JP6564032B2 - 造影剤用の化合物 - Google Patents

造影剤用の化合物 Download PDF

Info

Publication number
JP6564032B2
JP6564032B2 JP2017525594A JP2017525594A JP6564032B2 JP 6564032 B2 JP6564032 B2 JP 6564032B2 JP 2017525594 A JP2017525594 A JP 2017525594A JP 2017525594 A JP2017525594 A JP 2017525594A JP 6564032 B2 JP6564032 B2 JP 6564032B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
synuclein
dihydromyricetin
compound
aggregates
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017525594A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018505845A (ja
Inventor
エム，アリ エル‐アグナフ，オマル
エム，アリ エル‐アグナフ，オマル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
United Arab Emirates University
Original Assignee
United Arab Emirates University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by United Arab Emirates University filed Critical United Arab Emirates University
Publication of JP2018505845A publication Critical patent/JP2018505845A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6564032B2 publication Critical patent/JP6564032B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
    • A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
    • A61K31/216—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acids having aromatic rings, e.g. benactizyne, clofibrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/343—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide condensed with a carbocyclic ring, e.g. coumaran, bufuralol, befunolol, clobenfurol, amiodarone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2835—Movement disorders, e.g. Parkinson, Huntington, Tourette
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
  • Nuclear Medicine (AREA)

Description

［技術分野］
本発明は、漢方薬から分離される化合物及びこれらの化合物をα−シヌクレイン凝集体の存在の検出及びシヌクレイン性疾患（synucleinopathic disorder）の診断及びモニタリングに用いることに関する。また、本発明は、シヌクレイン性疾患の治療における当該化合物の用途に関する。
［背景技術］
シヌクレインにおける異常に関係する疾患は、シヌクレイン病と称されることが多い。シヌクレイン病は、神経変性状態、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）を含む。
シヌクレインは、約１４ｋＤａの低分子量のタンパク質ファミリー（family）であり、神経組織において高濃度で発現する。当該ファミリーの３つのメンバーは、α−、β−及びγ−シヌクレインである。α−シヌクレインは、主に脳組織において発現し、主としてニューロンのシナプス前終末に位置する。α−シヌクレインは通常、可溶性のモノマータンパク質として存在するが、その環境に依存していくつかの異なる折り畳まれた構造をとり得る。また、モノマーのα−シヌクレインは、凝集してオリゴマーになり得、加えて、凝集してより高分子量の不溶性の原線維（フィブリル（fibril））になり得る。α−シヌクレインの凝集は、モノマーのα−シヌクレインが可溶性のオリゴマー（初期凝集体（early aggregates））の形態を経由して、より高分子量の規則的なフィブリル（後期凝集体(late aggregates)）に変わることで進行する。
シヌクレイン病において、ＰＤ及びＤＬＢの脳ホモジネート中の可溶性のα−シヌクレインオリゴマーは、正常な脳と比較して増加していることが示されてきた。神経病理学的研究が行われ、変性したドーパミン作用性の黒質ニューロン並びに他の皮質ニューロン及び皮質下のニューロンにおいてみられる細胞質内封入体の存在が明らかとなった。脳内のこれらの病変は、レビー小体（Lewy bodies）及びレビーニューライト（Lewy neuritis）として知られ、かつ、ＤＬＢ患者の脳における主要な病理学的特徴を構成することが示されてきた。しばしばＰＤ及びＤＬＢの末期を特徴付けるこれらの神経病理学的病変は、繊維状のα−シヌクレインの沈着物から構成されることが広く見出されてきた。さらなる研究によって、α−シヌクレインは、ＭＳＡにおいて見られる細胞質内封入体等の非神経細胞が時として関わる他の神経変性疾患における病変にも関係していることが示された。
薬草又は薬用植物から抽出された漢方薬組成物は、広範囲の疾患の治療に何百年もの間使用されてきた。伝統的な漢方薬は、認知症及び他の神経変性疾患を含む様々な疾患の治療薬として使用されてきた。伝統的な漢方薬組成物の背後にある薬理学的根拠を究明することへの取り組みがなされてきた。
朝鮮人参は、研究されてきた漢方薬組成物の１つである。朝鮮人参の薬理学的特性は、主にその生物学的に活性な成分であるジンセノサイドに起因すると考えられる。ジンセノサイドは、根、葉、及び実を含む朝鮮人参の様々な部分から抽出され得る。ジンセノサイドは、四環系であり、糖部分及び脂肪族側鎖を持つステロイド構造を有するトリテルペノイドダンマラン誘導体である。
他の漢方薬組成物は、タンジン(danshen)である。タンジンの薬理学的特性は、サルビアノリン酸Ｂ及びその抗酸化能力に起因すると考えられてきた。さらに他の漢方薬組成物は、ケンポナシ（Japanese raisin tree）である。ケンポナシの薬理学的特性は、ジヒドロミリセチン、フラボノイドに起因すると考えられてきており、その化合物は二日酔いの治療薬として使用されてきた。
国際公開２００９／０２７６９０号は、α−シヌクレインに結合(bind)するペプチドを開示し、加えて、シヌクレイン病の診断及びモニタリングにおけるそれらの用途に言及している。国際公開０３／６９３３２号及び国際公開９９／５０３００号は、モノクローナル抗体を使用してα−シヌクレインのオリゴマー形成を検出する方法を開示している。
本発明は、被検者におけるシヌクレイン病のイメージング（imaging）及び／又は診断において使用され得るさらなる化合物を提供することを目的とする。
［発明の概要］
本発明は、α−シヌクレインのフィブリルに結合（bind）しかつ当該フィブリルを分散させる(disaggregate)能力を有する化合物を対象とする。
当該化合物である、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン及びサルビアノリン酸Ｂは、伝統的な漢方薬に用いられる植物において見出され、α−シヌクレインの凝集体を結合しかつ分散させることが見出されてきた。
従って、本発明は、α−シヌクレインの凝集体の検出において使用するための造影剤を対象とし、当該造影剤は、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された１つの化合物及び検出可能な標識を含む。
さらに、本発明は、α−シヌクレインの凝集体を検出する方法を提供し、当該方法は：
−ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された１つの化合物を投与するステップと、
−当該化合物のα−シヌクレイン凝集体への結合を検出するステップと、を含む。
当該方法は、インビトロ（in vitro）の方法であり得るか又はインビボ（in vivo）の方法すなわち被検体の体内での方法であり得る。インビトロの方法の１つの実施形態において、当該方法は、被検体から得られたサンプルに当該化合物を投与する（administrating）ステップを含む。
本発明は、α−シヌクレイン凝集体をイメージングする方法をさらに提供し、当該方法は、化合物ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂのα−シヌクレイン凝集体への結合を検出するステップを含む。凝集体をイメージングするための当該方法は、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された１つの化合物を投与するステップと；当該化合物のα−シヌクレイン凝集体への結合を検出するステップと、を含み得る。
当該方法は、サンプル中のα−シヌクレイン凝集体をイメージングするための方法であっても良く、被検体中のα−シヌクレイン凝集体をイメージングするための方法であっても良い。インビトロでα−シヌクレイン凝集体をイメージングするための方法において、当該方法は、当該化合物を被検体から得られたサンプルに投与するステップを含み得る。１つの実施形態において、当該サンプルは、脳組織のサンプルであり得る。
被検体におけるα−シヌクレイン凝集体をイメージングするための方法において、当該方法は、当該化合物を被検体に投与するステップを含み得る。１つの実施形態において、当該方法は、非外科的手段によって当該化合物を投与するステップを含み得る。
検出される化合物は、検出可能な標識を含み得る。α−シヌクレインフィブリルへの当該化合物の結合の存在は、オートラジオグラフィー（autoradiography）、ポジトロン放出断層撮影(positron emission tomography)、核磁気共鳴画像法(magnetic resonance imaging)、ガンマカウンタ(gamma counter)、又はシンチレーションカウンタ(scintillation couner)によって検出され得る。
本発明は、シヌクレイン性疾患（synucleinopathic disease）を診断する方法をさらに提供し、当該方法は、α−シヌクレイン凝集体の存在又は非存在を検出するステップを含む。α−シヌクレイン凝集体の存在は、被検体がシヌクレイン性疾患を有していることを示す。α−シヌクレイン凝集体の非存在は、被検体がシヌクレイン性疾患を有していないことを示す。
当該シヌクレイン性疾患を診断する方法は：
−被検体からの組織及び／又は体液のサンプルをジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された化合物とインビトロで混合するステップと、
−当該サンプルにおけるα−シヌクレインの凝集体の存在又は非存在を検出するステップと、を含み得る。
本発明は、α−シヌクレイン及び／又はα−シヌクレインのフラグメントが関わるシヌクレイン性疾患を診断するインビトロの方法を提供する。当該方法は：
（ａ）患者からの組織及び／又は体液のサンプルと、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された化合物とを、当該化合物を当該サンプル中に存在するα−シヌクレインの凝集体に結合させるために効果的な条件下で、インビトロで混合するステップと、
（ｂ）前記サンプル中のα−シヌクレインの凝集体の存在又は非存在を検出するステップであって、α−シヌクレイン凝集体の存在は、当該被検体（subject）がシヌクレイン性疾患を有していることを示し、α−シヌクレイン凝集体の非存在は、当該被検体がシヌクレイン性疾患を有していないことを示すステップと、を含む。
被検体におけるシヌクレイン性疾患を診断する代替的方法は、
−ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された化合物を被検体に投与するステップと、
−被検体におけるα−シヌクレイン凝集体の存在又は非存在を検出するステップと、を含む。
当該化合物は、非外科的方法によって被検体に投与されても良い。
本発明は、シヌクレイン性疾患を有している被検体においてα−シヌクレイン凝集体を分散させる方法をさらに提供する。当該方法は、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された化合物を被検体に投与するステップを含む。当該α−シヌクレイン凝集体は、レビー小体又はレビーニューライトであり得る。
また、本発明は、シヌクレイン性疾患を有している被検体におけるレビー小体若しくはレビーニューライトにおけるフィブリルを分散させるための医薬品組成物であって、ジヒドロミリセチン、ジンセノサイドＲｂ１、サルビアノリン酸Ｂ、又は薬学的に許容可能な塩若しくはその溶媒和物、及び薬学的に許容可能な希釈剤若しくはキャリア（carrier）を含む医薬品組成物に関する。
本発明は、シヌクレイン性疾患を有している被検体においてα−シヌクレインのフィブリル化を抑制する方法をさらに提供する。当該方法は、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された化合物を被検体に投与するステップを含む。
図１は、ジンセノサイドＲｂ１（Ｇｎ Ｒｂ１）（Ａ）、サルビアノリン酸Ｂ（Ｂ）及びジヒドロミリセチン（Ｃ）によるα−シヌクレインのフィブリル化の抑制を示している。α−シヌクレイン（２５μＭ）のサンプルは、連続的な振動を伴って様々な濃度の化合物（１００ｕＭ, ５０ｕＭ及び２５μＭ）の存在下で３７℃で５日間インキュベート（incubated）された。フィブリルの形成は、Ｔｈ−Ｔ結合アッセイ（Ｔｈ−Ｔ binding assay）によって測定された。当該分析は３回行われ、平均値±標準偏差が示されている。 図２は、Ｇｎ Ｒｂ１（Ａ）、サルビアノリン酸Ｂ（Ｂ）及びジヒドロミリセチン（Ｃ）のコンゴレッド結合分析の結果を示している。エージングされたα−Ｓｙｎ（５μＭ）が単体で又は異なる濃度のジンセノサイドの存在下で、コンゴレッドと混合された（最終的な濃度５μＭで）。分光光度計において、４００ｎｍから６００ｎｍまでのＵＶ吸収スペクトルが記録された。 図３は、単独で又はＧｎ Ｒｂ１（Ａ）、サルビアノリン酸Ｂ（Ｂ）及びジヒドロミリセチン（ＤＨＭ）（Ｃ）の存在下で、当該化合物：α−ｓｙｎのモル比は４：１、２：１及び１：１で、連続的な振盪を伴って３７℃で５日間エージングされた、ネガティブ染色されたα−シヌクレイン（２５μＭ）のサンプルの電子顕微鏡画像を示す。スケールバーは、５００ｎｍである。図３Ｄは、α-シヌクレインフィブリルが単独でエージングされた結果を示す。 図４は、免疫ブロット分析を示し、Ｇｎ Ｒｂ１（Ａ）、サルビアノリン酸Ｂ（Ｂ）及びジヒドロミリセチン（Ｃ）のα-シヌクレインのオリゴマー化に対する効果を示す。α−Ｓｙｎ単独で、又は、化合物：α−Ｓｙｎのモル比１：１、２：１及び４：１の化合物の存在下で、５日間インキュベートされた。レーン１、化合物：α−ｓｙｎ １：１、レーン２、化合物：α−ｓｙｎ ２：１、レーン３、化合物：α−ｓｙｎ ４：１、Ａ：エージングされたα−ｓｙｎ、Ｍ：未処理のα−ｓｙｎ。 図５は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化された、図３のサンプル中のモノマーのα-シヌクレインの量を示す。 図６は、Ｇｎ Ｒｂ１（Ａ）、サルビアノリン酸Ｂ（Ｂ）及びジヒドロミリセチン（Ｃ）の、α−ｓｙｎの凝集によって誘発される毒性に対する効果を示す。Ｍ１７ヒト細胞の生存率は、ＭＴＴ試験（MTT assay）によって見積もられた。結果は、平均値のコントロールサンプル（すなわち、未処理の細胞）に対するパーセンテージとして表わされている。当該細胞は、ＭＴＴを添加する前に、当該化合物を伴って又は伴わずに４８時間エージングされたα-シヌクレインによって処理された（３ウェルの平均値±標準偏差）。両側不対ｔ検定（two-tailed unpaired t-test）を使用して統計分析が行われた。＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊、ｐ＜０．０１；＊、ｐ＜０．０５。 図７は、Ｇｎ Ｒｂ１（Ａ）及びジヒドロミリセチン（Ｂ）の予め形成されたα-シヌクレインフィブリルに対する効果を示す。凝集したα-シヌクレインのサンプルは様々な濃度のＧｎ Ｒｂ１又はジヒドロミリセチン（化合物：α-シヌクレインが６：１、４：１及び２：１）の存在下又は非存在下で、３７℃で４８時間インキュベートされた。フィブリルの含有量は、Ｔｈ−Ｔ結合アッセイによって測定された。当該アッセイは、当該分析は３回行われた（３回の測定の平均値±標準偏差）。 図８は、Ｇｎ Ｒｂ１（Ａ）、サルビアノリン酸Ｂ（Ｂ）及びジヒドロミリセチン（Ｃ）のα−ｓｙｎの播種重合に対する効果を示す。α-シヌクレインモノマーのサンプル（１００μＭ）は、２μＭの超音波処理されたα-シヌクレインフィブリルを伴って播種された。当該サンプルは、異なる濃度（１０μＭ及び５０μＭ）の化合物の存在下又は非存在下で、連続的な振盪を伴って３７℃で６時間インキュベートされた。フィブリル化の程度は、Ｔｈ−Ｔ結合アッセイによって見積もられた。当該分析は３回行われた（３回の測定の平均値±標準偏差）。 図９は、α−シヌクレイン種子単独、及び化合物の非存在下又は存在下で連続的な振盪を伴って３７℃で６時間インキュベートされて播種されたα−シヌクレインのネガティブ染色されたサンプルの電子顕微鏡画像を示す。図Ａは、Ｇｎ Ｒｂ１（５０μＭ）、スケールバーは１,０００ｎｍである。図Ｂは、サルビアノリン酸Ｂ（ＳＡＢ）又はジヒドロミリセチン（ＤＨＭ）、化合物：α−シヌクレインは６：１、スケールバーは５００ｎｍである。 図１０は、Ｇｎ Ｒｂ１のα−シヌクレインオリゴマー（Ｇｎ Ｒｂ１：α−シヌクレインのモル比４：１）に対する結合活性を示す。（Ａ）は、Ｇｎ Ｒｂ１の存在下で５日凝集したα−シヌクレイン（α−シヌクレイン濃度＝１００μＭ）のゲルの、superdex 200 SEカラムを使用したろ過プロファイルを示す。溶出は、吸収波長２１５ｎｍにおいてモニタされた。（Ｂ）は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動によって分離されたサンプルＰ１、Ｐ２及びＰ３の免疫ブロット分析を示す。（Ｃ）は、ＳＥＣによって精製されたＧｎ Ｒｂ１の存在下におけるα−シヌクレインのＰ１、Ｐ２及びＰ３のネガティブ染色されたサンプルの電子顕微鏡画像を示す。スケールバーは、５００ｎｍを表わす。（Ｄ）は、Ｐ１、Ｐ２及びＰ３のＵＶ吸収スペクトルを示す。ＵＶ吸収は、１０ｍｍ石英キュベットを採用して２００−６００ｎｍの間で記録された。 図１１は、ジヒドロミリセチンのα−シヌクレインオリゴマー（ＤＨＭ：α−ｓｙｎは４：１）に対する結合活性を示す。（Ａ）は、１００μＭα−シヌクレインの、ジヒドロミリセチンを伴って５日間インキュベートされたサンプルのゲルのsuperdex 200 SEカラムを使用したろ過プロファイルを示す。溶出は、吸収波長Ａ２１５においてモニタされた。（Ｂ）は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動によって分離されたサンプルＰ１、Ｐ２及びＰ３の免疫ブロット分析を示す。（Ｃ）は、ＳＥＣによって精製されたジヒドロミリセチンの存在下におけるα−シヌクレインのＰ１、Ｐ２及びＰ３のネガティブ染色されたサンプルの電子顕微鏡画像を示す。（Ｄ）は、ＳＥクロマトグラフィーからのＰ１、Ｐ２及びＰ３サンプルのＵＶ吸収スペクトルを示す。ＵＶ吸収スペクトルは、１０ｍｍ石英キュベットを使用して２００−６００ｎｍの間で記録された。 図１２は、サルビアノリン酸Ｂのα−ｓｙｎオリゴマー（ＳＡＢ：α−ｓｙｎは４：１）に対する結合活性を示す。（Ａ）は、１００μＭα−シヌクレインの、サルビアノリン酸Ｂを４：１のモル比で伴って５日間インキュベートされたサンプルのゲルのsuperdex 200 SEカラムを使用したろ過プロファイルを示す。溶出は、吸収波長Ａ２１５においてモニタされた。（Ｂ）は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて電気泳動によって分離されたサンプルＰ１、Ｐ２及びＰ３の免疫ブロット分析を示す。（Ｃ）は、ＳＥＣによって精製されたサルビアノリン酸Ｂの存在下におけるα−シヌクレインのＰ１、Ｐ２及びＰ３のネガティブ染色されたサンプルの電子顕微鏡画像を示す。（Ｄ）は、ＳＥクロマトグラフィーからのＰ１、Ｐ２及びＰ３サンプルのＵＶ吸収スペクトルを示す。ＵＶ吸収スペクトルは、１０ｍｍ石英キュベットを使用して２００−６００ｎｍの間で記録された。 図１３は、１００μＭの野生型α−シヌクレインＦＬ＋Ｇｎ Ｒｂ１（Ｇｎ Ｒｂ１：ａ−ｓｙｎ １：１、４：１及び６：１）のピーク強度比プロットを示す（Ａ−全スキャン、Ｂ−１：１、Ｃ−４：１、Ｄ−６：１）。 図１３は、１００μＭの野生型α−シヌクレインＦＬ＋Ｇｎ Ｒｂ１（Ｇｎ Ｒｂ１：ａ−ｓｙｎ １：１、４：１及び６：１）のピーク強度比プロットを示す（Ａ−全スキャン、Ｂ−１：１、Ｃ−４：１、Ｄ−６：１）。 図１３は、１００μＭの野生型α−シヌクレインＦＬ＋Ｇｎ Ｒｂ１（Ｇｎ Ｒｂ１：ａ−ｓｙｎ １：１、４：１及び６：１）のピーク強度比プロットを示す（Ａ−全スキャン、Ｂ−１：１、Ｃ−４：１、Ｄ−６：１）。 図１３は、１００μＭの野生型α−シヌクレインＦＬ＋Ｇｎ Ｒｂ１（Ｇｎ Ｒｂ１：ａ−ｓｙｎ １：１、４：１及び６：１）のピーク強度比プロットを示す（Ａ−全スキャン、Ｂ−１：１、Ｃ−４：１、Ｄ−６：１）。
［発明の詳細な説明］
伝統的な漢方薬組成物において見られる化合物であるジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン及びサルビアノリン酸Ｂは、α−シヌクレイン凝集体に結合し、かつ、α−シヌクレイン凝集体を分散させることが見出されてきた。従って、本発明は、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン及びサルビアノリン酸Ｂを、α−シヌクレイン凝集体を検出する方法において使用することを対象としている。当該化合物は、α−シヌクレイン凝集体の検出において造影剤としても使用され得る。
α−シヌクレイン凝集体は、成長したα−シヌクレインフィブリルの不溶性の凝集体を意味し、当該α−シヌクレインフィブリルの不溶性の凝集体は、限定するものではないが、レビー小体及びレビーニューライトなどのα−シヌクレイン沈着物を含む。また、当該凝集体は、他の化合物を含み得る。
当該化合物の、予め形成されたα−シヌクレインフィブリルに結合する能力及び当該α−シヌクレインフィブリルを分散させる能力によって、当該化合物は、α−シヌクレイン凝集体のイメージングにおける使用及び／又はα−シヌクレインに関わる疾患の診断における使用に適している。
理論に従って結合されることなしに、当該化合物は凝集体中のフィブリルに結合することができ、予め形成されたフィブリルを分散させることができる。これによって、フィブリル−化合物複合体が形成されて、イメージング及び診断の目的で検出されることが可能となる。
α−シヌクレイン沈着物の検出及びイメージングにおける使用に関して、かつ、シヌクレイン性疾患の診断における使用に関して適切な化合物は、ジンセノサイドＲｂ１などのジンセノサイドを含み、当該ジンセノサイドは、化学式１に示す構造を有し、：
化学式２に示す構造を有するジヒドロミリセチンを含み：
化学式３に示す構造を有するサルビアノリン酸Ｂを含む：
当該化合物は、α−シヌクレイン凝集体のイメージングを容易にするために標識され（labelled）得る。例えば、当該化合物は、検出可能な標識（label）を含み得る。当該検出可能な標識は、α−シヌクレインフィブリルに結合している場合に当該化合物の検出を可能にする典型的なものである。有用な標識は、蛍光標識、放射性標識及び造影剤を含む。
適切な放射性標識は、１８Ｆ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、１４Ｃ、３Ｈ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、及び１２５Ｉを含む。適切な蛍光標識は、蛍光色素及びローダミンを含む。適切な造影剤は、ガドリニウム（Ｇｄ）、ジスプロシウム及び鉄などの希土類イオン（rare earth ion）、並びに磁性剤（magnetic agent）を含む。その他の標識は、ＮＭＲ活性標識（nuclear magnetic resonance active labels）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャナによって検出可能な陽子放出同位体（positron emitting isotopes）、化学発光及び酵素マーカーを含む。当該検出可能な標識は、直接又はリンカー（linker）を介して当該化合物に付着され得る。或いは、当該検出可能な標識は、当該化合物の構造に組み込まれ得る。
当該化合物であるジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂは、上記の又は他の検出可能な標識によって、標準的な技術を用いて標識され得る。
検出可能な標識を含む当該化合物であるジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂは、α-シヌクレイン凝集体をイメージングする方法において有用である。α−シヌクレイン凝集体の存在又は非存在は、被検体においてインビボで、例えば脳において、任意の適切なイメージング技術を用いて検出され得る。当該被検体は、典型的には哺乳類であり、ヒトであることが望ましい。当該被検体は、実験動物であっても良く、特に、シヌクレイン性疾患の実験動物モデルであっても良い。例えば、パーキンソン病の動物モデルは、当業者に知られており、かつ、遺伝子導入マウスを含む。
適切なイメージング技術には、ＰＥＴ、ガンマシンチグラフィー（gamma-scintigraphy）、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、機能的核磁気共鳴画像法（functional magnetic resonance imaging）（ＦＭＲＩ）、脳磁図（magnetoencephalography）（ＭＥＧ）、及び単光子放射型コンピューター断層撮影法（single-photon emission computerized tomography）(ＳＰＥＣＴ)が含まれる。ＭＲＩ及びＰＥＴは、インビボでイメージングするために好ましい方法である。
α-シヌクレイン凝集体の存在又は非存在は、インビトロでも検出され得、例えば、α-シヌクレインの凝集を抑制する物質を特定することができ、又は被検体から採取された生物学的サンプルにおいて検出され得る。
従って、その他のイメージング方法は、電子顕微鏡法、共焦点顕微鏡法又は光学顕微鏡法等の顕微鏡法を含み得る。
α-シヌクレイン凝集体は、インビトロ又はインビボで、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂを投与するステップと、当該化合物の、当該凝集体のα−シヌクレインフィブリルへの結合を検出するステップと、によって検出され得る。
検出されるα-シヌクレイン凝集体は、体液又は組織又はその他の検査されるべきサンプルにおいて存在し得る。限定するものではないが、当該凝集体は、生きている哺乳類の脳内に存在する凝集体又は検査されるべき被検体からの脳サンプルにおいて存在する凝集体を含む。当該方法は、心臓又は胃腸の組織等の、他の体の組織又は体液についても実行され得る。特に、インビトロの方法は、組織又は体液のサンプルについて実行され得る。
当該サンプルは当該化合物、すなわち、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂと、サンプル中に存在する任意のα−シヌクレイン凝集体に当該化合物を結合させるために効果的な時間にわたって、かつ、効果的な条件下で、混合される。当該サンプルは、レビー小体中のフィブリルに対して、当該化合物を結合させるために効果的な時間にわたって、かつ、効果的な条件下で、当該化合物と混合されることが好ましい。
当該サンプルは、標準的な方法で分析される前に、加工されても良い。
また、α−シヌクレイン凝集体を検出するインビトロの方法は、サンプル中のα−シヌクレイン凝集体を検出して、α-シヌクレインを分散させること及び／又はα-シヌクレイン凝集体の形成に影響を与えることに対する他の化合物の有効性を決定することにおいて、当該化合物、すなわち、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂを使用することを含む。
当該化合物であるジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン及びサルビアノリン酸Ｂは、シヌクレイン病を診断する方法において使用され得る。シヌクレイン性疾患を診断する方法は、α-シヌクレイン凝集体の存在又は非存在を検出するステップを含み得る。α−シヌクレイン凝集体の存在は、被検体がシヌクレイン性疾患を有していることを示し、かつ、α−シヌクレイン凝集体の非存在は、被検体がシヌクレイン性疾患を有していないことを示す。
α-シヌクレイン凝集体の存在又は非存在は、当該凝集体のフィブリルと、当該化合物との複合体（complex）が存在しているか否かを決定することによって検出され得る。当該フィブリルと当該化合物との複合体の存在及び／又は非存在は、上述したイメージング技術によって決定され得る。
当該診断方法は、被検体からの組織のサンプル又は体液を用いるインビトロの方法であり得る。当該サンプルは当該化合物に接触させられ、当該凝集体のフィブリルと当該化合物との間の複合体の存在及び／又は非存在が決定される。
或いは、当該診断方法はインビボの方法であっても良く、当該方法において当該化合物すなわちジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂは、被検体に投与され；α-シヌクレイン凝集体の存在又は非存在は、被検体において検出される。当該化合物は、非外科的手段によって被検体に投与され得る。
当該被検体は、シヌクレイン性疾患を治療するための治療を受けていても良く、当該方法は、当該治療の有効性をモニタリングすることに関する。
イメージングの方法によって検出されたα-シヌクレイン凝集体のレベルは、当該疾患の状況（status）を決定するために、かつ／又は特定の治療が成功したか否かを決定するために標準（standard）と比較され得る。被検体の脳において存在するα-シヌクレイン凝集体の数及び／又は大きさは、シヌクレイン疾患の進行と相関する。α−シヌクレイン凝集体の数及び／又は大きさの減少は、当該疾患が退行していることを示唆する。α−シヌクレイン凝集体の数及び／又は大きさの増加は、当該疾患が進行していることを示唆する。
当該診断の方法において使用される化合物は、上述したように標識化され得る。上述したようなイメージング技術は、当該診断方法において、当該化合物の当該フィブリルへの結合を検出するステップにおいて使用され得る。
当該イメージング及び診断の方法において使用するための当該化合物のフォーミュレーション（formulation）は、当該化合物が使用されるであろう方法に依存し得る。
当該化合物は、非外科的手段によって被検体に投与され得る。投与の非外科的手段には、例えば、経口の（例えば、錠剤、トローチ、水性の又は油状の懸濁液、分散性の粉末又は顆粒）、局所的な、経皮的な又は点滴又は吸入による手法が含まれる。医師は、特定の被検体の各々に関して、投与に必要とされる経路を決定することができるであろう。
当該化合物は、α-シヌクレイン凝集体、例えばレビー小体の部位に、通常、脳に血液を供給する血管又は脳そのものへの注射によって直接投与され得る。
通常、当該化合物は、薬学的に許容可能なキャリア（carrier）又は希釈剤（diluent）と共にフォーミュレートされるであろう。医師（physician）は、被検体に投与（delivery）するために適切な薬学的形態を決定することができるであろう。
本発明のさらなる実施形態は、シヌクレイン疾患を有する被検体におけるレビー小体又はレビーニューライト中のフィブリルを分散させるための方法を含む。当該方法は、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された化合物を被検体に投与するステップを含む。当該化合物は、治療効果のある量で投与され得る。
また、本発明は、シヌクレイン疾患を有する被検体におけるレビー小体又はレビーニューライト中のフィブリルを分散させるための薬学的組成物に関する。当該組成物は、ジヒドロミリセチン、ジンセノサイドＲｂ１又はサルビアノリン酸Ｂ、又は薬学的に許容可能な塩若しくはその溶媒和物、及び薬学的に許容可能な希釈剤若しくはキャリアを含む。
理論通りに結合することなしに、当該化合物であるジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン及びサルビアノリン酸Ｂの、フィブリル凝集体に結合しかつ当該フィブリル凝集体分散させる能力及びα-シヌクレインのフィブリル化を抑制する能力は、当該化合物がシヌクレイン病を有する被検体におけるレビー小体を分散させるために使用されることを可能にする。
化合物ジンセノサイドＲｂ１は、α-シヌクレインのフィブリル化を抑制することが見出された。理論通りに結合することなしに、ジンセノサイドＲｂ１は、βシートを含有しないα-シヌクレインの可溶性オリゴマーに結合しかつ当該可溶性オリゴマーの構造を安定化し、加えて、α-シヌクレインが誘発した毒性をブロックすると考えられている。その一方で、当該化合物であるジヒドロミリセチン及びサルビアノリン酸Ｂは、α-シヌクレインのオリゴマー化及びフィブリル化を抑制することが見出された。従って、これらの化合物はシヌクレイン性疾患の治療に適している。
従って、本発明は、シヌクレイン性疾患を有する被検体においてα-シヌクレインのフィブリル化を抑制する方法をさらに提供する。当該方法は、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された化合物を被検体に投与するステップを含む。当該化合物は、治療効果のある量で投与され得る。
シヌクレイン性疾患（synucleinopathic disorder）若しくはシヌクレイン障害（synucleinopathic disease）又はシヌクレイン病（synucleinopathy）は、シヌクレインに関わる疾患であり、特に、α-シヌクレインに関わる。シヌクレイン病は、限定するものではないが、パーキンソン病、レビー小体型認知症、及び多系統萎縮症を含むグループから選択された疾患を含む。被検体は、パーキンソン病又はレビー小体型認知症を有していることが好ましい。
化合物の「治療効果のある量」とは、当該化合物の量であって、被検体に投与された場合に、意図された治療効果を与えるために十分な量である。治療効果のある量は、１回以上の投与において与えられ得る。
本発明の化合物の輸送に適した薬学的形態及び様々な医薬組成物を調合する方法は、当業者にとって容易に明白となるであろう。そのような組成物及びそれらを調合する方法は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,19版（Mack Publishing Company 1995）に開示されている。
組成物の適切な形態は、錠剤、カプセル、丸薬（pill）、粉末、徐放性製剤、溶液及び懸濁液等の経口投与に適した形態、無菌食塩水（sterile saline）溶液、懸濁液又は乳濁液等の非経口注射に適した形態；坐薬等の直腸投与に適した形態を含み得る。非経口投与の形態の例は、無菌の水性溶液における懸濁液又は溶液を含み、例えば、含水プロピレングリコール又はデキストロース溶液を含む。そのような投与形態は、必要に応じて、適切に緩衝化される。
適切な薬学的キャリアは、不活性の希釈剤又は賦形剤（fillers）、水又は様々な有機溶剤を含む。また、組成物は、香味料（flavoring）、バインダ（binders）、又は賦形剤（excipients）などの付加的成分を含み得る。錠剤は：デンプン、アルギン酸及び複合ケイ酸塩（complex silicate）等の崩壊剤（disintegrates）；スクロース（sucrose）、ゼラチン（gelatin）及びアカシア（acacia）等の結合剤（binding agents）、及びステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム及びタルク等の平滑剤を含み得る。
固体組成物は、軟ゼラチンカプセル剤（soft gelatin capsules）及び硬ゼラチンカプセル剤（hard gelatin capsules）を含み得る。好ましい材料は、ラクトース（lactose）、乳糖（milk sugar）及び高分子量のポリエチレングリコールを含む。
水性懸濁液又はエリキシル剤は、甘未剤又は香味剤、顔料及び染料、乳化剤、懸濁化剤と同様に、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン又はこれらの組み合わせも含み得る。
以下の例は、本発明を説明する。
例１
組み換え型ヒトα−シヌクレイン（human α−synuclein）の発現及び精製
ｐＧＥＸ−４ＴＩベクター（vector）（韓国カトリック大学薬学カレッジ(The Catholic University College of Medicine)のハンシュク リム博士（Dr. hyanshuk Rhim）によって提供された）内のＧＳＴ-α−シヌクレイン融合構造物は、ＢＬ２１ Ｅ.coliバクテリアにヒートショックによって挿入された。形質転換されたバクテリアは、ＬＢ培地内で、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリンの追加を伴いオービタルシェーカー（orbital shaker）において３７℃でＯＤ６００が０．５となるように培養された。０．５ｍＭのＩＰＴＧ（シグマアルドリッチ製（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany））を加えることによって発現が誘導され、培養物は３７℃で２時間インキュベート（incubated）された。細胞は９０００ｘｇで１５分の遠心分離によって採取され、得られたペレット（pellet）はその後リシスバッファ（lysis buffer）（50mM Tris - HCl, pH7.4, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% DTT）中に再懸濁され、室温で１０分間振盪（shaken）された。細胞溶解の効率を向上するために、再懸濁されたペレットは、液体窒素中及び３７℃のウォーターバス中で６サイクルの冷凍−解凍サイクルにさらされた。当該溶解物は２７，０００ｘｇで１５分間遠心分離され、得られた上澄みは、ＧＳＴタグについて高い親和性を有する、グルタチオンに接合されたセファロースビーズを用いた親和性クロマトグラフィーによる精製のために保持された。当該細胞溶解物は、グルタチオンセファロースビーズと混合され、室温で１時間インキュベートされ、続いて４℃５００ｘｇで８分間、遠心分離された。当該ビーズは、ウォッシュバッファ（wash buffer）(50mM Tris - HCl, 150mM NaCl, 10mM EDTA, 1% Triton X-100, pH8.0)で２回洗浄され; 50mM Tris - HCl、pH8.0で２回；１ＸＰＢＳで１回洗浄された。洗浄されたビーズは５ｍｌの１ＸＰＢＳ中に再懸濁され、ＧＳＴタグはヒト血漿由来トロンビン(human plasma thrombin)（１unit／μｌ）、（シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich, USA））によって切断された。トロンビンに触媒された切断反応は、連続的な攪拌を伴って室温で一晩インキュベートされ、続いて３７℃で５分間インキュベートされることでなされた。その後、反応混合物は、４℃、５００ｘｇで８分間遠心分離され、トロンビンを分離（fish out）するためにベンズアミジンセファロースビーズ（アマシャム（Amersham, Sweden））が使用された。４℃、５００ｘｇで８分間遠心分離によって、純粋なα−シヌクレインが収集された。α−シヌクレインの濃度は、ＢＣＡアッセイ（ＢＣＡ assay）（ピアース（Pierce Biotechnology, Rockford, IL））を用いて評価された。
インビトロのα−シヌクレイン凝集
タンパク質の純度は、ＳＤＳゲル（ＳＤＳ ｇｅｌ）を用いて９５％以上（＞９５％）であると評価された。ジンセノサイドＲｂ１の貯蔵液（１０ｍＭ）は、１００％ＤＭＳＯ中に調製された。サンプル液中のＤＭＳＯの最終的な含有量は１％であった。ＰＢＳ中の２５μＭα-シヌクレインのサンプルは、単独で又はＲｂ１と共に様々なモル比で（Rb1:α-シヌクレインのモル比４：１、２：１又は１：１）エージングされた（aged）。サンプルは、１．５ｍｌの滅菌されたポリプロピレンチューブに入れられ、サンプルの蒸発を防ぐために鉱物油（mineral oil）が滴下された。その後当該チューブはパラフィルムで密封され、サーモミキサー(Thermomixer)（エッペンドルフ（Eppendorf））内で８００ｒｐｍでの連続的な振盪（shaking）を伴って、３７℃で５日間インキュベートされた。サンプルは、指示されたタイムポイント（time point）に回収され、タイムポイントの各々において直ちにチオフラビン−Ｔ分析が行われ、その他のサンプルはさらなる分析が必要となるまで８０℃で保管された。
チオフラビン−Ｔ（Ｔｈ−Ｔ）分析
α−シヌクレインフィブリルの形成は、Ｔｈ−Ｔ結合アッセイ（Th-T binding assy）によってモニタされた。Ｔｈ−Ｔは蛍光染料であり、β−シート構造を含むフィブリルと相互作用する。総量１０μｌのサンプルの各々は、Ｔｈ−Ｔを４０μｌ含むＰＢＳにおいて希釈された。蛍光は、３８４−ウェル、未処理の黒色マイクロウェルプレート（Nunc, Denmark）において、マイクロプレートリーダー（Victor, X3 2030, Perkin Elmer）を用いて、励起波長及び蛍光波長の組はそれぞれ４５０ｎｍ及び４８６ｎｍで測定された。バックグラウンド蛍光を考慮に入れるため、ブランクのＰＢＳ溶液の蛍光強度が全ての測定値から差し引かれた。
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
単独で又は化合物の存在下でエージングされたα-シヌクレインから電子像が生成された。サンプル（５μＬ）は、フォルムバールコート（Formvar-coated）した４００メッシュの銅グリッド（Agar Scientific, UK）に付着され、０．５％グルタルアルデヒド（５μｌ）で簡易的に固定され、２％酢酸ウラニル（Sigma-Aldrich, USA）でネガティブ染色され、電子顕微鏡フィリップス（Philips）ＣＭ−１０ＴＥＭで評価された。
免疫ブロット法
α-シヌクレイン（２０ｎｇ）のサンプルは、単独で又は当該化合物と共に１Ｘサンプルバッファ（250mM Tris-HCl, pH6.8, 30％グリセロール、0.02% ブロモフェノールブルー）と混合され、その後１５％の１ｍｍＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分離された。分離されたタンパク質は、９０Ｖで８０分、０．４５μｍニトロセルロースメンブレン（Whatman Gmbh-Germany）に転写された。当該メンブレンは、ＰＢＳ中で５分ボイルされ、その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０（０．０５％、ＰＢＳＴ）において調製された５％の無脂肪乳によって１時間ブロックされた。当該メンブレンは、ヒトα−シヌクレイン（１２１−１２５）（Santa Cruz Biotechnology, USA）を１：１０００の希釈において認識する初期マウスモノクローナルanti-α-syn（２１１）抗体と共に４℃で一晩インキュベートされた。当該メンブレンは、その後ＰＢＳＴで数回洗浄され、続いてＨＲＰ共役ヤギ抗マウス抗体（Dako Ltd., Ely, UK）によって、１：７０,０００の希釈において室温で６０分間、緩やかな攪拌を伴ってインキュベートされた。当該メンブレンは、２５分間充分に洗浄され、免疫活性なバンドがSuper Signal West Femto化学発光基質キット（Super Signal West Femto Chemiluminescent Substrate Kit(Pierce, Rockford, USA)）によって、メーカーの取扱説明書に従って可視化された。
コンゴレッド結合アッセイ（Congo red binding assay）
ＣＲは染料であり、アミロイドフィブリルに対する親和性が高い。コンゴレッド（２０μＭ）は、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）において調製され、０．４５μｍのフィルターを通してろ過された。α−シヌクレイン（５μＭ）のサンプルは、単独で又は化合物と共に、異なるモル比でされ、コンゴレッド（最終濃度５μＭ）と混合され、当該反応サンプルは充分に混合された。ＵＶ吸収スペクトルは、分光光度計（ＤＵ−８００、Beckman-Coulter）において、１０ｍｍ石英キュベット（Hellma Analytics-Germany）を使用して、４００ｎｍから６００ｎｍの間で記録された。ブランクとして、コンゴレッドが単独で用いられた。
ＢＥ（２）−Ｍ１７ヒト神経芽腫細胞の組織培養
ＢＥ（２）−Ｍ１７ヒト神経芽腫細胞は、１５％ウシ胎児血清及び１％ペニシリンストレプトマイシン（P/S;100U/ml ペニシリン, 100mg/ml ストレプトマイシン）を含むDulbecco’s MEM/Nutrient Mix F-12(1:1)(Gibco BRL, Rockville, MD)において規定通りに培養された。当該細胞は、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿されたインキュベータ内で３７℃に維持された。
細胞生存率（cell viability）の測定
ＤＭＥＭ培地に懸濁されたＢＥ（２）−Ｍ１７細胞は、１５０００細胞の密度（１００μｌ／ウェル）で９６ウェルプレートにプレーティングされた。２４時間後、当該培地は、当該化合物を含むか又は当該化合物を含まない、熟成されたα-シヌクレイン溶液を含む２００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Gibco-USA）無血清培地に置き換えられた。熟成されたα−シヌクレイン及び化合物を含む溶液は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭにおいて希釈されて所望の濃度が得られた。その後、細胞は５％ＣＯ２、３７℃において４８時間インキュベートされた。ＰＢＳ中の、総量２０μｌのＭＴＴ（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物）（Sigma-Aldrich, USA）(6mg/ml)が各々のウェルに吐出され、当該プレートは、３７℃で４．５時間インキュベートされた。当該ＭＴＴ含有培地は注意深く除去され、１００μｌのリシスバッファ（１５％ＳＤＳ、５０％Ｎ,Ｎ-ジメチルホルムアミド、ｐＨ４．７）が各々のウェルに加えられた。当該リシスバッファは、マイクロプレートリーダー（Perkin Elmer）によって５９０ｎｍにおける吸光度が決定される前に、３７℃で一晩インキュベートされた。
α−シヌクレインの分散アッセイ
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のα−シヌクレイン溶液は、上述したように、２５ｍＭの濃度で凝集された。得られた凝集したα-シヌクレインは、単独で又はＧｎ Ｒｂ１若しくはジヒドロミリセチンと共に様々なモル比で（化合物：α-シヌクレインのモル比６：１、４：１及び２：１）インキュベートされた。実験の目的のため、考慮されたα-シヌクレインの濃度は、処理前の（fresh）α-シヌクレインの濃度である。当該サンプルは、サーモミキサー上で、８００ｒｐｍの連続的な振盪を伴って、３７℃で４８時間インキュベートされた。サンプルは、一定間隔のタイムポイント毎に集められ、直ちにＴｈ−Ｔ蛍光が測定された。
播種重合（seeding polymerization）アッセイ
モノマーのα-シヌクレインの凝集は、播種（seeding）を伴って、又は播種を伴わずに、他の部分（１７）に記載されているように実行された。種子は、成長したα-シヌクレインフィブリルを超音波処理によって分断して短いフィブリルを得ることで調製された。当該短いフィブリルが「種子（seeds）」として採用された。簡単に述べると、１００μＭの濃度のモノマーのα-シヌクレインは、２μＭの種子を伴って播種されて、化合物（１０μＭ又は５０μＭ）の存在下又は非存在下で、連続的な振盪を伴って３７℃で６時間インキュベートされた。フィブリル化は、上記したようにＴｈ−Ｔ結合アッセイによってモニタされた。
α−シヌクレインのオリゴマーとモノマーとの分離のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣは、ＡＫＴＡ ＦＰＬＣシステム（ＧＥヘルスケア製（GE Healthcare-Sweden））及びsuperdex 200カラムを用いて４℃で実行されて、化合物を伴うα−シヌクレイン（化合物：α−シヌクレインのモル比４：１）の凝集によって生成したオリゴマーが分離された。上述したように、１００μＭの濃度のモノマーのα-シヌクレインは、化合物の存在下で５日間、凝集された。凝集プロセスの終わりに、当該サンプルは、１４,０００ｘｇで、４℃で４５分間遠心分離されて、不溶性の物質を含まない上澄みを生成した。生成した上澄みの８０％を注入する前に、カラムはランニングバッファ（running buffer）(１Ｘ ＰＢＳ、ｐＨ７．４)によって完全に平衡され、かつ、流量は０．１ｍｌ／ｍｉｎ（０．５ｍｌ／フラクション（fraction））に設定された。α-シヌクレインの溶離は、吸収波長２１５ｎｍ、２５４ｎｍ及び２８０ｎｍにおいてモニタされた。モノマーのα−synの溶離時間（elution time）を決定するために、分子量標準（フェリチン４４０ ｋＤａ、アルドラーゼ １７１ｋＤａ、アルブミン ６８ｋＤａ及びキモトリプシノゲンＡ ２５ｋＤａ）及びモノマーのα-シヌクレインが共にカラムに注入されて、上記したように同じ条件下で溶離された。
サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンによる実験のため、７−８ｍｌＣＶで溶出したフラクションが回収されてオリゴマーとしてラベルされ（サンプルＰ１）、１２−１４ｍｌＣＶで溶出したフラクションが回収されてオリゴマーとしてラベルされ（サンプルＰ２）、これに対して１４−１６ｍｌＣＶで溶出したフラクションは回収されてモノマーとしてラベルされた（サンプルＰ３）。
ジンセノサイドＲｂ１による実験の場合、２−４ｍｌＣＶで溶出したフラクションが回収されてオリゴマーとしてラベルされ（サンプルＰ１）、１０−１４ｍｌＣＶで溶出したフラクションが回収されてオリゴマーとしてラベルされ（サンプルＰ２）、これに対して１４−１６ｍｌＣＶで溶出したフラクションは回収されてモノマーとしてラベルされた（サンプルＰ３）。
Ｐ１、Ｐ２及びＰ３のフラクションは、さらにウェスタンブロッティング（western blotting）及びＴＥＭによってキャラクタライズされた。
ＵＶスキャニング（scanning）
ＳＥＣのオリゴマー及びモノマーのフラクションを表わすＰ１、Ｐ２及びＰ３のサンプルは、speed vac（CentriVap, Labconco）を用いて濃縮された。それらのタンパク質含有濃度は、ＢＣＡアッセイによって評価された。ＵＶ吸収スペクトルは、吸光光度計（ＤＵ−８０、Beckman-Coulter）において、１０ｍｍ石英キュベット（Hellma Analytics-Germany）を用いて２００ｎｍから６００ｎｍまで記録され、かつ、等しい濃度のＰ１、Ｐ２及びＰ３が採用された。陰性対照（ネガティブコントロール（negative control））として、未処理（fresh）のモノマーのα−シヌクレインが使用された。
ＮＭＲ観察
ＮＭＲ観察のため、組み換え型１５Ｎ標識α-シヌクレインは先に述べたように（２１、２２）発現しかつ精製され、ｐＨ６．６のＰＢＳバッファ中に再懸濁された。二次元１Ｈ１５Ｎ ＨＳＱＣスペクトルは、Ｇｎ Ｒｂ１の非存在下及びＧｎ Ｒｂ１の存在下における１００μＭ濃度のα-シヌクレインについて得られ、当該存在下におけるＧｎ Ｒｂ１：α-シヌクレインの次第に増加する化学量論比は１：１、４：１、及び６：１であった。データは、コールドプローブが搭載されたバルカー（Bulker）９００ＭＨｚ分光計によって収集された。
例２
ジンセノサイドＲｂ１、サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンのα−シヌクレインのフィブリル化に対する効果
濃度２５μＭのα−シヌクレイン溶液は、連続的な振盪を伴って３７℃で５日間インキュベートされ、フィブリルの形成が誘導された。当該フィブリルの形成は、Ｔｈ−Ｔ蛍光によって規則的な時間間隔でモニタされた。α−シヌクレインは、ジンセノサイドＲｂ１、サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンの各々と共に、それぞれ４：１、２：１及び１：１のモル比（化合物：α-シヌクレインのモル比）で、一定のα−シヌクレイン濃度２５μＭを伴ってインキュベートされた。
Ｇｎ Ｒｂ１は、テストされた全ての濃度におけるＴｈ−Ｔ蛍光の減少によって示されるように（図１Ａ）、α-シヌクレインのフィブリル化に対して著しい抑制作用を示した。この効果は、インキュベーション（incubation）の早くも２日程度で観察され、このとき抑制の割合は約９０％であった。５日間のインキュベーション後、α-シヌクレインのフィブリル化は約８０％減少した。
Ｇｎ Ｒｂ１がα-シヌクレインのフィブリル形成をブロックする能力は、上述したようなコンゴレッド（ＣＲ）結合アッセイによって、さらに評価された。α-シヌクレインのフィブリルに結合すると、ＣＲの吸収極大は４９０ｎｍから５０８ｎｍにシフトした。このシフトは、Ｇｎ Ｒｂ１の非存在下でインキュベートされたα-シヌクレイン制御サンプルについて、非常に顕著であった（図２Ａ）。しかし、この特徴的なシフトは、Ｇｎ Ｒｂ１の存在下でエージングされたα-シヌクレインサンプルについては観察されなかった。このことは、この化合物がアミロイドフィブリルの形成を抑制したことを示す（図２Ａ）。実際に、Ｇｎ Ｒｂ１（テストされた全ての濃度の）を含むα-シヌクレインサンプルに結合したＣＲの吸収極大は、数ｎｍのみシフトし、かつ、波長４９５ｎｍを超えなかった（図２Ａ）。興味深いことに、当該ＣＲのシフトは、モノマーのα−シヌクレインに関して観察されたシフトと同等であった。
これらの所見は、電子顕微鏡観察によってさらに裏付けされた。Ｇｎ Ｒｂ１の存在下でエージングされたα-シヌクレインのＴＥＭ像は、単独でエージングされたα-シヌクレインによって形成された長いフィブリルの高密度のメッシュとは異なり、α-シヌクレインが、断片化した外観を有する薄く、短い棒状のフィブリルを形成していることを示した（図３Ａ）。
サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンは、減少したＴｈ−Ｔ蛍光によって示されるように（図１Ｂ及び図１Ｃ）、α-シヌクレインのフィブリル化を抑制した。濃度１００μＭ及び５０μＭにおいて、サルビアノリン酸Ｂは、インキュベーションの３日目から顕著となる完全な抑制効果を示した。５日間のインキュベーションの後、１００μＭのサルビアノリン酸Ｂはα−シヌクレインのフィブリル化を完全に無効にし、一方で５０μＭでは、サルビアノリン酸Ｂは、フィブリル化を約８０％抑制した。より低い濃度において（２５μＭなど）も、サルビアノリン酸Ｂは、フィブリル化の抑制を誘導し、当該抑制の割合は、５日のインキュベーション後、約３５％に減少した（図１Ｂ）。これらの結果は、サルビアノリン酸Ｂは、フィブリルの形成を濃度依存の態様で抑制することを示す。
ジヒドロミリセチンは、フィブリル化の良い抑制剤として観察された。５日間のインキュベーション後、ジヒドロミリセチンは、濃度１００μＭ及び５０μＭにおいてそれぞれ８０％及び４０％、α-シヌクレインのフィブリル化を抑制し、一方で２５μＭでは、当該化合物はフィブリル化を抑制することができなかった（図１Ｃ）。
サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンのα-シヌクレインのフィブリルの形成をブロックする能力は、コンゴレッド（ＣＲ）結合アッセイを使用してさらに調査された。α-シヌクレインのフィブリルに結合すると、ＣＲの吸収極大は４９０ｎｍから５０８ｎｍにシフトし、加えて、このシフトは、当該化合物の非存在下でインキュベートされたα-シヌクレインサンプルについて、非常に顕著であった（図２Ｂ及び図２Ｃ）。しかし、この特徴的なシフトは、サルビアノリン酸Ｂ又はジヒドロミリセチンの存在下でエージングされたα-シヌクレインサンプルについては観察されなかった。このことは、これらの化合物がアミロイドフィブリルの形成を抑制したことを示す（図２Ｂ及び図２Ｃ）。サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチン（テストされた全ての濃度の）を含むα-シヌクレインサンプルに結合したＣＲの吸収極大は、数ｎｍのみシフトし、かつ、波長４９５ｎｍを超えなかった（図２Ｂ及び図２Ｃ）。
これらの所見は、電子顕微鏡観察によってさらに裏付けされた。サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンの存在下でエージングされたα-シヌクレインのＴＥＭ像は、単独でエージングされたα-シヌクレインによって形成された長いフィブリルの高密度のメッシュと（図３Ｄ）は異なり、α-シヌクレインが、断片化した外観を有する薄く、短い棒状のフィブリルを形成していることを示した（図３Ｂ及び図３Ｃ）。
例３
ジンセノサイドＲｂ１、サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンのα−シヌクレインのオリゴマー化に対する効果
Ｇｎ Ｒｂ１、サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンのα−シヌクレインのオリゴマー化への影響は免疫ブロット分析によって評価された。未使用の及びエージングされたα-シヌクレインの溶液は、単独で又はＧｎ Ｒｂ１、サルビアノリン酸Ｂ又はジヒドロミリセチンの存在下で分析された。サンプルは１５％ＳＤＳゲルにおいて分離され、ニトロセルロースメンブレンに転写されて、α-シヌクレインのアミノ酸残基１２１−１２５を認識する抗体によって探査された。新たに調製されたα-シヌクレインの大部分は、α-シヌクレインのモノマーに対応する〜１６ｋＤａのバンドとして移動した（図４Ａ−Ｃ）。
単独で及び化合物の存在下でエージングされたα−シヌクレインのサンプルにおけるモノマーのα-シヌクレインの量は、モノマー種のみを含む未処理のα-シヌクレインサンプルと対照して、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量された。
Ｇｎ Ｒｂ１は、全ての濃度において（図４Ａ及び図５Ａ）、α-シヌクレインのオリゴマー化の有力な抑制剤であることが示された。Ｇｎ Ｒｂ１は、より大きな凝集体（ＭＷ＞２５０ｋＤａ）及びより高分子量（higher ＭＷ）のオリゴマーの形成を抑制し、顕著なモノマーのバンド及び弱いダイマーの（dimeric）バンドを生成した（図４Ａ）。モノマーのバンドの密度分析によって、Ｇｎ Ｒｂ１は、α−シヌクレインのオリゴマー化を、テストした全ての濃度において同程度に抑制することが明らかとなった（図５Ａ）。最も低い濃度においても、より大きな凝集体の形成を抑制することができた。
サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンは、α−シヌクレインのオリゴマー化の有力な抑制剤であることが示された。サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンは、用量に依存する形でα−シヌクレインのオリゴマー化を抑制した（図４Ｂ−Ｃ及び図５Ｂ−Ｃ）。
サルビアノリン酸Ｂは、より大きな凝集体（ＭＷ＞２５０ｋＤａ）及びより高分子量（higher ＭＷ）のオリゴマーの形成を抑制し；モノマー及びダイマーのα-シヌクレインに対応するバンドが最も顕著な種であり、かつ、トリマーの（trimeric）α-シヌクレインに対応するバンドは薄かった（図４Ａ）。サルビアノリン酸Ｂの濃度が低下すると、ダイマー、トリマー及びオリゴマーのバンドが次第に強くなり、サルビアノリン酸Ｂがα−シヌクレインのオリゴマー化を用量に依存する形で抑制することを示した（図４Ａ）。最も低い濃度であってもなお、サルビアノリン酸Ｂはより大きい凝集体の抑制を誘導した。また、ジヒドロミリセチンは、オリゴマーの形成を濃度に依存した態様で抑制し；最も高い濃度は、テストされた３つの濃度の中で最も有力であった（図４Ｂ）。ジヒドロミリセチンの最も高い濃度において、α−シヌクレインはダイマー及びトリマーの薄いバンドを形成した（図４Ｂ）。しかし、これらのバンドは、ＣＭＣ１０の濃度が減少すると、次第に強くなり、用量に依存する抑制と一致していた（図４Ｂ）。
これらの結果は、サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンがα-シヌクレインのオリゴマー化及びフィブリル化をブロックすることを示す。
例４
ジンセノサイドＲｂ１、サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンのα−シヌクレイン誘導細胞毒性に対する効果
ＢＥ（２）−Ｍ１７ヒト神経芽腫細胞は、３つの異なる濃度０．５μＭ、１μＭ及び５μＭのエージングされたα-シヌクレイン溶液によって、単独で又はＧｎ Ｒｂ１、サルビアノリン酸Ｂ若しくはジヒドロミリセチンの存在下で処理された。
Ｇｎ Ｒｂ１、サルビアノリン酸Ｂ若しくはジヒドロミリセチンの存在下又は非存在下において、エージングされたα−シヌクレインで処理された細胞の生存率は、ＭＴＴ試験（MTT assay）によって決定された。実験前に、Ｇｎ Ｒｂ１、サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンの単独での細胞生存率が評価され（結果示さず）、Ｇｎ Ｒｂ１、サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンの、同様に毒性を示さない濃度が採用された。当該濃度は、その後のエージングされたα−シヌクレインを伴う実験のために採用された濃度である。
エージングされたα−シヌクレインは、ＭＴＴの還元を用量に依存する形で抑制した（図６）。ＭＴＴの還元は、生存細胞の数に正比例することを考えれば、エージングされたα-シヌクレインの濃度が高いほど生存細胞はより少ないことは明らかである。しかし、Ｇｎ Ｒｂ１、サルビアノリン酸Ｂ又はジヒドロミリセチンの存在下でエージングされたα−シヌクレインは、ＭＴＴの還元が増加することによって示されるように、細胞に対する毒性が低い（図６Ａ−Ｃ）。
５μＭにおいて、エージングされたα-シヌクレインは生存細胞の数のおよそ５０％の減少を誘導し、一方では全ての濃度のＧｎ Ｒｂ１の存在下において、約８０％の細胞の生存を伴い、細胞の生存率が約３０％増加した（図６Ａ）。１μＭのエージングされたα-シヌクレインの場合においても、同様の傾向が観察された；用いられた全ての濃度において、Ｇｎ Ｒｂ１は１μＭのエージングされたα-シヌクレインによって処理された細胞の生存率を約３０％向上させた（図６Ａ）。
サルビアノリン酸Ｂの存在下において、モル比４：１及び２：１に関して、約９５％の細胞が生存した（図６Ｂ）。また、これらのモル比において、サルビアノリン酸Ｂは、Ｔｈ−Ｔの強度（カウント（counts））における減少によって示されたように、フィブリル化に関する良い抑制剤であることが判明している（図１Ｂ）。また、ジヒドロミリセチンもα-シヌクレインの毒性を低減させる（図６Ｃ）。ジヒドロミリセチンは、最も高い濃度において、細胞を保護することを示し、当該保護は４：１のモル比によって表われ、細胞の生存率を約１０％改善した。これらの調査結果は、Ｔｈ−Ｔ蛍光測定（図１Ｃ）及び免疫ブロット分析（immunoblotting analysis）による（図４）。
例５
Ｇｎ Ｒｂ１及びジヒドロミリセチンの処理されたα−シヌクレインアミロイドフィブリルに対する効果
α−シヌクレインのフィブリル化を抑制する高い効果に起因して、Ｇｎ Ｒｂ１及びジヒドロミリセチンは、フィブリル化の反転に対する有効性に関して調査された。２５μＭの処理を受けたα-シヌクレインのフィブリルは、Ｇｎ Ｒｂ１又はジヒドロミリセチンの存在下、様々なモル比（化合物：α-シヌクレイン６：１、４：１及び２：１）において、３７℃で４８時間インキュベートされた。Ｔｈ−Ｔ蛍光強度を測定することによって（図７）、異なるタイムポイントにおけるフィブリルの含有量が見積もられた。
時間０において、単独でインキュベートされたα-シヌクレインのＴｈ−Ｔカウントは、Ｇｎ Ｒｂ１を含むサンプルのＴｈ−Ｔカウントと比較して、特に、最も高い濃度の特定のジンセノサイドを含むサンプルと比較して高かった。実験の進行中、Ｇｎ Ｒｂ１の非存在下でインキュベートされたα-シヌクレインフィブリルは、Ｔｈ−Ｔカウントの増加によって示されるように、さらに続けて凝集し、一方では、ジンセノサイドの存在下でインキュベートされたフィブリルは、用量に依存する形で分散（disaggregated）し、Ｔｈ−Ｔカウントが減少した（図７Ａ）。この傾向は４時間のインキュベーション後に顕著であり、Ｇｎ Ｒｂ１を含むサンプルのＴｈ−Ｔカウントは、コントロールサンプルのＴｈ−Ｔカウントの約５分の１であった。
時間０において、単独でインキュベートされたα-シヌクレインのＴｈ−Ｔのカウントは約２０,０００であり、一方でジヒドロミリセチンの存在下の場合は、Ｔｈ−Ｔカウントは当該タイムポイントにおいてより小さかった。単独でインキュベートされたα-シヌクレインフィブリルは、Ｔｈ−Ｔカウントの増加によって示されるように、さらに続けて凝集し、一方でジヒドロミリセチンの存在下でインキュベートされたα-シヌクレインフィブリルは、用量に依存する形で徐々に分散し、Ｔｈ−Ｔカウントが減少した（図７Ｂ）。従って、ジヒドロミリセチンは、予め形成されたα-シヌクレインフィブリルを用量に依存する形で分散させた。
Ｇｎ Ｒｂ１及びジヒドロミリセチンの、予め形成されたフィブリルを分散させる能力が、Ｇｎ Ｒｂ１及びジヒドロミリセチンを、被検体においてレビー小体などのα-シヌクレイン凝集体のイメージングにおいて使用されるために適切な化合物とする。
例６
サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチン及びＧｎ Ｒｂ１のα-シヌクレインモノマーの播種（seeding）に対する効果
アミロイドフィブリル形成のプロセスは、重合核依存性重合モデルに従うことが既に示されている。このモデルによれば、可溶性の成分は、重合核オリゴマー種（nucleation oligomeric）（核生成又は遅延時間フェーズ）の生成を経て、次に重合してフィブリルを形成し（重合又は成長フェーズ）、平衡状態として知られる最終的な安定状態に達する。小さい凝集体又は種子（seeds）は、インビトロ及びインビボにおけるアミロイド形成の核生成フェーズを播種（seeding）として知られるプロセスを経て促進することを示されてきた。
Ｇｎ Ｒｂ１、サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンがα-シヌクレインのフィブリル化を抑制したことを考慮して、α-シヌクレインの凝集の播種に対する効果が決定された。成長したα-シヌクレインのフィブリルは、超音波によって分断されて短いフィブリルが得られ、当該短いフィブリルが「種子」（seeds）として採用された。これらの短いフィブリルの種子は、その後モノマーのα−ｓｙｎに添加され、上述したように、当該モノマーのα−ｓｙｎは凝集した。当該短いフィブリルの種子の添加は、Ｔｈ−Ｓのカウントの増加によって示されるように、α-シヌクレインモノマーのフィブリル化のプロセスを促進した。
サルビアノリン酸Ｂ、ジヒドロミリセチン及びＧｎ Ｒｂ１のα−シヌクレインの凝集における播種に対する効果を評価するために、当該化合物は、１０μＭ又は５０μＭから１００μＭの濃度で、最終濃度２μＭで種子を含むモノマーのα−シヌクレインに添加された。当該混合物は、連続的な混合を伴って３７℃で６時間インキュベートされた。
α-シヌクレインの播種凝集（seeded aggregation）に対するＧｎ Ｒｂ１の効果は、２時間のインキュベーション後に明らかであり、コントロールサンプルのＴｈ−ＴカウントがＧｎ Ｒｂ１を含むサンプルの２倍であった。このタイムポイントにおいて、ジンセノサイドの異なる２つの濃度を示すＧｎ Ｒｂ１を含むサンプルの両方は、同等の測定結果であった。しかし、６時間のインキュベーション後、５０μＭのＧｎ Ｒｂ１を含むサンプルは、１０μＭのＧｎ Ｒｂ１を含むサンプルよりもはるかに高い効果を現わした。実際に、５０μＭの濃度において、Ｇｎ Ｒｂ１は播種プロセスを約９０％抑制し、一方では、１０μＭの濃度において播種プロセスを約６０％抑制した（図８Ａ）。これらの所見は、ＴＥＭによってさらに確認された（図９Ａ）。６時間のインキュベーション後、Ｇｎ Ｒｂ１を含み主に球形のα−シヌクレインを含むサンプルとは異なり、播種されたα-シヌクレインはフィブリルのネットワークを形成した。
サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンは、５０μＭの濃度において、低いＴｈ−Ｓカウントによって示されるように、播種プロセスを約９０％抑制した（図８Ｂ及びＣ）。より低い濃度において（１０μＭ）、ジヒドロミリセチンのみがα-シヌクレインモノマーの播種に対して抑制効果を示したが、サルビアノリン酸Ｂの場合は、当該抑制効果はより少ない程度であった。これらの所見（５０μＭかつ６時間のインキュベーション）は、ＴＥＭによって確認された。
例７
α−シヌクレインのフィブリル化のＧｎ Ｒｂ１抑制は、中間体種への結合及び安定なオリゴマーの形成によって仲介される
Ｇｎ Ｒｂ１、ジヒドロミリセチン及びサルビアノリン酸Ｂのα-シヌクレインオリゴマーとの相互作用が調査された。モノマーのα-シヌクレイン（１００μＭ）がＧｎ Ｒｂ１（Ｇｎ Ｒｂ１：α−シヌクレイン ４：１）、ジヒドロミリセチン（ＤＨＭ：α−シヌクレイン ４：１）又はサルビアノリン酸Ｂ（ＳＡＢ：α−シヌクレイン ４：１）の存在下で凝集された。５日間のインキュベーション後、当該サンプルは遠心分離され、上澄みはsuperdex 200 SEカラムに注入された。
Ｇｎ Ｒｂ１の実験のため、モノマーのα-シヌクレインの溶出体積が分子量標準によって決定され、カラム体積１４−１６ｍｌに対応するピークにおいて溶出した。一方で、オリゴマーのα-シヌクレインは、カラム体積約２−３ｍｌ及び１０−１４ｍｌに対応するピークにおいて溶出した（図１０Ａ）。
ジヒドロミリセチン及びサルビアノリン酸Ｂの実験のため、モノマーのα−シヌクレインの溶出体積が分子量標準によって決定され、カラム体積１４−１６ｍｌに対応するピークにおいて溶出た（データ示さず）。一方で、オリゴマーのα-シヌクレインは、カラム体積約７−８ｍｌ及び１２−１４ｍｌに対応するピークであるＰ１及びＰ２の各ピークにおいて溶出した（図１１Ａ及び図１２Ａ）。
オリゴマー及びモノマーのα−シヌクレインのピークに対応するフラクションは、別々にまとめて貯蔵されてＰ１、Ｐ２及びＰ３サンプルとなり、Speed vacを用いて濃縮された。
当該溶出は、吸収波長２１５ｎｍにおいてモニタされ、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける電気泳動によって分離されたＰ１、Ｐ２及びＰ３サンプルの免疫ブロット分析によってモニタされた。Ｐ１及びＰ２サンプルは、オリゴマーのピークに対応する分離されたフラクションを含み、Ｐ３はモノマーのピークに対応する分離されたフラクションを含む。
サンプル中のα−シヌクレイン種は、ウェスタンブロッティング及び電子顕微鏡観察によってキャラクタライズされた（図１０Ｂ、図１０Ｃ、図１１Ｂ−Ｃ、図１２Ｂ−Ｃ）。同じサンプルの電子顕微鏡観察は、Ｐ１及びＰ２における異なる種のオリゴマーの存在を示し（図１０Ｃ、図１１Ｃ、図１２Ｃ）、免疫ブロット法の結果と一致していた（図１０Ｂ、１１Ｂ、１２Ｂ）。
Ｐ１、Ｐ２及びＰ３のサンプルに包含されたＧｎ Ｒｂ１を検出するために、３つの顕著なピークを伴ってＵＶ吸収スペクトルを生成するＧｎ Ｒｂ１の能力が活用された。Ｇｎ Ｒｂ１：α−シヌクレインをモル比４：１で含むサンプルにおいて、Ｇｎ Ｒｂ１はオリゴマーのＰ２サンプルにおいてのみ検出された（図１０Ｄ）。
これらの結果は、Ｇｎ Ｒｂ１がオリゴマーの中間体種に結合しかつ当該中間体種を安定させていることを示す。Ｇｎ Ｒｂ１がα-シヌクレインモノマーと相互作用しているか否かをさらに評価するために、Ｇｎ Ｒｂ１のモノマーのα-シヌクレイン溶液への滴定が、二次元ＮＭＲを使用してモニタされた。当該二次元ＮＭＲはα-シヌクレイン全体のアミノ酸配列に及ぶシグナルをもたらす。最大で６：１のＧｎ Ｒｂ１：α−シヌクレインの化学量論において、有意な化学シフト又は共鳴強度の変化は観察されず（図１３Ａ−Ｄ）、Ｇｎ Ｒｂ１モノマーのα−シヌクレインとは顕著に相互作用をしないことが確認された。
Ｐ１、Ｐ２及びＰ３のサンプルに包含されたジヒドロミリセチンを検出するために、３つの顕著なピークを伴ってＵＶ吸収スペクトルを生成するジヒドロミリセチンの能力が活用された。ＤＨＭ：α−シヌクレインを４：１で含むサンプルにおいて、ジヒドロミリセチンは、それぞれオリゴマー種及びモノマー種を表わすＰ２及びＰ３の両方において検出された（図１１Ｄ）。
Ｐ１、Ｐ２及びＰ３のサンプルに包含されたサルビアノリン酸Ｂを検出するために、３つの顕著なピークを伴ってＵＶ吸収スペクトルを生成するサルビアノリン酸Ｂの能力が活用された。サルビアノリン酸Ｂ：α−シヌクレインを４：１で含むサンプルにおいて、サルビアノリン酸Ｂは、オリゴマー種を表わすＰ２サンプルにおいて検出された（図１２Ｄ）。
これらの結果は、当該化合物であるジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン及びサルビアノリン酸Ｂがオリゴマーの形のα-シヌクレインに結合することができ、かつ、予め形成されたフィブリルに結合しかつ当該フィブリルを分散させることができることを示す。このことは、これらの化合物がα−シヌクレインが関係する疾患の診断における使用、及びα-シヌクレイン凝集体のイメージングにおける使用に適しているであろうことを示唆している。ジンセノサイドＲｂ１及びサルビアノリン酸Ｂの、モノマーの形のα−シヌクレインではなく、オリゴマーの形のα−シヌクレインに結合する能力は、Ｇｎ Ｒｂ１及びサルビアノリン酸Ｂは、α−シヌクレインが関係する疾患に関して、凝集体の診断及びイメージングにおける使用に適しているであろうことをさらに示唆している。
また、これらの結果は、当該化合物であるジンセノサイドＲｂ１、サルビアノリン酸Ｂ及びジヒドロミリセチンは、α-シヌクレインの毒性に対する神経芽腫細胞の保護をもたらし、かつ、α-シヌクレインのオリゴマー化及びフィブリル化をブロックし得ることを示している。これによって、当該結果は、シヌクレイン病の治療における被検体において、α-シヌクレイン凝集体の形成を除去しかつ／又は防止することによって、これらの化合物が有用であろうことを示唆している。

Claims (13)

  1. α−シヌクレインフィブリルの不溶性の凝集体であるα−シヌクレイン凝集体の検出において使用する造影剤であって、
    ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された化合物と、
    検出可能な標識と、
    を含むことを特徴とする造影剤。
  2. α−シヌクレインフィブリルの不溶性の凝集体であるα-シヌクレイン凝集体を検出するインビトロの方法であって：
    ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された化合物を被検体からのサンプルに投与するステップと、
    前記化合物の前記α-シヌクレイン凝集体への結合を検出するステップと、
    を含むことを特徴とする方法。
  3. 前記化合物はジンセノサイドＲｂ１又はジヒドロミリセチンである請求項２に記載の方法。
  4. 前記α−シヌクレイン凝集体をイメージングする請求項２に記載のインビトロの方法。
  5. 前記サンプルは脳組織サンプルであることを特徴とする請求項２に記載のインビトロの方法。
  6. 前記化合物のα−シヌクレインフィブリルへの結合の存在がオートラジオグラフィー、ポジトロン放出断層撮影、核磁気共鳴画像法、ガンマカウンタ、又はシンチレーションカウンタによってインビトロで検出されることを特徴とする請求項２に記載のインビトロの方法。
  7. 前記化合物は検出可能な標識を含むことを特徴とする請求項２に記載のインビトロの方法。
  8. 前記α-シヌクレイン凝集体はレビー小体であることを特徴とする請求項２に記載のインビトロの方法。
  9. シヌクレイン性疾患の患者からの組織及び／又は体液のサンプルを対象とするインビトロの分析方法であって、
    （ａ）前記サンプルと、ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン又はサルビアノリン酸Ｂから選択された化合物とを、前記化合物を前記サンプル中に存在するα−シヌクレインフィブリルの不溶性の凝集体であるα−シヌクレイン凝集体に結合させるために効果的な条件下で、インビトロで混合するステップと、
    （ｂ）前記サンプル中の前記α−シヌクレイン凝集体の存在又は非存在を検出するステップと、
    を含むことを特徴とするインビトロの分析方法。
  10. ジンセノサイドＲｂ１、ジヒドロミリセチン及びサルビアノリン酸Ｂから選択された化合物の使用であって、被検体からのサンプル中のα−シヌクレインフィブリルの不溶性の凝集体であるα−シヌクレイン凝集体の存在を検出するための造影剤としての使用。
  11. 被検体においてα−シヌクレインフィブリルの不溶性の凝集体であるα−シヌクレイン凝集体を分散させることによる、シヌクレイン病の治療用の医薬品組成物であって：
    ジンセノサイドＲｂ１及びジヒドロミリセチンから選択された化合物を有効成分として含むことを特徴とするシヌクレイン病の治療用の医薬品組成物。
  12. 前記シヌクレイン病は、パーキンソン病、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）を含むグループから選択されたものであることを特徴とする請求項１１に記載のシヌクレイン病の治療用の医薬品組成物。
  13. 前記α-シヌクレイン凝集体はレビー小体であることを特徴とする請求項１１に記載のシヌクレイン病の治療用の医薬品組成物。
JP2017525594A 2014-11-14 2014-11-14 造影剤用の化合物 Active JP6564032B2 (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2014/066041 WO2016075516A1 (en) 2014-11-14 2014-11-14 Compounds for use as imaging agents

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2018505845A JP2018505845A (ja) 2018-03-01
JP6564032B2 true JP6564032B2 (ja) 2019-08-21

Family

ID=55953787

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017525594A Active JP6564032B2 (ja) 2014-11-14 2014-11-14 造影剤用の化合物

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10488417B2 (ja)
EP (3) EP4356967A2 (ja)
JP (1) JP6564032B2 (ja)
WO (1) WO2016075516A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108152319A (zh) * 2018-02-07 2018-06-12 山东省分析测试中心 一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Rd对照品含量的方法
CN108398452A (zh) * 2018-02-07 2018-08-14 山东省分析测试中心 一种基于氢核磁定量分析技术测定人参皂苷Re对照品含量的方法
CN108514546B (zh) * 2018-05-14 2020-09-29 山东师范大学 一种二氢杨梅素的壳聚糖水凝胶制剂及制备方法
EP3802548A1 (en) * 2018-06-08 2021-04-14 AC Immune SA Novel compounds for diagnosis

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999050300A1 (en) 1998-03-30 1999-10-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of identifying, diagnosing and treating synuclein positive neurodegenerative disorders
JP2000191539A (ja) 1998-12-22 2000-07-11 Japan Science & Technology Corp ジンセノサイドＲｂ１からなる脳細胞又は神経細胞保護剤
GB0203446D0 (en) 2002-02-14 2002-04-03 Univ Lancaster Detection and/or monitoring of synuclein-related diseases
EP1750808B1 (en) * 2004-05-18 2011-02-09 Bright Future Pharmaceutical Laboratories Limited Myricitrin compounds for treating sleeping disorders
WO2007118363A1 (fr) * 2006-04-19 2007-10-25 Jianxun Liu Composition médicinale chinoise, procédé de préparation et utilisation de celle-ci
CN1985836A (zh) 2006-12-18 2007-06-27 贵州信邦远东药业有限公司 一种抗脑缺血作用的药物组合物
CN101239057A (zh) 2007-02-06 2008-08-13 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 丹酚酸b及其盐类在治疗帕金森病中的用途
GB0716885D0 (en) 2007-08-30 2007-10-10 United Arab Emirates Universit Diagnostic agent
US20110159527A1 (en) * 2008-06-16 2011-06-30 Michael Gebhard Schlossmacher Methods and kits for diagnosing neurodegenerative disease
US20120053235A1 (en) 2010-08-30 2012-03-01 Hong Kong Baptist University Dihydromyricetin as an IKK-beta inhibitor used for treatment of arthritis, cancer and autoimmune conditions, and other diseases or disorders
US20120251448A1 (en) 2011-03-03 2012-10-04 Hefti Franz F Compounds for Use in the Detection of Neurodegenerative Diseases
CN102727508B (zh) 2012-07-15 2014-09-24 浙江大学 人参二醇皂苷组分制备及在防治帕金森氏病中的药物用途
CN103054847A (zh) 2013-01-04 2013-04-24 中国药科大学 丹酚酸b作为儿茶酚-o-甲基转移酶抑制剂在帕金森病治疗中的应用
US9534044B2 (en) * 2013-02-28 2017-01-03 United Arab Emirates University Alpha-synuclein antibodies and uses thereof
CN104116730A (zh) 2013-04-26 2014-10-29 中国科学院大连化学物理研究所 二氢杨梅素作为活性成份在制备帕金森症治疗药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP3961216A1 (en) 2022-03-02
US20170307623A1 (en) 2017-10-26
US10488417B2 (en) 2019-11-26
EP3961216B1 (en) 2024-02-14
EP3218721A1 (en) 2017-09-20
EP3218721A4 (en) 2018-11-21
JP2018505845A (ja) 2018-03-01
WO2016075516A1 (en) 2016-05-19
EP3218721B1 (en) 2021-08-18
EP4356967A2 (en) 2024-04-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Raffaele et al. The costs and benefits of senotherapeutics for human health
Shen et al. Autophagy regulates intracerebral hemorrhage induced neural damage via apoptosis and NF-κB pathway
JP6564032B2 (ja) 造影剤用の化合物
CN112457281B (zh) 阻断covid-19棘突状蛋白与人血管紧张素转化酶2结合的小分子抑制剂及其用途
JP5806679B2 (ja) 神経膠腫の治療のための神経フィラメントペプチドの使用
Sohn et al. The anti-inflammatory and antifibrosis effects of anthocyanin extracted from black soybean on a Peyronie disease rat model
Han et al. Jujuboside a protects H9C2 cells from isoproterenol‐induced injury via activating PI3K/Akt/mTOR signaling pathway
Aimaiti et al. Acteoside exerts neuroprotection effects in the model of Parkinson's disease via inducing autophagy: Network pharmacology and experimental study
CN112750496A (zh) 一种covid-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法、其筛选的活性分子及用途
Xing et al. Bone-targeted delivery of senolytics to eliminate senescent cells increases bone formation in senile osteoporosis
EP2903999B1 (de) Peptide zur behandlung und frühdiagnose von morbus alzheimer und anderer tauopathien
CN103857400A (zh) 玫瑰红景天提取物和分离的化合物及其在治疗神经变性疾病中的应用
Hu et al. Inhibiting β-amyloid-associated Alzheimer’s pathogenesis in vitro and in vivo by a multifunctional dimeric bis (12)-hupyridone derived from its natural analogue
Zeng et al. Ethyl ferulate suppresses post-myocardial infarction myocardial fibrosis by inhibiting transforming growth factor receptor 1
CN113993554A (zh) 选自食道、咽喉、肺、脑和肠的癌症的靶向化合物
Zhang et al. Protective effect of S14G-humanin against beta-amyloid induced LTP inhibition in mouse hippocampal slices
US20230099837A1 (en) Compositions and methods for treating neurodegenerative disorders with ripk1/ripk3 inhibitors
EP3383381B1 (en) Compound for use in the prevention and treatment of neurodegenerative diseases
Lee et al. Probing amyloid beta-induced cell death using a fluorescence-peptide conjugate in Alzheimer's disease mouse model
Yan et al. Deoxyschizandrin attenuates Aβ1–42-induced cognitive impairments through up-regulation of AMPA receptors in mice
Krishnamoorthi et al. PPARɑ Ligand Caudatin Improves Cognitive Functions and Mitigates Alzheimer’s Disease Defects By Inducing Autophagy in Mice Models
Su et al. N-Cinnamoylpyrrole-derived alkaloids from the genus Piper as promising agents for ischemic stroke by targeting eEF1A1
Wang et al. Promoting collateral formation in type 2 diabetes mellitus using ultra-small nanodots with autophagy activation and ROS scavenging
Feng et al. Cortical expression of peroxisome proliferator-activated receptor-α after human brain contusion
Nagu et al. Screening of Herbal Molecules for The Management of Alzheimer’s Disorder: In Silico and In Vitro Approaches

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20171212

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20180718

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20180731

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20181031

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190402

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20190625

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20190702

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20190725

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6564032

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250