NO335101B1 - NTP-peptider til fjerning eller destruksjon av celler, materialer omfattende NTP-peptidene, og anvendelse av NTP-peptidene til fremstilling av et medikament til behandling av en tilstand som krever fjerning eller destruksjon av celler. - Google Patents

Abstract

Det beskrives fremgangsmåter for å behandle tilstander som krever fjerning eller destruksjon av skadelige eller uønskete celler i en pasient, så som benigne og maligne tumorer, ved anvendelse av forbindelser som inneholder eller er basert på peptider som omfatter en del av aminosyresekvensen av et neuralt trådprotein.

Description

Område for oppfinnelsen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører visse NTP-peptider (neurale trådproteiner), NTP-peptidene til anvendelse som lekemiddel, materialer som omfatter et NTP-peptid i samsvar med opfindelsen og en bærer dertil, samt anvendelse av et NTP-peptid i samsvar med opfindelsen til fremstilling av et medikament til behandling av en tilstand som krever fjerning eller destruksjon av celler. Behandlingen inkluderer, men er ikke begrenset til, administrering av forbindelsene intramuskulært, oralt, intravenøst, intratekalt, intratumoralt, intranasalt, topikalt, transdermalt, etc, enten alene eller sammen med en bærer.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Essensen i mange medisinske behandlinger og prosedyrer involverer fjerning eller ødeleggelse av skadelig eller uønsket vev. Eksempler på slike viktige behandlingsmetoder inkluderer kirurgisk fjerning av cancervekster, ødeleggelse av metastatiske tumorer gjennom kjemoterapi, og reduksjonen av glandulær (f.eks. prostata) hyperplasi. Andre eksempler inkluderer fjerningen av uønsket ansiktshår, vorter, subkutanøst vev, lymfoid vev eller fettvev.

Det er et behov for et effektivt middel som vil ødelegge og således enten fjerning av, eller inhibere den videre vekst av skadelige eller uønskede celler og vev, men som kun i hovedsak vil ha lokale effekter og minimal eller ingen systemisk toksisitet. Neurale trådproteiner og deres beslektede molekyler er én klasse av slike midler som beskrives i US-Patentsøknad med serienummer 10/092,934, med tittel "Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins, av 8. mars 2002.

Peptider inneholdende aminosyresekvenser korresponderende til dele av aminosyresekvensen av et neuralt trådprotein, AD7c-NTP er også slike midler. Disse peptider er beskrevet i US søknad nr. 10/153,334 med tittel "Peptides Effektive in the Treatment of Tuors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells, av 24. mai 2002.

Kreft er en abnormitet i en celles interne regulatoriske mekanismer som resulterer i ikke-regulert vekst og re-produksjon av cellen. Normale celler utgjør vev, og idet disse celler mister sine evner til å oppføre seg som en spesifisert, regulert og koordinert enhet (de-differensie-ring) vil skaden føre til et disarrangment i cellepopula-sjonen. Idet dette forekommer, dannes en tumor.

Benign overvekst av vev er abnormiteter hvor det er ønskelig å fjerne celler fra en organisme. Benigne tumorer er cellulære proliferasjoner som ikke metastatiserer gjennom kroppen, men som imidlertid forårsaker sykdomssymptomer. Slike tumorer kan være letale dersom de er lokalisert i utilgjengelige områder i organer så som i hjernen. Der er benigne tumorer av organer inkluderende lunge, hjerne, hud, hypofyse, thyroid, adrenal cortex og medulla, eggstokk, livmor, testikkel, bindevev, muskel, tarm, øre, nese, hals, mandler, munn, lever, galleblære, bukspyttkjertel, prostata, hjerte og andre organer.

Kirurgi er ofte det første trinn i behandlingen av cancer. Formålet med kirurgien varierer. Noen ganger anvendes den for å fjerne så mye som mulig av den åpenbare tumor, eller i det minste å «debulke» den (fjerne hovedmengden av tumoren slik at det er mindre behov for å behandle med andre metoder). Avhengig av cancertype og lokalisasjon kan kirurgi også gi noe symptomatisk lindring for pasienten. F.eks. dersom en kirurg kan fjerne en stor del av en ekspanderende hjernetumor, vil trykket på innsiden av hodeskallen bli redusert, noe som fører til forbedring i pasientens symptomer.

Ikke alle tumorer er medgjørlige for kirurgi. Noen kan være lokalisert i deler av kroppen som gjør det umulig å fjerne dem fullstendig. Eksempler på slike vil være tumorer i hjernestammen (en del av hjernen som kontrollerer pusting), eller en tumor som har vokst i og rundt et hovedblodkar. I disse tilfeller er funksjonen av kirurgi begrenset pga. den høye risiko assosiert med fjerning av tumor.

I noen tilfeller anvendes kirurgi ikke for å fjerne tumor-masse fordi det ganske enkelt ikke er nødvendig. Et eksempel er Hodgkin's lymfom, en cancertype i lymfenodene som responderer godt til kombinasjoner av kjemoterapi og bestrålingsterapi. I Hodgkin's lymfom er kirurgi sjelden nødvendig for å oppnå helbredelse, men anvendes omtrent alltid for å etablere en diagnose.

Kjemoterapi er en annen vanlig form for cancerbehandling som involverer anvendelsen av medisinering (vanligvis gitt gjennom munn eller injisering) som spesifikt angriper hurtig delende celler (så som de som finnes i en tumor) gjennom kroppen. Dette gjør kjemoterapi nyttig i behandling av cancer som allerede er metastasisert, og likeledes for tumorer som har en høy sannsynlighet for å spre seg gjennom blodet og lymfesystemet, men som ikke er fremkommet i tillegg til den primære tumor. Kjemoterapi kan også anvendes for å forsterke responsen av lokaliserte tumorer til kirurgi og bestrålingsterapi. Dette er f.eks. tilfellet for noen typer cancere i hodet og nakke.

Dessverre vil andre celler i den menneskelige kropp som normalt deles hurtig (så som ved foringen i mage og hår) også påvirkes av kjemoterapien. Av denne grunn vil mange kjemoterapeutiske midler indusere bieffekter så som kvalme, oppkast, anemi, hårtap og andre symptomer. Disse bi-effekter er temporære, og leger har medisineringer som kan tilveiebringe en lindring for mange av disse bi-effekter. Således vil generelt kjemoterapeutiske behandlinger bli godt tolerert av pasienter. Idet vår kunnskap har fortsatt å øke, har forskerne kommet frem til nye kjemoterapeutiske midler som ikke bare er bedre for å drepe cancerceller, men som også har færre bi-effekter for pasienten.

Kjemoterapi administreres til pasienten på en rekke forskjellige måter. Noen er piller og noen administreres ved intravenøs eller annen injisering. For injiserbar kjemoterapi går en pasient til legens kontor eller sykehus for behandling. Andre kjemoterapeutiske midler krever kontinuerlig infusjon inn i blodstrømmen, 24 t pr. dag. For disse typer kjemoterapi vil en mindre kirurgisk prosedyre utføres for å implantere en liten pumpe som bæres av pasienten. Pumpen administrerer deretter langsomt medisine-ringen. I mange tilfeller plasseres en permanent port i pasientens vene for å eliminere behovet for repeterende nålestikk.

Bestrålingsterapi er et annet vanlig våpen i kampen mot kreft. Bestråling dreper cancer ved å ødelegge DNA i tumorcellene. Bestrålingen «appliseres» på 2 forskjellige måter. Den mest vanlige involverer peking av en bestrålingsstråle til pasienten på en meget presis måte, fokusert på tumoren. For å utføre dette ligger pasienten på et bord og strålene beveges rundt ham/henne. Dette tar kun et par minutter, men kan utføres daglig i flere uker (avhengig av type tumor), for å oppnå en bestemt total foreskrevet «dosering».

En annen bestrålingsmetode som noen ganger benyttes som kalles «brachy-terapi», involverer at man tar radioaktive pelletter («såkorn») eller vaiere og implanterer disse inn i kroppen i området for tumoren. Disse implantater kan være temporære eller permanente. For permanente implantater vil bestrålingen i såkornene «avta» eller utslukkes over en periode på dager eller uker, slik at pasienten ikke er radioaktiv. For temporære implantater vil den fullstendige dose av bestråling vanligvis avgis på noen få dager, og pasienten må bli på sykehuset i løpet av denne tid. For begge typer «brachy-terapi», vil bestrålingen generelt avleveres til et svært målrettet område for å få lokal kontroll over en cancer (i motsatt fall til behandling av hele kroppen, som i tilfellet kjemoterapi).

Noen utvalgte pasienter kan behandles med benmargstransplantasjon. Denne prosedyre utføres vanligvis enten fordi en pasient har en cancer som er spesielt aggressiv, eller pga. at de har en cancer som viser tilbakefall etter å være behandlet med konvensjonell terapi. Benmargstransplantasjon er en komplisert prosedyre. Det er mange typer, og de varierer i sine potensialer for å forårsake bieffekter og helbredelse. Mange transplantasjoner utføres ved spesielle sentre, og i mange tilfeller vurderes deres anvendelse som forskningsmessig.

Ytterligere terapier eksisterer, selv om de fleste av disse for tiden utforskes i kliniske forsøk og er ikke blitt standard behandling. Eksempler inkluderer anvendelse av immunoterapi, monoklonale antistoff, anti-angiogenesefaktorer, og genterapi.

Immunoterapi: Forskjellige teknikker er blitt konstruert for å hjelpe pasientens eget immunsystem til å bekjempe mot cancer, noe som er ganske forskjellig fra bestråling eller kjemoterapi. For å oppnå et mål, injiserer forskerne ofte til pasienten en spesifikk avledet vaksine.

Monoklonale antistoff: Dette er antistoff som er konstruert for å angripe cancer-lignende celler (og ikke normale celler) ved å dra fordel av forskjellene mellom cancer-lignende og ikke-cancerceller i deres antigenisitet og/eller andre karakteristika. Antistoffene kan administreres til pasienten alene eller konjugert til forskjellige cytotoksiske forbindelser eller i radioaktiv form, slik at antistoffet fortrinnsvis går mot de canceraktige cellene, og dermed avgir de toksiske midler til de ønskede celler.

Anti-angiogenesefaktorer: Idet cancerceller hurtig deles og tumoren vokser, kan de fort vokse ut av deres blod-forsyning. For å kompensere for dette utskiller tumorene en forbindelse som er blitt vist å hjelpe med å indusere vekst av blodkar i deres nærhet, noe som sikrer at cancer-cellene får en kontinuerlig forsyning av næringsstoffer. Eksperimentelle terapier er blitt utviklet for å stoppe vekst av blodkar til tumorer.

Genterapi: Cancer er et produkt av en serie mutasjoner som til slutt fører til produksjonen av en cancercelle og dens utstrakte proliferasjon. Cancer kan behandles ved å introdusere gener til cancerceller som enten vil virke for å kontrollere eller stoppe cancerenes proliferasjon, slå på cellens programmerte cellemekanisme for å ødelegge cellen, forsterke immungjenkjennelsen av cellen, eller uttrykke et pro-medikament som omdannes til en toksisk metabolitt eller et cytokin som inhiberer tumorvekst.

Benigne tumorer og feilformasjoner kan også behandles med en rekke metoder inkluderende kirurgi, radioterapi, medikament-terapi, termale- eller elektriske ablasjoner, kryoterapi og andre. Selv om benigne tumorer ikke metastatiserer kan de vokse seg store, og de kan fremkomme på nytt. Kirurgisk ekstirpasjon av benigne tumorer har vanske-ligheter og bieffekter med kirurgi generelt, og må mange ganger repeteres for noen benigne tumorer, så som for ade-nomaer i hypofyse, meningeomaer i hjerne, prostatisk hyperplasi, og andre.

Andre tilstander involverer uønskede cellulære elementer hvor selektiv cellulær fjerning er ønskelig. For eksempel forårsakes hjertesykdommer og slag er vanligvis forårsaket av arterosclerose som er en proliferativ skade i fibrofett og modifiserte glatte muskelelementer som ødelegger blod-karveggen, innsmalner lumen, hemmer blodstrømmen, predispo-nerer for fokale blod-klotter, og til slutt fører til blokkering og infarkt. Forskjellige behandlinger for arteriosklerose inkluderer bypass-transplantanter; artifisielle transplantater, angioplasti med rekanali-sering, kyrretasje, bestråling, laser eller annen fjerning; farmakoterapi for å inhibere arterioskleriose gjennom lipidreduksjon; anti-klottingsterapier; og generelle forholdsregler med hensyn til diett, mosjon og livsstil. En metode for å fjerne ateroskleroseskader uten risiko og bieffekter forbundet med kirurgiske prosedyrer er nødvendig.

Andre eksempler på uønskede cellulære elementer hvor selektiv cellulær fjerning er ønskelig, inkluderer virul-indusert vekst, så som vorter. Et ytterligere eksempel er hypertrop inflammatoriske masse som finnes under betennelsestilstander, og hypertropiske arr eller keloider. Ytterligere eksempler finnes i en kosmetisk sammenheng så som fjerning av uønsket hår, f.eks. ansiktshår, eller for krymping av uønskede vevsarealer for kosmetiske formål, så som ansiktsdermis og bindevev, eller i dermis og bindevev i ekstremitetene.

Ytterligere eksempler vil være åpenbare for fagkyndige innen feltet ved å lese beskrivelsen heri. I alle, eller i de fleste av disse eksempler er det et behov for behandlinger som kan fjerne eller ødelegge de uønskete cellulære elementer uten risiki og bieffekter forbundet med konvensjonelle terapier, eller å fjerne de ønskede cellulære elementer med en større nøyaktighet.

Neurale trådproteiner (NTP) er en familie av nylig karak-teriserte proteiner fra hjerne. Ett medlem av denne familie, AD7c-NTP, er et ca. 41kD membran-assosiert fosfo-protein med funksjoner assosiert med neuritisk spiring (de la Monte et al., J'. Clin. Invest., vol 100, pp 3093-3104

(1997); de la Monte et al., Alz., Rep., vol 2, pp 327-332

(1999); S.M. de la Monte og J.R. Wands, Journal of Alzheimer' s Disease; vol 3, pp 345-353 (2001)). Genet som koder for AD7c-NTP og predikert proteinsekvens for AD7c-NTP er blitt identifisert og beskrevet (de la Monte et al., J. Clin. Invest., vol 100, pp 3093-3104 (1997)). I tillegg til de ca. 41kD-formene er andre former av neurale trådproteiner (ca. 26kD, ca. 21kD, ca. 17kD, og ca. 15 kD) blitt identifisert og assosiert med neuroektodermale tumorer, astrocytomaer og glioblastomaer og med skadet pga. hypoksi, schema, eller celebralt infarkt (Xu et al., Cancer Research, vol 53, pp 3823-3829 (1993), de la Monte et al., J. Neurolpathol. Exp. Neurol., vol 55(10), pp 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sei., vol 138(1-2), pp 26-35

(1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sei., vol 135(2), pp 118-25(1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., vol 100, pp 3093-3104 (1997); og de la Monte et al., Alz.,Rep., vol 2, pp 327-332(1999).

Former av neurale trådproteiner er blitt beskrevet og er gjort krav på i US-Patent Nr 5.948.634, 5.948.888 og 5.830.670, alle for «Neural trådprotein gen-ekspresjon og deteksjon av Alzheimer's Sykdom» og i US-Patent Nr 6.071.705 for «Fremgangsmåte for å detektere neurologisk sykdom eller dysfunksjon». Beskrivelsene i disse patenter inkorporeres spesifikt heri med henvisning i deres hele. Som beskrevet deri blir NTP oppregulert og produsert under celledød. Således beskrives døde og døende nerveceller som overproduserende av NTP, og således vil deres nærvær indi-kere død av nerveceller og start av Alzheimer's Sykdom

(AD) .

Andre former for neurale trådproteiner er blitt identifisert som andre produkter av AD7c-NTP-genet (f.eks. et 112 aminosyre protein beskrevet i NCBI Entrez-proteindatabasekatalog #XP_032307 PID gl5928971) eller å være lignende til neurale trådproteiner (f.eks. 106 aminosyre protein beskrevet i NCBI Entrez-proteindatabasekatalog #AAH14 951 PID g 15928971, et annet 106 aminosyre protein, beskrevet i NCBI Entrez-proteindatabasekatalog #XP_039102 PID gl8599339 og et 61 aminosyre protein beskrevet i NCBI Entrez-proteindatabasekatalog #AAH02534 PID gl2803421.

Neurale trådproteiner er assosiert med AD og NTP er oppreguleres i forbindelse med celledød i AD. AD7c-NTP mRNA oppreguleres i AD-hjerne sammenlignet med kontroller; AD7c-NTP-protein-nivåer i hjerne og i CSF er høyere i AD enn kontroller; og AD7c-NTP-immunoreaktivitet finnes i senile plaque, i neurofibrillære tangiler (NFT); i degene-rerende neuroner, neurofile tråder og dystropisk neurotiske spirer i AD og Down's Syndrom-hjerner (Ozturk et al., Proe. Natl. Acad. Sei. USA, vol 86, pp 419-423 (1989); de la Monte et al., J. Cl in. Invest. , vol 86(3) pp 1004-13 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sei., vol 113(2), pp 152-64

(1992); de la Monte et al., Ann. Neurol., vol 32(6) pp 733-42(1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., vol 55(10) pp 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sei., vol 138(1-2) pp 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sei., vol 135(2) pp 118-25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest. , vol 100, pp 3093-3104 (1997); og de la Monte et al., Alz., Rep., vol 2, pp 327-332

(1999)). NTP er lokalisert inne i celler, med fine prosesser innen neuropilen, eller er ekstracellulær både i AD og Down's Syndrom hjerner, de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992).

Forhøyete nivåer av AD7c-NTP-protein er blitt funnet både i CSF og urin i AD-pasienter (de la Monte og Wands, Front Biosci. vol 7, pp 989-96(2002); de la Monte og Wands, Journal of Alzheimer' s Disease, vol 3, pp 345-353(2001); Munzar et al., Alzheimer' s Reports vol 4, pp 61-65(2001); Kahle et al., Neurology, vol 54, pp 14 98-1504(2000) og Averback Neurology vol 55, p 1068(2000); Munzar et al., Alzheimer' s Reports vol 3, pp 155-159(2000); de la Monte et al., Alzheimer' s Reports vol 2, pp 327-332 (1999); Ghanbari et al., J. Clin. Lab. Anal. vol 12, pp 285-288(1998); Ghanbari et al., J. Clin. Lab. Anal., vol 12, pp 223-226(1998); Ghanbari et al., Journal of Contemporary Neurology (1998), vol 4A, pp 2-6, og de la Monte et al., J. Clin. Invest., vol 100, pp 3093-3104(1997).

Overuttrykking av NTP er også blitt koblet til prosessen med celledød i Alzheimer's Sykdom (de la Monte og Wands, J. Neuropatho., og Exp. Neuro., vol 60, ppl95-207 (2001); de la Monte og Wands, Cell Mol. Life Sei., vol 58, pp 844-49

(2001). AD7c-NTP er også blitt identifisert i Down's Syndrom-hjernevev (Wands et al., Internasjonal Patent-publikasjon Nr WO90/06993; de la Monte et al., J. Neurol. Sei., vol 135, pp 118-25(1996); de la Monte et al., Alz. Rep., vol 2, pp 327-332 (1999)). Noen bevis tyder på at overuttrykking av NTP også kan være assosiert med normal tensjonsglaukom (Golubnitschaja-Labudova et al., Curr. Eye Res., vol 21, pp 867-76 (2000)).

NTP er vist å være et effektivt middel for å forårsake celledød både in vitro i glioma og neuroblastomcellekul-turer og in vivo i normale muskelvev fra gnager, subkute-nøst bindevev og dermis, og i en rekke forskjellige tumorer av human- eller ikke-human opprinnelse, inkluderende bryst-karsinom, hudkarsinom og papilloma, tarmkarsinom, hjerne-gliom, og andre i gnagermodeller. Se US patentsøknad med nr 10/092,934, Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins, av 8. mars 2002.

Visse peptidsekvenser av AD7c-NTP ("ADtc-NTP-peptider") har også vist seg å være effektive midler for å forårsake celledød både in vitro i gliom og neuroblastom cellekulturer og/eller in vivo i normalt gnagermuskelvev, subkutanøst bindevev, dermis og annet vev. Se US patentsøknad med nummer 10/153,334 med tittel "Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells, av 24 mai 2002 .

US 5.948.888 A beskriver molekyler, som er avlette av neurale trådproteiner (NTP), for eksempel NTP-antisense-oligonukleotider, ribozymer eller NTP EGS, eller fragmenter av sådanne av NTP avlette molekyler. Disse avlette molekylene ellers fragmenter derav administreres med det formål at motvirke effekten av NTP.

De la Monte, S. M. et al., " Characterization of the AD7C-NTP cDNA Expression in Alzheimer' s Disease and Measurement of a 41- kD Protein in Cerebrospinal Fluid", J. Clin. Invest., vol. 100, No. 12, 1997, s. 3093-3104, beskriver et cDNA (betegnet AD7c-NTP), som uttrykkes i neuroner og overuttrykkes i hjerner med Alzheimers Sykdom, og som koder for et ca. 41 kD NTP-protein.

WO 9838204 Al beskriver transgene dyr og transfekterte cellelinjer som overuttrykker AD7c-NTP med molekylvekt 41.3 kD.

Der er et behov innen fagfeltet for nye mindre toksiske behandlinger for å behandle uønskete cellulære elementer. Den foreliggende oppfinnelse tilfredsstiller disse behov.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse involverer i deler oppdagelsen av at peptidsekvenser inneholdt i AD7c-NTP som oppfinnerne har funnet å være effektive midler for ødeleggelse eller fjerning av skadelige eller uønskete celler, og varianter og homologer derav, også finnes i andre proteiner i andre organismer, inkluderende mennesker og andre pattedyr. Straks en peptidsekvens har blitt oppdaget, kan disse proteiner finnes av en fagkyndig person innen fagfeltet gjennom anvendelse av et bredt spekter av tilgjengelige offentlige og kommersielle proteindatabaser så som the National Center Biotechnology Inforraation's Protein database og søkeprogrammer så som BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool). See Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schåffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lippman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.

En person som har ordinære fagkunnskaper innen feltet kan screene disse proteiner ved anvendelse av analysemetoder beskrevet heri for å bestemme deres effektivitet som midler for destruksjon eller fjerning av uønskete eller skadelige celler. En person med ordinær fagkunnskap, som har funnet en eller flere slike effektive midler, kan deretter bestemme hvilke deler av disse midler som inneholder sekvensene som er homologe med eller like til AD7c-NTP-peptidsekvensene beskrevet heri, eller beskrevet i US-patentsøknad med nr. 10/153.334, med tittel: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells, av 24. mai 2002, og at disse deler av disse midler syntetiseres ved anvendelse av fremgangsmåter kjent for fagkyndige, og tester de syntetiserte midler for deres effektivitet som midler for ødeleggelse eller fjerning av uønskete eller skadelige celler. Videre kan en person med ordinære fagkunnskaper også anvende aminosyresekvensene av alle slike proteiner funnet for å bestemme andre peptidsekvenser som ikke er lik til eller homolog med homolog med eller lik til AD7c-NTP-peptidsekvensene beskrevet heri, og beskrevet i US-patentsøknad med serienr. 10/153.334, med tittel: Peptides Effective in the Treatment of Tumors and Other Conditions Requiring the Removal or Destruction of Cells, av 24. mai 2002. Disse nye syntetiserte sekvenser kan deretter testes for deres effektivitet som midler for ødeleggelse eller fjerning av uønskete eller skadelige celler.

Oppfinnelsen angår et NTP-peptid, some erkarakterisert vedat det består av et peptid valgt fra gruppen som består av: SEQ ID NO. 10 (Pro-Gly-Phe-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg);

SEQ ID NO. 19 (Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg);

SEQ ID NO. 22 (Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-IIe-Leu-Phe-Phe-Leu);

SEQ ID NO. 23 (Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-IIe-Phe-Asn-Phe-Leu) ;

SEQ ID NO. 24 (Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe):

SEQ ID NO. 25 (Phe-IIe-Phe-Asn-Phe-Leu);

SEQ ID NO. 26 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-IIe-Thr-Gly-Met);

SEQ ID NO. 27 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met) and

SEQ ID NO. 28 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-lle-Thr-Gly-Val).

Videre angår oppfinnelsen et NTP-peptid som definert ovenfor til anvendelse som lekemiddel, samt et materiale som omfatter et NTP-peptid i samsvar med krav 1, og en bærer dertil.

Videre angår oppfinnelsen anvendelse av et NTP-peptid i samsvar med krav 1 til fremstilling av et medikament til behandling av en tilstand som krever fjerning eller destruksjon av celler valgt fra gruppen som består av en benign eller malign tumor i et vev; en hyperplasi, hypertrofi eller overvekst av vev; et viralt-, bakterielt-eller parasittisk forandret vev; en malformasjon av et vev; tonsilar hypertrofi; prostatisk hyperplasi; psoriasis; eksem; dermatose; en kosmetisk modificering av et vev; en vaskulær sykdom; hemoroider; varikøse vener; aterosklerose; arteriosklerose; inflammatorisk sykdom; autoimmun sykdom; metabolsk sykdom; arvet/genetisk sykdom; traumatisk sykdom eller fysisk skade; ernæringsmangelsykdom; infektiøs sykdom; amyloid sykdom; fibrosesykdom; lagringssykdom; kongenital malformasjon; enzym-mangelsykdom; forgiftning; intoksisering; miljøsykdom; bestrålingssykdom; endokrin sykdom; og degenerativ sykdom.

De oppfinneriske peptider eller proteiner

("celledødpeptid") kan administreres alene eller konjugert til en bærer eller et antistoff. Celledødpeptidet kan administreres intramuskulært, oralt, intravenøst, intraperiotenalt, intracerebralt, (intraparencymalt), intracerebroventrikulært, intratumoralt, intralesionalt, intradermalt, intratekalt, intranasalt, intraokulart, intraaterielt, topikalt, transdermalt, via en aerosol, infusjon, bolusinjisering, implanteringsanordning, system for forlenget frigivelse etc., enten alene eller konjugert til en bærer. Alternativt kan celledødpeptidet uttrykkes in

vivo ved å administrere et gen som uttrykker peptidet, ved å administrere en vaksine som inkluderer slik produksjon eller ved å introdusere celler, bakterier eller virus som uttrykker peptidet in vivo, enten på grunn av genetisk modifisering eller på annen måte.

I tillegg kan celledødpeptidet anvendes i kombinasjon med andre terapier for å behandle benigne og maligne tumorer og andre uønskete eller skadelige cellulære vekster.

Kort beskrivelse av figurene

Fig. 1: Viser den fullstendige aminosyresekvens og nukleinsyresekvens av AD7c-NTP genet og AD7c-NTP proteinproduktet av dette gen (sekvenser 120 og 121 fra US-patent nr. 5.830.670, 5.948.634 og 5.948.888; de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); NCBI Entrez-Protein Accessionf AAC08737; PID g3002527)[SEQ ID Fig. 2: Viser den fullstendige aminosyresekvens av det 122 aminosyre neurale trådprotein (sekvens 40 fra US-patent nr. 5.830.670, 5.948.634 og 5.948.888; NCBI Entrez-Protein Accessionf AAE25447 PID gl0048540)[SEQ ID NO. 2]. Fig. 3: Viser de fullstendige aminosyresekvenser av det 112 aminosyre neurale trådprotein (NCBI Entrez-Protein Accessionf XP_032307 PID gl5928971)[SEQ ID NO. 3]. Fig. 4: Viser de fullstendige aminosyresekvenser av et 106 aminosyre neuralt trådproteinlignende protein (NCBI Entrez-Protein Accessionf AAH14951 PID gl5928971)[SEQ ID NO. 4]. Fig. 5: Viser de fullstendige aminosyresekvenser av et 106 aminosyre neuralt trådproteinlignende protein (NCBI Entrez-Protein Accessionf XP_039102 PID gl8599339)[SEQ ID NO. 5]. Fig. 6: Viser de komplette aminosyresekvenser av det 98 aminosyre neurale trådprotein (Sekvens 30 fra US-patent nr. 5.830.670. 5.948.634 og 5.948.888; NCBI Entrez-Protein Accessionf AAE25445 PID gl0048538)[SEQ ID NO. 6]. Fig. 7: Viser de komplette aminosyresekvenser av det 75 aminosyre neurale trådprotein (Sekvens 48 fra US-patent nr. 5.830.670. 5.948.634 og 5.948.888; NCBI Entrez-Protein Accessionf AAE25448 PID gl0048541)[SEQ ID NO. 7]. Fig. 8: Viser de komplette aminosyresekvenser av det 68 aminosyre neurale trådprotein (Sekvens 36 fra US-patent nr. 5.830.670. 5.948.634 og 5.948.888; NCBI Entrez-Protein Accessionf AAE25446 PID gl0048539)[SEQ ID NO. 8]. Fig. 9: Viser de fullstendige aminosyresekvenser av det 61 aminosyre neurale trådproteinlignende protein (NCBI Entrez-Protein Accessionf AAH02534 PID gl2803421)[SEQ ID NO. 9].

Detaljert beskrivelse av foretrukne utførelser

Termer og fraser benyttet heri er definert som nedenfor med mindre annet er spesifisert.

Termen «AD7c-NTP» benevner det ca 41dD proteinet og nukleinsyresekvensen som koder for det beskrevet i de la Monte et al., J. Clin. Invest. , vol 100, pp 3093-104 (1997) i Sekvenser 120 og 121 i US-Patentsøknader med nr 5.948.634, 5.948.888 og 5.830.670 og i GenBank fAF010144, hvis nukleinsyre- og aminosyresekvenser er illustrert i Fig. 1. Termen «AD7C-NTP» inkluderer også biologisk aktive fragmenter, varianter, derivater, homologer og etterligninger av AD7C-NTP.

Termen «NTP» eller «neuralt trådprotein» angir generelt neurale trådproteiner og beslektede molekyler (inkluderende pankreatisk trådprotein) og nukleinsyresekvensene som koder for disse proteiner, og inkluderende (mon—ikko begrenset til) for eksempel de følgende proteiner og

nukleinsyresekvensene som koder for aminosyresekvensene for disse proteiner:

(a) AD7C-NTP; (b) de ca. 42, ca. 26, ca. 21, ca. 17, ca 14 og ca. 8 kD formene av det neurale trådprotein beskrevet i US-Patenter nr 5.948.634, 5.948.888, 5.830.670 og 6.071.705 og i de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., vol 55(10), pp 1038-50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sei., vol 138(1-2), vol 26-35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sei., vol 135(2), pp 118-25 (1996), de la Monte et al., J. Clin. Invest. , vol 100, pp 3093-3104 (1997) og de la Monte et al., Alz., Rep., vol 2, pp 327-332 (1999); (c) proteiner spesifikt gjenkjent av monoklonalt antistoff nr 2, deponert ved The American Type Culture Collection, Manassas, Va., under katalog nr. HB-12546 eller monoklonalt antistoff nr 5 deponert ved The American Type Culture Collection, Manassas, Va., under katalognr. HB-12545; (d) proteiner kodet for av AD7c-NTP-genet; (e) det 122 aminosyre neurale trådprotein beskrevet i Sekvens 40 fra US-Patent Nr 5.830.670, 5.948.634 og 5.948.888 og angitt i NCBI Entrez-protein-

katalog #AAE25447, PID gl0048540, hvis aminosyresekvenser er illustrert i Fig. 2;

(f) det 112 aminosyre neurale trådprotein angitt i NCBI Entrez-proteinkatalog #XP_032307, PID gl4725132, hvis aminosyresekvenser er illustrert

i Fig. 3;

(g) et 106 aminosyre neuralt trådproteinlignende protein angitt i NCBI Entrez-proteinkatalog #AAH14951 PID gl5928971, hvis aminosyresekvenser

er illustrert i Fig. 4;

(h) et 106 aminosyre neural trådproteinlignende protein angitt i NCBI Entrez-proteinkatalog #XP_039102 PID gl8599339, hvis aminosyresekvens

er illustrert i Fig. 5;

(i) det 98 aminosyre neurale trådprotein protein angitt i Sekvens 30 fra US-Patent Nr 5.830.670, 5.948.634 og 5.948.888 og angitt i NCBI Entrez-proteinkatalog #AAE25445, PID gl00448538, hvis aminosyresekvenser er illustrert

i Fig. 6;

(j) det 75 aminosyre neurale trådprotein beskrevet i Sekvens 48 fra US-Patent Nr 5.830.670, 5.948.634 og 5.948.888 og angitt i NCBI Entrez-proteinkatalog #AAE25448, PID gl00448541, hvis aminosyresekvenser er illustrert

i Fig. 7;

(k) det 68 aminosyre neurale trådprotein beskrevet i Sekvens 3 6 fra US-Patent Nr 5.830.670, 5.948.634 og 5.948.888 og angitt i NCBI Entrez-proteinkatalog #AAE25446, PID gl0048539, hvis aminosyresekvenser er illustrert

i Fig. 8;

(1) det 61 aminosyre neurale trådproteinlignende protein beskrevet i NCBI Entrez-proteinkatalog #AAH02534, PID gl2803421, hvis aminosyresekvenser er illustrert i Fig. 9; (m) pankreatisk trådprotein;

(n) det neurale pankreatiske trådprotein (nPTP) beskrevet i US-Patent Nr 6.071.705; og

(o) proteiner spesifikt gjenkjent av antistoffer produsert av et hybridom fra gruppen som består av HB9934, HB9935 og HB9936 deponert ved American Type Culture Collection.

Uttrykket "NTP-peptid" angir de følgende aminosyresekvenser av NTP: NTP- peptid# l [SEQ ID NO. 10], tilsvarende til AD7c-NTP p227-245 med innsettingen av en ytterligere fenylalaninenhet etter p228.

PGFFKLFSCPSLLSSWDYRR

Pro-Gyl-Phe-Phe-Lys-leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

korresponderende nukleinsyresekvens [SEQ ID NO. 10A]

NTP- peptid# 10 [SEQ ID NO. 19], AD7c-NTP p239-245 med tillegg av leusein og prolinenheter ved N-terminalen

LPSSWDYRR

Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg

korresponderende nukleinsyresekvens [SEQ ID NO. 19A]

CTCCCAGAGTAGCTGGGACTACAGGCGC

NTP- peptid# 13 [SEQ ID NO. 22], AD7c-NTP p239-245 + AD7c-NTP pl39-144

SSWDYRRFILFFL

Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Leu-Phe-Phe-Leu korresponderende nukleinsyresekvens [SEQ ID NO. 22A]

GAGTAGCTGGGACTACAGGCGCTTTATTTTATTTTTTTTA

NTP- peptid# 14 [SEQ ID NO. 23], AD7c-NTP p241-245 + AD7c-NTP pl97-202

WDYRRFIFNFL

Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu korresponderende nukleinsyresekvens [SEQ ID NO. 23A]

TGGGACTACAGGCGCTTTATTTTTAATTTTTTG

NTP- peptid# 15 [SEQ ID NO. 24], AD7c-NTP p297-302

FNFCLF

Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe

korresponderende nukleinsyresekvens [SEQ ID NO. 24A]

TTTAATTTTTGTTTGTTT

NTP- peptid# 16 [SEQ ID NO. 25], AD7c-NTP pl97-202

FIFNFL

Phe-Ile-Phe-Asn-Phe-Leu

korresponderende nukleinsyresekvens [SEQ ID NO. 25A]

TTTATTTTTAATTTTTTG

NTP- peptid# 17 [SEQ ID NO. 26], AD7c-NTP p31-43

PASASPVAGITGM

Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Met korresponderende nukleinsyresekvens [SEQ ID NO. 2 6A]

CCTGCCTCAGCCTCCCCAGTAGCTGGGATTACAGGCATG

NTP- peptid# 18 [SEQ ID NO. 27], AD7c-NTP pl75-187

PASASQVAGTKDM

Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met korresponderende nukleinsyresekvens [SEQ ID NO. 27A]

CCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGCTGGGACCAAAGACATG

NTP- peptid# 19 [SEQ ID NO. 28], AD7c-NTP p277-289

PASASQSAGITGV

Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-Ile-Thr-Gly-Val korresponderende nukleinsyresekvens [SEQ ID NO. 28A]

CCTGCCTCGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCGTG

Aminosyrer og aminosyreenheter beskrevet heri kan angis i samsvar med den aksepterte en- eller trebokstavskode gitt i

tabellen nedenfor.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et materiale omfattende NTP-peptider som definert ovenfor i denne oppfinnelsen.

Et NTP-protein eller NTP-peptid kan fremstilles i samsvar med kjente rekombinante DNA-teknologimetoder så som de som er angitt i Sambrook et al., ( Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. [1989] og/eller Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Green Pub-lishers Inc. and Wiley and Sons, N.Y. [1994].

Et gen eller cDNA som koder for et NTP-peptid kan f.eks. oppnås ved screening av et genomisk- eller -cDNA-bibliotek, eller ved PCR-mangfoldiggjøring. Prober eller primere som er nyttige for screening av biblioteket kan genereres basert på sekvensinformasjon fra andre kjente gener eller genfragmenter fra den samme eller beslektet familie av gener, så som f.eks. konserverte motiver som finnes i andre NTP-proteiner eller NTP-peptider. I tillegg, der hvor et gen som koder for et NTP-protein eller NTP-peptid er blitt identifisert fra én art, kan hele eller en del av dette genet anvendes som en probe for å identifisere homologe gener fra andre arter. Probene eller primerne kan anvendes for å screene cDNA-biblioteker fra forskjellige vevskilder antatt å uttrykke et NTP-peptid eller NTP-proteingen. Typisk vil betingelser med høy stringens benyttes for å screene for å minimere antallet av falske positiver oppnådd fra screeningen.

En annen måte å fremstille et gen som koder for et NTP-peptid er å benytte kjemisk syntese ved anvendelse av metoder som er godt kjent for fagkyndige, så som de som er beskrevet av Engels et al. ( Angew. Chem. Intl. Ed., vol 28, pp 716-734 [1989]. Disse metoder inkluderer, inter alia, fosfotriester, fosforamiditt, og H-fosfonatmetoder for nukleinsyresyntese. En foretrukket metode for slik kjemisk syntese er polymerstøttet syntese ved anvendelse av standard fosforamidittkjemi. Typisk vil DNA som koder for et NTP-peptid eller NTP-protein være flere 100 nukleotider langt. Nukleinsyrer større enn ca. 100 nukleotider kan syntetiseres som flere fragmenter ved anvendelse av disse metoder. Fragmentene kan deretter ligeres sammen for å danne full-lengde NTPpeptidet eller NTP-proteinet. Vanligvis vil DNA-fragmentet som koder for aminoterminus av proteinet ha en ATG, som koder for en metioninenhet. Denne metionon kan, eller kan ikke, foreligger på den modne form av NTP-proteinet eller NTP-peptidet, avhengig av om proteinet produsert i vertcellen er konstruert til å kunne utskilles fra cellen.

Genet, cDNA, eller fragment derav som koder for NTP-proteinet eller NTP-peptidet kan innsettes i en egnet eks-presjons- eller mangfoldiggjøringsvektor ved anvendelse av standard ligeringsteknikker. Vektoren velges typisk til å være funksjonell i den bestemte vertcelle som benyttes, (dvs. vektoren er kompatibel med vertcellemaskineriet slik at mangfoldiggjøring av genet og/eller ekspresjon av genet kan forekomme). Genet, cDNA eller fragment derav som koder for NTP-proteinet eller NTP-peptidet kan mangfoldiggjøres/ uttrykkes i prokaryoter, gjær, insekt ( baculovirus-systemer) og/eller eukaryote vertceller. Seleksjon av vertcellen vil avhenge delvis av om NTP-proteinet eller peptidet skal glykosileres og/eller fosforyleres. Dersom dette er tilfellet vil gjær, insekt eller mammalske vertceller være foretrukket.

Typisk vil vektorene anvendt i noen av vertcellene inneholde 5'-flankeringssekvens (også angitt som en promotor) og andre regulatoriske elementer og likeledes forsterker(e), et replikasjonsorigo-element, et tran-skripsjonstermineringselement, en komplett intronsekvens inneholdende en donor og et akseptorspleisesete, en signal-peptidsekvens, et ribosombindende sete-element, en poly-adenyleringssekvens, en polylinkerregion for innsetting av nukleinsyren som koder for polypeptidet som skal uttrykkes, og et selekterbart markørelement. Hver av disse elementer er diskutert nedenfor. Valgfritt kan vektoren inneholde en «markør»-sekvens, dvs. et oligonukleotidmolekyl lokalisert ved 5'- eller 3'-enden av NTP-protein eller NTP-peptid kodingssekvensen; oligonukleotidmolekylet som koder for polyHis (så som heksaHis), eller annen «markør», så som FLAG, HA (hemaglutinin influensavirus) eller mye hvorfor kommersielt tilgjengelig antistoff eksisterer. Denne markør fusjoneres typisk til polypeptidet ved ekspresjon fra polypeptidet, og kan fungere som middel for affinitetsrensning av NTP-proteinet eller NTP-peptidet fra vertcellen. Affinitetsrensning kan utføres f.eks. ved kolonnekromatografi ved anvendelse av antistoff mot tag'en som en affinitetsmatriks. Valgfritt kan tag'en deretter fjernes fra det rensede NTP-protein eller NTP-peptid på forskjellige måter så som ved anvendelse av visse peptidaser.

Det humane immunoglobulin «hengsel» og Fc-region kan enten fusjoneres ved N-terminus eller C-terminus i NTP-proteinet eller NTP-peptidet av fagkyndige. Det påfølgende Fc-fusjonsprotein kan renses ved anvendelse av en Protein A-affinitetskolonne. Fc er kjent for å utvise en lang farraa-kokinetisk halveringstid in vivo og proteiner fusjonert til Fc er funnet å utvise en vesentlig større halveringstid in vivo enn den ikke-fusjonerte motpart. Videre vil fusjon til Fc-regionen muliggjøre dimerisering/multimerisering av molekylet som kan være nyttig for bioaktiviteten til visse molekyler.

5'-flankeringssekvensen kan være homolog (dvs. fra den samme art og/eller stamme som vertcellen), heterolog

(dvs. fra en art som er forskjellig fra vertcelle-arten, eller -stammen), hybrid, dvs. en kombinasjon av 5'-flankeringssekvenser fra mer enn én kilde), syntetisk, eller det kan være det native NTP-protein eller NTP-peptidgen 5'-flankeringssekvens. Således kan kilden for 5'-flankeringssekvensen være enhver unicellulær prokaryotisk-eller eukaryotisk organisme, enhver vertebrat- eller invertebrat organisme, eller enhver plante, gitt at 5'-flankeringssekvensen er funksjonell i, og kan aktiveres av, vertcellemaskineriet.

5'-flankeringssekvensene som er nyttige i vektorer ifølge oppfinnelsen kan oppnås med enhver av flere metoder kjent innen fagfeltet. Typisk vil 5'-flankeringssekvensene som er nyttige heri, andre enn NTP-protein eller NTP-peptid genflankeringssekvensene, tidligere være identifisert ved kartlegging og/eller ved restriksjonsendonuklease-oppkutting, og kan således isoleres fra den egnede vevskilde ved anvendelse av egnede

restriksjonsendonukleaser. I noen tilfeller kan den fullstendige nukleotidsekvens av 5'-flankeringssekvensen være kjent. Her kan 5'-flankeringssekvensen syntetiseres ved anvendelse av metoder beskrevet ovenfor for nukleinsyresyntese eller kloning.

Der hvor hele eller kun en del av 5'-flankeringssekvensen er kjent, kan den oppnås ved anvendelse av PCR og/eller ved screening av et genomisk bibliotek med egnet oligonukleotid og/eller 5'-flankeringssekvensfragmenter fra den samme eller andre former.

Der hvor 5'-flankeringssekvensen ikke er kjent, kan et fragment av DNA som inneholder en 5'-flankeringssekvens isoleres fra en større del av DNA som kan inneholde f.eks. en kodesekvens eller et annet gen eller gener. Isolering kan utføres ved restriksjonsendonuklease-oppkutting ved anvendelse av én eller flere forsiktig selekterte enzymer for å isolere det egnede DNA-fragment. Etter oppkutting kan det ønskede fragment isoleres ved agarosegelrensing, Qiagen®-kolonne, eller andre metoder kjent for fagkyndige. Seleksjon av egnede enzymer for å utføre dette vil være åpenbare for fagkyndige innen feltet.

Replikasjonsorigoelementet er typisk en del av prokaryote ekspresjonsvektorer som er kommersielt tilgjengelige, og bevirker amplifisering av vektoren i en vertcelle. Amplifisering av vektoren til et bestemt kopi-antall kan, i noen tilfeller, være viktig for optimal ekspresjon av NTP-proteinet eller NTP-peptidet. Dersom den valgte vektor ikke inneholder et replikasjonsorigosete, kan det kjemisk syntetiseres et slikt sete basert på en kjent sekvens, og dette kan ligeres inn i vektoren. Transkripsjons-termineringselement er typisk lokalisert 3' i forhold til enden av NTP-protein- eller NTP-peptid-kodesekvensen og fungerer for å terminere transkripsjonen av NTP-proteinet, eller NTP-peptidet. Vanligvis er transkrip-sjonstermineringselementet i prokaryote celler et G-C-rikt fragment etterfulgt av en poly-T-sekvens. Idet elementet enkelt kan klones fra et bibliotek eller også innkjøpes kommersielt som en del av en vektor, kan det også enkelt syntetiseres ved anvendelse av metoder for nukleinsyresyntese, så som de som er beskrevet ovenfor.

Et selekterbart markørgenelement koder for et protein som er nødvendig for overlevelse og vekst av vertcellevekst i et selektivt dyrkningsmedium. Typisk seleksjonsmarkørgener koder for proteiner som (a) gir resistens mot antibiotika eller andre tok siner, f.eks. ampicillin, tetracyklin eller kanamycin for prokaryote vertceller, (b) komplemente auxotrofe mangler i cellen; eller (c) forsyning av kritiske næringsstoffer som ikke er tilgjengelige fra det komplekse medium. Foretrukne selekterbare markører er kanamycinresi-stensgen, ampicillin-resistensgen, og tetracyklin- r es is tensgen .

Ribosombindingselement, vanligvis benevnt Shine-Dal-garnosekvensen (prokaryote) eller Kozak-sekvensen (eukaryote) er vanligvis nødvendig for translasjonsinitie-ring av mRNA. Elementet er typisk lokalisert 3' i forhold til promotoren og 5' i forhold til kodesekvensen av NTP-proteinet eller NTP-peptidet som skal syntetiseres. Shine-Dalgarno-sekvensen varierer, men er typisk et polypurin (dvs. som har et høyt A-G-innhold). Mange Shine-Dalgarno-sekvenser er blitt identifisert, og hver av disse kan syntetiseres ved anvendelse av metoder angitt ovenfor, og angitt i en prokaryotisk vektor.

I de tilfeller hvor det er ønskelig for NTP-proteinet eller NTP-peptidet å skulle utskilles fra vertcellen, kan en signalsekvens anvendes for å dirigere NTP-proteinet eller NTP-peptidet ut av vertcellen hvor det syntetiseres, og den karboksy-terminale del av proteinet kan deleteres for å hindre membranforankring. Typisk er signalsekvensen posi-sjonert i koderegionen i NTP-protein/NTP-peptidgenet eller cDNA, eller direkte ved 5'-enden av NTP-protein/NTP-peptidgenkoderegionen. Mange signalsekvenser er blitt identifisert, og enhver av disse kan fungere i selekterte vertceller og anvendes i forbindelse med NTP-protein/NTP-peptidgenet eller cDNA. Derfor kan signalsekvensen være homolog eller heterolog til NTP-genet eller cDNA, og kan være homolog eller heterolog til NTP-protein/NTP-peptidgenet eller cDNA. I tillegg kan signalsekvensen kjemisk syntetiseres ved anvendelse av metoder anvendt ovenfor. I de fleste tilfeller vil sekresjon av polypeptidet fra vertcellen via nærvær av et signalpeptid resultere i fjerning av det aminoterminale metionin fra polypeptidet.

I mange tilfeller kan transkripsjon av NTP-protein/NTP-peptidgenet eller cDNA økes ved nærvær av én eller flere introner i vektoren; dette er spesielt tilfellet hvor NTP-proteinet eller NTP-peptidet produseres i eukaryote vertceller, spesielt mammalske vertceller. Intronene anvendt kan være naturlig forekommende innen NTP-genet, spesielt hvor genet anvendt er en full-lengde genomisk sekvens eller et fragment derav. Der hvor intronene ikke er naturlig forekommende i genet (som for de fleste cDNA'er), kan intron(er) oppnås fra en annen kilde. Posisjonen av intronet med hensyn til flankeringssekvens og NTP-protein/NTP-peptdigenet er generelt viktig, idet intronet må transkriberes for å være effektivt. Således, idet NTP-protein/NTP-peptidgenet innsettes inn i ekspresjonsvektoren er et cDNA-molekyl, vil den foretrukne posisjon for intronet være 3' i forhold til transkripsjonsstartsetet, og 5' i forhold til polyA-transkripsjonstermineringssekvensen. Fortrinnsvis for NTP-protein/NTP-peptid cDNA vil intron, eller introner være lokalisert ved én side eller på den andre side (dvs. 5' eller 3') av cDNA'en slik at den ikke påvirker dens kodesekvens. Ethvert intron fra enhver kilde, inkluderende virale, prokaryote og eukaryote (planter eller dyr) organismer, kan anvendes for å praktisere oppfinnelsen, gitt at det er kompatibelt med vertcellen hvori de skal innsettes. Også inkludert heri er syntetiske introner. Valgfritt kan mer enn ett intron anvendes i vektoren.

Der hvor ett eller flere av elementene angitt ovenfor ikke allerede er til stede i vektoren som skal anvendes, kan de oppnås individuelt og ligeres inn i vektoren. Metoder anvendt for å oppnå hvert av disse elementer er godt kjent for fagkyndige og er sammenlignbare til metoder angitt ovenfor (dvs. syntese av DNA'en, biblioteks-screening o . 1.) .

De finale vektorer anvendt for å praktisere denne oppfinnelse kan typisk konstrueres fra utgangsvektorer så som en kommersielt tilgjengelig vektor. Slike vektorer kan, eller trenger ikke, inneholde noen av elementene som skal inkluderes i den fullstendige vektor. Dersom ingen av de ønskede elementer foreligger i utgangsvektoren, kan hvert element individuelt ligeres inn i vektoren ved å kutte vektoren med egnede restriksjonsendonukleaser slik at endene til elementene kan ligeres inn, og hvor endene til vektoren er kompatible for ligering. I noen tilfeller kan det være nødvendig å «blunte» endene som skal ligeres sammen for å oppnå en tilfredsstillende ligering. Blunting utføres ved først å fylle inn «sticky ends» ved Klenow-DNA-polymerase, eller T4-DNA-polymerase av alle 4 nukleotider. Denne prosedyre er godt kjent innen fagfeltet og er beskrevet i Sambrook et al., supra. Alternativt kan to eller flere av elementene som skal innsettes i vektoren først ligeres sammen (dersom de skal posisjoneres tilgrensende i forhold til hverandre) og deretter ligeres inn i vektoren.

En annen metode for å konstruere vektoren er å utføre alle ligeringer av de forskjellige elementer samtidig i én reaksjonsblanding. Her vil mange nonsense eller ikke-funksjonelle vektorer generere pga. uhensiktsmessig lige-ering eller innsetting av elementene. Den funksjonelle vektor kan identifiseres og selekteres ved restriksjonsendonuklease-oppkutting.

Foretrukne vektorer for praktisering av oppfinnelsen er de som er kompatible med bakterielle celler, insektceller og mammalske vertceller. Slike vektorer inkluderer, inter alia, pCRII, pCR3, og pcDNA3.1 (Invitrogen Company, San Diego, Calif.), pBSII (Stratagene Company, La Jolla, Calif.), pET115b (Novagen, Madison, Wis.), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Calif.), pETL (BlueBacII; Invitrogen) og pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.).

Etter at vektoren er blitt konstruert og et nukleinsyre-molekyl som koder for fullengde eller trunktert NTP-protein eller NTP-peptid er blitt innsatt på egnet sete i vektoren, kan den komplette vektor innsettes i en egnet vertcelle for mangfoldiggjøring og/eller polypeptidekspresjon. Vertcellene kan være prokaryotiske vertceller (så som E. coli) eller eukaryotiske vertceller (så som gjærcelle, en insektcelle, eller en vertebratcelle). Vertcellen, idet den dyrkes under egnede betingelser, kan syntetisere NTP-protein eller NTP-peptid som deretter kan samles fra dyrkningsmedium (dersom vertcellen utskiller det i medium eller direkte fra vertcellen som produserer det (dersom det ikke utskilles).

Etter innsamling kan NTP-proteinet eller NTP-peptidet renses ved anvendelse av metoder så som molekylær siktkromatografi, affinitetskromatografi o.l. Seleksjon av vertcellen for NTP-protein- eller NTP-peptidproduksjon vil avhenge delvis av om NTP-proteinet eller NTP-peptidet skal glykosyleres eller fosforyleres (i hvilket tilfelle eukaryote vertceller er foretrukket), og på hvilken måte vertcellen er i stand til å «folde» proteinet til dets native tertiære struktur (f.eks. hensiktsmessig orientering av disulfidbroer, etc.) slik at biologisk aktivt protein fremstilles av NTP-proteinet eller NTP-peptidet som har biologisk aktivitet. NTP-proteinet eller NTP-peptidet kan «foldes» etter syntese ved anvendelse av egnede kjemiske betingelser som beskrevet nedenfor. Egnede celler eller cellelinjer kan være mammalske celler, så som eggstokk-celler fra kinesisk hamster (CHO), humane embryoniske nyre-celler (HEK)293 eller 293T-celler, eller 3T3-celler. Selek-sjonen av egnede mammalske vertceller og metoder for transformasjon, dyrkning, mangfoldiggjøring, screening og pro-duktproduksjon og rensing er kjent innen fagfeltet. Andre egnede mammalske cellelinjer er COS-1- og C0S-7-celle-linjene fra ape, og CV-l-cellelinjen. Ytterligere representative mammalske vertceller inkluderer primatcellelinjer og gnagercellelinjer, inkluderende transformerte cellelinjer. Normale diploide celler, celler som er avledet fra in vitro dyrkning av primærvev, og likeledes primære eksplantater, er også egnet. Kandidatceller kan genotypisk mangle seleksjonsgenet, eller kan inneholde et dominantvirkende seleksjonsgen. Andre egnede mammalske cellelinjer inkluderer, men er ikke begrenset til, neuroblastom N2A-celler fra mus, HeLa, mus L-929-celler, 3T3-linjer avledet fra Swiss, Balb-c eller NIH-mus, BHK- eller HaK-hamstercelle-linj er.

Tilsvarende nyttig som vertcellene egnet for foreliggende oppfinnelse er bakterielle celler. F.eks. de forskjellige stammer av E. coli (f.eks. HB101, DHS.alfa., DH10, og MC1061) er godt kjent som vertceller innen fagfeltet bio-teknologi. Forskjellige stammer av B. subtilis, Pseudomonas spp., andre Bacillus spp., Streptomyces spp., o.l., kan også benyttes i foreliggende fremgangsmåte. Mange stammer av gjærceller kjent for fagkyndige er også tilgjengelige som vertceller for ekspresjon av polypeptidene ifølge oppfinnelsen.

Videre, der det er ønskelig, kan insektcellesystemer benyttes i fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Slike sys-temer er f.eks. beskrevet i Kitts et al. ( Biotechniques, vol 14, pp 810-817 [1993], Lucklow { Curr . Opin . Biotechnol., vol 4, pp 564-572 [1993], and Lucklow et al. ( J. Virol., vol 67, pp 4566-4579 [1993]. Foretrukne insektceller er Sf-9 og Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.).

Innsetting (også benevnt som «transformasjon» eller «trans-feksjon») av vektoren inn i den selekterte vertcellen kan utføres ved anvendelse av metoder så som kalsiumklorid, elektroporering, mikroinjisering, lipofeksjon eller DEAE-dekstranmetoden. Den metode som velges vil delvis være en funksjon av typen vertcelle som skal anvendes. Disse metoder og andre egnede metoder er godt kjent for fagkyndige, som angitt, f.eks. i Sambrook et al., supra.

Vertcellene som inneholder vektoren (dvs. de transformerte eller transfekterte) kan dyrkes ved anvendelse av standard dyrkningsmedium som er kjent for fagkyndige. Mediet vil vanligvis inneholde alle næringsstoffer som er nødvendige for vekst og overlevelse av cellene. Egnet medium for dyrkning av E.coli-celler er f.eks. Luria Broth (LB) og/eller Terrific Broth (TB). Egnet medium for dyrkning av eukaryote celler er RPMI 1640, MEM, DMEM, og alle kan tilsettes serum og/eller vektfaktorer som er nødvendig for den bestemte cellelinje som skal dyrkes. Et egnet medium for insekt-kulturer er Grace's medium tilsatt gjærtolat, laktalbumin-hydrolysat og/eller føtalt kalveserum dersom nødvendig. Typisk tilsettes et antibiotikum eller andre forbindelser som er nyttige for selektiv vekst av de transformerte celler til mediet. Forbindelsen som skal anvendes vil dikteres av det selekterte markørelement som er til stede på plasmidet hvormed vertcellen ble transformert. F.eks. der hvor det selekterbare markørelement er kanamycinresis-tent kan forbindelsen som skal tilsettes til dyrknings-mediumet være kanamycin.

Mengden av NTP-protein eller NTP-peptid produsert i vertcellen kan bestemmes ved anvendelse av standardmetoder kjent innen fagfeltet. Slike metoder inkluderer, uten begrensning, Western-blot-analyse, SDS-polyakrylamidgel-elektroforese, ikke-denaturerende gel-elektroforese, HPLC-separasjon, massespektroskopi, immunpresipitering og/eller aktivitetsanalyser så som DNA-bindingsgelskiftanalyse.

Dersom NTP-proteinet eller NTP-peptidet er blitt konstruert for å kunne utskilles fra vertcellen, vil hovedandelen av NTP-proteinet eller peptidet kunne finnes i celledyrknings-mediet. Proteiner fremstilt på denne måte vil typisk ikke oppvise et aminoterminalt metionin, idet det er fjernet under utskilling fra cellen. Dersom NTP-proteinet eller NTP-peptidet ikke utskilles fra vertcellen, vil det imidlertid foreligge i cytoplasma og/eller i kjernen (for eukaryote vertceller) eller i cytosol (for gramnegative bakterielle vertceller) og kan ha et aminoterminalt metionin.

For NTP-protein eller NTP-peptid som er i vertcelle-cytoplasma og/eller kjerne, vil vertcellen typisk først ødelegges mekanisk eller med detergent for å frigi det intracellulære innhold til den bufrede løsning. NTP-protein eller NTP-peptid kan deretter isoleres fra denne løsning.

Rensing av NTP-protein eller NTP-peptid fra løsning kan ut-føres med en rekke kjente teknikker. Dersom proteinet er blitt syntetisert slik at det inneholder en markør (tag) så som heksaHistidin (NTP-protein/heksaHis) eller et annet mindre peptid så som FLAG (Sigma-Aldritch, St. Louis, MI) eller kalmodulin-bindende peptid (Stratagene, La Jolla, CA) enten ved dets karboksyl- eller aminoterminus, kan det i hovedsak renses i en en-trinnsprosess ved å passere løsningen gjennom en affinitetskolonne hvor kolonnematrisken har en høy affinitet for markøren eller for proteinet direkte (dvs. et monoklonalt antistoff som spesifikt gjenkjenner NTP-peptidet). F.eks. binder polyhistidin med stor affinitet og spesifisitet til nikkel, sink og kobolt; og således kan immobiliserte metallion-affinitetskromatografi som benytter en nikkel-basert affinitetsresin (som anvendt i Qiagen's Qia-X-press-system eller Invitrogeen's X-press-system) eller en kobolt-basert affinitetsresin (som anvendt i BD Bioscience-CLONTECH's Talon-system) anvendes for rensing av NTP-protein/polyHis.

(Se f.eks. Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Section 10.11.8, John Wiley & Sons, New York [1993]) .

Der hvor NTP-proteinet eller NTP-peptidet fremstilles uten en markør festet til, og ingen antistoff er tilgjengelige, kan andre godt kjente prosedyrer for rensing anvendes. Slike prosedyrer inkluderer, uten begrensning, ionebytte-kromatografi, hydroksyapatittkromatografi, hydrofobisk interaksjonskromatografi, molekylsiktkromatografi, HPLC, nativ gelelektroforese i kombinasjon med geneluering, og preparativ isoelektrisk fokusering («Isoprime»-maskin/ teknikk, Hoefer Scientific). I noen tilfeller kan 2 eller flere av disse teknikker kombineres for å oppnå økt renhet.

Dersom det antas at NTP-proteinet eller NTP-peptidet vil kunne finnes primært intracellulært, kan intracellulært materiale (inkluderende inklusjonslegemer for gram-negative bakterier) ekstraheres fra vertcellen ved anvendelse av enhver standard teknikk kjent for fagkyndige. F.eks. kan vertcellen lyseres for å frigi innholdet i periplasma/ cytoplasma med French press, homogenisering og/eller soni-kering etterfulgt av sentrifugering. Dersom NTP-proteinet eller NTP-peptidet har dannet inklusjonslegemer i cytosol, kan disse ofte binde til de indre og/eller ytre cellulære membraner og vil således primært finnes i pellett-materialet etter sentrifugering. Pellett-materialet kan deretter behandles med pH-ekstremiteter, eller med kaotropiske midler så som en detergent, guanidin, guanidinderivater, urea eller ureaderivater i nærvær av et reduserende middel så som ditiotreitol ved alkalisk pH eller triskarboksyetyl-fosfin ved sur pH for å frigjøre, bryte fra hverandre, og solubilisere inklusjonslegemene. NTP-proteinet eller NTP-peptidet er nå i løselig form og kan deretter analyseres ved anvendelse av gelelektroforese, immunoprecipitering o.l. Dersom det er ønskelig å isolere NTP-proteinet eller NTP-peptidet kan isolering utføres ved anvendelse av standardmetoder så som de som er angitt i Marston et al.

( Meth. Enz. , vol 182, pp 264-275 [1990].

I noen tilfeller kan NTP-proteinet eller NTP-peptidet ikke være i dets biologisk aktive form ved isolering. Forskjellige metoder for «refolding» eller omdannelse av polypeptidet til dets tertiære struktur og generere di-sulfidkoblinger kan anvendes for å gjenvinne biologisk aktivitet. Slike metoder inkluderer eksponering av det solubiliserte polypeptid til en pH vanligvis over 7 og i nærvær av en bestemt konsentrasjon av en kaotrop. Utvelg-else av kaotropen er svært tilsvarende som valget for inklusjonslegemets solubilisering, men vanligvis ved en lavere konsentrasjon, og det et er ikke nødvendig at den samme kaotrop anvendes for solubilisering. I de fleste tilfeller vil refolding/oksidasjonløsningen også inneholde et reduserende middel eller det reduserende middel pluss dets oksiderte form i et spesifikt forhold for å generere et bestemt redokspotensiale som muliggjør disulfid-shuffling til å forekomme i dannelsen av proteinenes cysteinbro(er). Noen av de vanlige anvende redokspar inkluderer cystein/ cystamin, glutation (GSH)/ditiobis GSH, kobberklorid, ditiotreitol (DTT)/ditian DTT, 2-merkaptoetanol (bME)/ditio-b-(ME). I mange tilfeller er et koløsemiddel nødvendig for å øke effektiviteten av refoldingen, og det mest vanlige reagens anvendt for dette formål inkluderer glyserol, polyetylenglykol av forskjellige molekylvekter, og arginin.

Dersom NTP-protein- eller NTP-peptid-inklusjonslegemer ikke dannes i vesentlig grad i vertcellen, vil NTP-proteinet eller NTP-peptidet primært finnes i supernatanten etter sentrifugering av cellehomogenatet, og NTP-proteinet eller NTP-peptidet kan isoleres fra supernatanten ved anvendelse av metodene så som de som er angitt nedenfor.

I de situasjoner hvor det er foretrukket å delvis eller fullstendig isolere NTP-proteinet eller NTP-peptidet kan rensing utføres ved anvendelse av standardmetoder godt kjent for fagkyndige. Slike metoder inkluderer, uten begrensning, separering ved elektroforese etterfulgt av elektro-eluering, forskjellige typer kromatografi (immuno-affinitet, molekylær sikt og/eller ionebytting), og/eller høytrykksvæskekromatografi. I noen tilfeller er det foretrukket å anvende mer enn én av disse metoder for fullstendig rensing.

I tillegg til preparering og rensing av NTP-protein og NTP-peptid ved anvendelse av rekombinante DNA-teknikker, kan NTP-proteinene eller NTP-peptidene og deres fragmenter, varianter, homologer og derivater fremstilt ved kjemiske syntesemetoder (så som fastfasepeptidsyntese) ved anvendelse av teknikker kjent innen fagfeltet, så som de som er angitt i Merrifield et al., ( J. Am. Chem. Soc, vol 85, p 2149[1985], and Stewart and Young ( Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III [1984]). Slike polypeptider kan syntetiseres med eller uten metionin på aminoterminus.

NTP-peptider og salter derav kan fremstilles ved anvendelse av konvensjonelle peptidsynteseteknikker kjent for fagkyndige. Disse teknikker inkluderer kjemiske koblingsmetoder (cf. E. Wunsch: «Methoden der organischen Chemie», Volume 15, Band 1+2, Synthese von Peptiden, Thime Verlag, Stuttgart(1974), og G. Barrany, R.B. Marrifield: «The Peptides», eds. E. Gross, J. Meienhofer, Volume 2, Chapter 1, pp 1-284, Academic Press(1980)), enzymatiske koblingsmetoder (cf. F. Widmer, J.T. Johansen, Carlsberg Res.Commun., Vol 44, pp 37-46 (1979)), og W. Kullmann: «Enzymatic Peptide Synthesis», CRC Press Inc. Boca Raton, Fla. (1987), og F. Widmer, J.T. Johansen i «Synthetic Peptides in Biology and Medicines; eds. K. Alitalo, P. Partanen, A. Varieri, pp 79-86, Elsevier, Amsterdam (1985), eller en kombinasjon av kjemiske og enzymatiske metoder dersom dette er fordelaktig for prosessdesign og økonomi.

Den foreliggende oppfinnelse muliggjør nye fremgangsmåter for å behandle tilstander som krever fjerning av celler, så som benigne og maligne tumorer, glandulære (f.eks. prostata) hyperplasi, uønsket ansiktshår, vorter, uønsket fettvev. En slik metode omfatter administrering til et pattedyr i behov av behandling en terapeutisk effektiv mengde av NTP-peptid.

Tilstanden kan f.eks. være tumorer i lunge, bryst, mage, pankreas, prostata, blære, ben, eggstokk, hud, nyre, sinus, tarm, tynntarm, mage, rektum, esofagus, blod, hjerne og dens omslutninger, ryggmarg og dens omslutninger, muskel, bindevev, adrenal, parathyroid, thyroid, livmor, testis, hypofyse, reproduktive organer, lever, galleblære, øye, øre, nese, hals, mandler, munn, lymfenoder og lymfesystem (for eksempel lymfoid vev), og andre organer.

Som anvendt heri er termen «malign tumor» tiltenkt å omfatte alle former for humane karsinomer, sarkomer og melanomer som forekommer i svakt differensierte, moderat differensierte og godt differensierte former.

Oppfinnelsen tilfredsstiller et behov innen fagfeltet for behandlinger som kan fjerne benigne tumorer med mindre risiko, og færre av de uønskede bieffekter som er forbundet med kirurgi. En fremgangsmåte for å fjerne benigne tumorer i kirurgisk farlige områder så som i dype lokalisasjoner i kroppen (f.eks. hjerne, hjerte, lunge og andre) er spesielt nødvendig.

Fremgangsmåten for å behandle tilstandene hvor celler må fjernes kan anvendes i forbindelse med konvensjonelle metoder for behandling av slike situasjoner så som kirurgiske utsnitt, kjemoterapi og bestråling. NTP-peptider kan administreres før, under og etter slike konvensjonelle behandlinger .

Tilstanden som skal behandles kan også være hyperplasi, hypertrofi, eller overvekst av et vev valgt fra gruppen som består av lunge, bryst, mage, pankreas, prostata, blære, ben, eggstokk, hud, nyre, sinus, tarm, tynntarm, mage, rektum, esofagus, hjerne og dens omslutninger, ryggmarg og dens omslutninger, muskel, bindevev, adrenal, parathyroid, thyroid, livmor, testis, hypofyse, reproduktive organer, lever, galleblære, øye, øre, nese, hals, mandler, munn og lymfenoder og lymfesystem.

En annen tilstand som kan behandles ved anvendelse av peptidene_ifølge oppfinnelsen, men er ikke begrenset til, er et viralt-, bakteriologisk- eller parasittisk forandret vev valgt fra gruppen som består av lunge, bryst, mage, pankreas, prostata, blære, ben, eggstokk, hud, nyre, sinus, tarm, tynntarm, mage, rektum, esofagus, hjerne og dens omslutninger, ryggmarg og dens omslutninger, muskel, bindevev, adrenal, parathyroid, thyroid, livmor, testis, hypofyse, reproduktive organer, lever, galleblære, øye, øre, nese, hals, mandler, munn og lymfenoder og lymfesystem.

Betingelsen som skal behandles kan også være en malformasjon eller forstyrrelse av et vev valgt fra gruppen som består av lunge, bryst, mage, pankreas, prostata, blære, ben, eggstokk, hud, nyre, sinus, tarm, tynntarm, mage, rektum, esofagus, hjerne og dens omslutninger, ryggmarg og dens omslutninger, muskel, bindevev, adrenal, parathyroid, thyroid, livmor, testis, hypofyse, reproduktive organer, lever, galleblære, øye, øre, nese, hals, mandler, munn og lymfenoder og lymfesystem.

Nærmere bestemt kan situasjonen som skal behandles være tonsillar hypertrofi, prostatisk hyperplasi, psoriasis, eksem, dermatose og hemorroider. Betingelsen som skal behandles kan være en vaskulær sykdom, så som aterosklerose eller arteriosklerose, eller en vaskulær sykdom så som varikose vener. Betingelsen som skal behandles kan også være en kosmetisk modifisering i et vev, så som hud, øye, øre, nese, hals, munn, muskel, bindevev, hår eller brystvev.

Terapeutiske materialer med de ovenfor definerte NTP-peptider er innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse. Slike materialer kan omfatte en teraueptisk effektiv mengde av et NTP-peptid i samblanding med en farmasøytisk akseptabel bærer. Bærematerialet kan være vann for injisering, fortrinnsvis tilsatt andre materialer som er vanlige i løsninger for administrering til pattedyr. Typisk vil et NTP-peptid for terapeutisk anvendelse administreres i form av et materiale som omfatter renset NTP-peptid sammen med én eller flere fysiologisk akseptable bærere, eksipienter eller fortynningsstoffer. Nøytralt bufret saltløsning eller saltløsning blandet med serumalbumin er representative egnede bærere. Fortrinnsvis formuleres produktet som et lyofilisat ved anvendelse av egnede eksipienter (f.eks. sukrose). Andre standardbærere, fortynningsmidler og eksipienter kan inkluderes dersom ønskelig. Materialene omfatter buffere kjent for fagkyndige med et egnet pH-verdiområde, inkluderende Tris-buffer av ca. pH 7,0-8,5 eller acetatbuffer av ca. pH 4,0-5,5, som videre kan inkludere sorbitol eller et egnet substitutt derfor.

Anvendelsen av NTP-peptidene konjugert, bundet eller koblet til et antistoff, antistoff-fragment, antistofflignende molekyl, eller et molekyl med en høy affinitet til en spesifikk tumormarkør, så som en cellulær reseptor, signalpeptid eller over-uttrykt enzym, for å målrette til de uønskede cellulære elementer er også omfattet innenfor rammen av oppfinnelsen. Antistoffet, antistoff-fragmentet, antistofflignende molekyl, eller molekyl med en høy affinitet til en spesifikk tumormarkør anvendes for å målrette NTP-peptidkonjugatet til et spesifikt cellulært- eller vevsmål. F.eks. kan en tumor med et distinktivt overflate-antigen eller uttrykt antigen målrettes med antistoffet, antistoff-fragmentet, antistofflignende bindende molekyl og tumorcellene kan drepes av NTP-peptidet. En slik løsning som anvender antistoffmålretting har anticiperte fordeler for å redusere dosering, øke sannsynligheten for binding og opptak til målcellene, og øke nytteverdier for målretting og behandling av metastatiske tumorer og tumorer av mikro-skopisk størrelse.

Foreliggende oppfinnelse muliggjør også anvendelse av NTP-peptidene konjugert eller bundet eller koblet til et protein eller annet molekyl for å danne et materiale som, ved spalting ved eller nær sete(r) av tumoren eller de andre uønskede celler av et tumor- eller setespesifikt enzym eller protease, eller av et antistoffkonjugat som målretter tumoren eller andre uønskede celler, frigjør NTP-peptidet ved, eller nær sete(ne) av tumoren eller de andre uønskede celler.

Oppfinnelsen muliggjør også anvendelse av NTP-peptidene konjugert eller koblet eller bundet til et protein eller annet molekyl for å danne et materiale som frigjør NTP-peptidet eller et biologisk aktivt fragment av NTP-peptidet ved eksponering av vevet som skal behandles til lys (som i laserterapier eller andre fotodynamiske eller fotoaktiverte terapier), andre former for elektromagnetisk bestråling så som infrarød bestråling, ultrafiolett bestråling, røntgen eller gammabestråling, lokalisert varme, alfa- eller beta-bestråling, ultralydsemisjoner eller andre kilder for lokalisert energi.

NTP-peptidene kan benyttes alene, sammen eller i kombinasjon med andre farmasøytiske materialer, så som cyto-kiner, vektfaktorer, antibiotika, apoptoseinduserende midler, anti-inflammatoriske midler og/eller kjemoterapeutiske midler som er egnet for den indikasjon som behandles.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også terapeutiske materialer av NTP-peptider som benytter dendrimerer, fullerener og andre syntetiske molekyler, polymerer og makromolekyler hvor NTP-peptidet og/eller dets korresponderende DNA-molekyl er konjugert med, festet til, eller omsluttet i molekylet, polymer eller makromolekyl, enten ved seg selv eller sammen med andre former av molekylet så som en tumorspesifikk markør. F.eks. tilveiebringer US Patent Nr 5.714.166, Bioactive and/ or Targeted Dendimer Conjugates, en fremgangsmåte for å fremstille og anvende, inter alia, dendrittiske polymerkonjugater sammensatt av minst én dendrimer med en måldirektor(er) og minst ett aktivt middel konjugert til dette.

Oppfinnelsen vedrører også terapeutiske materialer av NTP-peptider og/eller gener og medikamentavgivelsesvehikler så som lipidemulsjoner, micelle-polymerer, polymermikro-sfærer, elektroaktive polymerer, hydrogeler og liposomer.

Faste doseringsformer for oral administrering inkluderer, men er ikke begrenset til, kapsler, tabletter, piller, pulvere og granuler. I slike faststoffdoseringsformer samblandes den aktive forbindelse med minst én av følgende: (a) én eller flere inerte eksipienter eller bærere, så som natriumcitrat eller dikalsiumfosfat; (b) fyllstoff eller ekstendere, så som stivelser,

laktose, sukrose, glukose, mannitol og silisisk syre;

(c ) bindingsstoff så som karboksymetylcellulose,

alginater, gelatin, polyvinylpyrrolidon, sukrose og akacia;

(d) humektanter, så som glyserol,

(e) desintegrerende midler så som agar-agar, kalsiumkarbonat, potet- eller tapiokastivelse, alginisk syre, visse komplekse silikater og natriumkarbonat; (f) løsningshemmere så som parafin; (g) absorpsjonsakseleratorer så som kvaternære ammoniumforbindelser; (h) fuktmidler så som acetylalkohol og glyserol monostearat; (i) adsorbenter, så som kaolin og bentonitt; og (j) smøremidler så som talk, kalsiumstearat,

magnesiumstearat, faststoff polyetylenglykoler, natriumlaurylsulfat eller blandinger derav.

For kapsler, tabletter og piller kan doseringsformene også omfatte buffermidler.

Væskeformige doseringsformer for oral administrering inkluderer farmasøytisk akseptable emulsjoner, løsninger, suspensjoner, siruper og eliksirer. I tillegg til de aktive forbindelser kan væskedoseringsformene omfatte inerte fortynningsmidler som vanligvis anvendes innen fagfeltet, så som vann eller andre løsemidler, solubiliserende midler og emulsifiserende midler. Eksempler på emulsifiserende midler er etylalkohol, isopropylalkohol, etylkarbonat, etylacetat, benzylalkohol, benzylbenzoat, propylenglykol, 1,3-butylen-glykol, dimetylformamid, oljer, så som bomullsfrøolje, jordnøttolje, hvetefrøolje, olivenolje, castorolje, sesam-olje, glyserol, tetrahydrofurfurylalkohol, polyetylenglykoler, fettsyreestere av sorbitan, eller blandinger av disse substanser, o.l.

I tillegg til slike inerte fortynningsmidler kan materialene også inkludere adjuvanser, så som fuktmidler, emulsifiserende- og suspenderende midler, søtningsmidler, smakstilsetningsmidler og luktmidler.

Aktuelle doseringsnivåer av aktive ingredienser i materialene ifølge oppfinnelsen kan varieres for å oppnå en terapeutisk effektiv mengde av NTP-peptidet som er effektivt for å oppnå en ønsket terapeutisk respons for et bestemt materiale og fremgangsmåte for administrering. De valgte doseringsnivåer avhenger derfor av den ønskede terapeutiske effekt, administrasjonsrute, den ønskede varighet av behandlingen, størrelsen på individet eller dyret som behandles, og andre faktorer.

For pattedyr, inkluderende mennesker, kan de effektive mengder administreres på basis av kroppsoverflateområdet. Forholdstall for doseringer for dyr av forskjellig stør-relse, species og mennesker (basert på mg/M<2->kroppsover-flate) er beskrevet i E.J. Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., vol 50(4), p 219 (1966)). Kroppsoverflate-areal kan omtrentlig bestemmes fra høyde og vekt av et individ (se f.eks. Scientific Tables, Geigy Pharmaceuti-cals, Ardsley, N.Y., pp 537-538 (1970)).

Den totale daglige dosering av NTP-peptidet administrert til en vert kan være i en enkelt eller delte doseringer. Doseringsenhetsmaterialet kan inneholde slike mengder av slike underdeler derav nødvendig for å utgjøre en daglig dosering. Det skal imidlertid forstås at det spesifikke doseringsnivå for enhver bestemt pasient vil avhenge av en rekke faktorer, inkluderende kroppsvekt, generelle helse, kjønn, diett, tid og rute for administrering, potensen til det administrerte medikament, absorpsjons- og utskillelses-hastigheter, kombinasjon med andre medikamenter og alvor-ligheten av den bestemte sykdom som behandles.

En fremgangsmåte for å administrere et NTP-peptidmateriale i samsvar med foreliggende oppfinnelse inkluderer, men er ikke begrenset til, administrering av forbindelsene intramuskulært, oralt, intravenøst, intraperitonealt, intracerebralt (intraparenkymalt), intracerebroventrikulært, intratumoralt, intralesjonalt, intradermalt, intratekalt, intranasalt, intraokulart, intra-arterielt, topikalt, transdermalt, via en aerosol, infusjon, bolusinjeksjon, implanteringsanordning, system for forlenget frigivelse, etc.

En annen metode for administrering av et NTP-peptid ifølge oppfinnelsen er ved en transdermal eller transkutenøs rute. Ett eksempel på en slik utførelse er anvendelsen av en lapp (patch). Fortrinnsvis kan en lapp fremstilles med en fin suspensjon av NTP-peptid i f.eks. dimetylsulfoksid (DMSO), eller en blanding av DMSO med bomullsfrøolje og brakt inn i kontakt med huden til det tumorbærende pattedyr i en avstand fra tumorlokaliseringssetet på innsiden av en hudlomme. Andre medier eller blandinger derav med andre løsemidler og faststoffstøttemedia vil også virke. Lappen kan inneholde NTP-peptidforbindelsen i form av en løsning eller en suspensjon. Lappen kan deres appliseres til huden til pasienten f.eks. ved å innsette den i en hudlomme til pasienten dannet av folding eller holding av huden sammen ved hjelp av sting, klips eller andre holdeanordninger. Lommen kan benyttes på en slik måte at man får kontinuerlig kontakt med huden, uten innblanding fra pattedyret. I tillegg til å anvende en hudlomme kan enhver anordning anvendes som sikrer en god plassering av lappen i kontakt med huden. F.eks. kan en adhesiv bandasje anvendes for å holde lappen på plass på huden.

NTP-peptidet kan administreres i en formulering eller pre-parat for forlenget frigivelse. Egnede eksempler på forlenget frigivelsespreparater inkluderer semipermeable polymermatriser i form av formede artikler, f.eks. filmer eller mikrokapsler. Forlengede frigivelsesmatriser inkluderer polyestere, hydrogeler, polyaktider (US-Patent Nr 3.773.919, EP Nr 58.481), kopolymerer av L-glutaminsyre og gammaetyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, vol 22, pp 547-556 [1983]), poly(2-hydroksyetyl-metakrylat)(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., vol 15, pp 167-277 [1981] og Langer, Chem. Tech. , vol 12, pp 98-105 [1982]) etylenvinyl-acetat (Langer et al., supra) eller poly-D-(-)-3-hydroksy-smørsyre (EP Nr 133.988). Forlengde frigivelsesmaterialer kan også inkludere liposomer, som kan fremstilles med enhver kjent fremgangsmåte innen fagfeltet (f.eks. Eppstein et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, vol 82, pp 3688-3692

[1985]; EP Nr 36.676; EP Nr 88.046; og EP Nr 143.949).

En annen metode for å administrere et NTP-peptid ifølge oppfinnelsen er ved direkte eller indirekte infusjon av NTP-peptidet inn i tumor eller annet vev som skal behandles. Ett eksempel på en slik utførelse er direkte injisering av NTP-peptidet inn i tumoren eller annet vev som skal behandles. Behandlingen kan bestå av én enkelt injisering, av multiple injiseringer på ett sted, eller en serie injiseringer over en periode på timer, dager eller måneder med regresjon, eller destruksjon av tumoren eller annet vev som skal behandles monitoreres ved hjelp av biopsi, imaging eller andre metoder for å monitorere vevs-vekst. Injiseringen inn i tumoren eller annet vev som skal behandles, kan være ved hjelp av en anordning innsatt i en åpning så som nese, munn, øre, vagina, rektum eller urinrør eller gjennom et innsnitt for å nå tumoren eller vevet in vivo og kan utføres i forbindelse med et image eller optisk system så som ultralyd eller fiberoptisk virkefelt for å identifisere det egnede sted for injisering(ene). Et annet eksempel på en slik utførelse er anvendelsen av en anordning som kan tilveiebringe en konstant infusjon av NTP-peptid til vevet over tid.

En annen metode for å administrere et NTP-peptid ifølge oppfinnelsen er i forbindelse med en kirurgisk eller tilsvarende metode benyttet for fysisk å fjerne, ablatere eller på annen måte drepe eller ødelegge tumor eller annet vev eller cellulære elementer nødvendig eller ønskelig for å fjerne eller ødelegge, hvor et NTP-peptid ifølge oppfinnelsen administreres til det umiddelbare området som omgir områdene hvor tumoren eller vevet ble fjernet for å ødelegge eller nedsette veksten av alle tumorceller eller andre cellulære elementer som ikke er fjernet eller ødelagt med prosedyren.

En annen metode for å administrere et NTP-peptid ifølge oppfinnelsen er ved implantering av en anordning innen tumoren eller det andre vev som skal behandles. Et eksempel på en slik utførelse er implanteringen av et oblat inneholdende NTP-peptid i tumoren eller det annet vev som skal behandles. Oblatet frigjør en terapeutisk dosering av NTP-peptid inn i vevet over tid. Alternativt, eller i tillegg kan materialet administreres lokalt via implantering til området som er angrepet i en membran, svamp eller annet egnet materiale hvorpå NTP-peptidet er blitt absorbert. Dersom det anvendes en implanteringsanordning kan anordningen være implantert inn i et egnet vev eller organ, og avgivelse av NTP-peptidet kan være direkte gjennom anordningen via bolus, eller via kontinuerlig admini strering, eller via kateter ved anvendelse av kontinuerlig infusjon.

De påfølgende eksempler er gitt for å illustrere foreliggende oppfinnelse. Det skal imidlertid forstås at oppfinnelsen ikke er begrenset til de spesifikke tilstander eller detaljer beskrevet i disse eksempler.

Eksempel 1

Formålet med dette eksempel var å bestemme effekten av NTP-peptid #14 på vev ved injeksjonsstedene.

Fire normale rotter ble injisert i huden og subkutanøst, hver i fire forskjellige foki, og i ekstrem skjellettmuskel, hver i to forskjellige foki, med NTP-peptid #14 i saltløsning i mengder av 100-400 ml i konstruksjoner av 0,1-1 mg/ml avlevert fra plastsprøyter gjennom nålespiss 26 i rustfritt stål.

Dyrene ble observert i 24 timer og smertefritt ofret ved den 24. timen. De individuelle foki av infiltrering ble utkuttet, fiksert i 10 % formalin, neddykket i parafin, og farget og undersøkt med standard histopatalogiske metoder.

Kontrollene mottok kun saltløsning.

Resultater: Injeksjon av NTP-peptid #14 produserte celledød og nekrose av vev ved injeksjonsstedene. Tilsvarende til eksempel 1 forelå celledøden i muskelvev, subkutanøst bindevev, og dermis ved stedene hvor NTP-peptid #14 var inj isert.

Bortsett fra milde områder med inflammasjon, viste kontrollene minimale bevis på nekrose eller celletap. Kontrollinjeksjoner hadde milde til minimale akuttbetennelse ved injeksjonsstedene og av og til fokale mikrohemorasjer fra nålene.

Eksempel 2

Formålet med dette eksempel var å bestemme effekten av NTP-peptid #17 på vev ved injiseringsstedene.

Fire rotter ble anestetisert med eter og gitt NTP-peptid #17 ved intraprostatisk infusjon. Injeksjonene bestod av 300 ul NTP-peptid #17 1 mg/ml i PBS pH 7,4 (1,0 mg/kg). Kontrollene mottok injiseringer av PBS alene eller ingen injeksjon. Rottene ble smertefritt ofret etter 72 timer. Prostatakjertler ble dissekert, fiksert i 10 % bufret formalin i 24 timer, neddykket i parafin, seksjonert og farget med H&E. For hvert dyr ble hele prostatakjertelen neddykket og seksjonert. Alle fargete seksjoner ble undersøkt histologisk.

Resultater: Injisering av NTP-peptid #17 produserte signifikant celletap og antropi i prostata ved 72 timer. Kontrollene viste minimal eller fraværende forandringer, i samsvar med milde fokale inflammasjon fra nålene.

Claims (4)

1. NTP-peptid,karakterisert vedat det består av et peptid valgt fra gruppen som består av: SEQ ID NO. 10 (Pro-Gly-Phe-Phe-Lys-Leu-Phe-Ser-Cys-Pro-Ser-Leu-Leu-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg); SEQ ID NO. 19 (Leu-Pro-Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg); SEQ ID NO. 22 (Ser-Ser-Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-IIe-Leu-Phe-Phe-Leu); SEQ ID NO. 23 (Trp-Asp-Tyr-Arg-Arg-Phe-IIe-Phe-Asn-Phe-Leu) ; SEQ ID NO. 24 (Phe-Asn-Phe-Cys-Leu-Phe): SEQ ID NO. 25 (Phe-IIe-Phe-Asn-Phe-Leu); SEQ ID NO. 26 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Pro-Val-Ala-Gly-IIe-Thr-Gly-Met); SEQ ID NO. 27 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Val-Ala-Gly-Thr-Lys-Asp-Met) and SEQ ID NO. 28 (Pro-Ala-Ser-Ala-Ser-Gln-Ser-Ala-Gly-lle-Thr-Gly-Val).

2. NTP-peptid i samsvar med krav 1 til anvendelse som lekemiddel.

3. Materiale,karakterisert vedat det omfatter et NTP-peptid i samsvar med krav 1, og en bærer dertil.

4. Anvendelse av et NTP-peptid i samsvar med krav 1 til fremstilling av et medikament til behandling av en tilstand som krever fjerning eller destruksjon av celler valgt fra gruppen som består av en benign eller malign tumor i et vev; en hyperplasi, hypertrofi eller overvekst av vev; et viralt-, bakterielt- eller parasittisk forandret vev; en malformasjon av et vev; tonsilar hypertrofi; prostatisk hyperplasi; psoriasis; eksem; dermatose; en kosmetisk modificering av et vev; en vaskulær sykdom; hemoroider; varikøse vener; aterosklerose; arteriosklerose; inflammatorisk sykdom; autoimmun sykdom; metabolsk sykdom; arvet/genetisk sykdom; traumatisk sykdom eller fysisk skade; ernæringsmangelsykdom; infektiøs sykdom; amyloid sykdom; fibrosesykdom; lagringssykdom; kongenital malformasjon; enzym-mangelsykdom; forgiftning; intoksisering; miljøsykdom; bestrålingssykdom; endokrin sykdom; og degenerativ sykdom.