CN108314737A

CN108314737A - 一种重组蛋白及其制备方法和应用

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Publication number: CN108314737A
Application number: CN201810072365.3A
Authority: CN
Inventors: 刘瑞田; 季梅; 谢喜秀
Original assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Current assignee: Institute of Process Engineering of CAS
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2018-07-24
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: CN108314737B

Abstract

本发明提供了一种重组蛋白及其制备方法和应用，所述重组蛋白包括Tau蛋白和乙型肝炎病毒核心蛋白。本发明采用Tau_294‑305和乙型肝炎病毒核心蛋白进行重组，融合表达的T294‑HBc自组装成表面展示Tau_294‑305的HBc嵌合病毒样颗粒，该疫苗均一性好、制备简单、免疫原性强、副作用较小，在Tau病变引起的阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、皮质基底节变性、皮克氏病和进行性核上性麻痹等痴呆症治疗方面具有较好的应用前景。

Description

一种重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组蛋白及其制备方法和应用，尤其涉及一种Tau蛋白和乙型肝炎病毒核心蛋白的重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、皮质基底节变性、皮克氏病和进行性核上性麻痹是主要的神经退行性疾病，可引起痴呆等症状。2015年全球痴呆症患者约4680万，到2050年患者的数量预计将达到1.135亿(World Alzheimer Report 2016:Improving healthcare forpeople living with dementia.)。其中，阿尔茨海默病的病理特征主要表现为神经元丢失、神经元内过度磷酸化的微管相关蛋白Tau蛋白聚集形成神经元纤维缠结，以及神经元外β淀粉样蛋白聚集沉积形成老年斑。额颞叶痴呆主要是由大脑颞叶和额叶的进行性退化引起的，患者在决策、行为控制、情感和语言等方面表现出障碍。研究表明，与β淀粉样蛋白斑块不同，Tau蛋白形成的神经元纤维缠结的数量与阿尔茨海默病患者的认知缺陷呈正相关(R.D.Terry.Neuropathological changes in Alzheimer disease.Prog.Brain Res.,101,383-390(2004)；M.Goedert.Tau protein and neurodegeneration.Semin.CellDev.Biol.,15,45-49(2004))。由Tau样病变引起的神经退行性疾病如皮质基底节变性、皮克氏病和进行性核上性麻痹等疾病不具有β淀粉样蛋白聚集沉积的病理特征；Tau基因突变(如P301S，P301L)可引起某些形式的额颞叶痴呆(FTD)，即单独的Tau功能障碍足以引起神经变性。目前治疗阿尔茨海默病的药物主要为胆碱酯酶抑制剂和谷氨酸受体拮抗剂，然而，这些药物并不能阻止疾病的恶化。

研究发现，阿尔茨海默病患者和轻度认知障碍患者的脑脊液中存在截短的Tau蛋白(151-391/4R)，与全长的Tau蛋白(2N/4R)相比，截短的Tau蛋白具有不同的构象，可形成寡聚体和纤维，引发神经元凋亡和星形胶质细胞与小胶质细胞的炎症反应(B.Kovacech,etal.Transition of tau protein from disordered to misordered in Alzheimer'sdisease.Neurodegener.Dis.,7,24-27(2010)；N.Zilka,et al.Truncated tau fromsporadic Alzheimer's disease suffices to drive neurofibrillary degenerationin vivo.FEBS Lett.,580,3582-3588(2006)；T.Wisniewski,et al.Immunotherapeuticapproaches for Alzheimer's disease.Neuron,85,1162-1176(2015))。目前，靶向Tau蛋白的免疫治疗成为阿尔茨海默病治疗领域的研究热点，截短的Tau蛋白有望成为治疗阿尔茨海默病的有效靶点。

与被动免疫疗法相比，主动免疫疗法利用机体自身免疫系统产生抗体，具有持久的治疗效果。利用全长β淀粉样蛋白作为免疫原的第一代阿尔茨海默病的治疗性疫苗，在临床试验中发现可以诱导Th1介导的细胞免疫应答，造成了脑膜炎、脑水肿和脑出血等不良反应；第二代阿尔茨海默病疫苗将Tau蛋白或β淀粉样蛋白的B细胞表位偶联在载体上制备得到。目前有两类靶向Tau蛋白的治疗性疫苗，一种为针对磷酸化的Tau抗原表位pS396/pS404的疫苗(ACI35)(A.A.Asuni,et al.Immunotherapy targeting pathological tauconformers in a tangle mouse model reduces brain pathology with associatedfunctional improvements.J.Neurosci.27,9115-9129(2007))，另一种为针对截短的Tau蛋白151-391/4R表位肽Tau_294-305的疫苗(AADvac1)(E.Kontsekova,et al.First-in-mantau vaccine targeting structural determinants essential for pathological tau-tau interaction reduces tau oligomerisation and neurofibrillary degenerationin an Alzheimer's disease model.Alzheimers Res.Ther.,6,44-55(2014))。其中，pS404存在于健康人群的Tau蛋白中，针对该位点的疫苗具有安全隐患，而Tau_294-305表位是截短的病理性Tau蛋白的关键序列，应用Tau_294-305制备的疫苗AADvac1可降低AD转基因大鼠的病理学变化，改善认知功能，但对额颞叶痴呆等神经退行性疾病是否具有治疗作用有待于进一步研究。

Tau_294-305是一种小分子短肽，免疫原性弱，需要借助KLH等载体提高免疫治疗的作用。但以KLH作为载体制备的疫苗中，KLH与抗原表位之间的连接比例、连接位点、分子大小等不易控制，为药物研发的质量控制造成了障碍。

因此，构建一种新型Tau蛋白疫苗，在神经退行性痴呆症治疗领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种重组蛋白及其制备方法和应用，所述重组蛋白包括Tau蛋白截短体和乙型肝炎病毒核心蛋白，制备得到的蛋白疫苗降低了脑内致病性截短Tau蛋白和Tau蛋白寡聚体的表达水平，对阿尔兹海默症、额颞叶痴呆、皮脂基底节变性、皮克氏病和进行性核上性麻痹具有显著的治疗效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种重组蛋白，所述重组蛋白包括Tau蛋白和乙型肝炎病毒核心蛋白。

乙型肝炎病毒核心蛋白不包含病毒基因组，可自组装成病毒样颗粒，安全性好，目前已广泛应用于疫苗制备领域，如流感疫苗ACAM-FLU-ATM和疟疾疫苗ICC-1132都利用乙型肝炎病毒核心蛋白作为疫苗载体。本发明中，将Tau蛋白插入乙型肝炎病毒核心蛋白的免疫优势区，形成重组蛋白，显著增强了Tau蛋白的免疫原性，实现了刺激机体产生高滴度抗体的目的。

优选地，所述Tau蛋白为Tau蛋白截短体。

优选地，所述Tau蛋白截短体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示；

所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：HQPGGG；

所述SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列如下：HVPGGG；

所述SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列如下：HKPGGG。

优选地，所述Tau蛋白截短体的氨基酸序列为Tau蛋白的第294-305位。

本发明中，Tau_294-305是一段12个氨基酸残基长度的短肽，位于Tau蛋白氨基酸序列的第294-305位，Tau_294-305作为免疫原刺激机体产生的抗体，通过靶向截短的病理性Tau蛋白(truncated tau151-391/4R)，具有降低Tau蛋白寡聚体含量的作用。

优选地，所述Tau蛋白截短体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或与其具有不高于40％氨基酸残基的取代、缺失或添加而获得的氨基酸序列。

所述SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列如下：KDNIKHVPGGGS.

本发明中，Tau_294-305包含一个基本的氨基酸序列“HXPGGG”(X为Q、V或K)，这段序列同时存在于Tau蛋白微管区多肽Tau_268-273(MTBR1)、Tau_299-304(MTBR2)、Tau_330-335(MTBR3)和Tau_362-367(MTBR4)结构中，机体产生的抗体可以靶向Tau_268-273(MTBR1)、Tau_299-304(MTBR2)、Tau_330-335(MTBR3)和Tau_362-367(MTBR4)等多个位点，实现了治疗阿尔兹海默病、额颞叶痴呆、皮质基底节变性、皮克氏病和进行性核上性麻痹的目的。

优选地，所述乙型肝炎病毒核心蛋白为乙型肝炎病毒核心蛋白截短体。

优选地，所述乙型肝炎病毒核心蛋白截短体的分子量为12-15kDa，例如可以是12kDa、13kDa、14kDa或15kDa、优选为14kDa。

本发明中，将乙型肝炎病毒核心蛋白全基因进行截短，有利于宿主细胞代谢表达，提高了宿主细胞对重组蛋白的表达量。

优选地，所述乙型肝炎病毒核心蛋白截短体的氨基酸序列的N端位于乙型肝炎病毒核心蛋白的第1位且C端位于乙型肝炎病毒核心蛋白的第140-183位中的任一氨基酸残基。

优选地，所述乙型肝炎病毒核心蛋白截短体的氨基酸序列的N端位于乙型肝炎病毒核心蛋白的第1位且C端位于乙型肝炎病毒核心蛋白的第149位。

本发明中，乙型肝炎病毒核心蛋白的前183位氨基酸序列可组装成病毒样颗粒，不含病毒基因组DNA，安全性较高，适用于作为载体以提高短肽的抗原性，本发明中，乙型肝炎病毒核心蛋白的氨基酸序列优选为N端位于第1位且C端位于第149位。

优选地，所述Tau蛋白截短体插于所述乙型肝炎病毒核心蛋白截短体的N端、C端或第1位到第149位氨基酸之间的任意位点，优选为所述Tau蛋白截短体插于所述乙型肝炎病毒核心蛋白截短体的第78位和第79位氨基酸之间。

本发明中，乙型肝炎病毒核心蛋白的第78位Asp和第79位Pro之间为免疫优势区，将Tau蛋白插入该位点，增强了Tau蛋白的免疫原性。

优选地，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列如下：

MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDGSGKDNIKHVPGGGSGSGPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV.

第二方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体包括如第一方面所述的重组蛋白。

优选地，所述重组载体为PBR327质粒。

第三方面，本发明提供了一种蛋白疫苗，所述蛋白疫苗包括如第一方面所述的重组蛋白。

优选地，所述重组蛋白的浓度为1-3mg/mL，例如可以是1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL或3mg/mL，优选为1mg/mL。

优选地，所述蛋白疫苗还包括佐剂，优选为铝佐剂。

优选地，所述重组蛋白与所述佐剂的体积比为1:(1-5)，例如可以是1:1、1:2、1:3、1:4或1:5，优选为1:3。

第四方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的重组蛋白、如第二方面所述的重组载体或如第三方面所述的蛋白疫苗中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第五方面，本发明提供了一种制备如第一方面所述的重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建如第二方面所述的重组载体；

(2)将步骤(1)所述的重组载体转入感受态细胞中，培养后挑取单克隆细胞进行裂解，得到裂解液；

(3)从步骤(2)所述的裂解液中提取和纯化蛋白质，得到所述重组蛋白。

优选地，步骤(1)所述构建的方法为将表达SEQ ID NO.5的核酸序列插入PBR327质粒的NcoI和BspTI位点之间。

第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的重组蛋白、如第二方面所述的重组载体、如第三方面所述的蛋白疫苗或如第四方面所述的药物组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备治疗阿尔兹海默症、额颞叶痴呆、皮脂基底节变性、皮克氏病或进行性核上性麻痹中的任意一种或至少两种疾病的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用Tau_294-305和乙型肝炎病毒核心蛋白进行重组，融合表达的T294-HBc自组装成表面展示Tau_294-305的HBc嵌合病毒样颗粒；

(2)本发明的重组蛋白与铝佐剂相配伍，得到的疫苗诱导产生了高滴度的特异性针对致病性截短Tau的抗体，抗体具有同时结合Tau_263-274、Tau_294-305、Tau_325-336、Tau_357-368和Tau_294-305(P301S)的能力；

(3)本发明的疫苗对Tau.P301S转基因小鼠具有治疗效果，所述疫苗显著提高了小鼠的记忆和认知水平，减少了小鼠脑内Tau单体、寡聚体和截短Tau的表达水平，降低了小胶质细胞和星形胶质细胞的活化水平，提高了突触水平；

(4)本发明的疫苗均一性好、制备简单、免疫原性强、副作用较小，在Tau病变引起的阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、皮质基底节变性、皮克氏病和进行性核上性麻痹等痴呆症治疗方面具有较好的应用前景。

附图说明

图1(A)为重组蛋白的分子结构示意图，图1(B)为T294-HBc重组蛋白的纯度分析结果，图1(C)为T294-HBc重组蛋白的透射电镜分析结果，图1(D)为T294-HBc重组蛋白的粒径分析结果；

图2(A)为疫苗诱导P301S小鼠产生的抗体滴度图，图2(B)为T294-HBc疫苗诱导P301S小鼠产生的抗体滴度图，图2(C)为抗体与截短的Tau151-391/4R和全长Tau 2N/4R的结合能力分析，图2(D)为P301S小鼠产生抗体的分型，图2(E)为抗体与Tau蛋白微管区多肽的结合能力分析；

图3(A)和图3(B)为采用强制性Y迷宫分析T294-HBc重组蛋白对P301S小鼠记忆水平的影响，图3(C)为采用新物体识别分析疫苗对P301S小鼠的记忆水平的影响，图3(D)、图3(E)、图3(F)和图3(G)为采用水迷宫实验分析疫苗对P301S小鼠记忆水平和空间认知能力的影响，图3(H)为采用自发性Y迷宫分析疫苗对P301S小鼠记忆水平的影响；

图4为T294-HBc疫苗对P301S小鼠脑内磷酸化Tau蛋白寡聚体含量的影响；

图5(A)为采用Western blot分析T294-HBc疫苗对P301S小鼠脑内不可溶组分Tau蛋白单体、寡聚体以及截短Tau蛋白含量的影响，图5(B)为Tau蛋白寡聚体的定量分析，图5(C)为Tau蛋白单体的定量分析，图5(D)为截短Tau蛋白的定量分析，图5(E)为Western blot分析小鼠脑内不可溶组分中总Tau蛋白的含量，图5(F)为人源Tau蛋白的定量分析；

图6为T294-HBc疫苗对P301S小鼠脑内星形胶质细胞活化水平的影响；

图7为T294-HBc疫苗对P301S小鼠脑内小胶质细胞活化水平的影响；

图8为T294-HBc疫苗对P301S小鼠脑内的突触水平的影响。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

材料：

实施例中的PBS为pH值为7.4的缓冲液，配方为9g NaCl，5.73g Na₂HPO₄·12H₂O，0.62g NaH₂PO₄·2H₂O，用ddH₂O溶解后调pH至7.4，用ddH₂O补足至1升；

裂解缓冲液的配方为50mM Tris-HCl，150mM NaCl，5mM EDTA(pH 8.0)，100μg/mLPMSF；

RIPA缓冲液的配方为50mM Tris(pH 7.2)，150mM NaCl，5mM EDTA，0.1％SDS和蛋白酶抑制剂；

SDS缓冲液为pH值为7.6的50mM Tris；

实验数据表示为平均值±SEM，数据的统计分析采用GraphPad Prism软件分析，以P<0.05为具有统计学差异。

实施例1 重组蛋白的制备与表征

将Tau_294-305基因插入到截短的乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)基因(编码HBc上氨基酸1至149)的免疫优势区Asp78和Pro79的密码子位点之间，得到T294-HBc重组蛋白；将表达T294-HBc重组蛋白的核酸序列克隆到PBR327载体中，得到T294-HBc-PBR重组载体；将T294-HBc-PBR重组载体转化大肠杆菌BL21感受态细胞，大肠杆菌细胞在补充有1％酪蛋白氨基酸、0.2％葡萄糖和50μg/mL氨苄青霉素的M9盐培养基中37℃培养20-24小时。

离心收集菌体，将2g细胞重悬于40mL裂解缓冲液中，在冰浴中超声处理30分钟；随后，12,000rpm离心15分钟，向上清液中加入硫酸铵至33％饱和度，沉淀目的蛋白；将硫酸铵沉淀制备的样品在4℃下以112,000g蔗糖密度梯度离心16h，应用羟基磷灰石柱纯化经蔗糖离心后的样品，收集流穿液。

在HBc插入HXPGGG蛋白的克隆、表达及纯化方法同上，得到的重组蛋白分别为R1(Tau_267-273-HBc)，R2(Tau_298-304-HBc)，R3(Tau_329-335-HBc)，R4(Tau_361-367-HBc)。

将纯化的蛋白浓缩，应用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；应用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析重组蛋白的纯度，应用透射电镜观察病毒样颗粒的形态，应用Nanomeasurer1.2(n＝100)测量病毒样颗粒的粒径。

重组蛋白的分子结构如图1(A)所示，截短的Tau蛋白表位插于HBc的免疫优势区的Asp78和Pro79之间；如图1(B)所示，SDS-PAGE分析显示，制备的T294-HBc重组蛋白的纯度>95％；如图1(C)和图1(D)所示，Tau蛋白截短体和HBc自组装形成直径为33.55±2.79nm的病毒样颗粒。

实施例2 疫苗的免疫及抗体的检测

(1)动物免疫

将5月龄大的Tau.P301S转基因小鼠随机分为PBS组、HBc对照组、R1组、R2组、R3组、R4组和T294-HBc组，每组7只，同时以7只月龄相同的野生型C57BL/6J小鼠作为WT对照组。

将上述8组小鼠进行如下处理：

向R1组、R2组、R3组、R4组和T294-HBc组小鼠注射100μg重组蛋白+铝佐剂，向PBS组小鼠注射等剂量的PBS+铝佐剂，向HBc对照组小鼠注射100μg等剂量的HBc载体+铝佐剂，向WT对照组小鼠注射等剂量的铝佐剂，在第0、14、28和42天对小鼠进行皮下注射，每次注射间隔两周。

(2)抗体滴度和EC₅₀检测

在每次免疫后第10天，于尾静脉采血，然后于37℃静置2小时，4000转离心5分钟，取上层血清，分装待用；

在96孔板中包被250ng全长Tau 2N4R和病理性截短的Tau 151-391/4R，4℃过夜，用PBS洗涤两次，以3％BSA(含0.05％PBST)在37℃下封闭2小时；加入连续稀释的血清(100μL/孔，以5倍倍比稀释)，于37℃下孵育1小时；以0.1％PBST洗涤8次；每孔加入100μL HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:5000)，于37℃孵育1小时后，采用0.1％PBST洗涤6次；每孔加入100μL TMB，37℃下孵育20分钟，每孔加入100μL浓度为1M的硫酸终止反应，于酶标仪上测定450nm处的OD值。

如图2(A)所示，在血清1:100稀释时，ELISA结果表明，与HBc对照相比，R1、R2、R3及R4没有诱导产生针对Tau 151-391/4R的抗体。

如图2(B)所示，T294-HBc疫苗在小鼠中诱导了强烈的免疫应答，抗体滴度随免疫次数的增加而提高，在第三次免疫后达到平台，在第2、3和4次免疫后，抗体滴度分别为1:21028、1:205357和1:218750；而PBS和HBc未能诱导机体产生相应的抗体。

如图2(C)所示，疫苗刺激机体免疫产生的抗体，针对截短Tau 151-391/4R的EC₅₀为25976，针对全长Tau 2N4R的EC₅₀为8258.937，表明疫苗诱导产生的抗体与截短Tau 151-391/4R的特异性结合作用远高于与正常生理状态下全长Tau 2N4R的结合作用(P<0.05)。

(3)抗体分型检测

在96孔板中包被截短Tau 151-391/4R，以100μL/孔向96孔板中加入1:6000倍稀释的血清，于37℃孵育1小时，用0.1％PBST洗涤8次；

每孔加入100μL HRP标记的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG抗体，于37℃孵育1小时，用0.1％PBST洗涤6次；每孔加入100μL TMB，于37℃放置20分钟，每孔加入100μL浓度为1M的硫酸终止反应，于酶标仪上测定450nm处的OD值。以相同的条件实验重复三次。

如图2(D)所示，疫苗诱导产生的抗体主要为IgG1，表明疫苗诱导的免疫应答主要为Th2型。

(4)竞争ELISA

在96孔酶标板中包被250ng截短Tau 151-391/4R，4℃过夜；将竞争多肽Tau_263-274、Tau_294-305、Tau_325-336、Tau_357-368和Tau_294-305(P301S)(纯度>95％)于PBS中溶解为浓度5mM，将血清以1:100为起始，两倍或三倍倍比稀释，将60μL稀释的血清与40μL多肽(终浓度为200μM)混合后在1.5mL Eppendorf管中室温孵育1小时；将100μL抗体/肽混合物转移到ELISA板中，37℃孵育1小时，用0.1％PBST洗涤8次；

每孔加入100μL HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1:5000)，于37℃孵育1小时后，用0.1％PBST洗涤6次；每孔加入100μL TMB，37℃放置20分钟，每孔加入100μL浓度为1M的硫酸终止反应，于酶标仪上测定450nm处的OD值。

如图2(E)所示，疫苗诱导产生的抗体与Tau_268-273(MTBR1)、Tau_299-304(MTBR2)、Tau_330-335(MTBR3)、Tau_357-368(MTBR4)和Tau_294-305(P301S)均具有结合作用。表明疫苗T294-HBc诱导产生的抗体能够结合致病性的Tau蛋白，显示出疫苗具有治疗阿尔兹海默病和额颞叶痴呆的潜力。

实施例3 T294-HBc疫苗改善Tau.P301S小鼠的认知水平

为了评估T294-HBc疫苗对Tau.P301S小鼠的治疗作用，对免疫治疗后的小鼠进行如下行为学实验：强制性Y迷宫、新物体识别、水迷宫和自发性Y迷宫。

(1)强制Y迷宫

该实验使用的Y迷宫由3个互为120度夹角的臂构成，每个臂的末端标记有不同的图案，随机将三个臂分别指定为起始臂、检测新臂和探索臂。

在训练阶段，将小鼠放入起始臂，让其在起始臂和探索臂中自由探索5分钟，此时，新臂处于关闭状态；30分钟后，打开新臂，将小鼠放入起始臂，让小鼠自由探索5分钟。由轨迹追踪装置记录每只小鼠停留在新臂的时间和进入新臂的次数。

如图3(A)和图3(B)所示，PBS组小鼠停留在新臂中的时间和进入新臂次数分别为65.88s和5.33次；HBc组小鼠停留在新臂中的时间和进入新臂次数分别为67.17s和5.3次；T294-HBc组小鼠停留在新臂中的时间和进入新臂次数分别为98.96s和8.6次；WT对照组小鼠停留在新臂中的时间和进入新臂次数分别为122.30s和11.86次。和PBS和HBc组小鼠相比，T294-HBc显著增加了小鼠在新臂的时间和次数(P<0.05)，表明T294-HBc改善了Tau.P301S小鼠的短期记忆。

(2)新物体识别

在安静且光线亮度适中的环境下，在空旷的活动箱(40×40×30cm³)中放置A和B两个物体(两个物体完全一样，每个物体距离盒子边缘的距离均为10cm)；将小鼠放置在箱中自由探索5min，观察小鼠用鼻子触碰(小鼠鼻子距离玩具小于等于2cm视为触碰)物体的次数；结束后，将小鼠放回饲养盒，将活动箱用70％酒精擦洗干净，进行第二只小鼠的检测，步骤同上；24h后，将场地内的A或者B物体换做一个新的物体C，C物体与A和B物体形状颜色都不同；将小鼠放入活动箱中记录小鼠在5min内对两个物体的探索次数。

实验结束后，统计分析小鼠对于新旧物体的探索次数及鉴别指数(DI，discrimination index)，DI的计算公式如下，其中TN为小鼠对新物体的探索次数，TF为小鼠对旧物体探索次数。

DI＝(TN-TF)/(TN+TF)

如图3(C)所示，PBS组的DI为0.081，HBc组的DI为0.092，T294-HBc组的DI为0.22，WT对照组的DI为0.21。与PBS和HBc组小鼠相比，T294-HBc显著提高了小鼠对新物体的识别能力(P<0.05)。

(3)水迷宫

实验分为空间记忆采集和空间探索实验两个部分。

(1’)空间记忆采集实验(acquisition trial)

实验历时5天。实验开始前一天将小鼠置于水迷宫中以适应环境，实验开始时，每只小鼠每天训练2次，每次以半随机方式选择入水点，实验者将小鼠用手拎起令其面向池壁，轻轻放入水中，如果小鼠在60s内寻找到平台，则记录其搜寻并登上平台所需要的时间，记为潜伏期时间；如果小鼠在60s内未找到平台，则由实验者将其引导至平台，潜伏期记为60s；小鼠登上平台后，让其在10s内根据4个象限的参照物进行空间学习和记忆。软件记录各组小鼠每天的潜伏期、游泳距离、平均游泳速度和探索轨迹图。

(2’)空间探索实验(probe/retention trial)

在实验的第7天撤除平台，随机选择一个入水点，将小鼠置于水中，游泳60s，期间测量小鼠第一次穿越平台所用的时间(潜伏期)，实验过程中穿越平台的次数，以及在目标象限(target quadrant，即原平台所在象限)的滞留时间。

如图3(D)所示，各组小鼠的潜伏期随着训练时间的增加而缩短。与PBS和HBc对照组小鼠相比，T294-HBc组小鼠在第5天时的潜伏期明显缩短(P<0.05)。

最后一次训练结束后，将平台移除，48小时后进行探索实验。

结果如图3(E)、图3(F)和图3(G)所示，PBS组小鼠的潜伏期、穿台次数和目标象限停留时间分别为27.14s、1.67次和14.046s；HBc组小鼠的潜伏期、穿台次数和目标象限停留时间分别为26.45s、1.67次和12.74s；T294-HBc组小鼠的潜伏期、穿台次数和目标象限停留时间分别为11.54s、3.4次和18.27s；WT对照组小鼠的潜伏期、穿台次数和目标象限停留时间分别为11.08s、3.43次和21.77s。结果表明，T294-HBc缩短了小鼠的潜伏期，增加了小鼠的穿台次数及其在目标象限的停留时间，T294-HBc显著改善了Tau.P301S转基因小鼠的空间记忆。

在训练期间和探索期间，各组内小鼠游泳速度没有显著差异。

(4)自发性Y迷宫

为了消除强迫Y迷宫的影响，我们改变了Y迷宫三个臂末端的标记，其余装置与强制Y迷宫相同。

将小鼠在三个开放的臂中自由进行探索5分钟，通过轨迹追踪装置记录小鼠进入各个臂的顺序。交替定义为连续依次进入三只手臂，(例如，ABCABC，交替为4次)。最大交替次数为进臂总次数减2，交替的百分比的计算公式为：

交替(％)＝(实际交替/最大交替)×100％

如图3(H)所示，PBS组小鼠的自发交替比率为48.18％；HBc组小鼠的自发交替比率为45.54％；T294-HBc组小鼠的自发交替比率为55.38％；WT对照组小鼠的自发交替比率为60.73％。T294-HBc组小鼠的自发交替百分比显著高于PBS和HBc组小鼠，表明T294-HBc疫苗改善了Tau.P301S模型小鼠的短期记忆能力。

实施例4 T294-HBc疫苗改善Tau.P301S小鼠的病理变化

(1)T294-HBc疫苗对P301S小鼠脑内磷酸化Tau蛋白寡聚体含量的影响

行为测试结束后，将小鼠用戊巴比妥钠麻醉，并采用含有10U/mL肝素的预冷PBS灌注心脏，采用4％多聚甲醛固定左脑，包埋石蜡；用Leica CM1850切片机矢状切片，切片厚度为5μm；将切片用80％甲醇(内含0.3％H₂O₂)浸泡20min，消除内源性过氧化物酶，以PBS洗涤3次，每次5min；用10％山羊血清(含0.3％Triton-X封闭液)室温封闭2h，加入AT8抗体(1:500)，37℃孵育1小时，以PBS洗涤4次，每次5min；加入HRP标记的二抗(1:100稀释)，室温作用1h，以PBS洗涤4次，每次5min；采用DAB室温染色1min，在BX60显微镜下采集图像，放大倍数分别为4×和10×。

如图4所示，在皮层区、海马CA1区和齿状回区，PBS组小鼠的磷酸化Tau蛋白聚集体的含量分别为10.78％、6.74％和7.8％；T294-HBc组小鼠的磷酸化Tau蛋白聚集体的含量分别为2.88％、1.33％和3.3％；WT对照组小鼠的磷酸化Tau蛋白聚集体的含量分别为0％、0％和0％。T294-HBc组小鼠的大脑皮层、海马CA1和齿状回区域的磷酸化Tau蛋白聚集体的含量明显减少。

(2)T294-HBc疫苗对P301S小鼠脑内不可溶组分的Tau蛋白单体、寡聚体以及截短Tau蛋白含量的影响

向右脑中加入RIPA缓冲液，用研磨器研磨；4℃下12,000g离心1小时，收集上清为RIPA可溶性组分；用1M蔗糖(RIPA缓冲液配制)洗涤RIPA不溶性沉淀，于4℃下100,000g离心30分钟，除去髓磷脂和相关的脂质；用2％SDS缓冲液提取RIPA不溶性组分，将不溶性组分进行SDS-PAGE电泳，湿法转膜2h；采用5％脱脂牛奶室温封闭2小时，分别加入HT7(1:3000)、Tau5(1:1000)、抗actin抗体(1:1000)，室温孵育1小时，用0.1％PBST洗涤3次；加入HRP标记的山羊抗小鼠或抗人IgG(1:10,000)，室温孵育1小时；用0.1％PBST洗涤3次；加入ECL于X光片上显影，使用IPwin5image pro plus软件测定条带的光密度。

由图5(A)可知，T294-HBc减少了P301S小鼠脑内不可溶组分的Tau蛋白寡聚体、单体以及截短Tau蛋白的含量；如图5(B，C，D)所示，PBS组小鼠脑内不可溶组分的Tau寡聚体、单体和截短体(包含磷酸化的Tau截短体和截短Tau寡聚体)的含量分别为7.44(/内参)、2.41(/内参)和2.73(/内参)；T294-HBc组小鼠脑内不可溶组分的Tau寡聚体、单体和截短体的含量分别为1.76(/内参)、1.15(/内参)和1.25(/内参)；WT对照组小鼠脑内不可溶组分的Tau寡聚体、单体和截短体的含量分别为0(/内参)、1.150(/内参)和0(/内参)。由此可知，T294-HBc减少了P301S小鼠脑内不可溶组分的Tau蛋白寡聚体、单体以及截短Tau蛋白的含量。

由图5(E)和图5(F)可知，T294-HBc疫苗减少了小鼠脑内人源Tau的含量，其中WT组有一条65kDa左右的条带为鼠源Tau。

(3)T294-HBc疫苗对P301S小鼠脑内星形胶质细胞活化水平的影响

免疫组织化学检测步骤同前，一抗采用抗GFAP抗体(1:100)。

如图6所示，在皮层区、海马CA1和齿状回区，PBS组小鼠的GFAP含量分别为4.86％、6.66％和6.91％；T294-HBc组小鼠的GFAP含量分别为1.96％、3.13％和2.35％；WT对照组小鼠的GFAP含量分别为0.05％、1.13％和0.81％。因此，T294-HBc降低了P301S小鼠脑内星形胶质细胞的活化水平。

(4)T294-HBc疫苗对P301S小鼠脑内小胶质细胞活化水平的影响

免疫组织化学检测步骤同前，一抗采用Iba1抗体(1:100)。

如图7所示，在皮层区、海马CA1和齿状回区，PBS组小鼠小胶质细胞的面积分别为2.07％、2.56％和1.86％；T294-HBc组小鼠小胶质细胞的面积分别为0.39％、0.40％和0.52％；WT对照组小鼠小胶质细胞的面积分别为0.27％、0.19％和0.17％。由此可知，T294-HBc显著降低了P301S小鼠脑内小胶质细胞的活化水平。

(5)T294-HBc疫苗对P301S小鼠脑内的突触水平的影响

免疫组织化学检测步骤同前，一抗采用抗突触素蛋白抗体(1:100)。

如图8所示，在皮层区、海马CA1和齿状回区，PBS组小鼠的突触素光密度分别为4385、9665和1465；T294-HBc组小鼠的突触素光密度分别为25570、16435和9069；WT对照组小鼠的突触素光密度分别为27946、23739和11253。因此，表明T294-HBc疫苗显著提高了小鼠的突触水平。

综上所述，本发明采用Tau_294-305和乙型肝炎病毒核心蛋白进行重组，融合表达的T294-HBc自组装成表面展示Tau_294-305的HBc嵌合病毒样颗粒；所述重组蛋白与铝佐剂相配伍，得到的疫苗诱导产生了高滴度的特异性针对致病性截短Tau的抗体，抗体具有同时结合Tau_263-274(MTBR1)、Tau_294-305(MTBR2)、Tau_325-336(MTBR3)、Tau_357-368(MTBR4)和Tau_294-305(P301S)的能力；采用所述疫苗治疗Tau.P301S转基因小鼠，显著提高了小鼠的记忆和认知水平，减少了小鼠脑内Tau单体、寡聚体和截短Tau的表达水平，降低了小胶质细胞和星形胶质细胞的活化水平，提高了突触水平。本发明的疫苗均一性好、制备简单、免疫原性强、副作用较小，在Tau病变引起的阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、皮质基底节变性、皮克氏病和进行性核上性麻痹等痴呆症治疗方面具有较好的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 中国科学院过程工程研究所

<120> 一种重组蛋白及其制备方法和应用

<130> 20180124

<141> 2018-01-25

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 1

His Gln Pro Gly Gly Gly

1 5

<210> 2

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 2

His Val Pro Gly Gly Gly

1 5

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 3

His Lys Pro Gly Gly Gly

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 4

Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 167

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 5

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Gly Ser

65 70 75 80

Gly Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly

85 90 95

Pro Ala Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly

100 105 110

Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe

115 120 125

Gly Arg Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile

130 135 140

Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr

145 150 155 160

Leu Pro Glu Thr Thr Val Val

165

Claims

1.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包括Tau蛋白和乙型肝炎病毒核心蛋白。

2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述Tau蛋白为Tau蛋白截短体；

优选地，所述Tau蛋白截短体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示；

优选地，所述Tau蛋白截短体的氨基酸序列为Tau蛋白的第294-305位；

3.根据权利要求1或2所述的重组蛋白，其特征在于，所述乙型肝炎病毒核心蛋白为乙型肝炎病毒核心蛋白截短体；

优选地，所述乙型肝炎病毒核心蛋白截短体的分子量为12-15kDa，优选为14kDa；

优选地，所述乙型肝炎病毒核心蛋白截短体的氨基酸序列的N端位于乙型肝炎病毒核心蛋白的第1位且C端位于乙型肝炎病毒核心蛋白的第140-183位中的任一氨基酸残基；

优选地，所述乙型肝炎病毒核心蛋白截短体的氨基酸序列的N端位于乙型肝炎病毒核心蛋白的第1位且C端位于乙型肝炎病毒核心蛋白的第149位；

优选地，所述Tau蛋白截短体插于所述乙型肝炎病毒核心蛋白截短体的N端、C端或第1位到第149位氨基酸之间的任意位点，优选为所述Tau蛋白截体段插于所述乙型肝炎病毒核心蛋白截短体的第78位和第79位氨基酸之间。

4.根据权利要求1-3任一项所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包括如权利要求1-4任一项所述的重组蛋白；

优选地，所述重组载体为PBR327质粒。

6.一种蛋白疫苗，其特征在于，所述蛋白疫苗包括如权利要求1-4任一项所述的重组蛋白；

优选地，所述重组蛋白的浓度为1-3mg/mL，优选为1mg/mL；

优选地，所述蛋白疫苗还包括佐剂，优选为铝佐剂；

优选地，所述重组蛋白与所述佐剂的体积比为1:(1-5)，优选为1:3。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-4任一项所述的重组蛋白、如权利要求5所述的重组载体或如权利要求6所述的蛋白疫苗中的任意一种或至少两种的组合；

8.一种制备如权利要求1-4任一项所述的重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建如权利要求5所述的重组载体；

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建的方法为将表达SEQ IDNO.5的核酸序列插入PBR327质粒的NcoI和BspTI位点之间。

10.一种如权利要求1-4任一项所述的重组蛋白、如权利要求5所述的重组载体、如权利要求6所述的蛋白疫苗或如权利要求7所述的药物组合物中的任意一种或至少两种的组合在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用；

优选地，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、额颞叶痴呆、皮质基底节变性、皮克氏病或进行性核上性麻痹中的任意一种或至少两种的组合。