WO2005017151A1

WO2005017151A1 - アポトーシスを誘導するip3受容体タンパク質の末端切断型変異体

Info

Publication number: WO2005017151A1
Application number: PCT/JP2003/014811
Authority: WO
Inventors: Katsuhiko Mikoshiba; Mitsuharu Hattori
Original assignee: Riken
Priority date: 2003-08-15
Filing date: 2003-11-20
Publication date: 2005-02-24
Also published as: AU2003304423A1; JP2005058116A

Abstract

本発明は、新規アポトーシス誘導薬に関する。該アポトーシス誘導薬により、細胞増殖性疾患の予防または治療が可能となる。　IP3受容体のチャネルドメインのみからなる変異体タンパク質を発現させることにより、該発現細胞においてアポトーシスを誘導する。該変異体タンパク質は、細胞の小胞体上に局在して小胞体内のカルシウムを細胞質へと流出させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する。

Description

明細書アポトーシスを誘導する IP₃受容体タンパク質の末端切断型変異体技術分野

本発明は、 IP₃受容体の C末端側に位置するチャネル形成ドメインのみを含む夕ンパク質が、アポトーシス誘導薬として作用することに関する。したがって、本発明は、該タンパク質による抗癌治療等の細胞増殖性疾患の治療にかかる分野に属する。背景技術 .

細胞膜上のレセプターの活性化に伴いホスファチジルイノシトール 4， 5-ビスホスフェート（phosphat idyl inos i tol 4， 5_bispliosphate)が加水分解されると、細胞内セ力ンドメッセンジャーであるィノシトール 1, 4， 5 -三リン酸（inos i tol 1, 4, 5-t ri sphosphate (IP₃) )が生成する。 IP₃は IP₃受容体（IP₃R)に結合することにより、細胞内カルシウム貯蔵オルガネラ (主に小胞体）からの Ca²⁺流出を誘導する。この IP₃/Ca²⁺シグナル経路において、 IP₃受容体は、 IP₃のシグナルを Ca²⁺のシグナルへ変換する役割を担っている（1-3)。

IP₃受容体は、 4量体の細胞内 IP₃-誘導性 Ca²⁺放出チャネル（IP₃- gated Ca²⁺ re lease channel) である（3, 4)。哺乳動物では、 3種の異なる ₃受容体が存在する（5-7)。 IP₃により誘発される IP₃受容体チャネル開口の詳細な機序は未だ不明であるが、 IP₃結合が IP₃受容体の何らかの立体構造変化を誘導することによつて、チャネルの開口が起こると考えられる（10)。チャネルの開口以外にも、 IP₃ - 誘導性の立体構造変化は、 ₃受容体の分解にも関与していると考えられる（13，

14)。

3受容体の活性化による細胞質 Ca²⁺濃度の増加によって、多種多様な下流標的分子の活性が制御される。これら下流標的分子は、受精、発生、増殖、分泌、シナプス可塑性など多岐に渡る細胞応答において重要な役割を担っている U - 2,

15) このような多岐に渡る細胞機能を制御するために、 Ca²⁺シグナルは、空間、時間、および濃度の点で厳密に制御される必要がある（2， 15)。このような Ca²⁺ シグナルの複雑な制御は、 IP₃受容体ァイソフォームの発現の多様性、 IP₃受容体ァイソフォームのヘテロ 4量体の形成、 IP₃受容体の細胞内分布、ならびに Ca²⁺自体、 ATPおよびリン酸化による IP₃受容体の制御によって部分的に担われている (3-4, 16)。 IP₃受容体チャネルはまた、カルモジュリン (18, 19)、 FKBP 12 (20- 22、 23-24)、カルシニューリン（21、 25、 23-24)、アンキリン（26-28)、ひ- 1 受容体（28)、クロモグラニン Aおよび B (29-31)、 IRAG (32)、 Fyn (33)ならびに BANK (34)などの該チヤネルと相互作用するタンパク質によっても制御される（4, 17) さらに、 CaBPと呼ばれるファミリーが、 Ca²⁺依存的に IP₃受容体と結合し、 IP₃非存在下で IP₃受容体を直接活性化することが示された（35)。 IP₃受容体はまた、夕ンパク質-夕ンパク質間相互作用によってその上流または下流のシグナル分子に物理的に会合していることが示されている。例えば、 ₃受容体は、 Homerフアミリータンパク質を介して代謝型グルタミン酸受容体グループ 1 (mGluRs)と結合し (36)、また、未知の機序によって B₂ブラジキニン受容体（B₂Rs)と結合している (37)。 mGluRsや B₂Rsの活性化によって、 IP₃受容体に近接した位置で IP₃が産生され、効率的かつ特異的にシグナルが伝播される。

このように、 IP₃分子は、様々な細胞機能を制御する重要なセカンドメッセンジャーであり、その細胞内の濃度は時間空間的に制御された形で変化していると考えられる。

上述の制御ドメインの C末端側近傍にはカスパーゼ 3特異的切断部位が存在する。カスパーゼ 3により該切断部位で切断されると、 IP₃受容体のチャネルドメインのみを含むタンパク質が生じる。カスパーゼ 3により IP₃受容体が切断されると細胞のアポトーシスが起こることが、種々の培養細胞系において示されている（38) 。

しかし、カスパーゼ 3により切断された IP₃受容体が、カルシウムの細胞内ブールに対してどのような作用をするのかは不明である。

細胞質 Ca²⁺の局在パターンの変動がアポ卜一シスにどの様な影響を与えるのかということは、現在論争の的であり、細胞種、アポ卜一シス誘導の刺激、細胞の環境等、種々の条件によって異なることが明らかにされている（2) 。しかし、 3受容体がアポト一シスに関与していることを示唆する報告がある。例えば、 Jurkat細胞におけるアンチセンス RNA法により IP₃受容体の存在量を低下させた場合（39) 、および DT40ニヮトリ B細胞において IP₃受容体の遺伝子を欠失させた場合（40) 、有意にアポトーシスが阻害されるとの報告がある。 IP₃受容体タイプ 3 (IP₃R3) は、リンパ細胞のアポトーシスの際に選択的に増加し、 IP₃R3アンチセンス RNAを発現させることによりアポトーシスが阻害されることも報告されている（41、 2) 。 Bd-XLは、 IP₃R1および IP₃R3をダウンレギュレートするが、該ダゥンレギュレートは抗アポト一シス作用の一部であると考えられる（43) 。したがって、 IP₃受容体とそのカスパーゼ 3切断産物は、条件によってはアポトーシスに必須のシグナル伝達を任っている可能性が高い。

しかしながら、現時点で IP₃受容体のカスパーゼ 3切断産物のアポトーシスに対する影響を直接的に証明した例は報告されていない。

本発明は、 IP₃受容体のチャネルドメインのみからなる変異体タンパク質によつてアポトーシスを誘導し、細胞増殖性疾患の治療等に有用な薬剤および方法を提供する。発明の開示

本発明者らは、種々の長さの IP₃受容体タイプ 1 (IP₃R1) 変異体タンパク質をグリーン蛍光タンパク質（GFP) で標識したものを作製し、それぞれを細胞内で発現させることにより、 IP₃受容体のチャネルドメインのみからなるタンパク質を発現させた場合、そのチャネルが開いた状態となるか、または少なくとも Ca²⁺ イオンの透過が可能な状態であることを見出した。

このことから、 IP₃受容体のチャネルドメインのみからなるタンパク質を強制発現させた細胞では、小胞体（ER) から細胞質へと Ca²⁺イオンが流出し、アポト一シスが誘導されることがわかった。

したがって、上記チャネルドメインのみを含むタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子は、アポ卜一シス誘導薬として細胞増殖性疾患の治療に用いることができる。

以上の知見より、本発明は、以下の態様：

1 . IP₃受容体タンパク質のチャネルドメインを含み、かつその制御ドメインを機能しうる形で含まない IP₃受容体変異体タンパク質；

2 . IP₃受容体タンパク質が IP₃受容体タイプ 1タンパク質である、上記 1記載のタンパク質；

3 . 以下の（a)または（b)のいずれかのタンパク質である、上記 2記載のタンパク質；

(a) 配列番号 1に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも 2216〜2749位、または 2276〜2749位の配列を含み、かつ少なくとも第 1〜1891位の配列は含まない夕ンパク質

(b) 上記（a)に規定するタンパク質において、 1〜60個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、哺乳動物細胞で発現させた場合に小胞体内から細胞質への Ca²⁺の流出を誘導することができるタンパク質

4 . 以下の（a)または（b)のいずれかのタンパク質である、上記 2記載のタンパク質；

(a) 配列番号 2に示すアミノ酸配列のうち、少なくとも第 2222〜2695位の配列を含み、かつ少なくとも第 1〜2221位の配列は含まないタンパク質

(b) 上記（a)に規定するタンパク質において、 1〜60個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、哺乳動物細胞で発現させた場合に、小胞体内から細胞質への Ca²⁺の流出を誘導することができる夕ンパク質

5 . 上記 1〜4のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸分子；

6 . 上記 1〜4のいずれかに記載のタンパク質をコードする核酸分子と、少なくとも 80 %の相同性を有する核酸分子、またはこれらにストリンジェントな条件下で八イブリダィズする核酸分子；

7 . 上記 1〜4のいずれかに記載の IP₃受容体変異体タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポトーシスを誘導する方法； 8 . 上記 1〜 4のいずれかに記載の IP₃受容体変異体夕ンパク質を発現させた細胞内で、小胞体内の Ca²⁺濃度が減少することを特徴とする、上記 7記載の方法； 9 , 上記 5または 6記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させる、上記 7または 8記載の方法；

1 0 . 上記 1〜4のいずれかに記載のタンパク質を、対象とする細胞で発現させる、上記 7または 8記載の方法；

1 1 . 上記 5または 6記載の核酸分子を含む、アポトーシス誘導薬；

1 2 . 上記 5または 6記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させ、該細胞の小胞体内の Ca²⁺濃度を減少させることを特徴とする、上記 1 0記載のアポ卜一シス誘導薬；

に関する。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2003- 293912号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、 GFPタグを付したマウス IP₃R1構築物の構造（A) およびその発現産物のサイズ（Bおよび C ) を示す。 A中、 LBDはリガンド結合ドメインを示す。抗

I P₃R 1モノクローナル抗体 18 A 10によって認識されるェピトープ部位は、 C末端部分である。 Bおよび Cは、 HeLa細胞で各 GFP-IP₃R1変異体を発現させ、その細胞溶解液を、それぞれ抗体 18A10および抗 GFP抗体によるウェスタンプロット（5 % ゲル SDS- PAGE) に供した結果である。レーン 1はコントロールベクター、レーン 2は GFP- IP₃M-Nの発現プラスミド、レ一ン 3は GFP- IP₃R1 - レーン 4は GFP -

IP₃R1-D610, レーン 5は GFP- GFP-Rl_caspおよびレーン 6は GFP_IP₃i _ESである。ネイティブな IP₃R1の位置を星印で示している（B ) 。

図 2は、各 GFP-IP₃R1変異体を発現させた He la細胞の ATPおよび TGに対する細胞内 Ca²⁺濃度の変化を調べた結果である。 Aおよび B中、細い実線は、各 GFP- IP₃R1 変異体を発現させていない Hel a細胞（コントロール）であり、太い実線は、それぞれ GFP- IP₃IU-N、 GFP-IP₃R1-D610, をそれぞれに発現させた Hel a細胞である。また、 Cおよび D中、細い実線は、各 GFP- IP₃R1変異体を発現させていない He l a 細胞（コントロール）であり、太い実線は、それぞれ GFP-IP₃Rl-casp、 GFP -

IP₃R卜 ESを低発現した細胞、破線はそれぞれを高発現した細胞である。発現レべルは、 470〜490nmで励起し GFPによる 510〜550nmの蛍光強度を指標に判断した。 GFPの蛍光画像（左上のパネル）中、高発現細胞を棒付き矢印、低発現細胞を矢羽印で示している。星印は GFP-IP3R1変異体の局在が正常でないか、または凝集しているものを示す。 Εは、 A〜Dの結果をグラフ化したものである。同じ実験を 4回繰り返して実施したが同様の結果が得られた。

図 3は、各 GFP- P₃R1変異体を発現させた HeLa細胞の TGに対する応答および続いて細胞外 Ca²⁺濃度を上昇させた場合の Ca²⁺の流入を調べた結果を示す。 GFP - IP₃R1_N、 GFP-P3RI-D6 IO , GFP-IP₃Rl-casp , GFP- IP₃R卜 ESをそれぞれ発現する HeLa細胞（A〜D ： Ca²⁺不含 BSS中）を 10分間 0. 3 Mの TGで処理し、その後 TGを含まない 2mMCa²⁺含有 BSSで処理した。細い実線は GFP- IP₃R1変異体を発現させてない細胞（コントロール）、太い実線は各 GFP-IP₃M変異体を発現させたものを示す。それぞれ 12〜14個の細胞について観察された平均を示す。同じ実験を 3回繰り返し実施したが、同様の結果が得られた。

図 4は、各 GFP-IP3R1変異体を発現させた HeLa細胞の細胞外 Ca²⁺濃度の変化に対する細胞質内への Ca²⁺の流入について調べた結果を示す。細胞を 2mMCa²⁺含有 BSSから Ca²⁺不含 BSSに培地交換し、さらにその 10分後に再度 2mMCa²⁺含有 BSSに培地交換した。その際の Fura-2による F340/380の蛍光変化を図に示している。細い実線は GFP-IP₃R1変異体を発現させてない細胞（コントロール）、太い実線は GFP- IP₃R卜 N、 GFP-IP3RI-D6 IO, GFP- IP₃R卜 casp、 GFP- IP₃R1_ESをそれぞれ発現させた HeLa細胞（A〜D ) を示す。それぞれ 10〜14個の細胞について観察された平均を示す。同じ実験を 3回繰り返し実施したが、同様の結果が得られた。

図 5は、 GFP_IP₃Rl-caspまたは GFP- IP₃M- ESによる細胞死の誘導を確認した結果を示す。 GFP_IP₃R卜 caspまたは GFP- IP₃R1- ESを一過性発現させた HeLa細胞について、トランスフエクシヨン後 96時間における GFPの蛍光を発する細胞を計測し、 GFPのみを発現させたコントロ一ル HeLa細胞の生存率を 100%として細胞生存率を算出した。発明を実施するための形態

以下、本発明を具体的に説明する。 IP₃受容体は、 4量体の細胞内 IP₃_誘導性 Ca²⁺放出チャネル（IP₃- gated Ca²⁺ rel ease channe l ) である（3, 4)。哺乳動物では、 3種の異なるサブタイプの IP₃ 受容体が存在する（5- 7)。いずれのサブタイプも、 N末端近傍に IP₃結合ドメイン、 C末端近傍に 6回膜貫通領域を有するチャネル形成ドメイン、およびこれら 2つのドメインの間に制御ドメインが存在する（10， 11)。

マウス IP₃受容体タイプ 1 ( IP₃R1) では、配列番号 1に示すアミノ酸配列を有する。 N末端側（1〜610残基）がリガンド結合ドメインで、 C末端側（2276〜2749 残基）がチャネル形成ドメインであり、これらの間に制御ドメイン（611〜2275 残基）が存在する。該タンパク質の 1891残基と 1892残基の間のペプチド結合は、カスパーゼ 3特異的切断部位である。上述のとおり、カスパーゼ 3切断断片がアポ ] ^一シスを促進することが報告されていることから、カスパーゼ 3切断部位より C 末端側がアポトーシスの誘導に重要であると考えられる。

この知見に基づいて、本発明者らは、アポトーシス誘導に関与する IP₃受容体部位をさらに限定するために、マウス IP₃R1のカスパーゼ 3切断 C末端側断片よりさらに短い、配列番号 1に示すマウス IP₃R1のアミノ酸配列のうち 2216〜2749位の配列のみを含むタンパク質に GFPタグを付したもの (GFP-IP₃R1-ES)を作製した。すなわち、該タンパク質は、 IP₃R1の C末端に存在するチャネルドメインとその N 末端側の制御ドメィンの C末端配列 60残基を含むものであり、これにはリガンド結合ドメインおよび制御ドメインは機能し得る形で含まれていない。

この GFP_IP₃R卜 ESを、細胞に強制発現させたところ、細胞の小胞体内における Ca²⁺ストアからの Ca²⁺の流出が起こり、小胞体内の Ca²⁺濃度が低くなる。この小胞体内の Ca²⁺濃度の低下により、細胞外から細胞質へのストァ作動性 Ca²⁺流入が起こる。これにより、 IP₃R1_ESを強制発現した細胞ではアポトーシスが誘導される。

IP₃R1- ESはほぼチャネルドメインのみからなるものであり、 N末端側の制御ドメイン由来の 60残基は機能を有してはいない。 IP₃Rの制御ドメインは、リガンド結合ドメィンへの IP₃の結合を受けてチャネルドメインの何らかの立体構造変化を誘導してチャネルの開口をもたらすと考えられている。本明細書中、「制御ドメインを機能しうる形で含まない」とは、制御ドメインを構成するアミノ酸配列の全部を含まないか、または一部または全部を含むものの上記のようなリガンド結合部位によるチャネルドメインの開口を誘導するという制御ドメイン本来の機能を有していないことをいう。したがって、 IP₃R卜 ESも、「制御ドメインを機能しうる形で含まない」 IP₃R1変異体タンパク質に含まれる。

マウス IP₃R1のアミノ酸配列のうち 2276〜2749位のチャネルドメインを構成するアミノ酸配列のみを含むタンパク質も、 IP₃M-ESと同様のアポトーシス誘導作用を示し得ることが当業者であれば容易に認識し得るであろう。さらに、これらの IP₃R1の 2216〜2749位、または 2276〜2749位のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に同等なタンパク質も、アポトーシス誘導作用を有する。ここで、「機能的に同等なタンパク質」とは、上記アミノ酸配列において、 1〜60、好ましくは 1〜20、さらに好ましくは 1〜10、特に好ましくは 1〜5個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、 IP₃R卜 ESと同様に哺乳動物細胞で発現させた場合、小胞体膜上に存在して小胞体内から細胞質への Ca²⁺の流出を誘導することができるタンパク質をいう。

また、 IP₃受容体タイプ 1に限らず、 IP₃受容体タイプ 2およびタイプ 3についても同様に、チャネルドメインを含み、かつ制御ドメインを機能し得る形で含まない変異体タンパク質は、アポトーシス誘導作用を有すると考えられるため、これらのタンパク質およびこれらと機能的に同等なタンパク質もまた本発明の範囲内である。

また、あらゆる哺乳動物に由来する IP₃受容体についても同様である。したがつて、例えば配列番号 2にアミノ酸配列を示すヒト IP₃受容体タイプ 1では、少なくとも第 2222〜2695位の配列を含み、少なくとも第 596〜2221位の配列は含まないタンパク質、およびこれに機能的に同等なタンパク質もまた、アポ卜一シス誘導作用を有する。

したがって、これらのタンパク質は全て本発明の範囲内にある。

また、これらのタンパク質をコードする核酸分子もまた本発明の範囲内である。本明細書中、「核酸分子」という用語は、 DNAおよび RNAを含む。また、これらの核酸分子と少なくとも 80 %の相同性を有する核酸分子、好ましくは BLAST等を用いて計算したときに（例えば、 BLASTのデフォルトすなわち初期条件のパラメ一ターを用いた場合に）、 90 %の相同性を有する核酸分子、さらに好ましくは 95 % の相同性を有する核酸分子、およびこれらにス卜リンジェン卜な条件下でハイブリダィズする核酸分子もまた、本発明に含まれる。本明細書中「ストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする」とは、例えば、ナトリウム濃度が 10mM〜 300mMであり、好ましくは 37〜65で、より好ましくは 42°Cである条件でハイプリダイズすることをいう。

さらに、上記の核酸分子を含むベクター、上記核酸分子が発現可能なように該核酸分子にプロモーターが機能し得る形で連結されているベクター、および上記核酸分子の発現産物を標識化するための何らかの標識物をコードする核酸分子と上記核酸分子がインフレームで連結されているベクター、さらにはこれらのべクターを含有する宿主細胞（哺乳動物細胞が好ましいが、これらに限定はされない）も、本発明に包含される。

本発明のタンパク質を発現させるためには、 ₃受容体のアミノ酸配列に基づいて上記タンパク質のアミノ酸配列をコ一ドする核酸分子を作製し、これを周知の遺伝子工学的手法を用いて、適切な発現ベクターに組込むとよい。アミノ酸配列に基づいて遺伝子を作製または単離する技法、および哺乳動物細胞での発現に適切な発現ベクターは、様々なものが公知であり、当業者であれば容易に適切なものを選択することができる。

対象とする細胞に該発現ベクターを導入して、該細胞で上記遺伝子を発現させるための種々の方法も知られている。

IP₃R1が細胞の小胞体膜上に存在するためには、チャネルドメインのみが必要十分であることを本発明者らは見出しており、少なくともチャネルドメインを含む上記 IP₃受容体変異体タンパク質を細胞で強制発現させた場合、該変異体タンパク質は小胞体膜上に局在する。該変異体タンパク質は、制御ドメインを欠くため、正常な 1?₃受容体の立体構造をとることができず、チャネルが完全に閉口せず、小胞体内の Ca²⁺を細胞質へと流出させ、細胞をアポトーシスへと導くと考えられる。

すなわち、上述のタンパク質は細胞のアポトーシス誘導薬として有用である。アポトーシス誘導薬は、細胞増殖性疾患の治療に有用である。

細胞増殖性疾患とは、特定の細胞種が異常増殖することにより発症する疾患であり、皮膚 T細胞増殖性疾患、血管平滑筋細胞増殖性疾患、骨芽細胞増殖性疾患、眼内細胞増殖性疾患、甲状腺の細胞増殖性疾患等を含む各種腫瘍および慢性関節リウマチ（RA) などが挙げられるが、これらに限定はされない。

かかる細胞増殖性疾患において、増殖する細胞をアポ 1 ^一シスにより死滅させる治療が該疾患において有効であり得る。

上記アポトーシス誘導薬としての ΙΡ₃受容体変異体タンパク質をコードする遺伝子を、所望の細胞内で該タンパク質を発現し得る形で導入することにより、所望の細胞のアポトーシスを誘導し得る。 IP₃R受容体変異体タンパク質をコードする遺伝子が所望の細胞でのみ発現し得るように、該細胞種に特異的な発現プロモ一夕一等の調節因子を上記遺伝子に機能し得る形で連結した発現カセットを含むベクターを用いて、対象とする生物個体に導入することができる。これらの方法は、種々のものが既に公知であり、いずれの方法を使用することも可能であるが、例えばアデノウイルス等を用いることができる。細胞種特異的な発現プロモー夕一も個々の細胞種について様々なものが公知であり、当業者であれば適切なものを選択することは容易である。

例えば、 IP₃受容体変異体タンパク質をコードする DNAを上記治療薬として使用する場合は、本発明の DNAを単独あるいは、レトロウイルスベクタ一、アデノウィルスベクター、アデノウイルス随伴性ウィルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常法に従って、患者に投与することができる。該 DNAは、そのままで、あるいは摂取促進のための補助剤とともに、遺伝子銃やハイド口ゲルカテ一テルのようなカテーテルによって投与できる。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。また、 DNAを生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ビヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによつて製造することができる。これら製剤における有効成分量は当業者であれば適当な用量がわかるであろう。

錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、ァカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなビヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、 D-ソルビトール、 D-マンニトール、塩化ナトリゥムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート 80^TM、 HC0-50) などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。

また、上記治療薬は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリゥム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニゥム、塩酸プロ力インなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フエノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。

投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより相違し、対象とする患者の健康状態、体重、併用する治療方法等の条件によって、個別に担当医によって決定される。

以下、本発明の理解を助けるために、実施例を例示として記載する。

実施例

GFPタグを付した IP受容体タイプ 1変異体 DNAの構築とその発現

IP₃受容体タイプ 1の 1892残基より C末端側のアミノ酸配列のみからなるぺプチドの N末端側にグリーン蛍光タンパク質 EGFPを付した IP₃受容体タイプ 1変異体

(GFP-IP₃Rl-casp) 、および、 IP₃受容体タイプ 1の 2216残基より C末端側のアミノ酸配列のみからなるぺプチドの N末端側にグリーン蛍光タンパク質 EGFPを付加した IP₃受容体タイプ 1変異体（GFP-IP₃R卜 ES) を作製した。

まず、マウス IP₃R1をコードする cDNAを、 Pfu turbo (St rat agene, La Jol l a, CA) を用いて常法に従って PCRにより増幅した。該 cDNA断片と EGFPのコード配列 (Clontech, Palo Al to, CA) とを、 cDNA3. l/Zeo⁺ (Invi t rogen, Carl sbad, CA) 内に EGFPcDNAが IP₃RlcDNAの上流に位置するようにサブクローニングし、 GFP- IP₃R卜 N発現べクタ一を得た。該ベクター内では EGFPcDNAと IP₃R lcDNAとの間にリンカーとして Leu- Lys (ΑΠ Π制限酵素認識配列に含まれる）が挿入されている。 GFP-IP₃R1- Cは、 EGFP分子が IP₃R1の C末端側に付加されており、同様の方法で、 GFP- IP₃IU-C発現ベクターも作製することができる。 IP₃RlcDNAと EGFPcDNAとの間にリンカーとして Gly- Pro-Al aが揷入されている。

さらに、上記 GFP_IP₃R卜 N発現べクタ一から IP₃R1の 1〜610残基をコードする配列部位を Ml l l/SacI I消化により切り出し、そこに Gly- Ser- Ser- Glyをコードするオリゴヌクレオチドリンカーを挿入して、 GFP-IP₃R卜 610発現ベクターを得た。さらに、上記 GFP- IP₃R卜 N発現べクタ一から IP₃R1の 1〜2216残基をコードする配列部位を M 111/EcoRI消化により切り出し、そこに Glu- Pheをコードするオリゴヌクレオチドリンカーを挿入して、 GFP- IP₃R卜 ES発現ベクターを得た。さらに、 IP₃R1の Argl892〜Glu2216アミノ酸配列をコードする cDNA断片を PCRにより増幅させて、上記 GFP-IP₃R卜 ES発現ベクターの EcoRI部位に挿入することにより、 GFP - IP₃M-casp発現ベクターを得た。図 1 A参照のこと。

50 g/mlポリリジンでコートしたガラスカバ一スリップ（直径 18匪）またはガラス底マイクロウェルディッシュ (直径 35匪、コーティングなし) 上で細胞を増殖させ、リポフエクトァミン 2000溶液（Invi torgen) を説明書の指示どおりの方法で、上記発現べクタ一を HeLa細胞に一過性にトランスフエク卜して、その細胞溶解液を抗 IP₃R1モノクローナル抗体 18A10 ( IP₃R1の C末端部を認識する）（14)を用いたウエスタンブロットにより各発現タンパク質の分子量を検定したところ、いずれも予想どおりの分子量を有することが確認された（図 1 B )。さらに、抗 GFP抗体（Santa Cruz CA)によるウエスタンプロットの結果でも同様であった（図 1 C)。なお、本明細書中に開示する実施例中の細胞培養では、 COS細胞および HeLa細胞は、 10 %ゥシ胎児血清（FCS) 、 1. 0g/lグルコース、 2mM L -グルタミン、ベニシリンストレプトマイシン含有ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM) を用いて行レ培養は 37°C、 5 % C0₂湿潤環境下で行った。

Ca²⁺イメージング

次に、これらの IP₃R1変異体を強制発現させた Hel a細胞を用いて、シングルセル Ca²⁺イメージングを実施した。

トランスフエクシヨンの 1〜 2日後、 HeLa細胞を 5 M iura- 2ァセトキシメチルエステル（Molecular Probe)で 45分間処理し、 fura- 2をロードした細胞を倒立蛍光顕微鏡（IX_70、ォリンパス社製）にセットし、平衡塩類溶液（BSS； 115mM NaCl、 5. 4mM KC 1、 2mM CaC l₂、 lmM MgC l₂、 lOmM グルコースおよび 20mM HEPES (pH7. 4)を 2. Oml/分の流速で灌流させた。画像処理は、 Argus50/CA (浜松フオト二クス社製）を用いて、室温にて 340nmと 380nmとで交互に励起して、それぞれの励起に対する蛍光イメージを取得した。細胞は、 100 M ATPおよび夕プシガルジン（TG)それぞれで刺激して、その際の蛍光比率（F340/F380)の変化を観察した。結果を図 2に示す。

GFP_IP₃R卜 Nおよび GFP- IP₃R卜 D610は、 ATP誘導性および TG誘導性の Ca 流入にはほとんど影響を与えなかった（図 2 A、 B )。一方、 GFP_IP₃IU-caspおよび GFP_ IP₃R卜 ESは ATP-誘導性および TG誘導性 Ca²⁺流入の両方とも応答が減少した（図 2 C、 D )。 GFP- IP₃M_caspおよび GFP- IP₃R卜 ESの発現量の増加に従って、減少が顕著であった。

COS細胞を用いて同様の実験を行った場合も、同様の結果を示した (データは示していない）。

この機序を探るために、さらに実験を行った。

各種 IP₃R1変異体を発現させた COS細胞の TG誘導性の Ca²⁺ストァからの Ca²⁺の漏出およびこれに伴うストァ作動性 Ca²⁺流入を調べた。 GFP-IP₃iU-Nおよび GFP-

IP₃R卜 D610を発現させた細胞は、 TGの誘導による Ca²⁺ストァからの Ca²⁺の漏出およびストァ作動性 Ca²⁺の流入ともにほとんど影響を示さなかったが、 GFP_IP₃R卜 caspおよび GFP- IP₃M-ESを発現させた細胞では、 TG処理による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇がほとんど認められなかった。しかし、細胞外 Ca²⁺濃度を上げた際のストア作動性 Ca²⁺の流入は明らかに認められた（図 3 C、 D )。この現象は、 GFP-IP₃R1 - caspまたは GFP- IP₃R1- ESを発現させた細胞の小胞体内の Ca²⁺濃度が低すぎ、すなわち小胞体の Ca²⁺ストァが枯渴した状態にあり、 TG刺激による細胞内 Ca²⁺濃度の上昇が認められないことを示唆するものである。

このことをさらに証明するために、 TGによる前処理を行わずに、細胞外 Ca²⁺濃度を変化させて Ca²⁺の流入を観察した（図 4 )。 GFP- IP₃R1- Nまたは GFP-IP₃R卜 D610 を発現させた細胞では、細胞内 Ca²⁺濃度は細胞外 Ca²⁺濃度に影響されることなくほぼ安定していたのに対し（図 4 A、 B )、 GFP- IP₃R1- caspまたは GFP- IP₃R卜 ESを発現させた細胞では、細胞外 Ca²⁺の除去に伴い細胞内 Ca²⁺濃度が低下し、細胞外 Ca²⁺の増加とともに細胞内 Ca²⁺濃度が上昇した（図 4 C、 D)。

これらの結果より、 GFP- IP₃i -caspおよび GFP- IP₃R卜 ESはいずれも、小胞体内の Ca²⁺ストアから Ca²⁺を漏洩させていると考えられる。 GFP - IP₃R卜 caspおよび GFP- IP₃R卜 ESは、 Ca²⁺ストア内の Ca²⁺量が低下し、細胞外から細胞質内へのストァ作動性カルシウム流入が起こり、その状態が維持されると考えられる。

GFP- IP R1- caspおよび GFP- IPjg-ESによる細胞死

次いで、 GFP- IP₃Rl-caspまたは GFP_IP₃R1- ESによる細胞死の誘導を調べた。 GFP- IP₃R卜 caspまたは GFP-IP₃R卜 ESをトランスフエクシヨンした後、 96時間後における GFPの蛍光を発する細胞を計測し、 GFPのみを発現させたコントロール HeLa 細胞の生存率を 100 %として細胞生存率を算出した（図 5 ) 。

GFP- IP₃Rl_caspおよび GFP- IP₃M_ESのいずれを発現させた細胞でも、細胞死の誘導が顕著に認められた。この結果は、 IP₃R1のチャネルドメインのみの変異体がアポトーシスを誘導することを示唆するものである。産業上の利用の可能性

以上より、本発明により、細胞内 Ca²⁺ストアから細胞質への Ca²⁺の流出を誘導することにより細胞のアポトーシスを誘導するタンパク質、およびそれによるァポトーシス誘導方法が提供される。また、 ₃受容体のチャネルドメインからなるアポト一シス誘導薬が提供される。本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

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Claims

請求の範囲

1 . IP₃受容体タンパク質のチャネルドメインを含み、かつその制御ドメィンを機能しうる形で含まない IP₃受容体変異体タンパク質。

2 . IP₃受容体タンパク質が IP₃受容体タイプ 1タンパク質である、請求項 1 記載のタンパク質。

3 . 以下の（a)または（b)のいずれかのタンパク質である、請求項 2記載の夕ンパク質。

4 . 以下の（a)または（b)のいずれかのタンパク質である、請求項 2記載の夕ンパク質。

(b) 上記（a)に規定するタンパク質において、 1〜60個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された配列を有するタンパク質であって、哺乳動物細胞で発現させた場合に、小胞体内から細胞質への Ca²⁺の流出を誘導することができるタンパク質

5 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。

6 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のタンパク質をコードする核酸分子と、少なくとも 80 %の相同性を有する核酸分子、およびこれらにストリンジ工ントな条件下でハイブリダィズする核酸分子。

7 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の IP₃受容体変異体タンパク質を、対象とする細胞に発現させることにより、該細胞のアポ卜一シスを誘導する方法。

8 . 請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載の IP₃受容体変異体夕ンパク質を発現させた細胞内で、小胞体内の Ca²⁺濃度が減少することを特徴とする、請求項 7記載の方法。

9 . 請求項 5または 6記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させる、請求項 7または 8記載の方法。

1 0 . 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載のタンパク質を、対象とする細胞で発現させる、請求項 7または 8記載の方法。

1 1 . 請求項 5または 6記載の核酸分子を含む、アポトーシス誘導薬。

1 2 . 請求項 5または 6記載の核酸分子を、対象とする細胞に導入することにより上記タンパク質を発現させ、該細胞の小胞体内の Ca²⁺濃度を減少させることを特徴とする、請求項 1 1記載のアポトーシス誘導薬。