CN102964442B - 一种聚乙二醇同神经生长因子结合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种聚乙二醇-神经生长因子的制备方法,具体包括:结合:将神经生长因子与聚乙二醇溶解在pH为4-10的缓冲溶液中,两者物质的量比例为1:10,室温下搅拌24小时;纯化并回收,得到聚乙二醇同神经生长因子结合物;还包括浓缩回收的蛋白质。还包括按照所述方法制备得到的聚乙二醇同神经生长因子结合物,及含聚乙二醇同神经生长因子结合物的组合物。还保护聚乙二醇同神经生长因子结合物在制备医药上的用途。该方法简单易行,将神经生长因子与聚乙二醇相结合后,仍然保持了神经生长因子的活性,且可以提高神经生长因子在体内半衰期,减少给药频率,减少病患痛苦。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域,更具体地,本发明涉及聚乙二醇同神经生长因子结合物的制备方法。
背景技术
20世纪80年代初以来,蛋白质类药物已成为国际医药市场上最重要的药物种类之一。在临床上,蛋白质类药物既有作用位点专一、疗效明确的优点,也有多项缺点,如在胃肠道内极易被蛋白酶水解,一般仅限注射给药;血浆半衰期较短,需反复多次注射;抗原性较强,易引起过敏等不良反应;溶解度不高等。结果,病人体内的蛋白质很难达到有效治疗的血液水平。
这些问题可通过将蛋白质同聚合物(如聚乙二醇,PEG)结合来克服。1977年Davis首次采用PEG修饰牛血清白蛋白。通过修饰后,他发现不仅蛋白的免疫原性成功减少,而且半衰期大大延长。同年,Abuchowski等首先应用PEG修饰药物蛋白,结果修饰后的蛋白质疗效优于未修饰的原型药物。进一步的研究表明,蛋白质经聚乙二醇化修饰后还可以改善许多其它方面的性质,如增加蛋白质对酶的稳定性、延长蛋白质在血浆中的半衰期、增加在水中的溶解度等。
神经生长因子(NGF)是1951年是由诺贝尔生理学和医学奖获得者R.Levi-Montalcini和S.Cohen在小鼠肉瘤细胞内发现的(Levi-Montacini,1987;Cohen et al.,1954)。它是神经营养因子家族中发现最早、最典型、研究最多的一员。它参与到周围神经系统的感觉神经元和交感神经元,及中枢神经元的存活和调节的进程中,并且可以逆转,停止或减缓老年痴呆症引起的萎缩症的进程。目前市面上的神经生长因子药物均是以其活性单位β亚基形式存在,其给药方式为肌肉注射。除了与其他蛋白类药物一样具有易被蛋白酶水解,血浆半衰期不长等缺点,还有注射后局部疼痛的副作用。
故目前需要寻找一种将聚乙二醇与神经生长因子有效结合起来的方法,以使神经生长因子仍然具有活性,提高其在体内半衰期,减少给药频率,减少患者病痛。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单易行的将神经生长因子(NGF)与PEG结合形成结合物的方法。
为实现上述目的,提供以下具体技术方案:
结合:将神经生长因子与聚乙二醇溶解在pH为4-10的缓冲溶液中,两者物质的量比例为1:10,室温下搅拌24小时;缓冲溶液为PBS、MES、Pyridine溶液。
纯化并回收,得到聚乙二醇同神经生长因子结合物;得到的聚乙二醇同神经生长因子结合物可保存在-20℃下0.05M,pH=7.0的PBS缓冲液中贮存。所述纯化可采用常规方法,优选地,比如采用高效液相色谱法或凝胶电泳法。
本发明还包括浓缩回收蛋白质步骤的技术方案。
本发明所述的缓冲溶液pH可以为7-10。
本发明所述的缓冲溶液pH可以为5-7。当pH可以为5-7时,所述方法中结合时,还可以添加还原剂;优选的,还原剂为NaBCNH3。
本发明根据所形成的不同的结合物,采用不同的缓冲溶液pH范围值。
本发明所述聚乙二醇可以是mPEG-SVA,mPEG-AD、mPEG-HZ形式。
本发明涉及通式I、II的具有生物活性的神经生长因子结合物。
其中:X为不同长度的脂肪烃链,n为1-1000的整数,a为1或2,m选自≥1的整数到NGF中可及氨基或羧基的数目。
式I中的-NH-基团由NGF分子中可及的氨基衍生而来的,这一点是不言而喻的。
式II中的-C(=O)-基团由NGF分子中可及的羧基衍生而来的,这一点是不言而喻的。
按照本发明,通式I和II的NGF结合物可如下制得:使末端被活化的连接基团取代的活化PEG与NGF中的一个或多个氨基或羧基反应。
按照本发明,通过使用活化的PEG试剂制备结合物,在蛋白质(如神经生长因子(NGF))的游离氨基或羧基和PEG之间形成了一个连键,使所得的结合物保持了蛋白质的至少一部分生物活性,但免疫原性降低。另外,通过使用活化的PEG而在本发明结合物中形成的连接基团,使所得的蛋白质结合物不易在体内水解断开。
为了避免有关PEG分子中单元数的任何疑问,PEG聚合物用分子量来表征。因为PEG化合物通常由平均分子量定义而不是由它们所含的自重复单元数定义。不同分子量的PEG活化物可由本领域已知的方法制得或由供应商处购得。
所使用的PEG活化物同含一个以上游离氨基或羧基的NGF反应时,可能得到NGF同PEG试剂混合物的不同反应产物的混合物。这些反应产物是由于PEG试剂同一个或更多个游离氨基或羧基反应而形成的。这可由通式I和II中的m表示。例如,当NGF含有三个游离氨基或羧基时,活化的PEG试剂可同其中的一个、二个或所有三个游离氨基或羧基反应。这种情形下,混合物包含所有三种情况下所形成的结合反应产物。由于这个混合物中的不同结合反应产物依m值的不同而具有大不相同的分子量,这些反应产物可用传统方法如色谱法分离。分离的结合反应产物可用与筛选NGF同样的方法筛选有生物活性的结合反应产物,从而确定结合反应产物是否仍保持了用未形成结合物的NGF的一部分生物活性。
活化的PEG试剂首先同NGF中包含的游离氨基或羧基之一发生反应。通过控制试剂如NGF的浓度和反应条件,按照胺缩合的标准方法,可控制蛋白质中包含的游离氨基或羧基的聚乙二醇化程度。在包含一个或更多个游离氨基或羧基的蛋白质中,若有一个游离氨基或羧基比其他氨基或羧基活泼,可选择反应条件使蛋白质同活化的PEG化合物反应以形成m为1的通式I或II化合物。形成蛋白质的氨基酸中所含的其它游离氨基或羧基可通过延长缩合反应时间或利用其它更剧烈的反应条件进一步同PEG反应。
式IA的结合物可如下制备:
式中b为1-3的整数。这个反应可在水性介质中胺缩合的常规条件下进行。该反应通常在pH 7-10的标准缓冲水溶液中进行,以制备式IA的结合物。依蛋白质中的游离氨基数和反应时间而定,该反应可制备不同分子量的PEG蛋白质结合物的混合物。PEG蛋白质结合物接下来可用常规方法如高效液相色谱(HPLC)或凝胶电泳法分出各个部分。用HPLC或凝胶电泳法依分子量来分离化合物的任何常规方法均可使用。这个混合物的分离按照本文所述的所得产物的分子量来进行。
式IB的结合物可如下制备:
式中c为2或3。这个反应可在水性介质中羰基与氨基反应的常规条件下进行。该反应通常在pH 5-7的标准缓冲水溶液中在还原剂存在的条件下进行,以制备式IB的结合物。依蛋白质中的游离氨基数和反应时间而定,该反应可制备不同分子量的PEG蛋白质结合物的混合物。PEG蛋白质结合物接下来可用常规方法如高效液相色谱(HPLC)或凝胶电泳法分出各个部分。用HPLC或凝胶电泳法依分子量来分离化合物的任何常规方法均可使用。这个混合物的分离按照本所述的所得产物的分子量来进行。
式II的NGF结合物可按下列反应路线来制备:
PEG胺或肼通过蛋白质上一个或更多个游离羧基同蛋白质缩合,以制备式II化合物。该反应通常在pH 5-7的水溶液中进行。依蛋白质中游离羧基数不同,式II的结合物可由不同分子量结合物的混合物组成。该结合物混合物可用前面描述过的方法来分离。
按照本发明实施例的结果,本发明所得的NGF结合物同可用于形成结合物的蛋白质具有同样的效用。这样,这些结合物同形成它们的蛋白质具有相同形式的治疗活性,可以按与蛋白质本身相同的方式使用,而不会产生在给予病人蛋白质本身时可能引起的不良免疫反应。本发明也包括以NGF或其为主要成分的药物组合物以及制备这些组合物的方法。
本发明用来控制、预防或治疗疾病的药物组合物包括NGF结合物和治疗惰性的、治疗上可接受的无毒的载体物质。药物组合物可制成制剂,并按与合适的医疗惯例一致的方式给药,并应考虑所要治疗的疾病、病人的个体状况、蛋白质结合物的释放部位、给药方法以及操作者已知的其它因素。
本发明所述神经生长因子可以是任何来源的,可以从天然来源、组织培养或由重组DNA技术得到,还可以是化学合成得到;制备或分离天然神经生长因子的方法在本领域是公知的技术。
本发明还保护根据所述方法制备所得到的聚乙二醇同神经生长因子结合物。
聚乙二醇与神经生长因子结合虽然能提高其在体内的半衰期,但也常常会出现使蛋白失活的现象。本发明通过对PEG修饰剂的选择和对反应条件的调控,建立寻找一种将聚乙二醇与神经生长因子有效结合起来的方法,以使修饰后的神经生长因子仍然具有活性,能够用于治疗。
本发明还保护聚乙二醇同神经生长因子结合物在制备医药上的用途。
本发明的聚乙二醇同神经生长因子相结合后,提高了神经生长因子在体内的半衰期,可减少给药频率,给患者带来福音。
本发明的一个实施例用三种不同制备方法,目的在于测试不同的缓冲体系对反应的影响。经过试验证实,不同的缓冲体系对反应没有影响.
本发明的实施例验证了单独NGF及聚乙二醇同神经生长因子结合物的活性比较,结果证明两者在蛋白含量相等的情况下,活性相当。
附图说明
图1为本发明中反应液在柱上进行凝胶过滤纯化的色谱图。
图2为本发明中纯化后的PEG修饰的蛋白质用SDS-PAGE鉴定结果图。
图3为本发明中小鼠神经生长因子与聚乙二醇的结合物的MALDI-TOF质谱图。
图4A、4B、4C均为神经生长因子的活性试验图,图4A是阴性对照、图4B是小鼠神经生长因子、图4C是小鼠神经生长因子与聚乙二醇结合物。
具体实施方式
下面通过具体实施例,对本发明进行解释。需要说明的是,下列实施例仅仅是说明性的,并不以任何方式限制本发明。另外,下列实施例中所采用的所有仪器、材料等均为市售可得的,如在下列实施例中没有明确指出的操作,可以通过本领域技术人员常规的操作方法进行。
实施例1:mPEG-Succinimidyl Valerate[mPEG-SVA]修饰的神经生长因子的制备
浓度为0.68mg/mL的神经生长因子PBS溶液(本公司上市产品恩经复的PBS溶液)与溶解在pH为7.4的PBS溶液中的mPEG-SVA(Laysan Bio生产)以物质的量比为1:10(NGF:PEG)的比例相混合,室温下搅拌24小时。经PEG修饰的蛋白质在凝胶色谱柱(如的KW802.5)上用色谱法进行纯化,使用0.05M的PBS缓冲溶液,结果见图1,从图中可以看出,色谱峰1为mPEG-SVA修饰后的神经生长因子,色谱峰2为修饰反应过程中过量的mPEG-SVA。经PEG修饰的蛋白质用SDS-PAGE鉴定,结果见图2,其中第1-3泳道代表纯化后的PEG修饰的小鼠神经生长因子,M泳道是分子marker,从上到下,各条带分子量依次为170、130、95、72、55、43、34、26、17、10kDa。结合反应产物的MALDI-TOF质谱图(图3),图中+1PEG,+2PEG,+3PEG分别对应分子量3、5、7万左右的峰,其中+1PEG代表神经生长因子与1个PEG分子结合的产物,+2PEG代表神经生长因子与2个PEG分子结合的产物,+3PEG代表神经生长因子与3个PEG分子结合的产物。可以看出,mPEG-SVA修饰的神经生长因子有三个产物,分别是从柱中洗脱出相应于结合有一个PEG(PEG1-NGF)或两个PEG(PEG2-NGF)或三个PEG(PEG3-NGF)的NGF的蛋白质。合并这些蛋白质,浓缩后用比色分析法测定蛋白质浓度为7ng/mL。PEG-NGF在-20℃下0.05M的PBS(pH=7.0)的缓冲液中贮存。
实施例2:mPEG-aldyhyde[mPEG-AD]修饰的神经生长因子的制备
浓度为0.68mg/mL的神经生长因子PBS溶液(本公司上市产品恩经复的PBS溶液)与溶解在pH为6的PBS溶液中的mPEG-AD(Laysan Bio生产)以物质的量比1:10(NGF:PEG)的比例相混合,加入10倍物质的量NGF的NaBCNH3,室温下搅拌24小时。经PEG修饰的蛋白质在凝胶色谱柱(如的KW802.5)上用色谱法进行纯化,使用0.05M的PBS缓冲溶液。经PEG修饰的蛋白质用SDS-PAGE鉴定。从柱中洗脱出相应于结合有一个PEG(PEG1-NGF)或两个PEG(PEG2-NGF)或三个PEG(PEG3-NGF)的NGF的蛋白质。合并这些蛋白质,浓缩后用比色分析法测定蛋白质浓度(7ng/mL)。PEG-NGF在-20℃下0.05M的PBS(pH=7.0)的缓冲液中贮存。
实施例3:mPEG-hydrazine[mPEG-HZ]修饰的神经生长因子的制备
方法1:浓度为0.68mg/mL的神经生长因子溶液(本公司上市产品恩经复的PBS溶液)与溶解在pH为6的PBS溶液中的mPEG-HZ(Laysan Bio生产)以物质的量比1:10(NGF:PEG)的比例相混合,加入10倍物质的量NGF的EDAC,室温下搅拌24小时。经PEG修饰的蛋白质在凝胶色谱柱(如的KW802.5)上用色谱法进行纯化,使用0.05M的PBS缓冲溶液。经PEG修饰的蛋白质用SDS-PAGE鉴定。从柱中洗脱出相应于结合有一个PEG(PEG1-NGF)或两个PEG(PEG2-NGF)或三个PEG(PEG3-NGF)的NGF的蛋白质。合并这些蛋白质,浓缩后用比色分析法测定蛋白质浓度。PEG-NGF在-20℃下0.05M的PBS(pH=7.0)的缓冲液中贮存。
方法2:浓度为0.68mg/mL的神经生长因子溶液(本公司上市产品恩经复的PBS溶液)与溶解在0.1M的MES溶液(pH约为6.2)中的mPEG-HZ(LaysanBio生产)以物质的量比1:10(NGF:PEG)的比例相混合,加入10倍物质的量NGF的EDAC,室温下搅拌24小时。经PEG修饰的蛋白质在凝胶色谱柱(如的KW802.5)上用色谱法进行纯化,使用0.05M的PBS缓冲溶液。经PEG修饰的蛋白质用SDS-PAGE鉴定。从柱中洗脱出相应于结合有一个PEG(PEG1-NGF)或两个PEG(PEG2-NGF)或三个PEG(PEG3-NGF)的NGF的蛋白质。合并这些蛋白质,浓缩后用比色分析法测定蛋白质浓度。PEG-NGF在-20℃下0.05M的PBS(pH=7.0)的缓冲液中贮存。
方法3:浓度为0.68mg/mL的神经生长因子溶液(本公司上市产品恩经复的PBS溶液)与溶解在0.01M的Pyridine溶液(pH约为4.8)中的mPEG-HZ(Laysan Bio生产)以物质的量比1:10(NGF:PEG)的比例相混合,加入10倍物质的量NGF的EDAC,室温下搅拌24小时。经PEG修饰的蛋白质在凝胶色谱柱(如的KW802.5)上用色谱法进行纯化,使用0.05M的PBS缓冲溶液。经PEG修饰的蛋白质用SDS-PAGE鉴定。从柱中洗脱出相应于结合有一个PEG(PEG1-NGF)或两个PEG(PEG2-NGF)或三个PEG(PEG3-NGF)的NGF的蛋白质。合并这些蛋白质,浓缩后用比色分析法测定蛋白质浓度。PEG-NGF在-20℃下0.05M的PBS(pH=7.0)的缓冲液中贮存。
实施例4:神经生长因子的活性试验
对NGF及经PEG修饰的NGF的活性用鸡胚背根神经节培养法进行了测定。所有的测定都相对于对照物进行了标准化。具体过程为:细胞培养板用无菌L-多聚赖氨酸包被,取9d龄鸡胚(白壳蛋鸡),显微解剖镜下,剥离背根神经节,分散接种在无血清的DMEM培养基中,实验组中加入7ng纯化的β-hNGF,37℃培养48h,倒置显微镜下观察突起生长。结果见图4A、图4B和图4C,其中图4A是阴性对照、图4B是小鼠神经生长因子、图4C是小鼠神经生长因子与聚乙二醇结合物。从图中可以看出:添加小鼠神经生长因子与聚乙二醇结合物处理的背根神经节四周长出了放射状的神经纤维,与添加小鼠神经生长因子的神经纤维生长情况一致,表明利用本方案制备的小鼠神经生长因子与聚乙二醇结合物具有与小鼠神经生长因子相同的生物活性。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (5)
1.一种聚乙二醇同神经生长因子结合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
结合:将神经生长因子与聚乙二醇溶解在pH为5-7的缓冲溶液中,两者物质的量比例为1:10,并加入10倍物质的量神经生长因子的还原剂,室温下搅拌24小时;所述神经生长因子从天然来源、组织培养、重组DNA技术或化学合成得到;所述的缓冲溶液为PBS、MES、Pyridine溶液;
纯化并回收,得到聚乙二醇同神经生长因子结合物;所述纯化采用高效液相色谱法或凝胶电泳法;
所述聚乙二醇是mPEG-SVA,mPEG-AD或mPEG-HZ形式;所述得到的聚乙二醇同神经生长因子结合物保存在-20℃下0.05M,pH=7.0的PBS缓冲液中贮存。
2.权利要求1的方法,其特征在于,还包括浓缩回收步骤。
3.权利要求1或2任一所述方法制备所得到的聚乙二醇同神经生长因子结合物。
4.一种组合物,包括权利要求3的聚乙二醇同神经生长因子结合物。
5.权利要求3的聚乙二醇同神经生长因子结合物或权利要求4的组合物在制备药物组合物中的用途。
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