CN1120040A - 蛋白酶抑制剂的鉴定和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过给药天冬氨酰蛋白酶抑制剂，尤其是组织蛋白酶D的蛋白酶抑制剂，在细胞培养物和体内可以抑制β-淀粉样蛋白肽(βAP)产生。有效的天冬氨酰蛋白酶抑制剂可以用二步测定法进行选择，其中首先用非细胞测定法筛选具有天冬氨酰蛋白酶体外抑制活性的试验化合物。然后将发现具有蛋白酶抑制活性的试验化合物用细胞测定法测定抑制βAP产生的作用。可将能够抑制细胞内产生β-淀粉样蛋白的试验化合物掺合到药物组合物中。

Description

蛋白酶抑制剂的鉴定和应用
本发明广泛地涉及抑制细胞中β-淀粉样蛋白肽(βAP)产生的方法和组合物。具体地讲，本发明涉及能抑制细胞内βAP产生的细胞蛋白酶抑制剂(特别是天冬氨酰蛋白酶抑制剂)的筛选和鉴定，以及这类细胞蛋白酶抑制剂在用于抑制βAP产生的方法方面的应用。
阿尔茨海默氏病(AD)是退行性脑疾病，其临床上的特征在于记忆、识别、推理、判断力和情绪稳定性的逐步丧失，结果逐渐导致极度的脑力衰退并最终死亡。AD是老年人中逐步脑力衰竭(痴呆)的常见病因，并且据信在美国它是死亡的第4位最常见的医学病因。在世界范围内的人种和种族中都观察到了AD，因此它是目前和未来重要的公共卫生问题。仅在美国，现估计该疾病侵袭大约2～3百万人。迄今，AD被证明是不可治愈的。
AD患者的脑具有神经元变性和各种称为淀粉样蛋白蚀斑、血管淀粉样蛋白血管病以及神经原纤维混乱等的特有损伤。在AD患者中通常发现人脑对记忆和识别功能有重要作用的几个区域存在大量的这些损伤，尤其是淀粉样蛋白蚀斑和神经原纤维混乱。在不具有临床AD症状的大多数老年入脑内也发现在解剖学分布更局限的范围内有少量这些损伤。淀粉样蛋白蚀斑和血管淀粉样蛋白血管病也是患有下列疾病患者的脑的特征：三体性(Trisomy)21(Down′s综合征)和具有荷兰型淀粉样变性的遗传性脑出血(HCHWA-D)。目前对AD的明确诊断通常需要观察死于该病的患者的脑组织中的上述损伤，或者偶尔也可以在对患者进行侵入性神经外科手术时取少量的脑组织的活组织检查标本进行观查。
AD和上面提到的其它疾病所特有的淀粉样蛋白蚀斑和血管淀粉样蛋白血管病的主要蛋白成分，是称为β-淀粉样蛋白肽(βAP)的由大约39～43个氨基酸组成的分子量约为4.2千道尔顿(KD)的蛋白质。βAP是称为β-淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)的大的膜跨越糖蛋白的有约3.9～43个氨基酸片段。
βAP的特征还在于，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳或在高性能液相色谱(HPLC)中有其相对的迁移率。βAP可以丝状聚合物的形式存在，该丝状聚合物形式具有淀粉样蛋白的结合刚果红和硫黄素-S染料以及苹果绿双折射的特征。在组织中βAP也可以非丝状形式(“前淀粉样蛋白”或“无定形的”或“弥散的”沉淀物)存在，在该非丝状形式中，不存在可检出的刚果红双折射染色。在美国专利第4,666,829号中叙述了由脑脊膜血管中得到的一部分以不可溶形式存在的此种蛋白质。
APP通常由各类哺乳动物(包括人)的许多组织中的细胞产生。APP由人21染色体长臂上的一个基因编码。编码APP的基因结构知识表明，βAP是以一肽片段的形式出现，而该肽片段是通过一种或多种迄今尚未被鉴定的蛋白酶的作用从APP裂解而得的。该裂解看来是在细胞内发生的。βAP片段从APP的裂解以及其后作为淀粉样蛋白蚀斑沉积在脑组织和脑与脑脊膜血管壁细胞外的精确的生物化学机理尚在研究中。
几方面的证据表明，在AD发病机理中βAP的逐步脑沉积起着基本的作用，并且这种沉积可先于识别症状出现之前几年或数十年。参见Selkoe，(1991)Neuron 6：487。近年已经证明，βAP可以由在培养物中生长的神经元细胞释放，并且存在于正常人和AD患者的脑脊液(CSF)中，参见Seubert等人，(1992)Nature 359：325～327。
出现在APP基因中的某些遗传性突变可以引起AD以及与AD有关的疾病。例如，在患有遗传学决定型(家族遗传性)AD的几个家族受损成员中，而不是未受损成员中，在APP的770-氨基酸同型体(isoform)的氨基酸717上发现了误义DNA突变。参见Goate等，(1991)Nature 349：704-706；Chartier Harlan等，(1991)Nature 353：844-846；Murrell等，(1991)Science 254：97-99。此外，在一个患有家族遗传性AD的瑞典家庭受试者中还发现存在被称之为瑞典变异或瑞典突变的双重突变，其中在695-氨基酸同型体中，Lys595-Met596突变为Asp595-Leu596。参见Mullan等，(1992)Nature Genet 1：345-347。
遗传连锁分析已证明，APP基因中的上述突变以及某些其他突变是上述家族受损成员AD的分子病因。此外，已确定在APP 770-氨基酸同型体的氨基酸693上的一个突变是βAP沉积疾病，HCHWA-D的病因，并且在氨基酸692上由丙氨酸变化为甘氨酸的突变看来将导致一些患者出现类似于AD的表现型，而另一些患者出现类似于HCHWA-D的表现型。参见Younkin等，(1993)Science 259：514-516。
尽管在理解AD和其他与βAP有关疾病的主要机理方面已取得了一些进展，但仍然需要开发一些治疗这些疾病的组合物和方法。治疗方法有利的是以能够抑制βAP产生的药物为基础。为了鉴定这些药物，理想的是开发筛选方法，所述方法理所当然地应该建立在对细胞内βAP产生的深入理解的基础上，尤其应建立在对βAP蛋白水解断裂途径(包括鉴定有关的水解酶)理解的基础上。然后通过这些筛选方法发现的药物可借助于体外细胞模型、患有AD和其他与βAP相关疾病的哺乳动物，以及用于研究β-淀粉样蛋白产生和其抑制剂的动物模型用于抑制βAP的产生。
APP和βAP的产生在下述文献中有综合评述：Sinha和Lieberburg，(1992)Neurodegeneration 1：169-175和Marx，(1993)Science259：457-458。下述文献中叙述了一个明显的产生βAP的溶酶体APP加工途径：Estus等，(1992)Science 255：726-728和Golde等，(1992)Science 255：728-730。释放可溶性βAP进入细胞培养基中已在下述文献中叙述：Haas等，(1992)Nature 359：322-325和Shoji等，(1992)Science 258：126-129；释放βAP进入人和动物的CSF中已在下述文献中叙述：Seubert等，(1992)Nature 359：325-327。用与家族遗传性AD有关的突变体APP基因转化的人细胞株已表明可导致βAP的过量生成，请参见Citron等，(1992)Nature 360：672-674和Younkin等，同上。在与AD有关的老年蚀斑中存在大量的溶酶体蛋白酶，包括组织蛋白酶D，可参见Cataldo等，(1990)Proc.Natl，Acad.Sci.USA 87：3861-3865，以及(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10998-11002。有关天冬氨酰蛋白酶(又称天冬氨酸蛋白酶(aspartic proteases))和天冬氨酰蛋白酶抑制剂的性质描述于Tang和Wong，(1987)J.Cell.Biochem.33(1)：53-63；Rich，“Inhibitors of Aspartic Proteases”inProteinase Inhibitors，Barrett和Salvesen，eds.，ElsevierScience Publishers BV，Amsterdam，1986，p179-217；以及VanNoort等，(1992)J.Biol.Chem.264：14159-14164。组织蛋白酶D在红细胞浆质结构中用细胞进行的定位已在下面文献中叙述：Diment等，(1992)J.Biol.Chem.263：6901-6907。
本发明提供了抑制β-淀粉样蛋白肽(βAP)产生的方法，该方法包含对细胞施用有效量的天冬氨酰蛋白酶抑制剂。
本发明还提供了抑制βAP产生的方法，该方法包含给需要治疗的哺乳动物给药有效量的天冬氨酰蛋白酶抑制剂。
本发明也提供了抑制淀粉样蛋白蚀斑沉积的方法，该方法包含给需要治疗的哺乳动物给药有效量的天冬氨酰蛋白酶抑制剂。
本发明还提供了预防或治疗阿尔茨海默氏疾病(AD)的方法，该方法包含给需要预防或治疗的哺乳动物给药有效量的天冬氨酰蛋白酶抑制剂。
本发明也提供了预防或治疗与βAP有关疾病的方法，该方法包含给需要预防或治疗的哺乳动物给药有效量的天冬氨酰蛋白酶抑制剂。
本发明还提供了其中天冬氨酰蛋白酶抑制剂为以下式I化合物或其可药用盐的上述方法，
Figure A9410952700171
其中i为1、2、3或4；
R1为C1-C6烷基、芳基、环己基或-S-R1x，其中R1x
  为芳基或环己基；
W为
Figure A9410952700181
其中R1W和R2W系独立地选自氢、C1-C6烷基、芳基(C1-C4)烷基、杂环(C1-C4)烷基、不饱和的杂环(C1-C4)烷基，或者R1W和R2W与它们所连接的氮原子一起形成杂环或不饱和的杂环，条件是该氮原子不可被季铵化；
  q为0、1、2、3或4；
  R2为氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基或氨基；或者
W为
其中
  j为1或2；
  R3W为氢、甲酰基、氨基甲酰基或-(B)e-X-Ro，其中B为-C(O)-或-S(O)k-；
k为0、1或2
e为0或1；
x为-(CH2)g-、-(CH2)m-O-(CH2)n-或-(CH2)m-NRx-(CH2)n-，其中g为0、1或2
m和n独立地为0、1或2；
Rx为氢或C1-C4烷基；
Ro为C1-C6烷基、C1-C4烷氧羰基、甲酰基、C2-C6链烷酰基、氨基、三氟甲基、C1-C4烷氨基、二(C1-C4)烷氨基、芳基、杂环或不饱和的杂环；
R2各自独立地为氨基酸侧链、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2(CH2)2CH3、-C(CH3)3、-CH2SO2NH2、-CH2CN、-(CH2)r-X1-R2a、-(CH2)s-C(O)NR2bR2c或-(CH2)t-S(O)k-[1-N(R2d)-四唑-5-基]，
    其中r、s和t独立地为0、1或2；
    X1为一条键、二价的(C1-C4)烷基、二价的(C2-C4)链烯基、二价的(C2-C4)炔基、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)NR2b-、-NR2b-C(O)-、-NR2b-、-C(O)-、-O-或-S(O)k-；
    R2a为C1-C6烷基、芳基、芳基(C1-C4)烷基、杂环、杂环(C1-C4)烷基、不饱和的杂环或不饱和的杂环(C1-C4)烷基；
    R2b为氢或C1-C4烷基；
    R2c为氨基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、-(CH2)m--二(C1-C4)烷氨基、芳基、芳基(C1-C4)烷基、杂环、杂环(C1-C4)烷基、不饱和的杂环或不饱和的杂环(C1-C4)烷基；
    R2d为氢、C1-C6烷基、芳基、不饱和的杂环、不饱和的杂环(C1-C4)烷基或芳基(C1-C4)烷基；
  R为
Figure A9410952700211
Figure A9410952700212
或
其中
A为-CH2-或
Figure A9410952700221
Y为芳基或不饱和的杂环；
Y1为杂环；
R4W为羟基或氨基；
R3a为一具有下式的基团：
1)-C(O)-NR4R4，
Figure A9410952700222
或
Figure A9410952700223
R3b为一具有以下结构的基团：
Figure A9410952700225
或
  p为4或5；
  1为3、4或5；
  R4在各情况下独立地为氢、C1-C6烷基或羟基(C1-C4)烷基；
  R5和R6系独立地选自氢、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、C1-C4烷氨基、羟基(C1-C4)烷基、羧基、C1-C4烷氧羰基、氨基甲酰基、N-(C1-C4)烷基氨基甲酰基、芳基、杂环或不饱和的杂环；条件是
(1)如果R为
Figure A9410952700232
那么
W为
Figure A9410952700233
R3W为甲酰基、氨基甲酰基或-(B)e-X-Ro，
 其中
 e为1；和
 B为-C(O)-；
(2)如果R为那么
W为
Figure A9410952700242
；和
 j为2；和
(3)如果R为
Figure A9410952700243
或
Figure A9410952700251
那么
i为1；和
R1为芳基、环己基或-S-R1x，其中R1x为芳基或环己基。
本发明还提供了其中天冬氨酰蛋白酶抑制剂为下述式II化合物或其可药用盐的上述方法，
R7-Cly-(R8)f-Thr-OH              (II)其中R7为C1-C6烷基、甲酰基或C2-C6链烷酰基；
f为1～6；
Ra各自独立地为氨基酸残基、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基(statine)或其衍生物；条件是：
(1)必须有至少一个4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基或其衍生物；
(2)如果f为2-6，那么在-(Ra)f-中4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基及其衍生物的总数不超过3。
此外，本发明提供了鉴定βAP产生抑制剂的方法，该方法包含：
(1)给试验系统给药天冬氨酰蛋白酶抑制剂；
(2)测定试验系统中产生的βAP；和
(3)将试验系统产生的βAP与未给药这种天冬氨酰蛋白酶抑制剂的对照试验系统产生的βAP进行比较。
最后，本发明提供了鉴定βAP产生抑制剂的方法，该方法包含：
(1)在细胞测定法中测定产生的βAP；和
(2)测定试验动物体液中产生的βAP。
本说明书和权利要求书中所述的术语和短语定义如下。不言而喻，在本发明领域中有许多事实上涉及相同部分的术语。本申请中应用的特定的术语不应被认为是一种限制。
本申请中应用的术语“β-淀粉样蛋白肽(βAP)”是指在患有AD、Down′s综合征、HCHWA-D的人脑中和在一些正常的老年研究对象中形成淀粉样蛋白丝亚单位的分子量约为4.2千道尔顿的蛋白质，所述淀粉样蛋白丝包含淀粉样蛋白蚀斑(老年性蚀斑)和血管淀粉样蛋白血管病(淀粉样蛋白沉积在小脑和脑脊膜血管中)。此外，本领域技术人员常用的βAP的一般缩写形式包括Aβ、AβP和β/A4。在培养细胞的细胞外液与哺乳动物(如老年人以及患有AD和与βAP有关的症状的人)的体液中，可以发现以可溶的形式存在的βAP。
βAP在其定义范围内，包括由在正常基因的βAP区域的突变所引起的有关的βAP序列，并且实质上与43-氨基酸序列相似。βAP的43-氨基酸序列为：
1
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr
11
Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe
21
Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala
31
Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val
41
Ile Ala Thr [SEQ ID NO：1]
本申请所应用的术语“β-淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)”是指由位于人21染色体的长臂上的相同名称的基因编码的多肽，人21染色体的长臂在羧基端三分之一长度内含有βAP。APP是表达于许多哺乳动物组织的各种细胞中的糖基化的单膜跨越的蛋白质。已知存在于人体中的具体的APP同型物的实例包括由Kang等在(1987)Nature 325：733-736中叙述的称为“标准(normal)”APP的695-氨基酸多肽；由Ponte等在(1988)Nature 331：525-527中和Tanzi等在(1988)Nature 331：528-530中叙述的751-氨基酸多肽；以及由Kitaguchi等在(1988)Nature 331：530-532中叙述的770-氨基酸多肽。APP的具体变异体的实例包括可在位置和表型均不同的点突变。参见Hardy，(1992)Nature Genet.1：233～234。
现已观察到，细胞内βAP的产生是由于APP经细胞蛋白酶裂解的结果。该细胞蛋白酶为天冬氨酰蛋白酶，更具体地说是组织蛋白酶D。此外还观察到，已知的组织蛋白酶D抑制剂胃酶抑素见下示序列：
Iva-Val-Val-Sta-Ala-Sta-OH其中Iva为异戊酸，
Sta为4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，它与βAP的6个羧基-末端氨基酸是类似的；
  38  39  40  41  42  43
Gly-Val-Val-Ile-Ala-Thr-OH.[SEQ ID NO：2]
优选的组织蛋白酶D抑制剂包括下述化合物，该化合物与含有至少1个4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸或其衍生物(优选在类似于氨基酸41或42的位置)的βAP的羧基末端极为相似。此外，优选的组织蛋白酶D抑制剂是具有能够提高化合物抑制组织蛋白酶D或形成βAP的能力的药理性质的化合物。药理性质的实例包括口服吸收、穿过细胞膜或血/脑屏障的能力等。
本申请中应用的术语“βAP相关的症状”是指AD(包括家族遗传性AD)、Down′s综合征、HCHWA-D、脑的晚期老化等。
本申请中应用的术语“限制性培养基”和“培养基”是指包围在体外生长的细胞的含水细胞外液，并且它们除了含有其他成分之外还含有蛋白质和由细胞分泌的肽。
本申请中应用的术语“体液”是指可含有可以测量数量的βAP和βAP片段的哺乳动物宿主的体液，具体地包括血液、CSF、尿和腹膜液。术语“血液”是指全血以及血浆和血清。
术语“细胞特征”是指涉及βAP产生并且在限制性培养基或体液中可以找到的成分。典型的细胞特征包括βAP和βAP片段以及其他类似于βAP加工的中间体。
术语“瑞典突变”是指编码APP的人体基因的突变，结果导致遗传的家族遗传性形式的AD。突变发生在正常APP基因的Lys595-Met596处，在该处替代为Asn595-Leu596。现已发现，用所述突变转染的人细胞株会过量产生βAP，分泌βAP到限制性培养基中。可以用于转染细胞株以产生βAP的其他家族遗传性APP基因的突变在本技术领域中是已知的。参见Hardy，同上。
术语“C1-C6烷基”表示有1～6个碳原子的直链或支链的烷基。常用的C1-C6烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基等。在术语“C1-C6烷基”的定义中包括术语“C1-C4烷基”。
术语“二价(C1-C4)烷基”表示有1～4个碳原子的直链或支链的二价烷基。常用的二价(C1-C4)烷基包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、2-甲基亚丙基、亚丁基等。
术语“卤素”表示氯、氟、溴或碘。
术语“卤素(C1-C4)烷基”表示有1～4个碳原子并有1、2或3个卤原子与其连接的直链或支链的烷基链。常用的卤素(C1-C4)烷基包括氯甲基、2-溴乙基、1-氯异丙基、3-氟丙基、2，3-二溴丁基、3-氯异丁基、碘-叔丁基、三氟甲基等。
术语“C1-C6烷硫基”表示有1～6个碳原子并连有一硫原子的直链或支链的烷基链。常用的C1-C6烷硫基包括甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基等。在术语“C1-C6烷硫基”的定义中包括术语“C1-C4烷硫基”。
术语“C1-C4烷氨基”表示有1～4个碳原子并连有一氨基的直链或支链的烷基链。常用的C1-C4烷氨基包括甲氨基、乙氨基、丙氨基、异丙氨基、丁氨基、仲丁氨基等。
术语“二(C1-C4)烷氨基”表示有二个烷基链的直链或支链的二烷氨基链，每个烷基链独立地有1～4个碳原子并与一共同的氨基相连。常用的二(C1-C4)烷氨基包括二甲氨基、乙基甲基氨基、甲基异丙基氨基、叔丁基异丙基氨基、二叔丁基氨基等。
术语“C2-C6链烷酰基”表示有1～5个碳原子并连有一羰基的直链或支链的烷基链。常用的C2-C6链烷酰基包括乙酰基、丙酰基、异丙酰基、丁酰基、叔丁酰基、戊酰基、己酰基、3-甲基戊酰基等。
术语“N-(C1-C4)烷基氨基甲酰基”表示有1～4个碳原子并与氨基甲酰基的氮原子相连的直链或支链的烷基链。常用的N-(C1-C4)烷基氨基甲酰基包括N-甲基氨基甲酰基、N-乙基氨基甲酰基、N-丙基氨基甲酰基、N-异丙基氨基甲酰基、N-丁基氨基甲酰基、N-叔丁基氨基甲酰基等。
术语“杂环”是指饱和的并由碳原子和1-3个选自氮、氧或硫的杂原子构成的未被取代的或取代的稳定的五～七元单环或七～十元双环杂环，其中杂原子氮和硫可以任意地被氧化，并且杂原子氮可以任意地季铵化。该杂环可以连接在提供稳定结构的任何杂原子或碳原子上。该杂环是未被取代的，或者被1、2或3个独立地选自以下基团的取代基所取代：卤素、羟基、三氟甲基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羧基、C1-C4烷氧羰基、氨基甲酰基或氨基。
术语“不饱和的杂环”是指有1个或多个双键并由碳原子和1-3个选自氮、氧或硫的杂原子构成的未被取代的或取代的稳定的五～七元单环或七～十元双环杂环，其中杂原子氮和硫可以任意地被氧化，并且杂原子氮可以任意地季铵化。该不饱和的杂环可以连接在提供稳定结构的任何杂原子或碳原子上。该不饱和的杂环是未被取代的，或者被1、2或3个独立地选自以下基团的取代基所取代：卤素、羟基、三氟甲基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羧基、C1-C4烷氧羰基、氨基甲酰基或氨基等。
上述杂环和不饱和杂环的实例包括哌啶基、哌嗪基、氮杂_基、吡咯基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑基、吡唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、噁唑基、噁唑烷基、异噁唑基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑基、噻唑烷基、异噻唑基、奎宁环基、异噻唑烷基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、噻二唑基、苯并吡喃基、苯并噻唑基、呋喃基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、噻吩基、苯并噻吩基、硫杂吗啉基、硫杂吗啉基亚砜、硫杂吗啉基砜、噁二唑基、三唑基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、3-甲基咪唑基、3-甲氧基吡啶基、4-氯喹啉基、4-氨基噻唑基、8-甲基喹啉基、6-氯喹喔啉基、3-乙基吡啶基、6-甲氧基苯并咪唑基、4-羟基呋喃基、4-甲基异喹啉基、6，8-二溴喹啉基、4，8-二甲基萘基、2-甲基-1，2，3，4-四氢异喹啉基、N-甲基喹啉-2-基、2-叔丁氧基羰基-1，2，3，4-四氢异喹啉-7-基等。
术语“芳基”表示未被取代的或被1、2或3个独立地选自以下基团的取代基所取代的苯基或萘基：卤素、羟基、三氟甲基、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、羧基、C1-C4烷氧羰基、氨基甲酰基、氨基或吗啉代(C1-C4)烷氧基。常用的芳基包括4-甲基苯基、3-乙基萘基、2，5-二甲基苯基、8-氯萘基、3-氨基萘基、4-羧基苯基等。
术语“氨基酸侧链”是指与键合一羧基和一氨基的α-碳原子键合的不同的原子或基团。所述侧链系选自在20个天然存在的氨基酸上存在的侧链。
术语“氨基酸残基”在其定义之内包括天然存在的氨基酸和其相应位置异构体以及其变体。常用的位置异构体和变体包括2-氨基己二酸(Aad)、3-氨基己二酸(bAad)、β-氨基丙酸(bAla)、2-氨基丁酸(Abu)、4-氨基丁酸(4Abu)、6-氨基己酸(Acp)、2-氨基庚酸(Ahe)、2-氨基异丁酸(Aib)、3-氨基异丁酸(bAib)、2-氨基庚二酸(Apm)、2，4-二氨基丁酸(Dbu)、锁链赖氨素(Des)、2，2′-二氨基庚二酸(Dpm)、2，3-二氨基丙酸(Dpr)、N-乙基甘氨酸(EtGly)、N-乙基天冬酰胺(EtAsn)、羟基赖氨酸(Hyl)、别羟基赖氨酸(aHyl)、3-羟基脯氨酸(3Hyp)、4-羟基脯氨酸(4Hyp)、异锁链赖氨素(Ide)、别异亮氨酸(alle)、N-甲基甘氨酸(MeGly)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、N-甲基赖氨酸(Melys)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、鸟氨酸(Orn)、氰基丙氨酸(CA)、γ-羧基谷氨酸盐、O-磷酸丝氨酸、α-萘基丙氨酸(NA)、β-萘基丙氨酸(bNA)、S-半乳糖基半胱氨酸、甘氨酰胺、N-甲酰基蛋氨酸、酪氨酸-O-硫酸盐等。所述氨基酸残基可以为D构型或L构型。除非另有说明，否则提到的氨基酸是指L构型。
本申请中应用的术语“蛋白酶”是指在某些蛋白质底物中减弱或破坏肽键的蛋白水解酶。术语“溶酶体蛋白酶”是指特征地在细胞的溶酶体内发现的那些蛋白酶。本申请中应用的术语“天冬氨酰蛋白酶”是指一组通常在酸性条件下作用的胃蛋白酶族系的蛋白水解酶。天冬氨酰蛋白酶的存在通常限于身体的特定部位，例如胃、细胞溶酶体。天冬氨酰蛋白酶分成EC3.4.23。对于本发明来说具有特别兴趣的是组织蛋白酶D是作用于细胞溶酶体的天冬氨酰蛋白酶。天冬氨酰蛋白酶(包括组织蛋白酶D)的性质和作用已由Tang和Wong(上述文献)叙述，将其全文公开收编在本申请中作为参考。
本申请中应用的术语“蛋白酶抑制剂”是指具有抑制蛋白酶作用的任何化合物、分子或物质。具体地讲，本发明所述的细胞蛋白酶抑制剂具有抑制涉及或导致APP在细胞内加工成βAP的细胞蛋白酶的作用。同样，天冬氨酰蛋白酶抑制剂具有抑制涉及或导致在细胞内将APP加工成βAP的天冬氨酰蛋白酶的作用，组织蛋白酶D抑制剂具有抑制组织蛋白酶D的作用。据信主要导致βAP产生的细胞蛋白酶是天冬氨酰蛋白酶，更具体地说是组织蛋白酶D。按照本发明的选择方法，可以选出合适的天冬氨酰蛋白酶抑制剂。一般来讲，有关天冬氨酰蛋白酶抑制剂，尤其是组织蛋白酶D的综述请参见Rich，“Inhibitors of Aspartic proteinases”(同上述)，将其全文公开收编在本申请中作为参考。
术语“4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基衍生物”是指下式化合物，
Figure A9410952700331
式中i和R1的定义同上述式I中的定义。Statine(4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基)缩写为(Sta)，其中i为1，并且R1为异丙基。4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸残基缩写为(AHPPA)，其中i为1，并且R1为苯基。
优选的天冬氨酰蛋白酶抑制剂为组织蛋白酶D抑制剂。优选的组织蛋白酶D抑制剂是式I和式II化合物。
虽然上述公开的式I和式II化合物的各种变化的所有组合提供了具有抑制天冬氨酰蛋白酶(如组织蛋白酶D)能力的化合物，但是其中某些化合物用于抑制天冬氨酰蛋白酶是优选的。
关于式I化合物，优选的是下述化合物或其可药用盐，其中i为1；
R1为-CH(CH3)2或苯基；
W为
Figure A9410952700341
其中R3W为氢或-B-X-Ro，其中B为-C(O)-或-S(O)2-；X为-(CH2)x-或-(CH2)m-O-(CH2)n-，其中g为0；m和n独立地为0、1或2；Ro为C1-C6烷基、芳基或不饱和的杂环；
R2为氨基酸侧链、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2(CH2)2CH3、-CH2CN或-CH2-R2a，其中R2a为芳基；
R为
Figure A9410952700351
，或
Figure A9410952700353
其中
R4w为氨基；
Y为苯基；和
R3a为-C(O)NH(叔丁基)；条件是如果R为那么j为2。
在这些优选的式I化合物中，特别优选的化合物是下述化合物或其可药用盐，其中B为-C(O)-；
m为1；
Ro为甲基、苯基、吡啶基或喹啉基；
R2为-CH(CH3)2、-CH2CH2CH3或-CH2-R2a，这里R2a为萘基；和
R为
Figure A9410952700361
或
Figure A9410952700362
这里R4W为氨基。
最优选的式I化合物是下述化合物或其可药用盐：
CH3C(O)-bNA-Val-Sta-Leu-bNA-NH2；
CH3C(O)-NA-Nva-Sta-Nva-NA-NH2；
CH3C(O)-NA-Nva-AHPPA-Nva-NA-NH2；
CH3C(O)-NA-Val-Sta-Abu-NA-NH2；和
NA-Val-AHPPA-Leu-NA-NH2；
如以上所述，优选的组织蛋白酶D抑制剂包括下述化合物或其可药用盐，该化合物与βAP的羧基末端极为相似，并且包含至少1个4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基或其衍生物，优选在类似于βAP羧基末端的氨基酸41或42的位置。因此，优选的式II化合物是下述化合物或其可药用盐，其中f为3或4。
在这些优选的式II化合物中，更优选的是下述化合物或其可药用盐，
R7-Gly-(R8)f-(R8)′-(R8)″-Thr-OH其中f为1或2；
R8各自独立地为氨基酸残基；
(R8)′为Ile、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基或其衍生物；
(R8)″为Ala、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基或其衍生物；条件是至少(R8)′和(R8)″中之一必须为4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基或其衍生物。
在这些更优选的式II化合物中，最优选的式II化合物是下述化合物或其可药用盐，
CH3C(O)-Gly-Val-Val-Sta-Ala-Thr-OH；and
Gly-Val-Val-Sta-Ala-Thr-OH；
用于本发明方法的式I和式II的肽类化合物可以按典型的麦瑞菲尔德(Merrifield)的分步固相肽合成法进行合成。各步反应如制备被保护的氨基酸、色谱法、茚三酮试验等的详细叙述请见Stewart和Young(1984)：Solid Phase Peptide Synthesis Second Edition(Pierce Chemical Company)。
肽的合成由第一个被保护的氨基酸与树脂(如对甲基-二苯甲基胺树脂)偶联而开始。各个叔-Boc-氨基酸按下法加入：加入约1～约4当量，优选2.5当量叔-Boc-氨基酸到树脂上。在加入叔-Boc-Sta或叔-Boc-AHPPA时，通常仅应用1～约1.5当量，优选1.25当量。按照Hui等(1987)：J.Med.Chem.30：1287-1295和Boger等(1985)：J.Med.Chem.28：1779所述方法，实质上可以制得权-Boc-Sta、叔-Boc-AHPPA以及其他的4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基衍生物。在下面实施例36-48将详述该方法。
茚三酮试验可用于检验游离氨基的存在。茚三酮试验可按下法进行：加1滴70％酚的醇(如乙醇，EtOH)溶液到肽/树脂混合物的样品中，然后加1滴吡啶溶液(含有0.0002M氰化钾(KCN))，接着再加1滴茚三酮溶液(0.28M乙醇溶液)。然后将得到的试验混合物加热至110℃并保持2分钟。兰色或琥珀色指示有游离的氨基存在，而淡黄色指示没有游离的氨基存在。
另外，茚三酮试验可以用肽/树脂混合物的小量等分试样进行，其方法是：首先用5％三乙胺(Et3N)的二氯甲烷(CH2Cl2)溶液将该混合物洗涤2次，然后用CH2Cl2洗涤3次，再在减压下将混合物浓缩，得到干燥的固体树脂。在试管中，使2～5mg该固体与0.1ml KCN(用Amberlite MB-3处理，以便除去氨)、0.04ml茚三酮和0.05ml酚(也用MB-3处理)混合。将得到的溶液加热至100℃并保持约10分钟，然后于冷水(H2O)中冷却并与1ml 60％EtOH混合。所得到的反应溶液经混合并通过玻璃棉塞过滤。试管用0.2ml 0.5M氯化四乙基铵的二氯甲烷(CH2Cl2)溶液漂洗2次，然后合并滤液与漂洗液，并加入60％ EtOH溶液将其稀释至2.0ml。以试剂空白为对照，于570nm处读出吸光度。淡色指示高百分比的偶联。茚三酮试验系由以下文献修改得到的：Steward和Young：同上；Kaiser等(1970)：Anal.Biochem.，34：595。
式I化合物或它们的前体可以用本技术领域已知的方法制得。除非在特定的反应中另有说明，否则溶剂选择不是关键性的，只要所立用的溶剂对进行的反应呈惰性，并且反应物能充分地溶解以便进行所需要的反应。更具体地说，式I化合物可以按下述反应I制备，
Figure A9410952700391
其中W为
Figure A9410952700392
R为
Figure A9410952700401
并且R1、R3W、R2、i和j的定义同上。
                     反应I其中J为卤化物、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对-甲苯磺酸盐、乙酸盐或三氟乙酸盐，并且W、R3W、R2、j、i和R1的定义同上。
以上反应I可以按下法进行：在偶合剂存在下，在有或无增进剂存在(优选在增进剂存在)下，使式Ia化合物与式W-OH化合物偶合。相对于反应物环氧乙烷，反应物羧酸通常使用约等摩尔比例～约3摩尔(3M)过量，优选为约2M过量。相对于反应物羧酸，偶合剂的用量通常为约等摩尔比例～略过量。适用于该方法的常用的溶剂包括二甲基甲酰胺(DMF)或四氢呋喃(THF)或DMF/THF混合液。当反应在约-15℃～反应混合物的回流温度进行时，反应通常基本上在约1～72小时后完成。该反应优选在约0C～约30℃温度下进行约24～48小时。优选的增进剂是羟基苯并三唑水合物(HOBT·H2O)。偶合剂的典型实例有碳化二亚胺类如N，N′-二乙基碳二亚胺、二环己基碳二亚胺(DCC)；咪唑类如羰基二咪唑，以及试剂如1-羟基苯并三唑甲磺酸盐、N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉(EEDQ)、苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)、O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基铀六氟磷酸盐(HBTU)和苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)。优选的偶合剂为BOP。反应I在下面实施例1中举例说明。
一旦反应完成之后，产物可用本技术领域已知的方法(例如过滤)分离出来，或者通过萃取、蒸发或滗析除去反应溶剂。如果需要，产物可以用一般的方法，例如结晶或在固体载体(如硅胶或氧化铝)上进行色谱法进一步纯化。
用于上面反应I中的式Ia化合物可以按下示反应路线IA进行制备，
                       反应路线IA：
Figure A9410952700421
Figure A9410952700431
上示反应路线IA可以按顺序通过反应1～7完成。一旦一步反应完成之后，中间体化合物可以按上述本技术领域已知的方法进行分离和/或纯化。反应路线IA在下面制备例1中举例说明。
在反应IA.1中，所述反应是使2，2-二甲基-4，5-二环氧乙烷-1，3-二氧戊环与式R-(CH2)1-1-Z亲核试剂于公共的惰性溶剂中反应，其中Z为卤化镁或锂。优选的亲核试剂为溴化镁。用铜盐例如碘化铜(I)(CuI)或溴化铜(I)(CuBr)进行催化，可以得到较好的结果。相对于反应物环氧乙烷，通常应用的亲核试剂的量为约等摩尔比例～约2M过量，优选为约0.5M过量。适用于该反应的常用的溶剂包括有机溶剂如乙醚(Et2O)或THF。当反应在约-40℃～约10℃进行时，该反应实质上通常在约1～24小时后完成。该反应优选在约-5℃～约5℃进行约2-6小时。
在反应IA.2中，该反应是使反应IA.1中制备的化合物与甲磺酰氯在公共的惰性溶剂中进行反应。应用的甲磺酰氯的量通常为约等摩尔比例～约3M过量，优选约2M过量。为了促进该反应，可以任选加入碱(例如2，6-二甲基吡啶或三烷基胺如Et3N或二异丙基乙基胺等)。该反应优选的碱是三烷基胺类，尤其是Et3N。适用于该反应的常用的溶剂包括非质子传递性的有机溶剂，如CH2Cl2或氯仿(CHCl3)。当反应在约0℃～反应混合物的回流温度进行时，该反应实质上通常在约15分钟～24小时后完成。该反应优选在约15℃～约30℃的温度下进行约15分钟～4小时。
在反应IA.3中，该反应是使反应IA.2中制得的化合物与叠氮化物离子在公共的惰性溶剂中进行反应。用于该步反应的叠氮化物离子可以由无机盐类如碱金属叠氮化物(例如叠氮化锂)，或由有机盐类如四甲基鈲叠氮化物制得。该叠氮化物离子的用量一般为约等摩尔比例～约3M过量，优选为约2M过量。通过加入碱如2，6-二甲基吡啶，可以提高产率。适用于该方法的常用的溶剂包括任何有机溶剂如六甲基磷酰三胺(HMPA)、DMF或N，N′-二甲基亚丙基脲(DMPU)。当反应在约0℃～反应混合物的回流温度进行时，该反应实质上通常在约1～24小时后完成。该反应优选在约25℃～约100℃反应约4～12小时。
在反应IA.4中，该反应是使反应IA.3中制得的化合物与强酸于醇溶剂如甲醇(MeOH)或乙醇(EtOH)中反应。适用于该反应的常用的酸包括氢卤酸如盐酸(HCl)或氢溴酸(HBr)、硫酸(H2SO4)等。优选的酸是氢卤酸，尤其是盐酸。通常应用大量过量的酸，例如约10M过量～约20M过量的反应物酸。当反应在约0℃～约40℃进行时，反应实质上通常在约1～24小时之后完成。该反应优选在约20℃～约30℃进行约2-4小时。
在反应IA.5中，该反应按实质上与反应IA.2所述类似的方法进行：使甲磺酰氯与在反应IA.4中制得的化合物反应，所不同的是相对于反应物甲磺酰氯，在反应IA.4中制得的化合物通常的用量约为等摩尔比例～约1M过量。
在反应IA.6中，通过碱催化的环化反应，优选使反应IA.5中制得的化合物与醇盐离子于合适的溶剂中反应，形成环氧乙烷环。醇盐离子可由铵或碱金属醇盐等得到。对于该反应优选的醇盐离子是甲醇钠(NaOMe)和甲醇钾(KOMe)。适用于该方法的常用的溶剂包括任何有机溶剂如MeOH或THF。当反应在约0℃～约40℃进行时，该反应实质上通常在约1～12小时之后完成。该反应优选在约20℃～约30℃进行约1～2小时。
在反应IA.7中，通过催化氢化反应，优选通过使反应IA.6中制备的化合物与氢气(H2)在乙酸(HOAc)和催化剂钯-炭(Pd/C)存在下进行反应，将叠氮基取代基还原为相应的胺。适用于该反应的常用的溶剂包括任何有机溶剂如乙酸乙酯(EtOAc)。当反应在约0℃～约40℃进行时，该反应实质上通常在约1～24小时之后完成。该反应优选在约20℃～约30℃进行约2-5小时。
另外，叠氮基取代基还原为相应胺的反应可以按下法进行。使反应IA.6中制得的化合物与三烷基或三芳基膦于含水乙酸存在下反应。优选的反应物膦是三丁基膦。适用于该反应的常用的有机溶剂包括混合溶剂，如EtOAc/含10％水的乙腈(CH3CN)。当反应在约0℃～约40℃进行时，该反应实质上通常在约1～12小时之后完成。反应优选在约20℃～30℃进行约0.5～2小时。
下述式I化合物可以由下面的反应II制备，其中
W为
Figure A9410952700471
R为
Figure A9410952700472
和
R1、R3W、R2、i和j的定义同上。
                        反应II
Figure A9410952700473
Figure A9410952700481
其中j为卤化物、甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、乙酸盐或三氟乙酸盐，和
W、R3W、R2、j、i和R1的定义同上。
上述反应II可以按下法进行：使式Ia′化合物与式W-OH化合物在偶合剂存在下，并于有或无增进剂存在下实质上按上述反应I所述方法进行偶合。反应II在下面实施例33-35中举例说明。
另外，所述这些二醇类可以由以上反应I中制得的环氧化合物在含水的酸性条件下反应制备。所述二醇还可以作为环氧化物反应的副产物分离出来。
用于以上反应II的式Ia′化合物，实质上可以按反应IA.7所述方法，通过还原以上反应IA.4中制得的叠氮基中间体来制备。该方法在下面制备例12中举例说明。
Figure A9410952700482
                   (Ia′)
式W-OH化合物可以按下法制备：实质上按照上述反应I中所述的方法，首先偶合具有通式H2N-CH(R2)-COOH的2个氨基酸，其中R2各自独立地为以上式I中定义的R2取代基中的一个；在W-OH中，
W为
Figure A9410952700491
j为2。
然后用本技术领域已知的方法脱去氨基保护基，并且将得到的二肽化合物进行酰化，或者与一化合物偶合，得到具有下式的化合物，
第2次偶合反应实质上可以按反应I中所述的方法进行。酰化反应可以通过与合适的酰基卤、异氰酸酯或氯甲酸酯反应来完成，酰化反应优选在酸清除剂如叔胺，优选在Et3N存在下进行。酰化反应在约-20℃～约25℃进行。适用于该反应的常用的溶剂包括醚类和氯代烃类，优选是Et2O、CHCl3或CH2Cl2。
式W-OH化合物还可以按下法制备：由合适取代的羧基保护的氨基酸与三光气反应，然后再使所得到的化合物与式R3W-H化合物反应，其中R3W的定义同上。该方法在下面制备例2中举例说明。
首先，使反应物羧基保护的氨基酸在公共的惰性溶剂中与三光气反应。相对于三光气，通常应用的反应物羧基保护的氨基酸的量为约等摩尔比例～约2M过量，优选约1M过量。为了促进该反应，可以加入碱，如三烷基胺，例如Et3N或二异丙基乙基胺。适用于该反应的常用的溶剂包括任何有机溶剂如甲苯。当反应在约25℃～反应混合物的回流温度进行时，反应实质上通常在约6～24小时之后完成。该反应优选在约80℃～反应混合物的回流温度进行约8～12小时。
然后将生成的化合物与式R3W-H化合物在公共的惰性溶剂中反应，用铜盐如CuI或CuCl进行催化，可以得到较好的结果。相对于式R3W-H化合物，通常应用的所生成的化合物的量为约等摩尔比例～约1M过量。适用于该反应的常用的溶剂包括任何有机溶剂如DMF或CH3CN。当该反应在约10℃～约40℃进行时，反应实质上通常在约15分钟～3小时之后完成。该反应优选在约15℃～约30℃进行约15分钟～2小时。
应用本技术领域已知的方法，例如将所述酯水解为相应的式W-OH的羧酸，可以将所得到的化合物上的羧基脱去保护。所述酯的水解可以由所得到的化合物与强酸在公共的惰性溶剂中进行简单的反应来完成。适用于该反应的常用的溶剂包括任何有机溶剂如二噁烷。当该反应在约25℃～反应混合物的回流温度进行时，反应实质上通常在约15分钟～4小时之后完成。该反应优选在约60℃～约100℃进行约15分钟～1小时。
另外，应用催化氢化反应，优选使得到的化合物与甲酸铵和Pd/C催化剂一起于醇溶剂(如MeOH或EtOH)中进行反应，可以脱去羧基保护基。当该反应在约0℃～反应混合物的回流温度进行时，反应实质上通常在约1～4小时之后完成。该反应优选在回流温度下进行约2～5小时。
最后，式W-OH化合物可以按下法制备：使合适取代的羧基保护的氨基酸与1，1′-羰基二咪唑反应，然后使生成的化合物与式R3W-H化合物基本上按上述方法进行反应。
具体地说是将反应物羧基保护的氨基酸首先与1，1′-羰基二咪唑于公共的惰性溶剂中反应。相对于反应物羧基保护的氨基酸，通常应用的反应物1，1′-羰基二咪唑的量为约等摩尔比例～约2M过量，优选为约等摩尔比例。适用于该反应的常用的溶剂包括任何普通的有机溶剂，如CH3CN。当反应在约15℃～30℃进行时，反应实质上通常在约15分钟～2小时之后完成。反应优选在约20℃～约25℃进行约15分钟～1小时。
然后使生成的化合物与式R3W-H化合物在公共的惰性溶剂中基本上按上述方法进行反应。应用上述方法可以脱去羧基保护基。
式I化合物，其中R为
Figure A9410952700511
或 ；和
W、R1和i的定义同上，可以按下示的反应III制备，
                    反应III
Figure A9410952700521
其中R、W、R1、i、R3a、R3b、A、Y和Y1的定义同上。
上示的反应III可以由式W-OH化合物与式Ib化合物偶合来完成。该偶合反应实质上按上述反应I中所述方法进行。优选的增进剂为HOBT·H2O。优选的偶合剂是DCC。反应III在实施例6中举例说明。
其中j为2的式I化合物可以按下法制备：首先使式Ib化合物与式Rb-NH-CH(R2)-COOH的氨基保护的氨基酸(其中Rb为氨基保护基；R2的定义同上)进行偶合。该反应实质上可按照上述反应I的偶合反应进行。
将生成的化合物脱去保护，然后与式R3W-H化合物于公共的惰性溶剂中反应。用铜盐如CuI或CuCl进行催化，可以得到较好的结果。相对于式R3W-H化合物，通常应用的生成的化合物的量为约等摩尔比例～约1M过量。适用于该反应的常用的溶剂包括任何有机溶剂如DMF或CH3CN。当该反应在约10℃～约40℃进行时，反应实质上通常在约15分钟～3小时之后完成。该反应优选在约15℃～约30℃进行约15分钟～2小时。
另外，可以将生成的化合物脱去保护，然后用合适的酰基卤、异氰酸酯或氯甲酸酯进行酰化，用合适取代的磺酰卤进行磺酰化，或用反应物合适取代的羧酸进行偶合，得到式I化合物。
其中R为下式的式Ib化合物可以按下示反应路线IIIA的方法进行制备。
Figure A9410952700531
                   反应路线IIIA其中Rb为氨基保护基；和
R1、R3a和Y的定义同上。
反应路线IIIA可以按反应1-6的顺序进行。一旦反应完成，如果需要，可以将中间体化合物按上述本技术领域已知的方法进行分离和/或纯化。
在反应IIIA.1中，反应通常按下法进行：按照本技术领域已知的方法和条件，通过与亚硫酰氯、亚硫酰溴、三氯化磷、三溴化磷、五溴化磷或五氯化磷反应，将合适取代的芳基或不饱和的杂环羧酸活化，即将其转变为相应的酰基氯或酰基溴。合适的芳基、杂环或不饱和的杂环羧酸化合物是市场上可以买到的，或者可按本技术领域已知的一般方法进行制备。
在反应IIIA.2中，在非极性的非质子传递溶剂或溶剂的混合物中，于有或无酸清除剂存在的情况下，使反应IIIA.1中制得的酰基氯或酰基溴与氨或具有下式的伯胺或仲胺反应，得到相应的酰胺，
               H-NR4R4，，或
Figure A9410952700542
其中R4、R5、R6及p的定义同上。该反应通常在约-20℃～约25℃进行。该反应常用的溶剂包括醚类和氯代烃类，优选Et2O、CHCl3或CH2Cl2。优选该反应在有酸清除剂如叔胺(优选Et3N)的存在下进行。
在反应IIIA.3中，使反应IIIA.2中制得的酰胺与强碱于加溶剂存在下进行反应，得到相应的阴离子，然后使该阴离子在反应IIIA.4中与Weinreb酰胺反应，得到一酮。反应IIIA.3在非质子传递溶剂中，于约-78℃～约0℃进行，用于反应IIIA.3的常用的碱包括氨基化锂碱类和烷基锂碱类，优选C1-C4烷基锂碱类和二(C1-C4)烷氨基化锂碱类。反应3常用的加溶剂有四甲基(C1-C4)亚烷基二胺类，优选四甲基亚乙基二胺。反应IIIA.4在非质子传递溶剂中于约-80℃～约-40℃进行。反应IIIA.3和IIIA.4常用的溶剂包括醚类，优选THF。在反应IIIA.4中，相对于反应物Weinreb酰胺，通常应用的阴离子的量为约等摩尔比例～约3M过量，优选约2M过量。
在反应IIIA.5中，用合适的还原剂使反应IIIA.4中制得的酮还原为相应的醇。该反应在质子传递性溶剂中于约-25℃～约25℃进行。该反应常用的还原剂包括硼氢化钠、硼氢化锂、氢化二异丁基铝和氢化双(2-甲氧基乙氧基)铝钠。优选的还原剂是硼氢化钠。该反应常用的质子传递性溶剂包括醇类，优选EtOH。反应IIIA.6是普通的氨基脱保护反应，可以用本技术领域已知的操作和方法进行，得到相应的式Ib胺，然后将式Ib胺用于以上反应III中。该胺可以不经纯化进行反应，但是优选首先将其纯化。
其中R为下式的式Ib化合物可以按下面反应路线IIIB中所示方法进行制备，
                         反应路线IIIB
Figure A9410952700562
Figure A9410952700571
其中Rb、R1、Y和R3b的定义同上。
上示的反应路线IIIB可以按反应1～7的顺序进行。一旦反应完成，可以按上述本技术领域已知的方法将中间体化合物进行分离和/或纯化。
在反应IIIB.1中，在一般的条件下用本技术领域已知的氨基保护基将合适取代的芳基或不饱和的杂环胺进行保护。反应IIIB.2-5实质上可按以上反应路线IIIA.3-6所述的方法进行，但在反应路线IIIB中，需要进行另外的脱保护反应(反应IIIB.5)，以便脱去在反应IIIB.1中引入的氨基保护基。按本技术领域已知的方法，这是一般的氨基脱保护反应。例如应用强酸，优选CF3CO2H可以脱去在反应IIIB.1中所示的t-Boc基团。
在反应IIIB.6中，最好于酸清除剂如叔胺(优选Et3N)存在下，将所示中间体用合适的酰基卤、异氰酸酯或氯甲酸酯进行酰化。该反应在约-20℃～约25℃进行。该反应常用的溶剂包括醚类和氯代烃类，优选Et2O、CHCl3或CH2Cl2。
按本技术领域已知的方法，反应IIIB.7是一般的氨基脱保护反应，得到相应的式Ib胺，然后将式Ib胺用于以上反应III。该胺可以不经纯化进行反应，但优选首先进行纯化。
其中R为下式的式Ib化合物可以按下示反应路线IIIC的方法制备，
                     反应路线IIIC
Figure A9410952700582
Figure A9410952700591
其中R1、R3a、Rb和Y1的定义同上，及G为卤素。
上示的反应路线IIIC可以按反应1～7的顺序进行。一旦反应完成，如果需要，可以将中间体化合物按以上反应I所述的本技术领域已知的方法进行分离和/或纯化。该反应在下面制备例9中举例说明。
反应IIIC.1按下法进行：在本技术领域已知的条件下使具有以下结构的反应物氨基保护的羧酸进行活化，即转变为相应的混合酸酐，例如可使反应物氨基保护的羧酸优选在酸清除剂存在下与C1-C6氯甲酸烷基酯(如氯甲酸异丁基酯)进行反应。优选的酸清除剂是三烷基胺类，优选Et3N。该反应通常在非质子传递溶剂(如EtOAc)中进行。优选将得到的混合酸酐不经分离或纯化用于反应IIIC.2中。
反应IIIC.2分2步进行。首先，将用一层醚溶剂(优选Et2O)覆盖的氢氧化钠(NaOH)溶液与大量过量的N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍反应，生成反应物重氮甲烷。氢氧化钠优选以约4～6MNaOH水溶液应用。一旦该反应基本上完成，将有机层经干燥剂如KOH干燥。然后使该溶液与由以上反应IIIC.1得到的混合酸酐进行反应，生成相应的α-重氮基羰基化合物。反应物重氮甲烷优选以未经分离或纯化的形式用于该反应。该反应通常在约-50℃～约-20℃，优选的-30℃进行。
在反应IIIC.3中，使在反应IIIC.2中制备的α-重氮羰基化合物在非质子传递溶剂如Et2O中与式H-G酸反应(其中G为卤素)，生成α-卤素羰基化合物。优选的反应物酸是提供相应的α-氯羰基化合物的HCl。该反应通常在约-30℃～约0℃进行。该反应物酸通常以干燥的气体形式以少量增加的方式加入，直至反应基本完成。该反应可用薄层色谱法(TLC)监控。
在反应IIIC.4中，将反应IIIC.3中制备的化合物上的羰基用本技术领域已知的一般方法进行还原，生成相应的α-氯羟基化合物。例如，将反应IIIC.3中制备的化合物于溶剂混合物中与还原剂进行反应。常用的还原剂包括硼氢化钠、硼氢化锂、硼氢化锌、氢化二异丁基铝和氢化双(2-甲氧基乙氧基)铝钠。优选的还原剂是硼氢化钠。常用的溶剂混合物包括质子活泼的和对质子呈惰性的混合液如THF/H2O。该反应通常在约-10℃～约10℃，优选约0℃进行。
在反应IIIC.5中，将反应IIIC.4中制得的α-氯羟基化合物在本技术领域已知的一般条件下用强碱处理，生成相应的环氧化物。例如，可以将α-氯羟基化合物与KOH/EtOH混合物于醇溶剂(如EtOH)中进行反应。反应通常在约0℃～约溶剂的回流温度下进行。优选该反应在室温下进行。
在反应IIIC.6中，使反应IIIC.5中制得的环氧化物与下式的杂环反应物进行反应，反应是在质子传递溶剂中于约70℃～100℃进行。该反应常用的溶剂包括醇类，优选EtOH。该反应优选在约80℃进行。
Figure A9410952700611
反应IIIC.7是一般氨基脱保护反应，可按本技术领域已知操作和方法进行，得到相应的式Ib胺，然后将其用于以上反应III中。该胺可不经纯化用于反应，但优选首先将其纯化。
用作反应IIIA.4和IIIB.3中反应物的Weinreb酰胺可以按下法制备：使氨基保护的氨基酸与N-甲氧基-N-甲基胺于增进剂、酸清除剂和偶合剂存在下进行反应。该反应在非质子传递溶剂或溶剂混合物中于约-25℃～25℃进行。该反应优选的增进剂是HOBT·H2O。优选的酸清除剂是叔烷基胺类，优选Et3N或N-甲基吗啉(NMM)。优选的偶合剂是乙基二甲氨基丙基碳化二亚胺盐酸盐。该反应提供的Weinreb酰胺优选在用于反应IIIA.4和IIIB.3之前将其进行分离。
其中R1为-S-R1x(这里R1x为芳基或环己基)的式Ib化合物可以应用反应IIIA.4和IIIB.3中具有以下结构的Weinreb酰胺进行制备，
Figure A9410952700612
该Weinreb酰胺可以按下法制备：首先使氨基保护的丝氨酸与三苯基膦和偶氮二羧酸二乙基酯(DEAD)在非质子传递溶剂中于约-80℃～0℃进行反应，生成相应的β-内酯。该反应通常在醚如THF中于约-80℃～-50℃进行。然后将该内酯与合适取代的具有结构-S-R1(其中R1的定义同上述式I)的硫阴离子(thioanion)反应，使该内酯环打开，得到具有以下结构的化合物，该硫阴离子化合物优选通过相应的硫醇与强碱(如氢化钠或氢化钾)反应生成。该反应通常在非质子传递溶剂中于约0℃～约40℃并在惰性气氛(如氮气)下进行。该反应常用的溶剂包括醚类，优选THF。然后使生成的反应物羧酸与N-甲氧基-N-甲基胺在增进剂、酸清除剂和偶合剂存在下基本上按以上所述的方法进行反应，生成所需要的反应物酰胺。
下述式Ib化合物可以按本技术领域已知的方法制备，其中R为
Figure A9410952700622
A为
Figure A9410952700631
；和
R3a和Y1的定义同上。
在制备上述化合物中一个可能特别有用的参考文献是R.Herranz等(1990)：J.Org.Chem.，55，p2232-2234。
用于以上反应IIIC.6中具有下式的杂环反应物可以用本技术领域已知的方法制备，
Figure A9410952700632
例如，该杂环反应物通常由相应的氨基保护的氨基酸经酸活化反应，接着用烷基胺处理来制备。该反应通常在酸清除剂如NMM存在下进行。然后应用一般的化学脱保护的方法脱去氨基保护基，得到用于上述反应C.8的杂环反应物。具体地说，[3S-(3R*，4aR*，8aR*)]-十氢异喹啉-3-N-叔丁基甲酰胺可以用(2S)-1，2，3，4-四氢-3-异喹啉羧酸按以下方法制得：
1)氨基保护(叔-Boc)；
2)酸活化反应/与叔丁胺反应；
3)催化氢化；
4)氨基脱保护。
用于反应III中市场上买不到的式W-OH化合物可以用已知的方法制备。更具体地说，式W-OH化合物可以按以上反应路线IA所述的方法制备，其中
W为
式W-OH化合物可以按下面反应路线IV所示的方法制备，其中W为
                    反应路线IV
Figure A9410952700651
其中q、R2、R1w和R2W的定义同上：和
E*为碘或C1-C4烷氧羰基。
如果E*为碘，那么以上反应路线IV可按反应1～3的顺序进行。一旦反应完成，那么中间体化合物可以用以上所述本技术领域已知的方法进行分离和/或纯化。反应IV在制备例1D中举例说明。
如果E*为烷氧羰基，那么将反应IV.1中制备的中间体化合物按反应IV.3中所述的方法直接进行反应，反应IV.2是不需要的。
反应IV.1是一般的偶合反应，基本上可以按以上反应I所述的方法进行。该反应可通过使合适取代的氨基(RRoNH)与具有下式的化合物进行简单的反应而完成，
Figure A9410952700652
其中E*为碘或C1-C4烷氧羰基；和
R2和q的定义同上。该反应可在非极性的非质子传递溶剂或混合溶剂中，于有酸清除剂或无酸清除剂存在下进行，结果得到相应的酰胺。该反应常用的溶剂包括THF和DMF，优选THF。该反应在约-30℃～约25℃进行。在等摩尔量～略过量的偶合剂存在下，相对于反应物羧酸，通常应用的反应物胺为等摩尔比例的。
反应IV.2是反应IV.1中制备的化合物的羰基化反应，结果导致碘取代基被C1-C4烷氧羰基(优选甲氧羰基)代替。该反应是使从以上反应IV.2中得到的碘中间体、催化剂在一氧化碳气氛和在醇溶剂(优选MeOH)中进行简单的反应，得到所需化合物的烷基酯。该反应在酸清除剂(优选二环己胺)存在下进行。该反应在约0℃～约25℃进行。优选催化剂是氯化双(三苯基膦)钯(II)。
反应IV.3是一般的烷基酯水解反应，得到相应的反应物羧酸W-OH，然后可将羧酸W-OH用于上述反应III中。该反应按下法进行：使反应物烷基酯与氢氧化锂于合适的溶剂中进行反应，接着酸化反应溶液至pH2-3，得到所需式W-OH羧酸反应物，其中W为
Figure A9410952700661
常用的溶剂包括醚与水的混合液，优选THF/H2O混合液。该反应在约0℃～约35℃进行。相对于反应物酯，应用的反应物氢氧化锂通常为等摩尔比例～约2M过量，优选约1M过量。
熟悉本技术领域的专业人员明白，在实施上述方法时，引入化学保护基到反应物中以防止发生第二级反应是合乎需要的。任何胺、烷基胺或可能存在于反应物上的羧基可以用任何一般的氨基或羧基保护基进行保护，氨基或羧基保护基不会有害地影响分子的其余部分按所需方式进行反应的能力。优选的氨基保护基有叔-Boc和Cbz。优选的羧基保护基是二苯甲基、苄基和烯丙基。然后可用本技术领域已知的方法同时或依次地脱去各种保护基。
如以上所述，所有的不对称形式、各个异构体及其组合物均属于本发明的部分。所述异构体可以由它们的各个前体按以上所述方法，通过拆分外消旋混合物，或通过分离非对映体制得。拆分可以在拆解试剂存在下，用色谱法或多次结晶法，或用本技术领域已知的所述方法的某些组合来完成。有关拆分的其它详细情况可参见Jacques等(1981)：Enantiomers，Racemates，and Resolutions，John Wiley&Sons。
在合成本发明化合物中用作为起始原料的化合物是已知的，对于市场上买不到的可以容易地通过本技术领域常用的一般方法进行合成。
使式I化合物与等摩尔量或过量的酸或碱反应，通常可以生成本发明的可药用盐。通常将反应物在公共溶剂中进行反应，对于酸加成盐，溶剂为例如Et2O或苯，对于碱加成盐，溶剂为水或醇类。在约1小时～约10天内，盐通常从溶液中析出，并可通过过滤或其他常用的方法进行分离。
以下面的制备例和实施例进一步具体地叙述本发明。但是应该认识到，所述制备例和实施例仅是为了叙述的目的，从任何方面来说都无意限制本发明的范围，并且不应如此解释。
在下面制备例和实施例中，术语熔点、核磁共振谱、电子碰撞质谱、场解吸质谱、快速原子轰击质谱、红外光谱、紫外光谱、元素分析、高性能液相色谱和薄层色谱依次缩写为“m.p.”、“NMR”、“EIMS”、“MS(FD)”、“MS(FAB)”、“IR”、“UV”、“分析”、“HPLC”和“TLC”。此外，列出的IR光谱的最大吸收仅是主要的，而不是所有观察到的最大吸收。
应用与NMR谱有关的缩写是“s”表示单峰，“d”表示二重峰，“dd”表示双二重峰，“t”表示三重峰，“q”表示四重峰，“m”表示多重峰，“dm”表示双多重峰，“br.s”、“br.d”、“br.t”和“br.m”依次表示宽单峰、宽二重峰、宽三重峰和宽多重峰。“J”表示偶合常数(单位赫兹(Hz))。除非另有说明，否则NMR数据是指受试化合物的游离碱的测定结果。
NMR谱是用Brüker.Corp.的270MHz核磁共振仪或用GeneralElectric QE-300的300MHz核磁共振仪测得的。化学位移用δ值表示(以四甲基甲硅烷为内标，用低场ppm表示)。MS(FD)谱是用碳树枝晶发射体在Varian-MAT 731 Spectrometer上测定的。EIMS是用Consolidated Electrodynamics Corporation的CEC 21-110质谱仪测得的。MS(FAB)谱是用VG ZAB-3 Spectrometer测得的。IR谱是用Perkin-ELmer 281红外仪测得的。UV谱是用Cary118紫外仪测得的。TLC是用E.Merck硅胶板进行的。熔点(m.p.)未经校正。
                      制备例1
A.2，2-二甲基-4(R)，5(R)-双(1(R)-羟基-2-苯基乙基)-1，3-二氧戊环
在氮气(N2)下，向0.278g(1.46mmol)CuI的2ml二甲硫和22ml THF的冷(-40℃)溶液中加入14.6ml(43.8mmol)苯基溴化镁的24.6ml Et2O溶液。该溶液搅拌5-10分钟后，加入2.72g(14.6mmol)1，2∶5，6-二脱水-3，4-O-异亚丙基-D-甘露糖醇的12ml THF溶液。然后将反应混合物温至0℃，并使其反应2小时15分钟，此时缓慢地加入饱和氯化铵(NH4Cl)溶液。所得的溶液剧烈搅拌5分钟，然后转移到内含2∶1 Et2O和H2O混合液的分液漏斗中。所得的各层经分离，有机层在减压下浓缩至干。得到的物质再用柱色谱法(洗脱剂为2.5％丙酮的CH2Cl2溶液)纯化。将含所需产物的级分合并，并在减压下浓缩至干，得到4.07g油状物。1H NMR(CDCl3)：δ7.35(m，10)；3.78(m，4)；3.15(dd，2)；2.90(d，2)；2.70(m，2)；1.45(s，6).MS：m/e342(M+).
B.2，2-二甲基-4(R)，5(R)-双(1(R)-甲磺酰氧基-2-苯基乙基)-1，3-二氧戊环
将2.97ml(38.3mmol)甲磺酰氯的20ml CH2Cl2溶液加到5.47ml(39.3mmol)Et3N和6.4g(18.7mmol)制备例1A小标题中间体的20ml CH2Cl2的冷(0℃)溶液中。再使反应混合物温至室温。反应完成后(用TLC检查)，反应混合物倒入50ml 0.2NHCl和150ml Et2O的溶液中。所得的各层经分离，有机层用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后在减压下浓缩至干。得到的物质再用柱色谱法(洗脱剂为1∶1Et2O/己烷溶液)纯化。将含所需中间体的级分合并，并在减压下浓缩至干。产量：3.7g。1H NMR(CDCl3)：δ7.30(m，10)；4.88(m，2)；4.25(d，2)；3.10(m，4)；2.32(s，6)；1.52(s，6).MS：m/e499(M+＋1).
C.2，2-二甲基-4(R)，5(R)-双(1(S)-叠氮基-2-苯基乙基)-1，3-二氧戊环
将0.784g(16.0mmol)叠氮化锂、4.0g(14.6mmol)18-冠醚-6和1.7ml(14.6mmol)2，6-二甲基吡啶的溶液加到3.6g(7.2mmol)制备例1B小标题中间体的25ml N，N′-二甲基亚丙基脲溶液中。然后将反应混合物加热至95～100℃，并使其反应约7小时。反应完成后(用TLC检查)，反应混合物倒入200ml1∶1 0.1N HCl和Et2O的混合液中。所得的各层经分离，有机层用硫酸钠(Na2SO4)干燥，然后在减压下浓缩至干，得到2.8g油状物。该油状物用柱色谱法(用5～10％ CH2Cl2的甲苯溶液进行梯度洗脱)纯化，将含所需产物的级分合并，并在减压下浓缩至干，得到1.03g该小标题中间体。1H NMR(CDCl3)：δ7.30(m，10)；4.12(s，2)；3.22(t，2)；3.05(m，4)；1.55(s，6).
D.1，6-二苯基-2(S)，5(S)-二叠氮基-3(R)，4(R)-二羟基己烷
在3小时内，向0.370g(0.943mmol)制备例1C小标题中间体的4ml MeOH溶液中缓慢地加入1.26ml 12M HCl。反应完成后(用TLC检查)，反应混合物用10ml CH3CN稀释，并浓缩2次。所得的物质再溶于EtOAc中，然后用半饱和的碳酸氢钠(NaHCO3)溶液洗涤。所得的各层经分离，有机层再在减压下浓缩至干，得到油状物。该油状物用柱色谱法(用0-20％ EtOAc的CH2Cl2溶液进行梯度洗脱)纯化。将含所需产物的级分合并，在减压下浓缩至干，然后用Et2O和己烷溶液重结晶，得到0.309g所需的小标题中间体。1H NMR(CDCl3)：δ7.25(m，10)；3.60(m，4)；3.0(m，4)；2.65(d，2).MS：m/e353(M+＋1).分析C18H20N6O2：
计算值：C，61.35；H，5.72；N，23.85；
实测值：C，61.15；H，5.73；N，23.70.
E.1，6-二苯基-2(S)，5(S)-二叠氮基-3(R)-甲磺酰氧基-4(R)-羟基己烷
将13.5μl(0.170mmol)甲磺酰氯的300μl CH2Cl2溶液缓慢地加到80mg(0.23mmol)制备例1D小标题中间体和32μl(0.23mmol)Et3N的0.6ml CH2Cl2的冷(0℃)溶液中。使反应混合物温至室温，反应15分钟，然后倒入50ml 3∶2Et2O和0.1N HCl的混合液中。所得的各层经分离，有机层用半饱和的NaHCO3溶液洗涤，然后在减压下浓缩至干，得到泡沫状物。该泡沫状物用柱色谱法(洗脱剂为1∶2EtOAc/CH2Cl2溶液)纯化。将含所需产物的级分合并，并在减压下浓缩至干，得到100mg 60∶40所需小标题中间体和起始物质(1，6-二苯基-2(S)，5(S)-二叠氮基-3(R)，4(R)-二羟基己烷)的混合物。
F.1，6-二苯基-2(S)，5(S)-二叠氮基-3，4-顺式-环氧己烷
向60mg(0.14mmol)制备例1E小标题中间体在1.5ml 2∶1MeOH/THF溶液的冷(0℃)溶液中加入0.325ml 0.5M NaOMe的甲醇溶液。再将反应混合物温至室温，并使其反应1小时，随后加入3ml含2滴乙酸(HOAc)的Et2O。所得的溶液再倒入65ml 8∶5饱和NaHCO3和Et2O的混合液中。所得的各层经分离，有机层在减压下浓缩至干，得到油状物。该油状物用柱色谱法(洗脱剂为20％己烷的CH2Cl2溶液)纯化。将含所需产物的级分合并，并在减压下浓缩至干，得到31mg所需的小标题中间体。1H NMR(CDCl3)：δ7.30(m，10)；3.57(m，1)；3.45(m，1)；3.18(m，2)；2.94(m，4).
G.1，6-二苯基-2(S)，5(S)-二铵-3，4-顺式-环氧己烷二盐酸盐
向350mg 5％Pd/C在10ml 9∶1 EtOAc/HOAc溶液的混悬液中加入0.368g(1.11mmol)上述制备例1F小标题中间体。在氢(H2)气下再将混合物快速搅拌约
Figure A9410952700721
小时。反应完成后(用TLC检查)，混合物用EtOAc稀释，并滤除5％Pd/C。滤液再冷却过夜，得到0.325g 1，6-二苯基-2(S)，5(S)-二铵-3，4-顺式-环氧己烷二乙酸盐。向0.100g(0.249mmol)该二乙酸盐在4ml 1∶1 CH2Cl2/Et2O溶液的溶液中缓慢地加入0.498ml 1NHCl的CH3CN溶液，得到0.090g白色固体。1H NMR(d6-DMSO)：δ8.40(br.s，6)；7.30(m，10)；3.40(m，4)；3.05(m，4).MS：m/e284(M+-2Cl).
                 制备例2
A.2(S)-铵-3(S)-甲基戊酸二苯甲基酯，对甲苯磺酸盐
向15.03g(49.54mmol)L-异亮氨酸对甲苯磺酸盐在450ml4∶5 CH3CN/MeOH溶液的溶液中加入二苯基重氮甲烷，直到呈现持久的淡桃红色(共计用17.12g(88.16mmol)二苯基重氮甲烷)，此时加入2ml冰乙酸(HOAc)。所得的溶液于室温搅拌约15分钟，然后在减压下浓缩，得到黄色固体。该固体再经热的CH3CN重结晶纯化，得到21.64g所需的小标题中间体。1H NMR(CD3OD)δ7.67(d，J＝9Hz，2)；7.37(m，10)；7.20(d，J＝9Hz，2)；6.98(s，1)；4.13(d，J＝3Hz，1)；2.34(s，3)；2.01(m，1)；1.17-1.46(m，2)；0.80-0.97(m，6).B.2(S)-氨基-3(S)-甲基戊酸二苯甲基酯
向21.64g(46.08mmol)制备例2A小标题中间体的溶液中加入450ml饱和NaHCO3溶液，这导致释放出气体。反应完成后，所得的各层经分离，有机层在减压下浓缩至干，得到13.61g所需的小标题中间体。1H NMR(CDCl3)δ7.19-7.45(m，10)；7.93(s，1)；3.47(d，J＝3Hz，1)；1.85(m，1)；1.33-1.50(m，4)；0.92(d，J＝8Hz，3)；0.83(t，J＝8，3).C.2(S)-氨基甲酰基-3(S)-甲基戊酸二苯甲基酯
将4.97g(16.7mmol)制备例2B小标题中间体和4.7ml(33.7mmol)Et3N组成的溶液经套管加入到2.51g(8.46mmol)三光气的90ml甲苯的热(60℃)溶液中。再使温度升至100℃，使溶液反应过夜。将反应混合物冷却至0℃，得到沉淀。该沉淀经过滤滤出，并用1∶1 EtOAc/己烷溶液洗涤。所得的溶液在减压下浓缩至干，得到5.45g足够纯的(经NMR分析，约为90％)所需的小标题中间体，将其用于后面的反应中。1H NMR(CDCl3)δ7.23-7.47(m，10)；6.98(s，1)；4.05(d，J＝3Hz，1)；2.05(m，1)；1.18(quintet，J＝8Hz，2)；1.00(d，J＝8Hz，3)；0.80(t，J＝8Hz，3).
D.2(S)-N-[(喹啉-2-基甲氧基)羰基]氨基-3(S)-甲基戊酸二苯甲基酯
向0.506g(3.18mmol)2-羟基甲基喹啉和0.315g(3.18mmol)氯化铜(I)的无水DMF溶液中加入1.13g(3.50mmol)制备例2C小标题中间体。反应基本上完成后(用TLC检查)，反应混合物用EtOAc稀释，并用半饱和的盐水溶液洗涤。所得的各层经分离，有机层用Na2SO4干燥，并在减压下浓缩至干，得到棕色油状物。该油状物用柱色谱法(洗脱剂为65％己烷的EtOAc溶液)纯化，得到1.23g所需的小标题中间体。1H NMR(CDCl3)δ8.15(d，1)；8.05(d，1)；7.8(d，1)；7.70(t，1)；7.55(t，1)；7.45(d，1)；7.30(m，10)； 6.92(s，1)；5.43(d，1)；5.40(s，2)；4.5(m，1)；2.0(m，1)；1.2(m，2)；0.9(d，3)；0.82(t，3).
E.2(S)-N-[(喹啉-2-基甲氧基)羰基]氨基-3(S)-甲基戊酸
将上面制备例2D小标题中间体溶于12ml含3ml浓盐酸的二噁烷中。所得的溶液加热至100℃并使其反应约5分钟，然后冷却至室温并搅拌，直至反应基本上完成(用TLC检查)。得到的溶液在减压下浓缩至干，然后重新溶于饱和的NaHCO3溶液中。所得的溶液用100ml Et2O洗涤，然后用1N HCl酸化至pH4。再用10％异丙醇(iPr)的CH2Cl2溶液萃取所需产物，经Na2SO4干燥并过滤。滤液在减压下浓缩至干，得到0.567g所需的小标题中间体。1H NMR(d6-DMSO)δ8.35(d，1)；7.92(d，2)；7.70(m，2)；7.53(m，2)；5.22(s，2)；3.92(m，1)；1.78(m，1)；1.40(m，1)；1.20(m，1)；0.90(m，6).
                      制备例3
A.N-叔丁基-2-甲基苯甲酰胺
在N2下，向139.2g(0.9mol)O-甲苯酰氯的1200ml CH2Cl2的冷(0℃)溶液中缓慢地加入180.0g(1.8mol)Et3N，随后滴加含73.14g(1.0mol)叔丁胺的200ml CH2Cl2溶液。将所得的反应混合物温至室温，并反应2.5小时。反应混合物再用1800ml H2O稀释。所得的各层经分离，有机层依次用2N NaOH、1.0N HCl和盐水洗涤，以MgSO4干燥，过滤，然后减压下浓缩至干，得到167.6g米色固体(mp77～78℃)。产率：97％。1H NMR(CDCl3)：δ1.41(s，9H)；2.41(s，3H)；5.54(br.s，1H)；7.13-7.30(m，4H).IR(CHCl3)：3430，3011，2971，2932，1661，1510，1484，1452，1393，1366，1304，1216，876cm-1.MS(FD)：m/e191(M+)，191(100).分析C12H17NO：
计算值：C，75.35；H，8.76；N，7.32；
实测值：C，75.10；H，9.11；N，7.20.
B.(S)-N-叔丁基-2-(3-(N-苄氧羰基)氨基-2-氧代-4-苯基丁基)苯甲酰胺
向7.0g(36.5mmol)制备例3A小标题中间体的200ml无水THF溶液中，通过注射器加入12.1ml(80.3mmol)N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TMEDA)。所得的溶液冷却至-78℃，然后，在反应温度保持在-60℃以下的同时，通过注射器滴加55.9ml仲丁基锂。所得的反应溶液于-78℃搅拌约1小时，然后将反应温度保持在-65℃以下，并通过套管加入含有5.00g(14.6mmol)(S)-N-甲氧基-N-甲基-2-(N-苯基甲氧羰基)氨基-3-苯基丙酰胺的50ml无水THF溶液。将得到的反应混合物温至-20℃，20ml饱和的NH4Cl使反应中止，然后用200ml Et2O稀释。所得的各层经分离，有机层依次用H2O、0.2N硫酸氢钠(NaHSO4)和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩至干，得到无色油状物。该油状物用快速色谱法(洗脱剂为25％ EtOAc的CH2Cl2溶液)纯化。产量：6.08g(88％)无色泡沫状物。[a]D-289.26°(c0.12，MeOH).1H NMR(CDCl3)：δ1.38(s，9H)；2.99(dd，J＝15；6Hz，1H)；3.24(dd，J＝15，6Hz，1H)；3.89(d，J＝18Hz，1H)；4.16(d，J＝18Hz，1H)； 4.72(dd，J＝15，6Hz，1H)；5.00-5.09(m，2H)；5.56(d，J＝6Hz，1H)；5.93(br.s，1H)；7.03-7.40(m，14H).IR(CHCl3)：3431，3027，3012，2973，1713，1658，1511，1454，1383，1366，1307，1231，1046cm-1.MS(FD)：m/e472(M+)，218(100).分析C29H32N2O4：
计算值：C，73.70；H，6.82；N，5.93 ；
实测值：C，73.41；H，6.98；N，5.83.
C.[2R-(2R*，3S*)]-N-叔丁基-2-(3-(N-苄氧羰基)氨基-2-羟基-4-苯基丁基)苯甲酰胺
在N2下，向6.96g(14.7mmol)制备例3B小标题中间体的200ml无水乙醇(EtOH)溶液中加入2.78g(73.5mmol)硼氢化钠。反应基本上完成后(用TLC检查)，反应混合物用200ml EtOAc稀释，再滴加20ml饱和NH4Cl溶液中止反应。所得的各层经分离，有机层依次用1N HCl、饱和NaHCO3和盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩至干，得到6.4g无色油状物。该油状物用快速色谱法(用2-10％CH2Cl2的EtOAc溶液进行梯度洗脱)纯化，得到5.12g主要的所需非对映体。产率：74％。[a]D+10.38°(c0.10，MeOH).1H NMR(CDCl3)：δ1.40(s，9H)；2.79(dd，J＝12；3Hz，1H)；2.90-2.98(m，2H)；3.04(44，J＝12，3Hz，1H)；3.70-3.81(m，1H)；3.97(m，1H)；4.96-5.08(m，2H)；5.10(d，J＝9Hz，1H)；5.88(d，J＝6Hz，1H)；5.93(s，1H)；7.13-7.42(m，14H).IR(CHCl3)：3431，3028，3012，2971，1773，1643，1515，
       1454，1367，1229，1028cm-1.MS(FD)：m/e475(M+)，475(100).分析C29H34N2O4：
计算值：C，73.39；H，7.22；N，5.99；
实测值：C，73.12；H，7.48；N，5.62.
D.[2R-(2R*，3S*)]-N-叔丁基-2-(3-氨基-2-羟基-4-苯基丁基)苯甲酰胺
制备含有41.0g(120mmol)制备例3C小标题中间体和500mg10％ Pd/C在150ml无水EtOH中的混悬液。该混悬液在60psi氢气下，于帕尔振荡器(Parr shaker apparatus)上振摇。然后滤除10％ Pd/C，所得滤液在减压下浓缩至干，得到31.1g所需的小标题中间体，为淡黄色泡沫状物。该泡沫状物未经进一步纯化即可应用。产率：96％。[a]D+34.68°(c1.0，MeOH).1H NMR(CDCl3)：δ1.46(s，9H)；2.71(dd，J＝13.7；9.5Hz，1H)；2.84(dd，J＝13.3；2.51Hz，1H)；2.95-3.06(m，2H)；3.23-3.29(m，1H)；3.84-3.90(m，1H)；6.23(s，1H)；7.19-7.37(m，12H).IR(CHCl3)：3440，3382，3007，2970，2934，1643，1516，1454，1367，1213cm-1.MS(FD)：m/e341(M+)，341(100).
基本上按照制备例3A-C详述的方法合成制备例4化合物。将所得的化合物脱去保护，然后按制备例3D所述的方法进一步反应。
                 制备例4
[2R-(2R*，3S*)]-N-叔丁基-2-(3-(N-苄氧羰基)氨基-2-羟基-4-苯基丁基)-5-甲基苯甲酰胺产量：4.84mg(82％)无色泡沫状物。[a]D+10.31°(c0.58，MeOH).1H NMR(CDCl3)：δ1.46(s，9H)；2.32(s，3H)；2.76(d，J＝15Hz，1H)；2.85-2.95(m，2H)； 3.04(dd，J＝15，5Hz，1H)；3.67-3.74(m，1H)；3.92-4.05(m，1H)；4.92-5.14(m，3H)； 5.86(d，J＝7Hz，1H)；5.91(s，1H)；7.03-7.40(m，13H).IR(CHCl3)：3431，3274，3027，3012，2970，1713，1643，1514，1496，1454，1367，1224，1039，910cm-1.MS(FD)：m/e489(M+)，205(100).分析C30H36N2O4：
计算值：C，73.74；H，7.43；N，5.73；
实测值：C，73.55；H，7.50；N，5.96.脱去保护后得到4.2mg(89％)无色泡沫状物。
                 制备例5
A.喹哪啶酸五氟苯基酯
向含有15.0g(86.6mmol)喹哪啶酸和20.8g(113mmol)五氟苯酚的200ml THF的混悬液中加入18.3g(95.3mmol)EDC。所得的反应混合物在室温下剧烈搅拌约2小时，在此期间烧瓶底部形成胶粘的沉淀。从胶状物中滗析出溶液，用CH2Cl2从胶状物中萃取所需的化合。得到的溶液再用己烷稀释，并依次用0.1N NaHSO4、1N碳酸钾(K2CO3)和盐水溶液洗涤。所得的各层经分离，有机层用Na2SO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩，得到淡桃红色的固体。该固体重新溶于30ml热的Et2O中，再用400ml热的己烷稀释。所得的溶液缓慢地冷至室温，得到21.6g无色针状物。产率：73％。1H NMR(CDCl3)：δ7.73(t，J＝7.5Hz，1H)；7.86(t，J＝7.9Hz，1H)；7.95(d，J＝8.2Hz，1H)；8.29-8.42(m，3H).IR(CHCl3)：3035，2997，1763，1522，1285，1068，998，842cm-1.分析C16H6NO2F5：
计算值：C，56.65；H，1.78；N，4.13；
实测值：C，56.66；H，1.77；N，4.12.
B.(S)-2-N-(喹啉-2-基羰基)氨基-3-氨基甲酰基丙酸
制备含17.9g(51.2mmol)制备例5A小标题化合物、6.99g(46.6mmol)L-天冬酰胺一水合物和15.7g(186mmol)NaHCO3的265ml H2O和219ml二噁烷溶液。所得的混悬液于室温剧烈搅拌过夜。反应混合物再在减压下浓缩以除去二噁烷，残留的水层2N NaHSO4酸化至pH3。然后用60ml 3∶1氯仿(CHCl3)/iPr溶液从水层中萃取所需的小标题化合物。有机层再用盐水溶液洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩至干，得到无色固体。该固体用500mlEt2O和250ml热的己烷洗涤，然后于80℃减压干燥3小时，得到10.61g所需的小标题中间体。产率：79％。[a]D+16.54°(c1.01，DMSO).1H NMR(DMSO-d6)：δ2.68(dd，J＝16.0，4.9Hz，1H)；2.81(dd，J＝16.0，5.7Hz，1H)；4.74-4.81(m，1H)；6.96(s，1H)；7.70(t，J＝7.5Hz，1H)；7.85(t，J＝7.5Hz，1H)；8.05-8.15(m，3H)；8.56(d，J＝8.5Hz，1H)；9.12(d，J＝8.6Hz，1H)；12.8(s，1H).IR(KBr)：3385，3367，3216，1171，1662，1523，1499，1427，780，592cm-1.MS(FD)m/e288(M+)，288(100).分析C14H13N3O4：
计算值：C，58.53；H，4.56；N，14.63；
实测值：C，58.80；H，4.57；N，14.56.
基本上按照制备例5A和5B详述的方法合成制备例6-8化合物。制备例6 (S)-2-N-(喹喔啉-2-基甲基羰基)氨基-
    3-氨基甲酰基丙酸制备例7 (S)-2-N-(萘-2-基甲基羰基)氨基-3-
    氨基甲酰基丙酸制备例8 (S)-2-N-(喹啉-2-基羰基)氨基-3-羧
    基丙酸
                 制备例9
A.[3S-(3R*，4aR*，8aR*，2′S*，3′R*)]-2-[3′-N-(苄氧羰基)氨基-2′-羟基-4′-苯基]丁基-N-(叔丁基)十氢异喹啉-3-甲酰胺
将[1R-(1R*，3S*，1′S*，4aS*，8aS*)]-1-[(1′-N-苄氧羰基氨基-2′-苯基)乙基]环氧乙烷和十氢异喹啉-3-N-叔丁基甲酰胺的无水EtOH溶液于80℃加热过夜。反应混合物在减压下浓缩至干，得到残余物，该残余物经快速色谱法(用10-50％ EtOAc的CH2Cl2溶液进行梯度洗脱)纯化，得到6.47g(75％)米色泡沫状物。1H NMR(CDCl3)：δ1.29(s，9H)；1.25-2.05(m，2H)；2.20-2.35(m，2H)；2.55-2.70(m，11H)；2.85-3.10(m，3H)；3.24(br.s，1H)；3.82(br.s，1H)；3.98(br.s，1H)；4.99(br.s，2H)；5.16-5.18(m，1H)；5.80(br.s，1H)；7.05-7.38(m，10H).IR(CDCl3)：3600-3100(br.)，3031，2929，1714，1673，1512，1455，1368，1232，1199，1047cm-1.MS(FD)：m/e536(M+H)，1068(100).
B.[3S-(3R*，4aR*，8aR*，2′S*，3′R*)]-2-[3′-氨基-2′-羟基-4′-苯基]丁基-十氢异喹啉-3-N-叔丁基甲酰胺
基本上按照制备例3D详述的方法制备所需的小标题化合物，用6.37g(11.91mmol)制备例9A小标题中间体和1.2g 10％ Pd/C的200ml无水EtOH溶液，得到5.09g固体。该化合物未经进一步纯化即可应用。1H NMR(CDCl3)：δ1.33(s，9H)；1.40-1.95(m，10H)；2.25-2.48(m，2H)；2.59-2.75(m，3H)；2.80-3.40(m，7H)；3.75-3.90(m，1H)；6.19(br.s，1H)；7.18-7.35(m，5H).IR(CDCl3)：3600-3100(br.)，2929，2865，1671，1515，1455，1367，1245，1047cm-1.MS(FD)m/e402(M+，100).
                 制备例10
A.N-[(1′-氧代-1′-(3″-碘-4″-甲基)苯基)甲基]-1，2，3，4-四氢异喹啉
在N2下，向含有5.00g(19.1mmol)3-碘-4-甲基苯甲酸和3.40g(21.0mmol)1，1-羰基二咪唑的80ml THF溶液中经注射器加入2.7ml(21.0mmol)1，2，3，4-四氢异喹啉。将所得的反应混合物反应约2小时，然后在减压下浓缩至于，得到残余物。该残余物重新溶于100ml EtOAc中，依次用饱和的NaHCO3和盐水溶液洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩至干，得到淡黄色油状物。该油状物经快速色谱法(用14-20％己烷的EtOAc溶液进行梯度洗脱)纯化，得到6.92g澄清的油状物。产率：96％。1H NMR(CDCl3)：δ2.46(s，3H)；2.90(br.s，2H)； 3.65(br.s，1H)；3.95(br.s，1H)； 4.85(br.s，1H)；7.17-7.34(m，6H)；7.90(s，1H).IR(CDCl3)：3010，1624，1586，1547，1497，1370，1300，1253，1108，1050，1035，831cm-1.MS(FD)：m/e377(M+，100).分析C17H16NOI：
计算值：C，54.13；H，4.28；N，3.71；I，33.64；
实测值：C，53.89；H，4.24；N，3.61；I，33.52.
B.N-[1′-氧代-1′-(3″-甲氧羰基-4″-甲基)苯基]甲基-1，2，3，4-四氢异喹啉
将含6.35g(16.8mmol)制备例10A小标题化合物、3.35ml(16.8mmol)二环己基胺和1.18g(1.68mmol)氯化双(三苯膦)钯(II)的150ml无水MeOH溶液在一氧化碳气氛下剧烈搅拌。反应基本上完成后(用TLC检查)，混合物在减压下浓缩至干，得到残余物。该残余物重新溶于200ml EtOAc中，所得的混合物经硅藻土过滤以除去不溶的有机盐。得到的滤液依次用饱和NaHCO3和盐水溶液洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩至干。所得的物质经快速色谱法(用14-20％ EtOAc的己烷溶液进行梯度洗脱)纯化，得到4.54g澄清的油状物。产率：87％。1H NMR(CDCl3)：δ2.64(s，3H)；2.90(br.s，2H)；3.89(s，3H)；3.98(br.s，1H)；4.59(br.s，1H)；4.87(br.s，1H)；7.05-7.51(m，6H)；8.03(s，1H).IR(CDCl3)3010，1722，1626，1584，1497，1436，1306，1268，1236，1210，1149，1109，1085cm-1.MS(FD)：m/e309(M+，100).分析C19H19NO3：
计算值：C，73.77；H，6.19；N，4.53；
实测值：C，73.95；H，6.43；N，4.57.
C.N-[1′-氧代-1′-(3″-羧基-4″-甲基)苯基]甲基-1，2，3，4-四氢异喹啉
向含4.25g(13.8mmol)制备例10B小标题化合物的200ml 3∶1THF/H2O混合液的溶液中加入661mg(27.6mmol)氢氧化锂(LiOH)。反应混合物反应约24小时，然后在减压下浓缩，并滴加1N HCl酸化(pH2-3)，得到粗产物沉淀。所得的混悬液与75ml EtOAc混合，并将所得水层和有机层分离。水相用EtOAc萃取2次，合并的有机层用盐水洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩至干，得到残余物。该残余物用柱色谱法(硅胶；洗脱剂为15％ MeOH的CH2Cl2溶液)纯化，得到4.05g米色泡沫状物。1H NMR(CDCl3)：δ2.68(s，3H)；2.92(br.s，2H)；3.67(br.s，1H)；4.00(br.s，1H)；4.62(br.s，1H)；4.91(br.s，1H)；7.18-7.58(m，6H)；8.17(s，1H).IR(CDCl3)：3500-2500(br.)，1699，1625，1584，1498，1445，1371，1301，1237，1202，1167，1060，981，934，838cm-1.Ms(FD)：m/e295(M+，100).分析C18H17NO3：
计算值：C，73.20；H，5.80；N，4.74；
实测值：C，73.14；H，5.90；N，4.44.
                 制备例11
N-[1′-氧代-1′-(3″-羧基-4″-乙基)苯基]甲基-1，2，3，4-四氢异喹啉
基本上按照制备例10的方法制备标题化合物。产量：1.35g(88％)白色泡沫状物。1H NMR(CDCl3)δ1.27(t，J＝7.5Hz，3H)；2.96(br.s，2H)；3.10(q，J＝7.4Hz，2H)；3.66(br.s，1H)；3.99(br.s，1H)；4.62(br.s，1H)；4.89(br.s，1H)；7.13-7.25(m，4H)；7.38(d，J＝7.9Hz，1H)；7.58(d，J＝7.2Hz，1H)；8.12(d，J＝1.6Hz，1H).IR(KBr)：3600-2300(br.)；1700，1625，1497，1443，1300，1237，1150，1109，1048，933cm-1.MS(FD)：m/e309(M+，100).
                 制备例12
1，6-二苯基-2(S)；5(S)-二铵-3(R)；4(R)-二羟基己烷
基本上按照制备例1G中详述的方法制备标题化合物，用285mg(0.81mmol)制备例1D小标题化合物、143mg Pd/C和9ml EtOH(含1ml浓HCl)，得到175mg(58％)白色固体。1H NMR(CD3OD)：δ1.98(d，J＝2Hz，2H)；2.79-3.07(m，4H)；3.60(br.，2H)；3.75(br.，2H)；7.20-7.37(m，10H).MS(FD)：301(M+).
                 实施例1
1，6-二苯基-2(S)；5(S)-二[N-[2(S)-N-(苄氧羰基)氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-3，4-顺式-环氧己烷
制备含215mg(0.818mmol)2(S)-N-(苄氧羰基)氨基-3-甲基丁酸、12mg(0.082mmol)HOBT·H2O、104μl(0.818mmol)NMM和362mg(0.818mmol)苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)的2ml DMF溶液，并于室温搅拌约10分钟。同时，将80μl(0.40mmol)N，N-二环己基胺加到71mg(0.20mmol)制备例1G小标题中间体的6ml DMF溶液中，结果生成白色固体。通过离心除去该固体，滤液加到上面的溶液中。所得的反应混合物在减压下浓缩至体积为2.0ml，并在室温下反应约48小时。反应混合物再用20ml EtOAc稀释，将得到的溶液加到120ml 2∶1 EtOAc/0.1N HCl中。所得的各层经分离，有机层用1∶1饱和NaHCO3/盐水溶液的混合液洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩至干，得到110mg物质。该物质再用快速色谱法(洗脱剂为65％甲苯的EtOAC溶液)纯化，得到52mg所需的标题产物。1H NMR(80％CDCl3/20％CD3OD)：δ7.35(s，10)；7.18(m，10)；5.12(s，4)；4.20(d，2)；4.12(m，1)；3.90(d，1)；3.18(m，1)；2.82(m，5)；2.05(m，2)；0.90(m，9)；(d，3).MS：m/e749(M+＋1).分析C44H52N4O7：
计算值：C，70.57；H，7.00；N，7.48；
实测值：C，70.31；H，7.11；N，7.76.
基本上按照实施例1中详述的方法，用HOBT·H2O、NMM和BOP制备以下实施例2-5。
                      实施例2
1，6-二苯基-2(S)；5(S)-二[N-[2(S)-N-(苄氧羰基)氨基丁酰基]氨基]-3，4-顺式-环氧己烷
用194mg(0.818mmol)2(S)-N-(苄氧羰基)氨基丁酸和71mg(0.20mmol)制备例1G小标题中间体制备标题化合物，得到21mg所需化合物。1H NMR(80％CDCl3/20％CD3OD)：δ7.35(s，10)；7.20(m，10)；5.15(s，4)；4.25(d，2)；4.10(m，1)；3.90(d，1)；3.15(m，1)；2.80(m，5)；1.45(m，4)；0.8(m，6).
                 实施例3
1，6-二苯基-2(S)；5(S)-二[N-[2(S)-N-[(喹啉-2-基甲氧基)羰基]氨基-3(S)-甲基戊酰基]氨基]-3，4-顺式-环氧己烷
用365mg(1.15mmol)制备例2E小标题中间体和100mg(0.282mmol)制备例1G小标题中间体制备标题化合物。所得的物质用反相HPLC(45％CH3CN/30％MeOH/20％含0.5％NH4OAc的水溶液)纯化，得90mg。1H NMR(CD3OD)：δ8.25(d，2)；7.95(d，2)；7.85(d，2)；7.70(m，2)；7.55(m，4)；7.10(m，10)；5.35(m，4)；4.25(m，2)；4.20(d，1)；4.0(m，2)；3.22(m，1)；2.80(m，4)；1.8(m，2)；1.5(m，1)；1.3(m，1)；1.1(m，2)；0.8(m，12).MS：m/e879(M+＋1).分析C52H58N6O7：
计算值：C，71.05；H，6.65；N，9.56；
实测值：C，71.05；H，6.70；N，9.75.
                 实施例4
1，6-二苯基-2(S)；5(S)-二[N-[2(S)-N-[[N(甲基)-N(喹啉-2-基甲基)氨基]羰基]氨基丁酰基]氨基]-3，4-顺式-环氧己烷
用187mg(0.62mmol)2(S)-N-[[N(甲基)-N(喹啉-2-基甲基)氨基]氨基甲酰基]氨基丁酸和63mg(0.18mmol)制备例1G小标题中间体制备标题化合物。所得的物质用反相HPLC(50％CH3CN/20％MeOH/30％含0.5％NH4OAc的水溶液)纯化，得到50mg所需产物。1H NMR(CD3OD)：δ8.25(dd，2)；7.95(m，2)；7.85(m，2)；7.70(m，2)；7.55(t，2)；7.40(dd，2)；7.15(m，10)；4.80(ABX，4)；4.35(m，2)；4.15(m，2)；4.0(m，1)；3.25(m，1)；3.02(s，3)；2.97(s，3)；2.80(m，4)；1.7(m，4)；0.85(m，6).MS：m/e849(M+＋1).
                 实施例5
1，6-二苯基-2(S)；5(S)-二[N-[2(S)-N-[[N(甲基)-N(喹啉-2-基甲基)氨基]羰基]氨基-3(S)-甲基戊酰基]氨基]-3，4-顺式-环氧己烷
用232mg(0.704mmol)2(S)-N-[[N(甲基)-N(喹啉-2-基甲基)氨基]羰基]氨基-3(S)-甲基戊酸和72mg(0.201mmol)制备例1G小标题中间体制备标题化合物。所得的物质用反相HPLC(50％CH3CN/20％MeOH/30％含0.5％NH4OAc的水溶液)纯化。1H NMR(CD3OD)：δ8.25(dd，2)；7.95(m，2)；7.85(d，2)；7.70(m，2)；7.55(t，2)；7.40(d，2)；7.15(m，10)；4.75(ABX，4)； 4.38(d，1)；4.28(t，1)；4.20(m，1)；4.0(m，2)；3.25(m，1)；3.02(s，6)；2.75(m，4)；1.78(m，2)；1.05-1.45(m，4)；0.75(m，12).MS：m/e906 (M+＋2).
                 实施例6
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-[1-(2-氨基-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基]-2-喹啉基甲酰胺
在N2下，向含有500mg(1.46mmol)制备例3D小标题中间体、443mg(1.54mmol)(S)-2-N(喹啉-2-基羰基)-氨基-3-氨基甲酰基丙酸和208mg(1.54mmol)HOBT·H2O在10ml无水THF和1.75ml无水DMF的冷(-10℃)溶液中加入309mg(1.50mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)。将所得的反应混合物于-10℃反应约20分钟，然后于0℃反应1小时，再于室温反应过夜。然后使反应混合物冷却至0℃，并过滤除去所得的沉淀物。滤液在减压下浓缩，得到残余物，将该残余物重新溶于50ml EtOAc中，依次用H2O、饱和NaHCO3、5％柠檬酸和盐水洗涤。所得的各层经分离，有机层用Na2SO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩，得到泡沫状物。该泡沫状物用快速色谱法(1.0mm板，用0-10％ MeOH的CH2Cl2溶液进行梯度洗脱)纯化。产量：487mg(55％)。[α]D+11.93°(c 0.10，MeOH).1H NMR(CDCl3)：δ1.46(s，9H)；2.71(dd，J＝15，6Hz，1H)；2.81-3.01(m，4H)；3.07(dd，J＝15，3Hz，1H)；3.75-3.78(m，1H)；4.28-4.32(m，1H)；4.95(dd，J＝12，6Hz，1H)；5.74(br.s，1H)；6.19(br.s，1H)；6.32(br.s，1H)；6.90(t，J＝6Hz，1H)；7，01(t，J＝6Hz，1H)；7.08-7.38(m，6H)；7.64(t，J＝6Hz，1H)；7.79(t，J＝9Hz，1H)；7.80(d，J＝6Hz，1H)；8.17-8.31(m，3H)；9.22(d，J＝9Hz，1H).13C NMR(75.4MHz，CDCl3)：δ28.7，35.3，37.1，37.2，50.1，52.1，53.5，55.9，74.8，118.7，126.0，127.0，127.6，128.2，129.3，129.4，130.0，130.2，130.3，130.9，137.4，137.5，138.2，146.5，148.8，164.6，170.4，170.5.IR(CHCl3)：3428，3411，3359，3012，2975，1681，1601，1565，1518，1499，1454，1428，1395，1367，1231，1047cm-1.MS(FD)：m/e 610(M+)；221(100).分析C35H39N5O5：
计算值：C，68.95；H，6.45；N，11.49；
实测值：C，68.76；H，6.55；N，11.49.
                 实施例7
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-[1-(2-氨基-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)-4-甲基苯基)己基]-2-喹啉基甲酰胺
基本上按照实施例6所详述的方法，用小标题中间体[2R-(2R*，3S*)]-N-叔丁基-2-(3-(N-苄氧羰基)氨基-2-羟基-4-苯基丁基)-5-甲基苯甲酰胺、(S)-2-N(喹啉-2-基羰基)氨基-3-氨基甲酰基丙酸、HOBT·H2O和DCC制备标题化合物。所得的物质用快速色谱法(用2-8％MeOH和CH2Cl2溶液进行梯度洗脱)纯化，得到2.00g粗品，该粗品进一步用反相HPLC纯化。产量：1.95g(74％)。[a]D+28.57°(c0.10，MeOH).1H NMR(CDCl3)：δ1.43(s，9H)；2.30(s，3H)；2.63-3.05(m，6H)；3.65-3.76(m，1H)；4.22-4.35(m，1H)；4.89-4.97(m，1H)；5.51(s，1H)；5.82-5.88(br.s，1H)；6.09(s，1H)；6.20(s，1H)；6.84-7.24(m，10H)；7.63(t，J＝7.5Hz，1H)；7.78(t，J＝7.5Hz，1H)；7.85(d，J＝8Hz，1H)；8.19(t，J＝8.4Hz，1H)；8.28(d，J＝8.4Hz，1H)；9.20(d，J＝8.1Hz，1H).IR(CHCl3)：3410，3022，3013，1674，1519，1497，1454，1428，1367，1210，1047，910cm-1.MS(FD)：m/e624(M+)；234(100).分析C36H41N5O5：
计算值：C，69.32；H，6.63；N，11.23；
实测值：C，68.73；H，6.76；N，11.07.
                 实施例8
A.[2R-(2R*，3S*，6S*)]-N-叔丁基-2-(2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-N(苄氧羰基)氨基)-7-氨基甲酰基庚基)苯甲酰胺
在N2下，向含3.4g(10mmol)制备例3D小标题中间体、2.6g(10mmol)2-N(苄氧羰基)氨基-3-氨基甲酰基丙酸、1.09ml(10mmol)NMM和1.48g(11mmol)HOBT·H2O的20ml无水DMF的冷(0℃)溶液中加入2.4mg(11mmol)DCC。将反应混合物温至室温，并使其反应过夜。所得的反应混合物经过滤，用EtOAc从滤液中萃取所需的小标题化合物。EtOAc溶液用EtOAc/H2O混合液稀释。所得的各层经分离，有机层依次用饱和的NaHCO3、5％柠檬酸、饱和的NaHCO3和盐水溶液洗涤，经MgSO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩至干，得到残余物。该残余物再用Et2O/己烷混合液漂洗，然后过滤，滤饼置于真空干燥器内干燥。产量：4.4g(79％)。
B.[2R-(2R*，3S*，6S*)]-N-叔丁基-2-(2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-氨基-7-氨基甲酰基庚基)苯甲酰胺
基本上按照制备例3D详述的方法，用实施例8A小标题化合物和Pd/C，制备小标题化合物，得到31.1g(96％)淡黄色泡沫状物。
C.[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(2-氨基-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-7-甲基喹啉-2-基甲酰胺
向含135mg(0.5mmol)2-羧基-7-甲基喹啉和81mg(0.5mmol)1，1-羰基二咪唑的15ml无水CH2Cl2溶液中加入227mg(0.5mmol)实施例8B小标题化合物。将所得的反应混合物反应过夜。反应基本上完成后(用TLC检查)，反应混合物用100ml CH2Cl2和25mlH2O稀释，得到乳状液。该乳状液依次用饱和的NaHCO3、5％柠檬酸、饱和的NaHCO3和盐水溶液洗涤。所得的混合物经MgSO4干燥，然后在减压下浓缩至干，得到残余物。该残余物与Et2O一起搅成泥浆，经过滤分离，然后在室温下于真空干燥器中干燥，得到115mg(37％)所需的小标题化合物。MS(FAB)：623(M+1).1H NMR(CDCl3)：δ1.46(s，9H)；2.6-3.1(m，10H)；3.69-3.75(m，1H)；4.22-4.32(m，1H)；4.28-4.35(m，1H)；4.9(m，1H)；5.3-5.35(m，1H)；5.9-6.05，(2br.s，2H)；6.89-8.3(m，14H)；9.3(d，1H).
基本上按照实施例8C所述的方法，用实施例8B小标题化合物和指定的羧基取代试剂制备以下实施例9和10化合物。
                 实施例9
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(2-氨基-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-8-甲基喹啉-2-基甲酰胺
用2-羧基-8-甲基喹啉制备标题化合物。产率：57.8％。MS(FAB)：M+1(623＋1).1H NMR(CDCl3)：δ1.46(s，9H)；2.6-3.1(m，8H)；3.70-3.78(m，1H)；4.28-4.32(m，1H)；4.9(m，1H)；5.2(br.s，1H)；6.05，(br.s，2H)；6.8-7.78，(m，12H)；8.2-8.3(dd，2H).分析C36H40N5O5：
计算值：C，69.32；H，6.62；N，11.23；
实测值：C，69.10；H，6.81；N，10.94.
                 实施例10
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(2-氨基-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-4-甲基喹啉-2-基甲酰胺
用2-羧基-4-甲基喹啉制备标题化合物。产率：35％。MS(FAB)：623(M+1).1H NMR(CDCl3)：δ1.46(s，9H)；2.6-3.1(m，10H)；3.7-3.78(m，1H)；4.23-4.35(m，1H)；4.9-4.95(m，1H)；5.35-5.40(br.s，1H)；5.97-6.08(2br.s，3H)；6.82-8.2(m，14H)；9.18-9.2(d，1H).分析C36H40N5O5：
计算值：C，69.32；H，6.62；N，11.23；
实测值：C，69.06；H，6.64；N，11.25.
基本上按照实施例6所详述的方法，用HOBT·H2O和DCC制备以下实施例11-15化合物。
                 实施例11
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(2-氨基-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-2(6，7，8，9-四氢萘基)甲酰胺产量：75mg(54％)无色泡沫状物。1H NMR(CDCl3)：δ8.0(d，1H)；7.5-7.03(m，12H)；6.51(br.s，1H)；6.22(br.s，1H)；5.57(br.s，1H)；4.84(m，1H)；4.23(m，1H)；3.75(m，1H)；3.12-2.5(m，10H)；1.81(m，4H)；1.43(s，9H).MS(FD)：629(M+1).分析C37H36N4O5：
计算值：C，70.79；H，7.55；N，8.92；
实测值：C，70.63；H，7.31；N，9.21.
                 实施例12
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-异丙基-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-2-喹喔啉基乙酰胺
用制备例3D和6小标题中间体制备所需的标题化合物，得到51mg(8％)淡黄色的泡沫状物。1H NMR(CDCl3)：δ9.69(s，1H)；8.31(d，1H)；8.28-7.0(m，13H)；6.78(m，2H)；6.12(m，2H)；4.43(m，2H)；3.82(m，1H)；1.5(s，9H)；1.0(dd，6H).MS(FD)：597(M+1).
                 实施例13
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-异丙基-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-2-萘基乙酰胺
用制备例3D和7小标题中间体制备标题化合物，得到39.6mg(11％)褐色泡沫状物。1H NMR(CDCl3)：δ8.22(s，1H)；7.93-6.7(m，15H)；6.1(d，1H)；6.0(s，1H)；4.49(t，1H)；4.35(m，1H)；3.82(m，1H)；3.09-2.77(m，4H)；2.2(m，1H)；1.47(s，9H)；0.98(t，6H).MS(FD)：594(M+1).
                 实施例14
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(2-氨基-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)噻吩-3-基)己基)-2-喹啉基甲酰胺产量：90mg(50％)白色固体。1H NMR(CDCl3)：δ1.42(s，9H)；2.75(dd，J＝7Hz，1H)；2.95-3.20(m，5H)；3.77(m，1H)；4.27(m，1H)；4.95(m，1H)；5.38(br.s，1H)；5.93(br.s，1H)；6.41(br.s，1H)；6.95(m，5H)；7.20(m，4H)；7.66(t，J＝8Hz，1H)；7.81(t，J＝8Hz，1H)；7.90(d，J＝8Hz，1H)；8.20(m，2H)；8.34(d，J＝8Hz，1H)；9.25(d，J＝8Hz，1H).IR(KBr)：3302，1667，1498，1427cm-1.MS(FAB)：mass 616.2591(M＋H).MS(FD)：m/e615(M+).分析C33H37N5O5S：
计算值：C，64.37；H，6.06；N，11.37；
实测值：C，64.60；H，5.98；N，11.42.
                 实施例15
[1S-(1R*，R*，5S*)]-N-(1-(2-羟基-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-2-喹啉基甲酰胺
用制备3D和8小标题化合物制备所需的标题化合物，得到40mg(40％)无色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ1.38(s，9H)；2.58-3.05(m，6H)；3.61(br.s，1H)；3.84(m，1H)；4.79(m，1H)；5.88(s，1H)；6.92(t，J＝8Hz，1H)；7.02(t，J＝8Hz，2H)；7.12-7.37(m，6H)；7.75(t，J＝10Hz，2H)；7.90(t，J＝10Hz，2H)；7.98(d，J＝10Hz，2H)；8.07-8.23(m，4H)；8.60(d，J＝10Hz，1H)；8.89(d，J＝10Hz，1H)；12.40(s，1H).MS(FD)：m/e 613(25)，612(95)，611(100).分析C35H38N4O6：
计算值：C，68.84；H，6.27；N，9.17；
实测值：C，68.61；H，6.44；N，9.10.
基本上按照实施例8C所述的方法，用1，1-羰基二咪唑制备以下实施例16-19化合物。
                    实施例16
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(2-(N-2-吡啶基甲基)氨基)-2-氧代乙基]-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-2-喹啉基甲酰胺
用0.2g(0.33mmol)实施例15标题化合物和0.07ml(0.66mmol)2-氨基甲基吡啶制备标题化合物。产量：33mg(14％)。1H NMR(CDCl3)：δ1.48(s，9H)；2.77-3.16(m，6H)；3.80(br.s，1H)；4.33(m，1H)；4.59(m，2H)；5.02(m，1H)； 5.90(br.s，1H)；6.23(s，1H)；6.90-7.09(m，4H)；7.15(m，1H)；7.20-7.42(m，8H)；7.57-7.70(m，2H)；7.82(t，J＝8Hz，1H)；7.91(d，J＝8Hz，1H)；8.18-8.40(m，4H)；9.35(d，J＝8Hz，1H).MS(FD)：m/e701(100)，700(15)，481(28)，220(90).分析C41H44N6O5·2.2H2O：
计算值：C，66.50；H，6.56；N，11.40；
实测值：C，66.35；H，6.20；N，11.00.
                 实施例17
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(2-(N-2-咪唑基甲基)氨基)-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-2-喹啉基甲酰胺
用0.50g(0.82mmol)实施例15标题化合物和0.28g(1.64mmol)咪唑甲基胺二盐酸盐，并用HOBT·H2O和DCC代替1，1-羰基二咪唑，制备所需的标题化合物，得到0.26g(46％)无色固体。1H NMR(DMSO-d6)：δ1.33(s，9H)；2.69(m，5H)；2.95(dd，J＝30Hz，14，2H)；3.62(br.s，1H)；3.88(br.s，1H)；4.22(d，J＝10Hz，2H)；4.80(br.s，1H)；6.82(br.s，1H)；6.87(t，J＝8Hz，1H)；7.05(t，J＝8Hz，2H)；7.15-7.25(m，4H)；7.30(t，J＝7Hz，2H)；7.74(t，J＝7Hz，1H)；7.89(t，J＝9Hz，1H)；7.98-8.14(m，6H)；8.45(t，J＝6Hz，1H)；8.58(d，J＝9Hz，1H)；8.96(d，J＝9Hz，1H).MS(FD)：m/e691(80)，690(100).分析C39H43N7O5：
计算值：C，67.91；H，6.28；N，14.21；
实测值：C，67.67；H，6.50；N，13.98.
                 实施例18
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(2-(N-2-苯并咪唑基甲基)氨基)-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-2-喹啉基甲酰胺产量：0.199g(82％)黄色泡沫状物。1H NMR(DMSO-d6)：δ1.34(s，9H)；2.63-3.30(m，5H)；3.60-3.65(m，1H)；3.88-3.91(m，1H)；4.43(d，J＝5.6Hz，2H)；4.84(dd，J＝7.8，6.0Hz，1H)；5.87(d，J＝5.3Hz，1H)；6.92-7.47(m，14H)；7.69-7.75(m，1H)；7.85(t，J＝7.7Hz，1H)；8.03-8.20(m，6H)；8.57(d，J＝8.6Hz，1H)；8.65(m，1H)；9.00(d，J＝8.2Hz，1H).MS(FD)：m/e743(M+1)；740(29)；739(50)；354(100).分析C43H45N7O5·0.4H2O：
计算值：C，69.13；H，6.18；N，13.12；
实测值：C，68.84；H，6.35；N，13.50.
                 实施例19
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(2-氨基-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-4-氯喹啉-2-基甲酰胺产量：29.2mg(9％)。1H NMR(CDCl3)：δ1.45(s，9H)；2.7-3.1(m，6H)；3.7-3.8(m，1H)；4.3-4.4(m，1H)；4.9-5.0(m，1H)；5.5(m，1H)；6.0(m，2H)；6.9-8.3(m，17H)；9.2(d，1H).MS(FD)：644.分析C35H38N5O5Cl：
计算值：C，65.26；H，5.95；N，10.87；
实测值：C，65.55；H，6.04；N，10.85.
基本上按照上面实施例6所详述的方法制备实施例20-22化合物。
                 实施例20
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(2-甲基丙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-喹啉-2-基甲酰胺产量：44mg(61％)。
                 实施例21
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(丙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-喹啉-2-基甲酰胺产量：42mg(22％)。MS(FD)：m/e598(M+4)。
                 实施例22
[1S-(1R*，4R*，5S*)]-N-(1-(2-氨基-2-氧代乙基)-2-氧代-3-氮杂-4-苯基甲基-5-羟基-6-(2-(1-叔丁基氨基-1-氧代甲基)苯基)己基)-8-三氟甲基-喹啉-2-基甲酰胺产量：116mg(34％)。MS(FD)：m/e678(M+1)。
                 实施例23
A.[2R-(2R*，3S*，6S*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-N(叔丁氧羰基)氨基-7-甲基]辛基苯甲酰胺
基本上按照实施例6所详述的方法，用1.34g(6.18mmol)(S)-2-N-(叔丁氧羰基)氨基-3-甲基丁酸和2.00g(5.88mmol)制备例3D小标题中间体制备本小标题化合物，得到3.95g无色泡沫状物。将该泡沫状物的一半用柱色谱法(SiO2；洗脱剂为3％MeOH的CHCl3溶液)纯化，得1.45g所需的小标题化合物。该泡沫状物的另一半未经进一步纯化即可用于下面实施例56B中进行反应。分析C31H45N3O5：
计算值：C，69.12；H，8.23；N，7.80；
实测值：C，69.38；H，8.43；N，7.96.
B.[2R-(2R*，3S*，6S*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-氨基-7-甲基]辛基苯甲酰胺
将2.0g(最大3.7mmol)实施例23A小标题化合物和0.713g(3.7mmol)甲苯磺酰基氢氧化物水合物(TosOH·H2O)的75ml无水EtOH溶液加热至55℃。反应基本上完成后(用TLC检查)，反应混合物冷至室温，并在减压下浓缩，得到残余物。该残余物在100mlEtOAc和50ml 10％NH4OH之间进行分配。所得的各层经分离，有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩至干，得到1.0g白色泡沫状物。该泡沫状物用快速色谱法(SiO2，用2-5％MeOH的CHCl3溶液进行梯度洗脱)纯化，得到0.97g所需的小标题化合物。分析C26H37N3O3：
计算值：C，71.04；H，8.48；N，9.56；
实测值：C，70.85；H，8.59；N，9.56.
C.[2R-(2R*，3S*，6S*，9S*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4，7-二氮杂-5，8-二氧代-6-(1-甲基乙基)-9-N(叔丁氧羰基)氨基-10-萘-1-基]癸基苯甲酰胺
基本上按照实施例6所详述的方法，用226mg(0.717mmol)(S)-2-N(叔丁氧羰基)氨基-3-萘-1-基丙酸和300mg(0.683mmol)实施例23B小标题中间体制备所需的小标题化合物，得到490mg(98％)米色泡沫状物。MS(FD)：m/e737(M+，100).分析C44H56N4O6：
计算值：C，71.71；H，7.66；N，7.60；
实测值：C，71.82；H，7.73；N，7.55.
                 实施例24
[2R-(2R*，3S*，6S*，9R*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4，7-二氮杂-5，8-二氧代-6-(1-甲基乙基)-9-N(叔丁氧羰基)氨基-10-萘-1-基]癸基苯甲酰胺
基本上按照实施例6所详述的方法，用226mg(0.717mmol)(R)-2-N(叔丁氧羰基)氨基-3-萘-1-基丙酸和300mg(0.683mmol)实施例23B小标题中间体制备所需的标题化合物，得到490mg(98％)米色泡沫状物。MS(FD)：m/e737(M+，100)。分析C44H56N4O6：
计算值：C，71.71；H，7.66；N，7.60；
实测值：C，71.41；H，7.90；N，7.68.
                 实施例25
A.[2R-(2R*，3S*，6S*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-N(苄氧羰基)氨基-7-氨基甲酰基]庚基苯甲酰胺
基本上按照实施例6所详述的方法，所不同的是将1.09ml(10mmol)NMM加到反应混合物中，用2.6g(10mmol)(S)-2-N(苄氧羰基)氨基-3-氨基甲酰基丙酸和3.4g(10mmol)制备例3D小标题中间体制备所需的小标题化合物，得到4.4g(76％)所需的小标题化合物。
B.[2R-(2R*，3S*，6S*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-氨基-7-氨基甲酰基]庚基苯甲酰胺
基本上按照制备例3D所详述的方法，用4g(6.7mmol)实施例25A小标题化合物和0.5g 5％ Pd/C制备所需的小标题化合物。产量：2.4g(80％)。
C.[2R-(2R*，3S*，6S*，9R*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4，7-二氮杂-5，8-二氧代-6-(2-氨基-2-氧代乙基)-9-N(叔丁氧羰基)氨基-10-萘-1-基]癸基苯甲酰胺
基本上按照实施例6所详述的方法，用630mg(2.0mmol)(R)-2-N(叔丁氧羰基)氨基-3-萘-1-基丙酸和908mg(2.0mmol)实施例25B小标题化合物制备所需的小标题化合物。产量：920mg(60％)。MS(FD)：m/e751(M+，100)。分析C43H53N5O7：
计算值：C，68.69；H，7.10；N，9.31；
实测值：C，68.66；H，7.22；N，9.27.
                 实施例26
[2R-(2R*，3S*，6S*，9S*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4，7-二氮杂-5，8-二氧代-6-(2-氨基-2-氧代乙基)-9-N(叔丁氧羰基)氨基-10-萘-1-基]癸基苯甲酰胺
基本上按照实施例6所详述的方法，用630mg(2.0mmol)(S)-2-N(叔丁氧羰基)氨基-3-萘-1-基丙酸和908mg(2.0mmol)实施例25B小标题化合物制备所需的标题化合物。产量：895mg(60％)MS(FD)：m/e751(M+，100)。分析C43H53N5O7：
计算值：C，68.69；H，7.10；N，9.31；
实测值：C，68.58；H，7.11；N，9.01.
                 实施例27
A.[2R-(2R*，3S*，6S*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-N(苄氧羰基)氨基-7-咪唑-4-基]庚基苯甲酰胺
基本上按照实施例6所详述的方法，用1.79g(6.18mmol)(S)-2-N(苄氧羰基)氨基-3-咪唑-4-基丙酸和2.00g(5.88mmol)制备例3D小标题中间体制备所需的小标题化合物，得到米色泡沫状物，它未经进一步纯化即可应用。产量：3.46g(96％)。分析C35H41N5O5：
计算值：C，68.72；H，6.76；N，11.45；
实测值：C，65.60；H，6.61；N，10.94.
B.[2R-(2R*，3S*，6S*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-氨基-7-咪唑-4-基]庚基苯甲酰胺
基本上按照制备例3D所详述的方法，用1.9g 5％Pd/C和3.36g(5.5mol)实施例27A小标题中间体制备所需的小标题化合物，得到淡黄色泡沫状物。分析C27H35N5O3：
计算值：C，67.90；H，7.39；N，14.66；
实测值：C，67.94；H，7.50；N，14.36MS：m/e478(M+)。
C.[2R-(2R*，3S*，6S*，9S*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4，7-二氮杂-5，8-二氧代-6-(咪唑-4-基甲基)-9-N(叔丁氧羰基)氨基-10-萘-1-基]癸基苯甲酰胺
基本上按照实施例6所详述的方法，用330mg(1.05mmol)(S)-2-N(叔丁氧羰基)氨基-3-萘-1-基丙酸和500mg(1.05mmol)实施例27B小标题化合物制备所需的小标题化合物。产量：612mg(76％)。MS(FD)：m/e774(M+，100)。分析C45H54N6O6：
计算值：C，69.7；H，7.02；N，10.84；
实测值：C，69.55；H，6.86；N，10.57.
基本上按照实施例6所详述的方法制备以下实施例28-30化合物。
                 实施例28
[2R-(2R*，3S*，6S*，9R*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4，7-二氮杂-5，8-二氧代-6-(咪唑-4-基甲基)-9-N(叔丁氧羰基)氨基-10-萘-1-基]癸基苯甲酰胺
用330mg(1.05mmol)(R)-2-N(叔丁氧羰基)氨基-3-萘-1-基丙酸和500mg(1.05mmol)实施例27B小标题化合物制备所需的标题化合物。产量：612mg(76％)。MS(FD)：m/e774(M+，100)。分析C45H54N6O6：
计算值：C，69.74；H，7.02；N，10.84；
实测值：C，69.75；H，6.98；N，10.88.
                 实施例29
[3_S-(3_R*，4_S*)]-N-[1′-氧代-1_-(3_-[1_-氧代-2_-氮杂-3_-苯基甲基-4_-羟基-5_-(2_-N-叔丁基脲基)苯基]戊基-4″-乙基)苯基]甲基-1，2，3，4-四氢异喹啉
用300mg(0.97mmol)制备例11小标题中间体和341mg(1.18mmol)制备例3D小标题中间体制备标题化合物。产量：410mg(67％)米色泡沫状物。1H NMR(CDCl3)：δ1.07(t，J＝7.6Hz，3H)；1.45(s，9H)；2.54(q，J＝7.5Hz，2H)；2.70-3.30(m，5H)；3.55(br.s，1H)；3.91-3.95(m，1H)；4.40-4.65(m，2H)；4.83(br.s，1H)；5.97(s，1H)；6.32(br.d，J＝9.2Hz，1H)；6.90-7.60(m，16H).IR(CDCl3)：3009，1645，1514，1455，1236，1213 cm-1.MS(FD)：m/e632(M+，100).
                 实施例30
[3S-(3R*，4aR*，8aR*，2′S*，3′R*)]-2-[2′-羟基-3′-苯基甲基-4′-氮杂-5′-氧代-5′-(3″-[1_，2_，3_，4_-四氢异喹啉-1_-基羰基]-6″-甲基)苯基]戊基-十氢异喹啉-3-N-叔丁基甲酰胺
用366mg(1.24mmol)制备例10C小标题中间体和500mg(1.24mmol)制备例9B小标题中间体制备标题化合物。产量：489mg(58％)米色泡沫状物。[a]D-69.1017°(c1.013，MeOH).1H NMR(CDCl3)：δ1.13(s，9H)；1.20-2.10(m，14H)；2.20-2.35(m，4H)；2.50-3.05(m，7H)；3.37-3.60(m，2H)；3.80-4.10(m，2H)；4.40-4.70(m，2H)；4.85(br.s，1H)；5.67(br.s，1H)；6.72(br.d，J＝8.4Hz，1H)；6.95-7.34(m，12H).13(KBr)：3600-3150(br.)；3009，1627，1514，1455，1247，1247cm-1.MS(FD)：m/e679(M+)，578(100).分析C42H54N4O4：
计算值：C，74.30；H，8.02；N，8.25；
实测值：C，74.07；H，8.00；N，8.22.
                 实施例31
A.[2R-(2R*，3S*，6R*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-N(叔丁氧羰基)氨基-7-苄氧羰基]庚基苯甲酰胺
基本上按照实施例6所详述的方法，用1.0g(2.9mmol)制备例3D小标题中间体和0.95g(2.9mmol)(2R)-2-N(叔丁氧羰基)氨基-4-氧代-4-苄氧基丁酸制备该小标题化合物，得到1.9g(87％)白色固体(m.p.67-72℃)。分析C37H47N3O7：
计算值：C，68.82；H，7.34；N，6.51；
实测值：C，69.16；H，7.50；N，6.56.
B.[2R-(2R*，3S*，6R*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-氨基-7-苄氧羰基]庚基苯甲酰胺
向2.89g(5.53mmol)实施例31A小标题化合物的CH2Cl2的冷(0℃)溶液中加入三氟乙酸(CF3COOH)。将所得的反应混合物搅拌约1小时，然后在减压下浓缩，得到泡沫状物。该泡沫状物在甲苯中成浆，再在减压下浓缩，得到2.4g粗品，该粗品未经进一步纯化即可应用。
C.[2R-(2R*，3S*，6R*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-N(甲磺酰基)氨基-7-苄氧羰基]庚基苯甲酰胺
在N2下，向含有0.75g(0.97mmol)实施例31B小标题化合物和Et3N的CH2Cl2溶液中加入75.1μl(0.970mmol)甲磺酰氯。反应基本上完成后(用TLC检查)，反应混合物在减压下浓缩至干，得到残余物。产量：0.33g(54％)白色固体。1H NMR(CDCl3)：δ1.45(s，9H)；2.42(dd，J＝6.12Hz，1H)；2.76(s，3H)；2.63-3.10(m，5H)；3.80(m，1H)；4.13(m，1H)；4.38(m，1H)；5.05(s，2H)；5.80(d，J＝8Hz，1H)；5.99(d，J＝6Hz，1H)；6.10(s，1H)；7.06-7.41(m，15H).MS(FD)：m/e623(M+).IR(CHCl3)：3026，1660，1643，1602，1517cm-1.UV(EtOH)：203nm(E＝44，949).分析C33H41N3O7S：
计算值：C，63.54；H，6.62；N，6.74；
实测值：C，63.73；H，6.56；N，6.52.
D.[2R-(2R*，3S*，6R*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-N(甲磺酰基)氨基-7-羧基]庚基苯甲酰胺
向0.13g(0.21mmol)实施例31C小标题化合物的MeOH溶液中加入0.2g(3.2mmol)甲酸铵和50mg 5％Pd/C。将反应混合物在回流温度下反应约2小时。反应完成后(用TLC检查)，使反应混合物冷却，用EtOAc稀释，然后过滤。溶液再与50ml H2O混合，所得的各层经分离，有机层在减压下浓缩至干。产量：0.10g(91％)白色固体。
                 实施例32
A.[2R-(2R*，3S*，6S*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-氨基-7-氨基甲酰基]庚基苯甲酰胺
基本上按照制备例3D所述的方法，用5％Pd/C和4g(6.7mmol)实施例25A小标题中间体制备所需的标题化合物。产量：2.4g(80％)固体。MS(FAB)：m/e455(M+1)。
B.[2R-(2R*，3S*，6S*)]-N-叔丁基-2-[2-羟基-3-苯基甲基-4-氮杂-5-氧代-6-N(萘-1-基乙基磺酰基)氨基-7-氨基甲酰基]庚基苯甲酰胺
基本上按照实施例31C所详述的方法，用118mg(0.462mmol)萘-1-基乙基磺酰氯和200mg(0.440mmol)实施例32A小标题化合物(用NMM而不用Et3N)制备所需的小标题化合物，得到126mg(42％)白色泡沫状物。MS(FD)：m/e673(M+1)。分析C37H44N4O6S：
计算值：C，66.05；H，6.59；N，8.33；
实测值：C，66.30；H，6.72；N，8.22.
                 实施例33
1，6-二苯基-2(S)，5(S)-二[N-[2(S)-N(苄氧羰基)氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-3，4-二羟基己烷
向(S)-2-N(苄氧羰基)氨基-3-甲基丁酸、2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三氮烯和36μl NMM的冷(0℃)溶液中加入含有0.142mmol制备例12标题中间体和36ml NMM的CH2Cl2溶液。将反应混合物温至室温，然后反应约5小时。反应基本上完成后(用TLC检查)，混合物倒入75ml 2∶1 EtOAc/0.2NHCl混合液中。所得的各层经分离，有机层用相当稀(half-dilute)的NaHCO3溶液洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，然后在减压下浓缩，得到固体。该固体用快速色谱法(Silica；洗脱剂为30％己烷的EtOAc溶液)纯化。产量：44mg(44％)。1H NMR(CD3OD)：δ0.6(d，J＝6Hz，6H)；0.75(d，J＝6Hz，6H)；1.85(m，2H)；2.80(m，4H)；3.75(m，2H)；4.05(m，2H)；5.02(s，4H)；5.42(d，J＝8Hz，2H)；7.05(m，10H)；7.25(m，10H).MS(FD)：m/e767(M+).
                 实施例34
1，6-二苯基-2(S)，5(S)-二[N-[2(S)-N(喹啉-2-基甲氧羰基)氨基-3-甲基丁酰基]氨基]-3，4-二羟基己烷
基本上按照实施例33所详述的方法，所不同的是反应在CH2Cl2中进行，用102mg(0.273mmol)制备例12标题中间体、184mg(0.608mmol)(S)-2-N(喹啉-2-基甲氧羰基)-氨基-3-甲基丁酸、107mg(0.608mmol)2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三氮烯和69μl(0.628mmol)NMM制备标题化合物。产量：155mg(65％)。1H NMR(CD3OD)：δ0.7(m，12H)；1.80(m，2H)；2.78(m，4H)；3.40(m，2H)；3.75(d，J＝6Hz，2H)；4.58(m，2H)；5.32(s，4H)；7.10(m，10H)；5.32(s，4H)；7.10(m，10H)； 7.55(m，4H)；7.75(t，J＝6Hz，2H)；7.85(d，J＝6Hz，2H)；7.95(d，J＝6Hz，2H)；8.30(d，J＝6Hz，2H).MS(FD)：m/e868(M+).分析C50H56N6O8：
计算值：C，69.11；H，6.49；N，9.67；
实测值：C，68.89；H，6.52；N，9.70.
                 实施例35
1，6-二苯基-2(S)，5(S)-二[N-[2(S)-N(吡啶-2-基甲氧羰基)氨基-3-甲基丁酰基]氨基]-3，4-二羟基己烷
基本上按照实施例34所详述的方法，用72.7mg(0.195mmol)制备例12标题中间体、110mg(0.436mmol)(S)-2-N(吡啶-2-基甲氧羰基)氨基-3-甲基丁酸、76mg(0.433mmol)2-氯-4，6-二甲氧基-1，3，5-三氮烯和50μl(0.455mmol)NMM制备标题化合物。产量：57.2mg(38％)。1H NMR(CD3OD)：δ0.72(t，J＝8Hz，12H)；1.84(m，2H)；2.81(d，J＝9Hz，4H)；3.41(s，2H)；3.76(d，J＝9Hz，2H)；4.55(br.t，J＝9Hz，2H)；5.17(s，4H)；7.00-7.40(m，12H)；7.45(d，J＝9Hz，2H)；7.84(t，J＝9Hz，2H)；8.48(br.d，J＝2Hz，2H).IR(CHCl3)：3428；3025；2973；1723；1667；1602；1507cm-1.MS(FD)：770(M+1).
                 实施例36
乙酰基-β-萘基丙氨酸-缬氨酸-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸-亮氨酸-β-萘基丙氨酸-酰胺
(CH3C(O)-bNA-Val-Sta-Leu-bNA-NH2)
A.树脂与t-Boc-氨基酸的结合的制备
在加入t-Boc-氨基酸以前，将0.45g对甲基二苯甲基胺盐酸盐树脂(含0.33mmol游离氨基)用5％N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)的CH2Cl2溶液中和3次，每次10ml，再用CH2Cl2洗涤3次，每次10ml。然后，向洗涤过的树脂中加入5ml 2.5相当量的t-Boc-β-萘基丙氨酸(t-Boc-bNA)的CH2Cl2溶液。接着向树脂/t-Boc-氨基酸混合物中加入2.5相当量DCC的1mlCH2Cl2溶液。所得的反应混合物于室温反应1到3小时，并偶尔地进行搅拌。用茚三酮试验检查t-Boc-氨基酸与树脂的偶合。
B.脱去t-Boc保护基团
进行偶合反应之后，从实施例36A得到的树脂用CH2Cl2洗涤3次，每次10ml，然后与15ml 50％CF3COOH的CH2Cl2溶液混合。将所得的反应混合物反应约1分钟，然后从树脂中除去上层清液，再加入另外的15ml 50％CF3COOH和CH2Cl2溶液。将所得的反应混合物反应约30分钟，然后除去上层清液，树脂再用CH2Cl2洗涤3次，每次10ml。应用茚三酮试验监测反应。
C.中和反应
下一个t-Boc-氨基酸偶合前，将实施例36B得到的肽-树脂用15ml 5％DIEA的CH2Cl2溶液中和。约1分钟后，除去上层清液，加入另一份15ml 5％DIEA的CH2Cl2溶液。将所得的混合物反应约5分钟，然后除去上层清液，肽-树脂用CH2Cl2洗涤6次。
D.顺序偶合以形成最终产物
基本上按照上面实施例36A、36B和36C所详述的方法，将下一个t-Boc-氨基酸溶液加到树脂中。用适当的t-Boc-保护的氨基酸依次重复该步骤，得到小标题化合物。
仅在偶合t-Boc-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸时方法有所改变。当加t-Boc-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸时，应用1.25相当量氨基酸和1.25相当量缩合剂DCC。t-Boc-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸的偶合反应进行3小时或更长时间。另外，可以应用较大过量的t-Boc-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸或更长的偶合时间。
E.乙酰化作用
向由上面实施例36D得到的中和后的肽-树脂中加入约5ml乙酐以覆盖过肽-树脂，随后加1ml 5％DIEA的CH2Cl2溶液。所得的反应混合物反应约15分钟。反应基本上完成，用茚三酮试验监测。从茚三酮试验得出的淡黄色表明，肽的氨基末端已被乙酰基保护。
F.从树脂上切下肽链
通过下述方法从肽-树脂上切下肽链：于0℃将10份(v/v)含10％茴香醚的氢氟酸(HF)和1份树脂的溶液搅拌45分钟。用减压将所有的HF基本上除去后，得到的混合物用无水Et2O洗涤。用冰HOAc、50％HOAc，然后用水从残余物中萃取游离的肽。合并萃取液，冷冻干燥，然后将标题肽化合物用反相HPLC纯化。
经水解肽得出以下氨基酸组成：Val，1.0(1)；Leu，1.1(1)；Sta，存在；bNA，1.8(2)；这与标题化合物的特有比例相符。该肽还经MS(FAB)分析，进一步证实该肽的分子量为822。
基本上按照实施例36所详述的方法制备实施例37～40化合物。
        实施例               化合物
          37    CH3C(O)-NA-Nva-Sta-Nva-NA-NH2
          38    CH3C(O)-NA-Nva-AHPPA-Nva-NA-NH2
          39    CH3C(O)-NA-Val-Sta-Abu-NA-NH2
          40            NA-Val-AHPPA-Leu-NA-NH2
实施例36～40中制备的化合物经水解分析氨基酸组成，经MS(FAB)测定其分子量。结果列在下面表1中。
                        表1
                  氨基酸组成和分子量
                   氨基酸分析             分子量实施例    残基      理论值     实测值    理论值    MH+37       NA        2.00       2.14       808     809
       Nva       2.00       1.85
       AHPPA     1.00       PRES38       NA        2.00       2.08       842     843
       Nva       2.00       1.92
       Sta       1.00       PRES39       Val       1.00       1.01       794     795
       Abu       1.00       0.98
       NA        2.00       2.01
       Sta       1.00       PRES40       Val       1.00       0.88       814     815
       NA        2.00       1.93
       Leu       1.00       1.12
       AHPPA     1.00       PRESPRES-存在。
基本上按照实施例36所详述的方法，用0.136mmol N-Boc-O-苄基-L-苏氨酸-4-(氧基甲基)-苯基乙酰氨基甲基(Pam)树脂、5mmol各种适当的t-Boc-氨基酸和1mmol t-Boc-4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸制备以下实施例41-48化合物。所有的偶合反应于室温反应约1小时。
关于下面实施例42、44、46、47和48中制备的化合物，基本上可按照上面实施例36B-C所详述的方法进行：在加入t-Boc-甘氨酸以后，脱去保护基并中和，树脂用1％ HOAc的DMF溶液洗涤2次，然后与3ml 50％丙酮的DMF溶液混合。然后向得到的混合物中加入1M氰基硼氢化钠的DMF溶液。所得的反应混合物于室温反应约1小时。反应完成后，除去上层清液。基本上按照上面实施例36F所详述的方法从树脂上切下所需的寡肽。反应用茚三酮试验监测。当树脂转变成淡红色时反应已完成。
实施例              化合物
  41     CH3C(O)-Gly-Val-Val-Sta-Ala-Thr-OH
  42    (CH3)2CH-Gly-Val-Val-Sta-Ala-Thr-OH
  43             Gly-Val-Val-Sta-Ala-Thr-OH
  44    (CH3)2CH-Gly-Sta-Ile-Ala-Thr-OH
  45             Gly-Val-Sta-Ala-Thr-OH
  46    (CH3)2CH-Gly-Val-Sta-Ala-Thr-OH
  47    (CH3)2CH-Gly-Val-Val-Ile-Sta-Thr-OH
  48    (CH3)2CH-Gly-Val-Sta-Ile-Ala-Thr-OH
实施例41-48中制备的化合物经水解分析氨基酸组成，经MS(FAB)测定其分子量。结果列在下面表2中。
                       表2
                氨基酸组成和分子量
                 氨基酸分析            分子量实施例    残基    理论值    实测值    理论值    实测值41      Gly      1.0      1.066      644.7     645
      Val      2.0      1.529
      Ala      1.0      1.000
      Thr      1.0      0.957
      Sta      1.0      PRES42      Gly      1.0      PRES       666.2     667
      Val      2.0      1.84
      Ala      1.0      1.15
      Thr      1.0      1.010
      Sta      1.0      PRES43      Gly      1.0      1.000      602.6     603
      Val      2.0      1.78
      Ala      1.0      1.13
      Thr      1.0      0.990
      Sta      1.0      PRES44      Gly      1.0      PRES       559.6     560
      Ala      1.0      1.000
      Ile      1.0      0.826
      Thr      1.0      0.967
      Sta      1.0      PRES45      Gly      1.0      1.020      503.5     504
      Val      1.0      1.050
      Ala      1.0      1.020
      Thr      1.0      0.910
      Sta      1.0      PRES
                     表2(续)
                氨基酸分析      分子量
实施例  残基    理论值  实测值  理论值   实测值
 46     Gly    1.0      PRES    567.8    568
 Val    1.0    1.06
 Ala    1.0    1.03
 Thr    1.0    0.92
 Sta    1.0    PRES
 47     Gly    1.0      PRES    686.8    687
 Val    1.0    1.609
 Ile    1.0    1.811
 Thr    1.0    1.000
 Sta    1.0    PRES
 48     Gly    1.0      PRES    659      660
 Val    1.0    0.94
 Ile    1.0    1.21
 Ala    1.0    0.96
 Thr    1.0    0.90
 Sta    1.0    PRESPRES-存在
基本上按上面所述的方法制备以下化合物。具体地说，实施例49-74所示环氧化物用实施例1所述方法制备。实施例82-113、140-145、149-152、170-206、210、212-214、218-239、242-243、249-258和275所示化合物用实施例6、8和25A所述的一般方法制备。实施例124-139和146所示化合物通常用实施例31所述的方法制备。实施例114-123、147、148、153、154、158-163和240-241所示化合物通常用实施例31所述的方法制备，所不同的是用乙酰氯(或其他合适的酰基氯)代替甲磺酰氯。实施例155-157、164-169、207-209、211和215-217所示化合物通常用实施例16所述的方法制备。实施例244-248和274所示化合物通常按照实施例28和29所述的方法，用制备例10C中所制备的中间体化合物制备。实施例259-262所示化合物用实施例33-35所述的方法制备。最后，实施例263-273所示化合物用实施例36所述的方法制备。
表1实施例           R3W                      R2           分析数据49        
Figure A9410952701202
          -CH2CN         MS：m/e785(M+＋1)50        
Figure A9410952701203
   -CH(CH3)2     1H NMR：δ8.05
                                                  (m，2)；7.72(m，2)；
                                                  7.45(m，2)；7.10
                                                  (m，10)； 5.35(s，4)；
                                                  4.15(m，2)；3.95(m，
                                                  2)；3.10(d，1)；2.80
                                                  (m，5)；2.0(m，2)；
                                                   0.8(m，12)51                -CH2C(O)NH2    产量：7mg(80-85％)52                -CH2CN          MS：m/e743(M+＋1)53          54       
Figure A9410952701207
        -CH(CH3)2      MS：m/e751(M+＋1)55                     1H NMR：δ7.50
                                                   (s，2)；7.10(m，20)；
                                                   6.68(s，2)；4.95
                                                   (s，4)；4.05(m，4)；
                                                   3.20(m，1)；2.60
                                                   (m，8)56       
Figure A9410952701209
    -CH2CH3        MS：m/e823(M+＋1)
                   表1(续)
Figure A9410952701211
实施例            R3W                       R2                  PChem57        
Figure A9410952701212
          -CH2SCH3             MS：m/e784(M+)58        
Figure A9410952701213
          -CH2CH2C(O)NH2      MS：m/e807(M+＋1)59                   -CH2CH(CH3)2        MS：m/e778(M+)60        
Figure A9410952701215
          -CH(CH3)CH2CH3      MS：m/e777(M+＋1)61        
Figure A9410952701216
          -CH(CH3)2         1H NMR：δ8.42
                                                             (m，2)；7.70(m，2)；
                                                             7.20(m，14)；4.22(m，
                                                             3)；4.0(q，1)；3.85(d，
                                                             1)；3.6
                                                             (m，4)；3.22(m，1)；
                                                             2.95(m，4)；2.82
                                                             (s，6)；2.80(m，4)；
                                                             1.95(m，2)；0.8
                                                             (m，12)62              -CH(CH3)2              MS：m/e888(M+＋2)63                  -CH3                    MS：m/e694(M+＋2)
                    表1(续)
Figure A9410952701221
实施例                 R3W                             R2                    PChem64                         -CH2CH2CH3         MS：m/e878(M+＋2)65         
Figure A9410952701223
               -CH2CH2CH2CH3     MS：m/e906(M+＋2)66                              -C(CH3)3            MS：m/e780(M+＋2)67         
Figure A9410952701225
                    -CH(CH3)CH2CH3     MS：m/e807(M+＋3)68         
Figure A9410952701226
                    -CH2CH2CH2CH3     MS：m/e780(M+＋2)69         
Figure A9410952701227
                      -CH(CH3)2           MS：m/e791(M+＋1)70         
Figure A9410952701228
               -CH2CN               MS：m/e872(M+＋2)71                             -CH2CH3             MS：m/e749(M+＋1)72                        -CH(CH3)2           MS：m/e780(M+＋2)
                     表1(续)
Figure A9410952701231
实施例                     R3W                    R2                  PChem73                     -C(CH3)3           MS：m/e879(M+＋1)74                          -CH(CH3)CH2CH3    MS：m/e777(M+＋1)
                      表2
Figure A9410952701234
实施例               R3W                        R2                        R1                PChem75                    -CH2CH3                          MS：m/e948(M+)76          
Figure A9410952701237
             -CH(CH3)CH2CH3                 MS：m/e904(M+)77          
Figure A9410952701239
             -CH2CH3                
Figure A94109527012310
         MS：m/e850(M+＋2)78          
Figure A94109527012311
            -CH2CH3                
Figure A94109527012312
      MS：m/e912(M+＋1)
            表3
Figure A9410952701241
实施例                  R3W                           R2          i            PChem79           
Figure A9410952701242
                   -CH(CH3)2    2       MS：m/e778(M+)80           
Figure A9410952701243
                   -CH2CH3      3       MS：m/e806(M+＋2)81           
Figure A9410952701244
                -CH2CH3      3      1H NMR(CD3OD))：δ
                                                                         8.2(m，2)；7.95
                                                                         (m，2)；7.83(m，2)；
                                                                         7.72(t，2)；7.55
                                                                         (t，2)；7.40(d，2)；
                                                                         7.10(m，10)；4.70
                                                                         (m，4)；4.40(t，1)；
                                                                         4.15(m，2)；3.98
                                                                         (m，1)；3.85(m，1)；
                                                                         3.38(m，1)；3.02
                                                                         (s，3)；2.97(s，3)；
                                                                         2.55(m，4)；1.80
                                                                         (m，4)； 1.58(m，8)；
                                                                         0.97(t，6)
                            表4
Figure A9410952701251
实施例          R3W                                   R2                        PChem82                             -CH2OH                 MS(FD)：m/e562(M+)；
                                                                                220(100)83                        -CH(CH3)CH2CH3       Ms(FD)：m/e639(M+)84      
Figure A9410952701254
                 -CH(CH3)CH2CH3       Ms(FD)：m/e652(M+)85      
Figure A9410952701255
                       -CH2CH2C(O)NH2       Ms(FD)：m/e623(M+)86                          -CH2CN                 Ms(FD)：m/e621(M+2)87                             -CH2CN                 Ms(FD)：m/e612(M+2)88                         -CH2CN                 Ms(FD)：m/e637(M+3)89      
Figure A9410952701259
              -CH2CN                 Ms(FD)：m/e697(M+2)
    表4(续)
Figure A9410952701261
实施例     R3W                 R2                                        PChem90       
Figure A9410952701262
                MS(FD)：m/e680(M+)91                              分析  C35H4N5O5：
                                                                 计算值C，68.72；H，
                                                                       6.76；N，11.45；
                                                                 实测值C，65.60；H，
                                                                       6.61；N，10.94.92       
Figure A9410952701264
                              MS(FD)：m/e516(M+)93       
Figure A9410952701265
                   产量：80mg(53％)；
                                                                        白色固体94       
Figure A9410952701266
                      MS(FD)：m/e516(M+)
                    表4A
Figure A9410952701271
实施例           R2                      PChem95         
Figure A9410952701272
           分析  C31H45N3O5：计算值C，69.12；H，8.23；N，7.80；实测值C，69.38； H，8.43；N，7.96.96              MS(FD)：m/e669(M+)97         
Figure A9410952701274
     MS(FD)：m/e634(M+)98         
Figure A9410952701275
        分析  C35H45N3O5S：计算值C，67.82；H，7.32；N，6.78；实测值C，67.57；H，7.20；N，6.52.99        
Figure A9410952701276
     MS(FD)：m/e670(M+)100       
Figure A9410952701277
    分析  C37H47N3O7：计算值C，68.82；H，7.34；N，6.54；实测值C，68.65；H，7.20；N，6.77.101       
Figure A9410952701278
      MS(FD)：m/e637(M+)102       
Figure A9410952701279
        MS(FD)：m/e621(M+)103       
Figure A94109527012710
      MS(FD)：m/e626(M+)
                    表4B实施例           R2                                 PChem104       
Figure A9410952701282
                      分析  C26H37N3O3计算值C，71.04；H，8.48；N，9.56；实测值C，70.85；H，8.59；N，9.56.105                             MS：m/e478(M+)106      
Figure A9410952701284
                  MS(FD)：m/e569(M+)107                          MS(FD)：m/e534(M+)108      
Figure A9410952701286
                      分析  C30H37N3O3S：计算值C，69.33；H，7.18；N，8.08；实测值C，69.60；H，7.43；N，8.07.109     
Figure A9410952701287
                  分析  C33H38N4O3S：计算值C，69.45；H，6.71；N，9.82；实测值C，69.59；H，6.58；N，9.61.110    
Figure A9410952701288
                   产量：0.75g(42％)111    
Figure A9410952701289
                      MS(FD)：m/e538(M+)112                             MS(FD)：m/e521(M+)113    
Figure A94109527012811
                      MS(FD)：m/e526(M+)
                     表4C
Figure A9410952701291
实施例           R2                               PChem114                           MS(FD)：m/e611(M+)115       
Figure A9410952701293
                   MS(FD)：m/e644(M+)116                            MS(FD)：m/e575(M+)117       
Figure A9410952701295
                    MS(FD)：m/e608(M+)118                               MS(FD)：m/e561(M+)119       
Figure A9410952701297
                       MS(FD)：m/e594(M+)120         -CH2CH2SCH3                     MS(FD)：m/e514(M+)121       
Figure A9410952701298
                   MS(FD)：m/e612(M+)122       
Figure A9410952701299
                  分析  C35H40N4O5S：计算值C，66.86；H，6.41；N，8.91；实测值C，67.13；H，6.37；N，8.63.123       
Figure A94109527012910
                  分析  C35H4N4O6S：计算值C，65.20；H，6.25；N，8.69；实测值C，65.49；H，6.26；N，8.61.
                   表4D
Figure A9410952701301
实施例            R2                                      PChem124                                MS(FD)：m/e647(M+)125       
Figure A9410952701303
                        MS(FD)：m/e680(M+)126       
Figure A9410952701304
                         MS(FD)：m/e611(M+)127       
Figure A9410952701305
                         MS(FD)：m/e628(M+)128       
Figure A9410952701306
                         MS(FD)：m/e644(M+)129       
Figure A9410952701307
                           MS(FD)：m/e597(M+)130       
Figure A9410952701308
                           MS(FD)：m/e630(M+)131                              MS(FD)：m/e649(M+)132                                MS(FD)：m/e615(M+)
                     表4D(续)实施例               R2                                     PChem133                                     MS(FD)：m/e632(M+)134        
Figure A9410952701313
                            分析  C31H38FN3O7S2：计算值C，57.48；H，5.91N，6.49；实测值C，57.19；H，5.86；N，6.23.135        
Figure A9410952701314
                               MS(FD)：m/e598(M+)136                                       产量    30mg(36％)；无色油状物137        
Figure A9410952701316
                               产量    44mg；白色固体138        
Figure A9410952701317
                             MS(FD)：m/e604(M+)139        
Figure A9410952701318
                             MS(FD)：m/e620(M+)
         表5
Figure A9410952701321
实施例         R3W                  R2                                          PChem140       
Figure A9410952701322
                      MS(FD)：m/e701(M+)141       
Figure A9410952701323
                     MS(FD)：m/e680(M+)142       
Figure A9410952701324
   -CH2SO2NH2                           MS(FD)：m/e625(M+)143       
Figure A9410952701325
      -CH2SO2NH2                           MS(FD)：m/e646(M+)144       
Figure A9410952701326
                       分析  C37H47N3O7：
                                                                       计算值C，68.82；H，
                                                                             7.34；N，6.51；
                                                                       实测值C，69.16；H，
                                                                             7.50；N，6.56.145       -H    146 
Figure A9410952701328
                            MS(FD)：m/e653(M+)
                表5(续)
Figure A9410952701331
实施例         R3W               R2                                        PChem147       
Figure A9410952701332
                      MS(FD)：m/e602(M+)148       
Figure A9410952701333
                     MS(FD)：m/e616(M+)149       
Figure A9410952701334
                      MS(FD)：m/e589(M+)150       
Figure A9410952701335
                        产量：0.52g(68％)151            -H          
Figure A9410952701336
                          MS(FD)：m/e518(M+)152       
Figure A9410952701337
                    产量：570mg(80％)
                表5A实施例             R3W                                     PChem153       
Figure A9410952701342
                        MS(FAB)：质量588.3051154            -CH2CO2H                               产量：0.51g(55％)155                                MS(FD)：m/e588(M+)156                              MS(FD)：m/e623(M+)157       
Figure A9410952701345
                        MS(FD)：m/e587(M+)158       
Figure A9410952701346
                            MS(FD)：m/e560(M+)159                                        MS(FD)：m/e561(M+)160       
Figure A9410952701348
                              MS(FD)：m/e568(M+)161       
Figure A9410952701349
                                  MS(FD)：m/e530(M+)162                             分析  C37H41N3O6：计算值C，71.25；H，6.62；N，6.74；实测值C，71.32；H，6.70；N，6.67.163                                      MS(FD)：m/e575(M+)
                表5B实施例                R3W                           PChem164           -CH2CO2H                      产量：0.10g(91％)165      
Figure A9410952701352
             MS(FD)：m/e660(M+)166      
Figure A9410952701353
               MS(FD)：m/e623(M+)167                  MS(FD)：m/e674(M+)168      
Figure A9410952701355
                    MS(FD)：m/e596(M+)169      
Figure A9410952701356
              产量：240mg(71％)
               表6实施型             R3W                                 PChem170       
Figure A9410952701362
                       IR(KBr)：3311，3065，2966，1656，1520，1453，1366，735，701cm-1171       
Figure A9410952701363
                    MS(FD)：m/e589(M+)，589(100)172       
Figure A9410952701364
                           MS(FD)：m/e610(M+)，220(100)173                               MS(FD)：m/e599(M+)，599(100)174       
Figure A9410952701366
                     MS(FD)：m/e639(M+)，639(100)175       
Figure A9410952701367
                           MS(FD)：m/e609(M+1)176                               MS(FD)：m/e612(M+2)
               表6(续)实施例            R3W                                           PChem177       
Figure A9410952701372
                                MS(FD)：m/e599(M+2)178       
Figure A9410952701373
                                MS(FD)：m/e616(M+2)179       
Figure A9410952701374
                           MS(FAB)：m/e623(M+1)180       
Figure A9410952701375
                                MS(FAB)：m/e623(M+1)181       
Figure A9410952701376
                                     MS(FAB)：m/e558(M+1)182       
Figure A9410952701377
                                     MS(FAB)：m/e559(M+1)183                                        MS(FAB)：m/e609(M+1)184                                      MS(FD)：m/e623(M+1)
                      表6(续)
Figure A9410952701381
实施例         R3W                                                PChem185       
Figure A9410952701382
                                    MS(FD)：m/e614(M+2)186                                       MS(FD)：m/e640(M+1)187       
Figure A9410952701384
                                     MS(FD)：m/e644188                                         MS(FAB)：m/e644189                                           MS(FD)：m/e588(M)190       
Figure A9410952701387
                                   MS(FD)：m/e638(M+1)191                                          MS(FD)：m/e646(M+1)
                表6(续)
Figure A9410952701391
实施例           R3W                                        PChem192       
Figure A9410952701392
                            MS(FD)：m/e686193       
Figure A9410952701393
                               MS(FD)：m/e644194       
Figure A9410952701394
                            MS(FD)：m/e644195                              MS(FD)：m/e638，546196                                    MS(FD)：640，420，220197       
Figure A9410952701397
                            MS(FD)：m/e666，573，445198              -H                                   MS(FAB)：m/e455(M+1)
                  表6(续)
Figure A9410952701401
实施例         R3W                                             PChem199       
Figure A9410952701402
                                    MS(FD)：m/e596(M+)200       
Figure A9410952701403
                                  MS(FD)：m/e646(M+)201       
Figure A9410952701404
                                  MS(FD)：m/e645(M+1)202       
Figure A9410952701405
                                MS(FD)：m/e645(M+1)203       
Figure A9410952701406
                                分析  C37H42N3O6S：计算值C，65.63；H，6.43；N，8.50；实测值C，65.52；H，6.45；N，8.43.
                 表7
Figure A9410952701411
实施例          R2                        PChem204        -CH(CH3)2               MS(FAB)：m/e595(M+)；128(100)205                      MS(FD)：m/e633(M+)；633(100)206        -CH2CH2CO2H            MS(FD)：m/e626(15)：625(35)；220(8)207      
Figure A9410952701413
  MS(FD)：m/e717(M+1 24)208      
Figure A9410952701414
     MS(FD)：m/e688(M+1，100)；220(22)209          MS(FD)：m/e702(M-，100)210        -CH2CH2C(O)NH2         MS(FD)：m/e624(M+2)211               MS(FD)：m/e739(M+1，35)；738(100)
                     表7(续)实施例             R2                           PChem212           -CH2CN                     MS(FD)：m/e594(M+2)；501，372，224213                    1H NMR：δ1.48(s，9H)；2.78-3.12(m，6H)；3.71(m，1H)；4.30(m，1H)；5.05(m，1H)；5.16(s，2H)；5.98(s，1H)；6.76-6.85(m，2H)；6.92(t，J＝9Hz，2H)；7.17-7.43(m，11H)；7.70(t，J＝9Hz，1H)；7.85(t，J＝9Hz，1H)；7.95(d，J＝9Hz，1H)；8.18(d，J＝9Hz，1H)；8.27(d，J＝9Hz，1H)；8.39(d，J＝9Hz，1H)；9.00(d，J＝12Hz，1H).214                   MS(FD)：m/e702(M+)215                 MS(FD)：m/e640(M+1，38)；610(63)，593(58)216                   MS(FD)：m/e625(M+，100)217       
Figure A9410952701426
   MS(FD)：m/e681(M+1)
                   表8
Figure A9410952701431
实施例            R1                                           PChem218       
Figure A9410952701432
                 MS(FD)：m/e716(M+，100)219                                 MS(FD)：m/e626(M+，100)220       
Figure A9410952701434
                               MS(FD)：m/e616(100)；396(15)；395(33)；394(8)；221(18)；220(100)；192(20)；191(88)221       
Figure A9410952701435
                       MS(FD)：m/e692(M+)；691(100)222                                  MS(FD)：m/e642(M+，100)；
                  表9实施例       
Figure A9410952701442
                                         PChem223      
Figure A9410952701443
                                 MS(FD)：m/e624(M+，100)224                                       MS(FD)：m/e660(M+，100)225      
Figure A9410952701445
                             MS(FD)：m/e661(M+，100)226      
Figure A9410952701446
                                   MS(FD)：m/e624(M+，100)227      
Figure A9410952701447
                                   MS(FD)：m/e610(M+，100)
                  表9(续)实施例       
Figure A9410952701452
                                 PChem228                              MS(FAB)：质量600.2839(M＋H)229        
Figure A9410952701454
                     MS(FAB)：质量616.2591(M＋H)230        
Figure A9410952701455
                MS(FD)：m/e650(M+)，231        
Figure A9410952701456
              MS(FAB)：624；607；355)
                       表9(续)实施例        
Figure A9410952701462
                                     PChem232                             1H NMR:δ1.45(s，9H)；2.26(s，3H)；2.73-2.80(m，2H)；2.94-2.99(m，2H)；3.13-3.23(m，2H)；3.90-3.95(m；1H)；4.29-4.40(m，1H)；4.89-4.97(m，1H)；6.68(s，1H)；6.79(s，1H)；6.85-7.15(m，10H)；7.49-7.60(m，3H)；7.72；(t，J＝7.5Hz，1H)；7.79(d，J＝8Hz，1H)；8.03-8.14(m，2H)；8.18(d，J＝8Hz，1H)；8.85(d，J＝6.3Hz，1H).233        
Figure A9410952701464
                      MS(FAB)：636(M+，100)
                        表1U实施例           R3W             R1                                 PChem234                               MS(FD)：m/e637(M+)，636(100)235          -H                                    MS(FD)：m/e537(M+)，536(100)236       
Figure A9410952701474
                      MS(FD)：m/e671(M+)，670(100)237       
Figure A9410952701475
                           MS(FD)：m/e587(M+，100)238          -H          
Figure A9410952701476
                             MS(FD)：m/e487(M+，100)239       
Figure A9410952701477
                          MS(FD)：m/e621(M+，100)240                                MS(FD)：m/e579(M+)，578(100)241                                    MS(FD)：m/e529(M+)，528(100)
                    表11实施例             R1                              PChem242       
Figure A9410952701482
                MS(FD)：m/e652(M+，100)243       
Figure A9410952701483
                    MS(FAB)：m/e703(M+)；602
                  表12
Figure A9410952701491
实施例             Z                                 PChem244       
Figure A9410952701492
                       MS(FD)：m/e618(M+，100)245       
Figure A9410952701493
                        MS(FD)：m/e618(M+，100)246       
Figure A9410952701494
                          MS(FD)：m/e618(M+)；
                                                      220(100)247       
Figure A9410952701495
                       MS(FD)：m/e618(M+，100)248       
Figure A9410952701496
                          MS(FD)：m/e604(M+，100)
                     表13
Figure A9410952701501
实施例          R2            *                         PChem249                  S                      分析  C39H51N5O7计算值C，66.74；H，7.32；N，9.98；实测值C，65.59；H，7.44；N，9.76.250                  R                       产量：100mg(33％)251       
Figure A9410952701504
      S                      MS(FD)：m/e740(M+－1)252             R                       MS(FD)：m/e741(M+)253       
Figure A9410952701506
           S                       分析  C38H49N5O7计算值C，66.36；H，7.18；N，10.18；实测值C，65.63；H，7.10；N，10.28.354                   R                       分析  C38H49N5O7计算值C，66.36；H，7.18；N，10.18；实测值C，66.20；H，7.23；N，10.31
                     表14实施例    R2          *        PChem255     -CH(CH3)2     S    MS(FD)：m/e636(M+，100)256     -CH(CH3)2     R    MS(FD)：m/e636(M+，100)257     -CH2C(O)NH2   S    MS(FD)：m/e652(M+，100)258     -CH2C(O)NH2   R    分析  CH39H48N4O4
                         计算值C，70.13；H，6.81；
                               N，10.76；
                         实测值C，70.38；H，7.01；
                               N，10.79.
            表15
Figure A9410952701521
实施例            R3W                R2W             PChem259       
Figure A9410952701522
  -CH2CH3           产量：105mg(50.2％)260             -CH2CH(CH3)2      MS：795(M+)261             -CH2CH2CH3        产量：16.1mg(10.6％)262             -CH2CN               产量：40mg(4％)
                          表16实施例                化合物                        PChem263       CH3C(O)-NA-Val-Sta-Leu-NA-NH2        MS(FAB)：m/e824264       CH3C(O)-NA-Val-Sta-Gly-NA-NH2        MS(FAB)：m/e768265       CH3C(O)-NA-Val-Sta-Ala-NA-NH2        MS(FAB)：m/e781266       CH3C(O)-NA-Val-Sta-Val-NA-NH2        MS(FAB)：m/e809267       CH3C(O)-NA-Val-Sta-Ile-NA-NH2        MS(FAB)：m/e823268       CH3C(O)-NA-Val-Sta-Nva-NA-NH2        MS(FAB)：m/e809269       CH3C(O)-NA-Val-Sta-Nle-NA-NH2        MS(FAB)：m/e823270                NA-Val-Sta-Nva-NA-NH2        MS(FAB)：m/e767271                NA-Val-Sta-Nva-NA-OH          MS(FAB)：m/e768272       CH3C(O)-NA-Val-Sta-Nva-NA-OH          MS(FAB)：m/e810273       CH3C(O)-bNA-Val-Sta-Leu-bNA-NH2      MS(FAB)：m/e823274      MS(FD)：m/e719(M+)；617(100)275       
Figure A9410952701532
  MS(FD)：m/e751(M+，100)
如上面所提示，本发明提供了鉴定βAP产生抑制剂的方法，该方法包含：
(1)对试验系统给药天冬氨酰蛋白酶抑制剂：
(2)测定试验系统中产生的βAP：和
(3)将试验系统产生的βAP与对照试验系统中产生的βAP进行比较，对照试验系统中没有给药天冬氨酰蛋白酶抑制剂。
关于这方面，本发明将按如下程序进行试验：首先是把对典型的天冬氨酰蛋白酶，特别是对组织蛋白酶D具有抑制作用的待测化合物鉴定为天冬氨酰蛋白酶抑制剂。在此所应用的术语“试验系统”指的是用于测定天冬氨酰蛋白酶抑制活性的一种测定方法，用于这种鉴定过程的一个典型的试验系统是一个非细胞的测定法。此方法是在给药蛋白酶抑制剂后对蛋白酶底物的转化进行监测。然后，将蛋白酶抑制剂的转化与未给药这种天冬氨酰蛋白酶抑制剂的对照试验系统中底物的转化进行比较。在此处应用的术语“对照试验系统”指的是一个与试验系统平行操作的同样的试验系统，所不同的是没有给药天冬氨酰蛋白酶抑制剂。这种非细胞的测定方法可用于鉴定那些在非细胞环境中具有适宜的天冬氨酰蛋白酶抑制活性的待测化合物。
一个可用于在体外测定天冬氨酰蛋白酶抑制活性的非细胞测定法的实例，是使部分纯化的人脑组织蛋白酶D与一个底物，例如猪血管紧张肽原酶十四肽反应。将所得反应混合物分成几份，每份被孵育不同的时间。反应停止后，用反相高性能液相色谱法测定每份中底物的转化。蛋白酶抑制活性可根据底物转化的比率来计算。这种测定方法将在下述测定方法1中被进一步举例说明。
用于在体外测定天冬氨酰蛋白酶抑制活性的第二种非细胞的测定方法，是利用一块微滴度板，将一种适合的天冬氨酰蛋白酶，例如组织蛋白酶D加入到微滴度板的每个孔中，并同时作对照试验。再向每孔中加入一种适合的荧光测定底物。让所得反应混合物，在一个预先选定的时间，例如30分钟内进行反应。酶活性终止之后，用荧光测定法测定底物或其产物，然后，可根据底物转化比率计算蛋白酶抑制活性。此测定方法将在下述测定方法2中进一步举例说明。
用于在体外测定天冬氨酰蛋白酶抑制活性的第三种非细胞测定法，一般描述在下列文献中：Jupp，R.A.等，(1990)Biochem.J.，265：871-878和Rao等，J.Med.Chem.(1993)(印刷中)。本测定法是如下进行的：将一个待测化合物与一个适合的天冬氨酰蛋白酶，例如组织蛋白酶D在生色底物存在下共同孵育。然后，可通过定量测定对生色底物水解的竞争性抑制作用来测定抑制常数Ki值。在文献Dunn等(1986)Biochem.J.，237：899-906中，对用于测定天冬氨酰蛋白酶活性的各种生色底物进行了讨论。在文献Scarborough，P.E.等，Protein Science(1993)，2：264-276中公开了一个用于组织蛋白酶D测定法的优选生色底物。
底物溶液和裂解产物的浓度可以运用氨基酸分析法来检验。为了定量测定酶的活性浓度，可用一个与之紧密结合的抑制剂来滴定酶制备样品。酶浓度通常在1-6nm的范围内。待测化合物贮备液的浓度配制在1.0到5.0mg/mL的范围内。然后，可取这些待测化合物的贮备液50-100μL，进一步稀释至浓度范围在5到300μM，用于反应速率测定。
首先，为了对待测化合物的效力提供一个评估，可测定在4mM待测化合物存在下相对于对照反应，反应的初始速率被抑制的百分数。然后，在用于反应速率测定的浓度范围，例如5到300μM内，对待测化合物进行测定。
用分光光度计，在波长284-224nm的范围内监测吸光度的降低。一般在不同的时间点测定吸光度读数。然后以反应的起始速度对起始底物浓度作图。根据这些数据，可以计算出生色底物的动力学参数Km。然后运用Dixom作图法，可对Ki作评估测定(Dixon，M.，(1953)，Biochem J.，55：170-171)。
如果总的活性酶浓度对Ki评估值的比率([E]t/Ki)小于0.2，那么根据下列等式，运用非线性曲线拟合程序(non-linear curvefitting program)可计算出精确的Ki值。
v＝Vmax[S]/[S]＋Km(1＋[I]/Ki)在此，v为初始速度，[S]为初始底物浓度，[I]为抑制剂浓度，Km和Ki的定义同上。如果比值[E]t/Ki在0.2到10之间，那么运用如下文献中叙述的方法，可计算出精确的Ki值：Henderson，P.J.F.，(1972)Biochem J.，127：321-332。这种测定方法在测定法3中举例说明。
为了鉴定哪种天冬氨酰蛋白酶抑制剂最适合于用作βAP产生抑制剂，理想的做法是选择那些具有天冬氨酰蛋白酶抑制活性的待测化合物，在一种细胞环境中作进一步测定。根据那些已测定的待测化合物的相对排列顺序，可以对它们的天冬氨酰蛋白酶抑制活性作初步评定，但是，更典型的方法是根据对待测化合物抑制活性的绝对评定，这通常包括测定抑制浓度，即为达到任意的天冬氨酰蛋白酶抑制水平，例如50％，所需要的浓度。术语“IC50”指的是达到50％抑制所需要的浓度。
此IC50值可以运用上述二种方案之一来测定，为了测定对照值，首先测定没有可能的蛋白酶抑制剂存在时的天冬氨酰蛋白酶活性。然后在有各种浓度的每种待测化合物存在的情况下，测定天冬氨酰蛋白酶活性，导致50％蛋白酶活性抑制的浓度为IC50值。可预先选定一个IC50阈值，可把所有导致达到或低于此IC50阈值的待测化合物指定为适合的天冬氨酰蛋白酶抑制剂，并可对这些待测化合物按照本发明方法作进一步测定，此阈值是随意选定的，但通常是一个较低的浓度，一般低于10μg/mL，更通常是5μg/mL，常常是1μg/mL，并且有时是250ng/mL或者更低的浓度。
在鉴定天冬氨酰蛋白酶抑制剂时，为了选出那些抑制细胞内βAP产生的天冬氨酰蛋白酶抑制剂，将进行进一步筛选。βAP产生抑制活性一般用细胞测定法或动物模型测定法来测定，或同时用此二种方法测定。
细胞测定法优选利用一个已经被转染以过多产生βAP的细胞系，例如一个已经用对AD或其他βAP相关的症状起决定性作用的瑞典突变体或其他的突变体转染的细胞系。通常，这些测定方法是在一个已经给药天冬氨酰蛋白酶抑制剂的试验系统内和在一个不给药这种天冬氨酰蛋白酶抑制剂的对照试验系统中测定所产生的βAP，以便测定相对于对照系统的βAP产生的减少。这些测定方法可以用于测定βAP的产生，或者，可以测定是否存在与βAP产生有关的细胞特征。那些能够抑制或者影响细胞内βAP产生的天冬氨酰蛋白酶抑制剂，通常将作进一步的实验测定。
用于测定βAP产生抑制活性的试验系统一般是一种细胞测定法或一种动物模型。βAP产生抑制活性优选应用细胞测定法通过直接测定βAP生成来得到，对此，在共同未决申请(copending application)，序列号07/965,972中已有说明，全文公开的该申请作为参考文献并入本文。这种测定方法将在下述测定法4中举例说明。
例如哺乳动物细胞系，一般是人类细胞系，是在某种特定的条件下生长的，这种生长条件将导致细胞分泌出可测定量的(一般在大约0.1ng/mL到10ng/mL)βAP进入限制性培养基中。通过使细胞在能导致在限制性培养基中积累βAP的条件下生长，并将这些培养细胞暴露于某一天冬氨酰蛋白酶抑制剂，就可以测定天冬氨酰蛋白酶抑制剂对βAP产生的影响。一种能够降低βAP生成的天冬氨酰蛋白酶抑制剂可用于治疗AD和其他与βAP有关的症状。
用于本细胞测定法的典型的细胞系包括人类和动物细胞系，例如293人肾细胞系、人神经胶质瘤细胞系、人HeLa细胞、早期人内皮细胞(如HUVEC细胞)、初级人成纤维细胞或成淋巴细胞、初级人类混合脑细胞-包括神经元星形胶质细胞和神经胶质，还有中国大田鼠(Chinese hampster)卵巢(CHO)细胞等等。优选能够表达具有超量产生βAP能力的APP变异体的细胞系。在此所运用的术语“超量产生”的含义是由APP变异体所产生的βAP的量比由任何一个、或者全部正常的APP同型体如695、751和770氨基酸同型体所产生的βAP的量都要多，对这些以前已经有过描述。特别优选的APP变异体是那些正好在βAP断裂位点的氨基末端具有一个或几个氨基酸取代的变异体。例如，表达含有瑞典变异体的APP的K293细胞所产生的βAP的量是表达正常APP的细胞的大约6倍到8倍。
在可能存在的其他APP片段存在的情况下，通过对鉴定出本质上完整的βAP有足够选择性和灵敏度的任何技术，都可在限制性培养基中测定β-淀粉样蛋白肽。可以运用免疫学检测技术，并使用对βAP具有特异性结合能力的物质，例如对βAP具有必需的特异性和灵敏度的抗体、抗体片段、重组抗体等等。仅对βAP接点区具有单一特异性的抗体能够从其他片段中识别区分出βAP。这里所用的术语“βAP接点区”指的是βAP的某一区域，它集中在氨基酸残基16和17(Lys16和Leu17)之间的位点。βAP接点区是APP正常蛋白水解过程的作用靶标。此种正常的蛋白水解过程导致产生各种APP片段，这些片段对完整的βAP分子可能具有免疫学交叉反应性。已经发现针对着由βAP的氨基酸残基13-28组成的人工合成肽所产生的抗体，能够表现出具有这种必需的特异性。
合适的检测技术包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、蛋白质印迹法(Western blotting)以及放射免疫测定法等等。用于测定βAP产生的典型的细胞测定法，已在共同未决申请，序列号07/965,971中描述过。全文公开的该申请作为参考文献并入本文。这种测定方法是基于测定APP的一个片段(而不是βAP片段)，此片段是由于βAP生成而产生的，并分泌进入细胞培养基中。此分泌片段包含一个实质上完整的APP氨基末端序列，而此氨基末端序列终止在羧基末端残基(对于正常的APP序列此末端残基是蛋氨酸)的5个氨基酸之中，该羧基末端残基位于与βAP区和完整的APP相邻的区域内。特别是，这种分泌片段实际上可能是由几种序列组成的。它们都终止于APP的695氨基酸同型体的Met596和Lys595，并且具有与其他同型体相一致的编号和与APP突变体相一致的氨基酸，例如，对于瑞典突变体是Lys595-Met595到Asn595-Leu596。
优选的测定技术包括双位点或夹心测定法，测定中运用一个与某种固相相连接的接点区特异性抗体作捕捉抗体，和另一被标记的抗体，它能够与一个不同于捕捉抗体与之结合的抗原表位相结合。此第二个被标记的抗体优选能识别βAP的氨基末端，并且可针对本质上由βAP的氨基酸残基1-16组成的人工合成肽作抗原而方便地产生。
另一种方法是，βAP的产生可以用动物模型来监测，例如在WO91/19810中公开的小白鼠动物模型，全文公开的该申请作为参考文献并入本文。一个能表达另一种APP同型体和/或变异体的动物模型也可以用于筛选天冬氨酰蛋白酶抑制剂。除了上述细胞测定法之外，还进行了动物模型的典型测定过程。因此，本发明还提供了鉴定βAP产生抑制剂的方法，包括(1)用一种细胞测定法测定βAP的产生；以及(2)在一种试验动物的体液中测定βAP的产生可以通过测定试验动物给药天冬氨酰蛋白酶抑制剂之前，和给药之后试验动物体液中是否存在βAP或βAP片段，来测定试验动物的体液中βAP的产生。
本发明提供了抑制细胞中β-淀粉样蛋白产生的几种方法，包括对细胞给予通过上述方法选出的一种天冬氨酰蛋白酶抑制剂。例如，该天冬氨酰蛋白酶抑制剂可以加入到某一细胞培养基中，以便抑制该培养细胞所产生的βAP。另一种方法是，可以将该天冬氨酰蛋白酶抑制剂给予某一需要这种治疗的哺乳动物，以便抑制β-淀粉样蛋白的产生和继而抑制与AD的其他βAP相关疾病有关的淀粉样蛋白蚀斑的沉积。
下述的测定方法将通过举例具体说明的方式，而不是以限定的方式给出。运用这些测定方法可验证在本发明方法中所使用的化合物抑制天冬氨酰蛋白酶，特别是组织蛋白酶D的能力。
测定方法1
对组织蛋白酶D的抑制活性
(非细胞测定方法)
人脑组织蛋白酶D是从冷冻的运动皮层后叶(post-mortem cortex)，实质上是按照如下文献中的方法纯化得到：Nixon and Morotta，(1984)J.Neurochem.，43：507-516。制得皮层物质后，将其施加于DEAE-Sepharose_柱上。收集经柱流出的级分，对50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)透析，然后再施加于伴刀豆球蛋白A Sepharose_柱上，用含有0.5M甲基α-D-吡喃甘露糖苷，pH7.5的50mM Tris-缓冲液洗脱。被洗脱出的具有组织蛋白酶D活性的级分再对pH7.5的25mMTris缓冲液透析，使用之前一直在-40℃贮存(Con A pool)。
对于每次实验测定，将50μL Con A pool用200mM柠檬酸钠(pH4.5)和150mM氯化钠(NaCl)稀释至270μl与用二甲亚砜(DMSO)稀释的15μl待测化合物贮备液一起，在4℃下共同孵育10分钟。然后向每个反应混合物加入底物，使底物的最后浓度为44μM，包含在总体积300μl中，将底物，即猪血管紧张肽原酶十四肽(CH3C(O)-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-Ser[SEQ ID No：3]购自Bachem Bioscience，Ine.，PhiladelPhia，PA)加到各反应混合物中，以形成在300μl总体积中最终浓度为44μM。所述样品再在37℃下分别温育0分钟，10分钟，20分钟或30分钟，然后煮沸5分钟使反应停止。将样品用微量离心机，在4℃下，以14,000rpm的转速离心10分钟。离心之后，从每个反应样品中取200μl，用一个Perkin Elmer ISS 100自动采样器，注入到C18 RPLC柱(Vydac，Hesperia，CA)上，用梯度洗脱液，0-50％CH3CN的0.1％CF3CO2H溶液以2ml/min的速度洗脱肽产物峰用一台Perkin Elmer LC95检测器在波长220nm处进行监测，并以Rainin Dynamax软件对肽产物峰作积分处理，以便对其活性作定量测定。
用测定方法1，对在实施例41-48中所制备的化合物以及胃酶抑素，测定它们对组织蛋白酶D的抑制活性。测定结果以IC50值的形式归纳在测定表1中。IC50值是通过将给予了各种天冬氨酰蛋白酶抑制剂的样品中组织蛋白酶D活性与未给予这种天冬氨酰蛋白酶抑制剂的对照样品中组织蛋白酶D活性相比较而测定的。
                     测定表1
           组织蛋白酶D活性(非细胞测定法)化合物                 结构                        IC50(nM)胃酶抑素    Iva-Val-Val-Sta-Ala-sta                  0.1实施例41    CH3C(O)-Gly-Val-Val-sta-Ala-Thr-OH      4实施例42    (CH3)2CH-Gly-Val-Val-sta-Ala-Thr-OH   8实施例43    Gly-Val-Val-sta-Ala-Thr-OH               53实施例44    (CH3)2CH-Gly-sta-Ile-Ala-Thr-OH      ＞100实施例45    Gly-Val-Sta-Ala-Thr-OH                  ＞250实施例46    (CH3)2CH-Gly-Val-sta-Ala-Thr-OH      ＞250实施例47    (CH3)2CH-Gly-Val-Val-Ile-sta-Thr-OH  ＞250实施例48    (CH3)2CH-Gly-Val-sta-Ile-Ala-Thr-OH  ＞250
                 测定方法2
对组织蛋白酶D的抑制活性
(非细胞荧光测定法)
可以采用下面文献中公开的荧光测定法的改良法来测定血管紧张肽原酶的活性：Murakami等，(1981)Anal.Biochem.100：232-239。将人肝脏组织蛋白酶D(购自Athens Research and Technology，Athens，GA)用测定缓冲液(200mM NaOAC pH4.5，150mM MaCl)稀释至500ng/ml。然后在96孔测定板内，除对照孔外，每个孔各加入100μl这种组织蛋白酶D溶液，对照孔则只加入100μl测定缓冲液。通过溶解某一天冬氨酰蛋白酶抑制剂于二甲亚砜(DMSO)中来制备待测化合物贮备液，配制成测定方法中使用的各种浓度。然后将5μl待测化合物贮备液加入上面制备的测定板的每个孔中，空白对照和酶对照孔各加入5μl DMSO载体。
接着在25℃下温育10分钟，使酶/待测化合物相互作用，然后向每个孔中加入以DMSO配制的5μl 500μm荧光底物(Suc-Arg-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Try-AMC[SEQ ID NO：4]购自Bachem Biosciences，Philadelphia，PA)以引发反应。在37℃温育30分钟后，通过向每个反应孔各加入100μL 400mU/ml微粒体亮氨酸氨基肽酶(EC3.4.11.2，购自Sigma，St.Louis，MO)的1MTris-HCl(pH8.0)溶液使组织蛋白酶D活性终止。
然后用荧光计(CytoFluor 2350，Millipore，Bedford，MA)对测定板作分析测定。为了防止由于待测化合物而形成的背景荧光干扰，分析测定中使用的激发波长为360nm，发射波长为460nm。再在37℃温育2小时以使氨基肽酶催化从组织蛋白酶D裂解产物中释放出荧光团，7-酰氨基-4-甲基香豆素(AMC)，并将测定板再次用荧光计作分析测定。为了防止可能出现的假阳性，也就是说可能存在微粒体亮氨酸氨基肽酶抑制剂，可通过向每个孔加入20μl 2.5mMLeu-pNA(购自Bachem Biosciences，Philadelphia，PA，用10％DMSO配制)，并直接检测每个孔中残留的氨基肽酶活性。用UVmax微量测定板检测仪(UVmax microplate reader)(Molecular Devices，MenloPark，CA)在波长405nm作为吸光度的增加测定氨基肽酶的活性。
用测定方法2，对在实施例9、12、13、20-23、23A、24、30、41-43、45和48中制备的化合物，以10μg/ml的浓度用于测定对组织蛋白酶D的抑制活性。在这些条件下，组织蛋白酶D活性显示出线性相关，并且测定结果表示为对照活性的百分抑制率(见下面测定表2)。表中列出的所有结果为至少4次重复测定结果的平均值和标准偏差。
                     测定表2
         组织蛋白酶D活性(非细胞荧光测定法)
     实施例           对组织蛋白酶D的抑制作用
       9                    44.4±1.9％
       12                   12.4±3.7％
       13                   91.4±0.4％
       20                   94.8±0.6％
       21                   78.3±3.8％
       23                   96.3±0.9％
       23A                  32.5±4.7％
       24                   92.7±0.5％
       30                   69.2±3.5％
       41                   98.3±0.1％
       42                   89.5±1.3％
       43                   87.9±2.4％
       45                   30.6±4.8％
       48                   79.9±2.7％
                    测定方法3
              对组织蛋白酶D的抑制活性
                  (非细胞测定法)
用某一生色底物测定天冬氨酰蛋白酶活性的测定方法被用于测定待测化合物的抑制常数Ki。将冷冻的人胎盘组织化冻，用组织匀浆器(Waring blender)在10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)和0.5％Brij 35内作成匀浆。组织匀浆用Sorvall GSA转子，以10,000rpm的转速离心30分钟。上层清液用5.7N HCl调整到pH3.7，然后加入乙酸钠，使其浓度为0.1M。将所得混合物在0℃保温30分钟，导致沉淀物的形成。通过离心(转速10,000rpm，离心30分钟)弃去此沉淀物。并将酸性上层清液施加于色谱柱(为Pepstatinyl琼脂糖柱，用0.1M乙酸钠(pH3.5)，0.1％Brij 35和1M NaCl溶液平衡)上，洗脱直到流出物在280nm的光密度(OD280)回到基线，然后再用PH8.6，含0.1％Brij 35和1M NaCl的50mMTris-HCl缓冲液洗脱。将洗脱液对pH7.0，含有0.1％Brij35和0.1M NaCl的10mM磷酸钠溶液透析，然后，将此经过透析处理的样品施加到一个1ml的DEAE-Sephacel柱上，此柱已用与上述相同的缓冲液平衡处理过。在流出的级分中回收组织蛋白酶D。
将酶混合物(125μl缓冲液(0.1M甲酸钠，pH3.7)、1μl1mM的待测化合物溶液、4μl DMSO、酶和水，总体积为230μl)在加入生色底物之前搅拌并预保温4分钟。保温后，自底物溶液的625μl稀释液中取20μl，加入此酶混合物。对照反应混合物也同样配制，但不加入待测化合物。通过对反应混合物和对照反应混合物进行平行监测，在某一特定的浓度(即14μM)待测化合物存在下可以测定待测化合物对酶反应初始速度抑制作用的百分数。
以一台装配有多室传输器(multi-cell transport)和恒温调节于37℃的Hewlett-Packard 8452A二极管陈列分光光度计(diode array spectrophotometer)，在284-324nm波长范围内跟踪检测样品吸光度的降低。对于作为检测目标的波长范围，每移动2nm，以0.1秒的时间间隔读取吸光度读数。每个比色杯取样测定5次，所得读数为每个时间点读数的平均值。对于每个比色杯，以17.2秒的循环周期重复读数，持续时间大约1000秒。
反应的初始速度可从反应线性相的斜率计算出，然后以反应的初始速度对反应开始时底物的浓度作图。再按照Marquardt分析法，将这些数据代入标准的Michaelis-Menten方程式，通过计算，得到该底物的Km计算值。Ki值将运用Dixon作图法进行初步估算，然后再如前面所述，运用非线性曲线拟合程序([E]t/ki＜0.2)或Hender-son方法(0.2＜[E]t/ki＜10)进一步计算Ki值。
运用测定方法3测定了在实施例1-11、14-19、22-28和30-37中所制备的化合物对组织蛋白酶D的抑制活性。测定结果归纳在测定表3A和3B中。
     测定表3A
实施例          Ki(μM)
   1          1.16±0.26
   2          0.75±0.14
   4          6.20
   5          0.24
   6          1.80±0.26
   7          0.42±0.06
   8          1.17
   9          0.82
  10          5.51
  17          2.3±0.2
  18          2.2±0.2
  22          0.9±0.1
  23          0.073
  24          0.042
  25          1.44±0.26
  26          2.30±0.41
  33          0.023±0.003
  34          0.018
  35          0.086
  36          0.00039±0.00004
  37          0.00054±0.00007
  38          0.00047±0.00007
  39          0.00053±0.00009
  40          0.00098±0.00012
               测定表3B
        实施例    ％抑制率(在4μM)
           3            40
          11            32
          14            22
          15            49
          16            36
          19            48
          27            40
          28             6
          30            28
          31            43
          32            12
                 测定方法4
对βAP产生的抑制作用(细胞测定法)
运用下面文献中所叙述的方法，以含有通常叫作瑞典突变的双重突变Lys651-Met652至Asn651-Leu652(编号APP-751)的APP-751基因，对二个细胞系(人肾细胞系293和中国大田鼠卵巢细胞系(CHO))作稳定的转染处理：Citron等(1992)Nature 360：672-674。把被转染的这二个细胞系分别称作293 751 SWE和CHO 751 SWE，将其用Corning 96孔板配制细胞培养测定板：细胞用加有10％胎牛血清的Dulbecco′s最低限制度必需培养基配制，每孔分别加入2.5×104或1×104个细胞。在一个以10％二氧化碳(CO2)平衡的培养箱中，将细胞板在37℃培养过夜后，遗弃各孔中原有的培养基，以200μl/孔含有天冬氨酰蛋白酶抑制剂的培养基代替。这样经过二小时的预处理时间后，再遗弃各孔中的培养基，并以新鲜的含有天冬氨酰蛋白酶抑制剂的培养基代替，细胞继续培养2小时。
用二甲亚砜(DMSO)配制天冬氨酰蛋白酶抑制剂贮备液，以使在处理时所用的最终浓度时，DMSO的浓度不超过0.5％。处理后，在室温下，将细胞培养板置于Beckman GPR中，以1200rpm转速离心5分钟。使细胞碎片从限制性培养基中分离沉淀出。然后从每个孔中取出100μl限制性培养基移入ELISA板中此ELISA板已经事先用针对βAP-13-28的抗体266包被过(Seubert等，同上述)，将此ELISA板置于4℃下贮藏过夜。第二天，用标记抗体6C6(针对βAP-1-16)进行ELISA检测试验，以测定βAP的生成量。
可用如下文献的改进方法测定化合物的细胞毒性作用：Hansen等(1989)J.Immun.Meth.，119：203-210。向残留在组织培养板中的细胞中，加入25μL溴化3，(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基四唑鎓(MTT)贮备液(5mg/mL)，至最后浓度为1mg/mL。将细胞于37℃培养1小时后，通过加入等体积MTT溶解缓冲液(20％w/v十二烷基硫酸钠的50％DMF溶液，pH4.7)以中止细胞活性。在室温下摇振过夜，以达到完全抽提的目的。用Molecular Devices UVmax微量培养板检测仪测定OD562nm和OD650nm的差值，并以此值作为细胞活力的指征。
将ELISA测定的βAP结果在标准曲线上查对，并以ng/mLβAP肽表示。为了使细胞毒性测定结果规范化，可将这些βAP测定结果除以MTT作用下的测定结果，以相对于无药物对照测定结果的百分数来表示。
运用测定方法4，在细胞中以10μg/ml的浓度测定上述实施例9、12、13、20-23、23A、24、30、41-43、45和48中制备的化合物对βAP产生的抑制活性。下列测定表4中所列的结果是至少6次重复实验结果的平均值和标准偏差。
                  测定表4
       对βAP产生的抑制活性(在细胞中)
实施例    对βAP产生的抑制作用
   9            44.4±7.7％
  12            12.4±6.0％
  13            91.4±3.9％
  20            94.8±3.1％
  21            78.3±1.5％
  23            96.3±2.8％
  23A           32.5±3.3％
  24            92.7±1.4％
  30            69.2±2.2％
  41            -6.2±6.2％
  42            13.1±7.5％
  43            16.2±8.5％
  45            3.3±1.1％
  48            1.6±19.8％
可给药本发明化合物以用于预防和/或治疗与βAP沉积有关的疾病，例如AD、Down′s综合征和脑的晚期老化。在用作治疗药物时，化合物是对已经患有所述疾病的宿主给药。化合物的给药量应足以抑制βAP蚀斑的进一步沉积。为了达到治疗和/或预防效果，本发明化合物给药的特殊剂量当然由围绕病例的具体情况来决定，包括诸如，给药化合物、给药途径、所治疗的症状、所治疗患者的个体差异等等。一般日剂量为对于每千克体重含有本发明活性化合物的剂量水平为约0.01mg/kg到大约50mg/kg。优选的日剂量通常为大约0.05mg/kg到大约20mg/kg，理想的是大约0.1mg/kg到大约10mg/kg。
在用于预防疾病时，本发明的化合物是给予对阿尔茨海默氏病或与βAP有关的疾病易感的、但还没有患有这种疾病的宿主。如在医学文献中所述(参见例如：Goate，(1991)Nature 349：704-706)，对于这种宿主，可以通过遗传筛选法和临床分析法来鉴定。所述化合物可以在症状出现的早期阶段抑制或预防βAP蚀斑的形成，优选预防甚至β-淀粉样蛋白病的初期阶段。
所述化合物可以按照各种途径给药，包括口服、直肠、经皮、皮下、静脉内、肌内和鼻内等途径。本发明化合物优选在给药前制成制剂。
在这种制剂中的活性成份的含量占整个制剂的0.1％到99.9％(重量)。“可药用”是指载体、稀释剂或赋形剂与制剂中的其他成份是相适合的，并对药物接受者是无害的。
例如，一个用于肌内注射的典型的药物组合物在1mL到4mL无菌缓冲水中含有大约1μg到1mg化合物。用于静脉内灌注的典型的药物组合物在100～500mL无菌Ringer′s液中含有大约1mg到100mg化合物。
药物制剂是运用已知的和易于得到的成份，按照已知的方法制备的。在制备本发明组合物时，通常是将活性成份与某一载体混合，或者以某一载体稀释，或者包裹在某一载体内，这时，该载体可能是胶囊形、小囊(sachet)形、薄片形或其他容器的形式。当载体用作稀释剂时，它可为固体、半固体或者液体物质，作为活性成份的载体、赋形剂或介质。因此，所述组合物可以做成下列剂型：片剂、丸剂、粉剂、锭剂、小囊剂、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂(以固体形式，或者在某种液体介质中)、软膏剂(含有例如最多达10％(重量)的活性化合物)、软的和硬的明胶胶囊剂、栓剂、无菌注射液、无菌包装的粉剂等等。
经常希望或者有必要将药物组合物直接或间接地引导进入脑内。直接导入技术通常涉及在宿主的脑室系统安置药物传输导管，以绕过血-脑屏障。间接导入技术，是通常优选的方法，涉及将所述组合物制成制剂，通过把亲水性药物转化成脂溶性药物的方法，使药物具有越过血-脑屏障的潜在能力(Latentiation)。这种潜力的获得，一般可以通过阻断存在于药物分子上的羟基、羧基和伯氨基的方法来实现，这样可使药物具有更强的脂溶性，因而能顺从地越过血-脑屏障。另一种方法是，通过向动脉血管内输入高渗溶液，这样可以暂时开放血-脑屏障，因而能提高亲水性药物传递进入血-脑屏障的能力。

Claims (11)

1.天冬氨酰蛋白酶抑制剂或其可药用盐在制备抑制β-淀粉样蛋白肽(βAP)产生的药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的用途，其中天冬氨酰蛋白酶抑制剂为组织蛋白酶D抑制剂。
3.根据权利要求1所述的用途，其中天冬氨酰蛋白酶抑制剂为以下式I化合物或其可药用盐：其中i为1、2、3或4；
R1为C1-C6烷基、芳基、环己基或-S-R1x，其中R1x
  为芳基或环己基；
W为
其中R1W和R2W系独立地选自氢、C1-C6烷基、芳基(C1-C4)烷基、杂环(C1-C4)烷基、不饱和的杂环(C1-C4)烷基，或者R1W和R2W与它们所连接的氮原子一起形成杂环或不饱和的杂环，条件是该氮原子不可被季铵化；
q为0、1、2、3或4；
R2为氢、卤素、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷硫基或氨基；或者
W为
Figure A9410952700031
其中
j为1或2；
R3W为氢、甲酰基、氨基甲酰基或-(B)e-X-Ro，其中B为-C(O)-或-S(O)k-；
k为0、1或2：
e为0或1；
x为-(CH2)g-、-(CH2)m-O-(CH2)n-或-(CH2)m-NRx-(CH2)n-，其中g为0、1或2；
m和n独立地为0、1或2；
Rx为氢或C1-C4烷基；
Ro为C1-C6烷基、C1-C4烷氧羰基、甲酰基、C2-C6链烷酰基、氨基、三氟甲基、C1-C4烷氨基、二(C1-C4)烷氨基、芳基、杂环或不饱和的杂环；
R2各自独立地为氨基酸侧链、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2(CH2)2CH3、-C(CH3)3、-CH2SO2NH2、-CH2CN、-(CH2)r-X1-R2a、-(CH2)s-C(O)NR2bR2c或-(CH2)t-S(O)k-[1-N(R2d)-四唑-5-基]，
    其中r、s和t独立地为0、1或2；
    X1为一条键、二价的(C1-C4)烷基、二价的(C2-C4)链烯基、二价的(C2-C4)炔基、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)NR2b-、-NR2b-C(O)-、-NR2b-、-C(O)-、-O-或-S(O)k-
    R2a为C1-C6烷基、芳基、芳基(C1-C4)烷基、杂环、杂环(C1-C4)烷基、不饱和的杂环或不饱和的杂环(C1-C4)烷基；
    R2b为氢或C1-C4烷基；
    R2c为氨基、C1-C6烷氧基、C1-C6烷基、-(CH2)m-二(C1-C4)烷氨基、芳基、芳基(C1-C4)烷基、杂环、杂环(C1-C4)烷基、不饱和的杂环或不饱和的杂环(C1-C4)烷基：
R2d为氢、C1-C6烷基、芳基、不饱和的杂环、不饱和的杂环(C1-C4)烷基或芳基(C1-C4)烷基；R为：
Figure A9410952700052
或
Figure A9410952700061
其中
A为-CH2-或
Y为芳基或不饱和的杂环；
Y1为杂环；
R4W为羟基或氨基；
R3a为一具有下式的基团：
1)-C(O)-NR4R4，或
R3b为一具有以下结构的基团：
Figure A9410952700065
Figure A9410952700071
或
    p为4或5；
    1为3、4或5；
    R4在各情况下独立地为氢、C1-C6烷基或羟基(C1-C4)烷基；
    R5和R6系独立地选自氢、羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、氨基、C1-C4烷氨基、羟基(C1-C4)烷基、羧基、C1-C4烷氧羰基、氨基甲酰基、N-(C1-C4)烷基氨基甲酰基、芳基、杂环或不饱和的杂环；条件是
(1)如果R为
Figure A9410952700073
那么
W为
Figure A9410952700081
R3W为甲酰基、氨基甲酰基或-(B)e-X-Ro，
  其中
  e为1；和
  B为-C(O)-；
(2)如果R为
Figure A9410952700082
那么
W为
Figure A9410952700083
；和
  j为2；和
(3)如果R为
Figure A9410952700084
或那么
i为1；和
R1为芳基、环己基或-S-R1x，其中R1x为芳基或环己基。
4.根据权利要求3所述的用途，其中天冬氨酰蛋白酶抑制剂为式I化合物或其可药用盐：其中i为1；
R1为-CH(CH3)2或苯基；
W为
其中R3W为氢或-B-X-Ro，其中B为-C(O)-或-S(O)2-；X为-(CH2)a-或-(CH2)m-O-(CH2)n-，其中g为0；m和n独立地为0、1或2；Ro为C1-C6烷基、芳基或不饱和的杂环；
R2为氨基酸侧链、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH2(CH2)2CH3、-CH2CN或-CH2-R2a，其中R2a为芳基；
R为 或
其中
R4W为氨基；
Y为苯基；
R3a为-C(O)NH(叔丁基)；条件是如果R为
Figure A9410952700111
那么j为2。
5.根据权利要求1所述的用途，其中天冬氨酰蛋白酶抑制剂为式II化合物或其可药用盐：
     R7-Gly-(R8)f-Thr-OH              II其中R7为C1-C6烷基、甲酰基或C2-C6链烷酰基；
f为1-6；
R8各自独立地为氨基酸残基、4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基或4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基衍生物；条件是：
(1)当f为1时，R8必须为4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基或4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基衍生物；
(2)当f为3～6时，-(R8)f-中4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基和4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸残基衍生物的总数不能超过2。
6.天冬氨酰蛋白酶抑制剂或其可药用盐，在制备预防或治疗阿尔茨海默氏病(AD)的药物方面的应用。
7.天冬氨酰蛋白酶抑制剂或其可药用盐，在制备治疗或预防与βAP有关的疾病的药物方面的应用。
8.鉴定βAP产生抑制剂的方法，该方法包含：
(1)对试验系统给药天冬氨酰蛋白酶抑制剂；
(2)测定试验系统中产生的βAP；和
(3)将试验系统产生的βAP与未给药这种天冬氨酰蛋白酶抑制剂的对照试验系统产生的βAP进行比较。
9.根据权利要求8所述的方法，其中天冬氨酰蛋白酶抑制剂的鉴定是通过在有和无试验化合物存在下，用非细胞测定法测定天冬氨酰蛋白酶的活性进行的。
10.权利要求权利要求8所述的方法，其中产生的βAP通过以下方法测定：
(1)将天冬氨酰蛋白酶抑制剂置于细胞试验中；和
(2)测定有关βAP产生的细胞特征。
11.鉴定βAP产生抑制剂的方法，该方法包含：
(1)鉴定天冬氨酰蛋白酶抑制剂；
(2)用细胞测定法测定产生的βAP；和
(3)测定试验动物体液中产生的βAP。
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