CN110755600A - 天然免疫激动剂联合大脑内稳态调控蛋白治疗阿尔茨海默症 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体为使用天然免疫激动剂联合大脑内稳态调控蛋白在治疗阿尔茨海默症中的应用。该大脑内稳态平衡调控蛋白能穿越血脑屏障，进而有效地调控大脑金属离子内稳态平衡，有效抑制活性氧物种的稳态平衡和削减毒性老年斑。天然免疫激动剂能有效调节大脑免疫细胞功能，削减大脑慢性炎症等病理特征。使用大脑内稳态调控蛋白联合天然免疫激动剂能显著改善海马组织神经细胞形态和抑制神经细胞凋亡，清除毒性淀粉样蛋白沉积，改善模型鼠学习记忆能力，阻止老年痴呆症病情发展。因此，该大脑内稳态平衡调控蛋白与天然免疫激动剂联用在治疗阿尔茨海默症方面有广阔应用前景。

Description

天然免疫激动剂联合大脑内稳态调控蛋白治疗阿尔茨海默症
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体为使用天然免疫调节剂联合大脑内稳态调控蛋白在治疗阿尔茨海默症中的应用。使用大脑内稳态调控蛋白联合天然免疫调节剂能显著改善海马组织神经细胞形态和抑制神经细胞凋亡，改善大脑学习记忆能力，抑制淀粉样蛋白沉积和大脑慢性炎症，阻止老年痴呆症病情发展。
背景技术
阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease,AD),俗称老年痴呆症，目前已成为世界最重大的疾病之一，美国FDA和中国CFDA批准的抗阿尔茨海默病药物很少，药物治标不治本，疗效不显著。全球抗阿尔茨海默病药物多数还处于临床阶段，主要作用于神经信号通路和Aβ淀粉样蛋白斑。但是，病人众多，药物需求很大。65岁及以上的AD患病率达到4.8％，年龄每增加5岁，患病率增长一倍， 85岁以上老人AD患病率达到28.9％。2000年，约400万美国人AD患病,护理费多达1000亿美元/年。美国、日本等8个主要国家阿尔茨海默症治疗的市场规模达到100亿美元以上，而且该药物市场逐年增加。
阿尔茨海默症是由德国学者Alosi Alzheimer于1907年首次报道。这是一种常发于老年人群中的中枢神经系统原发性退行性疾病，目前全世界有超过五千多万例AD患者，其临床表现为不同程度的记忆力丧失，语言困难，定向力障碍，认知能力降低，人格及行为和感情活动异常，进行性智力障碍，以至于生活不能自理，完全呆傻，最后全身衰竭，并发感染而亡。目前AD已经成为继心脏病、肿瘤和中风之后的第四位死亡原因。AD最典型的病理特征为：大脑皮层和海马组织内出现大量的老年斑(senile plaques,SP)、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)、神经元数量减少和颗粒空泡变性。AD的发病机理十分复杂，可能是多种因素相互作用的结果。迄今为止，其确切的发病机理还是一个未解之谜，但在近三十年的研究证据表明，淀粉样多肽 (amyloid-beta peptide,Aβ)、淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)、大脑内稳态调节蛋白及其相关的的金属离子内稳态平衡与AD的发生、发展有着密切的联系。
另外，大脑消耗人体20％的氧，而且抗氧化剂和相关酶的浓度相对较低又富含不饱和脂肪酸，易受氧化损伤。正常情况下，细胞可以通过调节内稳态平衡对抗氧化攻击，但随着年龄增长，细胞保持平衡的能力减低，导致自由基积累，线粒体功能失调，神经元损伤。氧化损伤诱发信号传导通路，操纵细胞对压力的反应，这个反应的表现就是ROS的增加。当ROS的数量超过了神经元细胞对抗的能力时就会发生氧化胁迫，进而导致线粒体机能障碍以及神经元细胞损伤。线粒体中缺乏组蛋白以及线粒体中DNA修复功能的减弱都是造成线粒体易产生氧化胁迫的原因。铁、铜离子被认为是AD中氧化胁迫发生的重要原因。在AD病中，氧化损伤的增加不是最终的结果，而是具有起始作用。AD的初期，神经细胞尽管氧化损伤增加，但实际上仍然是处于内稳态平衡的。随着AD病的发展及相应的ROS水平的增加，Aβ-金属化合物和过度磷酸化的tau蛋白将不能有效的被去除，导致淀粉样斑块和神经纤维缠结的不可控地增加，而这又会导致反应活性物质的进一步增多，这种恶化的反馈机制最终造成神经元功能丧失。
国内外已对AD的神经病理机制进行了大量的研究。70年代中期以来，大量药理学研究集中于提高突触裂隙中的乙酰胆碱水平，发现了一系列乙酰胆碱酯酶的抑制剂类药物。然而，这种治疗仅是缓解症状的治标疗法。80年代中期以来，许多研究围绕Aβ的形成、聚集以及清除机制，或Aβ的神经毒性机制进行。以Aβ为靶标治疗AD病的药物有Aβ前体蛋白APP分泌酶的抑制剂、抗Aβ聚集的金属离子螯合剂和Aβ的抗体等。然而，2008年Lancet报道，Aβ疫苗能有效地清除脑内 Aβ斑，但并不能阻止痴呆症状的发展。这一报道对围绕Aβ斑的治疗研究提出了疑问。这些结果说明，Aβ斑本身并不是细胞毒性的主要根源，可能的机制是，Aβ斑在形成过程中产生的ROS对神经细胞造成毒性。运用同步辐射X-射线荧光分析技术发现老年斑中有高浓度金属离子的聚集，如铜、铁、锌金属离子的含量分别高达1.0、0.4和1.0mM。大脑中这些过渡金属离子异常高浓度聚集及其相关的蛋白质(如Aβ、tau蛋白等)异常聚集是多种神经退行性疾病的共有特征。因此，金属离子与神经医学高度关联的这一领域受到科学家和神经医学科学家的极大关注。大量研究报道显示：脑神经中某些过渡金属离子的内稳态失衡是AD 病人神经元死亡的主要起因之一；脑中这些过渡金属离子，特别是能够进行单电子氧化还原的Cu和Fe离子的内稳态调节，以及有关的活性氧物种(ROS)水平的调控是治疗AD病的有效策略。因此，研究和探索大脑内过渡金属离子及其相互作用的金属蛋白质内稳态调控机制是理解神经元之间的信号传递和AD病理机制的关键环节，大脑内稳态调控关键蛋白及其有关的金属离子离子和ROS内稳态调控是治疗老年痴呆的关键因素。
金属硫蛋白-3(metallothionein-3,MT3)，在大脑中特异性表达。MT3由 68个氨基酸组成，其中就包括了20个保守的半胱氨酸。它的两个结构域含有两个金属簇，总共能够结合7个二价的金属离子。N-端beta-结构域中的M3S9和存在于C-端的Alpha-结构域的M4S11。两个结构域之间通过KKS三个氨基酸连接。大脑中MT3大量分布于神经星形细胞，但是在AD患者脑中，MT3的表达量明显下降约三分之一。MT3表达的受损可能与AD症状的发生或神经功能损伤有关。MT3还可以将NO信号转化为锌离子信号。NO通过与MT3中结合锌的半胱氨酸直接发生S-亚硝基反应或者与S-亚硝基硫醇发生亚硝基转换反应，将锌离子 Zn2+从MT3中释放出来。
锌离子是大脑中的信使，大脑具有最高的锌含量，最典型的是在灰质中可达到约150μM。大脑中处于自由离子形式的锌大量富集在许多谷氨酸能神经末端 (10-15％)。当锌被释放后进入突触间隙，在突触间隙内离子浓度可上升至毫摩尔数量级。和铜离子一样，释放的锌离子在突触间隙内与神经受体如NMDA相互作用，同时也会作用于多种神经元离子通道及转运子来调控神经信号传导。多种锌转运蛋白(ZnTs)以及金属硫蛋白MTs等结合胞质中的锌离子，从而阻止游离的锌离子转变为有毒状态。相比于铜离子，血浆中的锌离子含量从出生后逐步下降，且AD患者的血浆中锌离子含量比同龄正常人有进一步的减少。尽管锌离子总含量与大脑年龄的老化没有关系，然后已知一些特定区域含有高浓度的Z锌离子，如高谷氨酸能支配的海马区，随着年龄的增长表现出锌离子含量的降低。现在的多篇文献报道，大脑补锌可能是防治老年痴呆症的有效策略之一。
金属硫蛋白MT3是神经元内部锌的主要来源，近期的研究发现，结合于MT3上的锌离子能够同Abeta-Cu复合物发生金属置换，从而抑制了Abeta还原二价铜离子Cu2+所产生的氧化损伤。AD脑中锌离子失衡，可能源自锌离子输出的抑制。小鼠动物研究指出，系统性锌离子的缺失引起了脑中锌离子的滞留，而这种作用是通过抑制胞内锌离子输出蛋白ZnT1所致。
神经突触中，MT3、Abeta和铜金属离子可能形成一种动态平衡。在ZnT3的作用下，Zn2+和谷氨酸同时聚集于前突触囊泡中，Zn2+在突触间隙中浓度高达0.3 mM，而NMDA介导的激活使铜离子在突触后释放，转运到突触间隙，随之铜离子在突触间隙的浓度达到毫摩尔级。反过来铜和锌都可以抑制NMDA受体的应答反应。Abeta经淀粉样蛋白前体蛋白APP酶切后释放到突触间隙后可以与间隙内的铜发生反应，然后交联形成可溶性的Abeta聚集体甚至形成淀粉样沉淀。MT3由邻近的星形胶质细胞释放进入突触间隙，可以缓解这一不利反应的发生。神经金属离子、Abeta、MT3在突触间隙形成一个动态平衡，这种平衡可阻止Abeta在突触间隙中形成纤维沉淀。适当的神经突触活动可能会促进这一平衡系统，但是过度的或异常的神经活动可能对这一系统有害。调控脑神经内稳态[金属离子
-Abeta-MT3]形成有益的平衡可能是治疗老年痴呆症的创新思路，对AD病的调控治疗有重要意义。
因为AD大脑中稳态调控蛋白MT3的表达量下降至少三分之一，补充MT3是防治 AD的有效策略之一。但是，MT3是一个分子量7000的多肽，很难穿过血脑屏障。本发明运用能够穿过细胞膜和血脑屏障的跨膜肽gH625与MT3重组，制备了融合蛋白gMT3H625，然后经过金属重组而组成Zn7MT3gH625。该创新组成的融合金属蛋白能有效通过血脑屏障。以补充阿尔茨海默病大脑中缺少的金属稳态调控蛋白和增加神经营养元素锌为目的，通过生物基因工程和化学合成相结合的复合方法，制备了Zn7MT3gH625重组融合金属蛋白。在此基础上，运用阿尔茨海默症转基因小鼠模型，研究了Zn7MT3gH625在脑神经中的内稳态调控功能，研究发现，
Zn7MT3gH625可以改善阿尔兹海默症模型小鼠的认知和记忆能力，抑制神经细胞凋亡，抑制淀粉样蛋白沉积等，能有效阻止老年痴呆症病情发展。因此，
gH625-Zn7MT3在防治老年痴呆等神经退行性疾病方面有重要应用前景。
德国波恩大学的一项突破性研究发现：阿尔茨海默症是由脑部免疫细胞的炎症所引起。此前人类对于阿尔兹海默症的致病原因及发病机制一直未能完全确定，这一发现无疑是超级重磅。科学家预言，这项新发现为药物研发提供了新思路，人类或可能在未来五年内治愈甚至预防阿尔兹海默症。该研究结果已发表在世界顶级科学类杂志《自然》上。德国波恩大学MichaelHeneka教授和他的同事认为，有炎症参与阿兹海默症过程，β—淀粉样蛋白斑块是由炎症引起的。他们发现，破坏脑中的小胶质细胞，可以减少阿尔茨海默症形成的β—淀粉样蛋白斑块。因此，他们的研究直接针对引起炎症的小胶质细胞，而不是β—淀粉样蛋白。研究人员发现，当炎症发生时，小胶质细胞会释放出ASC微粒蛋白，活化β—淀粉样蛋白，促进淀粉样斑块产生。德国波恩大学的Heneka 教授说，这个病理过程可能发生在阿尔茨海默氏症的早期阶段。
近年来，大规模外显子测序研究发现，很多小胶质细胞基因上的突变与AD 发病风险相关，提示大脑免疫功能紊乱可能与AD的病理进程相关。其中最具代表性的发现是，发现了髓样细胞触发性受体-2(Triggering Receptor Expressed on Myeloid cells 2,TREM2)是多个神经退行性疾病的共有风险基因，其编码区 R47H突变增加近3倍罹患AD的风险，同时也显著增加额颞叶痴呆、肌萎缩侧索硬化病和帕金森病等的发病风险。TREM2在大脑内的小胶质细胞中特异表达，其突变与AD风险的增加高度关联。但是，关于TREM2如何参与并影响AD病理进程尚不十分清楚。Neuron杂志在线背靠背发表了两篇相似的工作，揭示了 TREM2行使其功能的具体细节。其中一篇题为―TREM2Is a Receptor for b-Amyloidthat Mediates Microglial Function”的论文由厦门大学神经科学研究所暨福建省神经退行性疾病及衰老研究重点实验室许华曦教授课题组与福建医学大学、美国SanfordBurnham Prebys医学发现研究所、德克萨斯大学休斯顿健康科学中心、梅奥医学中心等单位合作完成。该研究发现，在大脑免疫细胞中的一种受体TREM2能与有毒的β-淀粉样蛋白(Aβ)相互作用,并激活神经免疫细胞——小胶质细胞来清除Aβ，从而可能延缓AD发病的进程。在小鼠模型中 TREM2除了能减少与阿尔茨海默病相关的病理,还能够缓解认知功能上的缺陷。这提示使用大脑现有的免疫机制来清除淀粉样蛋白可以作为一种治疗AD的新策略，可通过上调TREM2的表达或激活TREM2信号通路实现。我们的研究发现，通过激活天然免疫通路STING可以促进大脑免疫细胞上调TREM2的表达或激活TREM2信号通路，消除大脑慢性炎症，减少大脑老年斑。
天然免疫通路(STING通路)是I型干扰素基因刺激通路，内质网(ER) 受体蛋白(STING)对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶(cGAS)在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。cGAMP结合STING，使转录因子IRF3激活并产生β干扰素。环二核苷酸cGAMP，是到目前为止发现的唯一一类既能直接激活鼠源又能激活人源 STING蛋白的STING激动剂。激动剂是指能与细胞上受体或信号转导途径的蛋白分子相结合，并产生天然物质的典型生理效能的化学品或药物。环二核苷酸cGAMP，作为STING的天然激动剂，能够诱导I性干扰素产生(X Cai, YH Chiu,ZJ Chen,Molecular cell,Volume 54,Issue 2,24April2014,Pages 289–296)。STING激活剂为环二核苷酸，包括：c-di-AMP,c-di-GMP,c-di-IMP,c-AMP-GMP,c-AMP-IMP,c-GMP-IMP等。
因此，天然免疫通路激活剂联合大脑内稳态调控蛋白可以双管齐下地高效治疗阿尔茨海默症和神经退行性疾病。
发明内容
本发明的主要内容是天然免疫激动剂联合大脑内稳态调控蛋白在治疗阿尔茨海默症中的应用，包括天然免疫激动剂联合大脑内稳态调控蛋白在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用。
本发明实验研究表明，使用大脑内稳态调控蛋白联合天然免疫调节剂能显著改善海马组织神经细胞形态和抑制神经细胞凋亡，改善大脑学习记忆能力，抑制淀粉样蛋白沉积，阻止老年痴呆症病情发展。
本文提及二核苷酸cGAMP，如不加特殊说明，均指C20H22N10O13P2.2NH4, CAS号为1441190-66-4。
本文提及STING，为特定蛋白质名称，如不加说明，均与多数公开文献及NCBI数据库、欧洲基因数据库一致。其GENE名为：TMEM173；GENE ID为： 340061；STING公开的其它命名包括：Transmembrane Protein 173,ERIS,MITA, MPYS,NET23,SAVI,STING,hMITA,hSTING。
本文提及的STING激动剂，包括但不限制于c-di-AMP,c-di-GMP,c-di-IMP, c-AMP-GMP,c-AMP-IMP,c-GMP-IMP以及其取代衍生物及混合物。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。
实施例1：STING激动剂的制备
cGAMP的制备：cGAMP(环化-GMP-AMP)按文献方法在结合DNA后的活化条件下，由环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶(cGAS)催化合成。纯度在98％以上。(Pingwei Li，et al.,Immunity,2013,39(6),1019-1031.)。硫代cGAMP、c-di-AMP、硫代c-di-AMP、c-di-GMP均购自sigma公司。
实施例2：大脑内稳态调控蛋白Zn7MT3gH625的制备
所有生物化学试剂、试剂盒，除特别说明外，均购自Sigama或Invitrogen公司。Zn7MT3gH625的制备按文献方法进行。(Wei Xu,Qiming Xu,Hao Cheng,Xiangshi Tan,Scientific reports,2017,7(1),13763.)
Zn7MT3gH625的金属含量测定
取一定量的重组好的融合蛋白Zn7MT3gH625，加少量浓硝酸于65℃硝化过夜，稀释10倍后在电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)上测定金属Zn的含量。结果显示重组后每摩尔Zn7MT3gH625融合蛋白含有的Zn为7±0.2摩尔。
Zn7MT3gH625内毒素的去除
Zn7MT3gH625先用超滤膜截留聚集态的内毒素(LPS)，再用Polymyxin B亲和柱除去残留的内毒素。
实施例3：阿尔茨海默症小鼠模型及STING激动剂联合Zn7MT3gH625药物治疗 APP/PS1转基因小鼠购自北京中科泽晟生物技术有限公司，4月龄，体重24-26g。受试药物名称：STING激动剂,STING激动剂联合Zn7MT3gH625。性状：白色粉末。溶媒：生理盐水。配制方法：临用前用生理盐水溶液配制成所需浓度的溶液。给药剂量为：10mg/kg。给药方式：腹腔注射；给药次数：每天1次，连续 60天。
实施例4：Morris水迷宫验证阿尔兹海默症小鼠认知能力
装置:圆形水池，直径1m，高50cm，水深30cm，池底白色，水温保持在23±2℃；池壁上标记四个等距离点N、E、S、W作为试验的起始点，分水池为四个象限，在第三象限中央放置平台(平台与池壁圆心距离相等)；没于水下1cm，使平台不可见。水池周围贴有丰富的参照线索(不同颜色三角形、四方形、圆、菱形置于各个象限)且保持不变，供小鼠用来定位平台。
定位航行试验:试验共历时6天，每天定于固定时间段训练4次。训练开始时，将平台置于第一象限，从池壁四个起始点的任一点将小鼠面向池壁放入水池。自由录像记录系统记录小鼠找到平台的时间和游泳路径，4次训练即将小鼠分别从四个不同的起始点(不同象限)放入水中。小鼠找到平台后或90秒内找不到平台(潜伏期记为90秒)，则由实验者将其引导到平台，在平台上休息10秒，再进行下一次试验。
空间探索试验：定位航行试验结束24h后，撤除站台。然后将鼠由第三象限放入水中，记录鼠在180s内的游泳路径，记录鼠在目标象限(第三象限)的停留时间和穿越原站台所在位置的次数，观察受试鼠的空间定位能力。数据用x±s表示，利用SPSS10.0软件进行处理，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a＝0.05。实验结果如图1所示(A为 AD模型对照组，B为cGAMP给药组，C cGAMP和Zn7MT3gH625联合给药组，结果表明：STING激活剂cGAMP和cGAMP和Zn7MT3gH625联合给药均能治疗阿尔茨海默症小鼠，使AD鼠认知能力提升。
注：*P<0.05vs A阴性对照组；**P<0.01vs A阴性对照组。
实施例5：cGAMP和Zn7MT3gH625联合给药对阿尔兹海默症小鼠脑神经细胞凋亡的影响
TUNEL凋亡试剂盒(G3250试剂盒)购自Promega公司。取小鼠脑组织，固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，PBS洗涤，蛋白酶K室温孵育 10min，切片PBS洗涤后甲醛固定，加入平衡缓冲液预平衡后洗涤，之后加入孵育缓冲液(内含平衡缓冲液，核苷混合物和rTdT酶)，37℃避光孵育1h，终止反应后共染DAPI，阴干，封片，激光显微镜拍照。实验结果如图2所示(A为 AD模型鼠对照组，B为cGAMP给药组，C联合给药组)，结果表明：cGAMP 和Zn7MT3gH625联合给药后，能够抑制小鼠大脑神经细胞的凋亡。
实施例6：cGAMP和Zn7MT3gH625联合给药对阿尔兹海默症小鼠脑淀粉样蛋白的影响
本实验为硫黄素S染色实验，实验流程为：取小鼠脑组织，固定，石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，TBS洗三次，0.3％硫黄素S(溶于50％乙醇) 滴于组织上，室温孵育10min，50％乙醇洗三次，TBS清洗，阴干，封片，激光共聚焦显微镜下观察。实验结果如图3所示(A为AD模型鼠对照组，B为cGAMP 给药组，C联合给药组)，cGAMP和联合给药均能够显著降低老鼠脑内Abeta蛋白的沉积。
实施例7：cGAMP和Zn7MT3gH625联合给药对阿尔茨海默症小鼠脑神经细胞的调控
AD鼠给药2个月后，取小鼠脑组织，在4％多聚甲醛中固定、脱水、石蜡包埋，在切片机上切成4微米厚的组织切片，然后用苏木精和曙红(HE)染，在光学显微镜(Leica,Germany)下观察海马体CA1区的细胞形态。实验结果如图4所示(A：为正常鼠对照组，B：为AD鼠模型组，C：cGAMP给药组,D为cGAMP 和Zn7MT3gH625联合给药组)。AD模型鼠脑组织CA1区的细胞变形皱缩，观察不到染色质及核糖体，cGAMP和Zn7MT3gH625联合给药后细胞形态趋于正常。使用cGAMP和Zn7MT3gH625联合给药后，能够抑制小鼠大脑神经细胞的退化变性，调控神经细胞恢复正常功能。
实施例8.急性毒性研究
实验材料
ICR小鼠20只(购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[实验动物质量合格证号：SCXK(沪)2007-0005])，雌雄各半，体重18～22g，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。
cGAMP和Zn7MT3gH625用生理盐水配制成浓度为200mg/mL的溶液。
实验方法
ICR小鼠按体重单次尾静脉注射2g/kg的cGAMP和Zn7MT3gH625给药，观察给药后小鼠14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠单次腹腔注射给药后，小鼠活动正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。
实验结果
上述急性毒性实验结果表明，腹腔给药最大耐受量MTD不低于2g/Kg，说明cGAMP和Zn7MT3gH625联合复方药物的急性毒性低。
附图说明
图1、cGAMP联合Zn7MT3gH625给药对阿尔兹海默症小鼠认知能力的影响 (A，AD鼠为对照组；B，cGAMP给药组；C，联合给药组；D，为正常鼠对照组)。
图2、cGAMP和Zn7MT3gH625联合给药对阿尔兹海默症老鼠脑内神经细胞凋亡的影响(A为AD模型鼠，B为cGAMP给药组，C联合给药组，d 正常鼠对照)。
图3、cGAMP及其与大脑稳态调控蛋白联合用药对阿尔兹海默症老鼠脑内 Abeta蛋白沉积的影响(A为AD模型鼠，B为cGAMP给药组，C联合给药组，d正常鼠对照)。
图4、HE染色实验，观察AD模型小鼠大脑海马区CA1区域神经凋亡情况。A，正常小鼠；B，AD转基因模型小鼠；C，cGAMP治疗后的模型小鼠；D,cGAMP和 Zn7MT3gH625联合给药。

Claims (3)

1.天然免疫激动剂联合大脑内稳态调控蛋白在防治阿尔茨海默症（AD）中的应用，其特征在于：改善AD脑认知功能障碍，调控大脑金属离子内稳态平衡, 抑制AD脑内毒性淀粉样蛋白沉积, 增强大脑免疫细胞功能，削减大脑慢性炎症，抑制脑内神经细胞凋亡，改善大脑学习记忆能力.
（1）大脑金属内稳态调控蛋白，即Zn7MT3gH625及其突变体衍生物，该重组融合金属蛋白Zn7MT3gH625由两个多肽（gH625和MT3）通过生物工程技术构成融合蛋白MT3gH625，然后经过金属重组而组成Zn7MT3gH625，gH625是单纯疱疹病毒的糖蛋白中的一段跨膜序列，含有23个氨基酸残基；MT3是金属硫蛋白III，含有68个氨基酸残基，经过化学重组构成融合蛋白Zn7MT3gH625，该大脑内稳态调控蛋白也包括基于金属硫蛋白MT3或Zn7MT3融合跨膜小肽标签的其它类似于MT3gH625的融合蛋白及其类似的基因突变体蛋白.
（2）天然免疫通路激动剂（cGAMPX）是指天然免疫通路（STING通路）的激活剂、激动剂，包括但不限于环二核苷酸（如2’3’-cGAMP）及其各种各样的衍生物（包括硫取代，硒取代，氟取代，氮杂取代等2’3’-cGAMP衍生物），也包括通过高通量筛选和优化的STING的激活剂或激动剂，所述的STING激动剂，也包括但不限制于c-di-AMP, c-di-GMP, c-di-IMP, c-AMP-GMP, c-AMP-IMP, c-GMP-IMP，及其各类衍生物以及组合物。
2.该天然免疫激动剂联合大脑内稳态调控蛋白在制备治疗阿尔茨海默症药物中的应用，包括天然免疫通路激动剂和大脑金属内稳态调控蛋白联合用药和由这两种物质制备的各种复方药物.
该天然免疫激动剂联合大脑内稳态调控蛋白按常规药剂学制成各种药物剂型，所述的剂型包括但不局限于：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取口服或注射（包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射、或脑室直接给药等）中的一种或多种给药途径进行治疗阿尔茨海默症。
3.天然免疫通路激动剂（指天然免疫STING通路的激活剂、激动剂）联合大脑内稳态调控蛋白Zn7MT3gH625（或Zn7MT3gH625的衍生物）制备治疗神经退行性疾病药物，神经退行性疾病包括但不限于阿尔茨海默症（AD）、帕金森症（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、多发性硬化症、共济失调毛细血管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、亨丁顿舞蹈症、小脑萎缩症、脊髓性肌萎缩症、脑缺血、痉挛性截瘫、重症肌无力等。
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