CN106552258A - Zn7MT3在防治阿尔茨海默症中的应用 - Google Patents

Zn7MT3在防治阿尔茨海默症中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体为使用金属硫蛋白Zn7MT3在治疗阿尔茨海默症中的应用。本发明研究表明，脑神经细胞金属内稳态调控蛋白Zn7MT3可以改善阿尔兹海默症模型小鼠的认知和记忆能力，调控AD脑海马体细胞恢复正常形态，抑制神经细胞凋亡，抑制淀粉样蛋白沉积等， 有效阻止老年痴呆症鼠病情进展。因此，Zn7MT3在制备抗阿尔茨海默症药物方面有重要应用前景。

Description

Zn7MT3在防治阿尔茨海默症中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Zn7MT3在抗阿尔茨海默症中以及在制备抗阿尔茨海默症等神经退行性疾病药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease, AD）, 俗称老年痴呆症，是由德国学者Alosi Alzheimer 于 1907 年首次报道。这是一种常发于老年人群中的中枢神经系统原发性退行性疾病，目前全世界有超过两千多万例 AD 患者，其临床表现为不同程度的记忆力丧失，语言困难，定向力障碍，认知能力降低，人格及行为和感情活动异常，进行性智力障碍，最后全身衰竭，并发感染而亡。目前 AD 已经成为继心脏病、肿瘤和中风之后的第四位死亡原因。AD 最典型的病理特征是：大脑皮层和海马组织内出现大量的老年斑（senileplaques, SP）、神经纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）、神经元数量减少和颗粒空泡变性。AD 的发病机理十分复杂，可能是多种因素相互作用的结果。迄今为止，其确切的发病机理还是一个未解之谜，但在近三十年的研究证据表明，淀粉样多肽（amyloid-betapeptide, Aβ）、淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）、金属硫蛋白（metallothionein, MT3）及其所参与调节的金属离子内稳态平衡与 AD 的发生、发展有着密切的联系。
国内外已对AD的神经病理机制进行了大量的研究。70年代中期以来，大量药理学研究集中于提高突触裂隙中的乙酰胆碱水平，发现了一系列乙酰胆碱酯酶的抑制剂类药物。然而，这种治疗仅是缓解症状的治标疗法。80年代中期以来，许多研究围绕Ab的形成、聚集以及清除机制，或Ab的神经毒性机制进行。以Ab为靶标治疗AD病的药物有Ab前体蛋白APP分泌酶的抑制剂、抗Ab聚集的金属离子螯合剂和Ab的抗体等。然而，2008年Lancet报道，Ab疫苗能有效地清除脑内Ab斑，但并不能阻止痴呆症状的发展。这一报道对围绕Ab斑的治疗研究提出了疑问。这些结果说明，Ab斑本身并不是神经细胞毒性的主要根源，可能的机制是，Ab斑在形成过程中产生的ROS对神经细胞造成毒性。运用同步辐射X-射线荧光分析技术发现老年斑中有高浓度的金属离子聚集，如铜、铁、锌离子的含量分别高达1.0、0.4和1.0 mM。大脑中这些过渡金属离子异常高浓度聚集及其相关的蛋白质（如Ab、tau蛋白等）异常聚集是多种神经退行性疾病的共有特征。因此，金属离子与神经医学高度关联的这一领域受到科学家和神经医学科学家的极大关注。大量研究报道显示：脑神经中某些过渡金属离子（Cu、Fe、Zn）的内稳态失衡是AD病人神经元死亡的主要起因之一；脑中这些过渡金属离子，特别是能够进行单电子氧化还原的Cu和Fe离子的内稳态调节，以及有关的活性氧物种（ROS）水平的调控很可能是治疗AD病的有效策略。
金属硫蛋白-3（metallothionein-3, MT3），也称为神经生长抑制因子（GIF），在人大脑中特异性表达。MT3 由68个氨基酸组成，其中就包括了20个保守的半胱氨酸。它的两个结构域含有两个金属簇，总共能够结合7个二价的金属离子。 N-端β-结构域中的 M3S9 和存在于 C-端的α-结构域的 M4S11。两个结构域之间通过KKS三个氨基酸连接。大脑中MT3大量分布于神经星形细胞，但是在 AD 患者脑中，MT3的表达量明显下降约三分之一。MT3表达的受损可能与AD症状的发生或神经功能损伤有关。MT3可以将NO信号转化为Zn2+信号。NO通过与MT3中结合Zn2+的半胱氨酸直接发生S-亚硝基反应或者与S-亚硝基硫醇发生亚硝基转换反应，将Zn2+从MT3中释放出来。
锌离子是大脑中的信使，大脑具有最高的锌含量，最典型的是在灰质中可达到约150 μM。大脑中处于自由离子形式的锌大量富集在许多谷氨酸能神经末端（10-15%）。当锌被释放后进入突触间隙，在突触间隙内离子浓度可上升至毫摩尔数量级。和铜离子一样，释放的锌离子在突触间隙内与神经受体如NMDA相互作用，同时也会作用于多种神经元离子通道及转运子来调控神经信号传导。多种锌转运蛋白（ZnTs）以及MTs等结合胞质中的Zn离子，从而阻止游离的Zn离子转变为有毒状态。相比于Cu离子，血浆中的Zn离子含量从出生后逐步下降，且AD患者的血浆中Zn离子含量比同龄正常人有进一步的减少。尽管Zn离子总含量与大脑年龄的老化没有关系，然后已知一些特定区域含有高浓度的Zn离子，如高谷氨酸能支配的海马区，随着年龄的增长表现出Zn离子含量的降低。现在的多篇文献报道，大脑补锌可能是防治老年痴呆症的有效策略之一。
Lovell等人早在1998年已经确证在AD大脑的特定区域（如淀粉样斑块，俗称老年斑）中存在有大量的Zn离子，达到约1 mM，而正常同龄的神经纤维中的含量只有约350 μM。另外，Zn转运蛋白的表达水平，如ZnT1、ZnT4和ZnT6在AD患者中都发生了改变。这些发现使人们开始重视Zn在AD病理过程中的潜在作用。
Zn离子与淀粉样多肽Aβ的聚集也有着密切的关系。Zn离子能够快速引起Aβ多肽形成蛋白酶不能降解的沉淀。在体外模拟的生理条件下，Zn离子以1:1的比列与Aβ结合形成复合物，而聚集体的结构被认为更加的无定形，如纤维含量更少。然而这种活性可能并不具有神经毒性，而是被认为是一种神经保护作用，因为体外皮层神经细胞培养实验证实Zn离子能够降低Aβ引起的细胞毒性。Zn离子保护Aβ毒性的确切机理还不是很清楚，但其中有一种可能性是Zn与Cu或者Fe金属离子竞争结合Aβ，促使其改变自身构象使得Cu/Fe离子接触不到它们的金属结合位点，从而阻止了它们与Aβ的结合，进而防止了过氧化氢及自由基的产生。
金属硫蛋白MT3是神经元内部Zn的主要来源，近期的研究发现，结合于MT3上的Zn离子能够同Aβ-Cu复合物发生金属置换，从而抑制了Aβ还原Cu2+所产生的氧化损伤。AD脑中Zn离子失衡，可能源自Zn离子输出的抑制，Aβ-Cu还原活性产生的一种过氧化物4-hydroxynoenal（4-羟基巴比妥）被认为具有这种作用。与此一致的是，小鼠动物研究指出，系统性Zn离子的缺失引起了脑中Zn离子的滞留，而这种作用是通过抑制胞内Zn离子输出蛋白ZnT1所致。
神经突触中，MT3、Ab和铜金属离子可能形成一种动态平衡。在 ZnT3 的作用下， Zn2+和谷氨酸同时聚集于前突触囊泡中，Zn2+在突触间隙中浓度高达0.3 mM，而NMDA 介导的激活使铜离子在突触后释放，转运到突触间隙，随之铜离子在突触间隙的浓度达到毫摩尔级。反过来铜和锌都可以抑制 NMDA 受体的应答反应。Aβ经淀粉样蛋白前体蛋白APP 酶切后释放到突触间隙后可以与间隙内的铜发生反应，然后交联形成可溶性的Aβ聚集体甚至形成淀粉样沉淀。MT3由邻近的星形胶质细胞释放进入突触间隙，可以缓解这一不利反应的发生。神经金属离子、Ab、MT3在突触间隙形成一个动态平衡，这种平衡可阻止Ab在突触间隙中形成纤维沉淀。适当的神经突触活动可能会促进这一平衡系统，但是过度的或异常的神经活动可能对这一系统有害。调控脑神经[金属离子-Ab-MT3]形成有益的平衡可能是治疗老年痴呆症的创新思路，对AD病的调控治疗有重要意义。
本发明运用阿尔茨海默症小鼠模型，研究了Zn7MT3在脑神经中的调控功能，研究发现，Zn7MT3可以改善阿尔兹海默症模型小鼠的认知和记忆能力，抑制神经细胞凋亡，抑制淀粉样蛋白沉积等，能有效阻止老年痴呆症病情进展。
发明内容
本发明的目的在于提供Zn7MT3及其衍生物在抗阿尔茨海默症中的应用，及其在制备抗阿尔茨海默症等神经退行性疾病药物中的应用。本发明实验研究表明，Zn7MT3可以抑制神经细胞的凋亡，抑制淀粉样蛋白聚集，改善认知记忆能力，具有明显的抗阿尔茨海默症发展的作用，可用于制备抗阿尔茨海默症药物。
本文提及人源MT3，为特定蛋白质名称，如不加说明，均与多数公开文献及NCBI数据库、欧洲基因数据库一致。MT3（Metallothionein 3）又称神经生长抑制因子（neuronal growthinhibitory factor），含有68氨基酸残基，其GenBank名为：EAW82868.1.
一、具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
实施例1：Zn7MT3的制备
所有生物化学试剂、试剂盒，除特别说明外，均购自Sigama 或Invitrogen公司。
质粒构建
人金属硫蛋白MT3和融合标签蛋白基因Smt3购自广州福能基因公司。基因载体质粒MBPHT-mCherry-2购自Invitrogen公司，基因引物合成由上海杰瑞生物技术公司完成，利用设计的引物P1、P2（扩增Smt3基因）和P3、P4（扩增MT3基因）扩增出PCR产物。扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测验证并胶回收正确的片段。产物1和产物2按相同浓度比例混合后作为模板，利用P1和P4引物扩增出Smt3-MT3序列，其5’端带有BamHI酶切位点GGATCC，3’端带有HindIII酶切位点AAGCTT。设计的扩增引物如下：
P1: 5’-CGCGGATCCATGGCTAGCATGTCGGACTC-3’
P2: 5’-GGCAGGTCTCAGGGTCCATACCACCAATCTGTTCTC-3’
P3: 5’-GAGAACAGATTGGTGGTATGGACCCTGAGACCTGCC-3’
P4: 5’-CGCAAGCTTTCACTGGCAGCAGCTGCAC-3’
分别将载体MBPHT-mCherry-2和扩增的Smt3- MT3基因序列用BamHI和HindIII内切酶，在37℃双酶切6小时，用1%琼脂糖凝胶检测验证酶切成功，胶回收酶切片段。酶切的大小片段按1：3混合，用T4连接酶在16℃连接8小时，连接产物转化到Top10 克隆感受态细胞，挑取阳性克隆进行PCR鉴定和测序证明，成功构建了融合蛋白MT3-Smt3表达质粒。
（2）MT3 蛋白的表达与纯化
将构建的质粒转化入宿主菌BL21（DE3）中，挑取单菌落于3ml LB培养基中，37℃下摇床培养8小时后以1：100的比例接入50ml的LB培养基中，在37℃摇床中培养6小时后再以1：100的比例接入2YT培养基中（以上培养基均含有100μg/ml 氨苄青霉素钠）。37℃ 200rpm摇床培养至OD值为0.6~0.8时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.4mM，于16℃过夜表达。
融合蛋白的纯化过程如下：离心收菌的菌体加Tris 缓冲液（20mM Tris-HCl，500mMNaCl，10%甘油，5 mM β-巯基乙醇，PH= 7.5）悬浮（1ml/g菌体），加少量溶菌酶、DNA酶、1%PMSF，搅拌溶菌并用超声破碎机破菌，然后，用高速离心机离心（12000 rpm、离心30min），取上清液穿流已经平衡好的亲和Ni-NTA 柱，使得带有His标签的融合蛋白挂柱。用含20mM 咪唑的Tris缓冲液洗脱杂蛋白，至考马斯亮蓝检测不变色为止。用含200mM 咪唑的Tris缓冲液洗脱融合蛋白。洗脱的融合蛋白装入透析袋中透析，透析液为Tris 缓冲液，每次1L，每隔6小时换液，共换三次，之后按1%的比例加入SUMO酶酶切6小时，酶切产物穿流已经平衡好的Ni-NTA 柱，共穿流三次除去标签蛋白及SUMO酶，再用Superdex-G75凝胶分子筛进一步除去杂蛋白，纯化得到的MT3蛋白经15% SDS－PAGE胶检测纯度达95%以上。
（3）Zn7MT3的金属重组
取2ml MT3蛋白溶液（5mg/ml），加入DTT至终浓度为50mM，4℃还原2小时。加入6M的HCI溶液调节pH至l-2，酸化l小时后，过Superdex G-25柱除去杂金属离子，用 pH2.0的HCI溶液洗脱MT3蛋白。流出液用紫外光谱仪检测，收集。脱金属的Apo-MT3蛋白溶液脱气后立即载入厌氧手套箱中，加入DTT至终浓度为50mM，加20倍于蛋白浓度的ZnCl2，慢慢滴加2M的Tris碱调节pH至8-9，室温下放置过夜，然后透析去除过剩的锌离子，蛋白浓缩后得到Zn7MT3。
（4）Zn7MT3 的性质表征
MT3蛋白浓度标定方法：采用2，2’- 二硫二吡啶( 2-PDS) 比色法。原理是利用2，2’一二硫二吡啶氧化蛋白中的巯基，形成的产物2-硫代吡啶在343nm处有敏锐吸收。取10μl蛋白溶液，加入到 500μl 测定液中（2mM 2，2’一二硫二吡啶，1mM EDTA，0.2M乙酸钠，pH4.0），混匀后室温下静置5分钟，用紫外光谱仪测量343nm吸光度值并用比尔朗伯定律 (lamber-beers law) 计算蛋白质中疏基（-SH）的浓度。C(-SH)= A343/(ε343· L)，其中A343为反应产物（2一硫代吡啶）在343nm的吸光度，ε343为反应产物在343nm的摩尔消光系数(7.06×103 M-1)，L为光径长度(cm)。由于金属硫蛋白中含有多个巯基，所以用测得的疏基浓度除以疏基数即可得到蛋白的浓度。
Zn7MT3金属含量测定：取一定量的重组好的蛋白，加少量浓硝酸于65℃硝化过夜，稀释10倍后在电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）上测定金属Zn的含量。结果显示重组后每摩尔MT3蛋白含有的Zn为7±0.2摩尔。
（5）Zn7MT3内毒素的去除
Zn7MT3（分子量约7KD）先用10KD的超滤膜截留聚集态的内毒素（LPS），再用PolymyxinB 亲和柱除去残留的内毒素。
实施例2：阿尔茨海默症小鼠模型及Zn7MT3药物治疗
APP/PS1 转基因小鼠购自北京中科泽晟生物技术有限公司， 5月龄，体重24-26g。受试药物名称：Zn7MT3；溶媒：生理盐水；配制方法：临用前用生理盐水溶液配制成所需浓度的溶液。小鼠脑室给药：实验动物为APP/PS1二转基因小鼠。使用Alzet 微渗泵 Model 2006，进行6周的缓释给药。给药部位为侧脑室，埋管时使用立体定位仪精确定位（以前囟为原点，左侧或右侧1.0mm，后侧0.4mm，深度0.3mm），给药剂量为2mg/kg/天，给药6周后取血清和脑组织。
实施例3：用Morris水迷宫验证阿尔茨海默症小鼠认知能力
装置:圆形水池，直径1m，高50cm，水深30cm，池底白色，水温保持在23±2℃；池壁上标记四个等距离点N、E、S、W作为试验的起始点，分水池为四个象限，在第三象限中央放置平台(平台与池壁圆心距离相等)；没于水下1 cm，使平台不可见。水池周围贴有丰富的参照线索(不同颜色三角形、四方形、圆、菱形置于各个象限) 且保持不变，供小鼠用来定位平台。定位航行试验:试验共历时6天，每天定于固定时间段训练4次。训练开始时，将平台置于第一象限，从池壁四个起始点的任一点将小鼠面向池壁放入水池。自由录像记录系统记录小鼠找到平台的时间和游泳路径，4次训练即将小鼠分别从四个不同的起始点（不同象限）放入水中。小鼠找到平台后或90秒内找不到平台(潜伏期记为90秒)，则由实验者将其引导到平台，在平台上休息10秒，再进行下一次试验。
空间探索试验：定位航行试验结束24h后，撤除站台。然后将鼠由第三象限放入水中，记录鼠在180s内的游泳路径，记录鼠在目标象限（第三象限）的停留时间和穿越原站台所在位置的次数，观察受试鼠的空间定位能力。数据用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较给药效果的显著性。结果表明：Zn7MT3治疗的阿尔茨海默症小鼠具有认知能力改善的现象。相比对照组，给药组AD鼠在第三象限停留时间和穿越原站台所在位置的次数几率提高了20% 以上，说明Zn7MT3能有效阻止治疗的阿尔茨海默症小鼠病情发展。
实施例4：Zn7MT3对阿尔茨海默症小鼠脑神经细胞的调控
AD鼠给药6周后，取小鼠脑组织，在4％多聚甲醛中固定、脱水、石蜡包埋，在切片机上切成4微米厚的组织切片，然后用苏木精和曙红（HE）染，在光学显微镜下（Leica, Germany）观察海马体CA1区的细胞形态）。实验结果如图1所示（A为对照组，B为AD鼠模型组，C为AD鼠模型脑室定位缓释Zn7MT3给药组）。AD模型鼠脑组织CA1区的细胞变形皱缩，观察不到染色质及核糖体，给药Zn7MT3后细胞形态趋于正常。使用Zn7MT3后，能够抑制小鼠大脑神经细胞的退化变性，调控神经细胞恢复正常功能。
例5：Zn7MT3抑制阿尔茨海默症小鼠脑淀粉样蛋白聚集
本实验为硫黄素S染色实验，实验流程为：AD鼠给药6周后，取小鼠脑组织，固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，TBS洗三次，0.3%硫黄素S（溶于50%乙醇）滴于组织上，室温孵育10min，50%乙醇洗三次，TBS清洗，阴干，封片，激光共聚焦显微镜下观察。实验结果如附图2所示。硫磺素S本身自带绿色荧光，能特异性的与成熟的Aβ淀粉样蛋白结合，用于标记脑组织中淀粉样蛋白的含量和分布，评价阿尔兹海默症的病理状况。实验结果如图2所示（A为对照组，B为AD鼠模型组，C为AD鼠模型脑室定位缓释Zn7MT3给药组）。给药后Aβ淀粉样蛋白较模型组有明显减少。Zn7MT3能够显著降低AD鼠脑内Aβ蛋白的沉积。
实施例6：Zn7MT3抑制阿尔茨海默症小鼠脑神经细胞凋亡
TUNEL凋亡试剂盒（G3250试剂盒）购自Promega公司。小鼠给药6周后，取小鼠脑组织，固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，PBS洗涤，蛋白酶K室温孵育10min，切片PBS洗涤后甲醛固定，加入平衡缓冲液预平衡后洗涤，之后加入孵育缓冲液（内含平衡缓冲液，核苷混合物和rTdT酶），37℃避光孵育1h，终止反应后共染DAPI，阴干，封片，激光显微镜拍照。实验结果如图3所示（A为对照组，B为AD鼠模型组，C为AD鼠模型脑室定位缓释Zn7MT3给药组），结果表明：Zn7MT3能够抑制小鼠大脑神经细胞的凋亡。
说明书附图
图1.Zn7MT3对阿尔茨海默症鼠脑组织海马体CA1区细胞形态的调控作用（A为对照组，B为AD鼠模型组，C为AD模型鼠脑室给药Zn7MT3六周）。
图2. Zn7MT3抑制AD鼠脑内Aβ蛋白的沉积
图3 、Zn7MT3对阿尔茨海默症鼠脑内神经细胞凋亡的影响（A为对照组，B为AD鼠模型组，C为AD模型鼠脑室给药Zn7MT3六周）。
人源MT3 蛋白氨基酸序列（1-68）：
MDPETCPCPS GGSCTCADSC KCEGCKCTSC KKSCCSCCPA ECEKCAKDCV
CKGGEAAEAE AEKSSCCQ。

Claims (6)

1.Zn7MT3及其衍生物在抗阿尔茨海默症中的应用。
2.Zn7MT3及其衍生物在制备抗阿尔茨海默症药物中的应用。
3.Zn7MT3及其衍生物在制备抗神经退行性疾病药物中的应用。
4.根据权利要求1所述Zn7MT3及其衍生物在抗阿尔茨海默症中的应用，其特征在于：改善AD脑认知功能障碍，调控AD脑海马体细胞形态恢复正常, 抑制AD脑内淀粉样蛋白沉积,抑制脑内神经细胞凋亡。
5.根据权利要求2、3所述的Zn7MT3按常规药剂学制成各种剂型，所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取口服或注射（包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射、或脑室直接给药等）中的一种或多种给药途径进行抗阿尔茨海默症及其直接相关的神经退行性疾病的预防或治疗。
6.Zn7MT3的高效制备方法，其特征在于：（1）MT3 用MBP和Smt3双标签融合表达，在大肠杆菌中可溶表达效率比没有融合标签时高5倍，蛋白质纯化纯度高10%， （2）Zn7MT3在厌氧手套箱中经酸变性去除杂金属，然后加入过量锌离子后使MT3蛋白复性，再过G25去除过剩锌离子，获得键合七个锌离子的金属硫蛋白Zn7MT3。
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