CN110179984B - 增加腹侧海马到内侧前额叶皮质层铁转运的药物在制备治疗神经精神疾病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了增加腹侧海马到内侧前额叶皮质层铁转运的药物在制备治疗神经精神疾病药物中的应用。发明人在投射至内侧前额叶皮质层的腹侧海马中的神经元内过表达人源铁转运蛋白。结果发现，过表达病毒表达14天后，内侧前额叶皮质层的铁浓度显著增加，证明此方法可增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运。与对照小鼠相比，过表达小鼠运动总路程增加、在旷场的中间时间增加、在黑箱内时间减少、在高架开臂时间增加，具有抗焦虑样行为。造模成功后，与正常对照相比，注射去铁酮后铁转运增加的小鼠在高架开臂时间增多、进入开臂的次数增加，具有抗焦虑样行为。综上所述，增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运具有预防及治疗焦虑的作用。

Description

增加腹侧海马到内侧前额叶皮质层铁转运的药物在制备治疗 神经精神疾病药物中的应用
技术领域：
本发明属于医学生物领域，具体涉及改变脑内铁转运在制备治疗神经精神疾病的药物中的应用。
背景技术：
精神疾病包括：抑郁症、焦虑症、双向情感障碍、精神分裂症和其他精神病、痴呆症、智力残疾和包括自闭症在内的发育障碍。全世界所有国家的精神疾患负担持续增加，对健康产生显著影响，并在社会、人权和经济方面造成重大后果。
铁是人体的必需微量元素，参与体内诸多重要代谢过程：血氧的运输、线粒体内氧化反应、蛋白质的合成、生化反应的辅酶构成等等。脑内铁由外周摄取，随血液系统进入脑。大量的研究发现，脑区内铁沉积、脑区内铁浓度异常、神经元内铁异常增多等等都与阿尔兹海默症、帕金森症、多发性硬化症、精神分裂症等诸多精神神经疾病的发生相关。
铁转运蛋白(Ferroportin,FPN，别称SLC40A1,IREG1,MTP1)是哺乳动物细胞内唯一的胞内铁转出蛋白。FPN存在在多种涉及铁稳态的组织内，如：网状内皮系统、十二指肠、妊娠子宫、肌肉和中枢神经系统等等。在脑内，铁转运蛋白分布于各个核团，并在神经元轴突及树突中表达。FPN在组织培养细胞中过表达可导致细胞内铁耗竭。在成年小鼠中，缺铁引起十二指肠MTP1表达。这些数据表明，MTP1是铁调节跨膜蛋白，参与细胞内铁代谢。
发明内容：
本发明的目的是提供改变脑内铁转运在制备治疗神经精神疾病的药物中的应用，具体是增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运的药物在制备治疗精神神经疾病药物中的应用。
本发明通过实验发现：
小鼠脑区间存在多条铁转运通路。发明人采用脑区注射去铁酮螯合铁的方法，在腹侧海马(Ventral hippocampus,vHip)、内侧前额叶皮质层(Medial prefrontal cortex,mPFC)、黑质(Substantianigra,SN)、背侧海马(Dorsal hippocampus,dHip)、纹状体(Striatum,CPu)、苍白球(Globus pallidus,GP)、杏仁核(Amygdala,AMG)及丘脑(Thalamus,Tha)等八个精神神经疾病相关脑区中，定点螯合某一脑区铁，24小时后测腹侧海马、内侧前额叶皮质层、黑质、背侧海马、纹状体、苍白球、杏仁核、丘脑及皮层(除内侧前额叶皮层外)(Cortex,Cor)各脑区的铁浓度。结果发现，螯合内侧前额叶皮质层的铁后，腹侧海马及杏仁核铁浓度下降；螯合黑质的铁后，黑质本脑区及内侧前额叶皮质层铁浓度均下降。与之相反的是，螯合丘脑的铁后，丘脑本脑区、杏仁核及黑质铁浓度均上升。而螯合背侧海马、纹状体、苍白球、杏仁核等脑区的铁后，本脑区及各脑区均无铁浓度的变化。以上结果表明，小鼠脑区间存在多条转运通路，例如：腹侧海马→内侧前额叶皮质层→黑质及丘脑→杏仁核→内侧前额叶皮质层→黑质等。以腹侧海马→内侧前额叶皮质层为例进行进一步验证说明。
为验证脑内存在腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁运输通路，发明人采用立体定位技术，在双侧腹侧海马定点注射56FeCl3(1.5g/L，1μl)，24小时后取腹侧海马、内侧前额叶皮质层、黑质、背侧皮层、纹状体、苍白球、杏仁核、丘脑及皮层(除内侧前额叶皮质层区)等九个脑区并检测铁浓度。结果发现，仅内侧前额叶皮质层的铁浓度升高，腹侧海马本脑区及其他脑区均无铁浓度的变化。上述结果提示，脑内腹侧海马的铁可运输至内侧前额叶皮质层且具有特异性。
为进一步证明内侧前额叶皮质层增多的铁来源于腹侧海马，发明人采用立体定位技术，在双侧腹侧海马定点注射非内源性的放射性铁剂59FeCl3(1.5g/L，1μl)，在注射后第0、3、6、18、24、48及72小时检测内侧前额叶皮质层内59FeCl3。结果发现，注射后，内侧前额叶皮质层内59FeCl3持续增高，并于第6小时达到峰值，随后降低。以上结果表明，脑内存在由腹侧海马至内侧前额叶皮质层的铁转运通路。
增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运可产生抗焦虑样行为。铁转运蛋白在铁运输中起到重要作用。发明人在投射至内侧前额叶皮质层的腹侧海马中的神经元内过表达人源铁转运蛋白(先在内侧前额叶皮质层注射逆行病毒标记投射至内侧前额叶皮质层的神经元，两周后在腹侧海马注射过表达铁转运蛋白的病毒，使腹侧海马中标记的神经元过表达铁转运蛋白)。结果发现，过表达病毒表达14天后，内侧前额叶皮质层的铁浓度显著增加，证明此方法可增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运。发明人采用旷场实验、黑白箱实验、高架实验等检测过表达转铁蛋白小鼠的运动、焦虑等行为。结果发现，与对照小鼠相比，过表达小鼠运动总路程增加、在旷场的中间时间增加、在黑箱内时间减少、在高架开臂时间增加，具有抗焦虑样行为。此外，发明人采用束缚模型造模使小鼠具有焦虑样行为，随后采用内侧前额叶皮质层注射去铁酮的方法增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运。结果发现，造模成功后，与正常对照相比，注射去铁酮后铁转运增加的小鼠在高架开臂时间增多、进入开臂的次数增加，具有抗焦虑样行为。综上所述，增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运具有预防及治疗焦虑的作用。
减少腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运可产生焦虑样行为。发明人在投射至内侧前额叶皮质层的腹侧海马中的神经元内干扰鼠源铁转运蛋白的表达。结果发现，病毒表达14天后，内侧前额叶皮质层的铁浓度显著降低，证明此方法可降低腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运。发明人采用旷场实验、黑白箱实验、高架实验等检测干扰转铁蛋白小鼠的运动、焦虑等行为。结果发现，与对照小鼠相比，干扰表达小鼠运动总路程增加、在旷场的中间时间减少、在黑箱内时间增多、在高架开臂减少，具有焦虑样行为。
为进一步验证增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运的抗焦虑作用，发明人采用一种经典抗焦虑药——地西泮，结果发现，腹腔注射地西泮(1mg/Kg)的小鼠腹侧海马铁转运蛋白转录mRNA及翻译的蛋白均增加，且内侧前额叶皮质层的铁浓度增加。以上结果表明，抗焦虑药可能通过增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运起效。
发明人给予干扰铁转运蛋白的表达的小鼠地西泮，并采用高架试验检测小鼠焦虑相关行为。结果发现，通过干扰投射至内侧前额叶皮质层的腹侧海马中的神经元内铁转运蛋白表达而具有焦虑样行为的小鼠可通过地西泮治疗起效。综上所述，用于患者的抗焦虑药可能通过增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运起到治疗作用。
因此，本发明提供增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运的药物在制备治疗神经精神疾病药物中的应用。所述的治疗神经精神疾病药物为抗焦虑药物。
所述的药物包括但不限于化合物、组合物、生物(如微生物，具体如病毒)、基因工程产品(如载体)。
优选，所述的生物为表达铁转运蛋白的病毒。
以上结果表明，腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运在焦虑样行为中起到重要作用，增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运可产生抗焦虑样行为。
本发明对开发新的、有效的治疗精神神经疾病药物具有重要价值。
附图说明：
图1是腹侧海马注射56FeCl3后各脑区铁浓度
图2是腹侧海马注射59FeCl3后腹侧海马及内侧前额叶皮质内放射性铁的放射性活度与其质量比
图3是投射至内侧前额叶皮质层的腹侧海马中的神经元过表达铁转运蛋白后各脑区铁浓度；
图4是过表达铁转运蛋白后小鼠旷场中运动总路程
图5是过表达铁转运蛋白后小鼠旷场中在中央的时间
图6是过表达铁转运蛋白后小鼠在黑白箱实验中在黑箱内时间
图7是过表达铁转运蛋白后小鼠在高架试验中在开臂的时间
图8是过表达铁转运蛋白后小鼠在高架试验中进入开臂的次数
图9是造束缚模型后螯合铁后检测小鼠高架实验中的开臂时间
图10是造束缚模型后螯合铁后检测小鼠高架实验中的进入开臂次数
图11是干扰投射至内侧前额叶皮质层的腹侧海马中的神经元表达铁转运蛋白后各脑区铁浓度
图12是干扰铁转运蛋白后小鼠旷场中运动总路程
图13是干扰铁转运蛋白后小鼠旷场中在中央的时间
图14是干扰铁转运蛋白后小鼠在黑白箱实验中在黑箱内时间
图15是干扰铁转运蛋白后小鼠在高架试验中在开臂的时间
图16是腹腔注射地西泮后小鼠腹侧海马中mRNA水平
图17是腹腔注射地西泮后小鼠腹侧海马中蛋白水平
图18是腹腔注射地西泮后小鼠各脑区铁浓度
图19是干扰铁转运蛋白后腹腔注射地西泮检测小鼠在高架试验中的开臂时间
图20是干扰铁转运蛋白后腹腔注射地西泮检测小鼠在高架试验中的进入开臂次数。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：脑铁转运通路的药效/药理学实验研究
1、特定脑区螯合铁实验：
腹腔内注射4％的水合氯醛麻醉后，将小鼠固定在立体定位仪的小鼠适配器上，眼睛涂眼药膏保持湿润。剪除头发后，在皮肤消毒，沿中线切开头部皮肤，去除表面结缔组织暴露颅骨后，调整前后囟位置和方向，根据以下坐标进行定位。
腹侧海马(AP:-3.28mm；ML:±3.25mm；DV:-4.50mm)
内侧前额叶皮质层(AP:+1.78mm；ML:±0.3mm；DV:-2.75mm)
黑质(AP:-3.40mm；ML:±1.5mm；DV:-4.50mm)
背侧海马(AP:-1.70mm；ML:±1.0mm；DV:-2.00mm)
纹状体(AP:+1.10mm；ML:±1.5mm；DV:-3.50mm)
苍白球(AP:-0.46mm；ML:±1.75mm；DV:-4.00mm)
杏仁核(AP:-1.70mm；ML:±2.75mm；DV:-4.75mm)
丘脑(AP:-1.58mm；ML:±0.75mm；DV:-4.50mm)
将1μl约13μg/μl的去铁酮注入到各脑区中，对照小鼠用同样的方式注射1μl人工脑脊液，注射结束后，注射针在注射位点停留十分钟，随后小心缓慢地上移抽出，进行缝合。手术后，小鼠保温处理随后放回原笼，术后密切观察。
2、铁浓度测量实验：采用原子吸收光谱法检测
将分离出的待测脑组织称重后，加预冷的PBS(0.1M磷酸盐,1％HCl)匀浆处理，匀浆液4℃5,000rpm,离心10min，取上清，使用博晖血清金属元素检测试剂盒进行检测。样品在原子吸收光谱仪中燃烧，被测样品经乙炔高温燃烧后使其原子化，产生的原子为自由基态，吸收由空心阴极灯发射的被测元素特征谱线从而完成检测。通过同时测量试剂盒中标准品，得到标准曲线，完成测量过程。
实验动物：SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(18±2克，3月龄)由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于12/12小时明暗转换的环境(上午7时开灯/下午7时关灯)，自由摄食饮水。小鼠定位注射去铁酮24小时后取各脑区组织检测铁浓度。
实验结果：如表1所示，与注射人工脑脊液的对照小鼠相比，螯合内侧前额叶皮质层的铁后，腹侧海马及杏仁核铁浓度下降；螯合黑质的铁后，黑质本脑区及内侧前额叶皮质层铁浓度均下降。与之相反的是，螯合丘脑的铁后，丘脑本脑区、杏仁核及黑质铁浓度均上升。而螯合背侧海马、纹状体、苍白球、杏仁核等脑区的铁后，本脑区及各脑区均无铁浓度的变化。说明脑区间存在铁转运通路，其中可能存在：腹侧海马→内侧前额叶皮质层→黑质及丘脑→杏仁核→内侧前额叶皮质层→黑质等。
表1
Figure BDA0001847730220000071
Figure BDA0001847730220000081
3、确认铁存在由背侧海马转运至内侧前额叶皮质层的通路实验：
脑区注射注射56FeCl3实验：用上述方法定位腹侧海马，注射56FeCl3(1.5g/L，1μl)，24小时后取腹侧海马(vHip)、内侧前额叶皮质层(mPFC)、黑质(SN)、背侧海马(dHip)、纹状体(CPu)、苍白球(GP)、杏仁核(AMG)、丘脑(Tha)、质层(Cor)(内侧前额叶皮质层区除外)等九个脑区并检测铁浓度。
脑区注射注射59FeCl3实验：用上述方法定位腹侧海马，注射正常小鼠体内不存在的放射性铁剂59FeCl3(1.5g/L，1μl)，在注射后第0、3、6、18、24、48及72小时检测内侧前额叶皮质层内59FeCl3。
实验动物：SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(18±2克，3月龄)由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于12/12小时明暗转换的环境(上午7时开灯/下午7时关灯)，自由摄食饮水。
实验结果：如图1所示，注射56FeCl3后，仅内侧前额叶皮质层的铁浓度升高，腹侧海马本脑区及其他脑区均无铁浓度的变化。如图2所示，注射59FeCl3后，内侧前额叶皮质层内59FeCl3持续增高，并于第6小时达到峰值，随后降低。进一步确认，铁可由腹侧海马转运至内侧前额叶皮质层。
实施例2：增强腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运的抗焦虑的药效/药理学实验研究
1、腹侧海马过表达铁转运蛋白增加背侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运实验：
先在内侧前额叶皮质层注射逆行病毒标记投射至内侧前额叶皮质层的上一级神经元，两周后在腹侧海马注射过表达铁转运蛋白的病毒，使投射至内侧前额叶皮质层的腹侧海马中的神经元过表达铁转运蛋白，两周后检测行为及脑区铁浓度。
逆行病毒：AAV2-RETRO-hSyn-cre
滴度：2.28E+13v.g/ml
生产公司：brainVTA,China
货号：PT-0136
过表达铁转运蛋白的病毒(人源)：AAV2/9-CMV-DIO-EGFP-T2A-SLC40A1
滴度：2.33E+12v.g/ml
构建基因序列：Gene ID:AF226614.1
生产公司：brainVTA,China
过表达对照病毒(不表达铁转运蛋白)：AAV2/9-CMV-DIO-EGFP-T2A
滴度：2.30E+12v.g/ml
生产公司：brainVTA,China
实验动物：SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(18±2克，3月龄)由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于12/12小时明暗转换的环境(上午7时开灯/下午7时关灯)，自由摄食饮水。
实验结果：如图3所示，注射过表达铁转运蛋白病毒两周后，内侧前额叶皮质层铁浓度显著增加，表明在投射至内侧前额叶皮质层的腹侧海马中的神经元过表达铁转运蛋白可模拟腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运通路的增强，使腹侧海马铁转运至内侧前额叶皮质层，增加内侧前额叶皮质层铁浓度。
2、旷场实验：旷场实验中所需要用到的设备是由聚氯乙烯材料制作成的一个大小为60cm×60cm×40cm(长×宽×高)的矩形盒子构成。旷场盒子的底部被划分为144个5×5厘米大小的矩形，每一次实验开始时，将小鼠放置在中央的矩形框内，让其在旷场内自由行走，感应设备将记录下其在旷场中所行走的路径并保存，用于后期实验结果分析。在每只小鼠进行完一次旷场实验后，用75％乙醇清洗装置，并用扇子将其吹干以便去除气味。当动物进入盒子探索时，由于对新环境的恐惧，所以动物主要在盒子周围贴壁区域活动，而在中心区域的活动较少。然而，动物喜欢探索新奇的特性又会驱使动物探索中间区域，动物焦虑时会减少探索中间“危险”区域的欲望，通过计算动物在中央区域的停留持续时间等指标可反映动物的焦虑状态，动物在旷场中所走过的总距离反映了动物的自发活动指标。
实验动物：SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(18±2克，3月龄)由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于12/12小时明暗转换的环境(上午7时开灯/下午7时关灯)，自由摄食饮水。根据上述方法，背侧海马过表达铁转运蛋白，两周后检测行为。
实验结果：如图4、5所示，注射了过表达病毒(过表达铁转运蛋白的病毒)后，小鼠运动总路程增加、中央时间显著增加。表明小鼠在增强腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运后具有明显的抗焦虑样行为。
3、黑白箱实验：黑白箱检测采用与旷场实验相同的实验装置，在装置中放入黑色检测盒将盒子分为敞开的一半和黑暗的一半。敞开的一半定义为白箱，黑暗的一半定义为暗箱。检测盒黑白箱交界处正中有一个可容许小鼠通过的矩形孔洞。实验时轻轻将小鼠放在白箱正中间并背对黑箱子，检测5min，实验结果使用Ethovision软件分析。通过分析动物在黑白箱子停留的时间等指标可观测动物的焦虑情况，小鼠在黑箱时间越长焦虑情况越重。
实验动物：SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(18±2克，3月龄)由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于12/12小时明暗转换的环境(上午7时开灯/下午7时关灯)，自由摄食饮水。根据上述方法，腹侧海马过表达铁转运蛋白，两周后检测行为。
实验结果：如图6所示，注射了过表达病毒后，小鼠在黑箱时间明显降低，表明小鼠在增强腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运后具有明显的抗焦虑样行为。
4、高架实验：高架十字迷宫是一种对啮齿动物广泛使用的的焦虑行为分析实验。测试设备有两个开放的臂和两个封闭的臂，两臂在中间交叉，中间为空地。实验时小鼠头部面对着开臂放置。检测时间为5分钟，视频跟踪系统记录动物活动轨迹，通过分析小鼠在开放臂和封闭臂内的探索时间和进入开放臂次数来分析动物的焦虑相关的行为。在开放臂的时间越短、进入开放臂次数越少则小鼠焦虑情况越严重。
实验动物：SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(18±2克，3月龄)由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于12/12小时明暗转换的环境(上午7时开灯/下午7时关灯)，自由摄食饮水。根据上述方法，腹侧海马过表达铁转运蛋白，两周后检测行为。
实验结果：如图7、8所示，注射了过表达病毒后，小鼠在开放臂的时间明显增加、进入开放臂的次数明显增加，表明小鼠在增强腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运后具有明显的抗焦虑样行为。
5、内侧前额叶皮质层注射去铁酮，增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运的实验：先用重复束缚应激造焦虑模型：束缚组小鼠用塑料通气管对小鼠进行束缚应激2小时。束缚应激每天两次，连续两天。每次束缚结束后，将小鼠从管中取出，放回到它们的家笼，在那里它们可以自由地获得食物和水。对照组小鼠置于相同的环境中，但不受束缚。两组均在束缚时间内被剥夺食物和水。24小时后再根据上述方法，螯合内侧前额叶皮质层的铁，24小时后用高架实验检测小鼠焦虑样行为。
实验动物：SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(18±2克，3月龄)由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于12/12小时明暗转换的环境(上午7时开灯/下午7时关灯)，自由摄食饮水。
实验结果：如图9、10所示，注射对照溶剂的两组中，与非束缚组相比，束缚组小鼠在开放臂的时间明显降低、进入开放臂的次数明显减少，表明小鼠造模成功。分别在束缚组及非束缚组内比较，与注射对照溶剂组相比，螯合内侧前额叶皮质层的铁后，小鼠在开放臂的时间均明显增加、进入开放臂的次数均明显增加，表明小鼠在增强腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运后具有明显的抗焦虑样行为。再次证明增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运具有预防及治疗焦虑样行为的作用。
实施例3：减少腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运的致焦虑的药效/药理学实验研究
与实施案例2所用方法相似，在投射至内侧前额叶皮质层的腹侧海马中的神经元内干扰铁转运蛋白的表达，并采用旷场实验、黑白箱实验、高架实验等检测过表达转铁蛋白小鼠的运动、焦虑等行为。
逆行病毒：AAV2-RETRO-hSyn-cre
滴度：2.28E+13v.g/ml
生产公司：brainVTA,China
货号：PT-0136
干扰病毒(鼠源，干扰铁转运蛋白的表达)：AAV2/8-CMV-DIO-EGFP-FPN-shRNA
滴度：2.15E+13v.g/ml
生产公司：Obio Technology,China
构建基因序列：Gene ID:NM_016917.FPN shRNA:CAGACATGAATGCTACCATTA
干扰对照病毒：AAV2/8-CMV-DIO-EGFP negative control shRNA
滴度：3.52E+13v.g/ml
生产公司：Obio Technology,China
构建基因序列：NC shRNA:GGAAGTCGTGAGAAGTAGAAT
实验动物：SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(18±2克，3月龄)由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于12/12小时明暗转换的环境(上午7时开灯/下午7时关灯)，自由摄食饮水。
实验结果：如图11所示，病毒表达14天后，内侧前额叶皮质层的铁浓度显著降低，且不影响黑质(SN)、背侧海马(dHip)、纹状体(CPu)、苍白球(GP)、杏仁核(AMG)、丘脑(Tha)、质层(Cor)(内侧前额叶皮质层区除外)等其他脑区铁浓度，证明此方法可特异性降低腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运。
如图12、13所示，在旷场实验中，与对照小鼠相比，干扰表达小鼠运动总路程增加、在旷场的中间时间减少，表明干扰表达小鼠可能具有焦虑样行为。如图14所示，在黑白箱实验中，干扰表达小鼠在黑箱内时间增多，表明小鼠可能具有焦虑样行为。如图15所示，在高架试验中，干扰表达小鼠在高架开臂时间减少，具有焦虑样行为。综上所述，多种行为实验均证明特异性降低腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运可使小鼠具有焦虑样行为。
实施例4：验证经典抗焦虑药可能通过增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运起到治疗作用的实验
1、腹腔注射经典抗焦虑药地西泮(1mg/Kg)，24小时后检测小鼠腹侧海马铁转运蛋白转录及翻译水平。
转录水平：实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：待测脑组织取出后迅速投入液氮中保存，测量时首先将脑组织研磨成粉末状。加入RNAiso Plus并于冰上操作将其进行匀浆至透明状。离心匀浆液后收集上清加入RNAiso Plus的1/5体积的氯仿，反复振荡至溶液呈乳化，12,000g高速离心15分钟。吸取上清液转入新EP管中，再加入等体积的异丙醇，混匀管内的溶液后再次离心，收集离心后的沉淀使用75％乙醇清洗后再次离心，随后室温下风干沉淀。沉淀使用适量的无RNA酶的dH2O溶解，之后可将溶解液储存于-80冰箱。吸取2ul RNA母液进行总RNA浓度的定量测定，使用紫外分光光度计测出OD值后可进行RNA总浓度计算。随后进行逆转录cDNA合成操作。合成cDNA的反应使用PrimeScriptR RT试剂盒，在冰面上配制逆转录反应液后转入PCR仪内进行逆转录反应，逆转录合成好的cDNA可进行下一步实时荧光定量PCR检测。
引物序列设计：
FPN-fw 5'-TTGTTGTTGTGGCAGGAGAA-3'
FPN-rv 5'-AGCTGGTCAATCCTTCTAATGG-3'
所有引物均为北京六合华大基因科技股份有限公司合成。qRT-PCR实验参照SYBRRPremix Ex TaqTM试剂盒说明书操作。具体如下：将冰面上配好的PCR反应液混匀离心后转入实时定量PCR仪器中，待检测基因的ΔCt值比对内参基因GAPDHΔCt值进行标准化处理，计算得出目的基因的相对表达量。
翻译水平：免疫印迹实验(Western Blotting)：将收集的脑组织样品加入预冷裂解液(RIPA)并加入的蛋白酶抑制剂超声震碎。离心后小心取出上清液。取出的脑组织样品使用蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白质定量测定，参照试剂盒说明书进行具体操作。分离胶的浓度根据待检测蛋白质分子量大小选择，上样时将各组蛋白质样品加入到胶槽内，控制各样品间的上样量一致。电泳结束后，将分离胶取出置于滤纸上，贴上PVDF膜进行转膜，最后取下PVDF膜，使用脱脂奶粉室温封闭1.5-2小时。封闭结束洗涤后加入目标蛋白的抗体，冰箱4℃孵育过夜。孵育好的PVDF膜洗涤后，根据目的蛋白抗体的源性选择合适的辣根酶标记的IgG，室温孵育1-1.5小时后洗涤。最后使用ECL化学发光液显色，并用柯达医学胶片系统进行曝光影。所得到的胶片用扫描议在相同参数下进行扫描，然后用
Figure BDA0001847730220000151
FC软件进行灰度分析。结果的统计计算中，用目的蛋白质灰度值比内参蛋白质灰度值作为所检测蛋白的相对表达量。
实验动物：SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(18±2克，3月龄)由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于12/12小时明暗转换的环境(上午7时开灯/下午7时关灯)，自由摄食饮水。
实验结果：如图16、17所示，与腹腔注射溶剂的对照组相比，注射地西泮24小时后，腹侧海马mRNA及蛋白水平均升高，证明经典抗抑郁药可能通过增加铁运输至内侧前额叶皮质层而起到治疗作用。
2、腹腔注射经典抗焦虑药地西泮(1mg/Kg)，24小时后检测小鼠各脑区铁浓度。
实验动物：SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(18±2克，3月龄)由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于12/12小时明暗转换的环境(上午7时开灯/下午7时关灯)，自由摄食饮水。
实验结果：如图18所示，与腹腔注射溶剂的对照组相比，注射地西泮24小时后，内侧前额叶皮质层(mPFC)的铁浓度显著降低，黑质(SN)、背侧海马(dHip)、纹状体(CPu)、苍白球(GP)、杏仁核(AMG)、丘脑(Tha)、质层(Cor)(内侧前额叶皮质层区除外)等其他脑区铁浓度均无变化，再次证明经典抗抑郁药可能通过增加铁运输至内侧前额叶皮质层而起到治疗作用。
3、腹腔注射地西泮治疗通过干扰投射至内侧前额叶皮质层的腹侧海马中的神经元内铁转运蛋白表达而具有焦虑样行为的小鼠。
实验动物：SPF级成年雄性C57BL/6J小鼠(18±2克，3月龄)由南方医科大学实验动物中心提供。实验动物饲养于12/12小时明暗转换的环境(上午7时开灯/下午7时关灯)，自由摄食饮水。根据上述实施案例3，减少腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运，得到具有焦虑样行为的小鼠，注射干扰病毒两周后，腹腔注射地西泮(1mg/Kg)，24小时后进行高架试验检测小鼠焦虑样行为。
实验结果：如图19、20所示，腹腔注射溶剂的两组小鼠相比，注射干扰病毒组小鼠在开放臂的时间减少、进入开放臂次数也减少，证明干扰小鼠组确实具有焦虑样行为；注射对照病毒的两组相比，腹腔注射地西泮组小鼠在开放臂的时间增加、进入开放臂次数增多，证明地西泮起到了抗焦虑样行为的作用；注射干扰病毒的两组相比，腹腔注射地西泮组小鼠在开放臂的时间增加、进入开放臂次数增多，证明地西泮可以逆转减少腹侧海马→内侧前额叶皮质层铁转运引起的焦虑样行为。综上所述，用于患者的经典抗焦虑药可能通过增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运起到治疗作用。因此，增加腹侧海马→内侧前额叶皮质层的铁转运的生物、化学物质及基因手段等可以成为抗焦虑药。

Claims (1)

1.铁转运蛋白在制备治疗神经精神疾病药物中的应用，其特征在于，所述的治疗神经精神疾病药物是抗焦虑药物。
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