JPH05503001A

JPH05503001A - Ｃ１インヒビターミューティンおよびその利用

Info

Publication number: JPH05503001A
Application number: JP2515057A
Authority: JP
Inventors: エルデリング，エリック; アールデン，ルシエン
Priority date: 1989-10-27
Filing date: 1990-10-22
Publication date: 1993-05-27
Also published as: AU658560B2; WO1991006650A1; CA2071871A1; AU6611290A; EP0497833A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＩインヒビターミュー−インおよびその１本発明は、分子生物学／免疫学の分野に関し、そしてタンパク質分解攻撃に耐性であるＣＩインヒビタニ、すなわちＣＩゼインビターミューティンの遺伝子工学的構成を示す。ミューティンは、好ましくは抗炎症剤及びより好ましくは敗血症の予防又は治療処置のために相当の用途を有する。

アメリカ合衆国において、病院内園血症が約１９４，０００人の患者に進行し、そして約７５，０００人が死亡している。Ｍａｋｉ、Ｄ、Ｇ、＋１９８１．　Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ　Ｉｎｆｅｃｔ、＋（Ｄｉｋｓｏｎ、Ｒ，Ｅ、、Ｅｄ、）＋１８３ページ、Ｙｒｋｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｏｏｋｓ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、これらの死のほとんどは、６種の主なグラム陰性バチルス菌に寄与し、そしてこれらは、プソイドモナス　アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　、ニスシリチア　コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、クレブシェラ　（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）　、エンテロバクタ−（Ｂｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）及びセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）である。菌属症のための現在の処置は、抗生物質の投与であるが、不幸なことには、その有効性は制限がある。

菌属症の正確な病理学は完全には解明されてはいないが、細菌性内毒素、すなわちリポ多糖類（ＬＰＳ）が主な原因物質であることが知られている。ＬＰＳは少なくとも３種の有意な抗原性領域、すなわち脂質Ａ、コアー多［類及び〇−特異的多Ｉｌｌから成る。後者はまた、〇−特異的鎖又は単純に〇−抗原として言及される。〇−特異的ｌｉｆ　１ｆＪｆ域は、反復多糖単位から構成される長鎖多糖類である。多糖類単位の数は、種々の細菌性の間で異なり、そして１〜６又は７個の単糖類単位であり得る。〇−特異的鎖は種々のグラム陰性細菌の間で異なるが、脂質Ａ及びコアー多糖類は、同一ではないが、類似する。

ＬＰＳは敗血症において主な役割を示すので、その活性を中和するために種々のアプローチが行なわれて来た。現在、ＬＰＳに対する抗体が標準の抗生物質治療に付随する価値ある臨床であることを示唆する相当の研究が存在する。

ＬＰＳは、結果的に患者の死を引き起こす一連の生化学的出来事を開始せしめる。ＬＰＳの導入後、第２の出来事は、マクロファージ細胞のＬＰＳ刺激の結果として腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の生成であると広く考えられている。従って、相当の努力が、ＴＮＦに対する中和抗体、又はその数置効果を阻害する他の分子を生成するために行なわれて来た。ＴＮＦに対する抗体は価値ある臨床的な適用であろうと思われる。

Ｔｒａｃｅｙ、　星＆、、１９８７．　Ｎａｔｕｒｅ、　３３０　：６６２゜グラム陰性細菌により引き起こされる敗血症は、相補的システムの活性化を包含し、そして種々の相補的成分の消耗を引き起こすと思われる。相補的システムの１つの成分、すなわちＣ５ａは、ニューロフィリスの凝集を引き起こし、そしてその凝集は、虚血を引き起こすように思われる。Ｓｉｅｇｅｌ＋Ｊ、＋１９８１、　Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｅｄ　、、３２：１７５゜従って、Ｃ５ａは敗血症における観察される器官不全現象の原因であることが提案されている。

ＣＩは、約１０５．０００の分子量を有する血漿糖タンパク質であり、そしてα １−抗トリプシン、α１−抗プラスミン、抗トロンビン■及びプラスミノーゲン活性化インヒビタータイプ■及び■のようなメンバーを包含するセリンプロテアーゼのメンバーである。相補的システムの活性剤成分が制御される１つの機構は、Ｃ１インヒビターによる。Ｃ１インヒビターは、補体（Ｃ１ｒ及びＣ１５）及び本来の凝集システム（第Ｘｌａ因子、第ＸＩＩａ因子及びＫａｌｌｉｋｒｅｉｎ）の従来の経路の活性化成分を阻害することが知られている。さらに、Ｃ１インヒビターは、フィブリン溶解成分プラスミン及び組織プラスミノーゲン活性化因子と相互作用することが示されている。

ＣＩゼインビターは、いわゆる非標的プロテアーゼ、特にリソシームセリンプロテアーゼエラスターゼによるタンパク質分解切断に敏感である。Ｂｒｏｗｅｒｅ、Ｍ、ａｎｄ　Ｈｏｒｐｅｌ、Ｐ、、１９８２゜Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　、、２５７　：９８４９　、この酵素は、多形核白血球から開放され、そして敗血性患者の循環に存在する。これらの患者に観察される凝集因子の濃度の低下は、一部、ＣＩゼインビターの白血球エラスターゼによるタンパク質分解の結果であると思われる。敗血症を処理するための可能性ある予防／治療アプローチは、タンパク質切断に耐性である遺伝的に構成されたＣ１インヒビターであり、そして敗血症にかかる危険性がある患者にそれらを投与し、又はすでに敗血症の患者にそれらを投与することが適切である。

敗血症の生命脅威性質は、追加の治療法又は予防法の同定及び開発を示唆し、そして両者とも敗血症の処置に効果的に適用され得る抗体又は他のものに基づかれる。

その最っとも一般的な形においては、本明細書に記載される発明は、Ｃｌインヒビターミューティン、そのミューティンの構成法及び好ましくは抗炎症剤として及びより好ましくは、敗血症の予防的又は治療的処置のためへのミューティンの適用を示す。

本明細書に記載される本発明の第２の目的は、エラスターゼ耐性であり、そして相補的システムの成分°に共有結合し、そして不活性化する能力を維持するＣｌインヒビターミューティンに関する。

本発明の第３の目的は、他の適切なアミノ酸に変異され、又は欠失される位置４４０及び／又は４４２でのアミノ酸を有し、耐エラスターゼ性であり、そして相補的システムの成分に共有結合し、そして不活性化する能力を維持するＣｌインヒビターミューティンの説明である。

本発明の第４の目的は、位置４４０及び／又は４４２でのアミノ酸を置換するアミノ酸のタイプに依存して、プロテアーゼ及び阻害活性に対する種々の悪魔を示すＣｌインヒビターミューティンの説明である。

本発明の第５の目的は、位置４４０及び／又は４４２でのアミノ酸を置換するアミノ酸のタイプに依存して、種々の基質に対して種々の阻害活性を示すＣｌインヒビターミューティンの説明である。

さらに、本発明は、抗−炎症性薬物としてＣｌインヒビターミューティンの予防又は治療的使用及び好ましくは敗血症の予防又は治療的処置に関する。

本発明のこれらの及び追加の目的は、下記に示される本発明の詳細な記載の考慮の後、明らかになるであろう。

第１図は、組換えＣＩゼインビターに対応するｃ　ＤＮＡ配列を示す。

第２図は、Ｃ１ミューティンの阻害又はプロテアーゼ活性を決定するための一般化されたアッセイ方法を間約に示す。

第３図は、Ｃ１ｓ及びＫａｌｌｉｋｒｅｉｎに対するＣＩミューティンの阻害活性（複合体形成）及びプロテアーゼ感受性（不活性化）の程度を示す。

第４図は、Ｂ−１２ａ及びプラスミンに対するＣＩミューティンの阻害活性（複合体形成）及びプロテアーゼ感受性（不活性化）の程度を示す。

第５図は、いくつかの０１インヒビターミユーテインの５０％阻害性のために必要とされるニューロフィルエラスターゼの量を示す。

１、、ｔｉ本発明の本質及び範囲の理解を促進せしめるため、本発明の種々のａｍに関する複数の定義を以下に示す。しかしながら、これらの定義は一般的であり、そしてこれらの定義は当業者に周知の意味に含まれている。

敗血症はダラム陽性又はグラム陰性細菌感染よりもたらされる疾患の意味と定義し、この後者は主に細菌内毒素リポポリサンカライド（ＬＰＳ）に起因する。これは少なくとも６種の主たるグラム陰性桿菌により誘発される。これらはシュードモナス　アエルギノーザ（ＰｓｅｕｄｏｌＩｌｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エツシエリヒリア　コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、タレブシェラ　（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）　、エンテロバクテリア（Ｅｎ　ｔｅｒｏｂａｃ　ｔｅｒ）及びセラチア（Ｓｅｒｒａ　ｔ　ｉａ）である。

ＣＩゼインビターは、セリンプロテアーゼインヒビターの超科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌいに属する、約１０５，０００の分子量を有する血漿塘タンパク質を意味する。これは補体Ｃ１ｒ及びＣ１ｓの古典経路の活性化成分、並びに固有凝血システムの因子Ｘｌａ、因子ＸＩＩａ及びカリクレインを阻害する。Ｃ１はまたプラスミン及び組織プラスミノーゲンアクチベーターと相互作用する。ＣＩはそれ自体がプロテアーゼ、特にエラスターゼにより不活性化される更なる特性を有する。この０１インヒビターの定義の範囲内に生物学的活性を保持するフラグメントも当然含まれることが理解されるであろう。

Ｃ１インヒビターミューティンは本発明のデーターにより例示される通りの種々の程度の生物活性を有し、そして特にタンパク質分解攻撃に耐性であるＣ１インヒビターの分子を意味する。

複数の特許／特許出願及び科学文献を以下に挙げる。本発明はこれらの文献中に示されるいくつかの材料と方法を引用し、従ってこれら全ての文献は全体的に本明細書に参照文献として組入れる。

ＣＩインヒビターはクローン化且つ発現されており、従って技術者が本明細書に詳細の突然変異誘発を実施するために容易に入手できる。例えばクローニング及び発現はＲｏｃｋら、１９８６、Ｌ匹肚計Ｕユ　益：　４２９２に詳細されている。このｃＤＮＡは図１に示す。更に、Ｅｌｄｅｒｉｎｇら、１９８８．　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ　、。

匹３　：１１７７６は、この分子全体をコード化するＡａｔＩＩ−ＨａｅＩＩｃ１インヒビターｃＤＮＡフラグメントを示す。このフラグメントはＣ１インヒビターミューティンを作製するための以下に詳細の方法を用いて操作されうる。

Ａ、ミューティンの　ｌ＋−ｍ−・　法Ａａ　ｔ　Ｉｆ−Ｈａ　ｅ　ＩｒＣ１インヒビターｃＤＮＡフラグメントについての所望のコード及びコントロール配列を含む適切なベクターの作製は、当業界において理解されている標準的ド、ＤＮＡ配列又は合成したオリゴヌクレオチドを切断し、テーラ−し、そして所望の形に再すゲートせしめた。

より詳しくは、当業界において一般的に知られる条件のもとて適切な制限酵素（又は酵素）による処理によって位置特異的ＤＮＡ切断を行う。そのうちの特殊な方法はこれら市販制限酵素の製造業者により特定されている。例えばＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　８ｉｏ１ａｂｓの製品カタログを参照のこと。一般に約１μｇのプラスミド又はＤＮＡ配列を１ユニツトの酵素により、約２０λの緩衝溶液中で切断せしめる。本明細書の実施例において、ＤＮＡ１体の完全なる消化を確実にするために典型的に過剰量の制限酵素を用いた。約３７°Ｃで約１時間から２時間のインキュベーション時間が有効であるが、変更は容認できうる。各インキュベーションの後、タンパク質をフェノール／クロロホルムによる抽出、その後のエーテル抽出により除去せしめ、そして核酸をエタノールによる沈殿及び１０ｎ＋Ｍのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７，５における再懸濁により水性画分から回収せしめる。所望するならば、切断フラグメントのサイズ分別を、標準の技術を利用するポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動により行なうことができる。サイズ分別の一般的な詳細はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ＋１９８０、皿：４９９−５６０に見い出せる。

制限切断フラグメントは、一旦工、２１ＪＤＮＡポリメラーゼ■（フレノウ）の大きなフラグメントとの、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下における、約１５〜２５分のインキュベーション時間にて、２０−２５° Ｃにて、５０ｍＭのトリスｐＨ７，６，５０ｍＭのＮａＣ１，６ｍＭのＭｇＣｌ２．６１ｍＭのＤＴＴ及び５５−１ＯｕのｄＮＴＰ中における処理によってプラント末端化されうる。このフレノウフラグメントは５′接着末端を補完するが、しかし例え４種のｄＮＴＰが存在していても突出し３′一本積を分解せしめる。

所望するならば、選択的な修復を、この接着末端の性質により示される制限内において、唯一の又は選んだｄＮＴＰを供給せしめることにより行うことができる。フレノウによる処理後、この混合物をフェノール／クロロホルムにより抽出し、エタノール沈殿させ、その後セファデックスＧ−５０スピンカラムにかける。

Ｓ１ヌクレアーゼによる適切な条件のもとての処理は、全ての一本鎖部分の加水分解をもたらした。

合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　ら１９８１．　Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅｎ＋、ｓｏｃ　、、１０３　：３１８５のトリエステル法、又は市販の自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いることにより作られる。

アニール化の前又は標識化のための一本鎖のリン酸化は過剰量の、例えば約１０ユニツトのポリヌクレオチドキナーゼを、０．１ナノモルの基質に対して、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７，６，１０ｍＭのＭｇＣｌ、２．５ｍＭのジチオトレイトール、１１−２１１ＩのＡＴＰ、１．７ピコモルのｒ３２Ｐ−ＡＴＰ　（２，９ｍＣ１／ミリモル）、０．１ｍＭのスペルミジン、０．１ｍＭのＥＤＴＡの存在下において用いることにより成し遂げられる。

リゲーションは以下の標準的な条件及び温度のもとで１５−３０λの容量において行なわれる。２０ｍＭのトリス−ＣＩｐＨ７，５，１０ｍＭのＭｇ　Ｃｌｚ　、１０ｍＭのＤＴＴ、３３ｕｇ／１ｍｌのＢＳＡ、１０ｍＭ−５０ｆｆｉＭのＮ　ａ　Ｃｌ　ｒ及び以下のいづれか、４０　ｇ　ＭのＡＴＰ、　０．　０１−０．　０２　（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ中０°Ｃにて（「接着末端」リゲーシ、７のため）、又は１ｍＭのＡＴＰ、０．　３−０．　６　（ＷｅｉｓＳ）ユニットのＴ、ＤＮＡリガーゼ中１４°Ｃにて（「プラント末端」リゲーシゴンのため）行なわれる。分子間のプラント末端リゲーション（通常は１０−３０倍モル過剰量のリンカ−を採用）は１ｍＭの総末＠濃度で行った。

「ベクターフラグメント」を用いるベクター作製において、このベクターフラグメントは通常５′リン酸を除去し、そしてベクターの再すゲーションを防止するために細菌アルカリホルファターゼ（ＢＡＰ）により処理する。ＢＡＰ消化はｐＨ８にて、約１５０ｍＭのトリス中、Ｎａ”及びＭ　ｇ　Ｚ　”の存在下において、約１ユニツトのＢＡＰを１μｇのヘクター当り用い、６０°Ｃにて約１時間にわたり行った。

核酸フラグメントを回収するために、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱し、そして５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカラムを通用して脱塩する。代わりに、望ましくないフラグメントの付加的な制限酵素消化によって二重消化されたベクターにおける再結合を防止することができる。

配列改質を必要とするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ由来のベクタ一部分については、部位特異的プライマー指令突然変異誘発を使用する。これは、限定された誤対合を除いて突然変異を誘発されるべき一本鎖ファージＤＮＡに相補する合成プライマーオリゴヌクレオチドを使用して行われる。簡単にいうと、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用してファージに相補する鎖の合成を指令し、そして得られた二本鎖ＤＮＡをファージ−サポーテイング（ｐｈａｇｅ−ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ）ホストバクテリアに形質転換する。形質転換したバクテリアの培養液を寒天上部に植菌し、ファージを担持する単一細胞からのプラークを形成させる。

理論的には、新規プラークの５０％が突然変異型を一本鎖として有するファージを含有し、５０％が元の配列を有する。

得られたプラークを、正確な対合のハイブリダイゼーションを許容する温度でキナーゼ化合成プライマーを用いてハイブリダイズするが、しかしその温度では、元の鎖との誤対合はハイブリダイゼーションを防止するに十分である。プローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養し、そしてＤＮＡを回収する。部位特異的突然変異の手順は、以下の特定の例において記述する。

プラスミド構築用の正しい結合は、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ、ＣＧＣＳ＃６１３５から得られるＥ、ｃｏｌｉ　Ｍ　Ｍ　２９４株、または他の適当なホストを連結混合物でまず形質転換することによって確認される。成功した形質転換体は、該技術分野では周知のように、プラスミドの構築様式に依存して、アンピシリン、テトラサイクリン、または他の抗生物質耐性によるか、または他のマーカーを用いて選択する。形質転換体からのプラスミドは、Ｃｌｅｗｅ１１．Ｄ、Ｂ　ら　（１９６９，Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　、６２：１１５９）の方法に従い調製され、任意には次いでクロラムフェニコール増幅（Ｃｌｅｗｅｌｌ　、　Ｄ、Ｂ、　、　１９７２．　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１１０：６６７）を行う。単離したＤＮＡは、Ｍｅｓｓｉｎｇら１９８１．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、９：３０９にさらに記載されているようにＳａｎｇａｅｒ　、　Ｆ　。

ら１９７７、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＩＩｓＡ）　、　７４：５４６３のジデオキシ法によるか、またはＭａｘａｍら１９８０．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６５：４９９の方法によって配列決定するか、及び／または制限によって分析する。

用いたホスト細胞によって、該細胞に適した標準的技法を用いて形質転換を行う。実質的な細胞壁を含有する原核細胞または他の細胞については、Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　（１９７２）６９：２１１０により記載されている塩化カルシウムを用いたカルシウム処理、またはＭａｎｉａｔｉｓらＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８２）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。

ｐ２５４に記載されているＲｂＣＩＺ法を使用した。このような細胞壁を持たない動物細胞については、Ｇｒａｈａｎ＋とＶａｎ　ｄｅｒ　ＥｂのＶｉｒｏｌｏｇｙ、　１９７８，５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい。

本明細書におけるクローニング及び発現に用いられたホスト株は以下のとうりである。クローニング及び配列決定には、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢ　１０１株をホストとして使用することができる。

Ｍ１３ファージ組換え体には、ファージ感染感受性のＥ、ｃｏｌｉ株例えばＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＤＧ９８株を使用する。Ｄ（１，９８株は１９８４年７月にＡＴＣＣに寄託されており、受託番号は１９６５である。ＣＩゼインビターミューティンの好ましい発現系は、Ｅｌｄｅｒｉｎｇらの１９８８．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６３：１１７７６に示されているＣＯ３−１細胞／ｐＳＶＬヘクター系である。ｐＳＶＬ　（ファルマシア、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）は、アンピシリン耐性遺伝子及び複製原点を含有するｐＢＲ３２２フラグメントに融合された、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルが続くポリリンカーの前のＶＰＩイントロン、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０複製原点から成る。

突然変異誘発は、該技術分野において周知のいずれの手順を使用しても行うことができる。これらの技法は、Ｓｍ１ｔｈ、１９８５、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９：４２３に記載されている。

該技法のいくつかの改変が、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４．ｐａｒｔ　Ｅ、（ｅｄｓ）Ｗｕ　ａｎｄ　Ｇｒｏｓｓ＋ｏａｎ（１９８７）、ｃｈａｐｔｅｒｓ　１７，１８，１９．ａｎｄ２０に記載されている。好ましい手順は、ＫｒａｍｅｒらのＭｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ−１５４，ｃｈａｐｔｅｒ　１７、及びＫｒａｓｃｅｒらの１９８４．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１２：９４４１によって記載されているＧａｐｐｅｄ　Ｄｕｐｌｅｘ部位指令突然変異誘発法の変法である。

Ｂ、ミューティン　−　”しい　１１１慣例のＭ１３突然変異法は、短い合成オリゴヌクレオチドを、変異誘発をめられるクローン化標的をコードしている配列を有する一本鎖Ｍ１３ＤＮＡにアニールする工程を包含する。オリゴヌクレオチドは、標的配列とほとんど相補しており（しかし完全には相補していない）、そして少なくとも一つの誤対合ヌクレオチドを有する。アニール反応後、−末鎖ＤＮＡの残る部分を満たして、変異の発現を許容する適当なホスト細胞内に感染できるヘテロ二本鎖ＤＮＡを与えなければならない。ＫｒａｍｅｒらのＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、ｃｈａｐｔｅｒ１７に記載されているギャンプト（ｇａｐｐｅｄ）二本頭注では、−末鎖Ｍ　１３　ＤＮＡの標的領域及び残りの部分が露出している慣例の方法とは違い、標的領域のみが露出している部分ＤＮＡ二本鎖を構築する。慣例の方法と同様に、短いオリゴヌクレオチドを標的領域にアニールし、伸長及び連結してヘテロ二本鎖を生成する。しかしながら、ギャップト二重鎖法では一本１ｊＤＮＡのごく一部しかハイブリダイゼーションに利用できないので、オリゴヌクレオチドはＭ１３ゲノム内の望ましくない部位にアニールしない。この方法は、標的領域のどちらかの側のＤＮＡのごく一部しか満たされる必要がないので、ヘテロ二本鎖の形成の際に導入されるエラーがより少ないという別の利点を有する。

より詳細には、ギャンプト二重法は、例えば停止コドンアンバー突然変異のような選択可能なマーカーを有する適当なＭ１３ファージに標的Ａａ　ｔ　ＩＩ−Ｈａ　ｅｌＩｃ１インヒビターｃＤＮＡフラグメントをクローニングすることを含む。後者は突然変異の効果を抑制できないホストセル内のネガティブ選択を許容する。好ましくは、このファージは重要なファージ遺伝子内に２つのアンバーコドン／を含むＭｌ　３ｍｐ　９である。従って、Ｃ１をコード化する配列はＭ１３ｍｐ９アンバーにクローニングされ、これより標準法を用いて１つのらせんＤＮＡが調製される。次に、アンバーコドンを欠いている強化Ｍ１３誘導体であるＭ１３ＧＡＰからの二重らせん複製形状ＤＮＡは適当な制限酵素により裂けられる。Ｍ１３ＧＡＰの塩基配列はＭ１３ｍｐ１８と同じであり、アンバーコドン及び塩基ベアー６１７２と６３２３の間の配列の両者を欠いている。この欠失はＭ１３ｍｐの多くのクローニングサイトの側面に位！し、独特な制限サイトを形成する。ギャップト二重ＤＮＡは標準ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法を用いて形成され、アンバーコドンを有する１つのらせんＤＮＡ、及びアンバーコドン及びＣ１コーディング配列の両者を欠いている消化されたＭ１３ＧＡＰからの第二のＤＮＡのらせんからなっている。従って、暴露されたギャップト二本鎖の唯一の部分はＣ１標的配列である。所望のオリゴヌクレオチドはギヤンプト二本鎖ＤＮＡにアニールされ、そして残っているギヤノブはＤＮＡポリメラーゼにより満たされ、切れ目はＤＮＡリガーゼによりシールされ、ヘテロ二本鎖を形成する。本発明に通用されるように、突然変異生成は１６の異なるミューティンをコードするオリゴヌクレオチドの混合物により行われる。Ｐ５及びＰ３二重変異体及びＰ５０イシン及びバリンシングルミューティンを単離するために用いられる縮重したオリゴヌクレオチドの配列は５　’　ＧＣＧＧＧＣＣ（ＡＧ）　（ＧＣ）　ＡＧＡＧ　（ＡＧ）　（ＧＣ）　ＧＧＣＧＧＡＧ３　’である。このオリゴヌクレオチドは、上記Ｂｏｃｋらのヌクレオチド１４１２−１４３３に相補性である。

上記に加え、多くの他のシングルＰ３ミューティンは以下のオリゴヌクレオチドを用いて得られた。

Ｐ３−ａｌａ　５’ＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＧＣＡＧＡＧＡＴＧＧ３’ｐ３−ｇｉｙ　５“ＧＧＴＧＣＧＧＧＣＴＣＣＡＧＡＧＡＴＧＧ３”Ｐ３−ａｒｇ　５’ＧＧＧＴＧＣＧＧＧＣＴＣＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧ３’Ｐ３−１ｅｕ　５’ＧＣＧＧＧＣＣＡＧＡＧＡＧＡＴＧＧ３’Ｐ３−ｔｈｒ　５’ＧＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＧＴＡＧＡＧＡＴＧＧＣＧ３’ヘテロ二本鎖は、好ましくは不釣り合いな修復欠損ホストにトランスフェクションされ、混合ファージが形成される。

混合ファージ集団より、この混合ファージ集団をアンバー突然変異を抑制できないホストセルにインフェクションすることにより、アンバー突然変異を有する未変異ＣＩ　ＤＮＡを有するファージが再び選ばれる。次いで、Ｃ１突然変異を有するファージに対しクローンがスクリーニングされ、突然変異の位置を決定するために分子が配列される。クローンはキナーゼ縮重オリゴヌクレオチドの混合物を用いてスクリーニングされる。前記方法を用いて、１１ｃ１インヒビターミユーテインが形成される。

Ｃ１インヒビターミューティンＤＮＡフラグメントは適当な制限酵素によりＭ１３から摘出され、ＣＯＳセルにおける発現に適したベクターにクローニングされる。このベクターはｐｓＶＬであり、上記のＢｏｃｋらに示されている。他のｐＣｌ−ＩＮＨも用いてよい。

ＳＶ４０形質転換ＣＯ３−１モンキーセルは、ペニシリン及びストレプトマイシンを含むｌ５ｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃ。

Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｕｍで培養された。この培地は１０％ＶＺＶ熱活性化生胎児血清が加えられている。セルのトランスフェクションは、Ｌｕｔｈｎ＋ａｎｎ　ａｎｄ　Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ、１９８３＋Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、５：１２９５に記載されたようにして行われた。

これは、セル培地中のスブコンフルエントＣＯ３−１をスーパーコイル化したベクターコード化Ｃ１インヒビターミューティンＤＮＡ　（５−７，５μｇ／ｍｌ）及びＤＥＡＥ−デキストラン（２００μｇ／ｍｌ）　と共に９０分間インキュベートすることを含む。９０分間インキュベートした後、セルをセル培地で２回洗浄し、さらに２時間８０μｇ／＋＋＋１のクロロキンを含むセル培地と共にインキュベートした。さらに２回洗浄し、１０％牛脂児血清を加えた培地にセルをインキュベートした。

この培地は２４時間後、血清を含まない培地に変えた。後者の培地を７２時間後に取り出し、遠心し、セル及び残金を除去し、以下に記載のようにしてＣ１インヒビター活性に付いて調べた。

図２はＣ１ミューティンのインヒビター（コンプレックス形成）もしくはプロテアーゼ感受性（不活性化）を測定するための一般的アンセイスクリーニングフォーマントを示す。

後者は非標的プロテアーゼによるＣ１インヒビターミューティンの不活性化を測定する。この方法は、Ｅｌｄｅｒｉｎｇら、１９８８゜Ｊ、ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ、、２６３：１１７７６に記載されている。この方法の改良も公知である。

通常、Ｃ１ミューティンのインヒビター活性は、Ｃ１インヒビターと基質の間のコンプレックス形成を測定することにより決定される。好ましい基質はグルコース、Ｃ１ｓ、　Ｋａｌｌｉｌｒｅｉｎ、　Ｂ　−１２ａ及びプラスミンである。

Ｃ１インヒビター、又はＣＩインヒビターミューティンは、基質と共有結合を形成することにより基質のプロテアーゼ活性を阻害する。

これらの分子は公知の方法により、又はＬｉｅｂｅｒｍａｎｎ、　Ｈ，ら、１９８４、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１７７：５３１及びＮｕｉｊｅｎｓ、　Ｊ、ら、１９８７．　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　６１　：３８７に記載されているようにして精製された。

数多くの方法が０１インヒビターミユーテインとその標的ブロティナーゼ基から得られる複合体を測定するのに利用可能であり、その方法としては標準的な免疫化学、放射線化学またはエライザアンセイが挙げられる（Ｌｅｖｉｎ、Ｍ、ら、１９８３゜Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５８　：６４１５　、Ｎｕｉｊｅｎｓ、Ｊ、ら、１９８７．　Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓ　ｔ　、　、　５８　：　７７８、ｄｅ　Ａｇｏｓｔｉｎｉ、１９８５．ハＡＳ、　８２：５１９０）。

これらの方法は、一般的に、複合体形成を起しうる溶液中で標的基質をＣＩインヒビターミューティンと接触させ、次いで複合体を未複合体化反応体から分離して形成された複合体量を検出することからなる。別のアッセイは、反応体の量、すなわち、複合体形成が起った後に反応溶液中に残存する遊離の０１インヒビターミユーテインまたは標的分子の量を使用してもよい。

好ましいアッセイは、活性化された標的基質（例えば、Ｃ１５）への機能性Ｃ１インヒビターミューティンの結合の観察に基づくラジオイムノアッセイである。

このアッセイは各種の方法で行うことができるが、好ましくは、当該技術分野で既知のシアノゲンブロマイドを介して固体マトリックス、好ましくは５ｅｐｈａｒｏｓ　４Ｂに精製された活性Ｃ１ｓが結合される。結合されたＣ１ｓは、必要によって少量の界面活性剤（好ましくはＴｆｖｅｅｒ＋−２０）を含む適当な緩衝液中でインキュベートされる。後者は約０．１重量／容量％の濃度で使用される。標的基質と複合体を形成するＣＩインヒビターミューティンの力価は、抗Ｃ１インヒビターミューティン抗体を使用して測定できる。また、放射性標識された第二抗体を使用して結合した第１抗体を測定することもできる。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルであることができ、Ｃ１インヒビターへの抗体の検出可能な結合を起こすのに十分な時間インキュベートされる。適当な洗浄工程により非特異的に結合した放射性標識抗体を０１インヒビターミユーテインに結合した抗体から分離した後、後者に付随する放射能を測定する。アッセイ系に適当な対照を組み入れたこの方法により、Ｃ１ミューティンの阻害力価が測定される。

同様な方法により、Ｃ１インヒビターミューティンの非標的プロテアーゼ感受性が測定可能である。完全なＣ１インヒビターミューティンまたはプロテアーゼにさらした後残存するミューティン由来の断片の量を測定する数多くのアッセイが利用可能である。多くの方法がＣ１，インヒビターミューティンのブロティナーゼ感受性を測定するのに利用でき、そしてこれらの方法としては標準的な免疫化学、放射性化学またはエライザアソセイが挙げられる。Ｃ１インヒビターミューティンを固体マトリックスに結合した非標的プロテアーゼと反応させて、残存する完全なミューティンの量を測定するか、または好ましくはミューティンの検出可能な断片の測定によってミューティンのタンパク分解量を測定する固相アッセイが好ましい。また、Ｃ１インヒビターミューティンを固体支持マトリックスに結合させ、このミューティンの付着物がミューティンへのプロテアーゼの接近を立体的に阻害しない場合には、その物質をタンパク分解にかけることもできる。

Ｃ１を開裂する非標的プロテアーゼの具体例は好中球エラスターゼである。すなわち、この酵素をＣＮＢ　ｒ処理５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂに結合させ、ＣＩインヒビターミューティンとインキュベートし、次いでタンパク分解的に開裂されたＣＩミューティンの存在を各種技法を用いてモニターできる。好ましい方法は５ｅｐｈａｒｏｓｅ結合エラスターゼをペレット化し、Ｃｌインヒビター分子を認識する抗体を用いて上澄中の開裂されたＣ１インヒビターの存在を測定することである。このような抗体は入手可能であり、そしてＮｕｉｊｅｎｓら、１９８Ｂ、　Ｂｌｏｏｄ　。

２２：１８４１に記載されている。これらを固体マトリックスに付着させて開裂されたＣ１インヒビターミューティンの他の反応体からの分離を促進してもよい。結合した開裂Ｃ１ミューティンインヒビターを担持する抗体を含むセファロースビーズを、遠心し、洗浄し、次いで未開裂Ｃ１インヒビターまたは開裂されているが未結合の断片から分離する。次に、結合した開裂ＣＩインヒビターは、その開裂分子を識別できる第二の標識抗体を用いて測定できる。最後に、５ｅｐｈａｒｏｓｅビーズに付着する放射能の量は、エラスターゼによりもたらされる開裂物の量の指標として測定できる。

Ｃ１インヒビターミューティンの阻害または非標的プロテアーゼ感受性の両者を測定するための一般方法は、図１に示されている。Ｃ１ｓを必要とするこの方法は、手短かにいえば、Ｅｌｄｅｒｉｎｇ、１９８８．Ｊ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ、、　２６３　：１１７７６に記載され、そして上述のＮｕｉｊｅｎｓ　らに示される変法を伴う他の基質用の方法と類似である。

上述のように、各種のミューティンのＣＩインヒビター活性を検出するためのラジオイムノアッセイは、機能的Ｃ１インヒビターミューティンが活性化Ｃ１ｓに結合するであろう観測に基づいている。従って、精製された活性化Ｃ１ｓは、ＣＮＢｒ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂにカプリングされ、そしてリン酸緩衝溶液、ｐＨ’７．　４．１０ミリモルＥＤＴＡ及び０．１％（Ｗ／Ｖ）Ｔｗｅｅｎ　− ２０に懸濁される。次いで活性化Ｃ１５１，５μｇを含むこの混合物０．３ｍＬが、多様に希釈したＣ１インヒビターミューティンと共に５時間インキュベーションされる。５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂビーズは採集され、十分に洗浄され、そして複合化Ｃ１インヒビターミューティンを＋ｚｓ■−ポリクローナル抗−Ｃ１抗体とインキュベーションされる（〉４時間）。抗体は、上記Ｈａｃｋ他により記載されている。その５ｅｐｈａｒｏｓｅビーズは洗浄され、そして結合した放射能は、ＬＫＢ１２６０マルチガンマ■ガンマカウンターを用いて検出される。

Ｃ１インヒビターミューティンの不活性化は、以下のように検出される。豚膵臓エラスターゼが、エラスターゼ約３゜７５■が５ｅｐｈａｒｏｓｅ　３００　ｍｇとカプリングされるように、５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂとカブリニ／グされる。そのビーズは１０ミリモルＥＤＴＡ及び０．１％ｗ　／　ｖ　Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝溶液に懸濁される。多様な量の０１インヒビターミユーテインが、容量５００μＬ中エラスターゼ５．６■を含む５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂ懸濁液１５０μＬと共にインキュベーションされる。続いて、その混合物は遠心分離され、そして上清は、不活性化ＣＩインヒビターミューティンの存在について、上記の５ｅｐｈａｒｏｓｅに結合させたＫＯＫ１２モノクローナル抗体及びポリクローナル＋ｚｓ■−抗一０１−インヒビター抗体を用いてアッセイされる。

図３は、基質としてＣ１ｓ及びカリクレインを、そしてプロテアーゼの供給源として好中球エラスターゼを用いて評価されるような、１１Ｃ１インヒビターミユーテインのインヒビター活性（複合体形成）の程度並びにプロテアーゼ感受性（不活性化）の程度を示す。図４は、基質がＢ−１２ａ及びプラスミンであったことを除いて、同様のデータを示す。

１１Ｃ１インヒビターミユーテインが、インヒビター活性及びプロテアーゼ感受性において相当な変動を示すことが、顕著である。これは、野生型のアミノ酸と置き換えて用いられるアミノ酸のタイプ及びインヒビター活性を試験するのに用いられる基質の両方の関数であった。

野生型ＣＩインヒビターは、４４０及び４４２の位１で、それぞれイソロイシン及びバリンを有する。４４０及び４４２の位置での変異は、それぞれＰ、及びＰ３　ミューティンと呼ばれる。これらの図は、Ｐ３でのみ変化された（Ａｌａ。

Ｇｌｙ、Ａｒｇ、ＬｅｕもしくはＴｈｒがＶａｌと置き換えられている）ミューティンは、用いられる標的プロテアーゼによって、異なる性質を示すことを表している。固相Ｃ１ｓが用いられる場合、複合体形成はＡｒ　ｇ＝Ｇ　ｌ　ｙ＜Ａ　１　ａ＜Ｌｅｕ＜野生型＝Ｔｈｒの順序で生しる。

さらに、２つの変異体、Ｐ、−Ｌｅｕ：Ｐ＋−ａｌａ；及びＰｓ−１ｅｕ：Ｐｚ −１ｅｕが不活性化に対して十分に低減された感受性を示すことが、明らかである。Ｃ１ｓに対する残りの機能的活性により測定されるような、５０％不活性化に必要とされるＩＮＦの量は、野生型Ｃ１インヒビターと比較して因子５〜８により増強される（図５）。

Ｄ、ＰＥＧＣ１ミューティン好ましい態様のＣＩミニ−ティンは、未変性分子よりも実質的に長い生体内循環寿命を有する。変性ミューティンから成る。好ましい変性Ｃｌインヒビターミューティンは、ミューティンに結合した水溶性ポリマーを有するものである。このような水溶性ポリマーの具体例としては、ポリアクリル酸とその誘導体、デキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、及びポリオキシエチレート化グリコールが挙げられる。好ましい態様の水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。それは、ポリエチレングリコールのタンパク質へのバインディング方法と共に、米国特許第４，１７９，３３７号明細書に開示されている。ポリエチレングリコール変性Ｉ　Ｌ−２は、米国特許第４，７６６、１０６号明細書に示されている。これら２つの特許に記載された組成物及び方法を用いて、当業者らによりポリエチレングリコール変性Ｃ１ミューティンは容易に製造される。

Ｅ、Ｃｌミュニ孟イユヴ列支並本明細書中に記載の０１ミユーテインが、単独でまたは他の抗炎症剤と組み合わせて、ヒトを含む哺乳類に投与でき、またはそれらが様々な医薬上許容される希釈剤もしくは担体と祖み合わせることができることは当業者により理解されるだろう。そのようなものは当業者に広く知られており、そして標準的な製剤プラクチスに従って製剤化される。

典型的な希釈剤としては、生理的食塩水、または緩衝化された食塩溶液、並びにリンガ−注射液およびブドウ糖注射液、およびブドウ糖食塩溶液、乳酸加リンガー注射液、または追加の治療剤、好ましくは敗血症の治療において有効であることが知られている抗生物質または抗体を含有する希釈溶液が挙げられる。そのような抗体としては、異なる菌株、好ましくはシュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　、エシェリキア・コリ　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、クレブシェラ　（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）　、エンテロバクタ−（Ｅｎ　ｔｅｒｏｂａｃ　ｔｅｒ）およびセレイシア　（Ｓｅｒｒａ　ｔｉａ）により引き起こされる敗血症の治療的処置に有益であることが知られているものが挙げられるだろう。

Ｆ、Ｃｌインヒビターミューティンの、法・　゛、本発明の１態様は、敗血症を発生する危険性が高いかまたは敗血症を発生している個体への有効量の当該Ｃｌインヒビターミューティンの投与である。前者の範晴の例は、手術を受けている最中の患者である。投与の形式は特に重要でないが、敗血症の迅速な進行のため、および従って０１インヒビタ一ミユーテイン組成物を体中に素早く広げる必要性のため、非経口投与が好ましい。ＣＩインヒビターの用量は、通常は処方医師により決定されるだろう。好ましい投与形式は、手術の直前、最中または直後にｒ、ｖ、巨丸剤を供給することである。用量は個体患者の年齢、体重および応答に従って変化するだろうと予想される。

本出願人は発明であると考えたものを一般的に記載してきたが、上記に与えられるものは本発明の例示である例である。

この例は、本発明の範囲から逸脱することなく多数の置換を行い得るため、示された材料および方法に本発明を限定するものと解釈してはならない。

本発明を特定の態様に関して今まで記載してきた。しかしながら、本出願は添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって行うことができるそれらの変更および置換を包含する。

ＦＩＧ、　ＩＡＦＩＧ、　ＩＢ７−＝７コーア＝−７７−Ｔうら一一−−−→ＣＣＡＡＡＡＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＧＧＧＴＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＡＴＴＡＧ　ＣＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＣＡＴＡ二ＡＣＣＴＧＡＣＡＧＡＣＣＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＦＩＧ、　ＩＣ卆浄書（内容に変更なし）ｃ＋ｓ　ＦＩＧ、　３ＡＫＡＬＬＩＫＲＥＩＮ　ＦＩＧ、　３ＢＰ６：　−−−−−−１ｅｕ　ｖａｌ　ｌｅｕ　ｖａｌ　ｌｅｕ　ｖａｌＰ３：　−ａｌａ　ｇｌｙ　ａｒｇ　ｌｅｕ　ｔｈｒ　ａｌａ　ａｌａ　ｌｅｕ　ｌｅｕ　−−浄書（内容に変更なし）Ｂ−１２−ＦＩＧ、　４Ａ −は野生型残基を意味する浄書（内容に変更なし）ＦＩＧ、　５ＣＩＳにより評価される残存ｒＣＬインヒビター手続手続補正力式）％式％１、　事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ　９０１０６０７２平成２年特許願第５１５０５７号 λ　発明の名称ＣＩゼインビターミューティンおよびその利用３、補正をする者事件との関係　特許出願人名称　シタス　オンコロジー　コーポレイション４、代理人住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号静光虎ノ門ビル　電話３５０４−０７２１５、補正命令の日付６、補正の対象（１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者」の欄（２）明細書及び請求の範囲の翻訳文（３）図面の翻訳文（４）委任状（５）名称の変更を証する書面７、補正の内容（１）（３）（５）別紙の通り（２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし）（４）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録（１）訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１通（２）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各１通（３）図面の翻訳文　１通（４）委任状及びその翻訳文　各１通国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．組換えＣ１インヒビターミューテイン。
２．前記ミューテインがヒト起源のものである、請求項１のＣ１インヒビターミューテイン。
３．組換えＣ１インヒビターの４４０位のアミノ酸が置換または削除されている、請求項２のＣ１インヒビターミューテイン。
４．組換えＣ１インヒビターの４４０位のアミノ酸が中性アミノ酸により置換されている、請求項３のＣ１インヒビターミューテイン。
５．組換えＣ１インヒビターの４４０位のアミノ酸が荷電アミノ酸により置換されている、請求項３のＣ１インヒビターミューテイン。
６．組換えＣ１インヒビターの４４０位のアミノ酸が荷電アミノ酸アルギニンにより置換されている、請求項３のＣ１インヒビターミューテイン。
７．組換えＣ１インヒビターの４４０位のアミノ酸がアラニン、グリシン、ロイシンおよびスレオニンから成る群から選択されたアミノ酸により置換されている、請求項４のＣ１インヒビターミューテイン。
８．組換えＣ１インヒビターの４４２位のアミノ酸が置換されている、請求項２のＣ１インヒビターミューテイン。
９．組換えＣ１インヒビターの４４２位のアミノ酸が中性アミノ酸により置換されている、請求項３のＣ１インヒビターミューテイン。
１０．組換えＣ１インヒビターの４４２位のアミノ酸が荷電アミノ酸により置換されている、請求項３のＣ１インヒビターミューテイン。
１１．組換えＣ１インヒビターの４４２位のアミノ酸が荷電アミノ酸アルギニンにより置換されている、請求項３のＣ１インヒビターミューテイン。
１２．組換えＣ１インヒビターの４４２位のアミノ酸がアラニン、グリシン、ロイシンおよびスレオニンから成る群から選択されたアミノ酸により置換されている、請求項４のＣ１インヒビターミューテイン。
１３．組換えＣ１インヒビターの４４０位と４４２位のアミノ酸が中性アミノ酸により置換されている、請求項２のＣ１インヒビターミューテイン。
１４．組換えＣ１インヒビターの４４０位と４４２位のアミノ酸がそれぞれ中性アミノ酸アラニンおよびロイシンにより置換されている、請求項１３のＣ１インヒビターミューテイン。
１５．組換えＣ１インヒビターの４４０位と４４２位のアミノ酸がそれぞれ中性アミノ酸アラニンおよびバリンにより置換されている、請求項１３のＣ１インヒビターミューテイン。
１６．組換えＣ１インヒビターの４４０位と４４２位のアミノ酸が中性アミノ酸ロイシンにより置換されている、請求項１３のＣ１インヒビターミューテイン。
１７．組換えＣ１インヒビターの４４０位と４４２位のアミノ酸がそれぞれ中性アミノ酸ロイシンおよびバリンにより置換されている、請求項１３のＣ１インヒビターミューテイン。
１８．Ｃ１インヒビターミューテイン活性を含んで成る分子をコードする組換えＤＮＡ。
１９．請求項７に記載のＣ１インヒビターミューテイン活性を含んで成る分子をコードする組換えＤＮＡ。
２０．請求項１２に記載のＣ１インヒビターミューテイン活性を含んで成る分子をコードする組換えＤＮＡ。
２１．請求項１７に記載のＣ１インヒビターミューテイン活性を含んで成る分子をコードする組換えＤＮＡ。
２２．請求項７に記載の生物学的に活性なＣ１インヒビターミューテインの有効量を含んで成る敗血症の治療的または予防的処置のための組成物。
２３．請求項１２に記載の生物学的に活性なＣ１インヒビターミューテインの有効量を含んで成る敗血症の治療的または予防的処置のための組成物。
２４．請求項１７に記載の生物学的に活性なＣ１インヒビターミューテインの有効量を含んで成る敗血症の治療的または予防的処置のための組成物。
２５．敗血症の治療方法であって、患者に有効量の請求項２２の組成物を投与することを含んで成る方法。
２６．敗血症の治療方法であって、患者に有効量の請求項２３の組成物を投与することを含んで成る方法。
２７．敗血症の治療方法であって、患者に有効量の請求項２４の組成物を投与することを含んで成る方法。