CN105315359A - 一种缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种用于治疗帕金森综合症的缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子。通过对人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子进行N端部分缺失突变，得到的缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子具有活性更高的特点。

Description

一种缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子

一、技术领域

本发明属于基因工程药物生产领域。通过对人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子进行N末端的缺失，得到了缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子。实验证明，通过与全长人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子进行比较，该结构具有更高的比活性，有望被开发成为治疗帕金森综合症的一种产品。

二、背景技术

帕金森病(Parkinsondisease，PD)是一种常见的神经系统病变性疾病，其确切的病因学机制至今未明，目前普遍认为系遗传与环境因素共同作用的结果。其中氧化(硝化)应激、小胶质细胞活化与神经炎症、线粒体功能障碍、蛋白质的聚集与清除障碍、自噬应激等事件是其病理生理学机制中的关键环节。目前研究的结果，正常人黑质致密部中大约有50万个特化的多巴胺能神经细胞，当其被破坏75-80％时，患者将出现帕金森病的症状。遗传学方面，目前已发现13个基因连锁位点与家族性PD的发病相关。除线粒体DNA突变外，Parkin、PINK1、DJ-1等基因突变与常染色体隐性遗传的家族性PD有关，而突触核蛋白、UCH-L1、LRRK2等基因与常染色体显性遗传的家族性PD有关，其中PINK1、Parkin、DJ-1属线粒体蛋白，与线粒体功能密切相关。

帕金森疾病的临床表现为震颤、强直、姿势不稳和无法或者迟缓运动，我国PD患者已经达到约300万人，目前PD的治疗主要以药物为主，包括抗胆碱能药、金刚烷胺、左旋多巴及复方左旋多巴，这些药物可暂时改善症状，但不能阻止病情发展。

目前针对帕金森综合症，人们重点的研究重点在脑神经细胞保护方面，现在主要集中在神经营养因子上。神经营养因子是一类小分子分泌蛋白，通过与相应的受体结合，调节神经细胞的生长、发育、成熟与存活，尤其在调控神经元的数量、突起的分支、突触的形成和神经细胞表型的成熟等发面发挥重要作用。神经营养因子还有促进损伤后神经元再生，治疗慢性神经系统疾病的功能。其中中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalicastrocytederivedneurotrophicfactor，MANF)是目前人们研究的重点，MANF是Petrova等于2003年首次在体外传代培养的大鼠中脑I型星形胶质细胞的培养基中分离到的一种能促进体外多巴胺神经元存活的神经营养因子，分子量为18kD。MANF具有促进多巴胺神经元存活的作用，研究发现MANF基因缺失的果蝇会因多巴胺能神经元数量和多巴胺水平的减少而死亡，给予人源性MANF可发挥替代功能。在大鼠中风模型中，MANF可保护大脑皮层神经元，在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)诱导的大鼠帕金森模型中，通过纹状体内注射MANF不但能保护中脑多巴胺神经元和纹状体多巴胺神经纤维，而且能加强存活神经元的功能、修复受损的黑质-纹状体多巴胺系统，减少帕金森大鼠的运动障碍，具有预防和治疗的双重潜在作用。同时，研究还证明与目前广泛研究的胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)相比，MANF对细胞外基质亲和力低，扩散范围较大；选择性作用于多巴胺神经元，对周围运动、感觉神经元和交感神经元无影响，副作用小；在低、中药物浓度时的选择性较GDNF高。因此，MANF作为一种强效神经保护因子，被认为是治疗某些中枢神经系统疾病的潜在候选因子，对于帕金森综合症的治疗有较大的应用前景。本发明对天然人MANF进行了缺失突变，得到的突变体具有活性更高的特点。

三、发明内容

本发明涉及缺失型人MANF的制备。

全长人MANF由179个氨基酸组成，成熟的人MANF切去了N末端的21个氨基酸，是由158个氨基酸组成的分子量约为17kD，研究表明，分子结构主要是由2个α螺旋组成的功能区，N末端1-3位氨基酸处于无规卷曲形态，不是功能所必须的，而且暴露在溶液外，推测对分子在溶液中的稳定性具有不利的影响。据此，本发明将MANF的N末端3个氨基酸去除，得到了缺失型MANF(dMANF)。

经测试，本发明的缺失型MANF的生物学活性明显高于天然型人MANF，具有潜在的治疗帕金森综合症的作用。

四、具体实施方式

以下实例仅是对本发明的说明，而不会对本发明产生任何限制。

(一)质粒构建和工程菌获得

1.天然人MANF和dMANF表达质粒构建

分别按照SeqIDNo1和SeqIDNo2氨基酸序列，采用大肠杆菌喜好的密码子，化学合成天然人MANF和缺失型MANF的基因序列。

采用pGEX-4T-1载体作为MANF的表达载体，其含有GST伴侣蛋白序列，能够有效地增强目的蛋白的表达，并且利于目的蛋白的下游纯化。采用BamHI-SalI双酶切pGEX-4T-1载体，并回收大片段，T4连接酶将目的基因和载体大片段连接后，转化至克隆菌株JM109中，再对经筛选的单克隆重组质粒进行目的基因测序，目的基因测序结果与理论序列一致，完成pGEX-4T-1-MANF和pGEX-4T-1-dMANF的重组表达载体的构建。

2.转化和工程菌构建

用CaCl₂法转化大肠杆菌BL21，涂布在含有50ug/ml氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性菌落在LK中培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时加入IPTG0.1mM诱导3-4小时离心收集菌体，8M尿素破菌后15％SDS-PAGE电泳时出现一条约18kD左右的蛋白带，表达量约为30％。获得工程菌株pGEX-4T-1-MANF/BL21和pGEX-4T-1-dMANF/BL21。

(二)目的蛋白获得

1.发酵

1)培养基：

(1)种子液培养基(LK)：

胰蛋白胨：10克/升、酵母粉：5克/升、氯化钠：10克/升、卡那霉素：50微克/毫升。

(2)上罐培养基(15升)：

磷酸氢二钠：315克、磷酸二氢钾：100克、氯化钠：10.05克、氯化铵：50克、胰蛋白胨：90克。

以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。

硫酸镁：15克、葡萄糖：450克、补料(500克/升)：葡萄糖。

2)发酵过程：

(1)种子培养：

从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升(250毫升的三角瓶)LC中，36度、200转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LC中，36度、200转/分，过夜。

(2)发酵过程：

将培养好的种子液(OD600＝3-4)加入罐中，调好各参数，36度、150转、溶氧100％，开始发酵；5小时后开始以2.5mL/min的速度流加2小时，约加入800毫升补料，加入1克IPTG诱导(4小时)。

3)收集菌体

离心6000rpm，15min，收集菌体，冷冻保存。

2.纯化

1)亲和层析

采用GSH-Agrose层析介质(Sigma公司)，平衡液采用25mMTris-HCl，pH8，上样平衡后，裂菌的离心上清上GlutathioneSepharose层析柱，平衡后用含10mM还原型谷胱甘肽(GSH)的洗脱液洗下融合蛋白。

2)酶解

上一步的洗脱液加入凝血酶(5NIHU/mL)37℃酶切2小时。

3)阴离子交换层析

采用QSepharoseHP层析介质，平衡液为25mMTris-HCl，pH8，上一步得到的样品用平衡液稀释3倍进行上样，平衡后采用25mMPB，pH7，0-0.5MNaCl的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。

(三)检测

1.纯度测定

得到的MANF和dMANF通过SDS-PAGE电泳和反相HPLC检测，纯度均大于98％。

2.生物学活性检测

采用动物试验法比较样品生物学活性。

取40只大鼠，10％水合氯醛(3ml/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠头部固定于大鼠脑立体定位仪上，常规消毒后从正中纵形切开头皮，暴露颅骨表面，以前囟为基准点，参照大鼠脑立体定位图谱，选用两点法注射6-OHDA(2.5g/L，含0.02％抗坏血酸无菌生理盐水)至大鼠纹状体，各点注射剂量均为10μg，体积为4μL，留8只作为空白对照组，不给予任何药物，留空针停至相同的时间，缝合并消毒伤口，待大鼠清醒后放回笼中继续饲养。

动物分组及给药造模3周后，将损伤后的大鼠腹腔注射阿扑吗啡(0.5g/L，含0.02％抗坏血酸的无菌生理盐水)，并置于安静空旷地带，5-10min后观察并计数大鼠向健侧不对称的旋转行为，观察30min，平均每分钟旋转超过7次视为成功的PD大鼠模型。将成功的PD大鼠模型随机分组，每组10只，分别为：PBS组，MANF10μg组，dMANF10μg组。分别给于相应药物，PBS和MANF(5、10、20g，一次性注射)，体积均为7μL，给药14天。

大鼠行为学检测：损伤后第6周，各实验组大鼠腹腔注射阿扑吗啡，观察计数其旋转行为，每隔2周进行1次行为学检测，给药后共进行3次行为学检测，记录每次各组大鼠的旋转次数。

结果，给药后各组大鼠旋转圈数均有不同程度减少，其中给药组在给药后旋转圈数明显少于PBS组：MANF组与PBS组比较P＝0.00192，dMANF组与PBS组比较P＝0.00099，P值均小于0.01，并且dMANF组和MANF组比较其旋转圈数也有减少P＝0.03091(P＜0.05)。

表1.MANF和dMANF对大鼠累积旋转圈数的影响

结果表明，同天然MANF比较，dMANF具有更高的体内生物学活性。

Claims (4)

1.一种缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子，由155个氨基酸组成，其氨基酸序列见SEQIDNo2。

2.权利要求1中缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子为缺失天然人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子的N末端3个氨基酸。

3.权利要求1中的缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子是用基因工程方法得到。

4.权利要求1中的缺失型重组人中脑星形胶质细胞源性神经营养因子，作为药物组合物主要成份，用于治疗帕金森综合症。