JPH01165387A - 抗凝固性タンパク質ｐｐ４‐ｘ、およびその製造と使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｉｔ、　Ｂｏｈｎ　（独国特許出願公開ＤＥ−Ａ第３．
３１５，０００号明細書）は、最初にヒト胎盤からのタ
ンパク質ＰＰ４について記述し、これを物理化学的パラ
メーターで特徴づけをした。ＰＰ４ペプチドをコードす
る種々のオリゴヌクレオチドが胎盤ｃＤＮＡバンク中の
ＰＰ４のｃＤＮＡを検索するために今や用いられている
。驚いたことに、ＰＰ４とは異なるタンパク質をコード
するｃＤＮＡが見出された。したがって、ここで記述さ
れるｃＤＮＡから得られるタンパク質をＰＰ４−Ｘと命
名する。アミノ酸配列および４個の反復を有するタンパ
ク質構造物（５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、タンパク質リボ
コルチン（ｌ　１ｐｏｃｏｒｔｉｎ）　　Ｉおよび■と
類似している。

タンパク質リボコルチン■および■またはカルバクチン
（（ａｌｐａｃｔｉｎ）　ＩＩおよび■は、ホスフォリ
パーゼへ２の阻害物質として最近開示された［Ｆ。

Ｄａｖｉｄｓｏｎら：　（１９Ｂ？）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、　１６９ｇ−１７０５、総説はＭ−Ｊ、
Ｇｅ１ＳＯｙおよび、Ｊ、　１１．　Ｗａｌｋｅｒ：（
１９８６）　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　ＬＬ４２０−４２３を参照され
たいコ。リボコルチンＩはＥＧＦリセプターチロシンー
タンパク質キナーゼの基質として作用するが、リボコル
チン■はｐｐ３６に類似のヒトタンパク質である。この
ｐ　ｐ　３６は、ｐ　ｐＧＯキナーゼ［Ｋ、　−５，ｌ
ｌｕａｎｇら：　（１９８（５）ｃｅｌｌ　’１５１９
］−１９９］の主な基質としてニワトリ胚繊維芽細胞ま
たはウシ腸管上皮細胞から分離される。リボコルチン■
は、アクチンとともに、内膜骨格（ｉｎｔｅｒｎａｌ　
ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）および外側細
胞骨格（ｅ、ｘｔｅｒｎａｌ　ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏ
ｎ）の構成成分である。リボコルチンＩは、コルチコス
テロイドと似て強力な抗炎症性を有しており、これらの
タンパク質の合成はコルチコステロイドによって誘導さ
れることが考えられるＣＧ、　Ｃ１ｒｉｎｏら：　（１
９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２Ｅ　２７０−２７２］。二
つのタンパク質のＤＮＡ配列分析および部分アミノ酸配
列分析によって、核酸配列もそれに対応するアミノ酸配
列（ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）もともに既
知のものであることがわかった［８．　Ｗａｌｌｎｅｒ
ら：　（１９８６）　ＮａｔｕｒｅｌｌＱ　７７−８１
およびに、　−５，Ｈｕａｎｇら：前出コ。二つの配列
は互いに非常によく似ており、さらに、それぞれ約２０
個のアミノ酸からなる同一配列を含む四つの反復構造を
有している。単一の基本アミノ酸配列中のこれら四つの
反復は、おそらく、２＋ Ｃａ　　の存在下でのりボコルチンの膜結合性に必要な
のであろう。

本発明者らは、ＰＰ４−ＸがＰＰ４から派生したオリゴ
ヌクレオチド配列を有することを見出したが、それはＰ
Ｐ４と同一ではない。これは検索に用いたオリゴヌクレ
オチドのただ一つのみが、リボコルチン■および口の反
復とＰ　Ｐ　４．およびＰＰ４−Ｘの反復の両方で比較
的よく保存されている塩基配列を含むという事実に基づ
く。

ＰＰ４−Ｘは、とくに胎盤のような血管に冨んだＭｉ織
や血管で見られる内生性の抗凝固剤である。

抗凝固的性質のために、ＰＰ４−Ｘは、凝固カスケード
における阻害剤とし・ての使用に適している。

なぜなら、それはトロンボプラスチン段階て血液凝固を
可逆的に阻害するからである。ＰＰ４−Ｘは、Ｃａイオ
ンを介して、負ここ荷電した燐脂質表面に結合する。こ
の結合は、ＥＤＴＡで再び解かれる。

このことから、血栓症の予防における使用が考えられる
。なぜならは、ＰＰ４−Ｘは、選択的に、効果的におよ
び可逆的に、凝固因子や阻害物質をタンパク分解によっ
てそれぞれ不活化したり活性化したすせずに凝固を阻止
するからである。凝固性（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｐ
ｏｔｅｎｔｉａｌ）はこの上うむこ完全に保持される。

部分的アミノ酸配列物（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）およびこ
れらから派生する適当なオリブヌクレオチドブローブを
得るために、タンパク質ＰＰ４を臭化シアン断片に切断
した。これら断片の二つ（それぞれ４１個および４４個
のアミノ酸から成る）の配列決定を行った。次のような
配列が見出された。

ＰＰ４オリゴペプチドＡ ＭＫＧＬＧＴＤＥＥＳ　１１．ＴＬＬＴｓＲ５Ｎ　ＡＱ
ＲＱＥＩＳＡＡＦにＴＬＦＧＲＤＬＬＤ　Ｄ ＰＰ４オリゴペプチドＢ ト１］、ＶＶＬＬＱＡＮＲＤ　　ＰＤＡＧＩＤＥＡＱＶ
　　ＥＱＤＡＱＡＬＦＱＡＧＥＬＫＸＧＴＤＥＥ　ＫＦ
Ｉ Ｒ，Ｌａｔｌ＋ｅ　　　［Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉｏ
ｌ、　　Ｌｆ１３　（１９８５）　　１−１２コの統計
的データに基づいて、オリゴペプチド八から３５個の塩
基を有するオリゴヌクレオチド（ＰＰ４オリゴヌクレオ
チド］２５） ＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＧＡ　ＴＧＡＧ
ＧＡＧＡＧＣＡＴＣＣＴを、 また、オリゴペプチドＢから３６個の塩基を有する配列 ＧＡＴＧＣＣＣＡＧＧ　ＣＣＣＴＧＴＴＣＣＡ　ＧＧＣ
ＴＧＧＣＧＡＧ　ＣＴＧＡＡＧ（ＰＰ４オリゴヌクレオ
チド１０４） を選択した。

これらオリゴ又クレオチドプローブを成熟ヒト胎盤から
のｍ　ＲＮ　Ａから調製しておいたｃＤＮＡバンクのス
クリーニングに用いた。ｍ　ＲＮ　Ａをまず胎盤から分
離して、そこからｃＤＮＡを調製した。後者にＥｃｏＲ
Ｉ末端を付して、ファージベクターλｇｔ　１０のＥｃ
ｏＲＩ切断部位に連結した。上記のプローブを用いて同
定しておいた４６個のクローンをさらに分析した。既知
の方法にて配列決定して、ＰＰ４−ＸをコードするＤＮ
Ａ配列を明らかにした。

第１図はＰＰ４−ＸをコードするｃＤＮＡ配列の制限酵
素地図を示す。「Ｎ」はＮ末端を表し、「Ｃ」はコード
領域におけるＣ末端を表し、　［Ａ（２５）Ｊは２５個
の塩基のポリ−（Ａ）配列を表す。ｃＤＮＡ配列は、Ｐ
Ｐ４−Ｘの完全なコード配列を表す。表１は５、一つの
クローン（ＰＰ４−Ｘ／２３）について、見出されたＤ
ＮＡ配列（コード鎖）およびそれに対応するアミノ酸配
列を示すものである。完全なｃＤＮＡは、１３２６塩基
対（ｂｐ）の長さで、かつ９７２　ｂｐの転写解読枠（
ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を有する。塩
基番号５９９と６３４との間、および８５１と８８５と
の間にそれぞれハイブリダイズするオリゴヌクレオチド
プローブ１０４および１２５の位置が、表１に下線で示
されている。

本発明によれば、適当な発現系を利用してコードｃＤＮ
Ａを用いてＰＰ４−Ｘを発現させることが可能である。

さらに、宿主の選択によってＰＰ４−Ｘの１１多飾のタ
イプに影響を及ぼすことができる。これまでのところで
は、細菌中では糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は
起きないが、一方、酵母細胞で起きる糖化は高等真核細
胞におけるものとは異なる。

Ｐ　Ｐ　４−Ｘのアミノ酸配列が解ると、ポリクローナ
ルまたはモノクローナル抗体の製造のための抗原として
用い得るアミノ酸部分配列物を従来法または遺伝子操作
法によって調製することができる。

そのような抗体は、診断的用途だけでなく、抗体カラム
の調製にも用いられる。そのようなカラムによって、Ｐ
Ｐ４−Ｘを他のタンパク質とともに含む溶液からＰＰ４
−Ｘを分離することが可能である。

また、ＰＰ４−Ｘをコードし、真核細胞中での発現を促
進し、さらには診断的結論をも導くことができるような
ゲノムクローンを、ｃＤＮＡまたはその部分を用いてゲ
ノムバンクから簡単な方法で単離することも可能である
。

本発明は、さらに、特許請求の範囲に定義され、以下の
語例に詳細に説明される通りである。

上記で説明したものの他に、次の略語を用いる。

ＥＤＴＡ＝エチレンジアミン四酢酸ナトリ「シム５ＤＳ
＝ソジウムドデシルサルフエートＤＴＴ＝ジチオスレイ
トール ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン 桝上 １、ヒト胎盤からのＲＮＡの単離 ＲＮＡを成熟ヒト胎盤から得た（Ｃｈｉｒ３ｗｉｎらの
方法：　８ｉｏｃｔ＋ｅｍｉｓｔｒｙ　ｈａ　（１９７
９）　５２９４−５２９９）。約１０ｇの胎盤！ＩＩ織
を乳鉢で？α体窒素中で破砕して、０．１Ｍメルカプト
エタノールを含む８０■１の４Ｍグアニジンチオシアネ
ート中に懸濁させて、次いでホモジナイザー（ｔｌｌ　
ｔｒａｔｕｒｒａｘ）で２０，０００ｒｐｍで９０秒間
処理した。破砕物を７，０００＋・ｐｍで１５分間遠心
分離（Ｓｏｒｖａｌｔ　ＧＳＡローター）して、上清を
２ｍｌのＩＭｆｉ￥酸および６０ｍ１の純エタノールで
一２０℃で一晩で沈澱させた。核酸を６．０００ｒｐｍ
で一１０℃にて１０分間で沈澱させて、次いで４０ｍ１
の７．５Ｍグアニジン塩酸（ｐＨ７，０）に完全に溶解
して、１ｍｌの１Ｍ酢酸と２０ｍ１の純エタノールとの
混合液で沈澱させた。

ＤＮＡを除去するために、各容量を半分にして沈澱処理
をもう一度繰り返した。ＲＮＡを１２ｍ１のＨ２Ｏに溶
解して、１．２ｍｌの４Ｍ酢酸カリウムと２４ｍ１の純
エタノールとの混合液で沈澱させて、最後にこの沈澱を
再び１０ｍ１のＨ２Ｏに入れたく組織１ｇ重量当り１ｍ
１）。

２、ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍ　ＲＮ　Ａの調製ポリ（Ａ
）を含むｍ　ＲＮ　Ａを得るために、胎盤ＲＮＡを２ｍ
ｌのパスツールピペット中のすリボ（ｄ　Ｔ　）−セル
ロースクロマトグラフィー［ＡｖｉｖおよびＬｅｄｅｒ
：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ’ｃｉ、
　ＵＳＡ　７（１９７３）　１４０８−１４１２コでＬ
ｉＣ１にて分画した。緩衝液１　［５００ｍＭ　Ｌ　ｉ
Ｃｌ、２０ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡ
、０．１％ＳＤＳ］に溶解した約５ｍｇの胎盤ＲＮＡを
カラムにかけた。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡはオリゴ（ｄ　Ｔ
）−セルロースと結合したが、ポリ（Ａ）−ＲＮＡを再
び、溶出することができた。緩衝液２［１００ｍＭＬｉ
ＣＬ、２９ｍＭ）リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡ
、０．１％ＳＤＳ］で洗浄処理した後に、ポリ（Ａ）”
　ＲＮＡ　（胎ｆ１ｇｍＲＮＡ）を緩衝液３［５ｍＭ）
リス（ｐＨ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤ
Ｓコにてカラ１１から溶出させた。

さらに精製するために、ポリｌ）”ＲＮＡを緩衝液１に
調整して、再びオリゴ（ｄ　’［’　）−セルロースク
ロマトグラフに供した。この第二精製工程の後の胎盤ポ
リ（Ａ）”　ＲＮＡの収率は、用いたＲＮＡの約４％だ
った。

３、ヒト胎盤からのｃＤＮＡ（胎盤ｃＤＮＡ）および二
本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｄｓＤ　Ｎ　Ａ）の合成ｃＤＮ
Ａ合成の前に、ポリ（Ａ）を含む胎盤ｍＲＮＡの全体を
１．５％アガロースゲルで調べた。

次いで、４７１ｇの胎盤ｒｒｔ　ＲＮ　Ａを６５．５７
ｚｌのＨ２Ｏに溶解して、７０℃にて１０分間変性させ
て、再び水中で冷却した。これに、２０μｍのＲＴ１ｍ
衝？１７［２５０ｍ旧・リス（ｐＨ８，２，４２℃）、
２５０ｍＭＫＣｌ、３０ｍＭＭｇＣ１２］、２．５７１
１の２０ｍＭｄＮＴＰ（全４種類のデオキシヌクレオシ
ド三燐酸）、１７１１の１７ｚｇ／ｍｌのオリゴ（ｄ　
Ｔ）、１７ｚｌのＩＭ　ＤＴＴ、２Ｉ１１のＲＮＡ５団
および８１１１の逆転写酵素（２４Ｕ／μｍ）を加えて
１００μｍの混合液にして、その後、４２℃で９０分間
でｃＤＮＡを合成した。

二本鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｄｓＤ　Ｎ　Ａ）をＧｕｂｌ
ｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎｎの方法（Ｇｅｎｅ　旺（１
９８３）　２６３−２６９）にて合成した。合成は、ｃ
ＤＮＡ合成の直後に、３０５．５μｍのｒ−ｒ　２　ｏ
、８０μｍのＲＴ？緩衝液［１００ｍＭ）リス（ｐＨ７
，５）、２５＋ｎＭＭｇＣＩ２．５００ｍＭＫＣｌ、５
０　ｍＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔ、２５０　μｇ／ｍｌＢ　Ｓ　Ａ
］、２　／２１のＲＮａ５ｅＨ（２Ｕ／　ｔｌｌ　）、
２．５７１１の大腸菌ＤＮＡリガーセ（５Ｕ／μｍ）、
５μｍの１５ｍＭβ−ＮＡＤ、および５ノＬ１のＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（５Ｕ／ｚｚｌ）を添加して、１５℃で
５時間インキュベートして行った。反応を加熱不活化（
７０℃、３０分間）によって終結させた。

５５μｍの２５０μＭ　ｄＮＴＰ、５５　／１１の１０
ｍＭトリス（ｐＨ７，５）、１０ｍＭ　ＭｇＣＩ　２．
１０　μｇ／ｍｌＢ　Ｓ　Ａ、　　３７１１のＴ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ　［（ＩＵ／７ｚり　　、　　２　　／
７　１　のＲＮａ５ｅＨ（２Ｕ／］１１）および２μｍ
のＲＮ　ａｓｅＡ　（２Ｂ　ｚ／　ｉｔ）を反応混合液
に添加した後、３７℃でさらに３０分間インキュベート
して二本口のＤＮＡＮ玉鎖上ける合成が完全であるよう
にした（「修復反応」）。

４、、ｄｓＤＮＡへのＥｃｏＲＩリンカ−の連結、およ
びリンカ−の開裂 胎盤ｃＤＮＡバンクを作出するために、ｄｓＤＮＡにＥ
ｃｏＲＩ末端を付して、ファージベクター人ｇｔｌｏの
ＥｃｏＲＩ切断部位にこれを連結できるようにした［Ｔ
、　Ｍａｎｉａｔｉｓら：（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ
コ。この目的のために、ｄｓＤＮＡを、 ａ）ｄｓＤ　Ｎ　Ａの内部ＥｃｏＲＩ切断部位を保護す
るためにＥｃｏＲＩメチラーゼで処理し、ｈ）Ｅ　ｃ　
ｏ　ＲＬリンカ−を付して、Ｃ）次いで、これらリンカ
−をＥｃｏＲＩで開裂した。

ａ）に関して： ｄｓＤＮＡのメチラーゼ反応を、修復反応に続いて直ち
に、２５７ｚ　Ｉの５００＋ｎＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８
，０）、６０１ＩＩのメチラーゼ緩衝液（１００ｍＭＮ
ａＯＡｃ　　（ｐＨ５，２）、２ｍｇのＳ−アデノシル
−し−メチオニン）および２μｍのＥｃｏＲＩメチラー
ゼ（２０Ｕ／７１１）を加えた後、３７℃で３０分間イ
ンキュベートして行った。

反応混合物をフェノールで抽出して、ｄｓＤＮＡを６０
　μｌｃ７）４ＭＮ　ａ　ＯＡ　ｃおよび１３００ｊｚ
ｌ（７）エタノールで沈澱させた。ｄｓＤＮＡを７０％
エタノールで２回洗浄して、エーテルと１回振盪して抽
出して、乾燥させた。

ｂ）に関して： ＥｃｏＲＩメチル化ｄｓＤＮＡを、８８μｍのＨ２Ｏに
溶解して、１０μｍのリガーゼ緩衝液［５００ｍＭ）リ
ス（ｐＨ７，４）、１００ｍＭＭｇＣｔ　２、１００ｍ
Ｍ　ＤＴＴ、　　１００ｍＭスペルミジン、１０ｍＭＡ
ＴＰ、１　ｍｇ／ｍｌＢ　Ｓ　Ａコおよび１７１１のＴ
４ＤＮＡリガーゼ（ＩＯＵ／７ｚｌ）を加えた後に、１
１１１のＥｃｏＲ［リンカ−（０，５μ８／μ１）（１
）ＧＯ−ＡＡＴＴＣＣおよびｐＡｃ八八へへＣＴ）と１
５℃にて一晩で連結させた。

Ｃ）に関して： リガーゼ混合物の容量を、６１１１の８２．０１１２μ
ｍの１０ＸＥｃｏＲＩ緩衝液および２１１１のＥｃｏＲ
Ｉ　　（１２０Ｕ／、ｉ）で１２０μ＋にした。

ＥｃｏＲ［消化を３７℃にて２時間で行った。

５、酢酸カリウム勾配による非結合リンカ−の除去、お
よびｄｓＤＮＡの大きさによる選択ＥｃｏＲ［反応混合
物を酢酸カリウム勾配（５〜２０％ＫＯＡｃ、１ｍＭ　
ＥＤＴＡ、１　μｌ／ｍ１臭化エチジウム）に供して、
５０．ＯＯＯｒｐｍで２０℃にて３時間遠心分離（ベッ
クマンＳＷ６５０−ター）することによって、すべての
非結合ＥｃｏＲＩリンカ−をｄｓＤＮＡから除去した。

勾配流出物を、最初の５画分を５００μｍずつ、後はす
べて１００μｍずつを計量して下から分画した。両分を
０．０１容量のアクリルアミド（２ｍｇ／ｍｌ）および
２．５容量のエタノールで沈澱させて。

７０％強度のエタノールで１回洗浄・乾燥して、それぞ
れを５１１１の８２０に入れた。

ｄｓＤＮＡの大きさを決めろために、各両分の１１１１
を１．５％のアガロースゲル中で分析した。

さらに、ｄｓＤＮＡの量を各両分の１μｍを用いて決定
した。

１０００ｂｐ以上のｄｓＤＮＡを含む両分を合わせて、
その試料を最終濃度２７μ８／ｍ１になるまで濃縮した
。

６、ファージベクター人ｇｔｌｏへのｄｓＤＮＡの挿入
、およびインビトロ組み入れ（ｐａｃｋａｇ　ｉ　ｎｇ
）反応 ｄｓＤＮＡを４μｍのリガーゼ混合物中でファージベク
ターλｇ　ｔ　ｌ　Ｏ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ３
　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、（：Ａ）の
Ｅ　ｃ　ｏ　ＲＩ切断部位に挿入した。

リガーゼ混合物は２μｍのｄｓＤＮＡ、１μｍのλｇｔ
ｌＯＸＥｃｏＲＩ　（１７１ｇ／ｍｌ）、０．４７ｚｌ
のりガーゼ緩衝液、０．５７１１のＨ２ｏ、０．１μｍ
の７４．　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼからなる。混合物を１５
℃で４時間インキュベートした。

ファージベクター人ｇｔｌＯ中に胎盤ｃＤＮＡバンクを
確立するために、次いでリガーゼ混合物をλ清涼性■胞
抽出物（大腸菌Ｎ９４２ＢおよびＮ５４３３）とのイン
ビトロ組み入れ反応に室温で２時間供した（Ｖｅｃｔｏ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　５ｙｓｔ、ｅｍｓ、　ＳａｎＤｉ
ｅｇｏ、ＣＡ、　［：ｎｑｕｉｓｔおよびｓｔｅｒｎｂ
ｅｒｇ：　Ｍｅｔｔ＋ｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　６Ｊ１１（１９７９）　２８１−２９８）。反応を
５００μ＋の懸濁培地［ＳＭ：　０．ＩＭ　ＮａＣｌ、
８　ｍＭ　　Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏａ、５０ｍＭ）　リス　（
ｐＨ７，５）、０、Ｏ１％ゼラチンコおよび２滴のクロ
ロホルムで終結させた。

７．胎盤ｃＤＮＡバンクの力価決定および分析大腸菌Ｋ
　１２　Ｃ６００ＨＦ　Ｌ株のコンピテントにした細胞
を用いて決定した胎盤ｃＤＮＡバンクのプラーク形成ユ
ニッ）　（ＰＦＩＪ）の数は、Ｉ　Ｘ　１０６ＰＦＵで
あった。全ファージの約８０％が１０００ｂｐより大き
いＤＮＡ挿入物を含んでいた。

８、胎盤ｃＤＮＡバンクのスクリーニングのためのオリ
ゴヌクレオチドプローブ 胎盤ｃＤＮＡバンクの分析のために二つのオリゴヌクレ
オチドプローブを合成した。それらの配列は、抗凝固性
タンパク質ＰＰ４−Ｘのいくつかの臭化シアン断片のア
ミノ酸配列から得た。

構築の方法および二つのプローブの使用は主にＲ，Ｌａ
ｔｈｅ　（前出）の方法に従った。

両方のオリゴヌクレオチド配列物の５′末端をＴ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼを用いて（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ［
ＳＡｌμｇのＤＮＡ（γ−３２Ｐ）ＡＴＰ：３０００　
Ｃｉ／ｍｍｏｌ、１０　μＣｉ／　μＩ、６μｍ／４０
１ｔ　ｌの反応混合物とともに用いるコの存在下でラベ
ルした。プローブの比活性は、ｉ　Ｘ　１０８Ｂｑ／μ
ｍすなわち１．５　Ｘ　１０６Ｂｑ／　ｐｍｏｌてあっ
た。

肌　ＰＰ４−特異性オリゴヌクレオチドによる胎盤ｃＤ
ＮＡのスクリーニング Ｉ　Ｘ　１０６ＰＦＩＪの胎盤ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを、ＰＰ
４オリゴヌクレオチドプローブ１０４　Ｊ３よび１２５
を合わせて調べた。この目的のために、３　Ｘ　１０’
ＰＦＵを、軟寒天中の大腸菌Ｋ　１２　Ｃ６００ＨＦ　
Ｌ株のｍ、ｌｔ！とともに１３．５ｃｍのベトリ皿上に
プレートして、３７°Ｃて６時間インキュベートした。

この時、溶菌はまだ不完全だった。プレートを一晩冷蔵
庫にてインキュＪ＼−トして、ファージを二Ｉ・ロセル
ロースフィルター（Ｓｃｌｒｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃ
ｌｕ＋ｅｌｌ、ＢＡ８５、Ｒｅｆ、　Ｎｏ、４０１１２
４）に移した（デユープリケード）。ニトロセルロース
フィルターおよびベトリ間には、注射針を用いて後の照
合のために印をはした。ニトロセルロースフィルターの
処理の間、ベトリ正を冷蔵庫に保存した。ニトロセルロ
ースフィルター」−のＤＮＡを１．５ＭＮａＣ１および
０．５ＭＮａＯＨに浸した濾紙（ファツトマンＭ３）上
にフィルターを５分間置くことによって変性させた。次
いでフィルターを同様にして１．５ＭＮａＣ１，０，５
Ｍ）リス（ｐＨ８，０）を用いてもとに戻して、２ＸＳ
ＳＰＥ　（０，３６ＭＮａＣ１，１６ｍＭ　ＮａＯＨ，
２０ｍＭＮａ８２ＰＯａ、２ｍＭＥＤＴＡ）で洗浄した
。次いでフィルターを８０℃にて２時間真空中で乾燥し
た。フィルターを３　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１０，１％ＳＤＳ
（２０ＸＳＳＣ＝＝３Ｍ　ＮａＣ１，０，３Ｍクエン酸
ナトリウム）中で６５℃にて４時間洗浄して、６５℃に
て４時間プレハイブリダイゼーションさせた［ブレハイ
ブリダイゼーション溶ｉｆｆ：０．６ＭＮａＣｌ、０．
０６Ｍ）リス（ｐＦ（８，３）、６ｍＭＥＤＴＡ、０．
２％非イオン性合成シュークロースポリマー（ρＦｉｃ
ｏｌｌ）、０．２％ポリビニルピロリドン４０．０．２
％ＢＳＡ、０．１％ＳＤＳ、５０７１ｇ／ｍｌ変性ニシ
ン精子ＤＮＡ］。フィルターに、１ｍｌのハイブリダイ
ゼーション溶液にシン精子Ｉ）　Ｎ　Ａを含まないプレ
ハイブリダイゼーション溶液）当り１００，０００〜２
００，０００１３ｑのラベルしたオリゴヌクレオチドを
加えて、これをビーカーまたは封をしたポリエチレンフ
ィルム中で静かに振盪しながら一晩インキユヘートした
。

ハイブリダイゼーションの温度は４４℃であった。

ニトロセルロースフィルターを６ＸＳＳＣ５０，０５Ｍ
と口燐酸ナトリウムで室温で１時間、それぞれのハイブ
リダイゼーション温度でさらに１時間洗浄した。フィル
ターを乾燥させて、−晩オートラジオグラフに供した。

ＸｙＡフィルムの両デュープリケ−１・に現れたシグナ
ルをベトリ皿に照合して、対応領域（約５０プラーク）
をパスツールピペットの広い先端で切り出して、ファー
ジを１ｍｌのＳＭ緩？ｇＪ液に再懸濁させた。陽性のフ
ァージを３回のサイクルで単離して、単一のクローンを
得た。

全部で、ｌ　Ｘ　１０６ＰＦＵの胎盤ｃＤＮＡバンクを
調べた。５４個のシグナルをデユープリケードフィルタ
ー上で同定した。さらに個々のプローブてスクリーニン
グを行うことによって、９個のクロ−ンが両方のプロー
ブと反応することが判明した。

これら９個のクローンはすべてＰＰ４−Ｘコード配列を
有しており、クローンＰＰ４−Ｘ／２３は最長ｃ０１３
２６ｂｐを有する。次イテ、ＰＰ４−Ｘクローンの配列
分析によって、ＰＰ４−Ｘ配列との８個のミスマツチが
完全な長さの二つのそれぞれのプローブ上で起きている
ことが明らかにされたく表２）。

１０、ＤＮＡ配列分析 ファージクローンＰＰ４−Ｘ／１０、／２３、／４７お
よび／４９を増やして、それぞれのＤＮＡを抽出した。

各場合に、ＥｃｏＲＩ断片を単離して、制限酵素分析に
はベクターｐＩｃ１９Ｈに、配列分析にはベクターＭ　
１３　ｒｎ　［）　８にそれぞれＥｃｏＲＩ部位で連結
して５ａｎｅｅｒの酵素的ジデオキシ法を用いて各分析
を行った。配列は、転写解読枠および最大３２１個のア
ミノ酸を有するタンパク質のコードを示す（表１）。

１１、大腸菌におけろＰＰ４−Ｘの発現ａ）成熟非融合
ＰＰ４−Ｘタンパク質の発現発現ベクターｐＴｒｃ９７
Ａ（欧州特許出願筒ＥＰ　Ｏ２３６９７８号明細！ＩＦ
）をＥｃｏＲＩによって消化して、５′突出末端を一本
領特異性酵素ｍｕｎｇｂｅａｎヌクレアーゼで除去して
、配列：５’ＡＡＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧ　　３’を得た
。次いでＤＮＡをＨｉｎｄＩ［Ｉで消化して、２８８９
ｂｐの断片を単離した。この断片を、ＰＰ４−ＸｃＤＮ
Ａの１１６５ｂｐのＢａ１ｌ／ＨｉｎｄＩ［Ｉ断片に連
結させた。このとき、ｃＤＮＡのＢａｌ［によって産生
された平滑末端は、ベクターの平滑にしたＥｃｏＲＩ末
端と反応した。結果として得られたＰＰ４−ＸのＮ末端
アミノ酸をコードする配列は、 Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｌｙ５ゞ、、ＡＡＣＡＧＡＣＣＡＴＧ　ＧＣＣＡＴＧ　
ＧＣＡ　ＡＣＣＡＡＡ　ＧＧＡ、、３’得られる４０５
４ｂｐの発現プラスミドｐＰＰ４−Ｘは、大腸菌におい
て成熟非融合ＰＰ４−Ｘタンパク質の合成を行うことが
できる。

Ｐ　Ｐ　４−Ｘタンパク質の発現のために、大腸菌に１
２株Ｗ３１１０１ａｃＩＱをｐＰＰ４−ＸＤＮＡで通常
の方法で形質転換した。アンピシリン耐性のコロニーは
誘導の後、目的のＰＰ４−Ｘタンパク質を発現した。細
胞性発現産物を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシーブルー
によるバンドの染色の後に分析したところ、分子置駒３
６ｋＤに対応する位置に新たなバンドが得られた。ｐＰ
Ｐ４−ＸＤＮＡで形質転換しなかった対照細胞の分析で
は、このバンドは得られていない。Ｗ３１１０１ａｃｒ
Ｑ（ｐＰＰ４−Ｘ）抽出物中に現れたタンパク質は、ウ
ェスタンプロット実験で抗ＰＰ４抗血清と特異的に反応
する。ざらに実験を進めて、細菌培養物の細胞性タンパ
ク質を、イソプロピルチオガラクトシド（Ｉ　Ｐ　ＴＧ
）で誘導の後に３５８−メチオニンでラベルして、後に
５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析してオートラジオグラフィーに
供した。再び約３６ｋＤの顕著なタンパク質バンドが現
れた。このタンパク質は、抗ＰＰ４−Ｘ抗血清で免疫沈
降する。

ｂ）ＰＰ４−Ｘ融合タンパク質の発現 さらに実験を進めて、大腸菌β−ガラクトシドを有する
ＰＰ４−Ｘ融合タンパク質を調製した。この目的のため
に、プラスミドｐＢＤ２１ｃ２０Ｈ（欧州特許出願筒０
２３６９７８号明細書）をＳ　ｍ　ａＩおよびＨｉｎｄ
ｍで消化して、３．８ｋｂ断片を単離して、これをａ）
に記述したＰＰ４−ＸｃＤＮＡのＢａ１ｌ／ＨｉｎｄＩ
ｌ断片に連結させた。得られたプラスミドｐＢＤ２　Ｉ
Ｃ２０Ｈ−ＰＰ４−Ｘは大腸菌において、約４１ｋＯの
β−ガラクトシダーゼ部分および３６ｋＤのＰＰ４−Ｘ
部分からなる約７７ｋＤの融合タンパク質を発現した。

この融合タンパク質は高収率で発現され、同様に抗ＰＰ
４−Ｘ抗血清と反応する。

さらに、バクテリオファージＭＳ　２　Ｄ　ＮＡポリメ
ラーゼを有するＰＰ４−ＸＭ合タンパク質を調製した。

この目的のために、プラスミドＩ）　Ｅ　ｘ３１　ｃ　
　［Ｋ、　５ｔｒｅｂｅｌ　　ら：　（１９８６）　Ｊ
、　Ｖｉｒｏｌ、　訂９８３−９９１］をＥｃｏＲｌで
消化して、クレノウボリメラーゼでＤＮＡを平滑末端に
した。次いて、ＤＮＡをＨｉｎｄＤＩで消化して、３．
２ｋｂ断片を単離して、これを上記（７）ＰＰ４−Ｘｃ
ＤＮＡ（７）ＢａｌＩ／Ｈｉｎｄｍ断片に連結させた。

このタンパク質は、温度シフトによる誘導の後に同様に
高収率で発現されて、同じく抗ＰＰ４−Ｘ抗血清と特異
的に反応する。

両ＰＰ４−Ｘ融合タンパク質は、ｐｐｔｔ−ｘに対する
抗体の産生および検出に適当な手段となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に係るＰＰ４−ＸをコードするｃＤＮ
Ａ配列の制限酵素地図を示す、説明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、表１に示されたアミノ酸配列を有する ＰＰ４−Ｘ。 ２、ＰＰ４−Ｘをコードし、かつ表１に示されたコード
   鎖を含む、ＤＮＡ配列物（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）。 ３、請求項２に記載のＤＮＡと緊縮条件 （ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）下でハ
   イブリダイズする、ＤＮＡ。 ４、表１に示されたアミノ酸配列をコードする、ＤＮＡ
   配列物。 ５、請求項２〜４のいずれか１項に記載の ＤＮＡを含む、遺伝子構造物（ｇｅｎｅ　ｓｔｒｕｃｔ
   ｕｒｅ）。 ６、請求項２〜５のいずれか１項に記載の ＤＮＡ配列物を含む、ベクター。 ７、請求項２〜５のいずれか１項に記載の ＤＮＡを含む、形質転換細胞。 ８、請求項２、４または５のいずれか１項に記載のＤＮ
   Ａ配列物を細菌、酵母または動物細胞で発現することに
   よって得られる、ＰＰ４−Ｘ。 ９、請求項２、４、５または６のいずれか１項に記載の
   ｃＤＮＡの発現系への挿入、およびそこでの発現、から
   成る、ＰＰ４−Ｘの製造法。 １０、ＰＰ４−Ｘ活性を有し、かつ表１に示されたアミ
   ノ酸配列を含むタンパク質、その部分、またはこれらタ
   ンパク質の突然変異体もしくは変体（ｖａｒｉａｎｔｓ
   ）。 １１、ＰＰ４−Ｘに特異的であって、かつ ＰＰ４−Ｘ、または抗原活性を有するその部分、から得
   た、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体。 １２、請求項１、８または１０のいずれか１項に記載の
   抗原を含んでなる、診断補助物。 １３、請求項１１に記載の抗体を含んでなる、診断補助
   物。 １４、請求項２〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡの全
   部または部分を含んでなる、診断補助物。 １５、請求項２に記載のＤＮＡと相補的な ＲＮＡの全部または部分を含んでなる、診断補助物。 １６、請求項１、８または１０のいずれか１項に記載の
   タンパク質を含んでなる、医薬物。