KR19990022370A

KR19990022370A - 간의 재생에서 상향 조절되는 신규 유전자

Info

Publication number: KR19990022370A
Application number: KR1019970708850A
Authority: KR
Inventors: 안토니 에프. 펄치오; 리쥬오 뉴; 캉 리우; 바파 카말리; 브라이언 누우톤
Original assignee: 나우톤 질 케이.; 어드밴스드 티슈 사이언스, 인코퍼레이티드
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 1999-03-25
Also published as: WO1996039540A1; JPH11507816A; CA2223707A1; AU6160396A; US6027935A; EP0832289A1; NZ310749A; EP0832289A4; AU714536B2

Abstract

간의 재생에서 상향조절되는 신규한 유전자, Rasp-1에 대해 상술한다. Rasp-1 유전자에 의해 인코드된 신규한 RASP-1 단백질에 대해서도 상술한다. 또한 Rasp-1 생성물에 대한 항체에 대해 상술한다. 또한, 간질환의 치료 및 진단에 Rasp-1 핵산 서열, Rasp-1 유전자 생성물과 Rasp-1 유전자 생성물에 대한 항체의 이용에 대해 상술한다.

Description

간의 재생에서 상향 조절되는 신규 유전자

본 발명은 Rasp-1(재생-연관된 세르핀-1) 유전자에 관계하는데, 이 유전자는 간 조직의 재생에 있어서, 이의 발현이 조절되는 신규한 유전자이다. 본 발명은 또한, Rasp-1 유전자에 의해 인코드되는 신규한 RASP-1 단백질에 관계한다. 또한 본 발명은 간 질환의 진단과 치료용 조성물과 그 방법에 관계한다.

[배경기술]

간은 성인에서 평균 중량이 1.4kg (약 31b)의 신체의 가장 무거운 선이고 피부 다음으로 가장 큰 기관이다. 간은 복막에 의해 완전히 덮혀있고 복막아래에 있는 조밀한 불규칙적인 연조직 층에 의해 완전히 덮혀있게 된다. 간은 두 개의 주요 엽(lobe)으로 나누어질 수 있는데; 큰 우측 엽과 작은 좌측 엽으로 나눌 수 있다. 엽은 겸상인대에 의해 분리되는데 이는 복막 체벽의 반향이다. 이는 횡경막으로부터의 간의 두 개 엽 사이에 있는 간의 상측면까지 이어져 있다. 겸상인대의 자유 경계면은 원형 인대이다. 이는 간에서 배꼽까지 이어져 있다. 둥근 인대는 태아의 배꼽정맥의 잔유물인 섬유성 코드이다.

간의 엽은 소엽이라 불리는 많은 기능성 단위로 구성된다. 각 소엽은 간세포(예를 들면 실질세포)라 불리는 특정 상피 세포로 구성되는데 이는 중앙 정맥 주면에 있는 불규칙적이고, 분지된 상호 연결된 플레이트에 배열되어 있다. 모세혈관과는 달리 간은 혈액이 통과하는 지누소이드라 불리는 내피에 의해 받쳐진 큰 공간을 가진다. 지누소이드는 성상 망상 내피 세포(Kuffer's)세포라 불리는 식세포에 의해 부분적으로 받쳐진다.

간의 주요기능은 혈액에서 특정 물질의 수준을 조절하는 것이다. 예를 들면, 간은 인슐린 호르몬의 영향아래에 혈액의 포도당을 제거하고 이를 글리코겐으로 저장하는 것과 같은 탄수화물 대사에 중요한 역할을 하고 있다. 혈액에서 포도당의 수준이 떨어지면 글루카곤 호르몬은 간이 글리코겐을 분해하여 혈액으로 포도당을 방출하도록 한다. 간도 또한 아미노산의 디아미네이션을 통하여 단백질 대사에도 중요한 역학을 하고, 이로 인해 생성된 독성 암모니아를 요소로 전환시켜 신장에 의해 배설되도록 한다. 간은 또한 많은 약물과 호르몬의 독성도 제거한다. 또한 간은 트리글리세리드를 저장하고, 지방산을 분해하고, 지방 단백질을 합성하는 등과 같이 지질대사에도 참여한다. 간은 또한 담즙을 분비하는데 이는 지방, 콜레스테롤, 인지질과 지방단백질의 분해에 도움이 된다. 또한 간은 비타민(A, B₁₂, D, E, and K)과 미네랄(철과 구리)을 저장한다. 또한 간의 성상세포(Kupffer 세포)는 소모된 적혈구 세포와 백혈구 세포 및 일부 세균을 식작용 처리한다. 헴(heme)의 분해 생성물인 비리루빈은 간에 의해 담즙관으로 분비되고 이는 내장기관으로 이동된다.

간질환은 여러 가지 이유로 발생된다. 간염 및 간염증은 주로 알코올 또는 다른 독성 물질의 섭취 또는 바이러스 또는 다른 기생충에 의한 감염에 의해 흔히 일어난다. 간 경변은 실질 세포의 파괴와 연결조직과 이들의 대체에 의해 일어난다. 예를 들면, 간염 C 바이러스로 인한 감염으로 인한 간염이 흔히 간 경변으로 발전한다. 한편 헤파타이티스 B 바이러스 감염은 많은 경우에 간암(헤파토마)으로 발전된다고 보고 있다. 헤파토마는 예를 들면 발암물질에 노출되어 내생 온코겐의 활성화로 인한 것이다.

이들 질환의 여러 가지 형태는 만성 또는 급성 간 기능 상실로 이어진다.

급성 간 기능 상실(FHP)로 인하여 막대한 간세포의 괴사와 간 대사의 심각한 손상이 동시에 일어난다. 임상적인 특징은 뇌기능의 심각한 마찰 증상으로 나타나는데-대부분의 경우에 혼수상태로 신속히 발전된다. 초기 황달에서는 비정상적으로 효소의 혈액수준이 증가되는 특징을 볼 수 있는데 이와 같은 환자는 일주일내에 죽게된다. 부분적으로 또는 완전히 간을 대체하는 것은 일시적인 또는 영구적인 중요한 간 기능의 이상이 있는 경우에 필요하다. 최근에 급진적인 치료발전에도 불구하고, FHP 환자는 80%이상의 치사율을 가진다.

다른 내기관과는 달리 간은 상당한 재력을 가진다. 예를 들어 쥐의 경우에 70% 절제된 간은 약 1 주일내에 고유 고유 수준으로 간을 재생시킬 수 있다. 그럼에도 불구하고, 간이 매우 중요한 생화학적 기능을 다수 수행하기 때문에 심각한 간 손상 또는 상실을 상당히 치명적이다. 따라서 간 재생과정에 연루된 분자인자를 확인하려는 일부 시도가 있었다.

많은 기존 연구는 수술후 처음 몇 시간내에(1~6시간) 일어나는 일에 대해 집중되었다. 이에 대해 Hagiya et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9:8142-8146, cloned ALR (augmenter of liver regeneration) from rat; Hsu et al., 1992, Mol. Cell Biol. 12:4654-4665 는 간 재생인자-1(LRF-1)으로 불리는 단백질을 포함하는 신규한 루이신-지퍼를 인코드하는 유전자를 확인하였고; Mohn et al., 1991. Mol. Cell Biol. 11:381-390은 41개의 신규한 최초 부분 DNA 서열에 대해 확인하였다. 이들 유전자는 부분적으로 간절제후에 초기 기간동안에 (1~6시간) 발현을 검사하여 분리하였다. 초기 재생 단계동안에는 급성상 염증 단백질의 발현이 실제 높기 때문에 배경 유전자의 유도발현이 나타나는데 니는 별로 유용하지 못한 것으로써 그 이유는 간 재생에 이들의 발현이 특이적인 것이 아니기 때문이다. 이와 같은 특이성이 부족한 것을 극복하기 위해서는 간질환의 초기 진단을 위한 신속히 요구되는 도구를 얻는데 인자를 결정하고 간의 비정상적인 재생 능력의 장점을 가지도록 치료요법을 개선하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 간 조직의 재생과정동안에 발현이 제어되는 신규한 Rasp-1 유전자와 이 유전자로부터 유도된 핵산에 관계한다. 간의 재생 초기 단계에서 유도된 발현이 제한되는 이미 확인된 유전자와는 달리, Rasp-1 발현의 유도는 일반적인 급성상 염증 유전자 발현이 가라앉은 후에 간 재생의 후기 단계(수술후 48시간)에도 관찰된다. Rasp-1 유전자에 상응하는 DNA 서열과 이의 유도체는 Rasp-1 단백질의 생산 및 간조직에서 Rasp-1 유전자의 발현 콘트롤을 포함하는 본 발명의 다양한 용도에 이용될 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 본 발명은 또한 간 재생에서 중요한 역할을 하는 단백질 인자를 나타내는 Rasp-1 유전자에 의해 인코드되는 단백질 생성물에 관계한다. Rasp-1 유전자 생성물인 RASP-1 인 혈류로 분비된다. 이와 같은 단백질 생성물은 선내 간 조직의 재생을 자극하거나 선내 간 조직의 성장을 강화함으로써 간 손상 또는 간 질환의 치료에 이용할 수 있다. 이와 같은 단백질 생성물은 섬유아세포와 연골뿐만 아니라 조혈 능력을 가지는 세포를 포함하나 이에 국한되지 않는 여러 세포와 조직에서 성장 조절 활성을 가진다. 또한, 본 발명은 Rasp-1 유전자 생성물에 대한 항체에도 연관된다. 항체는 혈류에 분비된 RASP-1의 존재를 감지함으로써 간 손상 및 질환의 진단에 이용할 수 있다.

도 1 은 신규한 Rasp-1 유전자의 DNA와 인코드된 아미노산 서열이다. 시그날 서열은 한줄로 밑출진 것이고 폴리아데닐화 시그날(AATTAAA)은 두줄로 밑출진 것이다. 글리코실화에 대한 5개 아스파라진(N) 잔기는 GENEPRO 5^TM(Riverside Scientific Enterprises)에 의해 분석하여 박스로 나타내었다.

도 2 는 정상조직(N)과 재생(R) 간 조직에서 Rasp-1 mRNA 의 노던 블랏 분석을 한 것이다. 10㎍ 총 간 RNA 샘플은 정상(N)에서 분리하고 간 절제후 48 시간된 동물은 1.6kb Rasp-1 cDNA 로 프로브시킨다.

도 3A 와 3B. 도 3A 는 동종 단백질과 인코드된 RASP-1 아미노산 배열이다.

MPSRCH의 Simth-Waterman algorithm(IntelliGenetics)를 이용하여 실행하였다. 동종 단백질은 다음과 같다: AIAT, 사람 α₁-안티트립신 전구물질(Bollen et al, 1983, DNA 2:255-264); HEP2 hu, 사람 헤파린 공인자 II 전구물질(Herzog et al., 1991, Biochemistry 30:1350-1357); IPSP hu, 사람 플라스미노겐 활성물질 저해인자-2 전구물질(Suzuki et al., 1987, J. Biol. Chem. 262-611-616); AACT hu, 사람 α₁-안티키모트립신 전구물질(Chandra et al., 1983, Biochem. 22: 5055-5061); SPI1 쥐, 쥐 세린 프로테아제 저해물질-1 전구물질과 SPI3 쥐, 쥐 세린 프로테아제 저해물질-1 전구물질(Pages et al., 1990, Eur. J. Biochem 190:385-391); UAU-1 hu, 사람 α₁-안티트립신 관련 단백질 전구물질(Bao et al., 1988, Genomics 2:165-173);

EP45 Xen, 제노푸스 에스트로겐 조절된 단백질 EP45(Holland et al., 1992, J. Biol. Chem. 267-7053-7059); THBG hu 사람 티록신 결합 글로블린 전구물질(Flink et. al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7708-7712)과 CBG hu, 사람 피질 스테로이드-결합 글로블린 전구물질(Hammond et al., 1991, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 40: 755-762)이다. 가상 세르핀 반응 중심 주변부분을 밑줄로 표시해 두었고 P₁-P₁사이에 단백질 절단성 결합으로 보이는 잔기의 관련위치를 나타내었다. 도 3B: 표는 도 3A 에서 11개 단백질 가운데 유사성과 변이성을 정량화하였다. 전반적인 유사성을 PAM250 잔기 중량 메트릭스의 Clustal 프로그램에 의해 상기 동종 단백질의 쌍 배열로부터 계산할 수 있다.

도 4는 RASP-1 펩티드(라인 2)로 면역화시킨 후에 혈청과 면역화전 혈청(라인 1)에서 얻은 쥐 혈청의 웨스턴 블랏 분석을 한 것이다.

도 5 는 간절제(HX)와 모조 HX에 대한 Rasp-1 발현의 노던 블랏 분석을 나타낸다. 다양한 15㎍ RNA 샘플을 로드하고 Rasp-1 cDNA로 프로브하였다. Rasp-1 mRNA는 판넬위에 나타내었다. 아래 판넬에는 동일 필터에서 메틸렌 블루 착색된 tRNA를 나타낸다. RNA 소스는 다음과 같다: 라인 1-정상; 라인 2-모조 HX후에 24시간; 라인 3-모조 HX후에 48시간; 라인 5-모조 HX후에 72시간; 라인 6-모조 HX후에 72시간; 라인 7-모조 HX후에 1주일; 라인 8-모조 HX후에 1주일; 라인 9-모조 HX후에 2주일; 라인 9-HX후에 2주일.

본 발명은 신규한 Rasp-1 유전자의 동정에 관계하는데 이의 발현은 간 재생에서 조절되고 또한 Rasp-1 유전자에 의해 인코드된 RASP-1 단백질과 간 질환의 치료와 재생에서 Rasp-1 유전자와 RASP-1 단백질의 용도에 관계한다. 본 발명은 또한, RASP-1 단백질에 대한 항체와 간 질환의 진단에 그리고 간 재생을 모니터하는데 이의 이용에 관계한다.

5.1. Rasp-1 유전자

도 1 에서 나타낸 것과 같이 Rasp-1 유전자는 간절제후에 초기 재생 단계동안에서 이의 발현이 조절되는 신규한 유전자이다. 확인된 Rasp-1 유전자의 핵산 서열을 여기에서 설명한다. 여기에서 사용한 것과 같이, Rasp-1 유전자는 (a) ATCC에 기탁된 클론 pRLC-1에 포함된 또는 도 1 에 나타낸 DNA 서열을 포함하는 유전자; (b) 도 1에 나타낸 아미노산 서열을 인코드하는 임의 DNA 서열 또는 ATCC에 기탁된 클론 pRLC-1에 의해 인코드된 아미노산 서열; (c) 매우 엄격한 조건하에서 도 1 에 나타낸 코딩 서열의 보체에 하이브리드되는 임의 DAN 서열 또는 ATCC 에 기탁된 클론 pRLC-1에 포함된 코딩서열에 하이브리드되는 임의 DNA 서열로써 이때 조건은 0.5M NaHPO₄, 7% SDS, 1mM EDTA에서, 65℃에서 필터-결합된 DNA에 하이브리드시키고, 0.1xSSC/0.1% SDS 68℃에서 세척하고 (Ausubel F.m. et sl., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley Sons, Inc., New York, at p. 2.10.3) 도 1에 나타낸 또는 클론 pRLC-1에 포함된 서열에 의해 인코드된 유전자 생성물에 등가인 유전자생성물을 인코드하는 서열이 되고 (d) 엄격성이 약한 조건하에서 도 1에 나타낸 또는 ATCC에 기탁된 클론 pRLC-1에 포함된 코딩 서열의 상보체에 하이브리드될 수 있은 임의 DNA 서열로써 조건을 예를 들면, 일체성이 약한 서열간에도 하이브리드될 수 있는 조건으로써 0.2xSSC/0.1% SDS, 42℃에서 세척하고 (Ausubel et al., 1989, supra) 도 1에 나타낸 또는 클론 pRLC-1내에 포함된 서열에 의해 인코드되는 유전자 생성물에 기능적으로 등가인 유전자 생성물을 인코드한다.

본 발명은 도한 전술한 단락에서 (a) 내지 (c)의 DNA 서열에 상보적인 것에 하이브리드될 수 있는 적절한 DNA 분자를 포함한다. 이와 같은 하이브리드 조건은 매우 엄격하거나 또는 다소 완화된 조건이 될 수 있다. 핵산분자가 데옥시올리고 뉴클레오티드(올리고)인 경우, 매우 엄격한 조건 즉, 37℃(14 개 염기-올리고), 48℃(17 개 염기-올리고), 55℃(20 개 염기-올리고), 그리고 60℃(23 개 염기-올리고)에서 6xSSC/0.05% 피로포스페이트 나트륨에 세척한다. 이들 핵산 분자는 Rasp-1 유전자 조절에 Rasp-1 유전자 안티센스 분자로 유용하고, Rasp-1 유전자 핵산 서열의 증폭반응에서 안티-센스 프라이머로써 유용하다. 또한, 이와 같은 서열은 리보자임의 일부 또는 삼중 나선 서열의 일부로 이용될 수 있고, 이는 또한 Rasp-1 유전자 조절에도 이용될 수 있다. 또한, 이와 같은 분자는 진단 방법의 성분으로도 이용될 수 있는데 이로써 간 질환의 원인이 되는 대립형질 유전자의 존재를 감지할 수 있다.

본 발명은 또한 (a) 전술한 코딩 서열 또는 이의 상보체(예로써 안티센스)를 포함하는 DNA 벡터; (b) 코딩 서열의 발현에 관계하는 조절서열이 연합된 전술한 코딩 서열을 포함하는 DNA 발현 벡터; 그리고 (c) 숙주세포에서 코딩서열의 발현에 관계하는 조절 서열이 연합된 전술한 코딩서열의 발현에 관계하는 조절 서열이 연합된 전술한 코딩서열을 포함하는 유전공학적으로 조작된 숙주 세포를 포함한다. 여기에서 언급한 것과 같이, 조절원소에는 유도성 및 비-유도성 프로머터, 인헨서, 오퍼레이터 그리고 발현을 유도하고 조절할 수 있는 본 기술분야에 공지된 다른 요소를 포함하나 이에 국한되지 않는다.

본 발명은 여기에서 상술하고 있는 임의 DNA 단편을 포함한다. 도메인의 하나이상의 코딩부분(예를 들면, 도 1 에서 나타낸 것과 같은 아미노산 1-20의 N-단부 시그날 펩티드를 코드하는 서열)에 상응하는 Rasp-1 유전자의 단편이 특히 유용하다. Rasp-1 유전자 단편을 전체 길이를 가지는 RASP-1 단백질에 기능적으로 등가인 절두형 유전자 생성물을 인코드한다. 또는 이와 같은 단편으로된 유전자 생성물은 결손된 도메인에 상응하는 활성이 부족될 수도 있고 또는 전체적인 활성이 결손될 수도 있다. 또한 본 발명은 도 1 에서 박스로 나타낸 아스파란긴 잔기에 의해 표시되는 N-링크된 글리코실화 부위에서 잔기를 치환하는 것을 포함하나 이에 국한되지 않은 아미노산 치환을 인코드하는 돌연변이 Rasp-1 유전자를 포함한다.

전술한 유전자 서열에 추가하여, 이와 같은 서열의 유사성이 사람을 포함하는 다른 종에 있을 수 있고 확인될 수 있고 본 기술에 공지된 분자 생물학적 기술에 의해 추가 실험없이 분리될 수도 있다. 또한 이와 같은 유전자 생성물의 하나 이상의 도메인에 상당한 유사성을 가지는 단백질을 인코드하는 게놈내에 유전자가 다른 유전자 위치에 있을 수 있다.

사람과 개, 고양이, 쥐, 생쥐, 헴스트를 포함하는 사람이 아닌 영장류를 포함하는 포유류 종에서 Rasp-1 유전자와 이의 동사체를 수득할 수 있다. cDNA를 얻기 위해서는, Rasp-1이 발현되는 조직과 세포가 적절하다. Rasp-1과 이의 동사체용 유전자 물질원을 제공하는 조직은 성인간, 배와 타아간을 포함한 간이 된다. 또한, 특정 세포원으로는 Hep G2, Hep 3B, PLC/PLF/5(사람), Hepa 1-6(쥐), H4TG-McA-RH7777과 MH₁C₁(쥐)와 같은 유도된 세포를 포함한다.

예를 들면, 분리된 Rasp-1 유전자 서열을 라벨하여 소요의 유기체로부터 수득한 mRNA에서 만든 cDNA 라이브러리를 스크린하는데 이용될 수 있다. 사용된 하이브리드 조건은 라벨된 서열을 유도할 수 있는 유기체와 상이한 형태의 유기체로부터 유도할 수 있다. 또는 라벨된 단편은 적절한 엄격한 조건을 이용하여 소요의 유기체에서 유도한 게놈 라이브러리를 스크린하는데 이용할 수 있다. 엄격성이 낮은 조건은 라이브러리와 라벨된 서열이 유도되는 특정 유기체에 따라 달라지기는 하나 이는 본 기술분야에 숙지의 지식을 가진 자에게 공지된 것이다. 이와 같은 조건 등의 안내는 Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press, N.Y.; and Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Assiciates and Wiley Interscience, N.Y.를 참조한다.

또한, 미지의 Rasp-1 유전자 형 서열은 소요의 유전자내에 아미노산 서열에 기초하여 고안된 두 개의 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머 집합체를 이용하여 PCR을 실시함으로써 분리할 수 있다. 반응의 주형은 Rasp-1 유전자 대립형질을 발현하는 것으로 알려진 또는 의심이 가는 사람 또는 사람이 아닌 조직 또는 세포주로부터 만든 mRNA의 역전사에 의해 얻어진 cDNA일 수 있다.

PCR 생성물은 증폭된 서열이 Rasp-1 유전자와 유사한 핵사 서열의 서열일 수 도 있다는 것을 확인하기 위해 서브클론시키고 서열화할 수 있다. PCR 단편은 다양한 방법을 이용하여 완전한 길이의 cDNA 클론을 분리하는데 이용할 수 있다. 예를 들면, 증폭된 단편을 라벨하여 이를 이용함으로써 박테리오파아지 cDNA 라이브러리를 스크린하는데 이용할 수 있다. 또는, 라벨된 단편은 게놈 라이브러리를 스크린하는데 이용할 수 있다.

PCR 기술을 이용하여 전체길이의 cDNA 서열을 분리할 수 있다. 예를 들면, 표준 과정에 따라 적절한 세포 또는 조직원으로부터 RNA를 분리할 수 있다. 역전사 반응은 제 1 가닥 합성을 위한 프라임용으로 5' 단부 증폭된 단편에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 RNA에서 실시할 수 있다. 생성된 RNA/DNA 하이브리드는 표준 단부 전이효소 반응을 이용하여 구아닌을 꼬리에 달 수 있고 이 하이브리드는 RNAase H로 절단시키고 제 2 가닥 합성은 폴리-C 프라이머로 프라임될 수 있다. 따라서, 증폭된 단편의 상류 cDNA 서열을 용이하게 분리할 수 있다. 이용된 클로닝 과정은 Sambrook et al., 1989, supra. 를 이용하여 참고한다.

확인된 Rasp-1 유전자가 정상 유전자인 경우에 이 유전자는 유전자의 돌연변이 대립형질을 분리하는데 이용할 수 있다. 돌연변이 대립형질은 간 질환 증세에 관계하는 유전자형을 가지는 것으로 알려진 또는 추정되는 개체에서 분리할 수 있다. 돌연변이 대립형질과 이의 생성물을 하기에서 상술하는 치료요법적 및 진단학적 시스템에 이용한다.

PCR과 같은 본기술 분야에 공지인 기술을 이용하여 돌연변이 유전자의 cDNA를 분리한다. 이와 같은 경우에, 제 1 cDNA 가닥은 돌연변이 대립형질을 가지는 것으로 추정되는 개체에서 발현하는 또는 발현하는 것으로 보이는 조직으로부터 분리한 mRNA에 올리고-dT 올리고뉴클레이오티드를 하이브리드시키고, 역전사효소를 이용하여 새로운 가닥으로 연장하여 합성할 수 있다. cDNA의 제 2 가닥은 정상 유전자의 5' 단 부에 특이적으로 하이브리드할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 이용하여 합성한다. 이와 같은 두 개의 프라이머를 이용하여 생성물은 PCR을 통하여 증폭되고, 적절한 벡터내에 클론되고, 본 기술분야에 숙지된 방법을 통하여 DNA 서열 분석을 받게 된다. 정상 유전자의 DNA 서열과 돌연변이 유전자의 DNA 서열을 비교함으로써, 돌연변이 유전자 생성물의 기능 상실 또는 변화에 책임을 가지는 돌연변이를 확인할 수 있다.

또는 돌연변이 대립형질 유전자를 가지는 또는 가지는 것으로 보이는 개체에 소요의 유전자를 발현하는 것으로 공지된 또는 발현하는 것으로 보이는 조직으로부터 유도된 각 DNA 또는 RNA를 이용하여 게옴 또는 cDNA 라이브러리를 작제하고 스크린할 수 있다. 정상 유전자 또는 이의 적절한 단편을 라벨시키고, 라이브러리에서 이에 상응하는 돌연변이 대립형질을 확인하기 위한 프로브로써 이용할 수 있다. 이와 같은 유전자를 포함하는 클론을 정제하고, 본 기술에 공지된 방법에 따라 서열분석을 한다.

또한, 돌연변이 대립형질을 가지는 것으로 공지된 또는 가지는 것으로 보이는 개체에서 소요의 유전자를 발현시킬 수 있는 것으로 공지된 조직에서 분리된 DNA 또는 합성된 cDNA를 이용하여 발현 라이브러리를 작제할 수 있다. 이와 같은 방식으로 예상되는 돌연변이 조직에 의해 만들어진 유전자 생성물이 발현되고, 5.3에서 상술하는 정상적인 유전자 산물에 대해 발생되는 항체와 연합하여 표준 항체 스크리닝 기술을 이용하여 스크리닝할 수 있다(For screening techniques, see, for example, Harlow, E. and Lane, eds., 1988, Antuibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor). 돌연변이가 기능이 변형된 (미스센스 돌연변이에 의해) 유전자 생성물을 발현시키는 경우에 다클론성 항체는 돌연변이 유전자 생성물과 교차-반응하는 것으로 보인다. 라벨된 항체와의 반응을 통하여 감지된 라이브러리 클론을 정제하고 본 기술의 공지의 방법에 따라 서열분석을 하게 된다.

5.2. Rasp-1 유전자의 단백질 생성물.

도 1 에는 Rasp-1 유전자에 의해 인코드된 아미노산 서열을 나타낸다. Rasp-1 유전자 생성물에는 5.1에서 상술하는 Rasp-1 유전자 서열에 의해 인코드된 이들 단백질을 포함한다. 특별히, RASP-1 단백질이라 불리는 Rasp-1 유전자 생성물은 도 1 에 나타낸 Rasp-1 유전자 서열 또는 ATCC에 기탁된 클론 pRLC-1에 포함된 유전자 서열에 의해 인코드된 Rasp-1 유전자 생성물을 포함할 수 있다.

또한, Rasp-1 유전자 생성물은 기능적으로 등가의 유전자 생성물을 나타내는 단백질을 포함할 수 있다. 이와 같은 등가의 Rasp-1 유전자 생성물은 5.1에서 상술하는 Rasp-1 유전자 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열내에 있는 아미노산 잔기의 결손, 추가 또는 치환을 포함하나 이 결과로 인하여 침묵 돌연변이가 되어 기능적으로 등가의 Rasp-1 유전자 생성물을 만든다. 아미노산 치환은 관련 잔기의 극성, 하전, 용해도, 소수성, 친수성 또는 양쪽성 성질에서 유사성에 기초하여 만들어진다.

예를 들면, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 포를린, 페닐알라닌, 트립토판과 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산에는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴과 글루타민을 포함하고; 양전하(염기성) 아미노산에는 아르기닌, 리신과 히스티딘을 포함하고; 음전하(산성) 아미노산에는 아스파르트산과 글루타민산을 포함한다. 여기에서 이용한 것과 같이 기능적으로 등가의는 5.1에서 상술하고 있는 Rasp-1 유전자 서열에 의해 인코드된 내생 Rasp-1 유전자 생성물로써 실제 생체 활성이 유사한 것을 나타내는 단백질을 말하는 것으로써 항-RASP-1 항체에 결합할 수 있는 능력을 가지는 항원성; RASP-1 단백질 또는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 만드는 능력을 말하는 면역원성; RASP-1에 대한 기질에 결합 (또는 결합시에 RASP-1과 경쟁하는) 능력; RASP-1에 결합하는 능력, RASP-1 수용체에 친화성 결합, RASP-1 수용체에 결합하는 생성된 생물학적 효과 예를 들면, 세포 대사에서 시그날 유도와 변화 (이온 유입, 티로신 포스포릴화) 또는 RASP-1 등가체가 적정 세포형에 존재하는 경우에 표현형의 변화 (세포성장 및 분화에서 자극 또는 저해) 등의 다수 기준에 의해 판단된다.

본 발명의 범위에는 RASP-1 단백질, 폴리펩티드, 항체 분자 또는 다른 세포리간드 등에 연결, 단백질 절단, 공지의 보호/차단기에 의한 유도화, 아미드화, 포스포릴화, 아세틸화, 글리코실화에 의해 의한 해독후 또는 해독 동안에 차등적으로 변화된 유도체(단편 포함)가 포함된다. 시아노겐 브로마이드 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH4 에 의한 특이적 화학적 절단; 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원; 튜니카마이신 존재하에 대사적 합성을 포함하나 이에 한정하지 않은 기술에 의해 이루어진다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 다른 분자에 연결되어 물에 대한 용해도를 증가시키고 (예를 들면 폴리에틸렌 글리콜), 반감기 또는 표면적 조직에 결합하는 능력(신체에 단백질을 표적화시키기 위한 이인산염 또는 폴로로크롬)을 증가시킨다.

또한, RASP-1 서열에 치환 또는 추가되는 것으로 비-전통적인 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 도입될 수 있다. 비-전통적인 아미노산에는 통상적인 아미노산의 D-이성질체, α-아미노 이소부틸산, 4-아미노부틸산, Abu, 2-아미노 부틸산, γ-Abu, ε-Ahu, 6-아미노 헥사노익산, Aib, 2-아미노 이소부틸산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르루이신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트롤린, 시스테인산, t-부틸클리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 사이클로헥실알라닌, β-알라닌, 플로오르-아미노산, β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산, Nα-메틸 아미노산과 같은 디자이너 아미노산과 일반적인 아미노산 유사체를 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 또한, 아미노산은 D 또는 L형이 될 수 있다.

무작위 돌연변이에 의해 Rap-1 DNA (본 기술에 숙지된 자에게 공지인 무작위 돌연변이 기술을 이용)를 만들고 생성된 돌연변이 RASP-1 단백질을 활성에 대해 테스트하고, Rasp-1 코딩 서열의 부위 돌연변이를 만들어 (본 기술분야에 공지인 부위-직접적인 돌연변이 기술을 이용) 기능이 증가된 돌연변이 RASP-1 단백질을 만들거나 (예를 들면, Rasp-1 수용체 또는 기질에 더 큰 친화력으로 결합하는); 또는 기능이 감소된 돌연변이 RASP-1 단백질 예를 들어 RASP-1 수용체 또는 기질에 낮은 친화력으로 결합하는 단백질을 만든다.

예를 들면, 도 3A 에서 나타낸 것과 같은 RASP-1의 배열과 다른 세르핀의 배열을 나타내는데 동일한 아미노산 잔기는 박스로 나타낸다. 돌연변이 RASP-1 단백질은 동일성 부분(도 3A의 박스로 나타낸)이 유지되도록 만들어지고 반면에 가변 부분(도 3A의 박스이외 부분)이 변경되는데, 예를 들면, 아미노산 잔기의 결손 또는 삽입 또는 하나이상의 상이한 아미노산 잔기의 치환등이 된다. 다양한 위치에서 보호성 변경이 있도록 조작하여 RASP-1 수용체 또는 기질의 친화력 결합과 같은 기능을 보유하는 돌연변이 RASP-1을 만든다. 비-보존성 변화를 여러 부위에서 만들어 수용체 또는 기질에 RASP-1 결합 친화력과 같은 기능을 변경시킨다. 또는 기능변경이 필요한 곳에는 보존된 부분(도 3A 에서 박스로 나타낸 동일한 아미노산)의 결손 또는 비-보존적 변경이 있도록 만들어질 수 있다. 예를 들면, RASP-1 반응 중앙(도 1 의 아미노산 395-405 또는 도 3A 의 윗줄)의 결손 또는 비-보존성 변경(치환 또는 삽입)으로 인하여 RASP-1의 효소활성이 변경된다. 또한, 아미노산 401에서 중요한 시스테인 잔기의 변경은 기질의 결합특이성을 변경시킨다.

Rasp-1 코딩 서열에 대한 다른 돌연변이가 만들어져 선택된 숙주세포에서 발현, 스케일 업 등에 더욱 적합한 RASP-1 단백질을 만든다. 예를 들면, N-연결된 글리코실화 부위(도 1 에서 박스로 표시된 N-잔기)를 변경 또는 제거하여 하이퍼글리코실화 N-연결된 부위로 공지된 숙주 효모로부터 용이하게 회수하고 정제할 수 있는 균질성 생성물의 발현을 얻을 수 있다. 이를 위해, RASP-1 단백질(N-X-S 또는 N-X-T)에서 일어날 수 있는 하나이상의 글리코실화 인지부위의 제 1 또는 제 3 아미노산 위치에서 다양한 아미노산의 치환으로 인하여 변형된 트리펩티드 서열에서 글리코실화를 막을 수 있다(Miyajima et al., 1986, EMBO J. 5(6):1193-1197).

RASP-1의 하나 이상의 도메인(예를 들면 도 1 에서 나타낸 것과 같은 아미노산 1-20 으로부터 N-단부 시그날 펩티드), 절두된 또는 결손된 RASP-1 단백질(시그날이 결손된 RASP-1)에 상응하는 펩티드 및 전체길이 RASP-1 단백질, 폴립펩티드 또는 유도체(단편포함) 또는 절두된 RASP-1(시그날 서열로 구성된 또는 시그날 서열이 부족한)이 무관한 단백질에 융합된 것과 같은 융합 단백질 또한 본 발명의 범위내에 있고 이는 본 단락과 5.1에서 상술한 Rasp-1 뉴클레오티드와 RASP-1 아미노산 서열에 기초하여 고안될 수 있다. 융합 단백질은 또한 RASP-1 서열과 비-RASP-1 단백질 서열 사이에 있는 절단부위를 포함하도록 조작되어 RASP-1 단백질 비-RASP-1 부분으로부터 절단될 수 있다. 이와 같은 융합 단백질은 RASP-1 단백질 또는 펩티드를 안정화시키고 생체에서 반감기를 연장시키고; 마커 기능을 제공하는 효소, 형광 단백질 또는 발광 단백질에 융합되는 FgFc 융합체를 포함하나 이에 국한시키지 않는다.

Rasp-1 유전자 생성물은 본 기술에 공지된 기술을 이용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생산될 수 있다. 따라서, Rasp-1 유전자 서열을 포함하는 핵산을 발현시킴으로써 본 발명의 Rasp-1 유전자 폴립펩티드와 펩티드를 만드는 방법을 여기에서 상술한다. 본 기술에 공지된 방법을 이용하여 Rasp-1 유전자 생성물 코딩 서열과 적절한 전사 및 번역 제어 시그날을 포함하는 발현 벡터를 만들 수 있다. 이와 같은 방법에는 시험관 재조합 DNA 기술, 합성기술 및 생체 유전자 재조합을 포함한다. 예를 들면 Sambrook et al., 1989, supra. and Ausubel et al., 1989, supra.에 상술된 기술을 말한다. 또한, Rasp-1 유전자 생성물 서열을 인코드할 수 있는 RNA는 합성기를 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이와 같은 기술은 Oligonucleotide Synthesis, 1984, Gait, M.J. ed., IRL Press, Oxford 에서 상술하고 있다. 다클론성 항체를 만들기 위한 RASP-1의 합성 펩티드 단편을 이용하는 것이 아래 단락 6 에서 상술하고 있다.

다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 이용하여 본 발명의 Rasp-1 유전자 코딩 서열을 발현시킬 수 있다. 이와 같은 숙주-발현 시스템은 소요의 코딩 서열이 생성되고 결과적으로 정제할 수 있는 운반체이나 본 발명의 Rasp-1 유전자 생성물을 나타낼 수 있는 적절한 코딩 서열로 형질도입된 또는 형질감염된 경우의 세포를 나타낸다. 여기에는 Rasp-1 유전자 생성물 코드 서열을 포함하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드, DNA 또는 코스미드 DNA 발현벡터를 형질전환된 박테리아(예로써 대장균, B, 서브틸리스); Rasp-1 유전자 생성물 코드 서열을 포함하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질도입된 호모 (예로써, 사카로마이세스, 피키아); Rasp-1 유전자 생성물 코딩 서열을 포함하는 재조합 바이러스 발현 벡터(베큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; Rasp-1 유전자 생성물 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현벡터(Ti 플라스미드)로 형질전환된 또는 재조합 바이러스 발현 벡터(꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)에 감염된 또는 Rasp-1 유전자 생성물 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계; 또는 포유류 세포의 게놈에서 유도된 프로모터(메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유류 바이어스에서 유도된 프로모터(예로써 아데노바이러스 후기 프로모터; 바시니아 바이러스 75K 프로모터)를 포함하는 재조합 발현 구조체를 가지는 포유류 세포계(COS, CHO, BHK, 293,3T3)를 포함한다.

박테리아 시스템에서, 상당수의 발현벡터는 발현될 Rasp-1 유전자 생성물의 사용 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 단백질 상당량이 RASP-1 단백질의 제약학적 조성물의 생성 똔느 RASP-1 단백질에 대한 항체를 만들기 위해 생성되는 경우에 실제 정제될 융합 단백질 생성물을 다량 발현시킬 수 있는 벡터가 바람직하다. 이와 같은 벡터에는 대장균 발현 벡터 pUR278(Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), 이때 Rasp-1 유전자 생성물 코딩 서열은 1ac z 코딩 부분에 있는 구조내에 벡터에 개별적으로 연결되어 융합 단백질이 생성되고; pIN 벡터(Inouye Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264:5503-5509); 등이 이용될 수 있으나 이에 한정시키지 않는다. pGEX 벡터는 글루타티온 S-전이효소(GST)가 있는 융합단백질로써 외부 폴리펩티드를 발현시키는데 이용된다. 일반적으로, 이와 같은 융합 단백질은 가용성으로 글루타타온-아가로즈 비드에 흡착시키고 자유 글루타티온 존재하에 용출시켜서 용해된 세포로부터 용이하게 정제해 낼 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 절단 부위를 포함하여 클론된 표적 유전자 생성물은 GST 부분에서 방출된다.

곤충 시스템에서 오토그라파 칼리포르니카 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcNPV)는 외부 유전자를 발현시키는 벡터로 이용한다. 바이러스는 스포도프테라 플루기페르다 세포에서 생장한다. Rasp-1 유전자 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 부분(예를 들면 폴리헤드린 유전자)에 개별적으로 클론되어 AcNPV 프로모터(예를 들면 폴리헤드린 프로모터)의 제어하에 있게 된다. Rasp-1 유전자 코딩 서열의 성공적인 삽입으로 인하여 폴리헤드린 유전 자의 비활성화와 비-차단된 재조합 바이러스(폴리헤드린 유전자에 의해 코드된 단백질 코드가 부족한 바이러스)가 된다. 이와 같은 재조합 바이러스는 삽입된 유전자가 발현되는 스포도프테라 플루기페르다 세포를 감염시키는데 이용된다(Smith et al., 1983, J. Virol. 46: 584; Smith, U.S. Patent No. 4,215,051).

포유류 숙주 세포에서, 다수의 바이러스성 발현 시스템이 이용된다. 아데노 바이러스가 발현 벡터로 이용될 때, 소요의 Rasp-1 유전자 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/해독 조절 복합체 예를 들면, 후기 프로모터와 삼부분 리더 서열에 연결된다. 그 다음 이와 같은 키메라 유전자는 생체 내 또는 시험관 내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입된다. 바이러스 게놈(E1 또는 E3 부분)의 비-필수 지역에 삽입하여 감염된 숙주에서 살아있고 Rasp-1 유전자 생성물을 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스를 만든다(Logna Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659). 특이적인 개시 시그날은 삽입된 Rasp-1 유전자 생성물 코드 서열의 효과적인 해독에 요구된다. 이와 같은 시그날에는 ATG 개시 코돈과 인접 서열을 포함한다. 고유 개시코돈과 인접서열을 포함하는 전체적인 Rasp-1 유전자가 적절한 발현 벡터에 삽입되는 경우에 추가 해독 조절 서열이 필요하지 않다. 그러나, Rasp-1 유전자 코디 서열의 일부만이 삽입되는 경우에, ATG 개시 코돈을 포함한 외부의 해독 조절 시그날이 제공되어야 한다. 또한, 완전한 소요의 유전자를 해독하기 위해서 바람직한 코딩서열의 해독 구조내에 개시코돈이 있어야 한다. 이와 같은 외생 해독 조절 시그날과 개시코돈은 다양한 천연 및 합성원이 될 수 있다. 발현의 효과는 적절한 전사 강화효소, 전자 종료물질 등을 포함함으로써 강화 될 수 있다(Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153:516-544).

또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하고, 특정 방식으로 유전자 생성물이 처리될 수 있는 숙주 세포균주가 선택된다. 이와 같은 단백질 생성물의 수정(글리코실화)과 프로세싱(절단)등은 단백질의 기능에 중요하다. 단백질의 해독후 프로세싱과 수정을 위해 상이한 숙주 세포는 특정적인 메카니즘을 가진다. 발현된 외부 단백질의 정확한 수정과 프로세싱을 위해서 저절한 세포주 또는 숙주 시스템이 선택된다. 이를 위해, 유전자 생성물의 제 1 차 전사체의 적절한 프로세싱, 글리코실화, 포스포릴화를 위한 세포기작을 가지는 진핵 숙주 세포가 이용된다. 이와 같은 포유류 숙주 세포에는 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

장시간 재조합 단백질의 다량 생산을 위해서는 안정된 발현이 적절하다. 예를 들면, Rasp-1 유전자 생성물을 안정적으로 발현하는 세포로 만들 수 있다. 바이러스 복제 원점을 포함하는 발현 벡터를 이용하는 것보다는 적절한 발현 조절 원소(프로모터, 인헨서, 서열, 전사종료물질, 폴리아데닐화 부위)와 선택적 표식물질에 의해 제어되는 DNA로 형질도입될 수 있다. 외부 DNA의 도입후에, 조작된 세포는 풍부한 배지에서 1~2일간 생장시키고 선택성 배지로 바꾸어서 생장시킨다. 재조합 플라스미드에서 선택성 표식은 선택에 대해 저항성을 제공하여 세포가 이들의 크로모좀에 플라스미드가 안정적으로 결합되게 하여 병변을 형성할 수 있게 하여 클론되고 세포주로 연장된다. 이와 같은 방법은 Rasp-1 유전자 생성물을 발현시키는 세포주를 만드는데 이용된다. 이와 같은 조작된 세포주는 Rasp-1 유전자 생성물의 내생 활성에 영향을 주는 화합물의 스크린과 평가에 특히 유용하다.

다수의 선택 시스템이 이용될 수 있는데 예를 들면, 허피스 심플렉스 바이러스 티미딘 카이나제(Wigler, et al., 1977, Cell 11:223), 하이포산틴-구아닌 포스포리보실 전달효소(Szybalska Szybalski, 1962, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026) 그리고 아데닐 포스포리보실 전달 효소(Lowy, et al., 1980. Cell 22:817)가 tk^-, hgprt^-또는 aprt^-세포에 이용될 수 있으나 이에 한정시키지 않는다. 또한 다음의 유전자에 대한 선택을 위해 항대사물질 저항성이 이용될 수 있다: dhfr은 메토트렉세이트에 저항성을 제공하고(Wigler, et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt는 미코페놀산에 저항성을 제공하고 (Mulligan Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo는 아미노글리코시드 G-418에 저항성을 제공하고 (Colberre-Garapin, et al., 1981, J. Mol. Biol 150:1) 그리고 hygro는 하이그로마이신에 저항성을 제공한다(Santerre, et al., 1984, Gene 30:147).

사람 세포주에서 발현된 비-변성 융합 단백질의 정제를 위해 또다른 융합 단백질 시스템을 이용한다(Janknecht, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-8976). 이와 같은 시스템에서, 소요의 유전자는 벡신 재조합 플라스미드에 서브클론하여 유전자의 개방 해독 구조는 6개 히스티딘 잔기로 구성된 아미노-단부 꼬리에 해독해 의해 융합된다. 재조합 베니시아 바이러스로 감염된 세포 추출물을 Ni²⁺니트릴로아세트산-아가로즈 칼럼에 얹고 히스티딘-태그된 단백질은 이미다졸 포함하는 완충액을 이용하여 선택적으로 용출한다.

Rasp-1 유전자 생성물은 유전자변이 동물에서 발현될 수 있다. 쥐, 생쥐, 토끼, 기니아 피그, 돼지, 마이크론-피그, 염소와 사람이 아닌 영장류 예를 들면 비비, 원숭이, 침팬지 등을 포함하나 이에 국한되지 않은 동물을 이용하여 Rasp-1 유전자 변이 동물을 만들 수 있다.

유전자 변이 동물의 발기 주를 만들기 위해 동물에 Rasp-1 유전자 트란스진을 도입하는 데에는 본 기술에 의해 공지의 기술을 이용한다. 이와 같은 기술에는 프로뉴클리어 마이크로인젝션(Hoppe, P.C. and Wangner, T.E., 1989, U.S. Pat. No. 4,873,191); 균주에 레트로바이러스 중개된 유전자의 전달(Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sc., USA 82:6148-6152); 배아 간 세포에 유전자 표적화(Thompson et al., 1989, Cell 56:313-321); 배의 전기청공법(Lo, 1983, Mol Cell. Biol. 3:1803-1814); 정자-중개된 유전자 전달(Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717-723)등이 포함되나 이에 국한하지는 않는다. 이와 같은 기술은 Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229에서 참고할 수 있다.

본 발명은 모든 세포에 트란스진을 가지는 유전자변이 동물을 제공하고 전부는 아니나 일부 세포에 트란스진을 가지는 모자이크 동물을 제공한다. 이와 같은 트란스진은 하나의 트란스진 또는 콘카타머로써 결합될 수 있는데 예를 들면 머리-머리 배열 또는 머리-꼬리 배열이 될 수 있다. 트란스진은 Lasko, M. et al. 에 따라 특정 세포형에 선택적으로 도입되어 활성화될 수 있다(Lasko, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236). 이와 같은 세포-형 특정 활성화에 요구되는 조절 서열은 소요의 특정 세포형에 따라 달라지고 이는 본 기술에 숙지의 지식을 가진 자에게 분명한 것이다. Rasp-1 유전자 트란스진이 내생 Rasp-1 유전자의 크로모좀 부위에 삽입되는 경우 유전자 표적화가 바람직하다. 간단히 말하면, 이와 같은 기술이 이용되는 경우에, 내생 Rasp-1 유전자에 동종인 일부 뉴클레오티드 서열을 가지는 벡터는 크로모좀 서열과 동종 하이브리드화를 통하여 내생 Rasp-1 유전자의 뉴클레오티드에 삽입되어 이 기능을 파괴하도록 고안한다. 특정 세포형에 트란스진을 선택적으로 도입시켜 내생 Rasp-1 유전자를 세포형에 의해 비활성화시킨다(Gu, et al., 1994, Science 265: 103-106). 이와 같은 세포-형 특이적인 비활성화에 요구되는 조절 서열은 소요의 특정 세포형에 따라 달라지는데 이 또한 본 기술 분야에 공지의 것이다.

일단 유전자 전이동물이 만들어지고 나면, 재조합 Rasp-1 유전자 발현으로 표준기술을 이용하여 검사한다. 트란스진의 삽입이 일어났는 지를 검사하기 위해 동물조직을 분석하는 서든 블랏 분석 또는 PCR 기술에 의해 초기 스크리닝을 할 수 있다. 유전자 전이 동물의 조직에서 트란스진의 mRNA 발현수준은 동물에서 수득한 조직 샘플의 노던 블랏 분석, in situ 하이브리드 분석과 RT-PCR을 포함한 기술을 이용하나 이에 국한하지 않은 기술에 의해 추정할 수 있다. Rasp-1 유전자-발현 조직 샘플은 Rasp-1 트란스진 생성물에 특이적인 항체를 이용하여 면역세포학적으로 평가할 수 있다.

5.3. RASP-1 단백딜에 대한 항체.

Rasp-1 유전자 생성물에 대한 항체도 본 발명의 범위에 속하는데 하나이상의 Rasp-1 유전자 생성물 에피토프를 특이적으로 인지하는 항체를 포함한다. 이와 같은 항체에는 다클론성 항체, 단클론 항체(mABS), 인격화된 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab')₂단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편, 항 인자형(항-Id)항체, 전술한 것의 에피토프-결합 단편을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 예로써, 이와 같은 항체는 혈장 또는 혈청을 포함하나 이에 국한되지 않는 생물학적 샘픔에서 Rasp-1 유전자 생성물의 감지에 이용될 수 있다. 또한, 비정상적인 Rasp-1 유전자 생성물의 활성을 저해하는 방법으로 항체를 이용할 수 있다. 따라서, 이와 같은 항체는 간 질환 치료법의 일부로 이용하거나 진단기술의 일부로 이용되고 환자는 비정상적인 Rasp-1 유전자 생성물의 수준을 테스트받거나 이와 같은 단백질의 비정상적인 형태의 존재에 대해 테스트 받는다. 또한, 이와 같은 항체는 간 재생과정 동안에 Rasp-1 유전자의 발현을 모니터하는데 이용될 수 있다.

Rasp-1 유전자 생성물에 대한 항체를 생산하기 위해, 다양한 숙주 동물을 Rasp-1 유전자 생성물 또는 이의 일부분은 주입하여 면역화시킬 수 있다. 이와 같은 숙주 동물에는 토끼, 생쥐, 쥐 등을 포함하나 이에 한정시키지는 않는다. 숙주 종에 따라 다양한 어쥬번트를 이용하여 면역학적 반응을 증가시키는데 예를 들면, 플루운츠(컴플리트와 인컴플리트), 수산화 알루미늄과 같은 미네랄 겔, 리졸레시틴, 플루론성 폴리올, 폴리안이온, 펩티드, 오일 유제, 키홀 림페트 헤모시아닌, 디니트로 페놀과 같은 표면 활성물질과 BCG(bacille Calmette-Guerin)와 코리네박테리움 파르붐과 같은 유용한 사람 어쥬번트를 포함하나 이에 한정하지는 않는다.

Rasp-1 유전자 생성물 또는 이의 항원 기능을 하는 유도체와 같은 항원으로 면역화시킨 동물의 혈청에서 유도한 항체 분자의 이형 집잔이 다클론성 항체이다. 합성 RASP-1 펩티드에 대한 다클론성 항체 생성은 단락 6에 상술하고 있다. 일반적으로, 다클론 항체의 생산을 위해, 전술한 것과 같은 숙주 동물은 상기에서 언급한 것과 같은 어쥬번트가 보충된 Rasp-1 유전자 생성물의 주입에 의해 면역화된다.

특정 항원에 대한 동종 항체 집잔인 단클론 항체는 배양물에서 연속 세포에 의해 항체 분자를 생성시킬 수 있는 임의 기술에 의해 수득될 수 있다. 여기에는 Kohler와 Milsten, (1975, Nature 256:495-497; and U.S Patent No. 4,376,110)의 하이브리도마 기술, 사람 B-새포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 포함하나 이에 국한시키지 않는다. 이와 같은 항체에는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD와 이의 아류를 포함하는 임의 면역글로블린 종류가 된다. 본 발명의 mAb를 만드는 하이브리도마는 시험관 또는 생체에서 배양한다. 생체에서 고역가의 mAb 생산이 본 발명에 적절한 방법이다.

키메라 항체를 생산하는데 이용되는 기술은 적절한 생물학적 활성을 가진 사람 항체 분자의 유전자에서 적절한 항원의 쥐항체 부분 유전자를 절단하여 이용한다(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454). 상이한 동물종에서 상이한 부분을 유도한 분자가 키메라 항체로써, 이는 쥐 mAb와 사람 이뮤노글로블린 항생 부분에서 유도된 다양한 부분을 가진다.

Rasp-1 유전자 생성물에 대한 단일 사슬 항체를 만드는데 있어서 단일 사슬 항체 생산을 위한 기술(U.S. Patent 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; and Ward et al., 1989, Nature 334:544-546)이 이용된다. 단일 사슬 항체는 아미노산 다리에 의해 Fv 부분의 중사슬과 경사슬을 연결시켜 단일 사슬 폴립펩티드가 형성된다.

공지 기술을 이용하여 특정 에피토프를 인지하는 항체 단편이 만들어진다. 예를 들면 이와 같은 단편에는 항체 분자의 펩신 절단에 의해 생성된 F(ab')₂단편 F(ab')₂단편의 이황화 결합의 환원시켜 만들어진 Fab 단편이 포함되나 이에 한정하지는 않는다. 또는 Fab 발현 라이브러리를 만들어 소요의 특이성을 가지는 단클론 Fab 단편을 신속하고 용이하게 확인할 수 있다.

5.4. 간질환의 진단방법.

상기 5.3에서 상술한 항체를 이용하여 간질환을 진단할 수 있다. 이와 같은 간질환에는 간염, 간경변, 간암 및 FHP를 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 이와 같은 질환에는 간에 손상으로 5.1에서 상술하고 있는 유전자의 발현이 상향-조절되어 결과적으로 정상 간과 비교할 때 RASP-1 단백질의 과량이 생성된다. 또한, 간암의 경우에 Rasp-1 유전자의 막대한 상향조절이 간질환을 유도한다. 이와 같은 질환을 감지하기 위해, RASP-1 단백질에 대한 라벨된 항체로 적절한 생물학적 샘플을 처리하여 생성된 RASP-1 단백질 수준을 결정한다. 정상 개체에서 발견되는 것과 비교하여 감지된 RASP-1 단백질의 양이 상당히 많은 경우 간질환이 있는 것을 나타낸다.

혈액 또는 다른 조직 및 세포에서 RASP-1 단백질을 본 기술에 공지된 기술을 이용하여 용이하게 분리할 수 있다. 이용된 단백질 분리방법은 Harlow and Lane (Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)에서 상술하고 있다.

야생형 또는 돌연변이 RASP-1 단백질을 감지하는 적절한 진단 방법은 면역검사를 포함하나 항-RASP-1 단백질 특이적 항체와의 상호작용에 의해 RASP-1 단백질이 감지될 수 있다.

예를 들어 본 발명에 유용한 5.3에서 상술하는 것과 같은 항체 또는 항체 단편을 이용하여 정량적으로 또는 정성적으로 야생형 또는 돌연변이형 RASP-1 단백질의 존재를 감지할 수 있다. 광 현미경, 흐름 세포 계산기 또는 형광 감지가 결합된 형광 라벨된 항체를 이용한 면역형광 기술에 의해 이루어질 수 있다. RASP-1 단백질이 세포 표면에서 발현되는 경우에 이와 같은 기술이 특별이 적절하다.

본 발명에 유용한 항체(또는 이의 단편)는 RASP-1 단백질의 감지를 위해 면역형광 또는 면역전자현미경을 이용할 수 있다. 이와 같은 감지는 환자에서 조직을 떼어내어, 본 발명의 항체에 이를 적용하여 이루어질 수 있다. 항체(또는 단편)는 생물학적 샘플위에 라벨된 항체(또는 단편)를 겹쳐서 이용할 수 있다. 이 과정을 이용하여 RASP-1 단백질의 존재를 결정하고 검사된 조직에서 이의 분포도 결정할 수 있다. 본 발명을 이용하면, 다양한 조직적 방법(착색과정)을 수득한 본 기술에 숙지의 기술을 가진 자는 이와 같은 in situ 감지를 위해 적절히 수정할 수 있다.

야생형 또는 돌연변이 RASP-1 단백질의 면역검사는 일반적으로 혈장, 혈청, 조직추출물, 수득세포 배양세포와 같은 생물학적 유체와 같은 생물학적 샘플을 RASP-1 단백질을 확인할 수 있는 감지가능한 라벨된 항체존재하에 배양하고, 본 기술에 공지된 다수의 기술을 이용하여 결합된 항체를 감지하는 것으로 구성된다.

생물학적 샘플은 고형상 서포트에 고정시키거나 또는 니트로셀룰로오즈와 같은 운반체에 고정시키거나 또는 세포, 세포입자 또는 가용성 단백질을 고정시킬 수 있는 고형 서포트에 접촉시킬 수 있다. 서포트는 적절한 완충액으로 세척시키고 감지가능한 라벨된 RASP-1 단백질 특이적 항체로 처리한다. 고형상 서포트는 결합안된 항체를 제거하기 위해 완충액으로 두 번 세척한다. 고형 서포트에 결합된 라벨 양은 통상적인 수단에 의해 감지된다.

고형상 서포트 또는 운반체는 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 서포트를 말한다. 공지된 서포트 또는 운반체에는 유리, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 천연 및 변형 셀루로오즈, 폴리아크릴아미드, 반려암 및 자석 등을 포함한다. 운반체의 성질은 어느 정도 가용성이거나 본 발명의 목적을 위해 불용성일 수 있다. 서포트 물질은 결합된 분자가 항원 또는 항체에 결합할 수 있는 한 실제 임의 가능한 구조적 모양을 가질 수 있다. 따라서, 서포트 모양이 비드와 같은 구형일 수도 있고, 테스트 튜브의 내면 또는 막대의 외면과 같이 실린더형일 수 있다. 또는 표면은 쉬트, 테스트 띠등과 같이 편평할 수도 있다. 적절한 서포트로는 폴리스티렌 비드를 포함한다. 본 기술에 숙지의 지식을 가진 자는 항체 또는 항원에 결합할 수 있는 다른 많은 적절한 운반체를 알거나 또는 일상적인 실험을 이용하여 확인할 수 있다.

항-야생형 또는 돌연변이 항-RASP-1 항체의 결합 활성은 공지의 방법에 따라 결정할 수 있다. 본 기술에 숙지의 지식을 가진 자는 일상적인 실험을 통하여 각 측정에 적합한 검사조건을 결정할 수 있다.

RASP-1 단백질 특이적인 항체를 라벨하는 방법중 하나는 효소에 이를 연결시키는 효소 면역검사(EIA)를 이용하는 것이다(Voller, The Enzyme Linked Imminosorbent Assay (ELISA), Diagnostic Horizons 2:1-7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller, et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, Meth. Enzymol. 73:482-523(1981); Maggio, (ed.) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980; Ishikawa, et al., (eds.) Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo, 1981). 항체에 결합할 수 있는 효소는 분광광도계, 형광계 또는 시각적 수단에 의해 감지할 수 있는 화학부분을 만들 수 있는 방식으로 적절한 기질, 바람직하게는 화학적 기질에 반응할 수 있다. 항체를 감지가능하도록 라벨시키는데 이용되는 효소에는 말레이트 디하이드로게나제, 스타필로코커스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 이스트 알코올 디하이드로게나제, 알파-글리세로포스페이트, 디하이드로게나제, 트리오즈 포스페이트 이소머라제, 양고추 냉이 퍼옥시다제, 알칼리 포스포타제, 아스파라기나제, 글루코즈 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코오즈-6-포스페이트 디하이드로게나제, 글루코아밀라아제와 아세틸콜린트란스퍼라제를 포함하나 이에 한정하지 않는다. 효소용 발색 기질을 이용하는 발색 방법에 의해 감지가 이루어질 수 있다. 감지는 또한 비슷하게 준비된 표준과 비교하여 기질의 효소반응의 정도를 시각적으로 비교하는 것으로 이루어질 수 있다.

다른 다양한 면역검사를 이용하여 감지할 수도 있다. 예를 들면, 방사활성적으로 항체 또는 항체 단편을 라벨링하여, 방사능 면역검사(RIA)를 통하여 야생형 또는 돌연변이 RASP-1 단백질의 감지가 가능하다(Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, which is incorporated by reference herein). 방사능활성 동위원소는 감마 카운터 또는 신틸레이션 카운트 또는 자가방사그래프와 같은 수단에 의해 감지될 수 있다.

형광화합물로 항체를 라벨링하는 것도 가능하다. 형광 라벨된 항체를 적절한 파장의 빛에 노출시키면 이의 존재는 형광에 의해 감지될 수 있다. 가장 흔히 이용되는 형광 라벨링 화합물은 플로로레신 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리틴, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데히드와 플로로스카민 등이 있다.

항체는¹⁵²Eu와 같은 형광을 방출하는 금속 또는 다른 란탄 시리즈를 이용하여 감지가능하도록 라벨시킬 수 있다. 이와 같은 금속은 디에틸렌트리아민페타아세트산(DTPA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 금속 킬레이트기를 이용하여 항체에 부착할 수 있다.

항체는 화학적 발광화합물에 이를 결합시킴으로써 감지가능하도록 라벨시킬 수 있다. 화학 반응동안에 발생하는 발광을 감지함으로써 화학적 발광물이 있는 항체를 알 수 있다. 특히, 유용한 화학적 발광물질로는 루미놀, 이소루미놀, 테로마틱 아크리디움 에스테르, 이미다졸, 아크리디움염 옥살레이트 에스테르이다.

유사하게, 생물학적 발광화합물을 이용하여 본 발명의 항체에 라벨할 수 있다. 생물학적 발광은 생물학계에 있는 화학적 발광형인데, 촉매 단백질이 화학적 발광 반응의 효율을 증가시킨다. 발광물질의 존재를 감지함으로써 생물학적 발광 단백질의 존재를 알 수 있다. 라벨 목적으로 중요한 생물학적 발광 화합물은 루시페린, 루시퍼라제와 에퀴린이다.

5.5. Rasp-1 유전자 생성물을 이용하여 간조직의 치료, 재생 및 성장시키는 방법.

5.5.1. 선내의 간조직의 치료

5.2에서 상술한 Rasp-1 유전자 생성물은 다양한 상황에서 간 조직의 생장 또는 재생을 강화하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에 환자의 간이 손상되어도 더이상 복구가 되지 않는다. 예를 들면, 과량의 알코올 소비는 간 경변을 유도한다. 간세포 파괴는 불연속적인 알코올 소비로 인한 것이나 회복은 될 수 있고 이는 간의 연속적인 재생을 요구한다. 이와 같은 경우에, 자연적인 재생과정이 과다한 간조직의 손상으로 인하여 손상될 수 있다. 임의 경우에서, 5.8에서 상술하는 Rasp-1 유전자 생성물로 구성된 제약학적 조성물로 환자를 치료하면 재생을 강화할 수 있고 따라서 신속히 회복할 수 있다.

일부 경우에서, 기증자의 간의 일부 또는 전부를 이식할 필요가 있다. 이와 같은 이식 치료동안에 살아있는 제공자와 수용자 간의 재생은 5.8에서 상술하고 있는 Rasp-1 유전자 생성물로 구성된 제약학적 조성물을 투여하여 이루어질 수 있다.

다른 상황에서는, 5.5.2에서 상술하는 방법에 따라 만들어진 인공 간을 간질환으로 고통을 받는 환자에게 이식할 수 있다. 정상 간의 생물학적 능력을 보유하지 못하는 단계에서 인공간을 이식하면 바람직한 효과를 얻을 수 있다. 이식물의 능력을 강화시키기 위해, 생장 속도는 5.8에서 상술하는 것과 같이 Rasp-1 유전자 생성물을 포함하는 제약학적 조성물을 투여하여 강화할 수 있다.

환자의 고유 간이 손상되거나 질병을 가지는 경우에, 이를 방치하거나 부분적으로 제거하는데, 기증자로부터 이식될 간조직 또는 이식된 인공 간조직으로부터 서포트를 요구한다. 이와 같은 경우에 Rasp-1 유전자 생성물로 구성된 제약학적 조성물을 이용하여 환자의 고유 간조직의 생장을 강화시키고 또한 이식된 간조직의 생장을 강화시킨다.

세포생장을 강화시키는데 있어서 Rasp-1 유전자 생성물을 조혈세포를 포함한 다른 조직에도 이용할 수 있다.

5.5.2. 시험관 내 간조직 배양물.

시험관에서 간조직 배양물은 다양한 용도를 가진다. 간손상 또는 간 질환으로 고통을 받는 환자를 치료하는데 있어서 간 조직 배양물을 이용하여 직접적인 이식 또는 외선 간 장치의 일부로서 고유 간을 서포트하거나 대체할 수 있다. 또한, 이와 같은 간 조직 배양물은 약물과 다른 화합물의 독성을 테스트하기 위한 모델로 작용한다.

기능을 가진 간 조직이 미국 특허 5,266,480에서 상술하는 3차원 조직 배양시스템을 이용하여 만들 수 있다. 이 시스템에 따르면, 간세포는 사람 간 생검 또는 부검 물질에 이용되는 통상적인 방법(Berry and Friend, 1969, J. Cell Biol. 43 : 506-520)을 이용하여 분리할 수 있다. 간략하면, 정맥문 또는 문분지에 캐뉼라를 넣고 간은 조직이 색이 엷어질때까지 칼슘, 마그네슘 완충액으로 관류시킨다. 기관은 적절한 유속에서 콜라게나제 용액과 같은 단백질 분해 효소로 관류된다. 이는 연결 조직 구조를 절단한다. 간은 완충액으로 세척해내고 세포는 분산된다. 세포 현탁액은 찌꺼기를 제거하기 위해 70㎛ 나일론 메쉬를 통하여 여과시킨다.

간세포는 두 번 또는 3번의 차등 원심분리에 의해 세포현탁액에서 선택될 수 있다.

절단된 사람간의 각 엽의 관류를 위해, HEPES 완충액이 이용된다. HEPES 완충액에서 콜라게나제의 관류는 30㎖/분 속도에서 이루어진다. 단일 세포 현탁액은 37℃에서 15-20분간 추가 콜라게나제로 배양하여 수득할 수 있다(Guguen-Guillouzo and Guillouzo, eds., 1986, Isolated and Culture Hepatocytes, Paris, INSERM, and London, John Libbey Eurotext, pp. 1-12; 1982, Cell Biol. Int. Rep. 6 : 625-628).

분리된 간세포는 3차원 기질에 접종시키는데 이용된다. 접종된 기질은 미국 특허 5,266,480에서 골수와 피부에 대해 상술하는 기술에 따라 배양시키고 생리학적 조건과 필적하는 시스템에서 시험관 내 간세포를 복제한다. 또한, 또다른 방법에 의해 생장된 간조직 배양물 또는 3차원 간 배양물의 생장 속도와 발생은 생장배지에 Rasp-1 유전자 생성물을 첨가하여 강화할 수 있다. 이로써 간세포에 의한 발현기능이 증가된다.

5.6. Rasp-1 유전자 발현에 영향을 주어서 간질환을 치료하는 방법.

하기에서 상술하는 것은 5.1에서 상술하고 있는 핵산으로 간질환을 치료하는 방법에 대해 상술하고 있다 .경변을 포함하나 이에 한정하지 않은 특정 경우에, Rasp-1 유전자 생성물의 활성의 증가는 간 손상을 재생시키거나 제거할 수 있다. 또한 특정 간 질환은 Rasp-1 유전자 발현 수준의 감소 또는 제거를 야기시킨다. 유전자 발현 수준을 증가시켜 간 질환증상을 제거할 수 있다. 5.6.1에서는 Rasp-1 유전자 발현 수준을 증가시키는 기술에 대해 설명한다.

간암을 포함하나 이에 국한하지 않은 경우에, 간 질환은 Rasp-1 유전자 생성물의 과다수준에 의해 또는 비정상적인 또는 활성의 과다를 나타내는 Rasp-1 유전자 생성물의 존재에 의해 야기된다. 이와 같은 유전자 생성물의 활성 또는 수준을 감소시켜 간질환 증상을 감소시킨다. 5.6.2에서는 Rasp-1 유전자 발현 수준을 감소시키는 기술에 대해 설명한다.

5.6.1. Rasp-1 유전자 발현의 복귀 또는 증가시키는 방법.

Rasp-1 유전자는 간질환 상태에서 적게 발현될 수 있다. 본 단락에서는 Rasp-1 유전자 발현을 증가시켜 간질환 증상이 제거되거나 간재생이 강화될 수 있는 방법에 대해 상술하고 있다.

예를 들면, Rasp-1 유전자 생성물을 인코드하는 RNA 서열은 간 질환증상이 감소될 수 있도록 Rasp-1 유전자 생성물 수준을 만들기 위해 충분한 농도로 간질환을 가지는 환자에게 직접 투여한다. 5.8에서 상술하고 있는 것과 같이 리포좀 투여와 같은 화합물의 세포 내 투여를 위한 기술을 이용하여 RNA 분자의 투여할 수 있다. 5.2에서 설명하는 것과 같이 재조합 기술을 이용하여 생산할 수 있다.

또한 환자는 유전자 대체 요법으로 치료받을 수 있다. Rasp-1 유전자 기능이 있는 정상적인 Rasp-1 유전자 생성물의 생산에 관여하는 정상 Rasp-1 유전자 또는 이의 일부분의 하나이상을 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스와 레트로바이러스를 포함하나 이에 국한되지 않은 벡터를 이용하고 또한 리포좀과 같은 세포에 DNA를 도입시키는데 이용되는 입자를 이용하여 세포에 삽입시킬 수 있다. 또한, 전술한 기술을 사람세포에 정상적인 Rasp-1 유전자 서열을 도입시키는데 이용할 수 있다. 5.2에서 상술하는 재조합 방법에 따라 RNA 또는 DNA 서열의 발현을 최적화시킬 수 있다.

정상적인 Rasp-1 유전자 발현 서열을 포함하는 세포, 적절하게는 자가인식 세포를 환자의 간질환 증상을 제거할 수 있는 부위에서 도입시킬 수 있다. 이와 같은 세포 대체 기술은 Rasp-1 유전자 생성물이 세포외 유전자 생성물로써 분비될 때 적절하다.

5.6.2. Rasp-1 유전자의 발현을 저해하는 화합물과 방법.

전술한 것과 같이, 비정상적인 Rasp-1 유전자는 Rasp-1 유전자 생성물 활성의 증가를 통하여 간질환을 일으킨다. 다양한 기술을 이용하여 이와 같은 Rasp-1 유전자의 발현을 저해시킬 수 있다.

간질환 증상을 감소시키는 능력을 가지는 화합물에는 5.1에서 상술한 서열에서 유도된 3중 나선 분자, 리보자임, 안티센스 등이 있다. 이와 같은 분자는 다량의 또는 비정상적(돌연변이) Rasp-1 유전자 발현수준을 감소시키도록 고안된다. 본 기술 분야에는 이와 같은 분자의 생산과 이용 기술이 공지되어 있다.

안티-센스 RNA와 DNA분자는 Rasp-1 mRNA에 하이브리드되어 단백질 해독을 방해함으로써 mRNA의 해독을 직접적으로 차단할 수 있다. 안티 센스 DNA의 경우에는 해독 개시 부위, 예를 들어 Rasp-1 유전자 뉴클레오티드의 -10 내지 +10 부위에서 유도된 올리고데옥시 리보뉴클레오티드가 적절하다.

리보자임은 RNA를 특이적으로 절단하는데 촉매역할을 할 수 있는 효소 RNA 분자이다. 리보자임 작용 메카니즘은 상보적인 Rasp-1 RNA에 리보자임이 서열 특이적 하이브리드와 이어서 엔도뉴클레아제 절단이 연관된다. 리보자임 분자 조성물에는 Rasp-1 유전자 mRNA에 상보적인 하나이상의 서열을 포함하고 mRNA 절단시킬 수있는 공지의 촉매 서열을 포함한다. 본 발명의 범위내에는 Rasp-1 유전자 생성물을 인코드하는 RNA 서열의 엔도뉴클레아제 절단을 특이적이고 효과적이고 촉매하도록 조작된 망치머리모양 모티프의 리보자임 분자도 포함한다.

임의 RNA 표적내에 특이적인 리보자임 절단부위는 GUA, GUU와 GUC를 포함하는 리보자임 절단부위에 대한 소요의 분자를 스케닝하여 초기 확인할 수 있다. 일단 확인되면, 절단부위를 포함하는 Rasp-1 유전자 부위에 상응하는 15개 내지 20개 리보뉴클레오티드의 짧은 RNA 서열이 2차 구조와 같은 예상된 구조적 특징에 대해 평가되는데 이는 올리고 뉴클레오티드 서열을 제공하기에는 부적절하다. 추천된 서열의 적합성은 리보뉴클레아제 보호 검사를 이용하여 상보적인 올리고뉴클레오티드와 하이브리드하기 위해 이들의 근접성에 의해 평가된다.

전사를 방해하기 위한 3중 나선 형성에 이용되는 핵산 분자는 단일 가닥으로 데옥시리보뉴클레오티드로 구성되어야 한다. 이들 올리고뉴클레오티드의 기본 조성물은 Hoogsteen 염기쌍 규칙에 따라 3중 나선 형성을 촉진하도록 고안되고 이는 일반적으로 이중 나선의 한 가닥에 있는 퓨린 또는 피리미딘의 스트레치를 요구한다. 뉴클레오티드 서열이 피리미딘-염기인 경우 생성된 3중 나선의 세 개 연합된 가닥에서 TAT와 CGC⁺삼중체가 있게 된다. 피리미딘이 많은 분자는 가닥의 방향과 나란하게 이중나선의 한 가닥의 퓨린이 많은 부분에 상보적인 염기를 제공한다. 또한, 핵산 분자는 G잔기 스트레치를 포함하는 퓨린이 많은 것으로 선택될 수 있다. 이들 분자들은 GC쌍이 풍부한 DNA 나선이 있는 3중 나선을 형성할 수 있고 퓨린기 대부분은 표적이 되는 이중나선의 단일 가닥에 위치하여 삼중나선의 세 번째 가닥을 가로지르는 GGC 삼중체를 만들게 된다.

또한, 3중 나선 형성에 대해 표적이 되는 서열을 스위치백 핵산 분자를 만들어 증가시킬 수 있다. 스위치백 분자는 5'-3', 3'-5' 방식으로 합성되어 이중나선의 처음 제1가닥에서 염기쌍을 이루고 그다음 다른 가닥과 염기 쌍을 이루어 이중나선에 있는 퓨린 또는 피리미딘의 스트레치 필요성이 없어진다.

여기에서 상술하는 안티센, 리보자임 또는 삼중 나선 분자는 정상적인 그리고 돌연변이 Rasp-1 유전자 대립형질에 의해 생성되는 mRNA의 전사(3중 나선) 또는 해독(안티센스, 리보자임)을 감소시키거나 방해할 수 있다. Rasp-1 유전자 생성물 활성의 정상 수준을 유지시키기 위해, 정상 활성을 가지는 Rasp-1 유전자 폴리펩티드를 인코드하고 발현시키는 핵산 분자를 서열을 포함하지 않은 세포에 도입시켜, 안티센스, 리보자임 또는 삼중 나선처리를 이용할 수 있다. 또는 세포 또는 조직 Rasp-1 유전자 생성물 활성의 요구되는 수준을 유지시키기 위해 세포 또는 조직적으로 정상적인 Rasp-1 유전자 생성물을 공동투여하는 것이 바람직하다.

DNA와 RNA 분자합성에서 공지된 임의 방법에 따라 본 발명의 안티-센스 RNA와 DNA, 리보자임 및 삼중 나선 분자를 만들 수 있다. 여기에는 고형상 포스포라미디트 화학적 합성과 같은 본 기술분야에 공지된 올리고 데옥시리보뉴클레오티드와 올리고리보뉴클레오티드를 화학적으로 합성할 수 있는 기술을 포함한다. 또는 RNA 분자는 안티센스 RNA 분자를 인코드하는 DNA 서열의 시험관 및 생체 전사에 의해 만들 수 있다 이와 같은 DNA 서열은 T7 또는 SP6 폴리머라제 프로모터와 같은 적절한 RNA 폴리머라제 프로모터에 결합된 다양한 벡터내로 결합될 수 있다. 또는 사용된 프로모터에 따라 유도성이거나 또는 구성적인 안티센스 RNA를 합성하는 안티센스 cDNA 구조는 세포주내로 안정하게 도입될 수 있다.

세포내에 안정성과 반감기를 증가시키는 수단으로써 DNA 분자에 다양한 공지의 수정을 가할 수 있다. 가능한 변형에는 분자의 5' 또는 3' 단부에 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드의 인접 서열의 추가 또는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 구조내에 포스포디에스테라제 연결외에 2' O-메틸 또는 포스포로티오에이트를 이용하는 등을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다.

5.7. Rasp-1 유전자 생성물 활성을 저해함으로써 간질환의 치료방법.

전술한 것과 같이, 간 질환은 다량의 Rasp-1 유전자 생성물 또는 돌연변이에 의한 것이다. 유해한 Rasp-1 유전자 생성물의 활성을 제거함으로써 이와 같은 간질환을 감소시킬 수 있다. 이와 같은 Rasp-1 유전자 생성물의 활성을 다양한 기술을 이용하여 방해할 수 있다.

Rasp-1 유전자 생성물에 특이적이고 이와 같은 활성을 간섭할 수 있는 항체를 이용하여 Rasp-1 유전자 생성물의 기능을 막을 수 있다. 5.3에 상술된 표준기술을 이용하여 단백질 자체에 대한 또는 단백질의 일부에 상응하는 펩티드에 대한 항체를 만들 수 있다. 이와 같은 항체에는 다클론성, 단클론성, Fab 단편, 단일 사슬 항체, 키메라항체를 포함하나 이에 국한하지 않는다.

Rasp-1 유전자 생성물이 세포내의 것이고 전체 ㅏㅇ체가 이용되는 경우에, 내화 항체가 바람직하다. 그러나, 세포내에 Rasp-1 유전자 생성물 에피토프에 결합하는 Fab 부분의 단편 또는 항체를 운송하는데 리포펙틴 리포좀을 이용한다. 항체 단편이 이용되는 경우에, Rasp-1 유전자 생성물의 결합 도메인에 결합하는 최소 저해 단편이 적절하다. 예로써, Rasp-1 유전자 생성물에 결합하는 항체의 다양한 부분에 상보적인 아미노산 서열을 가지는 도메인이 이용될 수 있다. 이와 같은 펩티드는 본 기술에 공지의 방법을 이용하여 화학적으로 합성되거나 재조합 DNA 기술에 의해 만들 수 있다(Creighton, 1983, supra; and Sambrook et al., 1989, supra). 또는 세포 내 Rasp-1 유전자 생성물 에피토프에 결합할 수 있는 단일 사슬 중화항체를 투여할 수 있다. 예를 들면, Marasco, W. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 7889-7893에서 상술하는 기술을 이용하여 표적세포집단내에 단일-사슬 항체를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 발현하여 투여될 수 있다.

예를 들여, Rasp-1 유전자 생성물이 세포외의 것으로 또는 막통과 단백질인 경우, 펩티드 투여에 적합한, 5.8에서 상술하고 있는 투여기술을 이용하여 작용부위에 Rasp-1 유전자 생성물에 대한 저해 항체를 효과적으로 투여한다.

5.8. 제약학적 조성물과 투여방법.

간 재생 활성을 가지는 또는 Rasp-1 유전자 발현에 영향을 주거나 또는 유전자 생성물 활성을 가지는 확인된 단백질 화합물은 간질환을 치료하거나 감소시킬 수 있는 치료요법적으로 효과량을 환자에 투여한다. 치료요법적으로 효과량은 간질환 증상을 감소시킬 수 있는데 충분한 화합물의 양을 말한다.

5.8.1. 효과량

화합물의 독성과 치료요법적인 효과는 세포 배양 또는 실험동물에서 LD₅₀(집단의 50%를 치사시킬 수 있는 양)과 ED₅₀(집단의 50%에 효과적인 치료요법적 양)을 결정하려는 것과 같은 표준 과정에 의해 이루어진다. 독성과 치료요법적 효과사이의 약량비율은 치료요법적 지수로써 LD₅₀/ED₅₀비율로 나타낸다. 치료요법적 지수가 큰 화합물이 바람직하다고 감염 안된 세포에 손상을 최소화하여 부작용을 감소시킬 수 있도록 환부 조직에 이와 같은 화합물을 표적화시킬 수 있는 수송시스템을 고안할 수 있다.

세포 배양검사와 동물조직에서 수득한 데이타를 이용하여 사람에 이용할 수 있는 약량범위를 만들 수 있다. 이와 같은 화합물의 약량은 독성이 적거나 없는 ED₅₀을 포함하는 계산농도범위에 있는 것이 바람직하다. 약량은 이용되는 약형과 이용되는 투여경로에 따라 다양한다. 본 발명에 이용되는 화합물의 경우에, 치료요법적으로 효과적인 약량은 세포 배양검사에서 평가된다. 세포 배양에서 결정된 것과 같이 IC₅₀(증상의 최대 50%를 저해할 수 있는 화합물의 농도)를 포함하는 순환계 혈장 농도범위를 얻기 위해 동물 모델에서 약량을 결정한다. 이와 같은 정보를 이용하여 사람에서 이용할 수 있는 정확한 약량을 결정할 수 있다. 혈장에서 수준은 HPLC에 의해 측정된다.

5.8.2. 조성물과 용도

본 발명에 따라 이용할 수 있는 제약학적 조성물은 하나이상의 생리학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제를 이용하여 통상적인 방식으로 제조할 수 있다.

따라서, 화합물과 이의 생리학적으로 수용가능한 염 및 용매를 흡입 또는 통기(구강 또는 코를 통하여) 또는 경구용, 볼, 비경구 또는 직장 투여에 의해 투여될 수 있도록 조제할 수 있다.

경구 투여용으로, 제약학적 조성물은 결합제(예를 들면 선겔라틴화된 옥수수전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오즈) 충진물(락토즈, 미소결정 셀룰로오즈 또는 수소칼슘 인산염); 윤활제(마그네슘 스테아레이트, 활석 또는 실리카); 분해제(옥수수 전분, 글리콜레이트 나트륨 전분) 또는 가습제(소듐 라우릴 설페이트)와 같은 제약학적으로 수용가능한 부형제를 사용하여 통상적인 방법에 의해 준비된 정제 또는 캡슐형태가 될 수 있다. 본 기술에 공지의 방법에 의해 정제를 피복시킬 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 조성물은 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태이거나 또는 사용하기 전에 물 또는 다른 적절한 담체로 재구성될 수 있는 건조 생성물로 만들 수 있다. 이와 같은 액상 조성물은 현탁제(솔비톨 시럽, 셀룰로오즈 유도체 또는 수소화된 식용기름); 유화제(레시틴 또는 아카시아); 비-수용성 담체(알몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분절된 식물성 오일) 및 보존제(메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빈산)와 같은 제약학적으로 수용가능한 첨가제와 함께 통상적인 수단을 이용하여 만들 수 있다. 이와 같은 조성물에는 완충염, 향료 발색제 및 적절한 감미제를 포함할 수 있다.

경구 투여용 조성물은 활성 화합물의 제어된 방출을 제공하기 위해 조성될 수 있다.

볼에 투여를 위해서는 통상적인 방식으로 조성된 정제 또는 로젠 형태가 될 수 있다.

흡입에 의한 투여를 위해서는 본 발명에 이용될 수 있는 화합물은 감압 팩 또는 분부기로부터 디클로로디플로로메탄, 트리클로로플로오르메탄, 디클로로테트라플로로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적절한 기체와 같은 적절한 추진 물질을 이용하여 에어로졸 스프레이 형태로 수송될 수 있다. 감압된 에어로졸의 경우에, 약량 단위는 측정된 양을 수송하는 밸브를 제공하여 결정한다. 흡입기에서 이용할 수 있는 캡슐 및 젤라틴 연골은 락토즈 또는 전분과 같은 적절한 분말 염과 화합물의 분말 홉합물을 포함하는 것으로 조성될 수 있다.

화합물은 알약 주입 또는 연속 주입과 같은 주사에 의해 비경구적으로 투여될 수 있도록 제조된다. 주사용 조성물은 앰플 또는 추가 보존제와 함께 다중-약량 용기에서 단위 약량형태로 제공될 수 있다. 조성물은 현탁액, 용액 또는 오일 또는 수용액 담체에 유제의 형태가 되거나 또는 현탁제, 안정화제 또는 분산제와 같은 조성물을 포함할 수 있다. 또는 활성성분은 사용하기 전에 멸균 발열물질 없는 물과 같은 적절한 담체와 재구성될 수 있는 분말 형태가 될 수 있다.

직장 투여를 위한 조성물은 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 염기를 포함하는 좌약 또는 관장액을 포함할 수 있다.

전술한 조성물에 추가하여, 화합물은 데포트 조성물로 만들어질 수 있다. 이와 같은 장기 작용 조성물은 이식(예를 들어 피하 또는 근육 내) 또는 근육 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 화합물은 적절한 고분자 또는 소수성 물질(예를 들면 수용가능한 오일에 유제) 또는 이온교환 수지로 만들어지거나 또는 가용성이 약한 염과 같은 약한 가용성을 가진 유도체로 만들어질 수 있다.

조성물이 활성 성분을 포함하는 하나이상의 단위 약량형을 포함하는 팩 또는 디스펜스 장치에 제공될 수 있다. 팩은 블리스터 팩과 같은 금속 또는 플라스틱 호일로 구성된다. 팩 또는 디스펜스 장치는 투여 지시에 따라 수반될 수 있다.

6. Rasp-1 유전자의 확인

여기에서는 신규한 유전자 Rasp-1의 확인에 대해 상술한다. Rasp-1 유전자는 재생 간조직에서 상향조절에 기초하여 확인될 수 있다(도 2). Rasp-1 유전자는 간 재생에서 중요한 역할을 하는 RASP-1 단백질을 인코드한다. cDNA 서열분석에서 RASP-1은 436개 아미노산으로 된 전구체로 분비된 단백질이다(도 1). RASP-1 단백질의 분비는 면역블랏에 의해 정상 쥐의 혈장에서 RASP-1의 감지에 의해 확인된다(도 4). 또한, 다중 쥐조직의 노던 블랏 분석에서는 Rasp-1은 간에서만 발현되고, 이는 아미도 간-특이적인 유전자임을 나타낸다. 실제 간절제술과 모의 간절제술에서 Rasp-1 유전자 발현을 자극하였다(도 5). 이 결과에서 급성 상 반응의 외과적 손상에 의해 유도되는 Rasp-1 전사를 유도하는 시그날은 유전자 조절의 간재생의 서열-특이적인 활성을 위한 Rasp-1 전사를 유도하는 시그날과 겹쳐진다고 제시한다. 또는 Rasp-1은 상이한 미소환경에 관련된 다수의 기능을 가진다. 동종 단백질 배열(도 3)로 RASP-1은 세린 프로테아제 저해물질 슈퍼패밀리에 속함을 나타내고 있다. 따라서 RASP-1은 신규한 프로테아제 저해물질로써, 재생과정동안에 세포외 간질 물질의 단백질 분해를 방지함으로써 간 재생에 중요한 역할을 한다. 또는, RASP-1은 조절 단백질의 단백질 분해를 방지하여 실질 간 세포의 세포분열성 기작을 자극하여 간 재생에 기여한다.

6.1. 재료와 방법.

간절제술

70-90% 간절세술은 전술한 것과 같이 실행한다(Naughton et al., 1977, Science 196 : 301-302). 간략하면, 메타판 마취를 유도후에 우측과 중앙 간엽 6주된 Long-Evans 수컷 쥐를 복부중앙 절개를 통하여 내장을 밖으로 내놓고 우측과 중앙간 정맥과 아래 대정맥의 합류점에서 연결시켰다. 좌측 엽은 유사한 방식으로 적출하여 잔류 간의 10-30%를 남겨둔다(Naughton et al., 1977, Science 196 : 301-302). 간절제술동안에 절단된 간조직은 보통의 기준으로 이용한다. 모의 수술은 동일한 방식으로 실시하나 간조직을 밖으로 내놓지는 않는다. 두 마리 동물의 간에 추출한 RNA를 각 실험집단 분석전에 모은다. 실험은 4회 반복한다.

RNA 추출과 노던 하이브리드 분석

Chomczynski et al(I 987)에서 상술한 것과 같이 구아니딘 티오시아네이트 용액에 모든 RNA를 추출한다. 폴리(A+)를 포함하는 부분은 올리고(dT)-셀룰로오즈 컬럼을 통하여 분리된 총 RNA를 통과시켜 얻는다(Stratagene, La Jolla, CA). 노던 블랏을 위해서, 10~15㎍ RNA를 6% w/v 포름알데히드를 포함하는 수직 1% 아가로즈 겔에서 분류하고 나일론 막(Hybond N, Amersham)에 옮기고 20x SSC 완충액을 통과시키고 UV-교차연결시킨다. 선하이브리드반응과 하이브리드반응은 이스트 tRNA 0.8mg/㎖과 함께 50% 포름아미드, 5x SSPE 완충액, 2x Denhardts' 시약과 0.2% SDS 용액에서 42℃에 실시한다. 정상 간 mRNA 또는 재생 간 mRNA에서 합성된 cDNA 25ng 또는 아가로즈 겔에서 정제한 DNA 단편 0.5ng은 Primer-It II 무작위 나이너 라벨링 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여³²P 라벨시킨다. 하이브리드후에, 블랏은 0.1% SDS와 0.2x SSC로 65℃에서 세척한다. 노출전에, 필터는 RNA의 동일한 로드와 전달을 위해 0.5M 아세테이트 나트륨(pH 4.8)과 0.05% 메틸렌 블루를 포함하는 용액에서 착색한다.

cDNA 라이브러리의 작제와 스크리닝

cDNA 라이브러리는 λ-uniZAP에서 작제한다(Stratagene, La Jolla, CA). 간략하면, 재생 간 poly(A+) RNA 5㎍을 M-MuL 역전사효소에 의해 역전시키고 DNA 중합효소 I은 제2가닥 cDNA의 합성에 이용된다. cDNA 단부는 Klenow 단편에 의해 절두되고 EcoRI 어뎁터는 cDNA에 연결된다. 5' 단부에서 EcoRI 부위와 3' 단부에서 XhoI 부위가 있는 cDNA 단편은 미리절단된 λ-uniZAP에 방향을 고려하여 연결하고 Gigapack Gold 패킹 추출물에 패킹한다(Stratagene, La Jolla, CA.). 전체 라이브러리는 대장균 균주 XL1-Blue MRF'에 플레이트하여 증폭시킨다. 총 1.5x10⁵라이브러리 파아지를 플레이트시키고 각 플레이트당 4회 작성된 니트로셀룰로오즈 막은 상이한 프로브에 4개 리프트중 2개를 하이브리드 시킴으로써 정상적인 그리고 재생 간 mRNA로부터 만들어진³²P-라벨된 cDNA 프로브로 차등적으로 스크린한다. 재생 프로브에 하이브리드가 증가된 것으로 나타나는 주요 양성 플락은 Thomas, 1994, BioTechniques 16 : 229-231에서 상술하는 것과 같이 중합효소 사슬 반응(PCR)에 의해 제2라운드 차등 스크리닝에 의해 선택될 수 있다. 제2라운드 양성 파아지에서 cDNA는 파아지미드 절단 과정(Stratagene, La Jolla, CA)에 따라 Bluescript 플라스미드에서 파아지없이 절단한다.

cDNA 서열과 예상 아미노산 서열의 분석

총 36개 양성 분리체를 정제해내고 Bluescript에 삽입체에 인접한 T7와 T3 프라이머와 함께 이중 가닥 뉴클레오티드 서열화한다. ~200bp의 뉴클레오티드 서열은 삽입체의 각 단부에서 구할 수 있다 .이들 뉴클레오티드 서열과 유추된 가상 아미노산 서열의 일부는 이들의 동질성과 유일성을 확인하기 위해 Blast 프로그래(NCBI)에 의해 조사한다. 분리체의 대부분은 GenBank(Bilofsky and Burks, 1988, Nucl. Acids Res. 16:1861-1864)에 있는 공지 유전자에 완전히 동일한 서열을 포함하는 것을 알 수 있고 일부는 돌연변이에 의한 겹쳐지는 서열을 가진다. rlcll.3으로 지정한 한 클론은 유일한 서열을 포함한다. 이는 완전한 해독 구조를 가지지 않고 5'단부에 비정상적인 CT 반복부분을 가진다. CT 반복부분 하류에 약 300bp 단편을 이용하여 재생 간 cDNA 라이브러리를 프로브한다. pRLC-1 양성클론을 서열화하고 여기에는 rlcll.3의 것과 겹쳐지는 완전한 개방 해독 구조를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 또한, pRLC-1에 포함된 완전한 개방 해독 구조의 5'단부에는 rlcll.3의 CT반복이 없다. 서열 분석후에 pRLC-1에 포함된 개방 해독구조에 상응하는 유전자는 Rasp-1이라 칭하고 추가 연구에 이용한다.

pRLC-1은 1996년 6월 5일에 ATCC에 기탁되었고 기탁번호는 _______이다.

항체 생성과 면역블랏팅

FKRVKETFSSNKKLG(아미노산 137-151, 도 1)로 구성된 Rasp-1 유전자에 의해 코드된 아미노산 서열에 상응하는 펩티드는 펩티드 분석기를 이용하여 분석하고, KLH에 결합시켜 토끼에 주사하여 항체 형성을 유도한다. 미리 면역화된 혈액을 얻고 토끼에 처음 1주간 2회 펩티드 준비물을 근육으로 주사한다. 혈청을 최고 8주간 2주 간격으로 수득된 혈액에서 얻는다. 4주째 토끼에 부스터시킨다. Burnette, 1981, A. Anal. Biochem., 112 : 195-203에서 상술하는 것과 같이 웨스턴 블랏시킨다. 간략하면 쥐 혈장 단백질 30㎍을 8% SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동시키고, 니트로셀룰로오즈 막에 전기청공법에 의해 이동시킨다. 블랏은 TBST(50mM 트리스, 500mM 염화나트륨, 0.05% 트윈 20, pH 7.5)에서 만들어진 5% Carnation 비-지방 건유(Blotto)로 1시간 동안 차단시킨다. 토끼 항-혈청은 Blotto에서 1 : 100으로 희석시키고, 22℃에서 2시간 동안 4℃에서 18시간동안 블랏에서 배양시켰다. 알칼리 포스포타제-공액된 염소 항-토끼 항체(Blotto에서 1 : 100으로 희석)는 22℃에서 1시간 블랏으로 배양시키고 알칼리 포스포타제용 기질과 배양시켜 면역반응성 단백질에 대해 밝힌다.

5.2 결과

재생 간에서 유도된 cDNA의 확인

재생 간 cDNA 라이브러리의 차등 스크리닝에 의해 36개 양성 클론을 분리하였다. 클론의 각 단부에서 약 200bp cDNA를 서열화한다. 완전한 개방 해독 구조를 인코드하는 클론 pRLC-1의 서열은 Blast 연구에 의해 신규한 것으로 밝혀졌다. 완전한 서열화후에 pRLC-1의 1.6kb 삽입물은 436개 아미노산으로 된 유추 단백질을 인코드하는 1308bp 개방 해독 구조를 확인하였다(도 1). 아미노산 단부에는 처음 20개 아미노산 잔기가 일반적인 소수성 분비 시그날로 구성된다. 이유전자 생성물에서 5개 N-글리코실화부분은 도 1에서 박스 N으로 나타낸 것이다. 세르핀 슈퍼 패밀리(도 3A와 3B)에 대해 인코드된 아미노산 서열이 유사하기 때문에, pRLC-1에 포함된 신규 유전자는 pRLC-1이라 칭한다(재생 연루된 세르핀-1).

정상 동물과 재생간이 있는 쥐에서 mRNA의 노던 블랏분석에서 이유전자에 대한 프로브에 의해 감지되는 1.7kb Rasp-1 시그날은 정상 간에서 보다 간절제후 48시간 경에 4배가 증가되는데 이로써 간재생은 RASP-1과 연관이 있음을 나타낸다(도 2).

쥐 게놈 DNA는 상이한 제한 엔도 뉴클레아제(EcoRI, Pst1, BamHI)로 절단하고 Rasp-1의 5' 코딩부분에 상응하는 300-bp 단편으로 프로브시켰을 때 크기가 다른 단 한 개의 밴드가 서든 블랏의 각 라인에서 감지되는데(데이타는 나타내지 않음) 이는 쥐 게놈에는 Rasp-1이 한 개 있다는 것을 나타낸다.

RASP-1은 세르핀 슈퍼패밀리에 구성원이다.

도 3A에는 GenBank에서 전반적인 유사성에 기초하여 최대 기록을 가지는 처음 10개 단백질과 RASP-1의 일부(잔기 89-436)를 비교하는 다중 서열을 나타낸다 .10개 단백질 모두 세르핀 슈퍼패밀리의 구성원이다. 세르핀은 다양한 부위에서 글리코실화된 단일 폴리펩티드 사슬인 작은 당단백질(MWt 40-60kD)이다. 이는 통상적인 전래 세린 프로테나제 저해물질(Carrell and Boswell, 1986, Serpins : The Superfamily of Plasma Serine Proteinase Inhibitors in Proteinase Inhibitors; (Barrett, A. and Salvensen, G., Eds., ), Elsevier, Amsterdam, pp. 403-420)에서 유도된 이들 구조에 의해 바로 인지할 수 있다. 아미노산 단부쪽의 RASP-1 서열이 이들 단백질에 대해 유사성이 다소 적게 나타나나, 매우 유사한 부분은 세르핀의 반응 중심의 보존된 구조를 포함하는 카르복실 단부에서 볼 수 있다(Carrell and Boswell, 1986, supra). 중간 정도의 유사성은 일부 다른 부분에서 나타내고; 도 3B에서는 각 단백질에 RASP-1의 전박적인 유사성 기록을 나타내었다.

RASP-1에 이들 단백질의 반응 중심의 비교에서 대부분 세르핀은 P₁' 부위에서 일반적으로 세린잔기가 보존된 반면(Morri and Travis, 1983, J. Biol., Chem. 258 : 12749-12752), RASP-1은 이 위치에 시스틴을 가지는 것으로 나타났다. 이와 같은 구조는 선열에서 단백질과 다른 공지의 세르핀과 비교하였을 때 독특한 것이다.

반응 중심, 특히 P₁과 P₁' 부위에서 아미노산 잔기가 반응 특이성을 정의하는데 중요한 것으로 보인다(Carrell and Travis, 1985, Trends in Biochem. Sci. 10 : 20-24); Owen et al., 1983, N. Engl. J. Med. 309 : 694-698). 도 3A에서 볼 수 있는 반응중심에서 변이는 가능성이 있는 다양화된 기질 상호작용 또는 이들 단백질 각각에 연합된 결합 특이성을 나타낸다.

Rasp-1은 간 조직에서 발현된다.

상이한 기판에서 분리한 총 RNA의 노던 블랏 분석에서는 Rasp-1 mRNA가 정상간에서 강하게 감지되고 반면에 심장, 폐, 뇌, 췌장, 고환 및 신장에서는 나타나지 않는다. 이 결과로써 간은 정상개체에서 Rasp-1 유전자 생성물의 주요 구성원이라는 것을 나타낸다.

RASP-1은 혈장단백질이다.

Rasp-1의 단백질 생성물을 확인하기 위해, RASP-1 유추된 펩티드 단편(FKRVKETFSSNKKLG)을 이용하여 다클론성 항체를 만든다. 웨스턴 분석에서 이 펩티드에 대한 면역혈청은 쥐 혈장에 있는 예상 분자량(50kD)의 단백질로 확인되었다(도 4, 라인 2). 선-면역 혈청을 웨스턴 블랏에 적용한 경우 단백질이 감지되지 않았다(도 5, 라인 1).

Rasp-1 전사체 제어에서 간절제술과 모의 간절제술의 효과

Rasp-1 전사제의 상향조절을 위해 간재생과 연합된 자극 시그날을 확인하기 위해 병행 수술을 실시한다. 노던 분석에서는 간에서 Rasp-1 발현이 일부 간절제술과 모의 간절제술후에 상향 조절된다는 것으로 나타났다(도 5). 모의 간절제술 후에 24시간 경에 하이브리드는 정상 간에서 관찰된 것보다 약 8배 높고, 외과술후에 48시간 경에 감소되고 그 다음 2주간 거의 정상적인 발현 수준으로 복귀한다. 재생 간의 Rasp-1 분석에서 간 절제후 48시간에는 정상에 약 3~4배의 최대 발현을 가지고 간제거후 최고 2주동안은 상승된 상태로 발현이 유지되었다.

본 발명은 여기에서 상술한 구체예에 제한하지 않는데 이는 본 발명의 개별특징을 설명한 것으로써 본 발명의 범위내에는 기능적을 등가의 방법과 성분이 포함된다. 또한 여기에서 상술한 것에 추가하여 다양한 변형 또는 본 기술에 숙지된 자는 전술한 설명과 도면을 통하여 인지할 것이다. 이와 같은 변형 또한 본 발명의 범위에 속한다. 모든 참고문헌은 여기에 첨부한다.

Claims

Rasp-1유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
(a) 도 1에 나타낸 핵산서열(SEQ ID No. 1) 또는 ATCC에 기탁된 (ATCC 기탁번호 _______ ) 클론 pRLC-1에 포함된 유전자 또는 유전자 단편의 뉴클레오티드 서열에 의해 인코드된 아미노산 서열을 인코드하거나; 또는

b) (a)의 핵산서열 또는 이의 상보체에 엄격한 조건하에서 하이브리드되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 RASP-1 단백질 또는 이의 단편을 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
N-단부 시그날 펩티드 또는 N-단부 시그날 서열 펩티드가 결손된 성숙한 세르핀 도메인에 상응하는 RASP-1 폴리펩티드를 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산서열.
이형 폴리펩티드에 융합된 제3항의 폴리펩티드로 구성된 키메라 단백질을 인코드하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산.
제1, 2, 3 또는 4항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 벡터.
숙주세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절할 수 있는 뉴클레오티드 조절원소가 연합된 제1, 2, 3 또는 4항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
제1, 2, 3 또는 4항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 숙조 세포.
숙주세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절할 수 있는 뉴클레오티드 조절원소와 연합된 제1, 2, 3 또는 4항에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전공학적으로 조작된 숙주세포.
제1, 2, 3 또는 4항에 따른 핵산에 의해 인코드되는 순수한 유전자 생성물.
제9항에 따른 유전자에 면역특히적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
동물의 게놈에 제1, 2, 3 또는 4항에 따른 핵산이 발현된 트란스진으로 포함된 것을 특징으로 하는 유전자 전이 동물.
제9항에 따른 유전자 생성물을 인코드하는 게놈 서열의 발현이 방해받거나 억제되는 것을 특징으로 하는 유전자 전이 동물.
환자의 샘플에서 Rasp-1 유전자 또는 Rasp-1 유전자 생성물을 감지하는 것으로 구성된 간질환을 진단하는 방법.
제13항에 있어서, 간질환은 경변인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 간질환은 간종양인 것을 특징으로 하는 방법.
간질환을 치료하는 방법에 있어서, 치료가 필요한 환자에게 Rasp-1 유전자의 발현 또는 Rasp-1 유전자 생성물의 활성을 조절할 수 있는 화합물을 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 간질환은 경변인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 화합물을 Rasp-1 유전자의 해독을 차단하는 안티센스 또는 리보자임분자인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 화합물은 표적 유전자의 5' 부분에 상보적이고 3중 나선형성을 통하여 전사를 차단하는 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 화합물은 표적 유전자 생성물의 활성을 중화시키는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 화합물은 Rasp-1 유전자의 발현 또는 Rasp-1 유전자 생성물의 합성 또는 활성을 강화하는 것을 특징으로 하는 방법.
간질환을 치료하는 방법에 있어서, 이와 같은 치료가 필요한 환자에게 Rasp-1 유전자 생성물을 인코드하는 핵산을 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
간질환을 치료하는 방법에 있어서, 치료가 필요한 환자에게 효과량의 Rasp-1 유전자 생성물을 투여하는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
간조직의 생장 또는 재생을 증강시키는 방법에 있어서 효과량의 Rasp-1 유전자 생성물로 간조직을 처리하는 것으로 구성된 방법.
제24항에 있어서, 간조직은 외선인 것을 특징으로 하는 방법.
제24항에 있어서, 간조직은 내선인 것을 특징으로 하는 방법.