CN113797231B - 一种方格星虫体壁自溶物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，公开了一种方格星虫体壁自溶物及其制备方法与应用。该方格星虫体壁自溶物的制备方法为：将方格星虫体壁与缓冲液混合，自溶，得到方格星虫体壁自溶物；所述缓冲液的pH为3～8；所述自溶的温度为30～60℃，该方法提高了方格星虫体壁自溶物中可溶性蛋白的含量。该方法制备得到的方格星虫体壁自溶物中可溶性蛋白含量高，其分子量为200Da～10kDa，可显著促进海马神经元细胞的增殖及活力，也可用于制备海马神经元细胞增殖促进剂以及治疗阿尔兹海默病、难治性癫痫、脑缺血性疾病和抑郁症等疾病的纯天然药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种方格星虫体壁自溶物及其制备方法与应用。
背景技术
方格星虫(sipunculus nudus)，又叫作光裸星虫，英文俗名Peanut worms，隶属于星虫科(Sipunculidae)、星虫属(Sipunculus)，外形像一根细细的香肠，所以又叫沙虫，在我国主要分布在沿海地区。多种中草药典籍中记载了方格星虫的食用和药用价值，被东南沿海地区称为“海洋冬虫夏草”，闽南人称其为“动物人参”，可见其极高的应用价值。近年来，大量研究发现，方格星虫富含丰富的蛋白质和微量元素，能调节机体的多种功能，具有显著的抗氧化、抗疲劳、抗衰老、增强免疫力、调节血压、哺乳、滋阴降火、清肺化痰等功效，同时对小儿神经衰弱、脾虚肾虚、夜尿频多等也有疗效。目前，方格星虫主要是直接食用为主，对方格星虫体壁自溶物及其体壁自溶物在促进海马神经元细胞增殖等方面的研究鲜有报道。
海马神经元细胞(Hippocampus nerve cells)来源于哺乳动物大脑皮层的海马区，海马神经元数量及突触功能的改变与学习记忆和认知功能有密切联系，多被用来对阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease，AD)、难治性癫痫(Intractable epilepsy，IE)、脑缺血性疾病(Ischemic cerebral Diseases)等多种疾病的病理、生理及药物筛选研究。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种方格星虫体壁自溶物的制备方法。
本发明第二方面的目的，在于提供一种方格星虫体壁自溶物。
本发明第三方面的目的，在于提供第二方面的方格星虫体壁自溶物在制备产品中的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种产品。
本发明第五方面的目的，在于提供一种促进海马神经元细胞增殖的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种方格星虫体壁自溶物的制备方法，将方格星虫体壁与缓冲液混合，自溶，得到方格星虫体壁自溶物；
所述缓冲液的pH为3～8；
所述自溶的温度为30～60℃。
优选地，所述方格星虫体壁通过如下方法得到：将方格星虫洗净后解剖，除去内脏，得到。
优选地，所述方格星虫体壁混合前还包括粉碎步骤。
优选地，所述缓冲液为PBS缓冲液、磷酸缓冲液、盐酸缓冲液、中性蛋白酶溶液和McIlvaine缓冲液中的至少一种。
优选地，所述缓冲液的pH为5～7。
进一步优选地，所述缓冲液的pH为6～7。
优选地，所述缓冲液的浓度为0.1～0.4mol/L。
进一步优选地，所述缓冲液的浓度为0.2～0.4mol/L。
优选地，所述缓冲液与方格星虫体壁的体积质量比(mL/g)为(1～10)：1。
进一步优选地，所述缓冲液与方格星虫体壁的体积质量比(mL/g)为(4～8)：1。
更进一步优选地，所述缓冲液与方格星虫体壁的体积质量比(mL/g)为(4～6)：1。
优选地，所述自溶的温度为40～60℃。
进一步优选地，所述自溶的温度为40～50℃。
优选地，所述自溶的时间为0～8h，不包含0h。
进一步优选地，所述自溶的时间为2～8h。
更进一步优选地，所述自溶的时间为4～8h。
优选地，所述制备方法还包括如下步骤：终止自溶，离心，取上清。
进一步优选地，所述终止自溶的方法为：80～120℃条件下灭酶3～8min。
进一步优选地，所述离心的条件为8000～15000r/min离心15～25min。
本发明的第二个方面，提供一种方格星虫体壁自溶物，通过本发明第一方面的制备方法得到。
优选地，所述方格星虫体壁自溶物包含可溶性蛋白。
优选地，所述可溶性蛋白的分子量为200Da～10kDa。
进一步优选地，所述可溶性蛋白的分子量为300Da～5000Da。
更进一步优选地，所述可溶性蛋白的分子量为300Da～3000Da。
本发明的第三个方面，提供第二方面的方格星虫体壁自溶物在制备产品中的应用。
优选地，所述产品为(1)～(2)中的至少一种；
(1)海马神经元细胞增殖促进剂；
(2)治疗疾病的药物；
所述疾病为阿尔兹海默病、难治性癫痫、脑缺血性疾病和抑郁症中的至少一种。
本发明的第四个方面，提供一种产品，包含本发明第二方面的方格星虫体壁自溶物。
本发明的第五个方面，提供一种促进海马神经元细胞增殖的方法，将海马神经元细胞与本发明第二方面的方格星虫体壁自溶物混合，培养。
本发明的有益效果是：本发明提供一种方格星虫体壁自溶物的制备方法，将方格星虫体壁与缓冲液混合，自溶，得到方格星虫体壁自溶物，通过限定缓冲液的pH为3～8，自溶的温度为30～60℃，提高了方格星虫体壁自溶物中可溶性蛋白的含量。
进一步地，本发明通过限定缓冲液的pH、自溶的温度及时间以及缓冲液与方格星虫体壁的体积质量比，进一步提高了方格星虫体壁自溶物中可溶性蛋白的含量。
本发明提供的方格星虫体壁自溶物中可溶性蛋白含量高，其可溶性蛋白的分子量为200Da～10kDa，该可溶性蛋白可显著促进海马神经元细胞的增殖及活力，也可用于制备海马神经元细胞增殖促进剂以及治疗阿尔兹海默病、难治性癫痫、脑缺血性疾病和抑郁症等疾病的纯天然药物。
附图说明
图1为自溶时间对方格星虫体壁自溶物的影响结果图。
图2为温度对方格星虫体壁自溶物的影响结果图。
图3是McIIvaines缓冲溶液的pH对方格星虫体壁自溶物的影响结果图。
图4是McIIvaines缓冲溶液与方格星虫体壁的液料比对方格星虫体壁自溶物的影响结果图。
图5是方格星虫体壁自溶物对HT22细胞活力的影响结果分析图，其中，*表示P＜0.05，****表示P＜0.0001。
图6是方格星虫体壁自溶物促HT22细胞增殖的平板克隆实验结果图。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。其中，饥饿培养基购买自赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司，批号为8121275；细胞色素C购买自Sigma，货号为C3131；胰岛素购买自Sigma，货号为I0310000；杆菌肽购买自上海麦克林生化科技有限公司，货号为B802311；甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸购买自Sigma，货号为G5386；甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸购买自Sigma，货号50239。
本实施例中使用的McIIvaines缓冲液(0.2mol/L)的配制方法如下：取Na2HPO4和柠檬酸混合，使Na2HPO4的终浓度为0.2mol/L，柠檬酸的终浓度为0.1mol/L，同时，利用pH仪配制得到不同pH的McIIvaines缓冲液。
实施例1自溶时间对方格星虫体壁自溶物的影响
实施例1-1
一种方格星虫体壁自溶物的制备方法，包括如下步骤：将鲜活方格星虫洗净后解剖，除去内脏，用高速组织捣碎机将体壁绞成匀浆，然后取3g样品，加入12mL pH 6.8的McIIvaines缓冲液，在45℃条件下自溶2h后，90℃条件下灭酶5min终止自溶，得到方格星虫体壁自溶物。
实施例1-2
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-1相同，区别仅在于：自溶时间为4h。
实施例1-3
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-1相同，区别仅在于：自溶时间为6h。
实施例1-4
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-1相同，区别仅在于：自溶时间为8h。
取未自溶的方格星虫体壁(自溶时间为0h)为对照组，实施例1-1～1-4得到的方格星虫体壁自溶物为实验组，室温静置20min，在4℃条件下以10000r/min的转速离心20min，取上清液，采考马斯亮蓝法于595nm处测定其吸光度值，并根据BSA蛋白标准曲线计算可溶性蛋白浓度。结果如图1所示：与对照组相比，方格星虫体壁自溶物中可溶性蛋白含量随着自溶时间的延长而逐渐增加，自溶4h时达到最大值，而4～8h可溶性蛋白含量无显著性变化(P>0.05)，是因为自溶初始阶段底物浓度和方格星虫体内自溶相关酶浓度最大，自溶速度很快；随着反应的进行，底物浓度减小，酶活力下降，减少了蛋白与酶的接触面积，酶解速度降低，自溶速度减慢。
实施例2温度对方格星虫体壁自溶物的影响
实施例2-1
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-2相同，区别仅在于：在30℃条件下自溶。
实施例2-2
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-2相同，区别仅在于：在40℃条件下自溶。
实施例2-3
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-2相同，区别仅在于：在50℃条件下自溶。
实施例2-4
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-2相同，区别仅在于：在60℃条件下自溶。
分别取实施例2-1～2-4得到的方格星虫体壁自溶物，室温静置20min，在4℃条件下以10000r/min的转速离心20min，取上清液，采考马斯亮蓝法于595nm处测定其吸光度值，并根据BSA蛋白标准曲线计算可溶性蛋白浓度。结果如图2所示：随着温度的不断升高，方格星虫体壁自溶物中可溶性蛋白浓度呈现先上升而后下降的变化趋势：在温度低于40℃时，可溶性蛋白浓度随着温度的升高而升高；当温度超过40℃，可溶性蛋白浓度有所下降，这是因为温度过高和过低都会使方格星虫体内相关酶的活性降低甚至失活。
实施例3pH对方格星虫体壁自溶物的影响
实施例3-1
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例2-2相同，区别仅在于：McIIvaines缓冲液的pH为3。
实施例3-2
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例2-2相同，区别仅在于：McIIvaines缓冲液的pH为4。
实施例3-3
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例2-2相同，区别仅在于：McIIvaines缓冲液的pH为5。
实施例3-4
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例2-2相同，区别仅在于：McIIvaines缓冲液的pH为6。
实施例3-5
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例2-2相同，区别仅在于：McIIvaines缓冲液的pH为7。
实施例3-6
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例2-2相同，区别仅在于：McIIvaines缓冲液的pH为8。
分别取实施例3-1～3-6得到的方格星虫体壁自溶物，室温静置20min，在4℃条件下以10000r/min的转速离心20min，取上清液，采考马斯亮蓝法于595nm处测定其吸光度值，并根据BSA蛋白标准曲线计算可溶性蛋白浓度。结果如图3所示：随着pH的不断升高，方格星虫体壁自溶物中可溶性蛋白浓度呈现先上升而后下降的变化趋势：在pH小于等于6时，可溶性蛋白浓度随着pH的升高而升高；当pH大于6，可溶性蛋白浓度有所下降。
实施例4液料比对方格星虫体壁自溶物的影响
实施例4-1
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-2相同，区别仅在于：加入3mL pH 6.8的McIIvaines缓冲液。
实施例4-2
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-2相同，区别仅在于：加入6mL pH 6.8的McIIvaines缓冲液。
实施例4-3
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-2相同，区别仅在于：加入18mL pH 6.8的McIIvaines缓冲液。
实施例4-4
本实施例的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-2相同，区别仅在于：加入30mLpH 6.8的McIIvaines缓冲液。
分别取实施例4-1～4-4及实施例1-2得到的方格星虫体壁自溶物，室温静置20min，在4℃条件下以10000r/min的转速离心20min，取上清液，采考马斯亮蓝法于595nm处测定其吸光度值，并根据BSA蛋白标准曲线计算可溶性蛋白浓度，并根据体积计算其质量。结果如图4所示：随着液料比的不断升高，方格星虫体壁自溶物中可溶性蛋白浓度呈现先上升而后下降的变化趋势：在液料比从1∶1增加到4∶1时，可溶性蛋白含量迅速增加；当液料比达到4∶1时，底物与酶的接触面积已经达到最大，继续增大料液比时，可溶性蛋白含量变化缓慢，趋势无明显改变(P>0.05)。
实施例5～20
实施例5～20的方格星虫体壁自溶物的制备方法与实施例1-2相同，区别仅在于：McIIvaines缓冲液的用量(液料比)、McIIvaines缓冲溶液的pH、自溶温度不同，具体如表1所示。分别取实施例5～20得到的方格星虫体壁自溶物，室温静置20min，在4℃条件下以10000r/min的转速离心20min，取上清液，采考马斯亮蓝法于595nm处测定其吸光度值，并根据BSA蛋白标准曲线计算可溶性蛋白浓度，并根据体积计算其质量。结果如表1所示：当温度为30～60℃、pH为5～7、液料比为(4～8):1时，得到的方格星虫体壁自溶物中可溶性蛋白含量显著提高。
表1方格星虫体壁自溶物的不同制备条件及结果
| 温度℃ | pH | 液料比 | 可溶性蛋白含量mg | |
| 实施例5 | 30 | 5 | 2 | 18.12 |
| 实施例6 | 50 | 5 | 2 | 19.32 |
| 实施例7 | 30 | 7 | 2 | 26.9 |
| 实施例8 | 50 | 7 | 2 | 28.43 |
| 实施例9 | 30 | 5 | 6 | 34.92 |
| 实施例10 | 50 | 5 | 6 | 36.36 |
| 实施例11 | 30 | 7 | 6 | 44.97 |
| 实施例12 | 50 | 7 | 6 | 50.71 |
| 实施例13 | 23.1821 | 6 | 4 | 25.8 |
| 实施例14 | 56.8179 | 6 | 4 | 41.92 |
| 实施例15 | 40 | 4.31821 | 4 | 20.88 |
| 实施例16 | 40 | 7.68179 | 4 | 47.37 |
| 实施例17 | 40 | 6 | 0.636414 | 14.04 |
| 实施例18 | 40 | 6 | 7.36359 | 40.7 |
| 实施例19 | 40 | 6 | 4 | 52.43 |
| 实施例20 | 45 | 6.5 | 4.5 | 53.31 |
效果实施例
1.方格星虫体壁自溶物色谱分析
采用体积排阻色谱法，利用高效液相色谱仪(LC-20AD，日本岛津公司)对实施例20所制备得到的方格星虫体壁自溶物的分子量进行测定。
样品前处理：将方格星虫体壁自溶物用流动相稀释成1.6mg/mL，得到供试品溶液；用流动相稀释蛋白标准品：细胞色素C(分子量12327Da)、胰岛素(分子量5808Da)、杆菌肽(分子量1423Da)、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸(分子量452Da)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(分子量189Da)，制成1.6mg/mL的溶液，作为对照品溶液。
色谱条件：色谱柱：TSK gel G2000 SWXL 300mm×7.8mm；流动相：水/乙腈/三氟乙酸(80:20:0.1，V/V/V)，柱温：30℃；流速：0.5mL/min：检测波长：220nm；进样量：20μL；检测时间：30min。
通过对各蛋白标准品进行色谱分析，建立了分子量M的对数与洗脱保留时间的回归方程，标准曲线回归方程为lg M＝-0.3448t+6.4433，R2＝0.9985，将方格星虫体壁自溶物的洗脱保留时间带入回归方程，得到方格星虫体壁自溶物中可溶性蛋白的分子量为300Da～3000Da。
2.方格星虫体壁自溶物对小鼠海马神经元HT22细胞活力的影响及平板克隆试验
采用MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)检测实施例20所得到的方格星虫体壁自溶物对小鼠海马神经元HT22细胞活力的影响。将对数生长期的HT22细胞消化、离心后计数，用DMEM完全培养基稀释细胞密度至1×104个/mL，取200uL细胞液加入96孔板中，培养24h后弃掉培养液，加饥饿培养基(含0.5％的胎牛血清)200uL培养12h后弃掉饥饿培养基，然后加入饥饿培养基配置的方格星虫体壁自溶物(方格星虫体壁自溶物终浓度分别为0、5、10、50和100ug/mL)(空白组：不加细胞，加方格星虫体壁自溶物；对照组：加细胞，不加方格星虫体壁自溶物；实验组：加细胞及方格星虫体壁自溶物)。24h后每孔加入20uL MTT(5mg/mL)继续孵育4h。终止培养，拿出96孔板，小心吸去孔内培养液，每孔加入150uL DMSO震荡10min，在酶联反应监测仪上测量490nm处的吸光度。
细胞活力＝(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100％。
结果如图5所示：HT22细胞在方格星虫体壁自溶物处理后，除了5ug/mL实验组的HT22细胞活力升高不明显(P＞0.05)外，其他浓度的方格星虫体壁自溶物均对HT22细胞活力具有明显增强作用(P＜0.05)，由此可知，大于等于10ug/mg的方格星虫体壁自溶物能促进HT22细胞增殖，并且存在浓度依赖性。
选用促进增殖作用较强的50ug/mL的方格星虫体壁自溶物进行平板克隆形成实验：将HT22细胞消化、离心、计数，以2×103个细胞每孔接种于6孔板中，24h后加药(空白组：不加细胞，加终浓度为50ug/mL的方格星虫体壁自溶物；对照组：加细胞，不加方格星虫体壁自溶物；实验组加细胞及终浓度为50ug/mL的方格星虫体壁自溶物)，隔日更换饥饿培养基。培养7天后，终止培养；弃去6孔板中培养基，用PBS浸洗2次。加4％多聚甲醛固定细胞5mL固定15min，向6孔板中加入1％结晶紫染色剂1mL/孔，室温染色20min然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥，体视镜下拍照分析，结果如图6所示：实验组的克隆形成明显高于对照组。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (2)
1.方格星虫体壁自溶物在制备产品中的应用，
所述方格星虫体壁自溶物的制备方法包括以下步骤：将方格星虫体壁与缓冲液混合，自溶，得到方格星虫体壁自溶物；其中，
所述缓冲液的pH为3～8；所述自溶的温度为30～60℃；所述方格星虫体壁通过如下方法得到：将方格星虫洗净后解剖，除去内脏，得到；
所述缓冲液为PBS缓冲液、磷酸缓冲液、盐酸缓冲液、中性蛋白酶溶液和McIlvaine缓冲液中的至少一种；
所述缓冲液与方格星虫体壁的体积质量比为（1～10）：1；
所述自溶的温度为40～60℃；所述自溶的时间为0～8h，不包含0h；
所述方格星虫体壁自溶物包含可溶性蛋白；所述可溶性蛋白的分子量为200Da～10kDa；
所述产品为海马神经元细胞增殖促进剂。
2.一种促进海马神经元细胞增殖的方法，将海马神经元细胞与方格星虫体壁自溶物混合，培养；
所述方格星虫体壁自溶物的制备方法包括以下步骤：将方格星虫体壁与缓冲液混合，自溶，得到方格星虫体壁自溶物；其中，
所述缓冲液的pH为3～8；所述自溶的温度为30～60℃；所述方格星虫体壁通过如下方法得到：将方格星虫洗净后解剖，除去内脏，得到；
所述缓冲液为PBS缓冲液、磷酸缓冲液、盐酸缓冲液、中性蛋白酶溶液和McIlvaine缓冲液中的至少一种；
所述缓冲液与方格星虫体壁的体积质量比为（1～10）：1；
所述自溶的温度为40～60℃；所述自溶的时间为0～8h，不包含0h；
所述方格星虫体壁自溶物包含可溶性蛋白；所述可溶性蛋白的分子量为200Da～10kDa。
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|---|
| 广西沿海裸体方格星虫纤维蛋白溶解酶的研究;雷丹青等;《天然产物研究与开发》;20130715(第07期);897-902 * |
| 蚯蚓蛋白质的自溶与开发应用;蔡明才等;《生物学通报》;20040420(第04期);23-24 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113797231A (zh) | 2021-12-17 |
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