CN107875397A

CN107875397A - 锌离子特异性结合肽及其组合物在预防或治疗阿尔茨海默症中的应用

Info

Publication number: CN107875397A
Application number: CN201711374373.5A
Authority: CN
Inventors: 张晓雨; 高慧玲; 钟曼丽; 王占友
Original assignee: Northeastern University China
Current assignee: Northeastern University China
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2018-04-06
Anticipated expiration: 2037-12-19
Also published as: CN107875397B

Abstract

本发明提供一种锌离子特异性结合肽及其组合物在预防或治疗阿尔茨海默症中的应用，所述锌离子特异性结合肽的氨基酸序列为：His‑Met‑Gln‑Thr‑Asn‑His‑His，如SEQ ID NO：1所示。经过ELISA测试结果和免疫荧光测试、阿尔茨海默症小鼠活体实验等结果，表示本发明的锌离子特异性结合肽，对锌离子的亲和性高，特异性良好，毒副作用小，并能够通过结合过多的游离锌离子而减少老年斑的形成，因此对预防或治疗阿尔茨海默症有一定的疗效。

Description

锌离子特异性结合肽及其组合物在预防或治疗阿尔茨海默症中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种锌离子特异性结合肽，具体涉及一种锌离子特异性结合肽及其组合物在预防或治疗阿尔茨海默症中的应用。

背景技术

阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）的发病率逐年攀升，已经成为严重威胁老年人生命健康和生活质量的主要疾病之一。此外还逐步呈现年轻化趋势，给患者及家属的生活质量带来很大影响，同时也给社会带来很大压力。AD的治疗已成为亟待解决的重要问题。

在过去的20多年中，淀粉样蛋白假说一直是AD研究的焦点。AD治疗除了使用神经保护剂外，大多数药物研发集中于非正常折叠蛋白的清除。然而，1998~2011年间，大约100种基于此策略的AD药物研发是失败的。这促使人们不得不重新审视AD病理机制和新药物发现的策略。其中，许多新机制的发现也给予了生物无机化学研究者发现AD病理中金属离子的角色和金属药物应用的新契机。

锌是体内重要的金属元素，参与了广泛的生理和病理生理过程。锌不仅是超过300种酶和转录因子的重要组成部分，而且是一种重要的信号分子。在AD的进展中，锌也起到非常重要的作用。目前的研究表明，Aβ沉积形成老年斑是诱发 AD 的主要原因之一，是 AD 形成和发展的重要因素，而Aβ沉积与金属离子尤其是锌离子有着密切的关系。在生理条件下，锌离子能够快速聚集Aβ，Aβ蛋白以6~28位残基与Zn²⁺结合，诱导Aβ聚集并形成不溶物。Zn²⁺与Aβ的键合可掩蔽水解位点，抑制Aβ的降解。金属鳌合剂可在一定程度上缓解AD症状，但同时也存在普遍会干扰有益的体内金属离子正常代谢的问题。在AD治疗中，金属药物可能在以下方面发挥作用：(1)通过配体和微量元素补充调节金属内稳态；(2)AD早期诊断探针；(3)BBB和神经保护金属药物。但这些金属药物在发挥药效的同时，普遍存在亲和性和选择性低下、毒副作用大、无法透过血脑屏障等问题。

目前用于预防或治疗阿尔茨海默症的典型化合物有姜黄素、没食子儿茶素没食子酸酯和硫辛酸等。这些药物通过直接与铜、铁、锌等金属离子鳌合，来调节过载的游离态金属离子，使其保持在固定的正常水平，从而缓解AD病情。但如上文所述，普遍存在毒副作用大、无法透过血脑屏障等问题。因此，开发出毒性较低，能透过血脑屏障，并具有合适的亲和性和选择性的新型药物对AD的理论研究和临床治疗均具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种锌离子特异性结合肽及其组合物在预防或治疗阿尔茨海默症中的应用，该锌离子特异性结合肽特异性高并具有良好的生物相容性，能够通过结合过多的游离锌离子而有效减少老年斑的形成，对治疗阿尔茨海默症有一定疗效。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种锌离子特异性结合肽，其氨基酸序列为：

His-Met-Gln-Thr-Asn-His-His（SEQ ID NO：1，命名为P-Zn）。

第二个方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括上述锌离子特异性结合肽和可药用载体。

上述锌离子特异性结合肽可与锌离子特异性结合且结合强度高，具有良好的生物相容性，能较快地通过血脑屏障，并有效减少老年斑的形成，因此，可以用于阿尔茨海默症的预防或治疗。

故在本发明的第三个方面，提供了上述锌离子特异性结合肽在用于预防或治疗阿尔茨海默症中的用途。

第四个方面，提供了上述药物组合物在用于预防或治疗阿尔茨海默症中的用途。

第五个方面，本发明提供一种预防或治疗阿尔茨海默症的方法，所述方法包括向有需要的个体给予有效量的锌离子特异性结合肽或者给予有效量的包括所述锌离子特异性结合肽和可药用载体的药物组合物。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：本发明的锌离子特异性结合肽，对锌离子的亲和性高，特异性良好，毒副作用小，并能够通过结合过多的游离锌离子而减少老年斑的形成，因此对预防或治疗阿尔茨海默症有一定的疗效。

附图说明

图1为本发明实施例的锌离子特异性结合肽（P-Zn）的筛选流程，共进行一轮预筛选和四轮亲和性筛选。

图2为本发明实施例的锌离子特异性结合肽的细胞毒性检测结果，其中图2-a为不同浓度P-Zn在不同时间对N2a Sw细胞活性的影响情况；图2-b为N2a Sw细胞活性随共同加入的不同浓度P-Zn、Zn²⁺的变化曲线。

图3为通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测本发明实施例的锌离子特异性结合肽在N2a Sw细胞中的浓度结果，其中图3-a为通过ICP-MS检测细胞内金属离子的过程示意图；图3-b为本发明实施例中三个实验组（对照组、锌离子组和锌离子特异性结合肽组）的细胞内锌离子含量示意图。

图4为本发明实施例中三个实验组（对照组、锌离子组和锌离子特异性结合肽组）Aβ的ELISA测试结果和免疫荧光测试结果，其中图4-a为Aβ的ELISA测试结果；4-b为Aβ的免疫荧光测试结果。

图5为本发明实施例中小动物活体成像图，图5-a为鼻饲给药方式下，标记FITC的P-Zn不同时间在小鼠体内的分布情况；图5-b为24 h后小鼠主要器官内药物的分布情况。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

第一个方面，本发明具体实施例中提供了具有下述氨基酸序列的锌离子特异性结合肽：

His-Met-Gln-Thr-Asn-His-His。

故第二个方面，本发明具体实施例提供了上述锌离子特异性结合肽在用于预防或治疗阿尔茨海默症中的用途。

所述的“预防”是指减少个体患上病症的风险或者延迟患者患病或者症状出现的时间。所述的“治疗”是指减轻或者缓解疾病的症状和/或减少了导致疾病症状的一种或多种潜在的细胞、生理或生物化学病因或机理。

第三个方面，本发明具体实施例提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述锌离子特异性结合肽和可药用载体。

所述的“可药用载体”是指在生物学上或其他方面不会具有不良作用的物质，并且将该物质与本发明的锌离子特异性结合肽一同给予受体时，不会引起任何不良的生物学反应或以有害的方式与所述药物组合物的任何其他成分相互作用。合适的载体包括但不限于：抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填充剂、增粘剂、缓冲剂、赋形剂等。比如，载体可选用壳聚糖温敏凝胶，采用壳聚糖与甘油磷酸钠体系作为P-Zn的载药系统，利用载药系统的室温时呈溶液状态，而体温时则形成凝胶的特点，以达到鼻腔给药后，凝胶粘附于鼻腔内的目的，从而达到提高药物疗效、更好的降低药物毒副作用的效果。

本发明具体实施例的药物组合物还可以包括用于调节所述锌离子特异性结合肽释放速率的载体，比如缓释载体。而这类缓释载体是本领域技术人员所熟知的。

本发明具体实施例的药物组合物的成品形式可以为溶液、混悬液、凝胶、乳剂、固体剂。这些制剂可以以即用形式、用前即配的冻干粉形式或用前稀释的液体形式储存。优选地，本发明具体实施例的药物组合物的成品形式为溶液，储存方式为用前即配的冻干粉形式。

第四个方面，本发明具体实施例提供了上述药物组合物在用于预防或治疗阿尔茨海默症中的用途。

第五个方面，本发明具体实施例提供一种预防或治疗阿尔茨海默症的方法，所述方法包括向有需要的个体给予有效量的锌离子特异性结合肽或者给予有效量的包括所述锌离子特异性结合肽的药物组合物。

所述“有效量”是指所使用的药物量足以改善某些相关症状的剂量，也即为给定病症和给药方案提供防止疾病发病或症状出现，或盖上疾病或病症的一种或多种病因或症状的剂量。例如，在阿尔茨海默症中，预防、减少、延缓、抑制或阻滞任何症状的药物或物质应当是治疗有效的。有效量的药物或物质不需要治愈症状，但将为症状提供质量，使得个体的发作被预防、延缓或阻止，或者症状得以缓解，或者症状的期限被改变，或者例如症状变得不严重，或者加速康复。对于本发明的锌离子特异性结合肽或者包括所述锌离子特异性结合肽的药物组合物而言，所述有效量也应当根据个体的年龄、体重以及身体状况等而变化。针对具体的个体，确定用以预防或治疗有效量是本领域技术人员能力所及。

下面就本发明所用到的有关实验方法，具体阐述如下：

1、本发明的锌离子特异性结合肽的制备方法

其制备方法包括以下步骤：

（1）Ni-NTA树脂的去Ni²⁺处理：

吸取1mLNi-NTA树脂于15mL离心管中，用1mL0.1%的TBST洗涤树脂2次；加入1mL浓度为0.5mol/L的EDTA（pH=8.0），洗涤至树脂由蓝色变为无色为止；最后用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（pH=4.4）洗涤3次，按照此步骤制得的脱镍NTA树脂称为M^-树脂；

M^-树脂的金属负载：在M^-树脂中加入5mLZn²⁺溶液处理过夜后，TBS洗涤6次，计量树脂体积，加入等体积的TBS悬浮树脂充分混匀，4℃保存待用；

（2）噬菌体随机七肽库筛选P-Zn

按照如图1所示的筛选流程，先进行预筛选：将肽库试剂盒中的噬菌体液100µL溶于900µL TBS中，加入到100µL（沉降体积）的M^-树脂中，于25℃、100rpm震荡25min，之后静置，收集上清液，取10µL进行滴度测定，剩余液体用于噬菌体扩增，用于下一步亲和性筛选；

P-Zn的亲和性筛选：亲和筛选共循环四轮

将上一步扩增所得的100µL噬菌体菌液，滴度大约为10¹²pfu/mL溶于900µLTBS中，加入100µL （沉降体积）负载金属Zn(II)的树脂，于25℃、100rpm震荡25min，之后静置，弃上清液；接着用1mL TBS洗涤树脂两次，去除未牢固结合部分，最后加入1mL浓度为0.5M的EDTA洗脱液，于25℃、200rpm震荡10min，收集洗脱液；洗脱液于100KD超滤离心管中，于4℃、5000rpm、15min离心除去金属离子Zn(II)，截留下来的噬菌体用移液器小心吹打（注意对超滤膜死角处的吹打以保证噬菌体回收完全），并溶于600µLTBS中，随后进行滴度测定，并将其扩增至所需滴度，进行下两轮相同条件下的筛选；

经过三轮的筛选后，在第四轮筛选之前，为加大筛选力度，提高Zn(II)结合肽对Zn(II)的亲和能力，实验减少了树脂上Zn(II)的负载量。在树脂与噬菌体作用之前，先用柠檬酸-柠檬酸钠(pH3.5)缓冲溶液冲洗负载Zn(II)的树脂，以降低Zn(II)的负载量，随后，用TBS缓冲溶液重新平衡树脂，之后再开始进行第四轮筛选；

（3）噬菌体单克隆的提取

将筛选得到的噬菌体洗脱液用LB液体培养基做10倍系列稀释，取适当稀释度的噬菌体菌液10µL，加入到190µLER2738对数生长期的菌液中，均匀混合，放置10min，吸取上述混合液，加入到融化并冷却至45~50℃的3mL顶层琼脂培养基中，充分摇匀后，倾注于事先准备好的LB/X-gal/IPTG固体培养基的平板上，于37℃培养过夜；从总量不到100个噬菌斑的平板上，挑取20个分隔良好的蓝色噬菌斑到1mL ER2738对数生长期的菌液中，于37℃、250rpm摇床培养4.5~5h；将培养物转入离心管中，离心1min，上清转入一新鲜管中，再离心，用移液器将80%的上清转入新鲜离心管，此即为扩增噬菌体贮液；之后用M13噬菌体单链DNA快速提取试剂盒提取制备噬菌体单克隆；

（4）测序和解析

对DNA样品进行序列测定，测序引物为-96gIII；

（5）酶联免疫分析法(ELISA)检测P-Zn的亲和能力

在扩增噬菌斑进行DNA测序的同时，将剩余的含噬菌斑的上清液于4℃保存；随后对其进行滴度测定，过程如下：

将所选的噬菌体滴度全部调整为1.2×10¹¹pfu/mL，取100µL噬菌体悬浮液溶于1mLTBS中，加到200µL（沉降体积）含Zn(II) （浓度为10µM）的树脂中，于25℃、150rpm结合1h，接着用1mLTBS洗涤3次，加入1mLHRP标记的抗M13抗体（1:5000稀释于TBST中），于25℃、150rpm结合1h，接着用1mL含0.5%Tween20的TBS洗涤3次，最后加入400µLHRP底物溶液，于25℃、150rpm结合1h，用酶标仪检测405nm处的吸光度值，并根据ELISA法所得结果，确定所需的噬菌体单克隆及其所对应的氨基酸序列为：His-Met-Gln-Thr-Asn-His-His。

2、P-Zn细胞毒性测试实验，实验过程如下：

(1) 用胰蛋白酶将N2a Sw细胞消化后稀释到合适浓度；将稀释后的细胞加到干净的血球计数板上，在显微镜下进行计数。

(2) 将细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔20000个/100 μL，留一列只含培养基作为空白孔，置于5% CO₂培养箱中37°C恒温培养。

(3) 细胞完全贴壁后用无血清的DMEM培养基饥饿培养5h。

(4) 吸净无血清培养基，a组依次加入含0μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM、500μM P-Zn的无血清培养基，每个浓度4孔，置于5% CO₂培养箱中37°C恒温培养0h、6h、12h、24h；b组依次加入0μM、50μM、70μM、90μM、100μM、110μM Zn(II)，同时每个孔都同时给入100μM P-Zn的无血清培养基，每个浓度4孔，置于5% CO₂培养箱中37°C恒温培养12 h。

(5) 将a组和b组的培养基吸净后，加入新的无血清培养基，每孔100μL，再每孔加入20μL MTT检测溶液，置于培养箱中孵育1 h。

(6) 采用酶标仪检测两组的吸光值，波长为490 nm，并绘制不同浓度P-Zn在不同时间对N2a Sw细胞活性的影响曲线和N2a Sw细胞活性随共同加入的不同浓度P-Zn、Zn²⁺的变化曲线。

图2-a为所得P-Zn细胞毒性测试实验，我们检测了不同浓度P-Zn在不同时间对N2aSw细胞活性的影响，实验结果表明，P-Zn在一定浓度范围内对细胞是没有显著性毒性的，并且可以不同程度的促进细胞增殖；图2-b显示，在细胞单独外加不同浓度锌离子时，细胞活性随着锌离子浓度的增加而降低，但当同时给予细胞100µM P-Zn时，细胞的活性始终可以保持在正常范围内，这说明P-Zn可以通过结合锌离子而降低其引起的细胞毒性。

3、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测细胞内金属离子含量，实验过程如下：

细胞给药处理

(1) N2a Sw细胞接种于6 cm细胞培养皿中，分为对照组（Ctrl组）、锌离子组（Zn组）和锌离子特异性结合肽组（PZn+ Zn组），细胞密度为40%左右，轻轻摇匀后置于5% CO₂培养箱中37°C恒温培养；

(2) 细胞完全贴壁后，用无血清培养基饥饿培养5h；

(3) 吸去无血清培养基，对照组加入3mL不作处理的无血清培养基，Zn(II)组培养皿中加入等量的含100μM Zn(II)的无血清培养基培养12h，Zn(II) +P-Zn组加入等量的含100μMZn(II) +P-Zn的无血清培养基培养12h。

细胞样品的处理及其所含金属离子含量的测定：

测定细胞中的金属离子，需要对细胞样品进行消解，在细胞样品进行细胞计数后，将细胞悬浮于 10mL 的尖头离心管中，离心，弃上清，加入消解液进行消解，待彻底消解后，将样品稀释一定倍数，用 ICP-MS 测定稀释液中所含金属离子的含量。图3-a为电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)检测细胞内金属离子的示意图；图3-b显示，与对照组相比，当给入锌离子100μM时,细胞内金锌离子含量明显升高，当同时给入100μM P-Zn时，P-Zn可以显著性降低细胞内锌离子的含量。

4、细胞Aβ分泌检测，实验过程如下：

酶连免疫吸附实验 (ELISA)

本实验所用的ELISA试剂盒含有两种抗体：BAN50和BC05。BAN50作为96孔板内的捕获抗体其抗原表位是人源的Aβ (1-16)，能够特异性地结合人源的Aβ (1-42) 的N末端，HRP标记的BC05进一步特异性地识别并结合Aβ (1-42)的C末端。在HRP的催化下，TMB显色为蓝色，加入反应终止液后，体系变为黄色，最后在450 nm波长下测定吸光值。具体步骤如下：

(1) 将4°C冰箱内的96孔板取出，用铝箔纸包裹严密后，置于室温中直至其温度达到室温。

(2) 将浓度为20、10、5、2、1、0.5、0.1 (pmol/L) 标准溶液分别加入空白孔中，每个浓度一个复孔，每孔100 μL。同时将Ctrl组、Zn(II)组和Zn(II) +P-Zn组三组的细胞培养基加入96孔板中，每组三皿重复，每皿两个复孔，每孔100 μL。

(3) 将96孔板密封置于4℃冰箱过夜孵育。

(4) 次日，负压吸去孔内溶液，清洗液清洗5min。

(5) 加入HRP标记的BC05抗体溶液，每孔100μL，将96孔板密封置于4°C冰箱1h。

(6) 负压吸去BC05抗体溶液，清洗液清洗5min。

(7) 迅速加入TMB显色液，每孔100μL，置于室温避光敷育30min。

(8) 每孔加入100μL终止液终止反应，30min内在450nm波长下测定吸光值。

(9) 根据吸光值制作标准曲线，计算Aβ (1-42) 的浓度。

免疫荧光染色

(1) 将灭菌处理后的圆形盖玻片置于24孔板中，每孔滴加约50μL 0.5mg/mL的多聚赖氨酸覆盖盖玻片，将24孔板置于5% CO₂培养箱中37°C包被1h。

(2) 吸净多聚赖氨酸，用灭菌的0.0.1M PBS溶液清洗2-3次。将N2a Sw细胞接种于盖玻片上，置于5% CO₂培养箱中37°C恒温培养。

(3) 细胞给药处理后，将24孔板中的培养基吸净，并用0.0.1M PBS溶液清洗5min。

(4) 向每孔加入500μL 4%的多聚甲醛，固定30min。用0.0.1M PBS溶液清洗2次，每次5 min。

(5) 向每孔加入500μL封闭液，室温静置1h。

(6) 将盖玻片用针头和镊子轻轻夹出，置于湿盒内，并标明分组。

(7) 向盖玻片上滴加相应的抗体，尽量覆盖整个盖玻片，置于4°C过夜孵育。

(8) 次日，用0.01M PBS溶液清洗3次，每次5min。加入荧光二抗，室温避光敷育1h。

(9) 用0.01M PBS溶液避光清洗3次，每次5min。加入DAPI染液，室温避光反应5min。

(10) 用0.01M PBS溶液避光清洗1次后进行封片，4°C避光静置2天。

(11) 激光共聚焦扫描显微镜下观察并采集图像进行分析。

图4-a为Aβ的ELISA测试结果，4-b为Aβ的免疫荧光测试结果，从a,b图中均可以看出，与对照组相比，当给入锌离子100 μM时,细胞分泌的Aβ明显升高，当同时给入100μM P-Zn时，P-Zn可以显著性降低细胞分泌的Aβ。Aβ沉积形成老年斑是诱发 AD 的主要原因之一，锌离子能够快速聚集Aβ，诱导Aβ聚集并形成不溶物，而加入P-Zn后，细胞分泌的Aβ显著性降低，说明P-Zn给药后能够有效减少老年斑，提示P-Zn对预防或者治疗阿尔茨海默症方面有一定的疗效。

5、阿尔茨海默症小鼠活体实验

标记FITC的P-Zn鼻饲给予裸鼠后30min、120min、24h，水合氯醛麻醉，利用小动物活体成像仪对实验动物进行观察并拍照，比较不同时间P-Zn的体内活体分布特性。在给入上述制剂后将裸鼠处死，生理盐水心脏灌流至肝脏呈黄色，取出主要脏器，利用小动物活体成像仪对不同脏器的荧光图像进行定性分析，比较P-Zn在裸鼠体内各脏器中的分布特性。

图5为本发明实施例中小动物活体成像图，图5-a我们通过鼻饲的给药方式检测了标记FITC的P-Zn不同时间在小鼠体内的分布情况，图5-b为24 h后小鼠主要器官内药物的分布情况，从同中可以看出P-Zn能够顺利进入小鼠脑内，并可以通过肝、肾将药物代谢。

综上，本发明具体实施例制备的锌离子特异性结合肽，对锌离子的亲和性高，特异性良好，毒副作用小，并能够通过结合过多的游离锌离子而减少老年斑的形成，因此对预防或治疗阿尔茨海默症有一定的疗效。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 东北大学

<120> 锌离子特异性结合肽及其组合物在预防或治疗阿尔茨海默症中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> "人工序列"()

<400> 1

His Met Gln Thr Asn His His

1 5

Claims

1.一种锌离子特异性结合肽，其特征在于，其氨基酸序列为：

His-Met-Gln-Thr-Asn-His-His，如SEQ ID NO：1所示。

2.一种锌离子特异性结合肽在用于预防或治疗阿尔茨海默症中的用途，其特征在于，所述锌离子特异性结合肽的氨基酸序列为：His-Met-Gln-Thr-Asn-His-His，如SEQ ID NO：1所示。

3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括锌离子特异性结合肽和可药用载体，所述锌离子特异性结合肽的氨基酸序列为：His-Met-Gln-Thr-Asn-His-His，如SEQID NO：1所示。

4.一种药物组合物在用于预防或治疗阿尔茨海默症中的用途，其特征在于，所述药物组合物包括锌离子特异性结合肽和可药用载体，所述锌离子特异性结合肽的氨基酸序列为：His-Met-Gln-Thr-Asn-His-His，如SEQ ID NO：1所示。

5.一种预防或治疗阿尔茨海默症的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的个体给予有效量的锌离子特异性结合肽或者给予有效量的包括所述锌离子特异性结合肽和可药用载体的药物组合物，其中所述锌离子特异性结合肽的氨基酸序列为：His-Met-Gln-Thr-Asn-His-His，如SEQ ID NO：1所示。