JPH02504279A

JPH02504279A - インスリン様成長因子１（ｉｇｆ‐１）または因子２（ｉｇｆ‐２）の類縁ペプチド

Info

Publication number: JPH02504279A
Application number: JP1500684A
Authority: JP
Inventors: バラード，フランシス，ジョン; ウォリス，ジョン，キャンベル; ウエルズ，ジュリアン，リチャード，エステ
Original assignee: グロペップ　プロプライエタリー　リミテッド
Priority date: 1987-12-24
Filing date: 1988-12-20
Publication date: 1990-12-06
Anticipated expiration: 2011-06-12
Also published as: DE3852636D1; ATE116335T1; EP0346429B1; WO1989005822A1; EP0346429A1; EP0346429A4; AU2900989A; AU612776B2; DE3852636T2; US5164370A; CA1341204C; JP2507106B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】インスリン様成長因子１　（ＩＧＦ−１）または因子２（ＩＧＦ−２）の類縁ペプチド本発明は、成長因子、関連化合物およびその使用に関する。

インスリン様成長因子−１、ソマトメジンは広範囲の培養細胞の成長を刺激することが明らかにされている小さなタンパク賀である。ヒトＩＧＦ−１（ｈｌＧＦ −１）はヒト血清から均質に精製され、その全アミノ酸配列は確立している。成長ホルモン作用の血清メディエータ−であるソマトメジンＣは、ｈｌＧＦ−１と同一の配列を有し、したがって、現在では、この２つの詔は同！ｌ諏と考えられている。ｈｌＧＦ−ｉについて確立されたアミノ酸配列は、Ｎ末端グリシンに始まり、以下の配列を有する。

Ｇｌｙ−ｐｒｏ−ｇＬｕ−ｔｈｒ−１ａｕ−ｃｙｓ−ｇｌｙ−ａｌａ−ｇｌｕ− １ｅｕ−ｖａｌ−ａｓｐ−ａｌａ−１ａｕ−ｇｉｎ−ｐｈａ−ｖａｌ−（ｙ５− ｇｌｙ−ａｓｐ−ａｒＱ−９１ｙ−ｐｈｅ−ｔｙｒ−ｐｈｅ−ａｓｎ−１ｙｓ− ｐｒｏ−ｔｈｒ−ｇｌｙ−セＹｒ−ｇｌｙ−ｓａｒ−ｓｅｒ−ｓａｒ−ｉｒｇ− ａｒｇ−ａｌａ−ｐｒｏ−ｇｉｎ−ｔｈｒ−ｇｌｙ−ｉｌｅ−ｖａｌ−ａｓｐ− ｇｌｕ−ｃｙｓ−ｃｙｓ−ｐｈｅ−ａｒｇ−ｓｅｒ−ｃｙｓ−ａｓｐ−１ｅｕ− ａｒｇ−ａｒｇ−１ｅｕ−ｇｌｕ−ｍｅｔ−セｙｒ−ｃｙｓ−ａｌａ−ｐｒｏ− １ｅｕ−１ｙｓ−ｐｒｏ−ａｌａ−１ｙｓ−ｓａｒ−ａｌａ−ウシＩＧＦ−１およびブタＩＧＦ−１は同一の配列を有する。

Ｎ末端グリシン残酷を＃１、Ｃ末端アラニン残基を＃７０とする慣用の番号表示システムを用いると、ヒツジおよびニワトリＩＧＦ−１はヒトＩＧＦ−１と次の点で異なるのみである。

ヒツジＩＧＦ−１：　　ａｓａ６６ニワトリＩＧＦ−１：ＳＯｒ　　、ｌｙｓ”、５０．６４ｇｌｎ　　Ｓ　＋ｌｅ血清中のＩＧＦ−ルベルは、思春期の少年の成長速度と正の相関を示し、成長ｉｌ！滞患者における成長ホルモン欠損の程度と負の相関を示し、成長ホルモン遺伝子−トランスフェクションしたマウスの成長速度そして最終的にはその大きさの両者に相関する。ＩＧＦ−１濃度が成長速度と間接的にＩＩＩ連し、さらにＩＧＦ−１の投与により、下垂体機能低下（成長ホルモン欠損）ラットまたはマウスの成長速賎が回復し、また正常ラットで成長速度が増大するというより直接的な証拠によって支持さ“るこれらの所兇は、ＩＧＦ−１が（１）ヒトにおける成長。

ルモン欠損の治療、ならびに（２）Ｉｋ殖動物における成長二度の増大、筋肉の比率の増加および飼料変換効率の上：に有効に適用できるとの解釈を導いてきた。ＩＧＦ−の投与には、さらに１３１火傷、感染または他の外傷後の−うなｌ篤なヒト異化状態における体タンパク質喪失の１輌、（４）ヒトおよび動物における創傷治癒の改善をもたらす可能性が示唆されている。ＩＧＦ−１はまた、■培養液中の細胞の成長維持にも使用できる。

上記の推論の結果として、動物試験、臨床試験に、また細胞培養に使用するためのＩＧＦ−１の供給への要求が生じている。しかしながら、何トンものヒト血清タンパク質の精製によってもたとえば、わずか数■のｈｌＧＦ−１１，、か得られず、組換えＤＮＡ法からの収率もまだ低い。

ＩＧＦ−１と同様、インスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）も、培養液中の細胞の成長を刺激することが明らかにされている小タンパク貿である。多くの揚るのと同じ細胞受容体とＩＧＦ−２との相互作用後に生じる。Ｎ末端アラニンに始まる確立されたヒトＩＧＦ−２（ｈｌＧＦ−２）のアミノ酸配列を以下に示す。

ｈｌＧＦ−１のＮ末端５アミノ酸と周等なアミノ酸を示すためには大文字を使用した。

Ｎ末端アラニンを残１＃１、Ｃ末端グルタミン酸を残基＃６７とする慣用の番号表示システムを用いると、ウシ、ヒツジ、ブタおよびニワトリＩＧＦ−２は、ヒトＩＧＦ−２と次の点で異なるのみである。

ウシＩＧＦ−２：　　ｓｅｒ　　、＋　ｌｅ　　、ａｓｎ”６３２．３５３２．３５ヒツジＩＧＦ−２：ｓｅｒ　　、＋　Ｉｅ　　５ａｓｎ３”、１ａ６２ブタＩＧＦ−２：　　ａｓｎ３６、ニット１月ＧＦ−２：　ａ　Ｉ　ａ１ヲ欠く、Ｑ　Ｉ　Ｖ３、ｔｈｒ　　、ａｌａ５．ｖａｔ３２、ｑ、ｙ３３、ａ６ｎ３５、ａ　ｓ　ｎ　３６、分子のＮ末端から１〜５個、好ましくは３個のアミノ酸残基を欠＜ＩＧＦ−１に相当する化合物が、より完全な化合物に比べて、実質的に高い生物学的効力を示すことができることが明らかにされている（本出願人のＰＣ’ｒ／ＡＬ１８７１００２４６訓１゜たとえば、Ｎ末端からアミノ酸残基ｃ＋　ｌ　ｙ、ＤｒＯおよびｇｌｕを欠く化合物、デストリペプチドｂｌＧＦ−１は、完全ｂｌＧＦ−１に必要な濃度の４〜５０侶低い濃度で、細胞系におけるタンパク質分解の阻害、ならびにタンパク質および１）ＮＡ両者の合成の刺激に有効ぐある。

ヒト／ウシ／ブタＩ”ＧＦ−１と共通のＮ末端アミノ酸配列を有するＩＧＦ−１ペプチドについて、Ｎ末端から１〜５個のアミノ酸残基を除去しても、生物学的効力の上昇を生じる。上述のＮ末端アミノ酸配列は、ラット、ヒツジおよびニワトリ種のｌ０Ｆ−１の特徴でもある。

しかしながら、１〜５個のＮ末端アミノ酸が除去されたＩＧＦ−１ペプチドになく、完全ＩＧＦ−１ペプチドのみがもつ有利な性質として、従来技術による組換えＤＮＡ法での産生がＮ末端グリシンの存在によって容易になることがある。容易になる理由は、グリシンの上流にアスパラギン残基を操作し、操作遺伝子の発瑛後に穏和なヒドロキシルアミン処理でアスパラギン／グリシン結合を選択的に切断できるからである。

本発明の目的は、従来技術に関連した困難性の１または２以上を克服または、少なくともそのひとつを解消することにある。

したがって、本発明はその第一の態様として、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３番目の位置または同因子−２（ＩＧＦ−２）のＮ末端から５番目もしくは６番目の位置のグルタミン酸残塁が少なくともないＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の類縁ペプチドを提供する。ニワトリＩＧＦ−２ではＮ末＠、Ａ、　ｌ　ａを欠くので、グルタミン酸残基はＮ末端から５香目になることを理解すべきである。

類縁ペプチドは、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタまたはニワトリのインスリン様成長因子類縁体であることが好ましい。さらに好ましくは、類縁ペプチドは、ヒト、ウシまたはブタのインスリン様成長因子類縁体である。

本発明の類縁ペプチドは、生物学的に純粋な形とされる。

本発明の好ましい態様においては、類縁ペプチドは、グルタミン酸残塁の不存在に加えて、Ｎ末端からＧＩＶ−１Ｐｒｏ−１またはＴｈｒ−残塁の少なくとも１個がさらにない、インスリン様成長因子−１類縁体である。

本発明の好ましい態様においては、グルタミン酸残基は別のアミノ酸残基で置換されていてもよい。

グルタミン酸残基の置換に適当なアミノ酸には、グリシン、グルタミン、ロイシン、アルギニンまたはリジンが包含される。

さらに好ましくは、グルタミン酸の蓚換残基は、アルギニンまたはリジンのような陽゛踵イ５をもつアミノ酸残基である。また、グルタミン酸残塁をグリシンで置換し、通常グルタミン酸に隣接するスレオニン残塁を別のアミン酸残基、好ましくはアルギニンまたはグリシン、とくに好ましくはアルギニンで置換してもよい。

Ｎ末端配列は、以下の配列Ｖａｌ−Ｌａｕ−Ｃｙｓ− Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ− Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ− Ｇｌｙ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ− Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ− Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ− Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ− τｈｒ−Ｌａｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ− Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−から選択するのが好ましい。配列中のＣｙＳ残基は、通常Ｎ末端から６番目に位＠するものである。

本発明の好ましい別の態様においては、類縁ペプチドは、インスリン様成長因子 −２類縁体である。この類縁ペプチドにおいては、グルタミン酸残基の不存在に加えて、Ｎ末端から、Ａｌａ−１Ｔｙｒ−１Ａｒ！；ｌ−１Ｐｒｏ−１Ｓｅｒ− またはＴｈｒ−残基の少なくとも１個を欠くことが好ましい。

さらに、グルタミン酸残基が他のアミノ酸残基で置換されていることも好ましい。

グルタミン酸残塁の置換に適当なアミノ酸には、グリシン、グルタミン、ロイシン、アルギニンまたはリジンが包含される。スレオニン残基の置換に適当なアミノ酸には、アルギニンまたはグリシンが包含される。

グルタミン酸の置換残基は、アルギニンまたはリジンのような陽電荷をもつアミノ酸残基をもつアミノ酸残基であることがさらに好ましい。また、グルタミン酸残塁をグリシンで置換し、通常グルタミン酸に隣接するスレオニン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはアルギニンまたはグリシン、とくに好ましくはアルギニンで置換してもよい。

Ｎ末端配列は、以下の配列Ａｌａ−Ｔｙｒ−人ｒｇ−Ｐｒｏ−５ｓｒ−Ｌｙｓ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ− 人１トτｙｔ−人ｒｇ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−人ｒｇ−Ｐｒｏ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−から選択するのが好ましい。配列中のＣｙｓ残基は、通常Ｎ末端から９番目に位１１するものである。

グルタミン酸残塁を欠くペプチドは、多くの細胞型によって産生される結合タンパク質との結合が弱い。この結合は、グルタミン酸残基のアルギニンまたはりジン残基による置換、および隣接スレオニン残基のアルギニンまたはりジン残基による任意の置換によってさらに弱くなる。結合タンパク賀が存在すれば、それと結合する他のＩＧＦ−１ペプチドは効力が低下する。

グルタミン酸残基が他のアミノ酸で置換されているかまたは除去されていて、Ｎ末端残基がグリシンである好ましい態様においては、本発明は、操作された上流のアスパラギンの切断に通した類縁ペプチドを提供する。これらの類縁ペプチドは培養細胞において、ＩＧＦ−１より高い効力を示す。

本発明の類縁ペプチドは、以下の適用において、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の適当な代替物となりうる。

すなわち、（１）ヒトにおける成長ホルモン欠損、（り養殖動物の成長速度の増大、筋肉の割合の増加、もしくは飼料変換効率の改善、（３）ヒトにおける火傷、感染もしくは他の外傷後のような！ａ篤な異化状態での体タンパク質喪失の抑制、（４）ヒトおよび動物における創傷治急の改善、および（５）培養細胞の成長の支持である。

別の特定の態様では本発明は、（２）それぞれインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３番目の位置または因子−２（ＩＧＦ−２＞のＮ末端から６番目の位置におけるグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の類縁ペプチドの有効」、および（ハ）その医薬的または獣医薬的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含有する医薬用または獣医薬用組成物を提供するものである。

類縁ペプチドは、１日約０．０１〜１０■／＃［９体重、好ましくは０．１〜１　＃／酊体重の割合の用量を与える適用するためには、類縁ペプチドは、約０．１〜１００ｑ／ｊの濃度で存在させることができる。

本発明の別の好ましい態様においては、本発明は、それぞれインスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３番目の位置または因子−２（ＩＧＦ−２）のＮ末端から６番目の位置のグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の類縁ペプチドの有効量を患者に投与することを包含するタンパク質蓄積不全またはタンパク貢喪失の処置方法を提供する。

類縁ペプチドは、たとえば、火傷、骨外傷、感染、癌、貴飽性ａｍ症、デュシエンヌ型筋ジストロフィー、ベラカージストロフィー、常染色体劣性ジストロフィー、多発性筋炎および他のミオパシー、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ＞を含めた組織の＊＊を伴う疾患の処置のために、ヒトに投与することができる。ただし、上述の疾患に限定されるものではない。類縁ペプチドは、非経口的にまたは注射によって投与ｔきる。

別の態様においては、本発明は、ヒトを含めた動物の創傷の処置にあたり、それぞれ哺乳類インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３番目の位置または同因子−２（ＩＧＦ−２）のＮ末端から６番目の位置のグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の類縁ペプチドの有効量を投与することを包含する方法を提供するものである。

ヒトまたは動物にお番プる創傷の処置のためには、ペプチド類縁体は創傷の外部に適用してもよく、または注射で投与してもよい。

さらに他の態様においては、本発明は、動物に、それぞれインスリン様成長因子 −１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３１目の位置または因子−２（ＩＧＦ−２）のＮ末端から６番目の位置のグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の１縁ペプチドの有効量を投与することを特徴とする動物の成長過程を改善する方法を提供する。

養殖動物への投与方法として好ましい方法は、移植体、好ましくはベレットを、慣用手段によって適用するものである。また、ペプチド塾縁体はａｌｌによって投与してもよい。

本発明の類縁ペプチドは、成長の促進、窒素代謝の改善および異化疾患の治療のために、早産児または他のヒト小児に投与することができる。また、このペプチドは上述のように、組５ｉ１１痩状！ｌにも投与することができる。

また、本発明はさらに他の態様として、培養培地および上述の類縁ペプチドの有効−を準備し、この類縁ペプチドを培養培地に添加することを特徴とする培養細胞の刺部方法を提供する。

本発明のこの態ｖ＆においては、任意の標準的培養培地が使用できる。この培養培地には、たとえば、イーグルの最小必須培地が包含される。

さらに他の態様においては、本発明は、Ｎ末端から３番目のグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１の類縁ペプチドを製造するにあたり、アミノ酸の原料を準備し、アミノ酸を以下の配列Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ− 人ｒｑ−Ｌｅｕ−ＣＹＳ− Ｇｌｙ−Ｌａｕ−ＣｙＳ− Ｇｌｙ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ− Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ− Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌａｕ−Ｃｙｓ− Ｇｌｙ−ｐｘｏ−Ｇｌｙ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ− Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ− Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−（式中、Ｃｙｓ残基は正常の場合Ｎ末端から６番目に位置するものである）から選ばれるＮ末端を有する類縁ペプチドを形成するように結合させる方法を提供する。

これら類縁ペプチドは、完全ＩＧＦ−１ペプチドの製造のためにすでに知られている方法を適当に改変して製造することができる。これらの改変は、本技術分野の熟練者にはよく知られたとおりである。

とくに、ヒト／ウシ／ブタＩＧＦ−１関連ペプチドは、ヒトＩＧＦ−１について開発された操作（たとえば、１−ｉら：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ％８０　：　２２１６〜２２２０．１９８３）を用い、アミノ酸連結の最終サイクルを改変するだけで、化学的に合成できる。合成ヒツジまたはニワトリＩＧＦ−１ならびに関連ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２ペプチドは、ヒトＩＧＦ−１について用いられるのと類似の技術により、これらのペプチドに関する配列情報を利用して製造できる。

本発明によれば、ペプチドはまた、このペプチドの発現を指図できるＤＮＡ配列を包含（る組換えプラスミドで、感受性のある細菌、酵母または組織培養細胞宿主を形質転換することによっても製造できる。ＤＮＡ配列は、合成配列でも、染色体由来、ＣＤＮＡからのもの、またそれらの組合せによるものでもよい。挿入暗号配列が、類縁ペプチドと完全ＩＧＦ−１ペプチドの配列の間の差を生じる欠失または省略を導入することになる。

本発明は、一部のＩＧＦ−１ペプチドの製造およびそれらの生物学的効力についての情報に間し、以下にさらに詳細に説明する。しかしながら、以下の記述は単に例示的なものであって、前述の・一般的記載をいかなる意味においても限定するものではないことを理解すべきである。

例１１ＧＦ−１ペプチドの合成１番目から４番目までのアミノ酸が正常なＮ末端から改変されたヒト／ウシ／ブタＩＧＦ−１ペプチドの化学合成は、以下の操作によって行われた。

出発原料はＢｏｃ−ａｌａ−フェニルアセトアミドメチル樹脂とした。連結は、予め生成されたＢｏｃ−アミノ酸の対称無水物により、ジクロロメタン中、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ　　４３０　Ａ型ペプチドシンセサイザーを用いて行った。ただし、アルギニン、アスパラギンおよびグルタミンの誘導体については、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ’）中で連結を行った。合成の各サイクル毎に樹脂のサンプルを取り出し、定量的ニンヒドリン分析に付した（Ｓａｒｉｎ、　Ｖ、　Ｋ、、にｅｎｔ、　Ｓ、　Ｂ、　Ｈ，、Ｔａｇ、　Ｊ、　Ｐ、。

Ｈｅｒｉｆｉｅｌｄ、　Ｒ，Ｂ、　：Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ、　１７　：　１４７〜１５７．１９８１）。側鎖が保護され、樹脂に結合しているペプチドの予備的配列分析も実施した。両者からの平均再現収率は９９％を示した。

Ｎ末端に４〜０のアミノ酸が連結されていない以外は１１１ＧＦ−１の完全配列に相当する、側鎖が保護されたペプチドを含む樹脂の部分を除去した。４〜３個のアミノ酸がＮ末端に連結されていない他の部分は、特定の類縁体に要求されるアミノ酸残基を連結させた。ペプチドをＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　Ｉｎｃ、の操作に従って切断し、脱保護し、ついでエーテル沈殿物として回収した。

ペプチドを、６Ｍグアニジン塩酸塩ｐＨ８，５中に１０ｍＷジチオエリスリトール含有Ｔｒｉｓとともに再溶解し、逆相ＨＰＬＣによってｌ１２温し、乾燥した。還元型ペプチドの酸化は、８Ｍ尿素、１３１）４１１化型グルタチオン含有０、１　Ｍ　　Ｔｒｉｓ（Ｈｅ　ｌでｐＨ８，０）に溶解して行い、２５℃で１５ｍｍインキュベートした。サンプルを、逆相ＨＰＬＣにより、０．１％トリフルオロ酢酢酸ノアセトニトリル勾配を用いて溶出させ、ペプチドの生物学的活性型を正しいジスルフィド結合を欠きしたがって完全な生物学的活性を欠く型から分離して精製した。サンプルは再懸濁前に乾燥させた。

生物学的活性は、し６筋芽ＩＩＩ！！におけるタンパク合成を刺激するペプチドの能力によって確認した。

＠述の部分の構成および配誼には、本発明の精神または範囲から逸脱することなく、様々な修飾および／または変更を導入できることは自明のとおりである。

ＩＧＦ−１ペプチドの生物学的活性精製された合成ペプチドを生物検定により、純粋なヒト／ウシ／ブタＩＧＦ−１と比較した。この検定は、ｒｒａｎｃｉｓら（Ｂｉｏｃｈｅｉ、　Ｊ、、２３３　：　２０７〜２１３．１９８６）の記載に従って、し６筋芽細胞の総細胞タンパク質中への３Ｎ−１１識ロイシンの取り込みを調べるものである。相対効力は、ヒト／ウシ／ブタＩＧＦ−１で５０％応答を与えるのに必要なｍ度（１２ｒ１Ｍａｅ）に対する百分率として、相当するのＩＩｊ＊を表し、第１表に示す。

第１表Ｌ６！ｉ５芽細胞におけるＩＧＦ−１ペプチドの相対生物学的効力（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−）　　　　　　　　　１００Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−１ｓＶａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−１３Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−１５ｘｒｇ−Ｌｅｕ−ｃｙｓ−４Ｇｌｙ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−１６Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−１２Ｇｌｙ−ｐｒｏ−Ｇｌｎ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−１８Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−１１Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌａｕ− τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−１８Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−５Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　　　　　　　　　　１４Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　４正常な場合ＩＧＦ−１の３番目にあるグルタミン酸残塁の欠失または修飾によって生じる効力の上昇は、結合を４℃で行うほかはＢａ１ｌａｒｄらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　。

２３３　：　２２３〜を用いた場合のし６筋芽ＩＩｌ胞りの受容体に対するペプチドの結合に著しい競合の増大を伴うものではない。この見掛は上の矛盾は、受容体に加えて結合タンパク賀を産生する筋芽ａｍによって生じる。この結合タンパク質は、Ｎ末端から３番目にグルタミン酸残基を有するＩＧＦ−１ペプチドと選択的に結合し、その結果、そのペプチドが細胞受容体に結合するのを妨害する。この解釈は、精製した結合タンパク賀についての以下の結果によって確認される（Ｈａｒｔｉｎ　ａｎｄ　Ｂａｘｔｅｒ　：Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、、　　２６１　　：　　８７５４〜８７６０　、１９８０、の方法によって測定、第２表参＠）。

第２表ＩＩ製された結合タンパク賀に対する標識ヒト／ウシ／ブタＩＧＦ−１の結合と競合するＩＧＦ−１ペプチドの相対結合能位置するものである）　　　質に対する結合能（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−τｈｒ−１．．ｅｕ−Ｃｙｓ−）　　　　　　　　１ｏ。

τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−０，２Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−０、１Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−０，１Ａｒｇ−Ｌｅｕ７Ｃｙｓ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　＜　　　０．１Ｇｌｙ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−１，０Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ −Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−０，５Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｉｎ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ− １，０Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−０，１Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−τｈｒ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−０，５Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−τｈｒ −Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−（０，１Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ −０−ＩＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌ＠ｕ−Ｃｙｓ−（０−１第１表および第２表に示すデータから以下の事項が明らかである。

−ｈｌＧＦ−１か３個のＮ末端アミノ酸（Ｇ　Ｉ　ｙ。

ｐｒｏ、Ｑｌｕ）を除去すると、生物学的活性の増大と、細胞が産生するタンパク賀への結合の低下を招く。

−３１１！１１のＮ末端アミノ酸の除去と同時に第４番目のアミノ酸（スレオニン）をアルギニンで置換すると、さらに生物学的効力は増大し、一方、結合タンパク質への結合はさらに低下する。

一２個のＮ末端アミノＩｔ　（Ｇ　ｌ　ｙ、　Ｐｒｏ）を除去し、同時に第３番目のアミノ酸（グルタミンｌ）をグリシンで置換すると、生物学的活性はｈｌＧＦ−１より強く、結合タンパク質とは僅かではあるが明らかに結合するＩＧＦ類縁体を生じる。

−４１１ＧＦ−１では正常な場合第３番目にあるグルタミン酸残基を、グリシン、グルタミン、リジン、ロイシンまたはアルギニンで置換すると効力の増大と、結合タンパク質への結合の低下を招き、この効果はリジンまたはアルギニンで置換した場合に最大になる。

−ｈｌＧＦ−１では正常な場合３番目にあるグルタミン酸残基をグリシンで置換し、ｈｊ１時に第４番目のスレオニンをグリシン、アルギニンまたはバリンで置換すると、同じく、効力の増大と、結合タンパク質への結合の低下を生じる。

最後に、本明細鍔に機造した本発明の精神から逸脱することなく、様々な他の修飾および／または変更が可能であることを理解すべきである。

国際調査報告一、−−ｅＡ、、−，１，−−−ＰＣＴ／ＡＵ　　８Ｂ１００４８５λ蛍ξズπ フ＝フ６ワ国に＝α鵜り９講にΣ可フゴＣα［ＧＱＬ　ＡＰＰＬＩＣＡ’ｆｆ１ＯＮ　Ｎｏ、　ＫＴ／ＡＬＩ　　８８００４８５ＡＩ３　６２８６９／８６　　　　　ＷＯ８７０１０３８ＥＰ　　　２３５２０５

Claims

【特許請求の範囲】

１．インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３番目またはインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）のＮ末端から５番目もしくは６番目に位置するグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の類縁ペプチド。
２．ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタまたはニワトリインスリン様成長因子類縁体である請求項１記載の類縁ぺブチド。
３．ヒト、ウシまたはブタインスリン様成長因子−１類縁体である請求項２記載の類縁ぺブチド。
４．さらにＮ末端からＧｌｙ−、ＰｒＯ−またはＴｈｒ−残基の少なくとも１つがない請求項３記載の類縁ペプチド。
５．グルタミン酸残基は別のアミノ酸残基で置換されている請求項３記載の類縁ペプチド。
６．アミノ酸残基は陽電荷をもつアミノ酸残基で置換されている請求項５記載の類縁ペプチド。
７．正常ではグルタミン酸残基に隣接するスレオニン残基が別のアミノ酸残基で置換されている請求項６記載の類縁ペプチド。
８．以下の配列【配列があります】（式中、Ｃｙｓ残基は正常にはＮ末端から６番目の位置に存在するものである）から選ばれるＮ末端配列を有する請求項１記載の類縁ペプチド。
９．操作された上流のアルギニン残基の切断に適した末端グリシン残基を含む請求項１記載の類縁ペプチド。
１０．生物学的に純粋な形である請求項１記載の類縁ペプチド。
１１．ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタまたはニワトリインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）類縁体である請求項１記載の類縁ペプチド。
１２．さらにＮ末端からＡｌａ−、Ｔｙｒ−、Ａｒｇ−、ＰｒＯ−、ＳｅｒまたはＴｈｒ−残基の少なくとも１つがない請求項１１記載の類縁ペプチド。
１３．グルタミン酸残基が別のアミノ酸残基で置換されている請求項１１記載の類縁ペプチド。
１４．アミノ酸残基は陽電荷を有するアミノ酸残基で置換されている請求項１３記載の類縁ペプチド。
１５．正常ではグルタミン酸残基に隣接するスレオニン残基が別のアミノ酸残基で置換されている請求項１４記載の類縁ペプチド。
１６．以下の配列【配列があります】（式中、Ｃｙｓ残基は正常にはＮ末端から９番目の位置に存在するものである）から選ばれるＮ末端配列を有する請求項１３記載の類縁ペプチド。
１７．操作された上流のアルギニン残基の切断に適した末端グリシン残基を含む請求項１１記載の類縁ぺプチド。
１８．（ａ）インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３番目またはインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）のＮ末端から５番目もしくは６番目に位置するグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の類縁ペプチドの有効量、および（ｂ）医薬的または獣医薬的に許容されるその希釈剤、担体または賦形剤を含有する動物のタンパク蓄積不全またはタンパク喪失の処置のための医薬または獣医薬組成物。
１９．類縁ペプチド中のグルタミン酸残基は別のアミノ酸残基で置換されている請求項１８記載の医薬または獣医薬組成物。
２０．類縁ぺブチドは約０．０２〜２．０００ｍｇの量含まれる請求項１９記載の医薬または獣医薬組成物。
２１．インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３番目またはインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）のＮ末端から５番目もしくは６番目に位置するグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の類縁ペプチドの有効量を処置すべき患者に投与することを包含するヒトのタンパク蓄積不全またはタンパク喪失の処置方法。
２２．類縁ペプチド中のグルタミン酸残基は別のアミノ酸残基で置換されている請求項２１記載の方法。
２３．タンパク蓄積不全は、小児早熟、成長ホルモン欠損、火傷、感染、他の外傷、癌、嚢胞性線維症、デユシエンヌ型筋ジストロフィー、ペツカージストロフィー、常染色体劣性ジストロフィー、多発性筋炎および他のミオパシーに関連したものである請求項２２記載の方法。
２４．類縁ペプチドは１日、体重１ｋｇあたり約０．０１〜１０ｍｇの用量で投与される請求項２３記載の方法。
２５．インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３番目またはインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）のＮ末端から５番目もしくは６番目に位置するグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の類縁ペプチドの有効量を処置すべき患者に投与することを包含するヒトを含めた動物の創傷の処置方法。
２６．類縁ペプチド中のグルタミン酸残基は別のアミノ酸残基で置換されている請求項２５記載の方法。
２７．類縁ペプチドは、約０．０２〜２，０００ｍｇの量を注射によって投与するかまたは外部に適用する請求項２６記載の方法。
２８．インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３番目またはインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）のＮ末端から５番目もしくは６番目に位置するグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２の類縁ペプチドの有効量を処置すべき動物に投与することを包含する動物の成長効率を改善する方法。
２９．成長効率の改善は、成長速度の増大、筋肉の選択的付着、脂肪量の低下または飼料変換効率の上昇である請求項２８記載の方法。
３０．類縁ペプチドは約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の用量で投与される請求項２９記載の方法。
３１．培養培地と、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３番目またはインスリン様成長因子−２（ＩＧＦ−２）のＮ末端から５番目もしくは６番目に位置するグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１またはＩＧＦ− ２の類縁ペプチドの有効量を準備し、その類縁ペプチドを培養培地に添加する培養細胞の成長を改善する方法。
３２．類縁ペプチドは、培養培地１ｌあたり約０．１〜１００ｍｇの量を添加する請求項３１記載の方法。
３３．インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）のＮ末端から３番目に位置するグルタミン酸残基が少なくともないＩＧＦ−１の類縁ペプチドを製造するにあたり、アミノ酸原料を準備し、以下の配列【配列があります】（式中、Ｃｙｓ残基は正常にはＮ末端から６番目に位置するものである）から選ばれるＮ末端を有する類縁ぺプチドを生成するようにアミノ酸を連結する方法。
３４．とくに例１に前述した方法にほぼ従う請求項３３記載の方法。