CN107216393A - 大脑内稳态调节蛋白的组成、制备方法及其在防治阿尔茨海默症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，发明了大脑内稳态调节蛋白的组成、制备方法及其在防治阿尔茨海默症和制备抗阿尔茨海默症药物中的应用。该大脑内稳态平衡调节蛋白能穿越血脑屏障，进而有效地调控大脑金属离子内稳态平衡，改善阿尔兹海默症模型鼠的认知和记忆功能，抑制神经细胞凋亡，抑制淀粉样蛋白沉积，阻止老年痴呆症病情发展。因此，该大脑内稳态平衡调节蛋白在抗阿尔茨海默症和制备抗阿尔茨海默症药物方面有重要应用前景。

Description

大脑内稳态调节蛋白的组成、制备方法及其在防治阿尔茨海 默症中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及gH625-Zn₇MT3的创新融合蛋白的化学组成、制备方法，及其在防治阿尔茨海默症和在制备抗阿尔茨海默症等神经退行性疾病药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默症（Alzheimer’s Disease, AD）, 俗称老年痴呆症，是由德国学者Alosi Alzheimer 于 1907 年首次报道。它是一种常发于老年人群中的中枢神经系统原发性退行性疾病。AD 发病率与年龄密切相关，65岁以上人群中发病率以每年0.5%的速度增长，并且女性比男性发病多。目前全球共有约4750万AD 患者，其临床表现为不同程度的记忆力丧失，语言困难，定向力障碍，认知能力降低，人格及行为和感情活动异常，进行性智力障碍，最后全身衰竭，并发感染而亡。目前 AD 已经成为继心脏病、肿瘤和中风之后的第四位死亡原因。AD 最典型的病理特征是：大脑皮层和海马组织内出现大量的老年斑（senileplaques, SP）、神经纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs）、神经元数量减少、颗粒空泡变性和慢性神经炎症。AD 的发病机理十分复杂，可能是多种因素相互作用的结果。迄今为止，其确切的发病机理还是一个未解之谜，但在近三十年的研究证据表明，淀粉样多肽（amyloid-beta peptide, Abeta）、淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）、金属硫蛋白（metallothionein, MT3）及其所参与调节的金属离子和相关的ROS内稳态平衡与 AD 的发生、发展有着密切的联系。

国内外已对AD的神经病理机制进行了大量的研究。70年代中期以来，大量药理学研究集中于提高突触裂隙中的乙酰胆碱水平，发现了一系列乙酰胆碱酯酶的抑制剂类药物。然而，这种治疗仅是缓解症状的治标疗法。80年代中期以来，许多研究围绕Abeta的形成、聚集以及清除机制，或Abeta的神经毒性机制进行。以Abeta为靶标治疗AD病的药物有Abeta前体蛋白APP分泌酶的抑制剂、抗Abeta聚集的金属离子螯合剂和Abeta的抗体等。然而，2008年Lancet报道，Abeta疫苗能有效地清除脑内Abeta斑，但并不能阻止痴呆症状的发展。这一报道对围绕Abeta 斑的治疗研究提出了疑问。这些结果说明，Abeta 斑本身并不是神经细胞毒性的主要根源，可能的机制可能是，Abeta 斑在形成过程中产生的ROS对神经细胞造成毒性。运用同步辐射X-射线荧光分析发现，老年斑中有高浓度的金属离子聚集，如铜、铁、锌离子的含量分别高达1.0、0.4和1.0 mM。大脑中这些过渡金属离子异常高浓度聚集及其相关的蛋白质（如Abeta、tau蛋白等）异常聚集是多种神经退行性疾病的共有特征。因此，金属离子与神经医学高度关联的这一领域受到科学家和神经医学科学家的极大关注。大量研究报道显示：脑神经中某些过渡金属离子（Cu、Fe、Zn）的内稳态失衡是AD病人神经元死亡的主要起因之一；脑中这些过渡金属离子，特别是能够进行单电子氧化还原的Cu和Fe离子的内稳态调节，以及有关的活性氧物种（ROS）水平的调控很可能是治疗AD病的有效策略。

金属硫蛋白-3（metallothionein-3, MT3），在大脑中特异性表达。MT3 由68个氨基酸组成，其中就包括了20个保守的半胱氨酸。它的两个结构域含有两个金属簇，总共能够结合7个二价的金属离子。 N-端 beta-结构域中的 M3S9 和存在于 C-端的 Alpha-结构域的 M4S11。两个结构域之间通过KKS三个氨基酸连接。大脑中MT3大量分布于神经星形细胞，但是在 AD 患者脑中，MT3的表达量明显下降约三分之一。MT3表达的受损可能与AD症状的发生或神经功能损伤有关。MT3还可以将NO信号转化为锌离子信号。NO通过与MT3中结合锌的半胱氨酸直接发生S-亚硝基反应或者与S-亚硝基硫醇发生亚硝基转换反应，将锌离子Zn²⁺从MT3中释放出来。

锌离子是大脑中的信使，大脑具有最高的锌含量，最典型的是在灰质中可达到约150μM。大脑中处于自由离子形式的锌大量富集在许多谷氨酸能神经末端（10-15%）。当锌被释放后进入突触间隙，在突触间隙内离子浓度可上升至毫摩尔数量级。和铜离子一样，释放的锌离子在突触间隙内与神经受体如 NMDA 相互作用，同时也会作用于多种神经元离子通道及转运子来调控神经信号传导。多种锌转运蛋白（ZnTs）以及金属硫蛋白MTs等结合胞质中的锌离子，从而阻止游离的锌离子转变为有毒状态。相比于铜离子，血浆中的锌离子含量从出生后逐步下降，且AD患者的血浆中锌离子含量比同龄正常人有进一步的减少。尽管锌离子总含量与大脑年龄的老化没有关系，然后已知一些特定区域含有高浓度的Z锌离子，如高谷氨酸能支配的海马区，随着年龄的增长表现出Z锌离子含量的降低。现在的多篇文献报道，大脑补锌可能是防治老年痴呆症的有效策略之一。

金属硫蛋白MT3是神经元内部锌的主要来源，近期的研究发现，结合于MT3上的锌离子能够同Abeta-Cu复合物发生金属置换，从而抑制了Abeta还原二价铜离子Cu²⁺所产生的氧化损伤。AD脑中锌离子失衡，可能源自锌离子输出的抑制。小鼠动物研究指出，系统性锌离子的缺失引起了脑中锌离子的滞留，而这种作用是通过抑制胞内锌离子输出蛋白ZnT1所致。

神经突触中，MT3、Abeta 和铜金属离子可能形成一种动态平衡。在 ZnT3 的作用下， Zn²⁺和谷氨酸同时聚集于前突触囊泡中，Zn²⁺在突触间隙中浓度高达0.3 mM，而 NMDA介导的激活使铜离子在突触后释放，转运到突触间隙，随之铜离子在突触间隙的浓度达到毫摩尔级。反过来铜和锌都可以抑制 NMDA 受体的应答反应。Abeta经淀粉样蛋白前体蛋白APP 酶切后释放到突触间隙后可以与间隙内的铜发生反应，然后交联形成可溶性的Abeta聚集体甚至形成淀粉样沉淀。MT3由邻近的星形胶质细胞释放进入突触间隙，可以缓解这一不利反应的发生。神经金属离子、Abeta、MT3在突触间隙形成一个动态平衡，这种平衡可阻止 Abeta 在突触间隙中形成纤维沉淀。适当的神经突触活动可能会促进这一平衡系统，但是过度的或异常的神经活动可能对这一系统有害。调控脑神经内稳态[金属离子-Abeta-MT3]形成有益的平衡可能是治疗老年痴呆症的创新思路，对AD病的调控治疗有重要意义。

维持大脑活性氧物种（ROS）内稳态平衡是大脑正常生理功能的必要条件。大脑消耗人体五分之一的氧，而且抗氧化剂和相关酶的浓度相对较低又富含不饱和脂肪酸，易受氧化损伤。正常情况下，细胞可以通过调节内稳态平衡对抗氧化攻击，但随着年龄增长，细胞保持稳态平衡的能力减低，导致自由基积累，线粒体功能失调，神经元损伤。当ROS的数量超过了神经元细胞对抗的能力时就会发生氧化胁迫，进而导致线粒体机能障碍以及神经元细胞损伤。线粒体中缺乏组蛋白以及线粒体中 DNA修复功能的减弱都是造成线粒体易产生氧化胁迫的原因。铜离子等被认为是AD中氧化胁迫发生的重要因素。在AD病中，氧化损伤的增加不是最终的结果，而是具有起始作用。AD的初期，神经细胞尽管氧化损伤增加，但实际上仍然是处于内稳态平衡的。随着AD病的发展及相应的ROS水平的增加，Abeta-金属化合物和过度磷酸化的tau蛋白将不能有效的被去除，导致淀粉样斑块和神经纤维缠结的不可控地增加，而这又会导致反应活性物质的进一步增多，这种恶化的反馈机制最终造成神经元功能丧失。

因为AD大脑中稳态调控蛋白MT3的表达量下降至少三分之一，补充MT3是防治AD的有效策略之一。但是，MT3 是一个分子量7000的多肽，很难穿过血脑屏障。本发明运用能够穿过细胞膜和血脑屏障的跨膜肽gH625与MT3重组，制备了融合蛋白gH625-MT3，然后经过金属重组而组成gH625-Zn₇MT3。该创新组成的融合金属蛋白能有效通过血脑屏障。以补充阿尔茨海默病大脑中缺少的金属稳态调控蛋白和增加神经营养元素锌为目的，通过生物基因工程和化学合成相结合的复合方法，制备了gH625-Zn₇MT3重组融合金属蛋白。在此基础上，运用阿尔茨海默症转基因小鼠模型，研究了gH625-Zn₇MT3在脑神经中的内稳态调控功能，研究发现，gH625-Zn₇MT3可以改善阿尔兹海默症模型小鼠的认知和记忆能力，抑制神经细胞凋亡，抑制淀粉样蛋白沉积等，能有效阻止老年痴呆症病情发展。因此，gH625-Zn₇MT3在防治老年痴呆等神经退行性疾病方面有重要应用前景。

发明内容

本发明提供了一种能穿越血脑屏障的创新融合金属蛋白gH625-Zn₇MT3及其制备方法。该重组融合金属蛋白gH625-Zn₇MT3是通过基因重组和化学合成相结合的复合方法制备。重组融合金属蛋白gH625-Zn₇MT3由两个多肽（病毒herpes simplex virus 1（单纯疱疹病毒）的糖蛋白中的一段跨膜序列gH625和金属硫蛋白MT3）通过融合构成融合蛋白gH625-MT3，然后经过金属重组而组成gH625-Zn₇MT3。

本发明的目的在于提供了能穿越血脑屏障的创新融合金属蛋白gH625-Zn₇MT3，该创新蛋白具有调节大脑金属内稳态平衡的功能，并能有效提供信使金属离子锌。该发明换提供了创新融合金属蛋白gH625-Zn₇MT3的制备方法，及其在防治阿尔茨海默症和制备抗阿尔茨海默症等神经退行性疾病药物中的应用。本发明实验研究表明，gH625-Zn₇MT3可以抑制神经细胞的凋亡，抑制淀粉样蛋白聚集，改善认知记忆能力，具有明显的抗阿尔茨海默症发展的作用，可用于制备抗阿尔茨海默症药物。

具体实施方式

下面通过实施例，具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。

实施例1：gH625-Zn₇MT3的制备和表征

所有生物化学试剂、试剂盒，除特别说明外，均购自Sigama 或Invitrogen公司。

（1）Smt-MT3质粒构建

人金属硫蛋白MT3和融合标签蛋白基因Smt3购自广州福能基因公司。基因载体质粒MBPHT-mCherry-2购自Invitrogen公司，基因引物合成由上海杰瑞生物技术公司完成，利用设计的引物P1、P2（扩增Smt3基因）和P3、P4（扩增MT3基因）扩增出PCR产物。扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测验证并胶回收正确的片段。产物1和产物2按相同浓度比例混合后作为模板，利用P1和P4引物扩增出Smt3-MT3序列，其5’端带有BamH I酶切位点GGATCC，3’端带有HindIII酶切位点AAGCTT。设计的扩增引物如下：

P1: 5’-CGCGGATCCATGGCTAGCATGTCGGACTC-3’

P2: 5’-GGCAGGTCTCAGGGTCCATACCACCAATCTGTTCTC-3’

P3: 5’-GAGAACAGATTGGTGGTATGGACCCTGAGACCTGCC-3’

P4: 5’-CGCAAGCTTTCACTGGCAGCAGCTGCAC-3’

分别将载体MBPHT-mCherry-2和扩增的Smt3- MT3基因序列用BamH I和Hind III内切酶，在37℃双酶切6小时，用1%琼脂糖凝胶检测验证酶切成功，胶回收酶切片段。酶切的大小片段按1：3混合，用T4连接酶在16℃连接8小时，连接产物转化到Top10 克隆感受态细胞，挑取阳性克隆进行PCR鉴定和测序证明，成功构建了融合蛋白Smt3-MT3表达质粒。

（2）Smt3-gH625-MT3表达质粒构建

以Smt3-MT3质粒为模板，利用TOYOBO突变试剂盒，设计引物（P5、P6）将gH625的基因序列（H2N-HGLASTLTRWAHYNALIRAFGGG-CONH2）插入到MT3序列的N端，引物如下：

P5: 5’-ATTACAACGCACTAATCCGGGCTTTCGGTGGTGGAATGGACCCTGAGACCTGCCC-3’

P6: 5’-GTGCCCATCGAGTCAGCGTTGAAGCGAGTCCTAGACCACCAATCTGTTCTCTGT -3’

具体实验操作如下：

（a）反向PCR

①将引物都稀释为10 pmol/µl，模板质粒DNA浓度调整至50 ng/ul。

②按以下配比配制PCR反应液。

灭菌蒸馏水 35µl

10×Buffer for iPCR 5µl

2 mM dNTPs 5µl

引物1（10 pmol/ul） 1.5µl

引物2（10 pmol/ul） 1.5µl

Plasmid DNA（50ng/ul） 1µl

KOD -Plus- 1µl

Total Volume 50µl

③按以下条件进行PCR。

1 94℃ 2 min

2 98℃ 10 sec

3 68℃ 6 min

4 重复步骤2至10个循环

4℃ Hold

（b）用Dpn I对模板质粒DNA进行消化

① PCR反应结束后，在PCR反应液（总量50 µl）中加入2ul Dpn I，轻轻混匀。

② Spin down，37℃反应1小时。

（c）PCR产物自身环化

①取出T4 Polynucleotide Kinase和Ligation high，冰浴融解。融解后，将Ligationhigh轻轻搅拌均匀，spin down。

②取一个新的PCR管，如下配制反应液：

Dpn I处理后PCR产物 2µl

灭菌蒸馏水 7µl

Ligation high 5µl

T4 Polynucleotide Kinase 1µl

Total Volume 15µl

③轻轻搅拌均匀，spin down。

④ 16℃反应1小时。

⑤取部分反应液转化大肠杆菌，挑取单克隆，测序。

测序成功的质粒其表达的蛋白为Smt3-gH625-MT3融合蛋白，载体是pET22b(+)，抗性为卡那霉素。

（3）Smt3-gH625-MT3 蛋白的生物表达和gH625-MT3 的纯化

将构建成功的Smt3-gH625-MT3质粒转化入宿主菌BL21（DE3）中，挑取单菌落于3ml LB培养基中，37℃下摇床培养8小时后以1：100的比例接入50ml的LB培养基中，在37℃摇床中培养6小时后再以1：100的比例接入2YT培养基中（以上培养基均含有50μg/ml卡那霉素）。37℃ 200rpm摇床培养至OD值为0.6~0.8时，加入IPTG诱导剂至终浓度为0.4mM，于16℃过夜表达。

融合蛋白的纯化过程如下：离心收集的菌体加Tris 缓冲液（20mM Tris-HCl，500mM NaCl，10%甘油，5 mM β-巯基乙醇，PH= 7.5）悬浮（1ml/g菌体），加少量溶菌酶、DNA酶、1% PMSF，搅拌溶菌并用超声破碎机破菌，然后，用高速离心机离心（12000 rpm、离心30min），取上清液穿流已经平衡好的Ni-NTA 亲和柱，使得带有His标签的融合蛋白挂柱。用含20 mM 咪唑的Tris缓冲液洗脱杂蛋白，至考马斯亮蓝检测不变色为止。用含200 mM 咪唑的Tris缓冲液洗脱融合蛋白。洗脱的融合蛋白装入透析袋中透析，透析液为Tris 缓冲液，之后按1%的比例加入SUMO酶酶切6小时，酶切产物穿流已经平衡好的Ni-NTA 柱，共穿流三次除去标签蛋白及SUMO酶，再用Superdex-G75凝胶分子筛进一步除去杂蛋白，纯化得到的gH625-MT3蛋白经15% SDS－PAGE胶检测纯度达95%以上。

（4）gH625-Zn₇MT3的制备

取2ml gH625-MT3融合蛋白溶液（5mg/ml），加入DTT至终浓度为5 mM，4℃还原2小时。加入6M的HCI溶液调节pH至l-2，酸化l小时后，过Superdex G-25柱除去杂金属离子，用 pH2.0的HCI溶液洗脱gH625-MT3蛋白。流出液用紫外光谱仪检测，收集。脱金属的gH625-MT3蛋白溶液脱气后立即载入厌氧手套箱中，加入DTT至终浓度为5 mM，加20倍于蛋白浓度的ZnCl₂，慢慢滴加2M的Tris碱调节pH至8-9，室温下放置过夜，然后透析去除过剩的锌离子，蛋白浓缩后得到融合金属蛋白gH625-Zn₇MT3。

（5）gH625-Zn₇MT3的金属含量测定

取一定量的重组好的融合蛋白gH625-Zn₇MT3，加少量浓硝酸于65℃硝化过夜，稀释10倍后在电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）上测定金属Zn的含量。结果显示重组后每摩尔gH625-Zn₇MT3融合蛋白含有的Zn为7±0.2摩尔。

（6）gH625-Zn₇MT3内毒素的去除

gH625-Zn₇MT3先用超滤膜截留聚集态的内毒素（LPS），再用Polymyxin B 亲和柱除去残留的内毒素。

实施例2：阿尔茨海默症模型小鼠及gH625-Zn₇MT3药物治疗

APP/PS1 转基因小鼠购自北京中科泽晟生物技术有限公司， 5月龄，体重24-26g。受试药物名称：gH625-Zn₇MT3；溶媒：生理盐水；配制方法：临用前用生理盐水溶液配制成所需浓度的溶液。小鼠腹腔给药：实验动物为APP/PS1二转基因小鼠。给药剂量为2mg/kg/天，给药6周后取血清和脑组织。

实施例3：用Morris水迷宫验证阿尔茨海默症小鼠认知能力

装置:圆形水池，直径1m，高50 cm，水深30 cm，池底白色，水温保持在23±2℃；池壁上标记四个等距离点N、E、S、W作为试验的起始点，水池分为四个象限，在第三象限中央放置平台(平台与池壁圆心距离相等)；没于水下1 cm，使平台不可见。水池周围贴有丰富的参照线索(不同颜色三角形、四方形、圆、菱形置于各个象限) 且保持不变，供小鼠用来定位平台。

定位航行试验: 试验共历时6天，每天定于固定时间段训练4次。训练开始时，将平台置于第一象限，从池壁四个起始点的任一点将小鼠面向池壁放入水池。自由录像记录系统记录小鼠找到平台的时间和游泳路径，4次训练即将小鼠分别从四个不同的起始点（不同象限）放入水中。小鼠找到平台后或90秒内找不到平台(潜伏期记为90秒)，则由实验者将其引导到平台，在平台上休息10秒，再进行下一次试验。

空间探索试验：定位航行试验结束24h后，撤除站台。然后把小鼠由第三象限放入水中，记录鼠在180s内的游泳路径，记录鼠在目标象限（第三象限）的停留时间和穿越原站台所在位置的次数，观察受试鼠的空间定位能力。数据用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）检验比较给药效果的显著性。

结果表明：经gH625-Zn₇MT3治疗的阿尔茨海默症小鼠具有认知能力明显改善的现象。相比对照组，给药组AD鼠在第三象限停留时间和穿越原站台所在位置的平均次数几率有明显提高（从50%提高到了78%），说明gH625-Zn₇MT3能有效地阻止阿尔茨海默症小鼠病情发展。

实施例4：gH625-Zn₇MT3对阿尔茨海默症小鼠脑神经细胞的调控

AD鼠给药（gH625-Zn₇MT3）6周后，取小鼠脑组织，在4％多聚甲醛中固定、脱水、石蜡包埋，在切片机上切成4微米厚的组织切片，然后用苏木精和曙红（HE）染，在光学显微镜（Leica, Germany）下观察海马体CA1区的细胞形态。实验结果如图1所示（A：为正常鼠对照组，B：为AD鼠模型组，C：为AD鼠模型给药组）。AD模型鼠脑组织CA1区的细胞变形皱缩，观察不到染色质及核糖体，给药gH625-Zn₇MT3后细胞形态趋于正常。使用gH625-Zn₇MT3后，能够抑制小鼠大脑神经细胞的退化变性，调控神经细胞恢复正常功能。

实施例5：gH625-Zn₇MT3抑制阿尔茨海默症小鼠脑淀粉样蛋白聚集

本实验为硫黄素S染色实验，实验流程为：AD鼠给药（gH625-Zn₇MT3）6周后，取小鼠脑组织，固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，TBS洗三次，0.3% 硫黄素S（溶于50%乙醇）滴于组织上，室温孵育10min，50%乙醇洗三次，TBS清洗，阴干，封片，激光共聚焦显微镜下观察。实验结果如附图2所示。硫磺素S本身自带绿色荧光，能特异性的与成熟的Abeta淀粉样蛋白结合，用于标记脑组织中淀粉样蛋白的含量和分布，评价阿尔兹海默症的病理状况。实验结果如图2所示（A为对照组，B为AD鼠模型组，C为AD鼠模型给药组）。给药后Abeta淀粉样蛋白较模型组有明显减少。gH625-Zn₇MT3能够显著降低AD鼠脑内Abeta 蛋白的沉积。

实施例6：gH625-Zn₇MT3抑制阿尔茨海默症小鼠脑神经细胞凋亡

TUNEL凋亡试剂盒（G3250试剂盒）购自Promega公司。小鼠给药6周后，取小鼠脑组织，固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，PBS洗涤，蛋白酶K室温孵育10min，切片PBS洗涤后甲醛固定，加入平衡缓冲液预平衡后洗涤，之后加入孵育缓冲液（内含平衡缓冲液，核苷混合物和rTdT酶），37℃避光孵育1h，终止反应后共染DAPI，阴干，封片，激光显微镜拍照。实验结果如图3所示（A为对照组，B为AD鼠模型组，C为AD鼠模型给药组），结果表明：gH625-Zn7MT3能够抑制小鼠大脑神经细胞的凋亡。

附图说明

图1.gH625-Zn₇MT3对阿尔茨海默症鼠脑组织海马体CA1区细胞形态的调控作用（A为对照组，B为AD鼠模型组，C为AD模型鼠给药六周）。

图2. gH625-Zn₇MT3抑制AD鼠脑内Abeta蛋白的沉积

图3、gH625-Zn₇MT3对阿尔茨海默症鼠脑内神经细胞凋亡的影响（A为对照组，B为AD鼠模型组，C为AD模型鼠给药六周）。

gH625-MT3 融合蛋白氨基酸序列（1-91）：

HGLASTLTRW AHYNALIRAF GGGMDPETCP CPSGGSCTCA

DSCKCEGCKC TSCKKSCCSC CPAECEKCAK DCVCKGGEAA

EAEAEKSSCC Q

Claims (9)

1.大脑金属内稳态调节蛋白的结构组成，即重组融合金属蛋白gH625-Zn₇MT3的氨基酸序列和化学结构组成.

其特征在于，该重组融合金属蛋白gH625-Zn₇MT3由两个多肽（gH625和MT3）通过融合构成融合蛋白gH625-MT3，然后经过金属重组而组成gH625-Zn₇MT3 ,gH625是单纯疱疹病毒的糖蛋白中的一段跨膜序列，含有23个氨基酸残基；MT3是金属硫蛋白III，含有68个氨基酸残基,经过化学重组构成融合蛋白gH625-Zn₇MT3。

2.大脑金属内稳态调节蛋白gH625-Zn7MT3的制备方法.

该制备方法是通过基因工程技术，运用载体pET22b(+)，构建含有融合标签的Smt3-MT3基因表达质粒，再利用TOYOBO突变试剂盒，设计引物将gH625的基因序列插入到Smt3-MT3基因，组成smt3-gH625-MT3融合蛋白基因,在大肠杆菌中使smt3-gH625-MT3重组融合蛋白可溶表达，分离纯化获得gH625-MT3重组融合蛋白, 进而通过化学重组，使其结合金属锌离子，制备gH625-Zn₇MT3。

3.gH625-Zn₇MT3在抗阿尔茨海默症中的应用。

4.gH625-Zn₇MT3在制备抗阿尔茨海默症药物中的应用。

5.gH625-Zn₇MT3在制备抗神经退行性疾病药物中的应用。

6.gH625-Zn₇MT3与其它药物联合用药，用于制备抗阿尔茨海默症或神经退行性疾病的药物。

7.根据权利要求3-6所述gH625-Zn₇MT3在抗阿尔茨海默症中的应用，其特征在于：改善AD脑认知功能障碍，调控大脑金属离子内稳态平衡, 抑制AD脑内淀粉样蛋白沉积, 抑制脑内神经细胞凋亡。

8.根据权利要求3-6所述的gH625-Zn₇MT3按常规药剂学制成各种药物剂型，所述的剂型包括但不局限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取口服或注射（包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射、或脑室直接给药等）中的一种或多种给药途径进行抗阿尔茨海默症及其直接相关的神经退行性疾病的预防或治疗。

9.基于金属硫蛋白MT3或Zn₇MT3融合跨膜小肽标签的其它类似融合蛋白，及其在抗阿尔茨海默症及其直接相关的神经退行性疾病的预防或治疗。