CN112750496A

CN112750496A - 一种covid-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法、其筛选的活性分子及用途

Info

Publication number: CN112750496A
Application number: CN202011598600.4A
Authority: CN
Inventors: 李悦青; 赵伟杰; 潘霞; 严梦雪; 孙萌萌
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2020-12-29
Filing date: 2020-12-29
Publication date: 2021-05-04

Abstract

本发明公开了一种COVID‑19棘突状蛋白抑制剂的筛选方法、其筛选的活性分子及用途，所述的筛选方法从数据库获取COVID‑19棘突状蛋白与人血管紧张素转化酶2共晶的三维结构；从中药材活性成分数据库获取中药材的活性分子及其衍生物，构建小分子的化合物库；建立药效团模型，将药效团模型作为查询式，基于匹配度值筛选，选取归一化匹配值大于0.35的小分子化合物。本发明可以实现针对新冠病毒侵入人体细胞的S蛋白结合人ACE2环节、快速有效的筛选出有效的S蛋白小分子抑制剂，所筛出的抑制剂效果确切，在预防或/和治疗新型冠状病毒肺炎上具有应用前景。

Description

一种COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法、其筛选的活性分子及用途

技术领域

本发明属于医药及生物技术领域，具体涉及一种COVID-19棘突状蛋白抑制剂的筛选方法、其筛选的活性分子及用途。

背景技术

人冠状病毒棘突状蛋白(COVID-19Spike protein，S蛋白)是一类病毒融合蛋白，S蛋白结合宿主受体是病毒感染细胞的关键步骤，可作为抑制人冠状病毒的药物的靶点[Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spikeprotein: potentialantivirus drug development for COVID-19，Acta Pharmacologica Sinica,2020]。今年4月份，由我国科学家多团队合作解析了COVID-19的S蛋白与人细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)复合物的晶体结构(PDB ID： 6LZG)。人新型冠状病毒COVID-19属于β冠状病毒，其S蛋白的S1亚基含有多个结构域A-D，其中结构域A和B组成受体结构域(Receptorbinding domain, RBD)，与人血管紧张素转化酶2(hACE2，人ACE2)产生相互作用。目前针对该靶点研究较多的是宿主中和抗体和疫苗设计，小分子抑制剂的报道较为稀少。

在我国，中医药在新型冠状病毒的治疗和防控中发挥了重要作用，并且在国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》(试行版)多个版本中，中成药和中药方剂都明确写入其中，在临床的治疗中发挥了较大的作用。目前的一些论文研究也逐步证实中药中的活性成分在病毒感染人体各个环节和引起炎性反应中的作用，比如终南山院士团队在Pharmacological Research上发表名为 Lianhuaqingwen exerts anti-viral and anti-inflammatory activity against novel coronavirus(SARS-CoV-2)(《连花清瘟对新型冠状病毒具有抗病毒、抗炎作用》) 的研究文章，显示连花清瘟能显著抑制新型冠状病毒(SARS-CoV-2)在细胞中的复制，从而发挥抗新冠病毒活性的作用。

随着计算机辅助药物设计的发展，药物虚拟筛选已成为一种与高通量筛选互补的技术，是发现先导化合物及其活性优化的重要方法。因此，建立一种快速、高效的COVID-19棘突状蛋白小分子抑制的筛选方法，对于潜在的、作用明确的COVID-19棘突状蛋白抑制的发现及其在新型冠状病毒的预防和治疗中的应用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于虚拟筛选的、高效的COVID-19棘突状蛋白小分子抑制剂的筛选方法及目标化合物在新型冠状病毒的预防和治疗中的应用。

本发明的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法，其包括以下步骤：

步骤1、从数据库获取COVID-19棘突状蛋白与人血管紧张素转化酶2共晶的三维结构；

步骤2、从中药材活性成分数据库获取中药材的活性分子及其衍生物，构建小分子的化合物库；

步骤3、根据步骤1)获得的三维结构中COVID-19棘突状蛋白与人血管紧张素转化酶2的氢键相互作用，以COVID-19棘突状蛋白为靶标蛋白，基于人血管紧张素转化酶2与COVID-19棘突状蛋白的结合特征，建立药效团模型，其中，基于人血管紧张素转化酶2的第24位氨基酸Gln24、第30位氨基酸Asp30、第34位氨基酸His34、第42位氨基酸Gln42、第83位氨基酸Tyr83、第353位氨基酸Lys353和第355位氨基酸Asp355，利用Discovery Studio手动生成药效团模型，所述的药效团模型包含两个氢键供体特征和六个氢键受体特征；

步骤4、采用有步骤3)中构建的药效团模型作为查询式，对步骤2)中构建的小分子化合物库进行基于匹配度值的筛选，选取归一化匹配值大于0.35的小分子化合物，作为潜在的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂。

在一个具体的实施方案中，在步骤1)中，所述的数据库为Protein data bank，所述的COVID-19棘突状蛋白与人血管紧张素转化酶2共晶的三维结构的登录号为PDB ID：6LZG。

在一个具体的实施方案中，在步骤2)中，所述的中药材活性成分数据库选自TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and AnalysisPlatform，https://tcmspw.com/tcmsp.php)和TCMID(Traditional Chinese MedicineIntegrated Database，http://www.megabionet.org/tcmid)。

进一步地，所述的中药材包括但不限于：连翘、金银花、苦杏仁、板蓝根、鱼腥草、广藿香、大黄、甘草、麻黄、红景天、棉马贯众、苍术、陈皮、厚朴、白芷、茯苓、大腹皮、半夏、甘草浸膏、紫苏叶油、泽泻、猪苓、杏仁、桂枝、白术、柴胡、黄芩、生姜、紫苑、冬花、射干、细辛、山药、枳实、败酱草、虎杖、马鞭草、芦根、浙贝母、牛蒡子、青蒿和藜芦。

在一个具体的实施方案中，在步骤3)中，所述的药效团模型的两个氢键供体特征和六个氢键受体特征具体为：

基于Gln24的酰胺氮原子为氢键供体药效团特征点中心，以与之成氢键的 hACE2的Asn487的酰胺羰基氧为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键供体；

基于Asp30的羧酸羰基氧为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的 hACE2的Lys417的氨基氮为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；

基于His34的咪唑芳香氮为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的 hACE2的Tyr453的羟基氧为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；

基于Gln42的酰胺羰基氧为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的 hACE2的Tyr449的羟基氧为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；

基于Tyr83的羟基氧为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的hACE2 的Asn487的氨基氮和Tyr489的羟基氧的中间点为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；

基于Lys353的羰基氧为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的 hACE2的Gly502的氨基氮为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；

基于Lys353的氨基氮为氢键供体药效团特征点中心，以与之成氢键的 hACE2的Gly496的羰基氧为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键供体；

基于Lys355的羧酸羰基氧为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的 hACE2的Thr500的羟基氧为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体。

进一步地，所述的人血管紧张素转化酶2的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个具体的实施方案中，在步骤4)中，采用软件Discovery Studio中的Pharmacophores模块下的Ligand Pharmacophore Mapping进行筛选。

优选地，在步骤4)中，选取归一化匹配值大于0.39的小分子化合物，作为潜在的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂；更优选地，选取归一化匹配值大于0.4的小分子化合物，作为潜在的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂。

在一个可选的实施方案中，在步骤4)筛选后，还包括：

步骤5、对步骤4)中获得的潜在的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂进行验证。

第二方面，本发明提供了根据上述的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法所获得的小分子抑制剂在制备用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染所引起的疾病的试剂中的用途，其中，所述的小分子抑制剂选自：编号为 DUT202009至DUT202157的小分子化合物、包含所筛选小分子的药材提取物及其组合。

进一步地，所述的新型冠状病毒感染所引起的疾病为新型冠状病毒肺炎。

进一步地，所述的新型冠状病毒肺炎为哺乳动物中的新型冠状病毒肺炎；优选地，所述的哺乳动物为人。

进一步地，所述的试剂通过阻断COVID-19棘突状蛋白与人血管紧张素转化酶2结合以治疗和/或预防新型冠状病毒感染所引起的疾病。

进一步地，所述的预防新型冠状病毒感染所引起的疾病的试剂为洗手液、漱口水或鼻喷雾剂。

第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含选自以下的化合物及药学上可接受的载体：编号为DUT202009至DUT202157的小分子化合物及其组合；所述的药物组合物用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染所引起的疾病。

第四方面，一种阻断COVID-19棘突状蛋白与人血管紧张素转化酶2结合的方法，其包括向受试者给予治疗有效量的选自以下的化合物：编号为 DUT202009至DUT202157的小分子化合物及其组合。

第五方面，本发明提供了一种治疗新型冠状病毒感染所引起的疾病的方法，其包括向受试者给予治疗有效量的选自以下的化合物：编号为DUT202009至 DUT202157的小分子化合物及其组合。

第六方面，本发明提供了一种阻断COVID-19棘突状蛋白与人血管紧张素转化酶2结合的方法，其包括向受试者给予治疗有效量的选自以下的化合物：编号为DUT202009至DUT202157的小分子的化合物及其组合。

本发明的效果和益处是：

本发明通过基于经验手动构建药效团模型及设定合理药效团筛选参数的模式，提高了靶向COVID-19棘突状蛋白小分子抑制剂的筛选效率，每个分子的虚拟筛选耗时低于1分钟；提高了活性分子富集率，FitValue值大于0.35的分子仅占被筛选分子的10％；经COVID-19S蛋白类病毒与细胞表面人ACE2的结合转录检测实验以及新冠病毒S蛋白的类病毒细胞检测验证，由计算筛选得到的目标化合物对二者的相互结合确实起到了明显的阻断作用。本发明可以实现针对新冠病毒侵入人体细胞的S蛋白结合人ACE2环节、快速有效的筛选出有效的S蛋白小分子抑制剂，所筛出的抑制剂效果确切，在预防或/和治疗新型冠状病毒肺炎上具有应用前景。

附图说明

图1为COVID-19S蛋白与人ACE2相互作用界面上的氨基酸残基及氢键。

图2为基于人ACE2关键残基建立的虚拟筛选药效团模型。

图3为100倍镜下100μM化合物DUT202001对荧光标记的COVID-19棘突状蛋白和表达荧光标记人血管紧张素转化酶2细胞结合的抑制情况。

图4A至图4C为基于新冠病毒S蛋白的类病毒细胞检测体系的结果图，其中图4A为化合物DUT202001的检测结果，图4B为化合物DUT202003的检测结果，图4C为化合物DUT202004的检测结果。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

术语(定义)

为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

在本说明书中，术语“小分子的化合物”是指：相对分子质量不大于1000，且非小肽、寡肽、寡糖和寡核苷酸的化合物。

术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。配体的抑制/阻断优选地降低或改变无抑制或阻断的情况下发生配体结合时出现活性的正常水平或类型。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患都有的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t 检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。

“药物组合物”表示含有一种或多种本公开所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

“有效量”、“有效剂量”是指获得任一种或多种有益的或所需的治疗结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量。对于预防用途，有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作，包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用，有益的或所需的结果包括临床结果，诸如减少各种本公开新型冠状病毒感染所引起的疾病的发病率或改善所述疾病的一个或多个症状，减少治疗病症所需的其它药剂的剂量，增强另一种药剂的疗效，和/或延缓患者的新型冠状病毒感染所引起的疾病的进展。

术语“药学上可接受的载体”指适合用于制剂中用于递送抗体或抗原结合片段的任何无活性物质。载体可以是抗粘附剂、粘合剂、包衣、崩解剂、充填剂或稀释剂、防腐剂(如抗氧化剂、抗菌剂或抗真菌剂)、增甜剂、吸收延迟剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂等。合适的药学上可接受的载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)右旋糖、植物油(例如橄榄油)、盐水、缓冲液、缓冲的盐水和等渗剂例如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化钠。

“有效量”、“有效剂量”是指获得任一种或多种有益的或所需的治疗结果所必需的药物、化合物或药物组合物的量。对于预防用途，有益的或所需的结果包括消除或降低风险、减轻严重性或延迟病症的发作，包括病症、其并发症和在病症的发展过程中呈现的中间病理表型的生物化学、组织学和/或行为症状。对于治疗应用，有益的或所需的结果包括临床结果，诸如减少各种本公开靶抗原相关病症的发病率或改善所述病症的一个或多个症状，减少治疗病症所需的其它药剂的剂量，增强另一种药剂的疗效，和/或延缓患者的本公开靶抗原相关病症的进展。

“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

实施例：COVID-19S蛋白抑制剂的筛选

在本实施例中，COVID-19S蛋白抑制剂的筛选具体步骤如下：

1)从Protein data bank中获取COVID-19S蛋白与人ACE2蛋白共晶的三维结构(PDB ID：6LZG)。

2)从中药材活性成分数据库(TCMSP、TCMID等)下载中药材——连翘、金银花、苦杏仁、板蓝根、鱼腥草、广藿香、大黄、甘草、麻黄、红景天、棉马贯众、苍术、陈皮、厚朴、白芷、茯苓、大腹皮、半夏、甘草浸膏、紫苏叶油、泽泻、猪苓、杏仁、桂枝、白术、柴胡、黄芩、生姜、紫苑、冬花、射干、细辛、山药、枳实、败酱草、虎杖、马鞭草、芦根、浙贝母、牛蒡子、青蒿和藜芦中的活性分子，以及部分活性分子的衍生物，组成包含个5221个小分子的化合物库。

3)根据步骤1)中获得的COVID-19S蛋白与人ACE2蛋白共晶的三维结构中，基于二者的氢键相互作用，以COVID-19的S蛋白为靶标蛋白，基于人 ACE2蛋白与S蛋白结合的特征建立药效团模型。

具体地，在本实施例中，基于COVID-19S蛋白与人ACE2共晶的三维结构中的人ACE2蛋白的第24位氨基酸Gln24、第30位氨基酸Asp30、第34位氨基酸His34、第42位氨基酸Gln42、第83位氨基酸Tyr83、第353位氨基酸Lys353 和第355位氨基酸Asp355，利用Discovery Studio手动生成药效团模型。所述的药效团模型包含两个氢键供体特征和六个氢键受体特征，包含人ACE2与 COVID-19的结合形成的关键氢键供受体关系的药效特征元素，如图2所示。

基于Gln24的酰胺氮原子为氢键供体药效团特征点中心(-35.415，48.299， -2.863；半径1.6埃)，以与之成氢键的hACE2的Asn487的酰胺羰基氧为另一特征点中心(-38.2783，47.4277，-2.65727，半径2.2埃)，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键供体；基于Asp30的羧酸羰基氧为氢键受体药效团特征点中心(-30.831，36.305，3.58；半径1.6埃)，以与之成氢键的hACE2的Lys417 的氨基氮为另一特征点中心(-30.823，35.4579，6.4579；半径2.2埃)，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；基于His34的咪唑芳香氮为氢键受体药效团特征点中心(-32.54，30.603，4.172；半径1.6埃)，以与之成氢键的hACE2 的Tyr453的羟基氧为另一特征点中心(-35.1122，29.3297，6.17518；半径2.2埃)，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；基于Gln42的酰胺羰基氧为氢键受体药效团特征点中心(-42.888，19.226，0.156；半径1.6埃)，以与之成氢键的hACE2的Tyr449的羟基氧为另一特征点中心(-43.2949，21.4028， 2.17987；半径2.2埃)，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；基于 Tyr83的羟基氧为氢键受体药效团特征点中心(-36.944，43.244，-3.855；半径 1.6埃)，以与之成氢键的hACE2的Asn487的氨基氮和Tyr489的羟基氧的中间点为另一特征点中心(-36.0547，42.6713，-1.04766；半径2.2埃)，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；基于Lys353的羰基氧为氢键受体药效团特征点中心(-31.489，17.337，1.754；半径1.6埃)，以与之成氢键的hACE2 的Gly502的氨基氮为另一特征点中心(-31.5854，15.0581，3.70273；半径2.2 埃)，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；基于Lys353的氨基氮为氢键供体药效团特征点中心(-36.301，21.41，3.197；半径1.6埃)，以与之成氢键的hACE2的Gly496的羰基氧为另一特征点中心(-38.1973，19.7902， 4.86432；半径2.2埃)，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键供体；基于Lys355的羧酸羰基氧为氢键受体药效团特征点中心(-34.593，13.071，-1.534；半径1.6埃)，以与之成氢键的hACE2的Thr500的羟基氧为另一特征点中心 (-37.1642，12.5286，0.777888；半径2.2埃)，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体。

具体地，人ACE2蛋白的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:1)：

MSSSSWLLLS LVAVTAAQST IEEQAKTFLD KFNHEAEDLF YQSSLASWNY NTNITEENVQNMNNAGDKWS AFLKEQSTLA QMYPLQEIQN LTVKLQLQAL QQNGSSVLSE DKSKRLNTIL NTMSTIYSTGKVCNPDNPQE CLLLEPGLNE IMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRPLYEEYVVLKNEM ARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRG QLIEDVEHTF EEIKPLYEHL HAYVRAKLMN AYPSYISPIG CLPAHLLGDMWGRFWTNLYS LTVPFGQKPN IDVTDAMVDQ AWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWEN SMLTDPGNVQKAVCHPTAWD LGKGDFRILMCTKVTMDDFL TAHHEMGHIQ YDMAYAAQPF LLRNGANEGF HEAVGEIMSLSAATPKHLKS IGLLSPDFQE DNETEINFLL KQALTIVGTL PFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEP PHDETYCDP ASLFHVSNDY SFIRYYTRTL YQFQFQEALC QAAKHEGPLH KCDISNSTEA GQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVGAKNMNVRPLLNYFEP LFTWLKDQNK NSFVGWSTDW SPYADQSIKVRISLKSALGD KAYEWNDNEM YLFRSSVAYA MRQYFLKVKN QMILFGEEDV RVANLKPRIS FNFFVTAPKNVSDIIPRTEV EKAIRMSRSR INDAFRLNDN SLEFLGIQPT LGPPNQPPVS IWLIVFGVVM GVIVVGIVILIFTGIRDRKK KNKARSGENP YASIDISKGE NNPGFQNTDD VQTSF

4)采用由步骤3)中生成的药效团模型作为查询式对步骤2)中的小分子化合物库进行基于匹配度值的筛选。具体地，运用Pharmacophores模块下的 Ligand PharmacophoreMapping进行筛选，主要参数设置为：

Conformation Generation(构象生成)：FAST(快速)

Maximum Conformations(最大构象数)：255

Discard Existing Conformations(剔除已存在构象)：True(是)

Energy Threshold(能量阈值)：20.0

Best Mapping Only(仅保留最佳匹配)：True(是)

Options(选项)：Fit most features(匹配最多的药效特征)

Maximum Omitted Features(最大可忽略特征)：-1

Fitting Method(匹配方法)：Flexible(柔性)

Minimum Interfeature Distance(特征间最小距离)：0.5

Map Each Conformation Separately(每个构象单独匹配)：True(是)

Fit Name(匹配名称)：FitValue(匹配值)

Scale Fit Values(归一化匹配值)：True(是)

5)采用步骤4)中的参数设置，对步骤2)中获得的含有5521的小分子化合物库进行筛选，得到包含534个化合物的初筛结果；

6)在步骤5)中获得的初筛结果中，归一化FitValue值大于0.35的257 个小分子化合物，其中69个无特定CAS号，35个小分子化合物已有文献报道具备抗新型冠状病毒感染所引起的疾病，证明本实施例采用的筛选方法有效，例如，柴胡皂苷a(CAS号：20736-09-8，后续测试例中编号为DUT202008，作为对照)，在已公开专利中证明可以能够抑制COVID-19假病毒侵染ACE2高表达细胞(CN111904971A)，在本实施例中，其FitValue为0.4585。

另外的153个小分子化合物，具体参见下表1：

表1：筛选所得Fitvalue值高于0.35未报道具有抗新冠活性的分子

测试例1：阻断COVID-19棘突状蛋白的受体结合域(RBD)与人血管紧张素转化酶2(hACE2)结合的活性测试

实验材料：化合物DUT202001、DUT202002、DUT202003、DUT202004和 DUT202010(实验室自有)；化合物DUT202008和DUT202009(购自四川维克奇生物科技有限公司)；SARS-CoV-2S、pAX2、pHB和ACE2-pcDNA3(中科普瑞昇科技有限公司)；293T细胞(上海合源生物科技有限公司)。 pCMV-SNAP-hACE2质粒、SNAP-561荧光染料和RBD541-Halo-640dye来自于中国科学院大连化学物理研究所徐兆超研究组。

具体地，测试步骤如下：

1)选取上述实施例中表1中的部分化合物进行活性检测，具体地，选取虚拟筛选归一化FitValue打分值为0.3966的木犀草素二磺化衍生物 MXCS-diSO₃Na(DUT202001)、归一化FitValue打分值为0.446的木犀草素二磺化衍生物MXCS-diSO₃Na(DUT202002)、归一化FitValue打分值为0.400的白藜芦醇类似物(DUT202003)、归一化FitValue打分值为0.38的藜芦生物碱 (DUT202010)、归一化FitValue打分值为0.4626的柴胡皂苷b2(DUT202009)、归一化FitValue打分值为0.4585的柴胡皂苷a(DUT202008，作为阳性对照)、以各自适宜浓度为起始浓度，选取测试的化合物见下表2。

表2进行测试化合物信息

2)阻断COVID-19棘突状蛋白的受体结合域(RBD)与人血管紧张素转化酶2(hACE2)结合的实验

将Hela细胞传于2个共聚焦成像皿，24小时后用Lipo2000试剂瞬时转入 pCMV-SNAP-hACE2质粒，37℃5％CO₂培养箱中培养48小时。将SNAP-561 荧光染料溶于DMEM高糖培养基中，终浓度为0.2μM。用该探针溶液孵育细胞 10min，用DMEM一遍。对照组加入只含有20nM RBD541-Halo-640dye的1mL DMEM培养基，实验组加入同时含有120μM待测药物分子和20nM RBD541-Halo-640dye的1mL DMEM培养基。在37℃5％CO₂培养箱中孵育60 min。用荧光共聚焦显微镜在10倍镜下成像，如图3所示。

图3中第一行为640nm激发的RBD541-Halo蛋白成像通道，第二行为561 nm激发的SNAP-ACE2蛋白的成像通道，其中，图3中的(a)为只加入20nM RBD541-Halo-640dye的细胞成像；图3中的(b)为同时加入20nM RBD541-Halo-640dye和120μM待测药物分子DUT202001的细胞成像，其红色通道的细胞荧光微弱，说明该分子有抑制SARS-CoV-2的RBD与hACE2结合的作用。

另外，我们统计了20个细胞的平均荧光强度

和

以及成像图片背景的平均荧光强度得到

和

以图 3中的(a)的IF₆₄₀/IF₅₆₁作为100％的RBD相对活性(RA)，图3中的(b)与图3中的(a)作对比，得到120μM该分子能够抑制85％的RBD活性。

所选取的化合物测试结果见表3。

表3抑制COVID-19棘突状蛋白类与人血管紧张素转化酶2结合的结果

按照上述实验方法，以上所选取的化合物的活性检测结果如表3和图3所示，候选化合物对COVID-19棘突状蛋白RBD与表达hACE2的Hela细胞具有不同程度的抑制效果，尤其化合物DUT202001在7.6μM的浓度时，达到了51.8％的抑制效果。

测试例2：基于荧光素酶报告体系为基础的针对新冠病毒S蛋白的类病毒细胞检测体系进行评价

本测试例中，新冠病毒S蛋白的类病毒细胞检测由合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司完成。简要地，包括以下步骤：

1)新冠病毒S蛋白的类病毒制备及收集：假病毒用三种假病毒质粒 SARS-CoV-2S、pAX2和pHB瞬时转染293T细胞，S蛋白作为包膜蛋白，荧光素酶基因被包装在病毒内部。6-8h后更换新鲜培养基，37℃，5％CO₂培养48h。从60mm培养皿中收集病毒上清液，病毒上清液用0.45um滤膜过滤，立即使用病毒或在-80℃保存。

2)表面表达hACE2的293T细胞的制备及种板：用ACE2-pcDNA3细胞质粒转染瞬时转染293T细胞，6-8h后更换新鲜培养基，37℃，5％CO₂培养48h。 48h后，将细胞旋转至生长培养基中，然后用细胞计数器计数，将细胞悬浮液稀释至所需密度，取50μl细胞悬液至96孔板，每孔的细胞数为25000个。37℃、 5％CO₂培养12h，培养12h后细胞完全贴壁于96孔板上。

3)加药孵育：根据实验设计，在96孔板上每孔加入10μL配制好浓度的待测化合物溶液，37℃，5％CO₂孵育1h。

4)加假病毒：96孔板上每孔加40μL病毒上清液。37℃，5％CO₂培养24h。 24h后更换新鲜培养基，100μL/孔。37℃，5％CO₂培养24h。

5)测量：测量前将孔板平衡至室温，每孔加入30uL肾素荧光素酶试剂；在摇床上混合2分钟，诱导细胞溶解；在室温下孵育5分钟以稳定发光信号；记录酶标仪上的荧光数据。

使用以下公式计算与DMSO处理的对照与加药的孔之间的相对荧光强度 (％)：

相对荧光强度(％)＝加药孔荧光值/对照孔荧光值*100％

化合物对于COVID-19S蛋白假病毒侵染细胞的抑制率为100％-相对荧光强度(％)。

表4抑制COVID-19S蛋白类病毒侵染实验分组及测试浓度

表5抑制COVID-19S蛋白类病毒侵染结果

按照上述实验方法，以上所选取的化合物的活性检测结果如表5和图4A至图4C所示，候选化合物对COVID-19S蛋白假病毒侵染表达hACE2的293T细胞具有良好的抑制效果，在化合物的浓度大于250μM时，对于假病毒侵染的抑制率可达到75％以上。

综上所述，本发明提供的基于虚拟筛选的靶向阻断COVID-19S蛋白的活性分子的方法能够从大量化合物中快速高效地筛选出具有活性的先导化合物，并对其进一步的结构优化提供理论依据和实践指导。

以上示例性实施方式所呈现的描述仅用以说明本发明的技术方案，并不想要成为毫无遗漏的，也不想要把本发明限制为所描述的精确形式。显然，本领域的普通技术人员根据上述教导做出很多改变和变化都是可能的。选择示例性实施方式并进行描述是为了解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的其它技术人员便于理解、实现并利用本发明的各种示例性实施方式及其各种选择形式和修改形式。本发明的保护范围意在由所附权利要求书及其等效形式所限定。

序列表

<110> 大连理工大学

<120> 一种COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法、其筛选的活性分子及

用途

<130> 2020

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 804

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala

1 5 10 15

Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe

20 25 30

Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp

35 40 45

Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn

50 55 60

Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala

65 70 75 80

Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln

85 90 95

Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys

100 105 110

Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser

115 120 125

Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu

130 135 140

Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu

145 150 155 160

Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu

165 170 175

Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg

180 185 190

Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu

195 200 205

Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu

210 215 220

Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu

225 230 235 240

His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile

245 250 255

Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly

260 265 270

Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys

275 280 285

Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala

290 295 300

Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu

305 310 315 320

Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro

325 330 335

Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly

340 345 350

Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp

355 360 365

Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala

370 375 380

Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe

385 390 395 400

His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys

405 410 415

His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn

420 425 430

Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly

435 440 445

Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe

450 455 460

Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met

465 470 475 480

Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Pro His Asp Glu Thr Tyr

485 490 495

Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe Ile

500 505 510

Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala Leu

515 520 525

Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile Ser

530 535 540

Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu Gly

545 550 555 560

Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala Lys

565 570 575

Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe Thr

580 585 590

Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr Asp

595 600 605

Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys

610 615 620

Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr

625 630 635 640

Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu Lys

645 650 655

Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala

660 665 670

Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys

675 680 685

Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg

690 695 700

Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn Ser

705 710 715 720

Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln Pro

725 730 735

Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val Ile

740 745 750

Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg Lys

755 760 765

Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile Asp

770 775 780

Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp Val

785 790 795 800

Gln Thr Ser Phe

Claims

1.一种COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，其包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，在步骤3)中，所述的药效团模型的两个氢键供体特征和六个氢键受体特征具体为：

基于Gln24的酰胺氮原子为氢键供体药效团特征点中心，以与之成氢键的hACE2的Asn487的酰胺羰基氧为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键供体；

基于Asp30的羧酸羰基氧为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的hACE2的Lys417的氨基氮为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；

基于His34的咪唑芳香氮为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的hACE2的Tyr453的羟基氧为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；

基于Gln42的酰胺羰基氧为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的hACE2的Tyr449的羟基氧为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；

基于Tyr83的羟基氧为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的hACE2的Asn487的氨基氮和Tyr489的羟基氧的中间点为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；

基于Lys353的羰基氧为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的hACE2的Gly502的氨基氮为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体；

基于Lys353的氨基氮为氢键供体药效团特征点中心，以与之成氢键的hACE2的Gly496的羰基氧为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键供体；

基于Lys355的羧酸羰基氧为氢键受体药效团特征点中心，以与之成氢键的hACE2的Thr500的羟基氧为另一特征点中心，建立包含两个特征点和一个矢量方向的氢键受体。

3.根据权利要求1或2所述的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，在步骤4)中，采用软件Discovery Studio中的Pharmacophores模块下的LigandPharmacophore Mapping进行筛选。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，在步骤4)中，选取归一化匹配值大于0.39的小分子化合物，作为潜在的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂；更优选地，选取归一化匹配值大于0.4的小分子化合物，作为潜在的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法，其特征在于，在步骤4)筛选后，还包括：

6.如权利要求1-5中任一项所述的COVID-19棘突状蛋白的小分子抑制剂的筛选方法所获得的小分子抑制剂在制备用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染所引起的疾病的试剂中的用途，其中，所述的小分子抑制剂选自：编号为DUT202009至DUT202157的小分子化合物及其组合。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述的新型冠状病毒感染所引起的疾病为新型冠状病毒肺炎；

优选地，所述的新型冠状病毒肺炎为哺乳动物中的新型冠状病毒肺炎；

更优选地，所述的哺乳动物为人。

8.根据权利要求6或7所述的用途，其中，所述的试剂通过阻断COVID-19棘突状蛋白与人血管紧张素转化酶2结合以治疗和/或预防新型冠状病毒感染所引起的疾病。

9.根据权利要求6或7所述的用途，其中，所述的预防新型冠状病毒感染所引起的疾病的试剂为洗手液、漱口水或鼻喷雾剂。

10.一种药物组合物，其包含选自以下的化合物及药学上可接受的载体：编号为DUT202009至DUT202157的小分子化合物及其组合；所述的药物组合物用于治疗和/或预防新型冠状病毒感染所引起的疾病。