CN101385796B - 一种制剂在制备改善因老化致认知功能障碍和老年痴呆药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及清开灵制剂及其有效成分黄芩苷、栀子苷、胆酸和珍珠母组合物在改善认知功能障碍预防及治疗老年痴呆的应用。通过Morris水迷宫实验证实清开灵及其有效组分可以改善快速老化鼠认知功能障碍；体内实验证实清开灵可以改善Aβ1-42海马注射所致类老年痴呆模型大鼠突触损伤的可塑性改变；体外实验证实清开灵及其有效成分黄芩苷、栀子苷、胆酸和珍珠母组合物可以提高快速脑老化鼠全脑乙酰胆碱含量，可能通过延缓乙酰胆碱、多巴胺、五羟色胺降解，使中枢多巴胺、五羟色胺水平相对升高，继而改善脑内单胺能系统活性。因此，清开灵组方改善认知功能障碍及预防和治疗痴呆的作用可能与此有关。

Description

一种制剂在制备改善因老化致认知功能障碍和老年痴呆药物中的应用

技术领域

本发明涉及清开灵改善认知功能障碍预防及治疗老年痴呆新用途，属于医药领域。 

背景技术

老年性痴呆(Alzheimer’s disease，AD)是一种以进行性认知障碍和记忆能力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。随着世界人口老龄化的加剧，其发病率越来越高，对人类生活质量的影响乃至生存的威胁也日趋明显。 

AD自Alois Alzheimer1907年首次报告以来，对其的发病机理和寻求有效治疗的研究就从未停止过。Aβ被认为是AD的始动因素和中心环节以后，针对Aβ的药物研究也日益增多。尽管投入了大量的人力和物力，但研究成果却十分有限。中医药在延缓衰老以及衰老相关疾病的防治方面有着丰富的理论和实践经验，中医药治疗AD近年来取得了一定的进步。对于AD这类多因素疾病，单一靶点治疗难以取得满意效果，在对AD的病因及发病机理知之甚少、近期无法取得突破性进展的情况下，虽然对AD病因等问题存在争议，但就其治疗已达成共识：应及早干预病情发展，如果在疾病后期才进行干预，虽可能延缓认知能力衰退的进程，但是已经发生的损害则不可逆转。认知功能障碍的发展是个长期的过程，可能在临床前数十年即已开始。当前治疗老年认知障碍的方法主要是通过暂时改善和减慢认知功能的衰退速度而减轻病人的症状，所以对于老年认知障碍，早期发现、早期诊断、早期治疗最为重要。因此，在认知障碍阶段及对病人进行积极干预是预防痴呆发生的最好策略。但遗憾的是，人们对老年的认知障碍的认识往往存在误区，认为老年人好忘事属于正常，因此，90％以上的老年认知障碍患者在早期未能被发现，而错过了最佳治疗和干预时机。 

现有的药物及治疗方法不能满足人们的需求，故人们希望能有一种成本 低廉、治愈率高，能有效改善脑认知功能障碍防治老年性痴呆的药物问世。 

清开灵是由胆酸、珍珠母、猪去氧胆酸、栀子、水牛角、板蓝根、黄芩苷、金银花等组成的纯中药复方制剂，目前的剂型有口服液，注射液，胶囊，颗粒剂等，具有清热解毒、通络开窍等功能，广泛用于临床。近年来应用清开灵的中医辨证理论治疗多种眼科疾病，取得较好效果。 

Aβ的毒性被认识是AD的始动因素，那对于脑缺血再灌注期起着积极防御作用的清开灵，能否对抗AD的Aβ毒性或者在其认知障碍的早期阶段发挥预防和阻滞作用。本发明首次证实清开灵及其有效组分组合物(黄芩苷、栀子苷、胆酸、珍珠母)可以改善认知功能障碍，有效防治老年痴呆。 

发明内容

本发明使用清开灵口服液研究对老年痴呆的作用，但不限于口服液，还可以是药学上可接受的剂型，如胶囊剂、片剂、注射剂等。 

本发明公开了清开灵制剂在制备治疗老年痴呆药物中的应用。 

本发明还公开了清开灵制剂在制备具有提高乙酰胆碱及中枢神经递质作用药物中的应用。 

本发明公开了清开灵制剂在制备治疗突触可塑性改变药物中的应用。 

CN1299717C公开了一种治疗脑中风的药物组合物及制备方法，本发明公开了这种药物组合物用于防制老年痴呆症的新用途；本发明还公开了上述组合物在制备治疗神经元和突触损伤药物中的应用。本发明还公开了上述组合物在制备具有提高乙酰胆碱集中枢神经递质作用药物中的应用。 

CN1299717C公开的一种治疗脑中风的药物组合物，其原料药组成为(按重量比) 

胆酸3-9重量份  黄芩苷4-6重量份 

栀子苷20-35重量份  珍珠母粉40-60重量份。 

所述药物组合物原料药优选组成为： 

胆酸7重量份     黄芩苷5重量份 

栀子苷25重量份  珍珠母粉50重量份。 

所述原料药栀子苷、黄芩苷、胆酸、珍珠母可以直接通过市售购买，也 可以按照现有技术制备，如CN1299717C所述的方法。 

本发明公开了一种由胆酸3-9重量份、黄芩苷4-6重量份、栀子苷20-35重量份、珍珠母粉40-60重量份为原料药的制剂在制备治疗老年痴呆药物中的应用。 

本发明公开了一种由胆酸3-9重量份、黄芩苷4-6重量份、栀子苷20-35重量份、珍珠母粉40-60重量份为原料药的制剂在制备治疗神经元和突触损伤药物中的应用。 

本领域人员可能想到该药物组合物可以制成药学要可以接受的剂型用于防制老年痴呆。 

一、行为学实验证实清开灵改善认知功能障碍预防和治疗老年痴呆作用 

本发明首先证实了清开灵口服液和精制清开灵口服液改善快速老化鼠认知功能障碍的在体实验，实验手段是Morris水迷宫实验，实验系统是快速老化模型小白鼠SAMP8。快速老化模型小白鼠SAM，其前身为美国AKR/J系小白鼠，由竹田教授于1968年引进日本，突然出现老化症状，经20年的培育，终于形成了SAM系统。根据老化速度分为正常老化的R品系(Senile-Resistant)和快速老化的P品系(Senile-Prone)：R品系随加龄匀速老化，平均存活时间为526天，通常用作正常老化对照组；P品系随加龄快速老化，特点是成长期(4～6月龄)过后迅速出现与人类极为相似的老化诸特征，平均存活时间为358天。 

Morris水迷宫实验是一种让实验动物学习寻找不透明水中的隐蔽平台的操作过程。该实验自英国科学家Richard Morris于1981年首次设计使用以来，已成为一种研究空间学习和记忆的标准模式，能较准确地反映动物的空间参考记忆能力。隐蔽平台试验用于检测动物空间辨别及学习记忆的获得能力。探索试验是Morris水迷宫中较为敏感而精确的测试方法，测量动物的记忆保持能力。原平台象限停留时间反映出动物的空间探索策略，及动物的记忆保持能力。反向试验主要反映动物的再学习能力，其实质是动物习惯于原平台位置的脱抑制过程。Morris水迷宫结果说明清开灵治疗组能够改善SAMP8表现出的空间学习记忆障碍，学习记忆的获得、保持及再学习能力 减退的各项指标。 

空间认识图形的记忆是以视觉为基础的，Tolman认为动物脑存在着迷宫的认知地图，可以从迷宫各点找到通向目标的通路。本实验的可视平台试验结果排除了不同治疗组在感觉、视觉及运动功能方面的差异，保证了实验结果的可靠性。 

结果：隐蔽平台试验证实清开灵全方治疗组，精制清开灵治疗组，阳性对照药安理申治疗组在训练第三天能使老化鼠学习成绩稳步提高，与模型组比较有显著性差异。 

二、清开灵改善Aβ_1-42海马注射所致类AD突触损伤模型鼠学习记忆能力， 

改变突触可塑性，减少Aβ沉积。 

本发明公开了清开灵口服液对通过Aβ_1-42海马注射所致类AD突触损伤模型以证实其抗老年痴呆作用，并研究了其致病机制。所使用的方法为：雄性SD大鼠(n＝50，8～10月龄)随机分为对照组、模型组、安理申治疗组、精制清开灵组和清开灵组。2ul浓度为5g/L的Aβ1-42右侧海马注射复制类阿尔茨海默病大鼠模型，对照组注射等体积的生理盐水。造模后3天治疗组根据前期实验用量给药，模型组及盐水组给与等体积的双蒸水，均每日一次。双侧海马CA1区注射Aβ_1-404周后，用Morris水迷宫进行行为学测试，模型组大鼠在Morris水迷宫中的游泳持续时间、游泳路径长度延长，与假手术组比较均有显著差异(P＜0.05)，搜索策略多为边缘式或随机式，海马、皮质Aβ1-40表达增加；安理申治疗组、精制清开灵组、清开灵组大鼠游泳路径长度明显缩短(P＜0.05)，搜索策略多为趋向式。结论：Aβ可导致突触可塑性改变，清开灵、精制清开灵与安理申治疗组均可改善Aβ所导致的突触可塑性改变，提高学习记忆能力，机制与减少Aβ沉积，调节NGF信号存活机制有关。 

三、清开灵对快速老化鼠脑内乙酰胆碱(Ach)含量的影响 

中枢胆碱能系统与认知功能密切相关，而老年性记忆功能减退总伴有该系统的损伤。乙酰胆碱作为人和哺乳动物中枢胆碱能神经系统的一种重要递质，参与学习和记忆、睡眠和觉醒以及多种神经系统疾病如AD、帕金森氏病等的生理、病理过程。AD主要临床表现之一是中枢ACh合成减少，因此ACh含量测定成为动物实验中衡量学习记忆能力高低的一个重要参数。

结果：与对照组比较，模型SHAMP8小鼠全脑ACh含量显著降低(P＜0.01)。给药8周后，与模型组大鼠比较，清开灵组、精制清开灵组大鼠全脑ACh含量显著升高(P＜0.05～0.01)；阳性药安理中治疗组组大鼠全脑ACh水平有升高趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。结论：清开灵及精制清开灵可以提高老化鼠全脑ACh含量，该药物提高老化鼠学习记忆能力，改善认知功能障碍及预防和治疗痴呆的作用可能与此有关。 

四、清开灵对快速老化鼠脑内中枢单胺类神经递质的影响 

中枢单胺类神经递质主要与精神活动、情绪、行为、躯体运动等密切相关，与学习记忆之间也存在着一定关联。多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)、五羟色胺3(5-HT 3)种单胺含量下降可导致中枢兴奋性下降，出现痴呆和忧郁症状。自然衰老动物脑组织中NE、DA、5-HT等含量降低，动物学习记忆功能下降。AD病变常累及蓝斑核和中缝背核，还可见DA能系统改变，表现为脑部NE、DA含量降低，5-HT和5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)浓度下降。调节脑内单胺类递质水平，可能有助于改善AD患者及老年人的学习记忆能力。 

与假手术组相比，模型组全脑5-HT含量明显降低(P＜0.05)，DA、NE表现出下降趋势。与模型组比较，清开灵组、精制清开灵组老化鼠全脑DA、5-HT水平均显著升高，但统计无意义(P＞0.05)，5-HIAA水平下降趋势明显，其中清开灵组、精制清开灵治疗组HVA显著下降(P＜0.05)。结论：清开灵及精制清开灵可以调节脑内单胺类递质水平，可能有助于改善AD患者及老年人的学习记忆能力，从而达到改善认知功能障碍及预防和治疗痴呆的目的。 

附图说明

图1Morris水迷宫中4种常见的搜索策略 

1代表边缘式；2代表趋向式；3代表随机式；4代表直线式 

图2NGF在各组脑组织中的表达变化 

A.对照组；B.模型组；C.安理申组；D.精制清开灵组；E.清开灵组 

具体实施方式

下述精致清开灵为CN1299717C公开的一种治疗脑中风的药物组合物制剂。 

实施例1：清开灵改善快速脑老化鼠认知功能障碍的实验研究 

1.材料与方法 

1.1研究对象 

健康的SAMR1老化鼠15只，SAMP88月龄老化鼠45只，雌雄各半，随即分为安理申治疗组，清开灵治疗组，精制清开灵治疗组，每组15只。 

1.2行为学测试 

1.2.1 Morris水迷宫(Morris water maze)的组成 

水迷宫由圆形水池、平台和记录系统三部分组成。水池直径90cm，高50cm，随意将水池分为四个象限(东北、东南、西南和西北象限)。每天实验开始，水池注水30cm深，并加入1斤奶粉，使水成不透明乳白色，水温保持在24℃±1℃左右。水池四周存在丰富的空间参照物(门、灯、桌椅、摄像头及实验者等)，且位置保持不变，以供小鼠定位平台。圆柱形平台直径9cm，高28cm，置于任一象限中央，平面没于水面下2cm。一摄像头置于水池中央的上方约2m处，自动采集动物游泳图像，所收集信号直接输入计算机，由图像自动采集和分析系统(中国医学科学院药物研究所提供)自动分析和处理，包括动物的逃避潜伏期、游泳路径、不同象限的停留时间、初始角度及游泳路线的长度、搜索策略及中、外环游泳距离百分比等参数。 

1.2.2实验内容 

(1).隐蔽平台试验(Hidden Platform Trial) 

试验前1d，让动物在不含平台的水池中自由游泳90s，上午、下午各一次，使其熟悉迷宫环境。试验时平台位置固定不变，置于东北象限中央，平台中点离池壁22.5cm。在平台对侧选两个与之距离相等的点作为入水点，训练时将动物面朝池壁轻轻放入水中，记录小鼠从入水至找到平台的游泳路线的长度及找到平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)，然后让小鼠在平台上停留10s。如果90s内找不到平台，潜伏期记为90s，并将小鼠置于平台 上休息10s。每天在2个入水点各训练1次，以两次潜伏期的算术均值作为这一天的成绩进行统计分析。所有实验小鼠均进行隐蔽平台试验5d，反向试验3d及可视平台试验1d，以评价不同治疗组学习记忆能力的变化。 

(2).反向试验(Reversal Trial) 

操作基本同隐蔽平台试验，只是将平台位置移至对面象限(西南象限的中央，平台中点离池壁22.5cm)。 

(3).可视平台试验(Visible Platform Trial) 

为排除感觉、视觉或运动功能障碍对空间学习记忆的影响，最后1d进行可视平台试验。让平台位置露出水面2cm，并帖上黄色胶带，其余操作同隐蔽平台试验。 

(5).数据处理 

所有数据用均数±标准差 

表示，并用SPSS10.0统计软件处理。 

隐蔽平台试验及反向试验中所获得的数据采用重复测量数据的双因素方差分析(two-way ANOVA with repeated measures)，以组别作为组间因素，不同的训练天数作为组内因素。在探索试验及可视平台试验中样本间比较用单因素方差分析(one-way ANOVE)。检验水准定为P＜0.05为差异有显著性。Morris水迷宫中4种常见的搜索策略见附图1。 

表1  Morris水迷宫实验结果 

试验类型

时间

对照组 N＝15

SAMP8模型组 N＝15

清开灵组 N＝15

精制清开灵组  N＝15

西药安理申组 N＝15

隐蔽平台试验 反向试验 可视平台试验

Day1 Day2 Day3 Day4 Day5 Day7 Day8 Day9 Day10

54.71±4.48 33.59±5.42 33.34±14.52**  30.39±15.17**  42.87±10.89**  50.54±11.37 40.66±14.51*  30.34±18.99**  29.67±5.23

59.12±1.80 56.32±4.17 55.31±1.62 58.67±0.89 58.45±0.53 59.74±0.38 59.56±0.54 57.70±1.28 35.16±10.35

57.70±6.07 47.81±11.92 46.53±10.26*  43.53±10.18*  42.87±10.89**  56.01±4.60 39.89±9.73*  35.81±8.84*  35.06±12.41

59.59±1.25  53.92±10.06  48.98±15.14*   45.57±12.90*   47.95±12.73*   54.03±11.55  42.83±14.32*   38.30±9.84*   34.78±10.96

55.87±8.89 47.69±17.92 46.74±16.60*  48.80±15.68*  44.87±17.26*  57.78±4.91 48.14±8.64 42.34±6.82 34.91±8.30

[0059] 注：与SAMp8比较^*P＜0.05，^**P＜0.01 

日本竹田俊男教授通过对AKR/J自然变异小鼠进行近交延代培养得到一种自然快速老化小鼠，该家族诸多品系中的SAM-P/8表现出明显的学习记忆功能减退，处于一种低紧张、低恐怖的痴呆状态。其中SAM-P/8具备AD的许多特征，诸如皮质萎缩、皮质和海马锥体神经细胞数目下降、Aβ样颗粒(β3-CIGS)广泛沉着、脑干网状结构大细胞群背侧部出现海绵状变化、星状胶质细胞反应等，是目前国际上公认的研究认知功能障碍、学习记忆能力以及老年痴呆的最佳模型之一。 

由上表1可以看出：隐蔽平台实验和反向实验清开灵全方治疗组，精制清开灵治疗组，阳性对照药安理申治疗组在训练第三天学习成绩稳步提高，与模型组比较有显著性差异。可视平台试验；同月龄SAMP8和SAMR1以及各治疗组逃避潜伏期的比较均无显著性差异。提示动物在感觉、视觉或运动功能方面的差异未对其空间学习记忆产生明显的影响。 

实施例2：清开灵对Aβ_1-42海马注射致AD大鼠认知功能及神经元突触的影响 

1材料 

1.1实验动物 

二级雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠50只(鼠龄8～10月，体重380～400g)，由北京维通利华实验动物中心提供。置于SPF环境(Specific pathogenfree)即屏障系统(barrier system)中饲养。实验过程中动物自由摄食和饮水(术前禁食除外)，室温20℃～22℃，相对湿度为60％～70％，光照周期为12h(7:00～19:00光照；19:00～7:00黑暗)。 

1.2药品及制备 

中药清开灵口服液 

精制清开灵口服溶液 

安理申在天津中医药大学第一附属医院购买。 

Aβ_1-42，由宣武医院多肽室合成，高效液相化学分析法鉴定纯度为98％。 

抗体：一抗-Aβ_1-40、PSD-95、NGF、MAPK、p-CREB由美国PE公司431A型全自动多肽合成仪固相法合成相关肽段，HPLC纯化，与血蓝蛋白交联后免疫小鼠或兔制成多克隆抗体，ELISA检测抗体效价最高可达1∶16000。TrkA为Senta Cruz产品。 

Western-blot印迹法所用二抗为北京中山生物技术公司的碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG通用二抗。 

其他实验试剂： 

多聚甲醛(Paraformaldehyde，PFA)、磷酸氢二钠(disodium hydrogen phosphatedodecahydrate，Na₂HPO₄·12H₂O)、磷酸二氢钠(sodium dihyfrogen phosphate，NaH₂PO₄·2H₂O)、蔗糖(sucrose)、氯化钠、硫酸铬钾(potassium chromium sulfate)，北京化工厂产品； 

二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司产品； 

异戊烷(iso-pentane)，北京五二九五二化工厂； 

DBA，美国Sigma公司产品； 

30％过氧化氢，北方同正公司产品： 

曲拉通X-100(Triton-100)，北京化学试剂公司产品。 

DAB、十二烷基硫酸钠(SDS)，溴酚兰(bromphenol blue)，胰蛋白酶(Typsine)，乙二胺四乙酸(Ethylene diaminetetraacetic acid，EDTA)、苯甲基磺FA氟(PMSF)，美国Sigma公司； 

甘氨酸预染标准分子量蛋白质(参考标准蛋白大小：176.5KD，113.7KD，80.9KD，63.8KD，49.5KD，37AKD，26.OKD，19.6KD，14.9KD，8.4KD)，美国GIBCO BRL公司； 

Folin酚试剂、酒石酸钾钠、硫酸铜(CUS04-5H20)，北京鼎国生物技术公司。 

硝酸纤维素膜(pure nitrocellulose bloting membrane)，Gelman公司。 

1.3实验用试剂的配制 

(1)前固定液(4％，1000ml) 

PFA 40g 

0.1M Na₂HPO₄·12H₂O 28.64g 

上述二者加超纯水800ml，置于磁力搅拌器上60℃搅拌溶解。完全溶解后加入： 

0.1M NaH₂PO₄·2H₂O  3.12g 

蔗糖                30g 

上液溶解后，4℃冰箱过夜，用NaOH或HCL调整pH为7.4，超纯水定容至1000ml。 

(2)后固定液 

前固定液    100ml 

蔗糖        20g 

(3)0.1M磷酸缓冲液(0.1M PBS) 

A液：0.1M磷酸氢二钠 

0.1M Na₂HPO₄·12H₂O  35.8g 

去离子水             1000ml 

B液：0.1M磷酸二氢钠 

NaH₂PO₄·2H₂O  15.6g 

去离子水       1000ml 

0.1M PBS： 

A液800ml 

B液200ml 

混匀调PH值至7.4 

(4)0.01M磷酸缓冲液(0.01M PBS) 

0.1M PBS  100ml 

NaCl      9g 

去离子水定容至1000ml。 

(5)0.01M PBST(pH7.4) 

0.1M PBS      1000ml 

Triton X-100  3ml 

二者分别水浴至40′C，混匀，4℃冰箱备用。 

(6)DAB工作液的配制(现用现配) 

DAB        6mg 

蒸馏水     9ml 

0.1MPBS    1ml 

上三者混匀，过滤。上液加10ulH₂O₂，即为工作液。 

(7)脑组织匀浆液的配制 

50mM Tris-Hcl，pH7.4 

0.5M EDTA，pH8.0 

0.1％胰蛋白酶肽 

1MM PMSF 

1.4主要仪器 

620-E冰冻切片机                 英国SHANDON公司 

DIAX900型电动匀浆器             德国Heidolph公司 

DYY III型转移电泳仪             北京六一仪器厂 

DYY-II12型稳压稳流电泳仪        北京医疗设备厂 

Microfuge R低温离心机           BECKMAN 

VISILOG 5.0图象分析系统，       Noesis Vision公司 

BS-2型多功能电子恒温水浴锅      上海凯乐电子设备厂 

奥立龙868型pH仪                 ORION 

TS-1型脱色摇床                  江苏海门市麒麟医用仪器厂 

SL-2型数控层析冷柜              北京四环科学仪器厂 

Morris水迷宫仪及数据处理系统    中国医学科学院动物所 

江湾I型C立体定向器              第二军医大学 

2动物模型 

2.1动物模型的选择 

根据文献选择Aβ海马注射大鼠模型。 

2.2模型制备 

(1)动物入选：用跳台实验筛选学习记忆功能正常大鼠入选实验。 

(2)凝聚态Aβ_1-42的制备：Aβ_1-42用二甲基亚枫溶解后在37℃恒温箱中孵育7天(二甲基亚砜不超过5％)。 

(3)模型制备：SD大鼠适养一周后，用10％水合氯醛按0.35ml/kg的剂量进行腹腔麻醉，脑立体定位仪固定，平颅头位，按大鼠脑定位图 谱，于前囱后3.0mm，中线右侧2.0mm处，用牙科钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，微量注射器自脑表面垂直进针2.8mm，选择大鼠右侧海马缓慢注入2μlAβ_1-42(10μg/μl，溶于生理盐水中)，每侧注射时间为5min，留针5min，缓慢起针，局部消毒后缝合皮肤，肌注青霉素预防感染。假手术组注射等体积的生理盐水(含与模型组等比例的二甲基亚枫)。 

2.3动物分组 

大鼠分生理盐水组、模型组、安理申治疗组、精制清开灵组及清开灵组。于造模后3天开始给药，安理申治疗组按临床给药剂量灌胃；精制清开灵、清开灵配置成0.36g/ml的浓度，按0.7ml/100g的剂量给药；模型组及空白对照组给与等体积的双蒸水，均每日一次。八周后进行行为学测试，取材。3测定指标 

3.1行为学观察 

测试大鼠的学习、记忆能力，采用Morris水迷宫测试。 

Morris水迷宫测试：同实施方案1。 

3.2 Western-blot蛋白印迹 

检测大鼠脑组织NGF的表达。大鼠在非麻醉状态下断头取脑，冰盒上迅速分离脑组织，称重，置于eppendorf管中。加入预冷的0.01M PBS液洗2次，按照1∶5的比例加入预冷的脑组织匀浆液，在冰浴环境中应用电动匀浆器匀浆2分钟、冰浴裂解30分钟，15000rpm，，4℃离心30分钟，取上清，分装，-70℃保存。Folin酚比色法对脑组织进行蛋白定量。将待检样品冷冻抽干，配成每10ul样品中含200ug蛋白质的浓度，取10ul待检样品加10ul 2xSDS凝胶加样缓冲液，煮沸变性5min，-20℃保存、备用。NGF按照1∶1000的浓度稀释。其余步骤与第一部分材料与方法2.2.3.5中的步骤相同。 

结果 

1.行为学特征 

双侧海马CA1区注射Aβ_1-404周后，模型组大鼠在Morris水迷宫中的游 泳持续时间、游泳路径长度延长，与假手术组比较均有显著差异(P＜0.05)，搜索策略多为边缘式或随机式。给药4周后，与模型组比较，清开灵组大鼠游泳路径长度明显缩短(P＜0.05)，搜索策略多为趋向式；精制清开灵组、安理申治疗组大鼠游泳持续时间、游泳路径长度均显著缩短(P＜0.05)，搜索策略多为趋向式。结果见表2-1。 

表2-1  对Aβ毒性损伤大鼠模型空间学习记忆能力的影响 

组别	n	持续时间	路径长度
				假手术组模型组安理申治疗组精制清开灵组清开灵组	10    10    10    10    10	9.3±5.1    23.5±9.1#     17.3±5.6    10.6±10.0*     9.3±3.6*	268.9±186.9    696.3±227.3##     436.7±284.4*     335.7±103.6*     321.1±112.1*

注：与假手术组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较^*P＜0.05。 

2.Aβ_1-40在海马CA1区与皮质的表达变化 

模型组海马CA1区和皮质Aβ_1-40阳性细胞的平均面积和平均光密度较对照组显著增加(p＜0.05)，在海马区，安理申治疗组较模型组减少，但无显著性差异(p＞0.05)，清开灵治疗组、精制清开灵治疗组较模型组显著下降(p＜0.05)，安理申治疗组和清开灵之间差异不显著(p＞0.05)；在皮层区，安理申治疗组、清开灵治疗组、精制清开灵治疗组较模型组显著下降(p＜0.05)  (见表2-2、2-3)。 

表2-2  Aβ_1-40在大鼠海马CA1区的表达 

组别	N	AD  Mean	OD  Mean
				对照组模型组安理申治疗组精制清开灵组清开灵组	10    10    10    10    10	10.90±2.27*     15.71±3.19    13.32±2.39    11.84±1.84*     11.14±1.68*	109.80±14.41**     143.03±14.78    130.39±25.29    107.33±19.83*     117.33±19.83*

注：与模型组比较：^*p＜0.05；^**p＜0.01 

表2-3  Aβ_1-40在大鼠皮质的表达 

组别	N	AD Mean	OD  Mean
				对照组模型组安理申治疗组精制清开灵组清开灵组	10    10    10    10    10	12.11±2.92*     18.57±5.64    12.34±3.87*     13.08±4.77*     12.46±2.55*	115.55±13.44**     143.66±8.15    118.6±18.91*     121.34±13.04*     111.34±13.04*

注：与模型组比较：^*p＜0.05；^**p＜0.01。 

3.NGF受体TrkA在海马CA1区与皮质的表达变化 

模型组海马CA1区和皮质TrkA阳性细胞的平均面积和平均光密度较对照组显著降低(p＜0.01)，而各治疗组则较模型组显著增加(p＜0.01)。 

表2-4 TrkA在大鼠海马CA1区的表达 

组别	N	AD Mean	OD Mean
				对照组模型组安理申治疗组精制清开灵组清开灵组	10    10    10    10    10	9.89±2.67**     4.54±0.87    8.32±3.39*     8.12±2.49*     8.70±2.29**	115.30±8.84**     73.34±5.59    98.08±9.30*     99.08±8.50*     112.34±16.45**

注：与模型组比较：^*p＜0.05；^**p＜0.01 

表2-5  TrkA在大鼠海马CA1区的表达 

组别	N	AD Mean	OD Mean
				对照组模型组精制清开灵组安理申治疗组清开灵组	10    10    10    10    10	18.77±5.88**     9.28±1.85    16.84±6.47**     15.94±5.37**     17.44±3.22**	85.68±16.58**     56.30±13.00    71.47±9.68**     87.47±12.86**     77.86±11.97**

注：与模型组比较：^**p＜0.01 

实施例3  清开灵对快速老化鼠SHAMP8脑内ACh含量的影响 

1.1仪器与器材 

582型二元泵、ACH-3(5μm，150mm×3mm ID)层析柱、柱前固定化酶反应器、柱后固定化酶反应器、542型自动进样器、CH150型柱温箱、库伦阵列II 5600A型电化学检测器、5040型固态微孔电级(铂电极、固态钯电极)：ESA公司，美国。 

超纯水净化系统：Purelab Plus公司，美国。 

超速低温离心机：55P-72型，日立公司，日本。 

-80℃冰箱：VXE380型，Jouan公司，法国。 

针筒式微孔滤膜过滤器：水系(0.2μm)、有机系(0.45μm)，天津市腾达过滤器厂。 

1.2药品与试剂 

氯化ACh、NE、DA、2，4-二羟基乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、5-HT、5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、四甲基氯化铵(tetramethylammonium chloride，TMACl)、辛基磺酸钠(octanesulfonic acidsodium salt，OSA)、磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)、柠檬酸、硫代硫酸钠(Na₂S₂O₅)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetracetate，EDTA)、Aβ_1-40(HPLC级)：Sigma公司，美国。 

磷酸(85％)、高氯酸、乙腈(HPLC级)：Fisher Scientific公司，美国。“MB”试剂：ESA公司，美国。 

1.3样品制备 

将实验一行为学实验完成后的快速脑老化鼠断头处死，冰台上迅速取出全脑，称重，液氮快速冷冻，-80℃保存。提取时全脑置冰冷的0.1mol/L高氯酸中匀浆20s(每0.1g脑重加入高氯酸1mL)。高氯酸中含0.04％(w/v)Na₂S₂O₅和0.04％(w/v)EDTA。脑匀浆于4℃离心(14000×g)20min。上清液以0.2μm滤膜滤过、分装，-80℃冷藏，用于ACh的检测。ACh上样检测前以缓冲液(含100mmol/L Na₂HPO₄、0.5mmol/L TMACl和2.0 mmol/L OSA)按1∶2(v/v)稀释。 

1.4 ACh检测方法 

【流动相】 

Na₂HPO₄：100mmol/L 

TMACl：0.5mmol/L 

OSA：2.0mmol/L 

“MB”试剂：0.005％(v/v) 

重蒸去离子水定容，磷酸(85％)调PH值为8.00，0.2μm水系膜过滤。每周更换流动相。 

【色谱条件】 

二元泵体系：ESA582型 

色谱柱：ESAACH-3，150×3mm I.D. 

酶反应器：ESA柱前酶反应器、ESA ACH-SPR，3cm 

进样量：10μL 

流速：0.35mL/min 

柱温：35℃ 

【检测条件】 

检测器：5600A型电化学检测器 

电极：M5040型分析电极 

工作电极：铂电极 

参比电极：固态钯电极 

电势：+300mV 

使用0.1mm厚度的Teflon垫以使电极反应体积在3μL以下。 

【外标的制备】 

称取氯化ACh 140.06mg，以重蒸去离子水按1∶10(v/v)稀释，得到含标准品的工作液。继而以流动相稀释，得到280.12μg/L工作标准液。由于氯化ACh易于吸潮，所有工作均需快速进行。 

【方法学考察】 

分别制备五种不同浓度的标准溶液(1400.60、700.30、280.12、140.06和28.01μg/L)用于测定线性范围。以280.12μg/L ACh标准溶液进行回收率、稳定性和特异性实验。同时确定系统最低检测极限(S/N＝3∶1)。 

2实验结果 

与对照组比较，模型SHAMP8小鼠全脑ACh含量显著降低(P＜0.01)。 给药8周后，与模型组大鼠比较，清开灵组、精制清开灵组大鼠全脑ACh含量显著升高(P＜0.05～0.01)；阳性药安理申治疗组组大鼠全脑ACh水平有升高趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。结论：清开灵及精制清开灵可以提高老化鼠全脑ACh含量，该药物提高老化鼠学习记忆能力，改善认知功能障碍及预防和治疗痴呆的作用可能与此有关。 

表3  不同药物对脑老化鼠模型全脑ACh含量的影响 

组别	n	ACh含量(μg/L)
			假手术组模型组安理申治疗组组精制清开灵组清开灵组	6    6    6    6    6	212.8±41.7    165.7±18.5##     179.0±33.5    217.8±44.1*     255.4±35.4**

注：与假手术组比较^##P＜0.01；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。 

实施例4、清开灵对快速老化鼠脑内中枢单胺类神经递质的影响 

1.1仪器与器材 

582型二元泵、ACH-3(5μm，150mm×3mm ID)层析柱、柱前固定化酶反应器、柱后固定化酶反应器、542型自动进样器、CH150型柱温箱、库伦阵列II 5600A型电化学检测器、5040型固态微孔电级(铂电极、固态钯电极)：ESA公司，美国。 

超纯水净化系统：Purelab Plus公司，美国。 

超速低温离心机：55P-72型，日立公司，日本。 

-80℃冰箱：VXE380型，Jouan公司，法国。 

针筒式微孔滤膜过滤器：水系(0.2μm)、有机系(0.45μm)，天津市腾达过滤器厂。 

1.2药品与试剂 

氯化ACh、NE、DA、2，4-二羟基乙酸(dihydroxyphenylacetic acid，DOPAC)、5-HT、5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindole acetic acid，5-HIAA)、高香草酸(homovanillic acid，HVA)、磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)、四甲基氯化铵(tetramethylammonium chloride，TMACl)、辛基磺酸钠(octanesulfonic acid sodium salt，OSA)、磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)、柠檬酸、硫代硫酸钠(Na₂S₂O₅)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetracetate，EDTA)、Aβ_1-40(HPLC级)：Sigma公司，美国。 

磷酸(85％)、高氯酸、乙腈(HPLC级)：Fisher Scientific公司，美国。 

“MB”试剂：ESA公司，美国。 

1.3样品制备 

将实验一行为学测试完成后的快速脑老化鼠断头处死，冰台上迅速取出全脑，称重，液氮快速冷冻，-80℃保存。提取时全脑置冰冷的0.1mol/L高氯酸中匀浆20s(每0.1g脑重加入高氯酸1mL)。高氯酸中含0.04％(w/v)Na₂S₂O₅和0.04％(w/v)EDTA。脑匀浆于4℃离心(14000×g)20min。上清液以0.2μm滤膜滤过、分装，-80℃冷藏，用于单胺类递质及其代谢产物检测。 

1.4检测方法 

【流动相】 

NaH₂PO₄：90mmol/L 

柠檬酸：50mmol/L 

OSA：1.7mmol/L 

乙腈：10％ 

EDTA：100μmol/L 

NaH₂PO₄、柠檬酸及OSA经0.2μm水系膜过滤后，加入经0.45μm有机系膜过滤的乙腈，加入EDTA，重蒸去离子水定容。 

【色谱条件】 

二元泵体系：ESA 582型 

色谱柱：C18，150×4.6mm，5μm 

进样量：10μL 

流速：0.6mL/min 

柱温：室温 

【检测条件】 

检测器：5600A型电化学检测器 

电极：M5040型分析电极 

电势：-150、+450、+500、+550mV 

【外标的制备】 

称取NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT各10mg溶于100mL0.1M 的HClO₄中作为储备液(100μg/mL)，分装，存于-80℃冰箱中。取储备液(100μg/mL)1mL，定容至10mL，浓度为10μg/mL。取稀释液0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mL，分别加入0.1M HClO₄至10mL，配成500、400、300、200、100ng/mL的混合标准液。 

2实验结果 

与假手术组相比，模型组全脑5-HT含量明显降低(P＜0.05)，DA、NE表现呈下降趋势。与模型组比较，清开灵组、精制清开灵组全脑DA、5-HT水平均显著升高，但统计无意义(P＞0.05)，5-HIAA水平下降趋势明显，其中清开灵组、精制清开灵治疗组HVA显著下降(P＜0.05)。结论：清开灵及精制清开灵可以调节脑内单胺类递质水平，可能有助于改善AD患者及老年人的学习记忆能力，从而达到改善认知功能障碍及预防和治疗痴呆的目的。 

表4不同药物对中枢神经递质及其代谢产物含量的影响 

单位：μg/L 

组别

n

NE

DOPAC

DA

5-HIAA

HVA

5-HT

假手术组模型组安理申治疗组清开灵组精制清开灵治疗组

6    6    6    6    6

108.7±16.5 69.6±19.5 75.9±11.3 105.6±5.8 112.2±12.5

18.2±3.6  10.7±2.0  13.4±1.3  12.6±2.0  14.1±2.4

168.4±36.5  118.4±14.2  136.2±8.5  177.3±12.9  165.7±15.6

48.7±11.4  25.6±13.2#   27.3±3.1  49.3±6.2  47.4±3.6

18.3±3.3 13.5±4.2 15.4±9.4 9.4±1.5*  8.1±4.6*

58.3±9.0 42.6±7.6#  41.7±5.9 59.9±8.4 42.7±8.8

注：与假手术组比较^#P＜0.05；与模型组比较^*P＜0.05。 

综合实施方案3、4的结果可知，ACh作为人和哺乳动物中枢胆碱能神经系统的一种重要递质，参与学习和记忆、睡眠和觉醒以及多种神经系统疾病如AD、帕金森氏病等的生理、病理过程。AD主要临床表现之一是中枢ACh合成减少，因此ACh含量测定成为动物实验中衡量学习记忆能力高低的一个重要参数。清开灵及精制清开灵可以提高老化鼠全脑ACh含量，该药物提高老化鼠学习记忆能力。自然快速脑老化鼠脑内单胺类递质代谢的低水平状态与衰老和AD患者的病变相似，表明老化鼠的记忆障碍可能与脑内单胺类递质代谢的变化有关，清开灵可能通过延缓Ach、DA、5-HT降解，使中枢DA、5-HT水平相对升高，继而改善脑内单胺能系统活性。因此，清开灵组方改善认知功能障碍及预防和治疗痴呆的作用可能与此有关。 

Claims (3)

1.一种由胆酸3-9重量份、黄芩苷4-6重量份、栀子苷20-35重量份、珍珠母粉40-60重量份为原料药的制剂在制备改善因老化致认知功能障碍药物中的应用。

2.一种由胆酸3-9重量份、黄芩苷4-6重量份、栀子苷20-35重量份、珍珠母粉40-60重量份为原料药的制剂在制备治疗因老化致老年痴呆药物中的应用。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于制剂的原料药组成为胆酸7重量份、黄芩苷5重量份、栀子苷25重量份、珍珠母粉50重量份。 

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