CN101379084A - 新的抗凝血多肽及复合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于蛇毒液领域且公开了两种新的蛇多肽及其编码核酸。本发明也公开了基于新蛇多肽的发现及其协同抑制凝血的能力的不同使用方法和组合物。

Description

新的抗凝血多肽及复合物

在这里引用的所有文献整体引入作为参考。

技术领域

本发明属于蛇毒领域，本发明提供了两种新的蛇多肽及其编码核酸。本发明也提供了各种基于该新蛇多肽的发现及其抑制血凝能力的应用、方法和组合物。

背景技术

血液凝固，是一种由一系列的扩增反应导致的对血管损伤的自然反应，其中血浆中丝氨酸蛋白酶循环的特异性酶原被限制性蛋白水解酶而持续活化，导致形成血栓，从而防止失血^(1-3)。这是透过外在途径启动的⁽⁴⁾。由于血管损伤而暴露的膜结合组织因子(TF)，与预存在血浆^(5，6)中的Vila因子(FVIIa)(占VII因子总量的1％-2％)互相作用，并形成了外源性的tenase复合物。这种复合物将X因子(FX)激活为Xa因子(FXa)。在与其辅助因子Va结合后，FXa将凝血酶原溶蛋白性裂解为凝血酶。凝血酶将纤维蛋白原裂解为纤维蛋白，促进一种纤维蛋白凝块的形成，并激活血小板包容在该凝块中。TF-FVIIa复合物也可以激活IX因子(FIX)，IXa因子(FIXa)，从而有利于在凝血级联中通过内在途径传播。凝血级联受到严格控制。调控中的任何失衡可能导致不能凝血，血造成外伤性失血过多致死或有害血块的形成，由于血管阻塞造成死亡和虚弱，所述的血管阻塞是指心肌梗塞、中风、肺栓塞或静脉血栓⁽⁷⁾。因此，人们迫切需要预防和治疗血栓疾病。

抗凝血药是预防和治疗血栓栓塞性疾病的关键。约0.7％的西方人接受口服抗凝血药治疗⁽⁸⁾。香豆素，肝素是最知名的临床使用的抗凝剂。香豆素抑制所有维生素K依赖蛋白的活性，包括前凝血剂(凝血酶，FXa，FIXa和FVIIa)及抗凝血药(活化蛋白C(APC)和蛋白S)，而肝素通过抗凝血酶III增强对凝血酶和FXa的抑制^(9，10)。这些抗凝剂作用的非特异性方式，决定了他们在形成血栓与止血之间的治疗上的局限性⁽¹¹⁾。因此，有必要开发新的在凝血过程中针对特定的凝血酶或某一特定步骤的抗凝血药^(12，13)。基于其在血液中相对较低的浓度(10nM)和在启动凝血级联中起关键作用⁽¹⁴⁾，FVII/FVIIa可能是一个诱人的开发新型和特异性抗凝血剂的药靶。

蛇毒中的蛋白质或毒素已用于设计和开发一些治疗药物或前导分子，尤其用于心血管疾病⁽¹⁵⁾。举例来说，一个血管紧张素转化酶抑制剂家族就是基于源自南美蛇毒液肽的缓激肽而开发的⁽¹⁶⁾。血小板聚集抑制剂，如替非巴肽和替罗非班，基于单链蛇毒多肽而设计的。所述的单链蛇毒多肽是一个发现在viperid和crotalid蛇毒中的血小板聚集抑制剂的大家族^(17-22)。从马来亚坑蝰蛇蛇毒提取的蝮蛇抗栓酶(ancrod)降低血纤维蛋白原水平，并已在各种缺血包括中风⁽²³⁾的情况中进行了成功的试验。

发明内容

此处所述的是一种调节眼镜蛇Hemachatus haemachatus(非洲环颈血腹蛇)毒液抗凝血活性的三指毒素(hemextin A)的纯化和鉴定。当hemextin A和另一种三指毒素(hemextin B)相互作用形成复合物hemextin AB时，其抗凝血活性得到了增强。

发明人表明了两种蛋白的复合物的形成可能对抗凝血活性很重要。这是第一种由三指毒素构成的四聚体。发明人通过用分割法抑制外源性tenase活性和研究它们对重构的外源性tenase复合物的影响表明hemextin A及其协同复合物延长了凝血时间

进一步地，发明人通过研究hemextin AB复合物和hemextin A对12种丝氨酸蛋白酶的作用证实hemextin AB复合物和hemextin A抑制作用的特异性。hemextin AB复合物是第一个被报道不需要介质介导其抑制活性的天然FVIIa抑制剂。hemextin AB复合物和FVIIa/TF-FVIIa的分子间相互作用为寻找抑制血液凝固启动的抗凝剂提供了一个新的示例。hemextin AB复合物形成过程中的分子间相互作用也可以用生物物理技术来解释。基于这些研究结果，这种独特的抗凝剂复合物模型将在下面描述。

在本发明的第一个方面，提供了一种包含SEQ ID NO.1或SEQID NO.3所示氨基酸序列的多肽，或其变体、突变体或片段。

在本发明的第二个方面，提供了一种包含SEQ ID NO.2，4或5所示氨基酸序列的多肽，或其变体、突变体或片段。

在本发明的第三个方面，提供了一种核酸分子，其:(i)编码本发明第一或第二个方面所述的多肽；或(ii)与(i)的核酸分子杂交，或其变体、突变体，片段或补体。

在本发明的第四个方面，提供了含有本发明第三个方面所述核酸分子的载体。

在本发明的第五个方面，提供了用本发明第四个方面的载体转化的宿主细胞。

在本发明的第六个方面，提供了一种制备本发明第一或第二个方面所述多肽的方法，该方法包括在适合所述多肽表达的条件下培养本发明第五个方面所述的宿主细胞。

在本发明的第七个方面，提供了一种制备本发明第一或第二个方面所述多肽的方法，该方法包括上述多肽的化学合成。

在本发明的第八个方面，本发明提供了一种制备包含第一个方面和第个二个方面所述多肽的复合物的方法，其中该方法包括在适宜复合物物形成的条件下将本发明第一个方面的多肽和第二的个方面所述多肽进行接触。

在本发明的第九个方面，本发明提供了一种复合物，其包含:

(i)本发明第一个方面所述的多肽；和

(ii)本发明第二个方面所述的多肽。

在本发明的第十个方面，提供了一种产生抗体的方法，该抗体能够识别本发明第一或第二个方面的多肽，或者能够识别本发明第九个方面所述的复合物，其中该方法包括下列步骤:

(i)用本发明第一或第二个方面的多肽或第九个方面所述的复合物免疫动物；

(ii)由所述动物获得抗体。

在本发明的第十一个方面，提供了能够识别本发明第一或第二个方面所述多肽或本发明第九个方面所述复合物的抗体。

在本发明的第十二个方面，提供了一种制备抗本发明第一个方面或第二个方面所述的多肽或本发明第九个方面所述复合物的抗蛇毒血清的方法，其中该方法包括用本发明第一个方面或第二个方面所述的多肽或第九个方面所述的复合物免疫动物；然后由所述用于制备抗蛇毒血清的动物收集抗体。

在本发明的第十三个方面，提供了有效抗本发明第一或第二个方面所述多肽或第九个方面所述复合物的抗蛇毒血清。

在本发明的第十四个方面，提供了识别本发明第一或第二个方面所述多肽或第九个方面所述复合物的调节剂的方法。其中该方法包括下列步骤:

(i)将待测化合物与本发明第一或第二个方面所述的多肽或第九个方面所述的合成物接触；以及

(ii)检测待测化合物是否与所述多肽或所述复合物结合。

在本发明的第十五个方面，提供了一种药物组合物，该组合物包含本发明第一或第二个方面的多肽，第三个方面的核酸分子，第四个方面的载体，第五个方面的宿主细胞，第九个方面的复合物，第十一个方面的抗体，第十三个方面的抗蛇毒血清，或第十四个方面的方法所识别的调节剂。

在本发明的第十六个方面，提供了第一或第二个方面所述的多肽，第三个方面的核酸分子，第四个方面的载体，第五个方面的宿主细胞，第九个方面的复合物，第十一个方面的抗体，第十三个方面的抗蛇毒血清，或第十四个方面的方法所识别的调节剂在药物中的应用。

在本发明的第十七个方面，提供了一种用于药物的联合制剂，该联合制剂包含:

(i)本发明第一个方面所述的多肽，或者编码相同多肽的核酸分子；和

(ii)本发明第二个方面所述的多肽，或者编码相同多肽的核酸分子。

在本发明的第十八个方面，提供了第一或第二个方面所述的多肽，第三个方面的核酸分子，第四个方面的载体，第五个方面的宿主细胞，第九个方面的复合物在制备用于治疗需抗凝血治疗病人的药物中的应用。

在本发明的第十九个方面，提供了下列物质在制备用于治疗需抗凝血治疗病人的联合制剂中的的应用:

(i)本发明第一个方面所述的多肽或编码相同多肽的核酸分子；和

(ii)本发明第二个方面所述的多肽或编码相同多肽的核酸分子。

在本发明的第二十个方面，提供了治疗需抗凝血治疗病人的方法，该方法包括对病人施用第一个方面或第二个方面的多肽，第三个方面的核苷酸分子，第四个方面的载体，第五个方面的宿主细胞，第九个方面的复合物，第十五个方面的药物组合物。

在本发明的第二十一个方面，提供了一种治疗需抗凝血治疗病人的方法，该方法包括给病人施用下述物质:

(i)本发明第一个方面所述的多肽，或编码该多肽的核酸分子；和

(ii)本发明第二个方面所述的多肽，或编码该多肽的核酸分子。

在本发明的第二十二个方面，提供了治疗被蛇咬伤的病人的方法，该方法包括对病人施用第一个方面或第二个方面的多肽，第三个方面的核苷酸分子，第四个方面的载体，第五个方面的宿主细胞，第九个方面的复合物，第十五个方面的药物组合物。

在本发明的第二十三个方面，本发明提供了第一个方面或第二个方面的多肽，第三个方面的核苷酸分子，第四个方面的载体，第五个方面的宿主细胞，第九个方面的合成物，第十五个方面的药物组合物在制备用于治疗被蛇咬伤病人的药物中的应用。

附图简要说明

图1:粗毒液的抗凝血活性。粗毒液对复钙时间(A)和凝血酶原时间(B)的影响。注意毒液在两种检测中都显示出强抗凝血活性。各数据点代表平均值±标准差。

图2:hemextin A和B的纯化。(A)唾蛇(H.haemachatus)粗蛇毒通过Superdex 30柱进行的分子排阻色谱。内附，峰2和峰3的抗凝血活性。(B)峰3在Uno S6柱上的阳离子交换色谱。包含hemextinA(C)和B(D)的级分通过Jupiter Cl 8半制备柱的RP-HPLC图谱。(E)和(F)分别是hemextinA和B的微柱液相色谱图谱。通过ESI-MS测定hemextinA和B的均质性和质量。hemextinA(G)和B(H)的重构质谱。

图3:hemextin A和B的N-端序列。通过Edman降解测定hemextinA和B起始的37个N端残基。三指毒素家族的保守半胱氨酸残基用黑底标注。进一步的蛋白测序结果显示于图13中。

图4:hemextin A区和B区对凝血酶原时间的影响。(A)hemextin A区和B区对凝血酶原时间的影响。注:当hemextin B存在时，hemextinA的抗凝能力增加。各数据点代表平均值±标准差。(B)通过对凝血酶原时间的影响解释了hemextins A和B之间形成了复合物。各数据点代表平均值±标准差。

图5:对形成的hemextinAB复合物进行的凝胶过滤研究。hemextin复合物的洗脱时间减至40分钟，单hemextin的洗脱时间为70分钟。

图6:活性步骤的定位。(A)图示显示了凝血酶原、stypven和凝血酶外源性凝血途径的选择性激活的凝固时间的测定。hemextin A(B)，hemextinB(C)和hemextinAB复合物(D)对凝血酶原时间(Δ)的影响；stypven时间(●)和凝血酶时间(■)凝血检测(具体参见下文)的影响。各数据点代表平均值±标准差。

图7:TF-FV活性的抑制。(A)hemextin A(●)，hemextinB和hemextinAB复合物(■)对FVIIa-TF抑制的抑制效力。(B)通过对TF-FV酶活性的影响解释了hemextins A和B之间形成了复合物。

图8:磷脂对hemextins A和B及hemextinAB复合物抑制活性的影响。hemextin A(●)，hemextinB(▲)和hemextinAB复合物(■)抑制(A)FVIIa及(B)FVIIa-sTF氨基分解活性的效力。注:缺乏磷脂不影响蛋白和重组复合物的抑制效力。

图9:丝氨酸蛋白酶特异性。hemextinA，hemextin B和hemextinAB复合物对(A)FIXa，(B)FXa，(C)FXIa，(D)FXIIa，(E)血浆激肽释放酶，(F)凝血酶，(G)胰蛋白酶，(H)糜蛋白酶，(I)尿激酶(J)血浆酶和(K)APC及(L)tPA的氨基分解活性的影响。除了在纤溶酶和糜蛋白酶实验中用抑肽酶，(■)在所有实验中用苯甲脒作为阳性对照，。通过与空白(□)相比来测定蛋白质和重组复合物的抑制效力，空白为含有用测定缓冲液替代蛋白的的测定混合物。注:hemextin A和hemextin复合物均抑制血浆激肽释放酶的氨基分解活性，但hemextin B不抑制。

图10:血浆激肽释放酶氨基分解活性的抑制。hemextin A(●)，hemextin B(▲)和hemextinAB复合物(■)抑制血浆激肽释放酶氨基分解活性的的效力。注:抑制的IC₅₀为～5μm。

图11:抑制特性。(A)为存在50nM(□)(2k_j)，25nM(○)(k_j)，12.5nM(■)(1/2k_j)的重组hemextin AB复合物的条件下，FVIIa-sTF动力学活性的双倒数(Lineweaver-Burk)作图。(●)表示不存在hemextinAB的情况下，FVIIa-sTF的动力学活性。V_max随抑制剂浓度的增加而减小，而Km保持不变(详见表2)，这是非竞争抑制剂中可观察到的典型现象。(B)为描述抑制Kj的次要曲线。图中的箭头表示K_j为25nM。

图12:hemextin AB复合物和FVIIa间形成复合物的ITC研究。(A)微卡/时间图示中的原始数据表示向1.4毫升的含10μM FVIIa的细胞中注射0.2mM的重组hemextin AB复合物后的热量释放；(B)原始数据的积分表示热/mol与摩尔的比。K的最适参数为4.11×10⁵M^-1，△H的为7.931kcal.M^-1，△S的为1.25cal.M^-1。

图13:hemextin B和A的序列信息以及hemextin B和A的序列比较。

图14:与hemextin复合物形成有关的构象变化。

图中显示了不同蛋白质浓度的(A)hemextin A和(B)hemextin B的CD谱。取决于较高浓度聚集的构象变化用箭头标注。(C)为hemextin A随着hemextin B浓度的增加而引起的构象变化。(D)为hemextin A随hemextinB浓度的增加在217nm处的CD变化。hemextin A与hemextin B的比达到1:1(C和D)后进一步增加hemextinA，CD谱没有显著的变化。

图15:用GEMMA测定hemextin抗体复合物形成过程中的分子直径。单一hemextin和hemextin复合物的分子直径是基于其电泳迁移率来计算的。hemextin复合物的形成导致分子直径增加。另外在验证所得的数据后，hemextin A和hemextin B的分子直径并没有随着加入等摩尔毒素C而有任何显著的增加。

图16:利用DLS测量铃动力直径。(A)对50mM Tris-HCl缓冲液中的hemextinA，hemextin B和hemextin复合物进行CONTIN分析。不同浓度的氯化钠(B)和甘油(C)对hemextin复合物的影响。计算的每一分子类型的铃动力直径显示在图中。

图17:利用ITC研究hemextin A和B间的相互作用。(A)为向1.4毫升的含0.1mM hemextin A的细胞中注射1M的hemextin B后的热量释放的原始ITC数据。N的最适参数为1.04，K_a的最适参数为2.33×10⁶M^-1，△H的为-11.68kcal.M^-1。

图18:hemextinA-hemextin B相互作用的热力学。(A)温度对hemextinA-hemextin B相互作用的能量的影响:(●)热焓变化(△H)，(■)熵范围变化(T△S)和(▲)自由能变化(△G)。(B)显示了文献(O)(数据来自Ye和Wu(68)，McNemar等人⁽⁶⁹⁾和引用的Stites的综述⁽⁷⁰⁾)中描述的不同蛋白-蛋白间相互作用以及hemextin A-hemextinB(●)间相互作用的焓熵补偿。

图19:不同的缓冲液条件下hemextinAB复合物的形成。(A)缓冲液离子化对hemextinAB复合物的焓的影响。所有实验均在pH值7.4的条件下进行。用于缓冲液的离子化焓的变化对磷酸盐而言为0.71kcal/mol，MOPS为5.27kcal/mol，Tris(Ref)为11.3kcal/mol。(B)Ka对缓冲液离子强度的依赖性。亲和力随着缓冲离子强度的增加而下降。(C)K_a对甘油浓度的依赖性。亲和力随着甘油浓度的增加而减少表明了疏水相互作用的重要性。

图20:不同缓冲液条件下hemextin复合物的SEC研究。(A)hemextin复合物在Tris-HCl缓冲液的洗脱分布。(B)各种离子强度的Tris-HCl缓冲液(用不同浓度的氯化钠)。(C)含有不同浓度甘油的Tris-HCl缓冲液。随着盐或甘油的增加，该四聚体复合物分解为二聚体和单体(分别以峰4，2和1表示)。*(D)使用以下蛋白作为分子量标记物对柱进行校准-(A)卵类粘蛋白(28KD)，(B)核糖核酸酶(15.6KD)，(C)细胞色素C(12KD)，(D)apoprotinin(7KD)和(E)pelovaterin(4KD)。由校正曲线计算得到四聚体、二聚体和单体的分子量。

图21:缓冲液条件对抗凝血活性的影响。(A)缓冲离子强度和(B)甘油对抗凝血活性的影响。Hemextin AB复合物的抗凝血活性随缓冲液离子强度的增加而增加，也随着甘油浓度的增加而增加。箭头表示抗凝复合物主要为二聚体和单聚体混合物时，(A)盐和(B)甘油的浓度。

图22:一维¹H NMR研究。不同缓冲液条件下，(a)hemextin A和(B)hemextin B的谱。氯化钠存在时，hemextin A的β-折叠结构完全不受影响。

图23:hemextin复合物的建议模型。(A)为描述hemextin AB复合物形成的图示。两个结构相似的三指毒素，hemextins A和B，以1:1的化学计量形成一个紧凑、刚性四聚体的复合物。(B)显示盐和甘油对hemextins A和B构象的影响的图示。盐存在时，hemextin A经历了构象变化。(C)为盐和甘油存在下，四聚体hemextin AB复合物的分解。分解可能产生两种不同的位面。因此，高盐中的hemextinAB二聚体，不同于存在甘油时形成的二聚体。虚线表示两个假定的抗凝位点(详见附图)。

发明详述

本发明在第一个方面提供了一种含有SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.3所示氨基酸序列的多肽，或其变体、突变体或片段。

在一个实施方案中，该多肽包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，该多肽包含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

下面所要描述的，也包含本发明第一个方面所述多肽的功能性等价物。

正如此处所描述的，Hemextin A自身也表现出抗凝血活性。相应地，本发明第一个方面所述的多肽也表现出抗凝血活性。

在一个实施方案中，多肽可获自H.haemachatus(非洲环颈血腹蛇)的毒液。

图13中所示的SEQ ID NO.1是Hemextin A序列，即:

LKCKNKLVPFLSKTCPEGKNLCYKMTMLKMPKIPIKRGCTDACPKSSLLVKWCCNKD KCN

SEQ ID NO.3是图3中第一行的序列，即:

LKCKNKLVPFLSKT..CPEGKN..LCYKMT.LKKVTPKIKRG

SEQ ID NO.3表示Hemextin A的N末端部分测序的结果。Hemextin A的进一步测序产生SEQ ID NO.1.中的序列。

本发明第二个方面提供了一种含有SEQ ID NO.2，4或5所示氨基酸序列的多肽，或其变体、突变体或片段。

在一个实施方案中，该多肽含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，带多肽含有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，带多肽含有SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

下面所描述的，也包括本发明第二个方面所述多肽的功能性等价物。图13中所示的SEQ ID NO.2是Hemextin B，即:

LKCKNKWPFLKCKNKWPFLCYKMTLKKVPKIPIKRGCTDACPKSSLLVNVMCCKTDKCN

SEQ ID NO.4是图3中第二行所示的序列，即:

LKCKNKWPFL.KT..CKNKWPFLCYKMT.LKKVTPKIKRG

SEQ ID NO.4表示Hemextin B的N末端的起始序列。

图13中所示的SEQ ID NO.5是Hemextin B序列，尽管没有最后四个氨基酸，即:

LKCKNKVVPFLKCKNKVVPFLCYKMTLKKVPKIPIKRGCTDACPKSSLLVNVMCCKT

人们确信在SEQ ID NO.2的C末端部分(尤其是最后四个氨基酸)可能存在变化。相应地，在一个实施方案中，提供了一种在C端不同于本发明第二个方面所示SEQ ID N0.2序列的多肽。更具体地，本发明提供了一种在SEQ ID NO.2最后四个氨基酸(例如C末端的第一个或第一、第二、第三和/或第四个中的一或多个氨基酸(即DKCN))中的至少一个(例如1、2、3或4个)不同于SEQ ID NO.2所示序列的。

因此，在本发明第二个方面的一个实施方案中，提供了一种含有SEQ ID NO.5的多肽。由于SEQ ID NO.5.被认为是Hemextin B的不完全序列，因此在一个实施方案中提供了一种包含SEQ ID NO.5和在位于SEQ ID NO.5氨基酸序列C末端一个或多个(例如1、2、3、4、5、6个等)附加氨基酸的多肽。

在一个实施方案中，本发明第二个方面所述的多肽可获自H.haemachatus(非洲环颈血腹蛇)的毒液。

本发明第二个方面的多肽能够与本发明第一个方面的多肽形成一种复合物，从而使得对本发明第一个方面所述多肽的抗凝活性产生了协同作用。

本发明第一和第二个方面所述的多肽不是必须获自蛇毒，而是可以以任何形式产生，包括例如重组技术和化学合成例如固相肽合成。在另一个实施方案中，提供了一种本发明第一或第二个方面所述的蛋白质，该蛋白质是从H.haemachatus蛇毒中纯化得到的。纯化的方法是本领域中公知的且其可用于纯化本发明第一或第二个方面所述的多肽。多肽的纯化可以通过实施方案中描述的方法获得。因此，在一个实施方案中，第一和第二个方面所述的多肽由实施例部分描述的方法获得或可获得。

本发明第一和第二个方面所述的多肽，可以是从天然环境中分离出来的，其自然发生的形式，或是被修饰的。但是它们或者单独保留(例如本发明第一个方面的多肽的情况)，或者以复合物的形式保留其所表现出的抗凝血活性。例如，用化学方法引入一或多个对氨基酸结构的化学修饰来对所述的多肽进行修饰。

关于蛋白质和氨基酸序列的测定和鉴定，本领域所属技术人员能够理解多肽的部分氨基酸序列是已知的，寡核苷酸探针可以被设计用来探测H.haemachatus基因组或cDNA文库，因此就能够确定和证实目的多肽或基因序列。由于基因编码是随机的，因此大量的多核苷酸序列能够编码相同的肽序列。为确保实际的核苷酸序列存在于探针寡核苷酸中，该寡核苷酸被合成掺入，当需要时使用多个核苷酸。

设计、制备和使用退化探针的方法是本领域公已知的。参见Narang，SA(1983)Tetrahedron 39:3；Itakura等(1981)RecombinantDNA，Proc 3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，ed.A G Walton，Amsterdam:Elsevier pp273-289；Itakura等.(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323；Itakura等.(1984)Science 198:1056；Dee等.(1983)Nucleic AcidRes.11:477。使用退化探针来解释基因序列和编码的多肽也是本领域公知的，并且本领域普通技术人员很容易能够完成。

本发明第一和第二个方面所述的多肽可以彼此形成复合物，因此，就会对本发明第一个方面所述的多肽的抗凝血活性产生协同作用。相应地，在本发明的第一和第二个方面的实施方案中提供了一个包含本发明第一个方面和第二个方面的多肽的复合物。

如下面所讨论的，该复合物被认为是一个四聚体。在一个实施方案中，该复合物是一个异质二聚体(heteodimer)。这样的复合物可用于本发明的各个方面，例如用在治疗病人所需的抗凝疗法个方面。

本发明第一个方面所述的多肽，其分子量被测定为约6835.00±50，20，10，15，10，5，2，1或0.52道尔顿。

本发明第一个方面所述的多肽，其分子量被测定为约6835.50±50，20，10，15，10，5，2，1或0.52道尔顿。

本发明第二个方面所述的多肽，其分子量被测定为约6791.38±50，20，10，15，10，5，2，1或0.32道尔顿。

本发明第二个方面所述的多肽，其分子量被测定为约6792.56±50，20，10，15，10，5，2，1或0.32。

本发明实施例部分所用的方法可以是，例如，用来测定分子量。其它本领域公知的方法也可以替换使用。

术语“多肽”和“蛋白质”可以互换使用，且是指任何肽键或修饰的肽键连接的氨基酸聚合物(二肽或更多)。

本发明所述的多肽也可以包含非肽组分，例如碳氢基团。碳氢和非肽取代基可被合成多肽的细胞加到多肽上，其根据细胞类型的不同而有所差异。多肽在此处是以氨基酸骨架结构所确定的；取代基例如碳氢基团一般不是特异性的，但是仍然可被表达。

术语“包含”及其语法变体是指“包括”。例如，一个组合物“包含”X可以仅仅由X组成，或者包括一个或多个附加组分。类似地，一个包含特定序列的多肽可以仅仅由特定的序列组成，也可以包括一个或多个其他的组分。例如，本发明的多肽可以由一个或多个附加在其N端或C端的氨基酸序列组成。

本发明第一和第二个方面所述的多肽包括所引证的序列的变体。因此各种变异的氨基酸可以包括，例如，为进一步研究Hemextin A或Heniextin B的结果所鉴别的等位变体或变异序列。也包括功能性等价物、活性片段和融合蛋白。为避免疑问，本发明的第一和第二个方面包括:变体的功能性等价物或变体的活性片段。所包含的融合蛋白包含变体、功能性等价物和活性片段。类似地，本发明扩展到功能性等价物的变体和活性片段。

本发明第一和第二个方面所述的多肽可以分别以一个具有第二个方面多肽或第一个方面多肽的复合物的形式提供。本发明第一个方面的多肽可以是hemextin A，hemextin A的变体、突变体、功能性等价物、活性片段，或者包含hemextin A的融合蛋白。本发明第二个方面的多肽可以是hemextin B，hemextin B的变体、突变体、功能性等价物、活性片段，或者包含hemextin B的融合蛋白。因此，各种hemextin A和hemextin B的混合物、变体、突变体、功能性等价物、活性片段以及hemextin A和hemextin B的融合蛋白的各种组合被想象假定产生的复合物具有抗凝血活性。

在一个实施方案中，如果一个多肽或多肽复合物增加凝血酶原时间或抑制了外源性tenase活性，那么该多肽或多肽复合物就被认为具有抗凝血活性。

为测定多肽或多肽复合物是否具有抗凝血活性，可以按照下面实施例部分描述的方式实施凝血酶原试验。简要地，凝血酶原时间可以根据Quick(参见QuickAJ.(1935)J Mol.Chem.109，73-74)方法测量。100μl of 50mM的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，100μl血浆和50μl研究的蛋白37℃培养2min。加入150μl加钙试剂凝血酶原激酶则凝血开始。如果多肽表现出抗凝血活性，则凝血酶原时间增加。

可选地，多肽或多肽复合物对外源性tenase活性的影响可通过下面实施例部分所述的方式来评估。正如此处所述的，hemextin A和及其与hemextin B的复合物被认为通过TF-FVIIa复合物(外源性tenase复合物)抑制了FX的活性。因此，本发明第一个方面的多肽和由本发明第一和第二个方面的多肽复合物适当地抑制了TF-FVIIa复合物将FX催化激活为FXa.的能力。关于如何测定的细节在下面实施例部分阐述，实施例部分描述了单个蛋白和外源性tenase活性复合物的抑制作用能够通过测量蛋白或FXa结构复合物的方式来测定。

在一个实施方案中，当以含有hemextin A的复合物或hemextin A的变体、突变体、功能性等价物、活性片段形式存在时，hemextin B的变体、突变体、功能性等价物、活性片段具有至少约20％，30％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％o或95％的外源性tenase活性抑制作用。

为测定推定的功能性等价物、活性片段或hemextin A的融合蛋白是否能够与本发明第二个方面的多肽形成一个协同复合物，或者为测定外源性抗凝血活性，选择性地使用hemextin B。

同样，为测定推定的功能性等价物、活性片段或hemextin B的融合蛋白是否能够与本发明第二个方面的多肽形成协同复合物，或者为测定外源性抗凝血活性，选择性地使用hemextin A。

变体包括，例如，属于源于由其获取多肽的种的等位变体。此外，可能SEQ ID NO.2的最后四个氨基酸用于突变。相应地，SEQ ID NO.1，2，3，4或5变体序列的鉴别序列和作为进一步研究HemextinA或B的鉴别序列也包括在第一和第二个方面的范围内。

本发明所述变体可以包括一个或多个氨基酸残基被一个或多个保守的或非保守的氨基酸残基(优选保守的氨基酸残基)所替代的多肽。一般此种替代发生在Ala，Val，Leu和He；Ser和Thr；酸性的Asp和Glu残基；Asn和Gln；基本的Lys和Arg残基；芳香族Phe和Tyr残基。

特别优选的变体是几个氨基酸以任意组合被替代、删除或添加，例如在5～10，1～5，1～3，1～2或仅仅1个。更特别优选的是沉默替代、添加或删除，这不会改变多肽的性质和活性。关于这个同样更优选的是保守氨基酸残基。变体或突变的多肽也包括其一个或多个氨基酸残基包括取代基的多肽。希望修饰一个氨基酸序列如修饰多肽的性质(例如其生物活性)的变体也被考虑在内。

另一个本发明所述第一和第二个方面的实施方案提供了包含单个或多个氨基酸残基，添加、插入，和/或删除，和/或化学修饰的氨基酸取代的本发明多肽的功能性等价物。其中“功能性等价物”指:(i)含有或者单独或以复合物形式表现出的抗凝血活性的功能性特征；或者(ii)含有与多肽协同的抗原决定簇。

本发明此个方面所述的功能性等价多肽，可以是一个含有至少与本发明所述的多肽有60％的相同序列的多肽。在一个实施方案中，提供了与hemextin A，hemextin B或等位变体至少有60％相同序列的功能性等同多肽。

测量蛋白序列同一性的方法是本领域已知的，该方法在本文中可以通过上下文被本领域普通技术人员所理解，序列同一性是基于氨基酸同一性(有时指的是“hard同源性)而计算出的。例如，UWGCGPackage提供了能够被用于计算序列同一性(例如使用其默认的设置)的BESTFIT程序(Devereux等(1984)Nucleic Acids Research 12，p387-395)。PILEUP和BLAST的算法能用于计算序列同一性或线性序列(典型地使用其缺省设置)，例如就像在Altschul S.F.(1993)J MoIEvol 36:290-300；Altschul，S，F等(1990)J MoI Biol 215:403中所描述的，BLAST分析软件可在世界范围内通过互联网从国家生物技术信息中心公开获得，网址是www.ncbi.nlm.nih.gov。此算法包括首先通过识别询问序列中长度W的短字码来识别高得分序列对(HSPs)，当与数据库序列中相同长度的字码比对时，询问序列或者匹配，或者满足某些阳性阈值界T。T指的是阈值界的相邻字码(Altschul等，同上文)。这些最初的相邻字码采样数最为开始检索含有它们的HSPs的源词。只要增加累积校准线，词采样数沿着每一个序列的方向被扩展。BLAST算法是对这两个序列的相似性作一个统计学分析。参见Karlinand Altschul(1993)Proc.Nad.Acad.Sci.USA 90:5873。由BLAST算法所提供的相似性测量是最小的概率(P(N))，它通过在两个核苷酸或被取代的氨基酸序列彼此匹配而提供了概率显示。

通常情况下，两个多肽之间具有大于60％的序列同一性便认为是功能性等同，假定多肽单独或以复合物的形式显示出抗凝血特性多肽之间具有共同的共同的抗原决定簇。在一个实施方案中，本发明所述同等功能多肽和该多肽序列或片段相同显示出序列同一性的程度大于60％。该多肽可能分别有大于70％，80％，90％，95％，97％，98％或99％序列相同度。

本发明所述的功能性等价多肽，因此意欲包括突变体(诸如含有氨基酸替换、插入或删除的突变体)。这种突变可能包括多肽，其中一个或一个以上的氨基酸残基被一个保守或非保守的氨基酸残基(最好是保守的氨基酸残基)取代，这样的取代氨基酸残基可能是也可能不是一个由遗传密码编码。典型的这种替换是包含在Ala，Val，Leu和Ile之中，丝氨酸和苏氨酸残基之中，其中酸性残留Asp和Glu残基之中，其中Asn和Gln残基之中，赖氨酸和精氨酸残基之中；或芳香苯丙氨酸和酪氨酸残基之中。

特别优选是其中的几个，即在5至10个，1个和5个，1个和3个，1个和2个或只有1个氨基酸被替换、删除或补充，在任何组合的变体。特别优选是不改变性质和活性的沉默替换，补充和删除。在这个方面是保守的替代也是特别优选。＂突变＂的多肽，还包括其中一个或一个以上的氨基酸残基包括一个取代基的多肽。

具有改进功能的功能性等价物，还可通过在多肽序列中的特异性残基系统或定向突变来设计。

也包括在该范围内的本发明第一和第二个方面都是活性片段，其中＂活性片段＂是指平截的多肽，即:(i)具有以单独或以复合物的形式表现抗凝血活性的功能性特点，(ii)具有与多肽共同的抗原决定簇。

本发明的活性片段，包括至少n个连续的来自本发明所述多肽的氨基酸。适当地，活性片段至少包含的n个连续氨基酸来自于SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或任意这些序列的变体、突变体或功能性等价物。n通常是7或更多(例如8、10、12、14、16、18、20、25、35、40、45、50、55或60或更多)。

本发明所述的多肽(例如本发明多肽的变体，突变体，功能等价物或片段)是可＂自由独立的＂，即不是一部分或融合于其它氨基酸或多肽，也可包含在形成部分或区域的较大多肽之中。当以一个较大的多肽组成时，在一个实施方案中的本发明所述的多肽形成了一个单一连续的区域。此外，一些多肽可由一个单一的较大的多肽组成。

在一个本发明第一和第二个方面的实施方案中，提供了一个功能性等价物或具有与本发明的多肽共同的抗原决定簇的活性片段。在一个实施方案中，抗原决定簇被hemextinA，hemextin B或一个等位基因变体共享。在一个实施方案中，抗原决定簇被SEQ ID NO.1，SEQID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4or SEQ ID NO.5.所共享。

＂抗原决定簇＂，指的是一个接触到某一特定抗体的分子片段(即抗原表位)。＂抗原决定簇＂或表位，通常由分子的化学活性表面基团，如氨基酸或糖侧链构成，并有特定的三维结构特征以及特异性电荷特性。

据了解，在本领域中，能够模拟一种蛋白质抗原决定簇的相对较短的合成肽，可以用来刺激生产蛋白质抗体(例如，见sutcliffe等人，科学219:660(1983))。抗原-表面呈递的肽和多肽能够含有，例如，至少4至10个氨基酸，至少有10至15个氨基酸，或约15至约25个氨基酸。这种抗原-表面呈递的肽和多肽可用此处所述的片段，或通过化学肽合成来生产。

此外，抗原决定簇可由随机肽库的噬菌体展示进行选择(见，例如，Lane和Stephen，Curr，Opin，免疫学5:268(1993)，和cortese等，Curr，gpin，biotechnol.7.616(1996))。鉴别抗原决定簇和由小分子肽组成的包含一个所描述的抗原决定簇的抗体产生的标准方法，例如，Mole，＂Epitope Mapping，＂in Methods in Molecular Biology，Vol.10，Manson(ed.)，p105-116(The Humana Press，Inc.1992)，Price，＂Production and Characterization of Synthetic Peptide-DerivedAntibodies，＂in Monoclonal Antibodies Production，Engineering，以及Clinical Application，Ritter and Ladyman(eds.)，p6084(CambridgeUniversity Press 1995)，以及Coligan等.(eds.)，Current Protocols inImmunology，第91-95页和第91-911页(John Wiley & Sons1997)。

这种具有抗原决定簇的多肽，可用于产生配体，如多克隆或单克隆抗体，其对本发明所述多肽具有免疫特异性。这种抗体可被用来分离或鉴别表达本发明多肽或者以亲和层析纯化多肽的克隆。抗体，也可能被用来诊断或治疗艾滋病，其中包括其他应用，这对本领域普通技术人员而言也是显而易见的。

在一个实施方案中，本发明的第一和第二个方面，提供了一种含有将本发明的多肽融合到一个肽或多肽的融合蛋白，诸如一种标记，这可能是，例如，生物活性的、放射性的、酶或荧光，或一种抗体。

举例来说，包括一或多个额外的氨基酸序列，往往是有利的，其中所述的序列可能含有分泌或前导序列，原序列，辅助纯化序列，或赋予更高的蛋白稳定的序列，例如在重组生产中。可选择地，成熟的多肽，可与另一化合物融合，诸如增加多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)。

融合蛋白也可用于为本发明的多肽活性的抑制剂筛选肽库。它可能用于表达能够被商业上可获得的抗体所识别的融合蛋白。融合蛋白也可能被基因改造，以含有位于本发明的多肽序列与一个异源多肽序列裂解位点，使该多肽可从异源多肽被裂解和纯化脱离。对于＂异源多肽＂，包括在本质上是没有发现与本发明的多肽结合的多肽。

在一个本发明第一和第二个方面的优选实施方案中，提供了一个包含序列成分的多肽:SEQ ID NO.1，2，3，4或5(优选SEQ ID NO.1，2或5)的氨基酸序列或变体、突变体、功能性等价物或活性片段。在一个实施方案中，多肽由SEQ ID NO.1，2，3，4或5(优选地是SEQ IDNO.1，2或5)的氨基酸序列或其变体、突变体、功能性等价物或活性片段构成。可以理解，本发明的多肽(例如SEQ ID NO.1，2或5)可以在培养hemextin A和hemextin B.抗体个方面具有实用性。

本发明的第三个方面提供了一种核酸分子，其中:(i)编码本发明第一或第二个的个方面多肽或，(ii)与(i)所述的核酸分子或其变体、突变体、片段或互补链杂交。

寡核苷酸可是一个引物或探针。寡核苷酸可能含有严谨条件条件下与(i)所述核酸分子的至少10，12，15，17，20，25，30，35或40个保守核苷酸杂交的核苷酸序列的区域。在本发明第三个方面的一个实施方案中，核酸分子是一个包含寡核苷酸的探针或引物，寡核苷酸包含一个核苷酸序列区域，所述的核苷酸序列在严谨条件条件下与至少10，12，15，17，20，25，30，35或40个保守核苷酸(最好是自然发生的核酸分子)杂交。所述的核酸分子编码SEQ ID NO.1，2，3，4或5(或变体，突变体或功能性等价物或活性片段，等)。在一个实施方案中，核酸分子是一个包含寡核苷酸的探针或引物。所述的寡核苷酸包含一个核苷酸序列区域，该序列区域至少与10，12，15，17，20，25，30，35或40个核酸分子(最好是自然发生的核酸分子)的保守核苷酸互补。所述的核酸分子编码本发明第一个方面的多肽，例如一个以SEQ IDNO.1，2，3，4或5(或变体，突变体或功能性等价物或活性片段，等)表示的多肽。

严谨条件可以是严谨的、中度严谨、中度/高度严谨、高度严谨或非常高度的严谨。

本领域普通技术人员能够理解由于遗传密码退化，许多编码本发明第一和第二个方面多肽的核酸分子，可能会产生一些与已知多核苷酸序列和自然产生的基因具有最小序列同一性的多核苷酸。因此，本发明包括每一种多核苷酸序列可能的变化，可以基于可能密码子选择筛选组合来制备。

此外，本领域普通技术人员能够理解密码子可能被挑选出以增加多肽或肽表达比率。所述的比率发生在某一特定的原核或真核宿主中，并与那些被宿主利用的特定密码子的频率一致。

本发明的核酸可采取RNA的形式，如mRNA，，或DNA的形式，其中包括，例如，克隆获得或合成制得的cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链或单链的。单链DNA或RNA可是编码链，也可以称为正义链，也可为非编码链，也被称为反义链。

术语＂核酸分子＂，还包括DNA及RNA的类似物，如那些含有修饰骨架的，例如，肽核酸。

测定是否将核酸分子杂交于特异性核酸的合适的实验条件，可包括载有相关样本的核酸滤纸的预浸泡，5x SSC，10分钟左右，并将滤纸在一个5x SSC溶液，5x Denhardt′s溶液，0.5％SDS和100μg/mL的变性经超声处理的鲑鱼精子DNA预杂交，然后在同样的含有浓度为10ng/ml的32-dCTP标记探针中杂交12小时大约45℃，按照Sambrook等(1989；Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2ndedition，Cold Spring Harbour，New York)所述的杂交方法操作。

然后滤纸冲洗两次，30分钟，在2×SSC，0.5％的SDS至少在55℃时(低严谨度)，至少为60℃时(中等严谨度)，至少65℃时(中等/高严谨度)，在至少70℃时(高严谨度)，或者至少为75℃(极高严谨度)。杂交通过将滤纸曝光到X光片检测。

此外，有很多条件和因素被本领域的普通技术人员所知，这可能会被用来改变杂交的严谨度。例如，杂交到特异性核酸上的核酸的长度和性质(DNA，RNA的碱基组成)；盐和其它组份的浓度，如存在或缺少甲酰胺，硫酸葡聚糖，聚乙二醇等；杂交温度的改变和/或洗涤步骤。

此外，它也有可能从理论上预言与否两个给定的核酸序列在某些特定的条件下杂交。相应地，作为一种上述经验方法的替代，关于变异核酸序列是否杂交的测定，可以理论计算T_m(熔化温度)为基础，所述的T_m(熔化温度)是两个外源核酸序列与已知序列在特定条件下，诸如盐浓度和温度。

在测定外源核酸序列(T_m(异质))熔化温度，必须先测定同源核酸序列的熔化温度(T_m(同质))。两种完全互补的核酸链(同源双键结构)之间的熔化温度(T_m(同质))，可按照下列公式确定，如在分子生物学中(John Wiley and Sons，1995年)概述的一样:

T_m(同质)＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500TmABM＝单价阳离子的摩尔浓度，

GC％＝序列总碱基数中鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的百分比，

％形式＝杂交缓冲液中甲酰胺的百分，和

L＝核酸序列的长度。

由上述公式确定的Tm是一个两种完全互补的核酸序列间的同源双键(T_m(同质))的Tm。为了使Tm值适合这两个外源核酸序列，它是假定异源序列的核苷酸序列间百分之一的差异等于Tm减少1℃。因此，异源双链结构的T_m(异质)，是通过将T_m(异质)减去类似序列与探针序列之间的序列同一性百分比的差异来获得。

本发明所述的多肽、核酸分子与抗体是＂纯化的＂。用在此处的术语“纯化”，是指＂通过人工＂由其自然状态改变而来，即如果它自然发生，它被从其自然宿主或环境改变或剔除。相关杂质可被减少或消除。在一个实施方案中，目的物种表现为优势种(即在一摩尔的基础上，它比任何其他个别物种在组成上更丰富)。在一个实施方案中，目的物种表现为实质上纯化组分。实质上纯化组分包括一个组合物，其中目的物种至少在所有生物大分子的物种的30％左右(摩尔基础)。一般来说，一个实质上纯化的组合物将包括多约80至90％的表现在组合物中的大分子种类，在一个实施方案中，对象物体被纯化到基本同质(污染物种类不能由传统的检测方法在组合物中检出)，其中，组合基本上是由单一高分子品构成。

核苷酸分子可以“裸露”的核苷酸分子或者包含核苷酸分子的载体和宿主细胞的形式提供，相关信息可参阅发明的第四和第五个方面。当核苷酸应用在病人身上时，总原则是所用的核苷酸分子应该是可以用核苷酸分子表达的多肽。本领域的技术人员包括具有适当资格的人员，如启动子等都可以轻易制备这种核苷酸分子。

本发明第四个方面提供了一种包含本发明的第三个方面所涉及的载体，如表达载体。此发明的载体可以包含形成信使核糖核酸的促进体和终结体，其中，促进体可操作的连接在核苷酸分子上，核苷酸分子可操作的连接在终结体上。载体还可以包括位置固定的核糖体，信使核糖核酸的初始和中止序列，提高和激活序列。许多原核和真核表达载体都可以买到。本领域技术人员知道如何选择合适的载体。

在一个实施方案中，载体包含编码本发明第一个方面所涉及多肽的核苷酸序列。

在一个实施方案中，载体包含编码本发明第二个方面所涉及多肽的核苷酸序列。

在一个实施方案中，载体包含编码本发明第一和第二个方面所涉及多肽的核苷酸序列。

本发明的载体还可以包含基因，例如允许可在合适宿主细胞和适当环境中筛选所述载体的标记基因。

本发明还包括包含这些载体和表达载体的重组宿主细胞。因此，发明的第五个方面提供了随着发明第四个方面所述的载体转化的宿主细胞。举例说明，宿主细胞包括细菌、酵母、真菌、昆虫、鸟类、哺乳动物和植物细胞。

在一个实施方案中，还提供了随着发明第四个方面所述的载体转化的宿主细胞，本发明第二个方面所述的多肽可以由宿主细胞表达。

在一个实施方案中，还提供了用本发明第四个方面所述的载体转化的宿主细胞，本发明第一个方面所述的多肽可以由宿主细胞表达，本发明第二个方面所述的多肽也可以由宿主细胞表达。本发明第一和第二个方面所述的多肽可由不同的载体编码，其中，宿主细胞至少可用发明第四个方面所述的两个不同载体转化。

本发明的第六个方面提供了一种制备本发明第一或第二个方面所述多肽的方法，包括在适合本发明第一或第二个方面涉及的表达多肽的条件下，培养本发明的第五个方面的宿主细胞。

在一个实施方案中，宿主细胞表达本发明第一个方面的多肽。

在另一个实施方案中，主细胞表达本发明第二个方面的多肽。

在其他实施方案中，宿主细胞表达本发明第一和第二个方面的多肽。

本发明的第七个方面提供了一种制备本发明第一或第二个方面所述多肽的方法，包括多肽的化学合成。例如:化学合成可通过缩氨酸固相反应进行。这种技术是此领域熟知的技术，此领域技术人员能够轻易实现。

本发明的第六和第七个方面所涉及的方法还包括提纯多肽，这种技术是此领域熟知的技术，此领域技术人员能够轻易实现。

如上所述，本发明的第一和第二个方面所涉及的多肽可以复合物形式提供，复合物包括本发明的第一个方面所涉及的多肽和本发明的第二个方面所涉及的多肽。复合物优选为四聚物。

因此，本发明的第八个方面提供了一种制备复合物的方法，此复合物由本发明的第一个方面所涉及的多肽和第二个方面所涉及的多肽组成。此方法包括将本发明的第一个方面所涉及的多肽和第二个方面所涉及的多肽在适于复合物合成的条件下链接。

本领域技术人员可容易的确定复合物的适当合成条件。此外，在下述具体实施例部分，适当条件包括将含有本发明第一个方面所涉及多肽和发明的第二个方面所涉及多肽的50mM缓冲溶液(Tris-buffer(pH7.4))在37℃保温5分钟。

本发明的第九个方面提供了一种包含发明第一个方面所涉及的多肽和第二个方面所涉及的多肽的复合物。

优选的，本发明第一个方面所涉及的多肽和第二个方面所涉及的多肽的比例是1:1。

优选地，复合物是两种多肽的四聚物。

在一个实施方案中，复合物可通过本发明第八个方面涉及的方法来制备。

如上所述，复合物为四聚物。

在一个实施方案中，本发明的第一个方面所涉及的多肽是hemextin A。

在一个实施方案中，本发明第二个方面所涉及的多肽是hemextinB。

同时，复合物中的多肽可以是hemextin A和hemextin B，在上述讨论中可知，一个或两个多肽可以是上述的变体、突变体、功能性等价体、活跃片段或融合多肽。发明的第十个方面提供了制备抗体的方法，此抗体可识别本发明第一或第二个方面所涉及的多肽，或者本发明第九个方面所涉及的复合物，此方法包括以下步骤:

(i)用本发明第一或第二个方面所涉及的多肽，或者本发明第九

个方面所涉及的复合物免疫动物；

(ii)由所述动物体获得抗体。

本发明的第十一个方面提供了一种可识别本发明第一或第二个方面多肽的抗体。

在一个实施方案中，抗体连接在hemextin A和hemextin B上，抗体连接在抗原表位上，如SEQ ID NO.1，2，3，4，或5所示。

在一个实施方案中，本发明第十和第十一个方面的抗体可识别本发明第一或第二个方面所涉及的多肽上的抗原决定簇，当多肽与本发明其他个方面所涉及的多肽形成复合物时，可暴露出抗原决定簇。

因此，在一个实施方案中，抗体识别由本发明第一和第二个方面所涉及的多肽形成的复合物，可将复合物作为免疫原培养这种抗体。

本发明涉及的抗体可单细胞或多细胞繁殖制备，可以是单特异性血清抗体，人抗体，还可能是杂交或嵌合抗体，如人源化抗体，改变抗体(Fab′)2片段，F(ab)片段，Fv片段，单功能域抗体，二聚或三聚抗体片段或构件，微型抗体，或连接在抗原上的功能片段。

抗体制备是本领域技术人员熟知的技术，且已公布在例如美国专利US4,011,308；4,722,890；4,016,043；3,876,504；3,770,380；和4,372,745上；也可以参照Harlow，Lane等人的《抗体-A实验室手册》和N.Y.的《Cold Spring Harbor Laboratory》(1988)。举例说明:通过对合适的动物，如老鼠，兔子，绵羊，山羊采用特定的抗原进行免疫处理，可以生成多细胞繁殖出的抗体。为提高免疫性，抗原必须在免疫处理前连接在载体上。这些载体是本领域普通技术人员熟知的。一般，将抗原混合或乳化在盐液中，特别是一种佐剂如甫氏完全佐剂中，再皮下注射混合液或乳化液，来产生免疫。试验动物通常2-6周后再加强一支或多支抗原盐液，最好用弗氏完全佐剂。抗体也可以由本领域熟知的方法—体外免疫生成，多细胞繁殖的抗体血清就可以从获得免疫的动物体内取得。

单细胞繁殖抗体可采用科勒和梅斯坦(Kohler & Milstein)在《自然》1975年256期495-497页的方法或其改进方法。典型地，上述方法可以使老鼠获得免疫，也可以用在兔子身上，但是，比起从动物身上抽血提取血清，将脾(也可选择几个大淋巴节)摘除或切开与单细胞的连接更好。如需要，脾细胞可通过细胞悬浮液或严密包裹在抗原中被筛选(摘除或断开特定连接)。表达特定抗原膜结合免疫球蛋白的B-细胞，连接在平板上，，不会被剩余悬浮液冲走。将得到的B-细胞或所有游离脾细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂种瘤，并在选定的介质(如次黄嘌呤，蝶啶胺，胸腺嘧啶介质，＂HAT＂)中培养，然后将杂种瘤稀释到一定限度，化验出与免疫抗原连接(不与无关抗原连接)的抗体。选定的单细胞克隆抗体—秘密杂种瘤就由体外(如在组织培养瓶或中空纤维反应器中)或体内(老鼠的腹中)培养出来。

本发明也应用了人源化或嵌合的抗体，嵌合抗体分子在温Winter等人1991年发表在《Nature》349期，293-299页的文章，美国专利(No.4,816,567)中论及。人源化抗体分子在瑞茨曼(Riechmann)等人1988年发表在《Nature》332期，323-327页的文章，沃森(Verhoeyan)等人1988年发表在《Science》239期，1534-1536页的文章，及1994年九月21日出版的英国专利公开出版物(No.GB2,276,169)中论及。

抗体可识别分子是说抗体能够与特定的分子反应使分子与抗体连接，本发明所涉及的抗体可以已连接发明所涉及多肽的形式，和未连接本发明所涉及多肽的形式提供。

在一个实施方案中，抗体或片段的结合亲和力大于与10⁵M^-1的结合力，优选的，大于与10⁶M^-1的结合力，更优选的，大于与10⁷M^-1的结合力，最优选的，大于与10⁸M^-1或10⁹M^-1的结合力。本领域一项普通技术可以测定抗体的结合力，如斯凯特卡特分析法(斯凯特卡特年报，NYAcad.Sci.51:660(1949))。

本发明的第十二个方面提供了一种制备本发明第一个方面、第二个方面所涉及的多肽以及本发明第九个方面所涉及的复合物的抗蛇毒血清的方法，包括利用本发明第一个方面，第二个方面所涉及的多肽以及本发明第九个方面所涉及的复合物使动物获得免疫能力，然后从动物身上收集抗体，用来制造抗蛇毒血清。

动物免疫处理可采用本发明第一个方面所涉及的一种多肽，或本发明第二个方面所涉及的多肽，或同时采用以上两种多肽，所以动物可分别提供(分别制备或复合制备)或以复合物的形式提供两种多肽。

制备抗蛇毒血清的传统方法是免疫处理哺乳动物，如马，山羊或绵羊获得对蛇毒的免疫能力。为降低毒性，蛇毒可用福尔马林处理改性。为延长吸收时间，改性蛇毒可混合在氢氧化铝溶胶中。这样得到的抗体就可以从动物身体中分离，用作病人特别是病人的解毒剂。最近，也采用非哺乳动物鸟类如鸡。在此过程中，将小鸡用小剂量目标毒蛇的毒液免疫处理，当小鸡长大，它就产生了可抗蛇毒的抗体，当小鸡开始下蛋，抗蛇毒血清蛋白遗传下来，并富集在蛋黄中，收集鸡蛋提取蛋白质，制备抗体。

将第一只动物(如马，鸡)的血清施用于患病动物(寄主)给患病动物提供了特定有效的抗体。应用的抗体就像内在抗体一样起作用，其与蛇毒结合降低毒性。

本发明的第十三个方面提供了一种有效抑制本发明第一个方面，第二个方面所涉及的多肽以及本发明第九个方面所涉及的复合物的抗蛇毒血清，它可以按照本发明第十二个方面的方法来制备，但本发明第十四个方面所涉及的的方法交替使用。

本发明的第十四个方面提供了一种识别本发明第一或第二个方面的多肽的复合分子，或本发明第九个方面的复合物分子的方法。

文中所述的“调节剂”和“调节子”(modulator＂and＂modulates＂)等是指拮抗物、拮抗剂或者具有拮抗物、拮抗剂作用的化合物。为避免歧义，“调节剂”应理解为包括可以提高发明的多肽或复合物抗凝血作用的化合物，以及可减弱本发明多肽或复合物抗凝血作用的化合物。

发明第一个方面和第二个方面的多肽可在任何一种药物筛选技术中用来筛选化合物文库，那这种化合物就可调节发明第一个方面和第二个方面的多肽及发明两种多肽复合物的活性。

在一个实施方案中，方法包括将测试化合物与发明第一个方面或第二个方面的多肽连接，并确定是否已连接，多肽可以以包含发明两种多肽的复合物形式提供。方法还包括确定测试化合物是否提高或减弱发明第一个方面或第二个方面的多肽的活性，或提高或减弱发明的两种多肽的复合物的活性。

本发明第一或第二个方面的多肽的活性，包括:(i)当多肽(如存在发明第一个方面的多肽的情况下)单独存在时，多肽作为抗凝血剂的活性；(ii)与发明其他个方面涉及的多肽形成活性化合物的能力(多肽发生复杂化合反应的能力或者得到复合物的反应可被影响(iii)复合物的活性。测定抗凝血活性的方法已在上文描述，在具体实施例也会提及。这种方法包括凝血素实验。拮抗物、拮抗剂、激动剂的活性也可以通过这里描述的外源tenase复合物抑制的试验来测定。

测定测试化合物是否提高或减弱本发明所涉及多肽或多肽复合物的活性的方法，是本领域技术人员公知的，包括如相接实验/软件或X-射线结晶学。

用在本发明筛选方法中的本发明所涉及的多肽或多肽复合物可以在溶液中的形式，或附着在固体支撑物上，粘在细胞表面或位于细胞内部。

测试化合物(例如潜在调节剂))会以多种方式表现，包括自然或改性的培养基，酶，受体，小有机分子如分子量达到2000道尔顿的自然或合成有机分子，优选800道尔顿或更小的有机分子、肽类似物、无机分子、肽、多肽，抗体，或上述物质的结构或功能类似物。

测试化合物可从如细胞，无细胞制剂，化学文库或自然产物混合物中被分离，调节剂可以是自然或改性的培养基，配体，酶，受体或结构、功能类似物。为适当了解这种筛选技术，可参照Coligan等.，Current Protocols in Immunology 1(2):第5章(1991)。

与拮抗物、拮抗剂、激动剂结合的好的化合物是结合于本发明所涉及的多肽和多肽复合物的分子。

分子(如拮抗物)可通过竞争性连接在本发明涉及的多肽或多肽复合物的受体上而可选择地功能化。

分子(如拮抗物)可通过结合在本发明涉及的多肽或多肽复合物的受体上，增加受体和发明涉及的多肽或多肽复合物的结合力而可选择地功能化。

潜在的调节剂(如拮抗物)包括有机小分子，肽，多肽以及连接在发明涉及的多肽上的抗体，从而抑制或消除活性。以这种方式，多肽或多肽复合体对正常细胞束缚分子的连接会被抑制，这样多肽或多肽复合体的自然生物活性也被消除。

在上述实施方案中，可采用简单的结合力试验，其中可通过标签(label)直接观测测试化合物与多肽或多肽复合体表面的结合，或间接连接于测试化合物，或在化验中引入与标签物质的竞争物。

另一种可采用的药物筛选技术提供了与目的多肽或多肽复合物有适当结合力的化合物的全面筛选(参见国际专利申请W084/03564)，由此，在固体基质上合成出大量不同小分子量测试化合物，然后与发明涉及的多肽或多肽复合体反应并冲洗。一种固定多肽或多肽复合体的方式是采用非中和抗体，采用本技术领域熟知的方法，可观测被固定的多肽或多肽复合体。纯化的多肽或多肽复合体也可以直接包覆在平板上，用在上述筛选技术中。

硅法可用来测定调节剂活性，如需要，可采用实验方法确定调节剂活性。

本发明的第十五个方面涉及一种药物组合物，包括第一个方面或第二个方面涉及的多肽，第三个方面涉及的核苷酸，第四个方面涉及的载体，第五个方面涉及的宿主细胞，第九个方面涉及的复合物，第十一个方面涉及的抗体，第十三个方面涉及的抗蛇毒血清，第十四个方面涉及的调节剂。

在一个实施方案中，药物组合物包括发明第一个方面涉及的多肽或其编码核酸。

在一个实施方案中，该药物组合物包含本发明第二个方面的多肽或其编码核酸。

在一个实施方案中，该药物组合物包含(i)本发明第一个方面的多肽其编码核酸分子；

(ii)本发明第二个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子。

包含本发明第一和第二个方面多肽的药物组合物，该组合物中的多肽可以通过包含两种多肽的复合物的形式提供，也可以通过非复合物多肽的形式提供。

在一个实施方案中，本发明第一个方面的多肽与第二个方面的多肽的比例是在1:2到2:1的范围内。更优选地，是在1:1.5至1.5:1的范围内；更优选地，是1:1.25至1.25:1，更优选地，是1:1.15至1.15:1；更优选地，是1:1.1至1.1:1；更优选地，是1:1.05至1.05:1，以及更优选地，是约1:1。

当多肽比例为1:1时，该多肽表现为四聚体形式，即包括本发明第一个方面的2条多肽和本发明第二个方面的2个多肽。

本发明的药物组合物，可包含一个药物上可接受的载体。该组合物单独施用或至少与其他的媒介物联合施用，如一个如何无菌情况下都可以施用的稳定化合物。

生物相容性药用载体包括，但不仅限于，生理食盐水，缓冲盐水，葡萄糖和水。

用在本发明中的药物组合物，可以通过任何编号的途径施用，包括但不仅限于，口服，静脉注射，肌肉注射，动脉内，脑室内(intracerebroventricularly)，髓内，鞘内，脑室，透皮吸收，皮下，腹腔，鼻腔，肠道，局部，舌下含化，或直肠内的手段。

除了活性成分，这些药物组合物可能含有适合的药物上可接受的载体，包括辅料和助剂。这些辅料和助剂能够促进活性化合物加工成药物上可应用的制剂。进一步配制和施用的技术细节，可参考最新版本的雷明顿的制药科学(Maack出版，伊斯顿宾州)。

口服的药物制剂，可通过活性化合物与固体辅料结合而获得，也可以通过加工由此产生的混合物颗粒(可选的，经过研磨)以获得药片或糖衣而获得。如果需要的话，也可以添加合适的助剂。适当的辅料包括碳水化合物或蛋白质填充剂，如糖类，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇；淀粉玉米，小麦，水稻，马铃薯，或其他植物纤维素，如甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯树胶(arabic)和西黄芪树胶(tragacanth)；和蛋白质，如明胶和胶原质。如果需要的话，可以添加崩解或溶解剂，如以交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂，褐藻酸或盐，如海藻酸钠。

辅料可用适当包膜包裹，如浓缩的糖溶液，其中还可能含有阿拉伯树胶，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，卡波普凝胶，聚乙二醇，及/或二氧化钛，紫胶漆溶液(lacquer solution)，以及适合有机溶剂或溶剂混合物。染料或颜料，可添加到药片或糖衣片作为产品标识或表征活性化合物的量，即剂量。

可用于口服的药物制剂包括明胶制成的压接式胶囊，以及软，密封的明胶制成的胶囊和包膜，如甘油或山梨醇。压接式胶囊可含活性成分与填料或粘结剂的混合物，如乳糖或淀粉，润滑剂，如滑石粉或硬脂酸镁，并选择性地，选用稳定剂。在软胶囊中，活性化合物可能被溶解或悬浮在合适的液体中，如脂肪油，液体，或液体聚乙二醇或无稳定剂。

适合肠外给药的制药配方可在水溶液中按配方制造，优选地，是在生理上兼容的缓冲器，例如汉克斯液，林格氏液，或生理缓冲盐水。水中悬浮物注射液可能含有增加悬浮液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠，山梨醇，或右旋糖酐。此外，活性化合物的悬浮液，可制成适当的油性注射液。合适的亲脂性溶剂或载体，包括不饱和脂肪酸脂，如麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯，三酸甘油脂，或脂质体。非脂聚阳离子氨基酸聚合物的要求，也可用于运载。或者，悬浮液也包含适合的稳定剂或增加化合物溶解度的因子，而且还可采用高浓度溶液的制剂。

对于局部或鼻腔给药，适当的能够透过特殊屏障的渗透剂，可以按照配方使用。这样的渗透剂在本领域是已知的。

本发明的药品成分可以本领域公知的方式制成，例如，通过常规的混合，溶解，制粒，制成糖衣片，研磨，乳化，灌封，entrapping或冷冻干燥过程。

药物组合物可作为盐提供，也可以与许多酸性物质形成，其中包括但不仅限于，盐酸，硫酸，醋酸，乳酸，酒石酸，苹果，和琥珀酸。盐类比相应的自由基地的形式更趋于易溶于水性或其他质子溶剂。药物组合物制备后，可以放置在一个适当的容器和标记指示状态的处置。这种标记可能包括数量，频率和使用的方法。

对于适合用在本发明中的药品组合物所包括的组合物，其中的活性成分是包含在可达到预期的目的一个有效的用量中。一个有效的剂量的测定是本领域普通技术人员多公知的。

对于任何化合物来说，其治疗有效剂量的初步估计或者通过细胞培养试验，例如，对肿瘤细胞，或通过动物模型，如小鼠，大鼠，兔，狗，或者猪。动物模型也可用于确定适当的浓度范围及给药途径。这些资料可以用来确定有用的剂量及对人的给药途径。

治疗有效剂量是指减轻症状的活性成分的用量。疗效与毒性，可通过在细胞培养中的标准的药学程序或实验动物，例如通过计算ED₅₀或半数致死量统计资料来确定。治疗作用的毒性剂量率是治疗指数，它可以表示为LD₅0/ED₅₀比例。其中表现大的治疗指数的药物组合物是优选的。从细胞培养实验和动物研究获得的数据是用于按方配制人用的剂量范围。包含此种组合物的剂量在循环浓度的范围内是优选的，所述的循环浓度包括的ED₅₀很少或根本没有毒性。在这个范围内剂量的不同取决于加工时的剂型，病人的敏感度，以及给药途径。

精确的剂量将取决于医生根据需要治疗的病人的相关因素来确定。剂量和给药被调整到以提供足够浓度的活性成分或维持理想效果。可以考虑的因素，包括病情的严重性，病人的一般健康状况，其年龄，体重和性别，给药的时间和频率，药物组合物和反应灵敏度，及对治疗的反应。长效型药剂成分可每3至4天，每个星期，或双周给药，具体视其特定成分的半衰期和清除率而定。

虽然上述讨论的是关于本发明的药品组合物，它应被理解为这种讨论可能也适用于本发明的其他医疗产品或个方面，其中包括了本发明所述的＂联合制剂＂和＂药物＂。

本发明的第十六个方面提供了本发明第一或第二个方面的多肽，本发明第三个方面的核酸分子，本发明第四个方面的载体，本发明第四个方面的宿主细胞，本发明第九个方面的复合物，本发明第十一个方面的抗体，本发明第十三个方面的抗蛇毒血清，能被本发明第十四个方面用于医药的方法所鉴别的调制剂。在一个实施方案中，医疗用途是使用病人需要的抗凝疗法治疗病人。

＂需抗凝治疗的病人＂，包括病人或对过量的凝血症状易感者。过量的凝血对于特定病人，是指任何程度的可能有害病人健康的凝血。这些症状可能包括一项或多项下列内容:血栓病，脑栓塞，冠状动脉疾病，心肌梗死，脑血管疾病，中风，肺栓塞，静脉血栓形成，下肢深静脉血栓，静脉炎，表浅周边动脉疾病，弥散性血管内凝血(DIC的)，血栓性静脉炎，静脉血栓形成，再狭窄，peripheral anginaphraxis，血管病血栓形成，缺血性脑血管血栓，血栓形成有关的疾病，不稳定型心绞痛，不稳定型心绞痛，血栓闭塞性脉管炎。

由于此处使用的＂治疗＂(与语法变体)是指无论在任何情况下，任何的及所有的用于纠正疾病状态或症状，防止疾病发生，或以其他方式阻止，妨碍，阻碍，或扭转疾病疾病进展或其他不良症状的应用。因此，所谓＂治疗＂，包括预防性和治疗性的处理。

本发明的第十七个方面提供了一种用于治疗需抗凝治疗的病人的联合制剂，该联合制剂包括:

(i)本发明第一个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子；

(ii)本发明第二个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子。

(i)及(ii)可以本发明第九方面的复合物形式提供或分别提供。

本发明第十八个方面提供了本发明第一个或第二个方面的多肽，本发明第三个方面的一个核酸分子，本发明第四个方面的载体，本发明第五个方面的宿主细胞或者本发明第九个方面的复合物在制备一种需抗凝治疗的病人所需药物上的应用。

在本发明第十八个方面的一个实施方案中，提供了一种本发明第一个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子在制备一种需抗凝治疗的病人所需药物上的应用。

可选的，该药剂同时，单独或连续的顺序与本发明第二个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子给与病人。

在一个实施方案中，将本发明第二个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子施用于患者。

在本发明第十八个方面的一个实施方案中，提供了提供了一种本发明第二个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子在制备一种需抗凝治疗的病人所需药物上的应用。

可选的，该药剂同时，单独或连续的顺序与本发明第一个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子给与病人。

在一个实施方案中，病人被给与了本发明第一个方面的多肽或编码相同核酸分子。

本发明第十九个方面提供了下列物质:

(i)本发明第一个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子；

(ii)本发明第二个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子。

在制备一种需抗凝治疗的病人所需药物上的应用。

此处所使用的＂组合制剂＂，包括了医药制剂，其中包括:(i)本发明第一个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子；(ii)本发明第二个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子。(i)及(ii)的成分可能出现在一个单一配方或可能出现在单独的配方中。如果(i)及(ii)出现在单一配方中，它们可能会以复合物的形式提供，还可以非复合多肽(或当然是一个两种混合物)的形式提供。

因此，该活性成分在同一时间内(如同步)，或在不同的时间(如:按顺序)并在不同的时间内施用于病人，这可能是单独独立于另一个或与另一个相重叠。

如果有单独或连续给药，第二治疗剂的推迟给药不应如失去本发明所述的治疗剂的药物组合物发挥的协同治疗效果的益处。两次组分给与的延迟时间，将于组分确切性质，相互作用，以及各自的半衰期的不同而变化，组合物可以按任何顺序施用。

在一个实施方案中，组份(i)与组份(ii)的比例是在1:2到2:1的范围内。更优选地，是在1:1.5至1.5:1的范围内；更优选地，是1:1.25至1.25:1，更优选地，是1:1.15至1.15:1；更优选地，是1:1.1至1.1:1；更优选地，是1:1.05至1.05:1，以及更优选地，是约1:1。

本发明第二十个方面提供了一种治疗需要抗凝疗法的病人用的方法，该方法包含对病人施用本发明第一个或第二个方面的多肽，第三个方面的核酸分子，第四个方面的载体，第五个方面的宿主细胞，第九个方面的复合物或第十五个方面的药物组合物。

本发明的第二十一个方面提供了一种治疗需要抗凝疗法的病人用的方法，该方法包括对病人施用:

(i)本发明第一个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子；

(ii)本发明第二个方面的多肽或编码相同多肽的核酸分子。

正如上面所讨论的，(i)和(ii)，可以表现为单独的配方或者作为一个包含(i)和(ii)单一的配方。凡是单独配方的形式，(i)和(ii)，可分别施用、按顺序或同时施用。

(i)和(ii)可以以本发明第九个方面的复合物的形式提供。

本发明的第二十二个方面提供了一种治疗被蛇咬伤病人的方法，该方法包括对病人施用，本发明第一个或第二个方面的多肽，第三个方面的核酸分子，第四个方面的载体，第五个方面的宿主细胞，第九个方面的复合物或第十五个方面的药物组合物。

本发明的第二十三个方面提供了本发明第一个或第二个方面的多肽，第三个方面的一个核酸分子，第四个方面的载体，第五个方面的宿主细胞或者第九个方面的复合物以及第十五个方面的药物组合物，在制备一种治疗被蛇咬伤病人所需药物中的应用。

虽然本发明已在特定地方对本发明的特定方面进行了描述，但本领域普通技术人员应能理解这些内容可同样适用于本发明的其他方面，并且说明书应据此相应地诠释。

本发明的实施，除另有注明外，将采用传统的分子生物学技术，微生物学技术和基因重组技术。所述的这些技术包含在本领域所采用的这些技术之内。这些技术在文献中被充分地解释。供参考的实例，包括:Sambrook Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第三版(2000)以及随后的版本。

实施例

这里介绍了可介导眼镜蛇H.haemachatus(非洲环颈血蝮蛇)毒液抗凝血活性的三指毒素的纯化和鉴定。尽管其具有温和的抗凝血活性，但是与第二种三指毒素的协同作用增加了它的抗凝作用。这里描述了该复合物形成的一些特征。抗凝蛋白及其复合物通过TF-FVIIa特异性地抑制FX的活性。这是第一个独特的通过抑制TF-FVIIa复合物表现抗凝作用的三指毒素协同复合物。

材料和方法

材料——低压冻干的H.haemachatus毒液获自非洲爬行动物和蛇毒，Gauteng，南非。凝血激酶与钙(用于凝血酶原时间衍生法)，鲁塞尔(氏)喹蛇毒液(RW)(用于蛇毒止血时间测定)，凝血酶试剂(用于凝血酶时间测定)，苯甲脒盐酸化物以及4-乙烯吡啶购自Sigma公司(St.Louis，MO，美国)，β-巯基乙醇购自Nacalai Tesque(Kyoto，日本)。显色底物是H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilide(pNA)二盐酸盐(2HCl)，(S-2288)，pyro-Glu-Pro-Arg-pNA·HCl(S-2366)，H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl(S-2238)，H-D-Pro-Phe-Arg-pNA·2HCl(S-2302)，Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl(S-2765)，pyro-Glu-Gly-Axg-pNA·HCl(S-2444)，benzoyl-Ile-Glu(GluγOMe)-Gly-Arg-pNA·HCl(S-2222)，H-D-Val-Leu-Lys-pNA·2HCl(S-2251)，H-D-Val-Leu-Arg-pNA·HCl(S-2266)和MeO-Suc-Arg-Pro-Tyr-pNA·HCl(S-2586)来自Chromogenix AB，Stockholm。

FIXa(H-D-Leu-Ph′Gly-Arg-pNA.2AcOH)购自美国Dignostica Inc.，Stamford，CT。所有底物在使用前在去离子水中重构。冷冻干燥的重组人凝血激酶(Innovin)购自德国Dade Behring Marburg。人原血浆由健康自愿受试者捐献。所有其它化学药品以及试剂均为可获得的最高纯度。

抗凝血蛋白的纯化——采用AKTA纯化装置(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)将H.haemachatus天然毒液(100mg溶于1ml蒸馏水中)用Superdex 30凝胶过滤柱过滤(1.6 x 60cm)，并用50mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液平衡，并用同样的缓冲液进行洗脱。利用凝血酶原时间凝固试验来分析每一成分的抗凝血活性(见下文)。将有效的抗凝血活性成分混合，在相同色谱系统中再利用阳离子交换柱来进行亚分类。把抗凝血成分填装到Uno S-6柱(Bio-Rad，Hercules，CA；柱体积为6ml)，并用50mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液平衡。结合的蛋白质用加有1M NaCl的相同缓冲液进行线性梯度洗脱。将收集的成分用于抗凝血活性试验。将通过阳离子交换色谱法获得的抗凝血峰组分装入用0.1％三氟醋酸(TFA)平衡的Jupiter Cl8(1 x 25cm)柱。结合的蛋白质用含有80％乙腈(ACN)的0.1％TFA缓冲液进行线性梯度洗脱。收集各峰的组分，低压冻干，以备抗凝血活性试验使用以及随后的采用Chromeleon微液色谱系统(LC Packings，San Francisco，CA)的窄内径Pepmap柱的再次色谱法分析试验。

电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)——用Perkin-Elmer Sciex的API-300 LC/MS/MS系统通过ESI-MS法来测定抗凝蛋白的均质性及质量。典型地，可将RP-HPLC部分直接用于分析。离子喷射的喷孔以及环的电压分别是4600，50和350V。喷雾气以及气幕采用氮气。溶剂(0.1％含有40％ACN的TFA)输送装置采用50μl/分钟的低速LC-IOAD Shimazdu泵。采用BioMultiview软件(Perkin-Elmer Sciex)分析和解卷粗质谱。

还原以及吡啶乙基化——利用已知方法⁽²⁴⁾对蛋白质进行还原和吡啶乙基化。简单地说，将蛋白质(0.5mg)溶解于500μl的变性剂缓冲液(6M的盐酸胍，0.25M Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.5)中。添加10μl的β-巯基乙醇到混合物中后，真空中37℃孵育2小时。再向混合物中添加4-乙烯吡啶(50μl)，室温放置2小时。吡啶乙基化的蛋白质用Jupiter Cl 8分析柱(4.6 x 250mm)进行梯度纯化，流速为0.5ml/min，缓冲液为含有0.1％(v/v)CAN的TFA。

N-末端测序——采用Perkin-Elmer Applied Biosystems 494pulsed-液相测序仪(Procise)以及在线的785A PTH-氨基酸分析器进行自动化Edman降解来测定天然的以及S-吡啶乙基化的蛋白质序列。

抗凝血复合物的重构—之前的研究表明，有效的抗凝血蛋白质与另一种毒液蛋白互作形成具有协同作用的复合物。该复合物可以通过体外试验在试验前立即将两种蛋白质(除非另外提到)按等量分子浓度在50mM Tris缓冲液(pH7.4)中，37℃孵育5分钟，就可以构建成各种不同的复合物。

抗凝血活性——通过采用BBL fibrometer的四种凝固试验来测定H.haemachatus毒液及其组分的抗凝活性:

1、复钙时间:按照Langdell等人的方法⁽²⁵⁾来测定复钙时间。50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)(100μl)，血浆(100μl)以及不同浓度的毒液或它的成分(50μl)在37℃预孵育2分钟。在添加50μl50mM的CaCl₂溶液后开始凝固。

2、凝血酶原时间:按照Quick的方法⁽²⁶⁾来测定凝血酶原时间。100μl50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，100μl血浆以及50μl的毒液或它的成分在37℃预孵育2分钟。在添加购自Sigma(St.Louis，MO，USA)的凝血激酶和钙试剂(150μl)后开始凝固。

—为了研究静电相互作用，通过50mM含有不同浓度NaCl(35mM-150mM)的Tris-HCl(pH7.4)溶液来监控特定浓度的hemextin A(4.4μM)，hemextin B(4.4μM)和hemextin AB复合物(0.11μM)的抗凝活性。

—为了研究疏水性的相互作用，通过50mM含有不同浓度甘油(125mM-250mM)的Tris-HCl(pH7.4)溶液来监控特定浓度的hemextin A(4.4μM)，hemextin B(4.4μM)和hemextin AB复合物(0.11μM)的抗凝活性。

3、蛇毒止血时间:蛇毒止血时间的测定是按照Hougie介绍的方法⁽²⁷⁾确定的。血浆(100μl)，50mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)(100μl)以及RW(0.01μg/100μl)和单一的蛋白质或改造的复合物(50μl)在37℃预孵育2分钟。在添加50μl50mM的CaCl₂溶液后开始凝固。

4、凝血时间:凝血酶时间是按照Jim介绍的方法⁽²⁸⁾来确定的。将单一蛋白或重构复合物与100μl的血浆以及100μl，50mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)在总体积为250μl体系下37℃孵育2分钟。在添加标准的凝血酶试剂后开始凝固(50μl中添加0.01NIH单位)

凝胶过滤色谱法——不同抗凝蛋白之间复合物的形成是通过利用AKTA纯化仪的Superdex 30凝胶过滤柱(1.6 x 60cm)的凝胶过滤色谱法来检测的。滤柱用流速为1ml/min的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)来平衡。将单一蛋白质以及等量分子的抗凝蛋白混合物(37℃孵育30分钟)载入过滤柱，并用同样的缓冲液进行洗脱。洗脱在280nm下进行。

FVIIa的纯化—按照参考文献⁽²⁹⁾的方法大量制备FVIIa。简单地说，通过纯化以及从15000L人血浆纳过滤的4.5g FVII。通过在10℃下孵育18小时将FVII完全活化为FVIIa后，将FVIIa制品在20mM含有240rnM NaCl以及13mM甘氨酸、pH6.9的柠檬酸盐溶液中透析。透析后的FVIIa置于-60℃冷冻保存。

sTF的制备—按照参考文献⁽³⁰⁾所述的方法制备重组体人sTF(TF负型，跨膜以及胞内区域，含有氨基酸的1-219位)。简单地说，构建sTF产物的表达载体并在啤酒酵母中表达。重组体sTF被分泌到发酵液中，然后通过两步柱层析法分离。

外在X复合酶的改造—通过10pM FVIIa与70nM重组体人TF(Innovin)在缓冲液A(20mM HEPES，150mM NaCl，10mM CaCl₂and1％BSA，pH7.4)中37℃孵育10分钟完成TF-FVIIa复合物的重构。然后向混合液中添加FX至终浓度为30nM。孵育15分钟后，向每50μl反应混合液中添加50μl的终止溶液(20mM HEPES，150mMNaCl，50mM EDTA以及1％BSA，pH7.4)后终止激活状态。通过将1mM S-2222水解在缓冲液A中，并利用微量滴定板读写器在405nm处测定形成的FXa。通过在添加FX之前15分钟添加单一蛋白质或抗凝复合物来测定对外在X复合酶活性的抑制作用。

丝氨酸蛋白酶特异性—通过抗12种丝氨酸蛋白酶-前凝血丝氨酸蛋白酶(FIXa，FXa，FXIa，FXIIa，血浆激肽释放酶和凝血酶)，抗凝蛋白丝氨酸蛋白酶(APC)，溶解纤维蛋白丝氨酸蛋白酶(尿激酶，t-PA和纤维蛋白溶酶)和典型的丝氨酸蛋白酶(胰岛素和胰凝乳蛋白酶)来检验抗凝蛋白及其复合物的选择性。不同浓度的纯化的hemextinA/hemextin B和重组的hemextin AB复合物与每种酶(表1)37℃下预孵育5分钟，然后再加入合适的显色底物。

表1

 

丝氨酸蛋白酶	底物	对照抑制剂	实测效果
				FVIIa	S-2288	过苄脒	抑制
FVIIa-sTF	S-2288	过苄脒	抑制
				FVIIa-TF	S-2288	过苄脒	抑制
IXa因子	Spectrozyme flax	过苄脒	不抑制
				FXa	S-2765	过苄脒	不抑制
IXa因子	S-2266/S-2302/S-2366	过苄脒	不抑制
				IXa因子	S-2302	过苄脒	不抑制
血浆激肽释放酶	S-2266/S-2302/S-2288	过苄脒	抑制
				凝血酶	S-2238	过苄脒	不抑制
t-PA	S-2288	过苄脒	不抑制
				APC	S-2366	过苄脒	不抑制
尿激酶	S-2244/S-2484	过苄脒	不抑制
				降纤酶	S-2251	抑酞酶	不抑制
糜蛋白酶	S-2586	抑酞酶	不抑制
				胰岛素	S-2222	过苄脒	不抑制

为了研究FXIa、激肽释放酶以及尿激酶，在筛选抗抑制剂之前首先确定它们的合适的底物。对于FXIa，确定了对应于显色底物S-2266，S-2302和S-2366的酰胺酶活性V_max。S-2302具有最高的底物活性V_max，因此被用于筛选研究。同样地，我们对激肽释放酶与底物S-2266，S-2302和S-2288以及尿激酶与底物S-2444和S-2484进行了试验。微量滴定板单孔总体积是200μl，测定了FVIIa终浓度(300nM)/S-2288，FVIIa-sTF(30nM)/S-2288，FXa(0.75nM)/S-2765，α-凝血酶(0.66nM)/S-2238，纤维蛋白溶酶(2nM)/S-2366，FIXa(3μM)/

，FXIa(0.34nM)/S-2366，FXIIa(0.4nM)/S-2302，重组体组织纤维蛋白溶酶原激活剂(80nM)/S-2288，激活蛋白C(0.34nM)/S-2366，尿激酶/S-2444，血浆激肽释放酶(0.4nM)/S-2302，胰岛素(2.17nM)/S-2222以及胰凝乳蛋白酶(0.4nM)/S-2586。测量5分钟以上的底物水解作用的动力学速率(mOD/min)。

底物水解作用动力学常数的测定—所有的试验都是在含有50mM pH8.0的Tris-HCl，150mM NaCl，10mM CaCl₂以及1％BSA的测试缓冲液中37℃下进行。在测定单一hemextin以及hemextin AB复合物的抑制作用以前，先测定FVIIa-sTF的显色底物S-2288水解作用的动力学常数。在含有FVIIa(30nM)与sTF(100nM)复合物的终体积为180μl的96孔板每孔中添加S-2288(0—5mM)后开始反应。利用SPECTRAmax 

温度控制的微量培养板分光光度计(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)通过405nm(A405nm)处的吸光值来测得5分钟以上的初始反应速度线性增加。通过测得的速度非线性回归拟合获得Km值为2.79mM。

抑制作用动力学—通过大范围底物浓度变化来测定抗凝血复合物的抑制潜能性。在微量滴定板的小孔中将酶辅助因子与抑制剂预混合后添加S-2288启动反应。FVIIa-sTF的反应包含0.0125-0.05μM抑制剂复合物以及0至3mM的S-2288。在稳定状态下测试5分钟以上的起始速度，并通过反复的非线性回归与方程1的拟合，它展现一种经典的非竞争性抑制剂，并获得K_i值。

V＝V_max[S]/(l+[I]/Ki)/{Km+[S]}.................(Eq.1)

等温滴定量热法(ITC)试验—用VP-ITC滴定量热系统(MicrocalInc.，Northampton，MA)来测定抗凝剂hemextin AB复合物与FVIIa的互作。该仪器采用内装电刻度校验来标记刻度。将50mM的含有FVIIa(10μM)的Tris-HCl以及10mM CaCl₂(pH7.4)置于量热孔，再用溶于250μl注射器的含有同样缓冲液的重组的抗凝复合物(0.2mM)在37℃300rpm连续搅拌下滴定。在滴定前，将所有的蛋白质溶液进行过滤和脱气。由于初始几次注射出现基线错误，因此拟合法不包含这些数据。利用仪器本身配套的Microcal OriGln Version 7.0数据分析软件将量热数据处理以及拟合成为相同位点单一组合模型。按照方程式2来计算活性孔体积V₀中的溶液的总产热量Q(通过非配对的种类设置为0来确定)，其中K为亲和力常数，n是位点数量，ΔH是配体结合的热函，M_t和X_t分别是大分子以及配体的容积浓度，结合时 $X+M\↔\mathrm{XM}.$

$Q=\frac{n{M}_t\mathrm{\ΔH}{V}_0}{2}[1+\frac{X_t}{n{M}_t}+\frac{1}{n{K}_a{M}_t}-\sqrt{{(1+\frac{X_t}{n{M}_t}+\frac{1}{n{K}_a{M}_t})}^2-\frac{4X_t}{n{M}_t}}]....................(\mathrm{Eq}.2)$

测定的两次连续注射完成之间的热变化(ΔQ)是按照标准的Marquardt方法将孔内的蛋白质以及配体溶液进行校对的。按照下面的关系计算互作之间的自由能变化(ΔG):ΔG＝ΔH-TAS＝-RT In K_a，其中T为绝对温度，R为普适气体常数。

CD分光镜试验——利用Jasco J-810分光旋光计(JascoCorporation，Tokyo，Japan)记录远紫外CD光谱(260-190run)。所有测定均利用光路长度为0.1cm的比色杯在室温下进行。通过30l/min的氮气来洗涤光学器械。光谱的扫描速度为50nm/min，分辨率为0.2nm以及谱带宽度为2nm。每个光谱扫描6次，取平均值后减去基线。利用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)来监控不同浓度的hemextinA以及hemextin B的构象。为了研究复合物的形成，我们采用了将hemextinA浓度保持为0.5mM，而变化hemextinB浓度的滴定试验。

分子直径的测定——hemextin AB复合物以及单一hemextin的分子直径都采用气相和液相两种方式来测定。

(A)气相电泳迁移率大分子分析仪(GEMMA)——利用GEMMA(71，72)的纳微分迁移率分析仪，3980模型(TSI，St Paul，MN，USA)以及标准的CPC 3025型(TSI，St Paul，MN，USA)来测定分子直径。仪器的操作设置为“锥形喷射”模式，电压大小为2.5-3.0kV，产生的电流大小为200-300nA。为了稳定电喷射，消除电晕放电，我们采用2l/min的过滤大气气体以及0.1l/min的滤过CO2气体的同心鞘气流。在试验前，用20mM醋酸铵(pH7.4)配制hemextin A(4ng/ml)和hemextin B(4ng/ml)样品溶液，现配现用。将hemextin AB复合物(4.5ng/ml)在上述缓冲液中重新配成溶液，37℃孵育10分钟。另外一种从相同毒液中分离纯化得到的三指蛋白毒素C，在GEMMA试验中用作对照。将样品按照流速为100nl/min注入电喷射室。在整个EM直径范围内(0到25nm)记录扫描20次，并取平均数获得GEMMA光谱。数据的表示采用非平滑算法。

(B)动态光散射(DLS)—用BI200SM仪(Brookhaven InstrumentsCorporation，Holstvile，NY，USA)在25℃条件下通过DLS来研究复合物的形成。试验光源为一垂直偏振氩离子激光器(514.2nm，70mW；NEC GLG-3112型)。在试验前，配置hemextin A(4mM)，hemextin B(4.1mM)以及hemextin AB复合物(2.3mM)样品溶液，现配现用。记录hemextin AB复合物以及单一hemextin在不同离子强度以及不同甘油浓度溶液中，25℃条件下的水动力学直径。通过添加NaCl来改变离子强度。测定平移扩散系数(D_T)可以利用Stokes-Einstein关系式计算出流体半径(R_H):

D_T＝k_BT/6πηR_H...................(Eq.3)，

这里k_B是Boltzmann常数，T是开(尔文)氏温度，η是溶剂的粘滞度。利用仪器本身自带的BI-9000数字相关器获得强度-强度时间相关函数。通过分析利用约束正则化CONTIN方法(73)的相关函数|g⁽¹⁾(τ)|来获得颗粒大小以及大小的分布情况。

质子作用—为了研究复合物形成的质子作用，我们还采用了在PBS，pH7.4或10mM MOPS，pH7.4溶液中的量热试验。

静电相互作用的功能—通过采用不同离子强度的50mMTris-HCl缓冲液的ITC试验来评估复合物形成的静电相互作用的功能。通过添加氯化钠(NaCl)来改变缓冲液中的离子强度(35mM到150mM)。

疏水性相互作用的功能—通过采用50mM含有不同浓度甘油(125mM-250mM)的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)来研究复合物形成的疏水性相互作用的功能。

分子筛析色谱法(SEC)试验—采用AKTA纯化系统(AmershanBiosciences，Uppsala，Sweden)的预先装好的Superdex 75凝胶过滤柱(1.6 x 60cm)，所有SEC试验均在室温下进行。使用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)或特定的洗脱液洗柱，流速为1ml/min。样品上柱体积为4ml。用卵类粘蛋白(28KD)，核糖核酸酶(15.6KD)，细胞色素C(12KD)，apoprotinin(7KD)以及pelovaterin(4KD)(20)作为过滤柱的分子量标准。通过跑葡聚糖蓝测定空白的体积。在每循环之前用至少2个柱床体积的洗脱缓冲液平衡过滤柱。通过检测利用含有不同浓度NaCl(75mM-150mM)的50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)的洗脱物来研究在hemextin AB复合物形成中的静电作用。通过记录50mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)的洗脱物来确定在复合物形成中的疏水作用。在两个试验中，先用目的缓冲液平衡柱，再将用各自缓冲液重悬的hemextinAB复合物溶液上柱。通过280nm处的吸光值来检测蛋白质的洗脱。

1D-NMR分光镜试验—利用装备有现代冷冻探针的Bruker 600MHz核磁共振波谱仪以及电子变温元件来进行一维质子NMR试验。利用光谱仪接口的Topspin软件(Bruker)获得光谱。用50mMTris-HCl缓冲液(pH7)配置Hemextin A(0.5mM)和hemextin B(0.5mM)溶液，然后将溶液转入5mm Willmad NMR管。所有的氘化试剂都购自Aldrich实验室，其同位素纯度为99.9％。¹H₂O试验的谱宽设置为16p.p.m，传感器/输送器置于水信号的位置，最大限度的降低假象。通过WATERGATE脉搏来连续抑制水质子引起的大量共振现象。典型地，每个FID扫描128次，再切趾之前先平均，然后进行傅立叶转化。¹H化学位移以2，2-二甲基-2-硅戊烷-5-磺酸钠(DSS)溶液为参考。

结果

抗凝蛋白的纯化—天然的H.haemachatus毒液同时在再钙化试验以及凝血酶原时间分析试验中都具有有效的抗凝血活性(图1A和图1B)。天然毒液通过凝胶过滤色谱(法)按照粒级纯化抗凝蛋白(图2A)。通过凝血酶原时间试验确定了对应于峰2和3的成分含有抗凝蛋白。峰2对应的蛋白质，大多数含有已经鉴定的PLA2(31)。而峰3含有较缓和的抗凝血活性(插图2A)。因此，我们目标集中到分离峰3中含有的抗凝蛋白，其用Uno S柱通过阳离子交换色谱法进一步分离(图2B)。只有峰A表现出缓和的抗凝血活性。初步研究表明，峰A的抗凝血活性是由峰B加强的(见下)。因此，抗凝血复合物特异地抑制外在的tenase复合物(描述如下)，将其命名为hemextin(Hemachatus extrinsic tenase inhibitor)，其单体蛋白分别命名为hemextin A和B。对应于hemextin A和B的部分各自混合，并用RP-HPLC(图2C and图2D)以及毛细管液相色谱法(图2E and图2F)纯化。利用ESI-MS来确定单一蛋白质的同质性以及质量。hemextinsA和B的质谱具有3次质/荷比的峰值，其范围为3-6个电荷(数据未显示)，其质量量经计算分别为6835.00±0.52和6792.56±0.32道尔顿(图2G和图2H)。

氨基端序列的确定—利用埃德曼降解来测定hemextins A和B前37个氨基酸残基序列(图3)。通过测定吡啶基乙醇酯蛋白的序列确定该两种蛋白质的半胱氨酸的位置。这两种蛋白质都与心脏毒素、突触后神经毒素、纤维束以及其它三指毒素家族成员类似(图3)，因此它们属于蛇毒蛋白家族。

Hemextins的抗凝血活性—利用凝血酶原时间试验来测定hemextins A和B的抗凝血活性(图4A)。Hemextin A凝固时间延长，并具有较缓和的抗凝血活性，相反地，hemextin B即使在较高浓度下都不对凝血时间产生显著效果。更有趣地是hemextinsA和B等摩尔混合之后具有更有效的抗凝血活性，因此表明这两种蛋白质具有协同作用(图4A)。抗凝血活性如此的增加可能是由于凝血连锁反应的两个独立步骤的任一抑制或由于它们之间复合物的形成。而hemextin B自身在凝血酶原时间上不具有显著作用，它不能抑制独立的步骤；因此，hemextins A和B形成复合物的可能性很大。

Hemextins A和B之间复合物的形成—为了研究这两种蛋白质之间复合物的形成，将滴定试验用于凝血酶原时间测定。在该试验中，保持hemextins A浓度4.4μM不变，利用hemextin B浓度增加来监控其抗凝血活性(图4B)。抗凝血活性随着hemextin B浓度的增加，直到比率为1:1。进一步浓度增加并不能增加抗凝血活性。这些结果显示hemextins A和B之间按1:1形成复合物，并且复合物形成是抗凝血活性有效的关键。

通过凝胶过滤色谱法进一步确定了hemextins A和B之间复合物的形成。如图5所示，单一hemextin A和B的滞留时间为约70min。然而，重构的复合物洗脱物在滞留时间约40min时具有较大的峰值，在滞留时间约70min时的峰值较小。滞留时间减少的主峰的出现与两种hemextins之间复合物的形成是一致的。

抗凝血活性位点—如前所述，hemextinA及其与hemextin B形成的复合物，可以延长凝血酶原时间(图4A)。我们采用简单的“分割方法”来确定外源性凝血途径的特定时期^(32，33)。采用三种名为凝血酶原时间，蛇毒止血时间以及凝血酶时间的常规实验来进行凝血时间试验(图6A)。该方法基于的原理是启动抑制步骤“上游”级联反应将延长凝固时间，而启动抑制步骤“下游”级联反应就不会影响凝固时间。因此，单一蛋白质以及复合物的抗凝血活性可以定位在级联反应一定的活性阶段(图6B-D)(详情请参阅参考文献32，33)。在凝血酶原时间试验中，hemextinA能够延长凝血时间，具有缓和的抗凝血作用，但是却不能延长蛇毒止血时间以及凝血酶时间(图6B)。如我们所预料的，hemextin B在凝血酶原时间试验、蛇毒止血时间试验以及凝血酶时间试验中都不能延长凝血时间(图6C)。在凝血酶原时间试验中，hemextin AB复合物具有延长凝血时间的有效抗凝血活性。然而，在其它2种试验中，凝血时间却不受影响(图6D)。这些结果表明hemextin A和hemextin AB复合物仅仅影响外在的tenase复合物，而不能影响凝血酶原酶复合物或不能将纤维蛋白素原转换成纤维蛋白凝块。

为了确定抑制作用位点，因此测定了hemextins A和B以及它们的复合物对TF-FVIIa复合物的作用(图7A)。在高浓度时，hemextinA具有更为缓和的抑制活性。与其相反地，hemextin B对外源的tenase复合物的酶促作用不具有任何抑制活性。然而，hemextinAB复合物在IC₅₀(抑制50％活性的抑制剂的浓度)的值为100nM时，具有完全的抑制外源性tenase活性(图7A)。在后面的筛选试验中，都未观察到单一蛋白或复合物介导的对FXa酰胺酶活性的抑制作用(见下文)。我们采用类似的滴定试验来确定hemextin AB复合物形成对TF-FVIIa复合物的抑制。Hemextins A的浓度保持50μM不变，通过增加hemextin B的浓度来确定其对外源性的tenase活性的抑制作用。如图7B所示，hemextin A的抑制活性随着hemextin B浓度的增加，直到比率为1:1。额外继续添加并不能增加抗凝血作用。该结果表明，hemextins A和B形成1:1的复合物，并且该复合物形成是抗凝血活性有效的关键。hemextins A和B等摩尔比值后额外增加并不能增加抑制活性。这些发现进一步确定了hemextins A和B之间复合物形成的重要性。为了解磷酯的作用，我们监测了存在或不存在sTF情况下，hemextin A和hemextin AB复合物对FVIIa酰胺酶活性的抑制作用。在两种情况下，我们观察到剂量依赖方式的有效抑制活性(图8A和图8B)。

抑制的特异性—采用12种丝氨酸蛋白酶来筛选确定hemextin A和B以及它们的复合物来确定抑制的特异性。如图9所示，除FVIIa以及血浆激肽释放酶外，对任何其它的丝氨酸蛋白酶都不具有抑制活性。在FVIIa存在情况下，hemextin A和hemextins AB复合物以剂量依赖的方式抑制血浆激肽释放酶(图10)。hemextin B不具有抑制血浆激肽释放酶活性。然而，对FVIIa(存在或不存在sTF情况下)抑制的有效性至少比对血浆激肽释放酶高50倍。

抑制动力学——为了确定抑制的机制，采用测定hemextin AB复合物对sTF-FVIIa复合物在底物S-2288酰胺酶活性的抑制动力学。动力学试验显示hemextin AB复合物非竞争性的抑制FVIIa-sTF的活性。Lineweaver-Burk图显示随着抑制剂浓度的增加，V_max减少，而K_m保持不变(图11A，表2)，该特征是非竞争性抑制剂的特征。测定的抑制K_i值为25nM(图1IB)。同时计算了不同浓度抑制剂的酶变率(K_cat)(每分钟每产生一摩尔酶的底物的摩尔数)。在观察到经典的非竞争性抑制中，K_cat随着hemextin AB复合物浓度的增加而降低(表2)。由于单独地FVIIa酰胺酶活性非常低(34)，因此我们没有单独研究hemextin AB复合物对FVIIa酰胺酶活性的抑制动力学。

表2

 

[抑制剂]μM	Vmax	Km(mM)	Kcat(1/min)
				0.0	1.06E-04	3.8	3518
0.0125	7.37E-05	3.9	2456
				0.0250	5.51E-05	3.9	1835
0.05	3.75E-05	4.0	1252

ITC试验—我们同时还监测了随着hemextin AB复合物与FVIIa结合引起的热力学变化(图12)。该结合为放热过程，其中ΔH＝-7.931kcal.M^-1，ΔG＝-7.543kcal.M^-1，ΔS＝-1.25kcal.M^-1。计算获得的结合K值为4.11×10⁵M^-1。

复合物形成过程中的构象变化—研究表明hemextin A和hemextin B相互作用形成1:1四聚体复合物，该复合物的形成具有能够抑制FVIIa以及凝血启动的能力，因此非常重要⁽⁷⁴⁾。我们利用远UV-CD来检测hemextin AB复合物形成过程中的构象变化。首先，记录了单一hemextin A和B在不同浓度下的单个CD谱(图14A和图14B)。hemextin A和hemextin B在217nm处为负的最小，在196nm处为正的最大，这主要是由于各自酰胺生色团的π→π^*以及n→π^*的转变，具有代表性的是β-折叠结构(图14A和图14B)。然而，在高浓度时的两种蛋白质中都观察到了聚集作用(图14A和图14B)。接着，采用滴定CD试验来研究两种蛋白质复合物的形成。在该试验中，hemextin A的浓度保持0.5mM不变，记录添加不同浓度的hemextin B时hemextin A的构象发生变化(图14C和图14D)。随着hemextin B的增加，β-折叠结构数量增加。因此，hemextin AB复合物表现出更稳定的β-折叠结构。当hemextin A与hemextin B的浓度达到1:1时，再添加hemextin B，光谱并未观察到明显变化(图14C)。因此CD试验表明hemextinAB复合物的形成伴随着β-折叠构象的稳定，并确定了1:1的化学量论。

复合物形成过程中分子直径的改变—利用气相和液相来测定单一hemextins以及hemextin AB复合物的直径。利用GEMMA气相来测定它们的电泳迁移率，hemextin A和hemextin B具有近似的大小分别为10.2±0.38nm和8.82±0.42nm的分子直径(图15)。hemextins AB复合物的直径较大，为16.3±0.43nm。由于GEMMA是研究蛋白质互作的较新技术(75)，因此通过测量位于hemextin A和hemextin B的分子直径上的另外一种蛋白质(毒素C，从H.haemachatus毒液中分离的到)来进一步验证实验结果。通过凝血酶原时间试验(数据未显示)确定毒素C不影响抗凝血活性，也不与hemextin A形成复合物。利用GEMMA技术，毒素C在等摩尔浓度下不影响hemextin A或hemextin B的分子直径(图14)。采用DSL技术测定了位于50mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)的单一hemextin以及hemextin AB复合物的铃动力直径。通过对hemextin A，hemextin B和hemextin AB复合物的单一态散射(单众数分布)的观察，显示样品制备的同质性，流体直径分别为10.3nm，9.9nm和16.8nm(图16A)。Hemextin A和hemextin B一混合，就出现了单分散性大分子(表现为分布较狭窄)，由此说明了定义明确的复合物的形成。然而，hemextin AB复合物的大小与估计的四聚体大小相比小很多，由此说明该复合物为刚性结构(76)。

Hemextin AB复合物形成的热力学—利用ITC技术来测定复合物形成的热力学。每次注射都是放热反应(图17)。结合等温线拟合为单一的结合位点模型，由此说明hemextin A和B之间为等摩尔结合。hemextin A和hemextin B的互作在热力学上是允许的(由放热自由能改变表明)(表3)。有利的焓放热，但是不利的熵变放热，说明该复合物的形成受焓驱动。另外，正如通过GEMMA和DLS试验数据表明，放热熵变确定了刚性复合物的形成。hemextin AB复合物形成中观察到的结合常数(K_a)为2.23 x 10⁶M^-1，在生物学有关过程中K_a值随着蛋白质互作而降低，其范围为10⁴to至10¹⁶M^-1(70)。

表3

 

温度(℃)	缓冲液	Ka×106(M-1)	ΔH(kcal/mole)	ΔS(cal/deg.mole)	ΔG(kcal/mole)
						10	50mM Tris(pH7.4)	0.64	-6.85	-2.24	-6.22
25	50mM Tris(pH7.4)	2.07	-9.92	-4.43	-8.6
						37	50mM Tris(pH7.4)	2.23	-11.7	-8.645	-9
45	50mM Tris(pH7.4)	1.97	-13.12	-12.49	-9.15
						37	50mM Tris(pH7.4)+35mM NaCI	0.63	-10.5	-7.2	-8.2
37	50mM Tris(pH7.4)+75mM NaCl	0.33	-9.32	-4.8	-7.8
						37	50mM Tris(pH7.4)+100mM NaCl	0.02	-7.31	-3.82	-6.12
37	50mM Tris(pH7.4)+150mM NaCl	0.002	-5.01	-1.2	-4.6
						37	50mM Tris(pH7.4)+125mM glycerol	0.32	-10.8	-11.01	-7.6
37	50mM Tris(pH7.4)+175mM glycerol	0.2	-10.5	-10.6	-7.2
						37	50mM Tris(pH7.4)+250mM glycerol	0.05	-9.4	-10	-6.4

温度对复合物形成的影响—试验温度可能影响若干蛋白质与蛋白质、蛋白质与肽的互作的量热焓。采用温度范围为10-45℃来研究hemextin A与hemextin B结合的温度依赖性，在图18A和表3中显示了体现温度作用的热力学参数焓(ΔH)、熵(ΔS)和自由能(ΔG)。在所有温度下，复合物的形成都是焓驱动的。依赖于温度的数据可以用作测定复合物形成热容量的改变(ΔC_p＝δΔH/δT)。在这个温度范围内ΔH对温度的曲线是线性的(图18A)。Hemextin A与hemextin B结合的线性产率的倾斜ΔC_p为-177cal mol^-1deg^-1。结合反应得ΔC_p较小表明刚性复合物的形成^(77，78)，这也同样支持了前面的试验观察结果。同样地，在蛋白质与蛋白质互作中经常可观察到负的热容量变化，这主要归因于溶剂的易疏水表面被覆盖⁽⁷⁰⁾。不同温度下，hemextinA与hemextin B结合的ΔH与ΔS比值的曲线图显示约1.1的斜率(插图，图18B)，该斜率是蛋白质与蛋白质结合过程中常见的^(79-83)，它主要是由于焓/熵的代偿作用。这由大量的高ΔC_p值直接导致的，因为(δΔH/δT)_p＝ΔC_p并且(δ(TΔS)/δT)_p＝ΔC_p+ΔS，因此如果ΔC_p>>ΔS，ΔH和TΔS随温度变化大体上应一致(＝ΔC_p)，并且可以相互补偿。在测定的温度范围内，ΔG变化最小(图18A)。通常ΔH和ΔS的值为负值，这再一次说明了hemextin A与hemextin B的结合倾向于焓变而不是熵变。ΔH对温度呈线性相关表明解离和结合形式平衡的两种状态的结合过程。

缓冲液离子化作用对复合物形成的影响—这种观察到的量热焓变是由于结合反应以及其它所有的相关反应导致的(水结合(解离)作用、物质的电离作用、稀释以及混合的产热等)。为了利于结合，内表面氨基酸残基可以质子化或去质子化，从而导致缓冲液中质子的交换。在这种环境下，由于量热焓主要依赖于缓冲液电离作用焓，所以量热滴定主要在磷酸盐以及MOPS，pH7.4的缓冲液中进行。在复合物形成过程中，观察到焓变(ΔH_obs)(表3)随着缓冲液离子化焓变(ΔH_ion)的增加而增加。量热焓对应于参与互作的质子(n_H ⁺)的电离作用焓以及结合焓按照下面关系式被校正为质子化作用(ΔH_bin)曲线。

ΔH_obs＝ΔH_bin+n_H ⁺.ΔH_ion......(Eq.4)

正性斜率表明从缓冲液中摄取质子的倾向，负值表明释放质子到缓冲液的倾向。该曲线(图19A)表明了复合物形成的值n_H ⁺为-0.57，结合焓(ΔH_bin)为-3.638kcal/mole。因此，hemextin AB复合物形成与纯质子释放到缓冲液相关。

hemextin AB复合物形成的静电相互作用—静电相互作用对蛋白质与蛋白质的互作起着重要作用，它提供了结合界面的特异性。利用ITC、SEC以及DLS来评估复合物的静电相互作用。首先，hemextinAB复合物形成的结合常数是通过ITC在增加离子强度的缓冲液中完成的。利用不同浓度的NaCl来改变缓冲液的离子强度。复合物形成的log K_a值随着NaCl浓度的增加线性下降(图19B，表3)，表明复合物形成过程中静电作用参与的可能性。其次，通过SEC来测定缓冲液离子强度对hemextin AB复合物组合的影响。如前所述⁽⁷⁴⁾，hemextin A和B洗脱物为四聚体复合物，而单一的hemextins洗脱物为单体(图20A)。利用含有不同浓度的NaCl的缓冲液洗脱的复合物来研究复合物形成的静电相互作用的功能。如图20B所示，75mMNaCl可以促使四聚体解离成二聚体。在高离子强度下(NaCl 150mM)的复合物洗脱物大多数为二聚体和单体形式。利用ESI-MS和HPLC分析得出二聚体的峰值表明同时含有两种hemextin A和B(数据未显示)。该结果再次说明了静电相互作用可能参与了hemextin AB复合物的形成。有趣的是，另外的峰值蛋白质洗脱速度比单体慢，表明在高离子强度的缓冲液中hemextin A和/或hemextin B经历了构象的变化。因此，我们分析了高离子强度下的缓冲液对单一hemextin A和B的洗脱谱。hemextin A在75mM NaCl浓度下具有2个峰；第二个峰蛋白洗脱比单体要慢。利用150mM NaCl浓度洗脱hemextin A大多数位于第二个峰。利用ESI-MS和HPLC分析第二个峰表明结构上是完整的hemextin A(数据未显示)。因此，高离子强度缓冲液的hemextin A洗脱谱的改变暗示了蛋白质构象的改变，并用1D NMR试验进一步验证了该结果(见下文)。然而，缓冲液离子强度的增加，对hemextin B的洗脱没有影响(图20A和图20B)。

利用DSL同样测定了高离子强度缓冲液中的hemextin AB复合物以及单一hemextin的流体直径(图16B)。在高盐浓度下，hemextinAB复合物表现出高多分散性表明不同形式物质的存在。在75mMNaCl浓度下，至少存在3种不同形式的物质；除了单体和四聚体外，还存在表观分子直径为12.4nm的一类物质。基于SEC的结果(图20B)，直径为12.4nm的物质可能是二聚体hemextin AB复合物。正如所预料的，当NaCl浓度增加到150mM时，直径为12.4nm的物质的数量增加(图16B)。并且，DLS数据同样也表明四聚体复合物向二聚体的解离。有趣的是，在高离子强度缓冲液中的hemextin A也存在多分散性(图16B)。另外对于它本身大小10.4nm外，还存在一类大小为11.57nm的微粒。通过SEC(图20B)以及ID-NMR(见下)可以表明11.57nm的这类物质可能是hemextin A构象改变的形式。随着缓冲液离子强度的改变，并未观察到hemextin B流体直径的变化(图16B)。这些结果表明，随着浓度的增加，四聚体复合物解离为二聚体和单体。解离很可能是由于亚基静电相互作用的干扰和/或hemextinA构象的改变所致。

我们利用测定高离子强度缓冲液的复合物和单一hemextin的抗凝血活性来解释hemextin A构象的变化以及四聚体复合物的解离。随着NaCl离子强度增加到100mM(图21A)，hemextin AB复合物的抗凝血活性降低。然而，盐浓度的进一步增加并不能显著影响抗凝血活性。在150mM NaCl浓度时，复合物存在的混合物有二聚体，单体以及构象改变的hemextin A(图20B)。然而，高浓度的NaCl不影响hemextin A的抗凝血活性(图21A)。因而，尽管构象发生了改变(见下)，hemextin A仍然维持其抗凝血活性。因此，由于hemextin A的存在，在NaCl为150mM浓度时仍然观察到了抗凝血活性。从这些结果可以得出如下结论:在高盐浓度下形成的二聚体对抗凝血活性无任何意义。

hemextin AB复合物形成的疏水性相互作用—疏水性相互作用是复合物形成的驱动力。仍然用ITC，SEC和DLS测量复合物形成的疏水性相互作用的重要性。ITC试验在浓度增加的甘油缓冲液中进行。甘油在蛋白质周围形成疏水层，因此抑制疏水性相互作用。随着甘油浓度的增加，结合常数下降(图19C和表3)，表明复合物形成时疏水性相互作用的重要性。通过Superdex 75过滤柱来测定hemextin AB复合物在含有甘油的缓冲液中的洗脱(图20C)。在含有高甘油浓度的缓冲液中，四聚体解离成二聚体或单体。ESI-MS和HPLC方法分析得到的二聚体峰表明其含有hemextins A和B两种物质(数据未显示)。然而，未观察到构象改变的hemextin A所对应的另外的峰。单一hemextin在甘油中的洗脱保持不变(图20C)。在DSL试验中还观察到在甘油存在下hemextin AB复合物的解离(图16C)。在125nM甘油浓度下，除了观察到单体和四聚体复合物外，还观察到大小为12.8nm的一类物质。根据SEC试验推测12.8nm的这类物质为二聚体。大小为12.8nm的这类物质随甘油浓度的增加而增加(图16C)。值得注意的是，这类二聚体与在高离子缓冲液条件下形成的二聚体的表观分子直径不同(12.8nm比12.4nm；图16B和图16C)。(由于GEMMA工作原理基于纳-ESI，因此不能用此方法测量含有高盐以及高甘油缓冲液的分子直径)。在甘油缓冲液中，未能观察到单一hemextin的多分散性(图16C)。这些研究表明疏水性相互作用对hemextin AB复合物的形成起着重要作用。

采用测定含有不同浓度甘油的缓冲液的单一hemextin来进一步理解hemextin AB复合物的解离以及其抗凝血活性。随着甘油浓度的增加，hemextin AB复合物的抗凝血活性降低(图21B)。当甘油浓度为125mM时，复合物的抗凝血活性没有降低。当甘油浓度为250mM时，复合物的抗凝血活性虽然有所降低，但是其仍然比单一hemextinA的活性高。此外，单一hemextin的抗凝血活性不受甘油的影响(图21B)。SEC分析显示在甘油浓度为250mM时，复合物的组成为二聚体和单体的混合形式(图20C)。当甘油浓度为250mM时，二聚体的抗凝血活性高于单一的hemextin A，但是低于四聚体。因此，甘油中形成的二聚体与在盐溶液中形成的不同；并且甘油中形成的二聚体的抗凝血活性比单一的hemextin A高，而后者中形成的二聚体却不是。

缓冲液条件对hemextins构象的影响——前面SEC(图20B)和DLS(图16B)的研究表明，在盐溶液缓冲液中，hemextin A的构象发生了变化。因此，利用ID-NMR试验来分析不同缓冲液条件下hemextin A和B构象的变化(图22)。在NaCl存在的条件下，在4.8ppm和6ppm之间的Hα共振峰数量减少(图22A)。不同氨基酸残基之间形成所有三指毒素中常见的反平行β折叠结构，这样使得Hα之间氨基酸残基出现NOE交叉峰，进而引起化学位移⁽⁸⁴⁾。因而，在NaCl存在情况下观察到了hemextin Aβ折叠结构减少。另外，侧链化学位移也发生了几处改变。一个显著的改变就是，盐存在的情况下，在负的化学位移值(-0.38ppm)处出现一个高的隔离的甲基峰。这些发现更有力地支持了在NaCl存在下，hemextinA的构象发生改变。在添加甘油后(氘化的)，hemextin A的ID质子核磁共振光谱整体分布仍然抑制，只是在酰胺区域发生微小的改变(图22A)。因此，在添加甘油后，hemextin A的构象并未发生明显的改变。对hemextinB采用相同的试验，结果显示在NaCl或甘油存在下，由于光谱频率几乎都是一一配对的，所以其构象都未发生任何改变(图22B)。

讨论

在机体受伤或创伤之后，凝血的启动是生物体存活的保证。然而，非必要血块的形成是有害的，因此需要抗凝治疗。目前采用的治疗此类病症的抗凝药都是非特异性的，并且有效药浓度范围很窄，因此需要严格仔细的实验监控来达到最佳的药效以及最大限度的减少出血。其还并发于其它因素如饮食⁽³⁵⁾。因此，人们努力寻求一种新的抗凝剂以及抗血小板试剂。由于FVIIa是血液凝固的关键启动因子，并且其在血浆中浓度非常低，因此其是抗凝剂设计以及研制的药靶。到目前为止，仅鉴定出两种能特异性的抑制TF-FVIIa的蛋白质，它们分别是组织因子通道抑制剂(TFPI)以及线虫抗凝肽c2(NAPc2)。TFPI是该复合物的内源性的抑制剂⁽³⁶⁾，而NAPc2是外源性的抑制剂，它分离自犬十二指肠虫Ancylostoma caninum⁽³⁷⁾。TFPI大小为42kDa，其是由三个串联的Runitz型结构域组成的一种血浆糖蛋白。其第一和第二结构域能够分别抑制TF-FVIIa和FXa。该分子的第三个Runitz结构域以及C-端的碱性区域具有肝素的结合位点⁽³⁸⁾。TFPI的抗凝血作用分为两步。首先第二Runitz结构域与分子FXa结合使其失去活性。接着第一结构域迅速与临近的TF-FVIIa复合物结合，阻止FX的进一步的激活^(39-41)。另外，NAPc2是一种大小为8kDa的短肽。它作用的机制是其首先必须与FXa或酶原FX结合形成一种二元的复合物，然后才能与膜结合的TF-FVIIa互作并抑制其活性⁽⁴²⁾。因此，尽管结构上存在差异，这两种抑制子都与TF-FVIIa-FXa形成四元的复合物。然而，在两种复合物中，FVIIa的活性位点被各自的抑制子覆盖而不暴露在外。

由于缺乏天然能够特异性干扰FVIIa活性的抑制子存在，所以人们设计和制造了大量的人工合成抑制子。它们包括那些能够阻止TF和FVIIa结合的蛋白质，诸如抗TF或FVIIa的抗体，TFAA(对FX不具有辅助因子作用的TF突变体)，FFR-VIIa(比天然的FVIIa对TF具有高5倍亲和力的非活化形式的FVIIa)以及来自TF或FVIIa的肽类^(43-50)。另外，还发现了两个系列的肽外结合位点抑制子，它们筛选自噬菌体展示文库，具有与TF-FVIIa复合物结合的能力^(43-44)。它们与FVIIa的丝氨酸蛋白酶结构域的两个不同的外结合位点结合，表现出空间及其构象的抑制⁽⁴⁶⁾。尽管两类肽能够有效并选择性地抑制TF-FVIIa复合物，但是即使在饱和浓度下也不能100％的抑制其活性。这个问题已经通过两类肽的融合(47)或利用蛋白酶调控底物噬菌体⁽⁴⁵⁾解决了。人们设计了大量的能够抑制FVIIa以及TF-FVIIa复合物活性位点的合成化合物^(48，51-54)。近来，有报道多种甲萘脒对FVIIa活性具有抑制作用。它们是通过脒基苯甲醛类似物与聚苯乙烯树脂偶联而成。然而，虽然这些合成的化合物能够抑制FVIIa的活性，但是它们却仍然对其它凝血丝氨酸蛋白酶具有非特异性的抑制⁽⁵⁵⁾。

这里介绍了来自H.haemachatus毒液的两类蛋白质hemextin A和hemextin B的分离和鉴定，以及由于协同作用引起的抗凝血作用。hemextin A和hemextin B都属于蛇毒蛋白三指家族(图3)。尤其地，只有hemextin A具有较为缓和的抗凝血活性，而hemextin B不具有抗凝血活性(图4A)。然而，hemextin B能够协同增强hemextin A的抗凝血活性，并且它们的复合物表现出更有效的抗凝血活性。在添加hemextin B后hemextin A抗凝血效果的增加(图4A)说明两种蛋白质之间可能形成复合物。利用凝血酶原时间试验分析得出1:1的复合物的形成对有效的抗凝血活性至关重要(图4B)。利用凝胶过滤色谱法进一步确定了复合物的形成(图5)。

利用“剖分法”^(32，33)，鉴定出hemextin A及其增效复合物的抗凝血作用位点(图6A)。利用三种普通的凝血时间试验得出，hemextinA和hemextin AB复合物能够抑制外源性的tenase复合物，但在外源途径中没有其它的步骤(图6B-D)。利用hemextin A及其复合物对重组的TF-FVIIa复合物的作用进一步验证了该结果。hemextin AB复合物以及hemextin A都能抑制依赖于重组的外源性的tenase复合物的FXa的形成(图7A)。有趣的是，hemextin A和hemextin AB在sTF存在与否的条件下都能抑制FVIIa的酰胺酶活性，其IC₅₀分别约为100nM和105nM(图8A和图8B)。几乎相同的IC₅₀值表明hemextin A和hemextin AB复合物并没有与FVIIa的辅助因子结合位点结合。hemextin A和hemextin AB复合物的抑制活性可能不是由于hemextin A或hemextin AB复合物与外源性的tenase复合物的磷脂的非特异互作，由于它们不能抑制磷脂表面仍然形成的促凝血球蛋白复合物，所以不能延长蝰蛇毒止血时间。该结果通过测定hemextin A和hemextin AB复合物对利用sTF和FVIIa重组的外源性的tenase复合物的酰胺酶活性来进一步验证了(图8A)。此外，hemextin A和hemextin AB复合物能够抑制FVIIa的酰胺酶活性。然而，hemextin B在缺乏hemextin A的情况下不具有任何的抑制活性。为了进一步的鉴定抑制特性以及确定抑制的特异性，我们将hemextins A和B以及hemextin AB复合物进行抗12种丝氨酸蛋白酶筛选。除了FVIIa及其复合物外，hemextin A以及hemextin AB复合物还具有依赖于剂量方式的对激肽释放酶的酰胺酶的活性的抑制。然而，激肽释放酶的抑制IC_5O值为约5μM，而FVIIa/FVIIa-TF/FVIIa-sTF的抑制IC_5O值为约100nM。动力学研究显示hemextin AB复合物对FVIIa-sTF复合物的抑制是非竞争性的，其Ki值为25nM。ITC试验表明hemextin AB复合物能够直接与FVIIa互作。FVIIa和hemextin AB复合物之间的结合互作伴随着自由能的负变化，由此表明该复合物形成是有利的。结合的熵负向变化表明两组分之间紧密折叠复合物的形成(56)。因此，这些数据更有力的表明hemextin AB复合物是FVIIa的高特异性的天然抑制因子。

一些其它的来自蛇毒的抗凝血剂同样能够抑制外源性tenase复合物。然而，它们不具有特异性。例如，CM IV，其是一种来自Najanigricollis的强抗凝血磷脂酶A₂(PLA₂)，它能通过抑制两步连续的凝血连锁反应从而能够延长凝血时间。它对TF-FVIIa复合物的作用具有酶的和非酶的两种机制⁽⁵⁷⁾，然而其对凝血酶原酶复合物的抑制只有非酶的机制^(58，59)。这里首次介绍了hemextin A及其增效复合物，它们能够特异性的抑制来自蛇毒的FVIIa。

相同的对TF-FVIIa复合物和FVIIa的剂量依赖性抑制表明，hemextin AB复合物的抑制活性既不需要TF的参与也不干扰TF和FVIIa的结合。与TFPI和NAPC2不同的是，它与FVIIa的结合不需要以FXa为支架，因此对FVIIa的抑制不需要FX或FXa的参与。此外，TFPI和NAPC2能够与FVIIa的活性位点结合。相反，hemextinAB复合物是一种非竞争性的抑制子，所以它不通过与活性位点结合而互作。因此，hemextin A以及hemextin AB复合物是FVIIa以及TF-FVIIa复合物的新的抑制因子。

CD研究表明该复合物形成使得β-折叠结构趋于稳定(图14)。这种相互作用也导致刚性结构的形成。这反映在构象熵损失与hemextinAB复合物的形成相关联(表3)。GEMMA和DLS研究表明在气相和液相实验，复合物形成期间表观分子直径均增加(图15和16)。由这些技术得到的分子直径几乎是同等的。然而，表观的分子大小比天然蛋白质理论估计的直径大许多，并比完全＂伸展构造＂的估计长度小很多(85，86)。这种异常应归于该蛋白质的非球状结构(87)。

ITC为研究大分子在溶液中的相互作用提供了可能，并且它是唯一能够分辨结合亲合性的焓和熵部分并由此分辨在初始和最终状态之间的吉布斯自由能差异。由ΔH倾向于负变化鉴定了hemextin A和hemextin B之间的相互作用。因而，范德华相互作用和氢键在该复合物的形成中起着重要的作用。hemextin A和hemextin B之间相互作用观察到的有力参数显示其对试验温度的具有强依赖性。尽管在焓和熵随着温度改变中观察到差异，自由能变化仍然是最小(图18A)5暗示焓-熵的补偿。弱的分子间相互作用经历不断地重排实现结合自由能降低(91-93)，这种现象在蛋白质-肽相互作用中是一种常见特征。图18B显示大量蛋白质-蛋白质系统互相作用的熵和焓之间的这种相关性(r²＝0.956)。hemextin AB复合物形成的数据沿于这条相关线。

根据热力学定律，对ΔH和ΔS的温度依赖性是由于ΔCp的改变。在几乎所有的蛋白质关联过程中，如果以游离组分作为基准则ΔCp为负号(94)。在hemextin AB复合物形成中观察到结合的ΔCp为-177-cal mol^-1deg^-1。

负ΔCp的改变显示非极性溶剂可及表面积的减少，其按照如下方程式(95):

ΔC_P＝0.45(ΔASA_nonpol)-0.26(ΔASA_pol)cal/molK..........(Eq.5)

其中，ΔASA_pol和ΔASA_nonpol分别是极性和非极性可及表面面积的变化。大的负的ΔCp变化已在蛋白质-肽相互作用、受疏水作用支配的蛋白质折叠^(96，97)以及与溶剂暴露的疏水残基的掩埋相关的复合物形成^{(80，81，98，99)}中观察到。相反，极表面面积的掩埋有助于产生弱的正ΔC_P。hemextin AB复合物形成的ΔCp是负值，虽然弱于典型蛋白质-蛋白质相互作用⁽⁷⁰⁾。负的ΔCp支持这种由Tanford提出的疏水作用标准模型，并且其随着溶剂分子的重组，从而增加溶解熵。这个过程与在hemextin A-hemextin B相互作用中观察到的不利ΔS相矛盾。然而，这种现象在蛋白质-蛋白质相互作用中并不是罕见的^(101-110)。这种观察到的不利ΔS可能是由于发生在hemextin A和/或hemextin B的结合(图14)和/或由于在互相作用蛋白质接触面的水分子的结合。Ladbury等认为这种在高度水化的特定内表面内水分子的自由度的限制将会对ΔC_P产生实质的负面影响，如同在多个蛋白质-蛋白质复合物中观察到的那样^{(80，112-114)}。水分子在内表面通过氢键担当介于蛋白质和配体之间相互作用的分子桥^(113，115)或改变蛋白和配位体表面形状互补性^(116，117)。

hemextin AB四聚体在高盐的情况下解离为二聚体和单体(图19B，2OB，16B，21A和表3)。因而，直觉地怀疑库伦相互作用参与复合物形成。然而，当由极性基团之间的相互作用支配结合时，将产生弱的正ΔC_P。相反，观察到的ΔCp负值与通过螯合水分子形成的包含＂桥＂氢键的一种结合界面形成相一致，或与发生的结合构象变化相一致。如同hemextin A在盐存在的情况下发生构象变化(图22A和23A)，四聚体在高离子强度缓冲液中的解离可能是由于hemextin A的构象变化。然而，静电相互作用在复合物形成中的作用是不能被排除的。

hemextin AB四聚体在有甘油参与的情况下也解离成二聚体和单体(图20C，19C，16C和21B)。因而疏水性相互作用在该复合物形成中起重要作用。这同时支持在ITC实验中不同温度下观察到的负的ΔC_P的变化(图18A)。此外，这种解离不是由于hemextins的构象变化，因为甘油不影响单一hemextin的构象(图22和23)。因此，疏水性相互作用可能提供该复合物形成的驱动力。

hemextin AB复合物的形成模型——分别来自hemextin A和B的各两如前所述，hemextin AB二聚体在高盐中不同于在有甘油参与的情况下成形的二聚体。前者二聚体表观的分子直径为12.4nm且缺乏抗凝血活性，而后者二聚体表观的分子直径为12.8nm并且展现出稍微较高的抗凝血作用(图23)。因而，四聚体解离为二聚体可能发生在hemextin A和B之间相互中用的两个不同面中。一个面对其环境的离子强度灵敏，而另一个对甘油灵敏(图23)。此外，在有盐参与的情况下，hemextin A经历一种能干扰四聚体形成的构象变化(图23)。在高离子状态下成形的二聚体缺少抗凝血位点(图23中由虚线半圆形标记)。相反，在第二个面中疏水性相互作用占优势。因此，甘油离解四聚体成二聚体。然而，这样唯一的微小变化发生在复合物的抗凝血位点(如图23所示)，由此生成的二聚体是具有活性的。四聚体形成很可能稳定hemextin A的抗凝血位点。

在蛇毒蛋白中特别是突触前神经毒素，复合物形成和增效作用已为大家所熟知。一些蛇毒复合物是—来源于Crotalus durissus terrificus的响尾蛇毒素⁽⁶⁰⁾，来源于Oxyuranus scutellatus的泰攀蛇毒素(61)，来源于Calloselasma rhodostoma的紫红杀菌素(rhodocetin)(64)，来源于澳大利亚的蛇的C组凝血酶原激活剂。从Crotalus durissusterrificus毒液中分离得到的响尾蛇毒素，包含两个亚单位；碱性的亚单位是一种PLA₂酶，而酸性的亚单位无催化活性(虽然它源自于一种PLA₂类似蛋白)⁽⁶⁰⁾。单一组分只有碱性亚单位略有毒，而其复合物显示出有效毒性。酸性亚单位看起来作用就象侣伴蛋白并提高碱性亚单位特异结合到突触前的位点上。类似地，其他突触前的神经毒素，诸如源自Oxyuranus scutellatus的泰攀蛇毒素⁽⁶¹⁾和源自Pseudonajatextilis的组织毒素(textilotoxin)⁽⁶²⁾毒液分别包含三个和四个亚单位。所有这些亚单位在结构上均类似于PLA₂酶。这种在这些毒素亚单位之间的非共价相互作用对他们的有效毒性是重要的。因此，许多蛇毒突触前毒素是与作为整合部分的PLA₂的蛋白质复合物。另一种从O.scutellatus毒液中分离的蛋白复合物泰杰蛇毒素阻遏钙通道，并且它具有PLA₂、蛋白酶抑制因子和神经毒素(一种三指毒素)亚单位⁽⁶³⁾。在蛇毒中只有少数非共价蛋白复合物不包含作为整合部分的PLA₂。例如，一种来自Calloselasma rhodostoma毒液中的抗血小板蛋白质复合物紫红杀菌素，包含两个亚单位，其显示与C-型外源凝集素具有结构相似性。源自澳大利亚的蛇的C组凝血酶原激活物是促凝血的蛋白质复合物，其在结构上和功能上类似于哺乳动物血液凝结剂FXa-FVa复合物^(65-67)。紫红杀菌素是一种抗血小板的蛋白质复合物，其是一种C型凝集素有关蛋白质的异源二聚体⁽⁶¹⁾。Pseutarin C是一种在在结构和功能上类似于哺乳动物FXa-FVa复合物的促凝血复合物^{(65- 66)}。在剩余的情况中，各亚单位通过未鉴定的非共价相互作用结合在一起。Hemextin AB复合物是第一个从蛇毒中分离的抗凝血复合物，其hemextin A的抗凝血活性通过hemextin B的协同作用得以加强⁽⁷⁴⁾。在不需要FX支架的条件下，其特异性地并非竞争地抑制FVIIa。因而，这是首次获知FVIIa的天然蛋白抑制剂。在结构上，其是唯一获知的由两个三指毒素形成的四聚体复合物⁽⁷⁴⁾。由于复合物形成对凝结启动的协同作用是必不可少的，因而阐明支配这种独特复合物形成的分子间相互作用是重要的。

总之，这里介绍了一种来自蛇毒的独特抗凝蛋白复合物，其能特异性和非竞争地抑制FVIIa活性。其结果有力地支持了hemextin A和B之间的相互作用对有效抗凝血活性是必不可少的。通过多种生物学手段鉴定了这种介于两种紧密关联的三指毒素之间的独特蛋白-蛋白复合物。圆二色性研究表明复合物形成使得β折叠趋于稳定。Hemextin AB复合物是刚性的，其形成由焓驱动。热容量为负值表明氢键的存在以及构象变化的发生。疏水性相互作用主要驱动复合物形成的过程，但是复合物的稳定性也依赖于其环境的离子强度。在甘油或盐存在的情况下四聚体解离成二聚体。在盐存在的情况下而具体的形成似乎不同于甘油；他们的表观分子直径不同，并且表现出不同的抗凝血特性。在盐存在的情况下复合物的解离可能是由于hemextin A的构象变化。基于这些结果，现提出一种定义hemextin AB复合物装配的模型。

有益地，这种新抗凝血剂能促进不同策略和抑制血液凝固启动药物的发展。本研究还使得这种蛋白复合物的结构-功能关系更为透彻。

应能理解，实施例仅用于说明本发明，在不背离本发明范围和精神的情况下仍可对其进行修改。

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104.Tsumoto，K.，Ueda，Y.，Maenaka，K.，Watanabe，K.，Ogasahara，K.，Yutani，K.，和Kumagai，I.(1994)JBiol.Chem 269，28777-28782

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107.Weber-Bornhauser，S.，Eggenberger，J.，Jelesarov，L，Bernard，A.，Berger，C，和Bosshard，H.R.(1998)Biochemistry 37，13011-13020108.Keown，M.B.，Henry，A.J.，Ghirlando，R.，Sutton，B.J.，和Gould，H.J.(1998)Biochemistry 37，8863-8869

109.Cole，J.L和Garsky，V.M.(2001)Biochemistry 40，5633-5641

110.Katragadda，M.，MoriMs，D.，和Lambris，J.D.(2004)JBiolChem279，54987-54995

111.Ladbury，J.E.，Wright，J.G.，Sturtevant，J.M.，和Sigler，P.B.(1994)JMol.Biol.238，669-681

112.Morton，C.J.和Ladbury，J.E.(1996)ProteinSci5，2115-2118

113.Bhat，T.N.，Bentley，G.A.，Boulot，G.，Greene，M.L，Tello，D.，Dall′Acqua，W.，Souchon，H.，Schwarz，F.P.，Mariuzza，R.A.，和Poljak，R.J.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 91，1089-1093

114.Holdgate，G.A.，Tunnicliffe，A.，Ward，W.H.，Weston，S.A.，Rosenbrock，G.，Barth，P.T.，Taylor，I.W.，Pauptit，R.A.，和Tirnms，D.(1997)Biochemistry 36，9663-9673

115.Sevrioukova，I.F.，Li，H.，Zhang，H.，Peterson，J.A.，和Poulos，T.L.(1999)Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 96，1863-1868

116.Kornblatt，J.A.，Kornblatt，M.J.，Hoa，G.H.，和Mauk，A.G.(1993)Biophys.J 65，1059-1065

117.Xavier，K.A.，Shick，K.A.，Smith-Gil，S.J.，和Willson，R.C.(1997)Biophys.J 73，2116-2125

Claims (32)

1、一种含有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示氨基酸序列或其变体、突变体或片段的多肽。

2、一种含有SEQ ID NO.2、4或5所示氨基酸序列或其变体、突变体或片段的多肽。

3、如权利要求1或2所述的多肽，其中所述多肽是获自Hemachatus haemachatus(非洲环颈血蝮蛇)毒液。

4、如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽具有抗凝血活性。

5、一种包含如权利要求1～4任一所述多肽的功能等价物的多肽，其中所述功能等价物具有选自SEQ.ID NO.1、SEQ.ID NO.2、SEQ.IDNO.3、SEQ.ID NO.4和SEQ.ID NO.5多肽的活性。

6、一种核酸分子，其:

(i)编码权利要求1～5任一所述的多肽；或

(ii)与(i)所述核酸分子或其变体、突变体、片段或互补链杂交。

7、如权利要求6所述的寡核苷酸，其为引物或探针。

8、一种含有权利要求6所述核酸分子的载体。

9、一种用权利要求8所述载体转化的宿主细胞。

10、一种制备权利要求1～5任一所述多肽的方法，该方法包括在适合表达权利要求1～5任一所述多肽的条件下培养权利要求9所述的宿主细胞。

11、一种制备权利要求1～5任一所述多肽的方法，该方法包括化学合成所述多肽。

12、如权利要求11所述的方法，其中化学合成为固相肽合成。

13、如权利要求10～12任一所述的方法，其中所述方法还包括纯化所述多肽的步骤。

14、一种制备包含:

(i)权利要求1所述多肽；和

(ii)权利要求2所述多肽，

的复合物的方法，该方法包括将权利要求1所述的多肽和权利要求2所述的多肽在适合复合物形成的条件下接触。

15、一种复合物，其包含:

(i)权利要求1所述的多肽；和

(ii)权利要求2所述的多肽。

16、如权利要求15所述的复合物，其中所述(i)与(ii)之比为1:2至2:1。

17、一种制备识别权利要求1～5任一所述多肽或权利要求15所述复合物的抗体的方法，其中该方法包括步骤:

(i)用权利要求1～5任一所述多肽或权利要求15所述复合物免疫动物；和

(ii)由所述动物获得抗体。

18、一种识别权利要求1～5任一所述多肽或权利要求15所述复合物的抗体。

19、一种制备抗权利要求1～5任一所述多肽或权利要求15所述复合物的抗蛇毒素的方法，该方法包括用权利要求1～5任一所述多肽或权利要求15所述复合物免疫动物并从所述动物中获得用于制备抗蛇毒素的抗体。

20、一种有效抗权利要求1～5任一所述多肽或权利要求15所述复合物的抗蛇毒素。

21、一种鉴定权利要求1～5任一所述多肽或权利要求15所述复合物的介质的方法，该方法包括步骤:

(i)将测试化合物与权利要求1～5任一所述多肽或权利要求15所述复合物接触；和

(ii)测定测试化合物是否与所述多肽或所述复合物结合。

22、如权利要求21所述的方法，其还包括测定所述测试化合物是否增强或减弱所述多肽或所述复合物活性的步骤。

23、一种药物组合物，其含有权利要求1～5任一所述多肽、权利要求6所述核酸分子、权利要求8所述的载体、权利要求9所述的宿主细胞、权利要求15所述的复合物、权利要求18所述抗体、权利要求20所述抗蛇毒素或按照权利要求21所述方法鉴定的介质。

24、权利要求1～5任一所述的多肽、权利要求6所述的核酸分子、权利要求8所述载体、权利要求9所述宿主细胞、权利要求15所述复合物、权利要求18所述抗体、权利要求20所述抗蛇毒素或按照权利要求21所述方法鉴定的介质在药物中的应用。

25、一种用于药物的联合制剂，其含有:

(i)权利要求1所述多肽或编码该多肽的核酸分子；和

(ii)权利要求2所述多肽或编码该多肽的核酸分子。

26、如权利要求25所述的联合制剂，其中所述联合制剂用于治疗需抗凝治疗的病人。

27、权利要求1～5任一所述的多肽、权利要求6所述的核酸分子、权利要求8所述载体、权利要求9所述宿主细胞、权利要求15所述复合物在制备治疗需抗凝治疗病人的药物中的应用。

28、(i)权利要求1所述多肽或编码该多肽的核酸分子；和

(ii)权利要求2所述多肽或编码该多肽的核酸分子

在制备治疗需抗凝治疗病人的联合制剂中的应用。

29、一种治疗需抗凝治疗病人的方法，该方法包括给病人施用权利要求1～5任一所述的多肽、权利要求6所述的核酸分子、权利要求8所述载体、权利要求9所述宿主细胞、权利要求15所述复合物或权利要求23所述的药物组合物。

30、一种治疗需抗凝治疗病人的方法，该方法包括给病人施用:

(i)权利要求1所述多肽或编码该多肽的核酸分子；以及

(ii)权利要求2所述多肽或编码该多肽的核酸分子。

31、一种治疗蛇咬伤病人的方法，该方法包括给病人施用权利要求1～5任一所述的多肽、权利要求6所述的核酸分子、权利要求8所述载体、权利要求9所述宿主细胞、权利要求15所述复合物或权利要求23所述药物组合物。

32、权利要求1～5任一所述的多肽、权利要求6所述的核酸分子、权利要求8所述载体、权利要求9所述宿主细胞、权利要求15所述复合物或权利要求23所述药物组合物在制备治疗蛇咬伤病人的药物中的应用。

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