CN103788178A - 一种短肽抑制剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种短肽抑制剂及其用途。所述短肽抑制剂的序列中包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。本发明的短肽抑制剂与β-淀粉样多肽的结合能力较强、自身细胞毒性较低且其溶解性好，能够降低β-淀粉样多肽对神经细胞的毒害作用。因此本发明的短肽抑制剂能够用于抑制β-淀粉样多肽聚集和/或对细胞毒害作用，以及用于治疗和/或预防与β-淀粉样多肽有关的疾病。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种短肽抑制剂，尤其涉及一种抑制β-淀粉样多肽聚集的短肽抑制剂及其用途。
背景技术
淀粉样多肽的错误折叠和异常聚集与许多退行性疾病的发病有着密切的关系，如阿尔茨海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏症、前额颞退行病变、脊索侧索硬化症、II型糖尿病、牛海绵状脑病、克罗伊茨费尔特-雅各布氏病等多种疾病。其中，阿尔茨海默症（Alzheimer's disease，AD）发病率最高。据中国阿尔茨海默病协会2011年的公布调查结果显示，全球有约3650万人患有痴呆症，平均生存期只有5.9年，是威胁老人健康的“四大杀手”之一。在中国65岁以上的老人患病率为6.6%，而在85岁以上的老人中的发病率高达30%以上。作为全球人口第一大国和老龄化社会的现状，退行性疾病造成严重的社会和家庭负担，成为我国必须面对的重大社会问题。AD是以进行性记忆力减退和认知功能障碍为主要特征的老年期常见神经系统变性疾病。在众多的AD致病学说中，淀粉样蛋白级联假说一直占有AD发病机制的主要地位。该假说认为：脑内淀粉样蛋白前体（amyloid protein precursor，APP）的异常代谢使得β-淀粉样多肽（beta-amyloid，Aβ）产量增多、降解减少，引起Aβ的大量聚积。过量的Aβ聚积会形成寡聚体、原纤维和纤维等聚集体，进而形成淀粉样斑块，产生神经细胞毒性（可参考Roberson,E.D.等人Science2006,314,781;Spillantini,M.G.等人Science2006,314,777;Klein,W.L.等人,Neurochemistry International2002,41,345;Lambert,M.P.;Klein,W.L.等人,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America1998,95,6448.;Selkoe,D.J.,Nature2003,426,900.）。
以Aβ为靶点的AD治疗药物成为临床研究的主要方向之一。目前，针对Aβ的治疗方法主要有抑制Aβ生成和抑制Aβ聚集等方法。而治疗方式主要有通过加入（1）小分子抑制剂（如刚果红类、硫磺素T类、多酚类等）；和（2）引入多肽类调节剂（如KLVFF）来抑制淀粉样多肽的聚集和其神经毒性。对于小分子类抑制剂，较高浓度的刚果红能够抑制纤维的形成，硫磺素T则与纤维有很强的结合力，二者均可用于体内Aβ的标记和抑制其聚集；而多酚类分子表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）也被证明对Aβ有显著地聚集抑制和解聚作用。对于短肽抑制剂，KLVFF五肽片段常被用于识别Aβ相应区域并与Aβ发生特异性相互作用（可参考Tjernberg,L.O.等人,Journal ofBiological Chemistry1996,271,8545;Chafekar,S.M.等人,ChemBiochem2007,8,1857；Findeis,M.A.等人,Biochemistry1999,38,6791；Gibson,T.J.等人,Biochemistry2005,44,8898）。
尽管刚果红类、硫磺素T类、多酚类和KLVFF衍生物类短肽抑制剂的研究受到了很大重视，但其应用也受到限制。比如刚果红类、硫磺素T类和五肽KLVFF的溶解性较差，细胞毒性较高且结合能力也不高，这些都直接地导致了这些抑制剂在实际使用中受到了很大的限制。因此，目前需要发展一种溶解性好，自身细胞毒性较低并且与Aβ的结合能力较强的抑制剂。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明人经过大量试验和艰辛的劳动发现了一种短肽抑制剂，其对β-淀粉样多肽聚集及其引起的细胞毒害作用具有显著的抑制作用，可用作治疗和/或预防与β-淀粉样多肽有关的疾病的药物活性成分。因此，本发明的目的在于提供一种短肽抑制剂及其用途。
为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：
在第一方面，本发明提供一种短肽抑制剂，其序列中包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
优选地，所述短肽抑制剂的序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
本发明的短肽抑制剂能够用于抑制β-淀粉样多肽聚集和/或对细胞毒害作用。其中，所述对细胞毒害作用一般是由β-淀粉样多肽的错误折叠和/或聚集造成的。优选地，所述β-淀粉样多肽为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的1种或至少2种所示的氨基酸序列。
本发明的短肽抑制剂还能够用于治疗和/或预防与β-淀粉样多肽有关的疾病。所述疾病包括但不限于阿尔茨海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏症、前额颞退行病变、脊索侧索硬化症、II型糖尿病、牛海绵状脑病或克罗伊茨费尔特-雅各布氏病。
在第二方面，本发明提供如第一方面所述的短肽抑制剂在制备用于抑制β-淀粉样多肽聚集和/或对细胞毒害作用的药物中的用途。
其中，所述对细胞毒害作用一般是由β-淀粉样多肽的错误折叠和/或聚集造成的。优选地，所述β-淀粉样多肽为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的1种或至少2种所示的氨基酸序列。
本发明还提供如第一方面所述的短肽抑制剂在制备用于治疗和/或预防与β-淀粉样多肽有关的疾病的药物中的用途。
所述疾病包括但不限于阿尔茨海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏症、前额颞退行病变、脊索侧索硬化症、II型糖尿病、牛海绵状脑病或克罗伊茨费尔特-雅各布氏病。
相比现有技术中的小分子抑制剂或多肽类调节剂，本发明的短肽抑制剂与Aβ的结合能力较强，通过表面等离基元共振技术得到的本发明的短肽抑制剂与Aβ的结合动力学常数中的结合常数ka达到120（摩尔/升）-1秒-1、解离常数kd为10-8秒-1数量级、平衡解离常数KD为10-10摩尔/升数量级，明显优于对照短肽；利用光散射技术和ThT荧光技术检测到本发明的短肽抑制剂对β-淀粉样多肽的聚集抑制效果明显，并且优于同类短肽抑制剂；神经细胞毒性实验显示本发明的短肽抑制剂能够降低Aβ对神经细胞的毒害作用。此外，本发明的短肽抑制剂自身细胞毒性较低且其溶解性好。
附图说明
图1是氮末端片段Aβ1-20、Aβ1-25、Aβ1-28与反序列Aβ20-1、Aβ25-1和Aβ28-1与标记分子共组装体的扫描隧道显微镜图像和进行长度测量统计分析得到的稳定组装序列。
图2是短肽抑制剂GYEVHH和对比序列GYGVGG与β-淀粉样多肽Aβ1-42结合的表面等离基元共振检测的结果。其中图2A是12.5μM、25μM和50μM的Aβ1-42分别与GYEVHH的结合过程；2b-2d是对比序列GYGVGG与Aβ1-42分别在12.5μM、25μM和50μM下的的结合过程；2e是通过表面等离激元共振技术得到的结合常数Ka、解离常数Kd和平衡解离常数KD。并通过表面等离激元共振得到的结果证明短肽抑制剂GYEVHH与Aβ1-42的结合作用主要是主链间的氢键和侧链间的电荷相互作用。
图3是短肽抑制剂对Aβ1-42聚集体形貌调控的光散射结果、ThT荧光结果和原子力显微镜图像。其中，图3A与3B分别为短肽抑制剂对β-淀粉样多肽的抑制作用的光散射和ThT荧光结果；图3C-3H分别为Aβ1-42、Aβ1-28、Aβ33-42和Aβ1-42+GYEVHH、Aβ1-28+GYEVHH、Aβ33-42+GYEVHH摩尔比为1:1的原子力显微镜图像，图中的1微米表示X和Y坐标轴的比例尺，20纳米表示Z坐标轴的比例尺。
图4为短肽抑制剂对β-淀粉样多肽神经毒性的抑制效果。其中，图4A为10μM、20μM和40μM不同浓度的Aβ1-42与浓度比为10:1、2:1、1:1、1:2和1:4的短肽抑制剂GYEVHH的神经细胞毒性测试结果；图4B为Aβ1-42浓度保持在10μM与浓度比为10:1、10:2、10:5、10:10、10:20和10:40的短肽抑制剂GYEVHH的神经细胞毒性测试结果及GYEVHH神经抑制效果与KLVFF的抑制效果的对比。
图5为短肽抑制剂自身的神经细胞毒性测试结果。
具体实施方式
为了有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的含义。
除非另外说明，本文中的“抑制剂”指的是可以抑制β-淀粉样多肽的聚集和/或毒性的短肽。
除非另外说明，本文中的“短肽”指的是可以抑制β-淀粉样多肽的聚集和/或毒性的多肽片段。
除非另外说明，本文中的“β-淀粉样多肽”指的是全长的β-淀粉样多肽以及其不同长度的β-淀粉样多肽的片段。
除非另外说明，本文中的“聚集体”指的是β-淀粉样多肽自聚集形成的单组分聚集体；“共聚集体”指的是β-淀粉样多肽与抑制剂分子或标记分子共聚集形成的多组分聚集体。
除非另外说明，在本文中，“μM”是指“μmol/L”，“mM”是指“mmol/L”。
除非另外说明，本文中的“反序列”是指与其对应序列的氨基酸顺序相反的序列，比如反序列Aβ20-1是指与Aβ1-20的氨基酸序列顺序相反的序列。
本发明中，任何多肽、短肽或氨基酸序列都可以通过人工合成获得，人工合成多肽的技术属于现有技术，本领域技术人员可以根据其具备的知识和技能自己合成，也可以委托相应公司合成。
本发明的短肽抑制剂可以溶解到缓冲液中制备混合溶液，可以使短肽抑制剂的终浓度为10-100μM，优选为50μM。所述缓冲液可以是pH6.8-7.5的磷酸盐缓冲液，优选pH7.2的磷酸盐缓冲液。
本发明中，β-淀粉样多肽为全长β-淀粉样多肽Aβ及其不同长度的片段，
优选地，所述β-淀粉样多肽Aβ选自β-淀粉样多肽Aβ1-42（Aβ1-42）、β-淀粉样多肽Aβ1-40（Aβ1-40）、β-淀粉样多肽Aβ1-28（Aβ1-28）、β-淀粉样多肽Aβ1-25（Aβ1-25）、β-淀粉样多肽Aβ1-20（Aβ1-20）、β-淀粉样多肽Aβ33-42（Aβ33-42）、β-淀粉样多肽Aβ9-20（Aβ9-20）及其片段中的一种或多种。最优选地，所述β-淀粉样多肽为全长β-淀粉样多肽Aβ1-42（Aβ1-42）。
本发明涉及的多肽及其序列总结如表1所示：
表1本发明涉及的多肽及其序列汇总表
为了获得本发明的技术方案，本发明利用扫描隧道显微技术在分子水平上得到组装核心片段，及所选取的短肽抑制剂；利用表面等离激元共振技术测试短肽抑制剂与β-淀粉样多肽间的结合能力；利用原子力显微技术测试抑制剂对于β-淀粉样多肽聚集体形貌的改变；利用光散射和ThT荧光技术测试短肽抑制剂对β-淀粉样多肽聚集行为的调控效果；利用细胞毒性测试技术检测短肽抑制剂对β-淀粉样多肽神经毒性的抑制。
具体地，本发明进行了以下几个方面的探索和研究：
1）将β淀粉样多肽1-20（Aβ1-20）、β淀粉样多肽1-25（Aβ1-25）和β淀粉样多肽1-28（Aβ1-28）及其反序列（Aβ20-1、Aβ25-1和Aβ28-1）与标记分子进行共组装，获得多肽组装体的扫描隧道显微镜图像并得到相同的组装核心片段。
所述组装体的制备方法包括如下步骤：
a1.将所述六种多肽Aβ1-20、Aβ1-25、Aβ1-28、Aβ20-1、Aβ25-1和Aβ28-1和标记分子制成溶液；
b1.将标记分子与六种多肽一一混合，形成共组装体；
c1.将步骤b1得到的溶液滴加到导电性基底，例如石墨或金、银、铜、铂等金属基底以及硅等半导体基底表面，以形成组装体。
除去溶剂后，在固/气界面获得短肽抑制剂组装体的扫描隧道显微镜图像。
d1.将使用STM得到的Aβ1-20、Aβ1-25、Aβ1-28、Aβ20-1、Aβ25-1和Aβ28-1的稳定的组装核心片段（分别为GYEVHHQKLVFF，GYEVHHQKLVFFAEDVG，GYEVHHQKLVFFAEDVGSNK，DAEFRHDSGYEVHH，DAEFRHDSGYEVHH和DAEFRHDSGYEVHHQ）取相同的片段为GYEVHH，即为所选用的短肽抑制剂。
在制备短肽抑制剂组装体中，采用超声来充分混合；所述导电性基底为石墨，优选为新解理的高定向热解石墨。高定向热解石墨具有原子级平整的表面，而且在很多环境中都很稳定，适于扫描隧道显微镜表征。
此外，在制备短肽抑制剂组装体中，还包括除去基底表面残留液的步骤，可以采用吹惰性气体（例如氮气）的方式来除去所述基底表面的残留液。
2）将β-淀粉样多肽溶解到磷酸缓冲液中，与短肽抑制剂在37℃下恒温摇晃共同孵育24小时，利用原子力显微技术观察短肽抑制剂对β-淀粉样多肽的聚集形貌的影响。
所述短肽抑制剂对β-淀粉样多肽的聚集形貌的影响的表征包括如下步骤：
a2.将β-淀粉样多肽溶解到pH=7.4的磷酸缓冲液中，制成50μM溶液；
b2.将短肽抑制剂与β-淀粉样多肽按摩尔比为1:1的比例，溶解到pH=7.2的磷酸缓冲液中制备混合溶液，各自的浓度为50μM溶液，在37℃共同孵育24小时；
c2.将步骤a2和b2得到的混合溶液分别滴加到云母、硅片等平整基底上，然后空气干燥后，在固/气界面获得各自的原子力显微镜图像。
在制备短肽抑制剂组装体中，采用超声来充分混合；所述平整基底为云母、硅片、石墨等，优选为新解理的云母。云母具有原子级平整的表面，而且在很多环境中都很稳定，并且表面亲水性好，适于生物样品的原子力显微镜表征。
3）利用表面等离激元共振成像（SPRi）技术测试短肽抑制剂与β-淀粉样多肽的结合能力。
所述表面等离子体共振技术所需样品的制备和实验方法包括如下步骤：
a3.将短肽抑制剂和对照短肽（GYGVGG）溶解到pH=4.5的乙酸钠缓冲液中，浓度为100μg/mL。
b3.将这些样品点制在同一张SIP芯片表面上，每种样品重复三个点，4℃孵育12小时。然后将芯片浸入1M乙醇胺（pH=8.5）的水溶液中室温孵育30分钟，以封闭表面未被蛋白占据的活性位点，后用超纯水洗净，氮气吹干。
c3.将芯片安装在SPRi仪器上，调节最佳光学位置为18.6，在检测区域选取相关的检测点，包括样品点和空白点，进行检测。实验中流速均设为2μL/s。
d3.选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后依次通入浓度为50μM、25μM和12.50μM的β-淀粉样多肽（溶解在磷酸缓冲溶液中，缓冲液浓度20μM,pH7.2）进行检测，结合时间为800秒，解离时间为200秒。每个浓度间通入10mM NaOH进行重生。
所述SPRi仪器为Plexera Kx5V2，
Bioscience LLC,USA，检测基于该表面的多肽-多肽间相互作用。该仪器主要装配有660nm LED光源、CCD图像采集器和带微流通道的传感芯片。芯片表面可检测区为14mm×14mm。仪器显示每个检测点上反射光强度随时间的变化并记录为SPR曲线，以反应芯片表面的结合事件，根据Langmuir吸附模型及SPRi软件可获得结合的动力学常数和亲合力常数。
4）利用荧光光谱技术测试短肽抑制剂在磷酸缓冲液中对β-淀粉样多肽聚集行为的调控效果。
所述荧光光谱测试硫磺素（ThT）荧光强度所需样品的制备方法包括如下步骤：
a4.将β-淀粉样多肽制成100μM溶液；
b4.将β-淀粉样多肽和短肽抑制剂的混合溶液制成100μM:100μM溶液；
c4.将ThT荧光染料分子制成1mM溶液；
d4.将步骤a4和b4中制备的溶液分别与所述的荧光染料分子溶液混合之后放入标准的石英池中，ThT荧光染料分子的终浓度为20μM，在荧光光谱仪中进行测试。测试选取特定激发波长和发射波长，通过测试发射波长处其荧光强度反映溶液中β-淀粉样多肽的聚集程度，从而验证短肽抑制剂对β-淀粉样多肽聚集的调控。
所述荧光光谱仪为Hitachi F4600；所述石英池光路长度为1cm；所述测量条件为测试时激发光和检测的发射光波长分别为450nm和480nm；使用时间驱动模式，光谱的带宽设置为1nm，狭缝宽度为2.5nm。荧光的强度值为15s的时间内所测得的荧光强度的平均值。
5）利用光散射技术测试短肽抑制剂在磷酸缓冲液中对β-淀粉样多肽聚集行为的调控效果。
所述光散射技术测试光散射强度所需样品的制备方法包括如下步骤：
a5.将β-淀粉样多肽制成100μM溶液；
b5.将β-淀粉样多肽和短肽抑制剂的混合溶液制成100μM:100μM溶液；
c5.将步骤a5和b5中制备的溶液进行测试。测试选取特定激发波长和发射波长，通过测试发射波长处其光散射强度反映溶液中β-淀粉样多肽的聚集程度，从而验证短肽抑制剂对β-淀粉样多肽聚集的调控。
所述连续光谱多功能酶标仪为Hitachi F4600；所述石英池光路长度为1mm；所述测量条件为测试时激发光和检测的发射光波长均为400nm；所述实验条件为37℃。每间隔15分钟-60分钟测试一次。
6）利用细胞毒性测试实验检测短肽抑制剂对β-淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果。
所述β-淀粉样多肽细胞毒性测试的样品制备方法包括如下步骤：
a6.将所述β-淀粉样多肽分别制成300μM的溶液；
b6.将所述短肽抑制剂及参照用的抑制剂KLVFF制成600μM的溶液；
c6.将步骤a6中所述的β-淀粉样多肽溶液加入到培养好的神经肿瘤细胞中，β-淀粉样多肽溶液的最终浓度分别为10μM、20μM和40μM；经过48小时的孵育后，利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试神经肿瘤细胞的存活率，通过存活率判断β-淀粉样多肽对神经肿瘤细胞损伤的程度。
d6.将步骤a6中所述的β-淀粉样多肽和步骤b6中所述的短肽抑制剂的溶液各按比例加入到培养好的神经肿瘤细胞中，β-淀粉样多肽溶液的最终浓度为10μM、20μM和40μM，β-淀粉样多肽与短肽抑制剂或KLVFF的最终浓度比分别为10:1、2:1、1:1、1:2和1:4；经过48小时的孵育后，利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试神经肿瘤细胞的存活率，通过存活率判断β-淀粉样多肽对神经肿瘤细胞损伤的程度。
优选地，所述β-淀粉样多肽为全长β-淀粉样多肽Aβ1-42（Aβ1-42）、β-淀粉样多肽Aβ1-40（Aβ1-40）、β-淀粉样多肽Aβ1-28（Aβ1-28）、β-淀粉样多肽Aβ9-20（Aβ9-20）或β-淀粉样多肽Aβ33-42（Aβ33-42），所述β-淀粉样多肽Aβ1-42的序列为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述β-淀粉样多肽Aβ1-40的序列为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。更优选地，所述β-淀粉样多肽为为全长β-淀粉样多肽1-42（Aβ1-42）。
所述的神经肿瘤细胞为SH-SY5Y细胞，作为神经细胞的模型体系。
综上所述，本发明通过加入抑制β-淀粉样多肽毒性的短肽抑制剂，抑制β-淀粉样多肽的组装、聚集和毒性。
本发明利用扫描隧道显微技术在分子水平上观察到了β-淀粉样多肽氮末端片段的组装结构，确认了氮末端的稳定片段，即为所选定的短肽抑制剂；利用表面等离激元共振成像技术检测短肽抑制剂与β-淀粉样多肽的结合能力并得到结合常数；利用原子力显微技术在纳米尺度水平观察到了短肽抑制剂对β-淀粉样多肽聚集体形貌的调控，可以使人们直观地观察到短肽抑制剂对β-淀粉样多肽的聚集调控效果；利用ThT荧光光谱技术和光散射技术揭示了短肽抑制剂对β-淀粉样多肽聚集行为的调控效果；利用神经细胞毒性测试方法检测短肽抑制剂对β-淀粉样多肽神经毒性的抑制效果。
总之，本发明提供了一个高结合常数、高水溶性和低细胞毒性的短肽抑制剂，为研究治疗β-淀粉样多肽相关的神经退行性疾病的药物提供了新的选择。
以下，结合附图和实施例来详细说明本发明的实施方案，其中：除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。除非特别指明，以下实施例中所用的神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）购自北京协和细胞资源中心。
实施例1利用扫描探针显微镜得到β-淀粉样多肽氮末端的组装核心片段
1、所使用物质的化学结构
短肽抑制剂（GYEVHH（SEQ ID NO:1），上海科肽生物技术有限公司，纯度为98%），标记分子为4,4'-联吡啶（4,4'-bipyridyl,4Bpy,Sigma-Aldrich）序列和结构如下所示：短肽抑制剂：N2H-GlyTyrGluValHisHis-COOH；标记分子4Bpy：
2、具体方法
1）利用扫描隧道显微技术得到氮末端稳定组装片段。
先将β-淀粉样多肽（Aβ1-20、Aβ1-25、Aβ1-28与反序列Aβ20-1、Aβ25-1和Aβ28-1）和标记分子溶解于水溶液中，超声30秒，充分混合之后，取出15微升溶液，滴到新解理的高定向热解石墨（ZYB级，Veeco，美国）表面，静置10分钟，使体系形成共组装体并沉积在石墨表面上之后，再用高纯氮气吹干。
利用商品化的多模式扫描探针显微镜（SPM，Nanoscope IIIa型，Veeco公司，美国），实验条件为大气下恒电流模式，对六种多肽与标记分子的共组状体分别进行扫描，得到高分辨STM图像（如图1所示）。
图1A、1C、1E、1G、1I和1K分别为Aβ1-20、Aβ1-25、Aβ1-28、Aβ20-1、Aβ25-1和Aβ28-1与标记分子的共组装结构的高分辨STM图像，从图像中我们可以看出多肽分子的组装体形成片层状结构，以条陇结构存在，而标记分子伴随在多肽的陇间，与多肽分子相互作用。
图1B、1D、1F、1H、1J和1L分别为根据高分辨STM图像对Aβ1-20、Aβ1-25、Aβ1-28、Aβ20-1、Aβ25-1和Aβ28-1多肽链进行测量得到的长度统计图。以Aβ1-20为例，其组装结构所得到的稳定吸附的多肽链长度分布为3.25-5.20nm，即其中包含10-15个氨基酸残基，而高斯统计数据给出的信息显示，最可几长度为12个氨基酸残基，意味着Aβ1-20的稳定组装片段为GYEVHHQKLVFF，以相同方法得到的Aβ1-25、Aβ1-28、Aβ20-1、Aβ25-1和Aβ28-1的最可几的稳定组装序列为16/17、20、14、14和15个氨基酸残基。
图1M、1N、1O、1P、1Q和1R分别为根据STM图像得到的Aβ1-20、Aβ1-25、Aβ1-28、Aβ20-1、Aβ25-1和Aβ28-1与标记分子相互作用的模型示意图，及六种多肽在基底表面分别的稳定片段序列。Aβ1-20、Aβ1-25、Aβ1-28、Aβ20-1、Aβ25-1和Aβ28-1六种多肽的稳定组装片段分别为GYEVHHQKLVFF、GYEVHHQKLVFFAEDVG、GYEVHHQKLVFFAEDVGSNK、DAEFRHDSGYEVHH、DAEFRHDSGYEVHH和DAEFRHDSGYEVHHQ。其中深色片段表示六种多肽相同的稳定片段，即为所选用的短肽抑制剂GYEVHH。
2）利用表面等离激元共振技术检测β-淀粉样多肽与短肽抑制剂的结合动力学过程与结合动力学参数。
利用商品化的，SPRi仪器（Plexera Kx5V2，
Bioscience LLC,USA)，采用poly(OEGMA-co-HEMA)表面芯片一张，检测基于该表面的多肽-多肽间的互作。仪器显示每个检测点上反射光强度随时间的变化并记录为SPR曲线，以反应芯片表面的结合事件，根据Langmuir1：1吸附模型及SPRi软件可获得结合的动力学常数和亲和力常数。实验中，调节最佳光学位置为18.1，自动进样系统与芯片表面的微流通道连接，样品流动速率为2μL/s。选择PBS为缓冲液通入流通池至基线稳定后开始检测该表面的传感特性（如图2所示）。
图2A为12.5μM、25μM和50μM的Aβ1-42与GYEVHH的结合过程的表面等离基元共振检测结果。结果显示短肽抑制剂和β-淀粉样多肽的结合强度随β-淀粉样多肽的浓度的增高而升高。并且可以得到β-淀粉样多肽与短肽抑制剂的结合动力学常数。
图2B-2D为12.5μM、25μM和50μM的Aβ1-42与GYEVHH及对比序列GYGVGG的结合过程的表面等离基元共振检测结果。在相同的浓度下，Aβ1-42与GYEVHH的结合能力要强于与GYGVGG的结合能力。并且可以得到GYGVGG与Aβ1-42的结合动力学常数。
图2E为使用表面等离基元共振技术得到的GYEVHH及对比序列GYGVGG与Aβ1-42的结合动力学常数：结合常数ka、解离常数kd和平衡解离常数KD。通过数据比较可以得到Aβ1-42与GYEVHH的结合能力要强于与GYGVGG的结合能力，并且Aβ1-42与GYEVHH的结合能力与Aβ1-42-抗Aβ1-42抗体的结合能力在同一个数量级上。
3）利用光散射技术检测短肽抑制剂对β-淀粉样多肽的聚集抑制效果。
利用连续光谱多功能酶标仪为Hitachi F4600；所述石英池光路长度为1mm；所述测量条件为测试时激发光和检测的发射光波长均为400nm；所述实验条件为37℃。每间隔15分钟-60分钟测试一次（如图3a所示）。
图3A中方形和上三角形曲线分别为Aβ1-42和Aβ1-40单独在溶液中的聚集动力学曲线，均为典型的S型生长曲线，当加入了短肽抑制剂GYEVHH后，分别如下三角形与左三角形曲线所示，聚集过程中的光散射信号强度明显的削弱，Aβ1-42和Aβ1-40的聚集过程被明显的抑制了。这种抑制作用源于多肽的聚集结构被调节，短肽抑制剂通过与β-淀粉样多肽的主链形成氢键作用及与β-淀粉样多肽的侧基形成电荷相互作用，改变了β-淀粉样多肽的聚集结构，这将导致β-淀粉样多肽的聚集被抑制。圆形的曲线表示短肽抑制剂自身的聚集过程。
4）利用ThT荧光技术测试短肽抑制剂对β-淀粉样多肽聚集行为的抑制效果。
利用Hitachi F4600荧光光谱仪；所述石英池长度为1mm；所述测量条件为测试时激发光和检测的发射光波长分别为450nm和480nm。使用时间驱动模式，光谱的带宽设置为1nm，狭缝宽度为2.5nm。荧光的强度值为测试15s中强度的平均值。整体测试使用衰减模式。得到的荧光结果如图3b所示。
图3B中方形、上三角形和右三角形曲线分别为Aβ1-42、Aβ1-40和Aβ1-28单独在溶液中的聚集动力学曲线，均为典型的S型生长曲线，当加入了短肽抑制剂GYEVHH后，分别如下三角形、左三角形和钻石形曲线所示，聚集过程中的荧光信号强度明显的削弱，Aβ1-42、Aβ1-40和Aβ1-28的聚集过程被明显的抑制了。同时，作为对比，加入常用的抑制剂KLVFF作为对比。圆形曲线为Aβ1-42+KLVFF的聚集动力学曲线，且荧光信号强度要明显的强于Aβ1-42+GYEVHH的荧光信号强度，这证明GYEVHH对β-淀粉样多肽聚集的抑制作用要明显的强于KLVFF对β-淀粉样多肽的聚集抑制作用。五边形曲线表示短肽抑制剂自身的聚集过程。
5）利用原子力显微技术检测短肽抑制剂对β-淀粉样多肽聚集体形貌的抑制效果。
利用商品化的原子力显微镜（SPM，Dimension3100型，Bruker公司，美国），实验条件为大气下轻敲模式，对β-淀粉样多肽、短肽抑制剂与Aβ1-42（SEQ ID NO:2）、Aβ1-28（SEQ ID NO:4）、Aβ33-42（SEQ ID NO:7）（上海科肽生物科技有限公司，纯度为98%）混合体系分别进行扫描，得到高分辨AFM图像（如图3C-3H所示）。
图3C-3E是β-淀粉样多肽Aβ1-42、Aβ1-28和Aβ33-42的聚集体形貌，AFM图像中是典型的β-淀粉样多肽聚集形成的粗大纤维结构。图3F-3H所示分别为β-淀粉样多肽Aβ1-42、Aβ1-28和Aβ33-42与短肽抑制剂GYEVHH混合体系的聚集体的形貌。图3F与3H中虽然纤维的形成仍然存在，但是纤维的数量、长度和粗细都明显的下降取而代之的是出现了大量的形貌表现为均匀的颗粒聚集体，而在图3G中显微结构完全消失，聚集体的形貌表现为均匀的颗粒。图3F-3H说明短肽抑制剂起到了抑制β-淀粉样多肽聚集的效果。
实施例2利用神经细胞毒性测试方法检测β-淀粉样多肽Aβ1-42神经毒性和短肽抑制剂对β-淀粉样多肽神经毒性的抑制
将SH-SY5Y细胞（ECACC,英国）接种于96孔板中（购于CorningIncorporated,USA），每孔150μL细胞培养液，放于孵箱中37℃下培养。待细胞大约有60%贴壁，且状态良好时，可向细胞培养液内加入β-淀粉样多肽和短肽抑制剂与β-淀粉样多肽的混合体系，进行细胞毒性测试，细胞浓度为15000个/孔。
将Aβ1-42、Aβ1-42/GYEVHH和Aβ1-42/KLVFF分别加入细胞培养液内，其最终浓度分别为Aβ1-42：10μM、20μM、40μM；GYEVHH：10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、120μM、160μM、200μM；Aβ1-42/GYEVHH：10μM:—、10μM:1μM、10μM:5μM、10μM:10μM、10μM:20μM、10μM:40μM；在固定Aβ1-42浓度为10μM时，Aβ1-42/GYEVHH：10μM:—、10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM、10μM:20μM、10μM:40μM；Aβ1-42/KLVFF：10μM:—、10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM、10μM:20μM、10μM:40μM。作用48小时后，测试细胞存活率。我们采用MTT细胞存活试验(Morita,Y.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,97,5405;Takeda,K.等,J.Biol.Chem.2000,275,9805)，检验β-淀粉样多肽的细胞毒性以及短肽抑制剂对β-淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果。MTT细胞存活实验中，主要使用MTT试剂（Dojindo,日本），其可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。MTT化学名称为：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，其基本原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。测试波长为492nm。加入CCK-8后，3-4小时内进行测试。使用酶标仪进行OD值测试。数据分析：试验结果为三次试验的平均值，每次试验平行测试三次。数据为平均值±误差值。数据统计分析使用SPSS专业统计分析软件（SPSS，Chicago），利用配对样品t-检验。当P<0.05时，视为有差异，P<0.01时视为有显著差异。
图4A为Aβ1-42的浓度为10μM、20μM和40μM时，不同浓度的短肽抑制剂GYEVHH对β-淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果（10:—、10:1、2:1、1:1、1:2、1:4）。结果显示，随着短肽抑制剂浓度的增加，短肽抑制剂对β-淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果逐渐增强。
图4B为Aβ1-42的浓度保持在10μM不变，不同浓度的短肽抑制剂GYEVHH及对比抑制剂KLVFF对β-淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果（Aβ1-42/GYEVHH：10μM:—、10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM、10μM:20μM、10μM:40μM；Aβ1-42/KLVFF：10μM:—、10μM:1μM、10μM:2μM、10μM:5μM、10μM:10μM、10μM:20μM、10μM:40μM）。结果显示，随着短肽抑制剂浓度的增加，短肽抑制剂对β-淀粉样多肽神经细胞损伤的抑制效果逐渐增强。且在短肽抑制剂低浓度时KLVFF对β-淀粉样多肽细胞毒性的抑制效果较好，但是在短肽抑制剂高浓度下时GYEVHH对β-淀粉样多肽的抑制效果较好，而KLVFF作为抑制剂在高浓度下时因为KLVFF自身的细胞毒性较高，导致细胞存活率大幅下降。
图5为10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、120μM、160μM和200μM不同浓度的短肽抑制剂GYEVHH的新配置溶液对神经细胞的毒害，以及10μM、20μM和40μM不同浓度的参照用的抑制剂KLVFF的新配置溶液对神经细胞的毒害的结果比较，通过比较不同浓度时神经细胞存活率来反映短肽抑制剂GYEVHH和参照用的抑制剂KLVFF的神经毒性。结果显示短肽抑制剂GYEVHH本身的神经毒性相比KLVFF本身的神经毒性更小，因此本发明的短肽抑制剂GYEVHH自身的神经毒性较低。
综上所述，β-淀粉样多肽具有比较强的细胞毒性。将短肽抑制剂溶液和β-淀粉样多肽溶液同时加入细胞培养液中，随后进行细胞存活率的检测，检测结果发现：与对照组实验相比，含有短肽抑制剂的体系中，细胞存活率有明显提高。结合前面的表面等离激元共振技术、原子力显微镜、ThT荧光光谱和光散射结果说明：短肽抑制剂可以大大的抑制β-淀粉样多肽的聚集，使得β-淀粉样多肽对细胞的损伤大大降低。而且短肽抑制剂GYEVHH自身的神经毒性较低，对抑制β-淀粉样多肽的聚集有着很大的帮助，可以大大加强短肽抑制剂对β-淀粉样多肽的聚集和细胞毒性的抑制，达到最优化的效果。通过对细胞神经毒性的测试，我们确认了短肽抑制剂GYEVHH可以有效抑制β-淀粉样多肽神经毒性的结果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种短肽抑制剂，其序列中包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的短肽抑制剂，其特征在于，其序列为SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQID NO:16所示的氨基酸序列，优选为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的短肽抑制剂，其特征在于，所述短肽抑制剂用于抑制β-淀粉样多肽聚集和/或对细胞毒害作用；
优选地，所述对细胞毒害作用是由β-淀粉样多肽的错误折叠和/或聚集造成的；
优选地，所述β-淀粉样多肽为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的1种或至少2种所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2所述的短肽抑制剂，其特征在于，所述短肽抑制剂用于治疗和/或预防与β-淀粉样多肽有关的疾病。
5.根据权利要求4所述的短肽抑制剂，其特征在于，所述疾病选自阿尔茨海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏症、前额颞退行病变、脊索侧索硬化症、II型糖尿病、牛海绵状脑病或克罗伊茨费尔特-雅各布氏病。
6.如权利要求1或2所述的短肽抑制剂在制备用于抑制β-淀粉样多肽聚集和/或对细胞毒害作用的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述对细胞毒害作用是由β-淀粉样多肽的错误折叠和/或聚集造成的。
8.根据权利要求6或7所述的用途，其特征在于，所述β-淀粉样多肽为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8中的1种或至少2种所示的氨基酸序列。
9.如权利要求1或2所述的短肽抑制剂在制备用于治疗和/或预防与β-淀粉样多肽有关的疾病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述疾病选自阿尔茨海默症、帕金森氏症、亨廷顿氏症、前额颞退行病变、脊索侧索硬化症、II型糖尿病、牛海绵状脑病或克罗伊茨费尔特-雅各布氏病。
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