JP2003532623A - 抗脈管形成性アンジオテンシン−７およびそれをコードするポリヌクレオチドを使用することによる脈管形成の調節方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、被験体に抗脈管形成性のＡｎｇ−７ポリペプチドを投与することによる脈管形成の調節方法を提供する。抗脈管形成性のＡＮＧ−７核酸を投与することによる脈管形成の調節方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の背景） 分化された細胞および組織の発生、維持および修復の原因である細胞の挙動は
、大部分が、増殖因子および他のリガンドならびにそれらの受容体を介して運搬
される細胞内シグナルにより調節される。これらの細胞内シグナル伝達分子の受
容体は、応答する細胞の細胞表面上に配置される。増殖因子および他のリガンド
は受容体に結合し、それにより細胞膜を横断するシグナルの伝達を引き起こす。
こうしたシグナル伝達は、孔形成およびリン酸化を包含する多くの様式により起
こることができる。チロシンキナーゼによるタンパク質上のチロシンのリン酸化
は、それによりシグナルが細胞膜を横断して伝達される重要な様式の１つである
。事実、数種の現在既知のタンパク質チロシンキナーゼ遺伝子は、ポリペプチド
の増殖因子およびホルモンの膜貫通受容体をコードする。

【０００２】 脈管形成は、一般に、成長因子および他のリガンドにより大いに調節されると
考えられている。脈管形成、ならびに同時発生の組織の発生および再生は、内皮
細胞の増殖、移動、分化および生存のしっかりと制御される過程に依存する。刺
激物質および阻害物質双方のリガンドが、これらの過程の間に細胞の受容体と直
接もしくは間接的に相互作用するようである。脈管形成は、内皮細胞および白血
球により放出される酵素による基底膜の糜爛で開始する。その後、血管の内腔の
内側を覆う内皮細胞が基底膜を通って突出する。脈管形成刺激物質は、内皮細胞
が糜爛された基底膜を通って移動することを誘導する。移動する細胞がその後、
親血管から「新芽」を形成し、ここで内皮細胞は有糸分裂を受けかつ増殖する。
内皮の新芽は相互と合流して毛細管ループを形成し、新たな血管を創製する。

【０００３】 内皮細胞の調節に関与するリガンドおよび受容体は解明されることを開始して
いる。とりわけ、内皮増殖因子の受容体およびそれらのキナーゼが発見されてい
る。例えば、内皮細胞の膜貫通チロシンキナーゼをコードする遺伝子がＰａｒｔ
ａｎｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８９１３
−１７（１９９０））により記述された。この遺伝子およびそのコードされるタ
ンパク質は「ＴＩＥ」と呼ばれ、これは、「ＩｇおよびＥＧＦ相同性ドメインを
もつチロシンキナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ Ｉｇ ａ
ｎｄ ＥＧＦ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｏｍａｉｎｓ）」の略語である。（Ｐａｒ
ｔａｎｅｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：１６９８−１７０７（１９
９２）；国際特許公開第ＷＯ ９９／１５６５３号明細書を参照されたい。）高
められたＴＩＥ発現は、新生血管形成の間に、発生する卵胞および皮膚創傷中の
顆粒組織に関連することが示された。（Ｋｏｒｈｏｎｅｎら、Ｂｌｏｏｄ ８０
：２５４８−２５５５（１９９２）を参照されたい。）従って、ＴＩＥタンパク
質は脈管形成である役割を担うことがありそうである。

【０００４】 ２種の構造的に関係したラットＴＩＥ受容体様チロシンキナーゼ、ＴＩＥ−１
およびＴＩＥ−２が報告され；これらの受容体は別個の遺伝子によりコードされ
る。（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：１６３１−７（１
９９３）を参照されたい。）双方の遺伝子は、胚および生後組織の内皮細胞中で
広範に発現されることが見出された。かなりのレベルのＴＩＥ−２転写物が、水
晶体上皮、心外膜および間葉の領域を包含する他の胚細胞集団中にもまた存在し
た。（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅら、上記を参照されたい。）血管内皮における
ＴＩＥ受容体の優勢な発現は、ＴＩＥが血管系の発生および維持、ならびにとり
わけ脈管形成である役割を担っていることを示唆する。

【０００５】 ＴＩＥ受容体のリガンドもまた特徴づけられている。２種のＴＩＥ−２結合リ
ガンド、アンジオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）−１（Ａｎｇ−１）お
よびアンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）が同定されている。Ａｎｇ−１ポリペ
プチドはＴＩＥ−２受容体チロシンキナーゼと相互作用する。（Ｍａｉｓｏｎｐ
ｉｅｒｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：５５−６０（１９９７）を参照された
い。）Ａｎｇ−２ポリペプチドはＡｎｇ−１ポリペプチドに拮抗的であり、活性
化するリガンドの結合を予防しかつＴＩＥ−２キナーゼ活性および自己リン酸化
を刺激するその能力を封鎖する。しかしながらＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２はＴ
ＩＥ−１を結合しない。Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２は約６０％同一であり；こ
れらのポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｎ末端のコイルドコイル領域およびＣ末
端のフィブリノーゲン様ドメインと類似のドメイン構造を共有する。ノーザン（
ＲＮＡ）分析は、ＡＮＧ−１ ＲＮＡが極めて広範に発現されること、しかしＡ
ＮＧ−２ ＲＮＡの発現が非常に制限されることを示す。ＡＮＧ−２ ＲＮＡは
、血管のリモデリングを受ける卵巣、子宮および胎盤のような組織中にのみ存在
する。Ａｎｇ−１はヒトＴＩＥ受容体リガンド「ｈｔｉｅ−２」もしくは「ｈＴ
Ｌ−１」と同一であると考えられている。（国際特許公開第ＷＯ ９９／１５６
５３号明細書を参照されたい。） 最近、ＴＩＥ−２受容体の他のリガンドが同定された。（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌ
ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１９０４−０９
（１９９９）を参照されたい。）これらのリガンドはＴＩＥリガンド−３（もし
くはアンジオポエチン−３（Ａｎｇ−３））およびＴＩＥリガンド−４（もしく
はアンジオポエチン−４（Ａｎｇ−４））と呼ばれる。Ａｎｇ−３（マウスポリ
ペプチド）はＴｉｅ２受容体に拮抗的であるようである一方、Ａｎｇ−４（ヒト
ポリペプチド）はアゴニストであるようである。Ａｎｇ−３およびＡｎｇ−４ポ
リペプチドの正確な生理学的役割は解明されるべきままである。

【０００６】 ヒトからの他のＴＩＥリガンド相同物、ＮＬ１ないしＮＬ６およびＮＬ８もま
た同定されている。（国際特許公開第ＷＯ ９９／１５６５３号および同第ＷＯ
９９／１５６５４号明細書を参照されたい。）これらの相同物の１つ、すなわ
ちＮＬ６は、分泌シグナルをコードする配列についてｃＤＮＡライブラリーをス
クリーニングすることにより同定された。完全長のＮＬ６ ｃＤＮＡのその後の
分析は、ＴＩＥリガンド受容体に対する相同性を示した。他の相同物、ＮＬ１−
５およびＮＬ８は、ＮＬ６に対する類似性を示す配列についてＥＳＴデータベー
スをスクリーニングすることにより同定された。ＮＬ６に対するそれらの類似性
に基づき、ＮＬ１−５およびＮＬ８は脈管形成に関与することもまた提案された
。ＮＬ１およびＮＬ８は細胞を腫瘍形成性にすることが可能であることが見出さ
れた。（国際特許公開第ＷＯ ９９／１５６５３号明細書を参照されたい。） Ａｎｇ−１ないしＡｎｇ−４およびＮＬファミリーを包含するＴＩＥリガンド
相同物の数は、これらのリガンドが脈管形成で種々の役割を担っていることを示
唆する。従って、これらのリガンドのさらなる特徴づけは、脈管形成におけるそ
れらの役割の理解における１つの重要な段階である。とりわけ、持続性の調節さ
れない脈管形成が、腫瘍転移および内皮細胞による異常な成長を包含する非常に
多数の疾患状態で発生し、そして、これらの病状でみられる病理学的損傷を支持
する。従って、脈管形成因子の特徴づけは、脈管形成に関係する（および関係し
ていると仮定される）疾患の治療法の開発もまた助長することができる。例えば
、腫瘍形成は脈管形成に依存することが提案されている。従って、脈管形成を阻
害するＴＩＥリガンドの相同物は、こうした腫瘍に治療的治療を提供することが
できる。

【０００７】 （発明の要約） 本発明は、抗脈管形成性Ａｎｇ−７ポリペプチドを使用する脈管形成の調節方
法を提供する。本発明は、疾患もしくは臨床状態の原因もしくは治療に脈管形成
が関連性のある疾患もしくは臨床状態の治療のためのＡｎｇ−７ポリペプチドの
使用をさらに包含する。一態様において、こうした疾患もしくは病状は、限定さ
れるものでないが癌、創傷治癒、腫瘍形成、糖尿病性網膜症、黄斑変性、心血管
系疾患などを挙げることができる。Ａｎｇ−７ポリペプチドのさらなる用途は、
胎盤の血管新生の調節を包含する生殖器系における脈管形成を伴う臨床状態の治
療、もしくは人工妊娠中絶薬としての使用を包含する。本発明は、Ａｎｇ−７ポ
リペプチドを含有する製薬学的組成物、および前述の疾患もしくは臨床状態の治
療のためのこうした製薬学的組成物の使用もまた包含する。

【０００８】 本発明の一局面は、配列番号２のアミノ酸配列を有するＡｎｇ−７ポリペプチ
ド、ならびにそれらの生物学的に活性のまたは診断上もしくは治療上有用なフラ
グメント、変異体、誘導体および類似物の使用に関する。付加的な一局面は、本
発明のＡｎｇ−７ポリペプチドに対する抗体、とりわけ配列番号２に記述される
配列、または最低２０、好ましくは最低３０、より好ましくは最低４０、なおよ
り好ましくは最低５０、もしくは最も好ましくは最低１００残基にわたって、配
列番号２に対する最低６０％、好ましくは最低７０％、より好ましくは最低８０
％、なおより好ましくは最低９０％、もしくは最も好ましくは最低９５％の配列
の同一性を共有する配列のエピトープに特異的に結合する抗体の使用に関する。

【０００９】 本発明の別の局面は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡならびにＡ
ＮＧ−７アンチセンス核酸を包含する、本発明のＡｎｇ−７ポリペプチドをコー
ドする単離されたＡＮＧ−７核酸の使用に関する。こうした核酸は、配列番号１
のヌクレオチド配列を有するＡＮＧ−７ ｃＤＮＡ配列を包含する。別の局面は
、生物学的に活性のまたは診断上もしくは治療上有用なポリペプチドをコードす
るＡＮＧ−７配列のフラグメントもしくは変異体に関する。こうしたフラグメン
トもしくは変異体は、国際特許公開第ＷＯ ９９／１５６５３号明細書（その開
示はそっくりそのまま引用により本明細書に組み込まれる）中にＮＬ１として同
定されるヌクレオチド配列（配列番号１）のような、同一のアミノ酸の全部の可
能なコドンの選択もしくはそれらの保存的ミノ酸置換を有する配列を包含する。
他の変異体は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でヒトＡＮＧ
−７ ｃＤＮＡ（例えば配列番号１）に選択的にハイブリダイズすることが可能
である核酸を包含する。本発明の別の局面は、本発明のＡｎｇ−７ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするのに十分な長さの
ポリヌクレオチドを含んで成る核酸プローブに関する。

【００１０】 本発明のなお別の局面は、組換えベクターの使用による組換え技術による、Ａ
ｎｇ−７ポリペプチド、またはそれらの生物学的に活性かつ診断上もしくは治療
上有用なフラグメントもしくは変異体の製造方法に関する。本発明のさらなる一
局面は、Ａｎｇ−７ポリペプチド、あるいはその生物学的に活性のまたは診断上
もしくは治療上有用なフラグメントもしくは変異体をコードするＡＮＧ−７核酸
配列を含んで成る組換えの原核生物および／もしくは真核生物の宿主細胞に関す
る。関係する一局面において、ＡＮＧ−７核酸および／またはＡｎｇ−７ポリペ
プチド、フラグメントもしくは変異体を発現する核酸構築物が提供される。こう
した構築物は、典型的に、それぞれがＡＮＧ−７核酸もしくはそのフラグメント
の発現のため操作可能に連結される転写プロモーターおよび転写ターミネーター
を包含する。

【００１１】 本発明の別の局面は、遺伝子治療の目的上、本発明のポリペプチド、もしくは
該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を伴う方法に関する。本明
細書で使用されるところの遺伝子治療は、ある個体内の疾患状態の治療のための
その個体における外因性起源の核酸配列の発現の提供方法と定義する。

【００１２】 本発明のさらなる一局面は、治療の目的上、脈管形成の調節、または疾患もし
くは病状に脈管形成が関連性のある疾患もしくは病状の調節を必要とする、Ａｎ
ｇ−７ポリペプチド、それらのフラグメント、変異体、誘導体もしくは類似物、
あるいはＡＮＧ−７ポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメント、変異体も
しくは誘導体の利用方法に関する。こうした疾患もしくは病状は、例えば、癌、
創傷治癒、糖尿病性網膜症、黄斑変性、心血管系疾患、および胎盤の血管新生の
調節を包含する生殖器系の脈管形成を伴う臨床状態の治療、もしくは人工妊娠中
絶薬としての使用を包含する。こうした治療は、タンパク質置換療法およびタン
パク質模倣物におけるＡｎｇ−７ポリペプチドの使用をさらに包含する。

【００１３】 本発明の別の局面は、本発明のＡＮＧ−７核酸配列中の突然変異に関係した疾
患もしくは臨床状態、または疾患もしくは臨床状態に対する感受性を検出するた
めの、および、こうした配列によりコードされるＡｎｇ−７ポリペプチドの過剰
発現もしくは過小発現を検出するための診断アッセイに関する。

【００１４】 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の記述および図面の参照に際して明ら
かになるであろう。

【００１５】 （詳細な記述） 本発明をより詳細に示す前に、下で使用されるところのある種の用語の定義を
示すことが、そのさらなる理解に役立つことができる。 定義： 別の方法で定義されない限り、本明細書で使用される全部の技術的および科学
的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により普遍的に理解されると同一の
意味を有する。本明細書に記述されるものに類似の他の方法および材料を本発明
の実務もしくは試験で使用することができ；従って、例示的方法および材料のみ
を記述する。本発明の目的上、以下の用語を下に定義する。

【００１６】 「脈管形成」という用語は、組織もしくは器官における新たな血管の生成を意
味する。脈管形成は新生血管形成および側副枝血管新生を包含する。「正常な脈
管形成」は、正常な生理学的条件下で、創傷治癒、胎児および胚の発生、ならび
に黄体、子宮内膜および胎盤の形成に関連する新たな血管形成を包含する。「好
ましくない脈管形成」は、制御されない脈管形成に関係した病理学的損傷を伴う
疾患もしくは臨床状態におけるような、異常な生理学的条件下で起こる脈管形成
を指す。例えば、好ましくない脈管形成は腫瘍形成の間に起こる可能性があり、
ここでは新生血管形成が腫瘍内に存在する。

【００１７】 「ＡＮＧ−７核酸」（すなわち全部大文字かつ斜体にされた）という用語は、
ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにアンチセンス核酸を包含
するＡｎｇ−７ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらの
生物学的に活性のまたは診断上もしくは治療上有用なフラグメント、変異体およ
び誘導体をコードするポリヌクレオチドを指す。有用なフラグメントおよび変異
体は、同一のアミノ酸の全部の可能なコドンの選択および保存的アミノ酸置換に
基づくコドンの選択に基づくもの、ならびにそれらの生物学的に活性のまたは診
断上もしくは治療上有用なフラグメントもしくは誘導体を包含する。有用な変異
体は、配列番号１のポリヌクレオチドに対し最低７０％のポリヌクレオチド配列
の同一性、より好ましくは８０％、なお好ましくは９０％を有するもの、および
それらの生物学的に活性かつ診断上もしくは治療上有用なフラグメントもしくは
誘導体をさらに包含する。

【００１８】 「ＡＮＧ−７遺伝子」（すなわち全部大文字かつ斜体にされた）という用語は
、コーディング配列、介在配列ならびに転写および／もしくは翻訳を制御する調
節要素を指す。

【００１９】 「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、典型的にホスホジエステ
ル結合を介して連結される、非常に多数のヌクレオチド単位（リボヌクレオチド
もしくはデオキシリボヌクレオチド、または関係した構造変異体）より構成され
るポリマーを指す。ポリヌクレオチドもしくは核酸は、実質的にいかなる長さ、
典型的には約６ヌクレオチドから約１０⁹ヌクレオチドもしくはより大きいまで
のものであることができる。ポリヌクレオチドもしくは核酸は、ＲＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、合成の形態、ならびにセンスおよびアンチセンス双方の鎖の
混成のポリマーを包含し、そしてまた、当業者により容易に認識されであろうと
おり、化学的もしくは生物学的に改変することもできるか、または非天然のもし
くは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有することもできる。こうした改変は
、例えば、標識、メチル化、類似物での天然に存在するヌクレオチドの１個もし
くはそれ以上の置換、荷電しない結合（例えばメチルホスホネート、ホスホトリ
エステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、荷電した結合（例えばホス
ホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分（例えばポリペ
プチド）、挿入剤（例えばアクリジン、プソラレンなど）、キレート剤、アルキ
ル化剤および改変された連結（例えばαアノマー核酸など）のようなヌクレオチ
ド間の改変を包含する。指定されたヌクレオチド配列に水素結合形成および他の
化学的相互作用を介して結合するそれらの能力においてポリヌクレオチドを模倣
する合成分子もまた包含する。こうした分子は当該技術分野で既知であり、そし
て、例えば、ペプチド結合が該分子のバックボーン中のリン酸結合と交替するも
のを包含する。

【００２０】 「オリゴヌクレオチド」という用語は、長さが約６から約１００ヌクレオチド
もしくはより以上までのポリヌクレオチドを指す。従って、オリゴヌクレオチド
はポリヌクレオチドのサブセットである。オリゴヌクレオチドは、製造元により
提供される仕様書に従って、自動化オリゴヌクレオチド合成機（例えばアプライ
ド バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）（カリフォル
ニア州フォスターシティ）により製造されるもの）で合成することができる。

【００２１】 「プライマー」という用語は、プライマー伸長産物が合成される条件下で使用
される場合にポリヌクレオチド合成の開始点として作用するポリヌクレオチド、
典型的にはオリゴヌクレオチド（酵素消化物中でのように天然に存在しようとイ
ンビトロで合成的に製造されようと）を指す。

【００２２】 「Ａｎｇ−７ポリペプチド」という用語は、配列番号２のアミノ酸配列を有す
るポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性のまたは診断上もしくは治療
上有用なフラグメント、変異体および誘導体を指す。「フラグメント」は、Ａｎ
ｇ−７ポリペプチドの典型的には最低１０の連続するアミノ酸、より典型的には
最低２０、なおより典型的には最低５０の連続するアミノ酸を有するＡｎｇ−７
ポリペプチドの一部分を指す。有用な変異体は、典型的には、保存的アミノ酸置
換を有するもの、およびそれらの生物学的に活性かつ診断上もしくは治療上有用
なフラグメントを包含する。有用な変異体は、本来のＡｎｇ−７アミノ酸配列（
配列番号２）に典型的には最低約５０％類似、より典型的には約９０％より多い
、そしてなおより典型的には最低約９５％類似、および、それらの生物学的に活
性のまたは診断上もしくは治療上有用なフラグメントもしくは誘導体である。Ａ
ｎｇ−７ポリペプチドは、抗Ａｎｇ−７ポリペプチドと免疫学的に相互反応性で
あるものをさらに包含する。

【００２３】 「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーおよびその同等物を指し
、そして生成物の特定の長さを指さず；従って、ペプチドおよびオリゴペプチド
（すなわちフラグメント）ならびにタンパク質がポリペプチドの定義内に包含さ
れる。本用語はＡｎｇ−７ポリペプチドの誘導体（例えばグリコシル化、アセチ
ル化、リン酸化など）もまた包含する。例えば、アミノ酸の１種もしくはそれ以
上の類似物（例えば非天然のアミノ酸など）を含有するポリペプチド、置換され
た結合ならびに天然に存在するおよび天然に存在しないの双方の当該技術分野で
既知の他の改変をもつポリペプチドが、該定義内に包含される。

【００２４】 「生物学的に活性の」という用語は、内皮管形成に影響を及ぼすことによる（
例えば実施例９（下）のＨＵＶＥＣアッセイを使用して）、または腫瘍細胞の成
長もしくは増殖に影響を及ぼす（例えば実施例１０（下）の腫瘍細胞成長阻害ア
ッセイを使用して）ような、脈管形成を調節するある分子の能力を指す。生物学
的に活性の分子は、Ａｎｇ−７ポリペプチド、それらのフラグメント、変異体、
誘導体および類似物；Ａｎｇ−７ポリペプチド、それらのフラグメント、変異体
および誘導体をコードする核酸；ならびに脈管形成を調節する（例えば、内皮管
形成を阻害もしくは刺激する）、または腫瘍細胞の成長もしくは増殖を調節する
（例えば腫瘍細胞の成長を阻害もしくは刺激する）ことによる抗Ａｎｇ−７抗体
であることができる。

【００２５】 「治療上有用な」もしくは「治療上有効な」という用語は、患者もしくは哺乳
動物のような被験体において脈管形成を調節する（例えば内皮管形成を阻害もし
くは刺激する）、または腫瘍細胞の成長もしくは増殖を調節する（例えば腫瘍細
胞の成長を阻害もしくは刺激する）のに十分である分子（例えばＡｎｇ−７ポリ
ペプチド、抗Ａｎｇ−７抗体、もしくはＡＮＧ−７核酸）の量を指す。

【００２６】 「診断上有用な」もしくは「診断上有効な」という用語は、被験体における脈
管形成もしくは脈管形成の阻害を検出するための分子（例えばＡｎｇ−７ポリペ
プチド、抗Ａｎｇ−７抗体もしくはＡＮＧ−７核酸）を指す。これらの用語は、
本発明のＡＮＧ−７核酸配列中の突然変異に関係した疾患もしくは臨床状態、ま
たは疾患もしくは臨床状態に対する感受性を検出する、およびこうした配列によ
りコードされるＡｎｇ−７ポリペプチドの過剰発現もしくは過小発現を検出する
のに有用な分子をさらに包含する。

【００２７】 「Ａｎｇ−７化合物」もしくは「Ａｎｇ−７抗脈管形成性化合物」という用語
は、生物学的に活性のＡｎｇ−７ポリペプチド、そのフラグメント、変異体、誘
導体もしくは類似物、抗Ａｎｇ−７抗体、生物学的に活性のＡＮＧ−７核酸、フ
ラグメントもしくは誘導体、およびＡＮＧ−７アンチセンス核酸を指す。

【００２８】 「アミノ酸」、「アミノ酸残基」もしくは「残基」という用語は、さらに後述
されるとおり天然に存在するＬアミノ酸もしくはＤアミノ酸を指す。アミノ酸は
、本明細書で、それらの公知の三文字記号もしくはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学的
命名法委員会により推奨される一文字記号のいずれかにより称される。同様に、
ヌクレオチドはそれらの普遍的に一般に容認される一文字コードにより称するこ
とができる。（例えば、Ｂｒｕｃｅ Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ 、ガーランド パブリッシング イン
ク（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク（第３
版、１９９４）を参照されたい）。

【００２９】 ２種もしくはそれ以上の核酸もしくはポリペプチド配列に関連して「同一の」
もしくは「同一性のパーセント」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの
１つを使用して、もしくは視覚的検査により測定されるような、比較かつ最大の
対応のために整列される場合に同一であるかまたは同一であるヌクレオチドもし
くはアミノ酸の明記されたパーセンテージを有する、２種もしくはそれ以上の配
列もしくは下位配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を指す。

【００３０】 ２種の核酸もしくは２種のポリペプチド配列に関連して「実質的に同一の」と
いう用語は、下述される配列比較アルゴリズムの１つを使用して、もしくは視覚
的検査により測定されるような、比較かつ最大の対応のために整列される場合に
最低６０％、典型的には８０％、最も典型的には９０〜９５％の同一性を有する
、２種もしくはそれ以上の配列もしくは下位配列を指す。２種のポリペプチド配
列が「実質的に同一」であることの表示は、１種のポリペプチドが第二のポリペ
プチドに対し生じられた抗体と免疫学的に反応性であることである。

【００３１】 ２種もしくはポリペプチド配列に関連して「類似性」もしくは「類似性のパー
セント」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを使用して、もしくは視覚的検
査により測定されるような、比較かつ最大の対応のために整列される場合に、同
一であるかまたは同一であるアミノ酸残基もしくはそれらの保存的置換の明記さ
れたパーセンテージを有する、２種もしくはそれ以上の配列もしくは下位配列を
指す。例として、第一のタンパク質領域は、第一の領域中に含有される数と等し
い数のアミノ酸のＡｎｇ−７ポリペプチド中のいずれかの配列に比較される場合
、もしくは上で論考されたような当該技術分野で既知のコンピュータ類似性プロ
グラムにより整列されているＡｎｇ−７ポリペプチドの整列された配列に比較さ
れる場合、第一の領域のアミノ酸配列がＡｎｇ−７ポリペプチドのある領域に最
低３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％もしくは
なお９５％同一または保存的に置換される場合に、ヒトＡｎｇ−７ポリペプチド
の一領域に類似とみなすことができる。

【００３２】 ポリペプチド配列に関連して「実質的類似性」という用語は、該ポリペプチド
が、約１０〜２０アミノ酸残基の比較窓にわたって、参照配列に対する最低７０
％の配列の同一性、もしくは好ましくは８０％、もしくはより好ましくは８５％
の参照配列に対する配列の同一性、もしくは最も好ましくは９０％の同一性をも
つ配列を含んで成ることを示す。アミノ酸配列に関連して、「実質的類似性」は
アミノ酸の保存的置換をさらに包含する。従って、あるポリペプチドは、例えば
２種のペプチドが１個もしくはそれ以上の保存的置換によってのみ異なる場合に
第二のポリペプチドに実質的に類似である。

【００３３】 ポリペプチドを記述する場合の「保存的置換」という用語は、該ポリペプチド
の活性を実質的に変えないポリペプチドのアミノ酸組成の変化を指す。従って、
特定のアミノ酸配列の「保存的置換」は、タンパク質活性に決定的に重要でない
アミノ酸のアミノ酸置換、もしくは決定的に重要なアミノ酸の置換であっても活
性を実質的に変えないような類似の特性（例えば、酸性、塩基性、正もしくは負
に荷電した、極性もしくは非極性、など）を有する他のアミノ酸でのアミノ酸の
置換を指す。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は当該技術分野
で公知である。以下の６群のそれぞれは、相互についての保存的置換であるアミ
ノ酸を含有する： １）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）； ２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）； ３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）； ４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）； ５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
および ６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。 （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗ．Ｈ．フリーマン アンド カン
パニー（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）（１９８４）もま
た参照されたい。）加えて、コードされる配列中の単一のアミノ酸もしくは小さ
なパーセンテージのアミノ酸を変更、付加もしくは欠失する個々の置換、欠失も
しくは付加もまた「保存的置換」である。

【００３４】 配列の比較のためには、典型的には１つの配列が参照配列として作用し、これ
と試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照
配列をコンピュータに入力し、必要な場合は座標を指定し、そして配列アルゴリ
ズムプログラムのパラメータを指定する。そうすると、配列比較アルゴリズムが
、指定されたプログラムパラメータに基づき、参照配列に関する試験配列（１種
もしくは複数）について配列の同一性パーセントを計算する。

【００３５】 比較のための配列の至適の整列は、例えば、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（ Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ． ２：４８２（１９８１））の局所相同性アルゴリ
ズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４
３（１９７０））の相同性整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ（ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）
）の類似性の検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化されたインプリ
メンテーション（例えば、ウィスコンシン ジェネティックス ソフトウエア
パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａ
ｃｋａｇｅ）、ジェネティックス コンピュータ グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄ
ｉｓｏｎ、ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）
、もしくは視覚的検査により実施することができる。（全般的に、Ａｕｓｕｂｅ
ｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉ ｏｌｏｇｙ 、ジョン ワイリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎ
ｄ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（１９９６）を参照されたい。） 有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは漸進的な対
にした整列を使用して、関係した配列の一群から複数の配列の整列を創製して、
配列の同一性パーセントを示す。それは、該整列を創製するのに使用されるクラ
スタリングの関係を示す木もしくは樹状図もまたプロットする。ＰＩＬＥＵＰは
ＦｅｎｇとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０
（１９８７））の漸進的整列法の単純化を使用する。使用される方法はＨｉｇｇ
ｉｎｓとＳｈａｒｐ（ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３（１９８９））により
記述される方法に類似である。該プログラムはそれぞれ５，０００ヌクレオチド
もしくはアミノ酸の最大長さの３００までの配列を整列することができる。複数
の整列手順は２個の最も類似の配列の対にした整列で開始し、２個の整列された
配列のクラスターを生じさせる。その後、このクラスターを、次の最も関係した
配列もしくは整列された配列のクラスターと整列する。配列の２個のクラスター
は、２個の別個の配列の対にした整列の単純な拡張により整列する。最後の整列
は、一連の漸進的な対にした整列により達成する。配列比較の領域について特定
の配列およびそれらのアミノ酸もしくはヌクレオチド座標を指定すること、なら
びにプログラムのパラメータを指定することにより、該プログラムを実行する。
例えば、以下のパラメータ、すなわちデフォルトのギャップ重み（ｄｅｆａｕｌ
ｔ ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）（３．００）、デフォルトのギャップ長重み（ｄｅ
ｆａｕｌｔ ｇａｐ ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）（０．１０）および加重さ
れたエンドギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｅｎｄ ｇａｐ）を使用して、参照配
列を他の試験配列と比較して配列の同一性の関係のパーセントを決定することが
できる。配列の複数の整列のための別の有用なプログラムは、ＭＥＧＡＬＩＧＮ
（商標）エキスパート配列分析ソフトウェア（Ｅｘｐｅｒｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州
マディソン）である。

【００３６】 配列の同一性および類似性のパーセントを決定するのに適するアルゴリズムの
別の例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍ ｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０（１９９０））により記述される。（
Ｚｈａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２６：３９８６−９０（１
９９８）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５：３
３８９−４０２（１９９７）もまた参照されたい。）ＢＬＡＳＴ分析を実施する
ためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉ
ｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公
的に入手可能である。このアルゴリズムは、クエリ配列（データベースの配列中
の同一の長さの語（ｗｏｒｄ）と整列される場合になんらかの正の値の（ｐｏｓ
ｉｔｉｖｅ−ｖａｌｕｅｄ）閾値スコアＴと合致するかもしくはこれを満足する
かのいずれかである）中の長さＷの短い語を同定することにより、高得点配列対
（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒｓ）（ＨＳＰ）を最
初に同定することを必要とする。Ｔは隣接語スコア閾値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏ
ｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１
９９０）、上記）と称される。これらの初期隣接語ヒットが、それらを含有する
より長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。そ
の後、累積整列スコアを増大させることができる限り遠くへ、各配列に沿って語
ヒットを双方向に伸長させる。各方向での語ヒットの伸長は：累積整列スコアが
その最大の達成された値から量Ｘだけ低下する；累積スコアが１個もしくはそれ
以上の負の点数をつける残基の整列の蓄積によりゼロもしくはそれより下になる
；またはいずれかの配列の端に到達する場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリ
ズムのパラメータＷ、ＴおよびＸが整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳ
Ｔプログラムは、１１の語長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６
２得点マトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨ
ｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０
９１５−９（１９９２）を参照されたい）、５０の整列（Ｂ）、１０の期待値（
ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および双方の鎖の比較を
、デフォルトとして使用する。

【００３７】 配列の同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは
、２種の配列の間の類似性の統計学的分析もまた実施する（例えば、Ｋａｒｌｉ
ｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０
：５８７３−７７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによ
り提供される類似性の１つの尺度は、最小総和確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ
ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））であり、これはそれにより２種のヌク
レオチドもしくはアミノ酸配列の間の合致が偶然発生することができる確率の表
示を提供する。例えば、参照核酸との試験核酸の比較における最小総和確率が約
０．１未満、より典型的には約０．０１未満、そして最も典型的には約０．００
１未満である場合に、ある核酸は参照配列に類似とみなされる。

【００３８】 ２種の核酸配列もしくはポリペプチドが実質的に同一であることのさらなる一
表示は、第一の核酸によりコードされるポリペプチドが、下述されるとおり第二
の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることであ
る。従って、あるポリペプチドは、典型的には、例えば２種のポリペプチドが保
存的置換によってのみ異なる場合に第二のポリペプチドに実質的に同一である。

【００３９】 「形質転換」もしくは「トランスフェクション」という用語は、ポリヌクレオ
チドの導入によりレシピエントの細胞もしくは微生物の遺伝子型を安定に変える
方法を意味する。これは、レシピエントの細胞もしくは生物体の表現型の変化に
より典型的に検出される。「形質転換」という用語は、一般に微生物に適用され
る一方、「トランスフェクション」は多細胞生物体由来の細胞におけるこの方法
を記述するのに使用する。

【００４０】 ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）の方法論は、一般に、米国特許第４，６
８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号明
細書に開示される。本明細書で使用される他の命名法、ならびに下述される細胞
培養、分子遺伝学および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションにおける実
験室の手順の多くは公知のものでありかつ当該技術分野で普遍的に使用される。
（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、ジョン ワイリー アンド サンズ（Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（１９９６）；Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、第２版、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プ
レス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ
ｓｓ）、ニューヨーク（１９８９）を参照されたい）。組換え核酸の方法、ポリ
ヌクレオチド合成、生物学的サンプルの調製法、ｃＤＮＡフラグメントの調製法
、ｍＲＮＡの単離などに標準的技術を使用する。一般に、酵素反応および精製段
階は製造元の仕様書に従って実施する。

【００４１】 本発明は、抗脈管形成性Ａｎｇ−７ポリペプチドおよびそれらの生物学的に活
性のまたは診断上もしくは治療上有用なフラグメント、変異体、誘導体もしくは
類似物を使用する脈管形成の調節方法を提供する。本発明は、下により完全に記
述されるような、脈管形成を調節するためのＡＮＧ−７核酸を使用方法をさらに
包含する。本発明は、脈管形成が原因に関連性のある疾患もしくは臨床状態の治
療、または限定されるものでないが癌、創傷治癒、腫瘍形成、糖尿病性網膜症、
黄斑変性、心血管系疾患などを挙げることができる疾患もしくは臨床状態の治療
のためのＡｎｇ−７ポリペプチドおよび／もしくはＡＮＧ−７核酸の使用をさら
に包含する。 ＡＮＧ−７核酸： 本発明の一局面は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびにア
ンチセンス核酸を包含するＡｎｇ−７ポリペプチドをコードする単離された核酸
、ならびに脈管形成の調節におけるそれらの使用に関する。ＡＮＧ−７核酸はＡ
ＮＧ−７ ｃＤＮＡ配列（例えば配列番号１）を包含する。ＡＮＧ−７核酸は、
同一のアミノ酸の全部の可能なコドンの選択もしくはそれらの保存的アミノ酸置
換をコードするもののような生物学的に活性の配列の変異体をさらに包含し、そ
してまた、それらの診断上もしくは治療上有用なフラグメントも包含する。こう
した変異体はＮＬ１ ｃＤＮＡ配列（国際特許公開第ＷＯ ９９／１５６５３号
明細書の配列番号１）を包含する。

【００４２】 本発明は、Ａｎｇ−７ポリペプチドのフラグメントをコードする最低６個の連
続するヌクレオチド（例えばハイブリダイズ可能な部分）を含んで成る精製され
たＡＮＧ−７核酸をさらに提供する。別の態様において、ＡＮＧ−７核酸は、Ａ
ＮＧ−７配列の最低８個の（連続する）ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０
ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド
またはなお２５０ヌクレオチドまでもしくはそれ以上のフラグメントより成る。
別の態様において、核酸は長さが２００もしくは２５０ヌクレオチドより大きい
。核酸は一本鎖もしくは二本鎖であることができる。容易に明らかであるとおり
、本明細書で使用されるところの「Ａｎｇ−７ポリペプチドのフラグメントをコ
ードする核酸」は、Ａｎｇ−７ポリペプチドの列挙されるフラグメントもしくは
部分のみをコードする核酸を指しかつ連続配列としてＡｎｇ−７ポリペプチドの
他の連続する部分を指さないと解釈される。１個もしくはそれ以上のＡｎｇ−７
ドメインをコードするＡＮＧ−７核酸のフラグメントが提供される。

【００４３】 本発明は、前述の配列にハイブリダイズ可能もしくはそれに相補的な核酸にも
また関する。こうした核酸は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、な
らびにアンチセンス核酸、ならびにそれらの生物学的に活性かつ診断上もしくは
治療上有用なフラグメントもしくは変異体を包含する。ＡＮＧ−７遺伝子もしく
はｃＤＮＡの最低１０、２５、５０、１００、２００もしくは２５０ヌクレオチ
ドまたはそれ以上に相補的な配列を含んで成る核酸もまた提供される。一態様に
おいて、高ストリンジェンシーの条件下でＡＮＧ−７核酸（例えば配列、配列番
号１を有する）、もしくはＡＮＧ−７変異体をコードする核酸にハイブリダイズ
しうる核酸が提供される。

【００４４】 例として、そして制限でなく、高ストリンジェンシーの条件を使用する手順は
後に続くとおりである。すなわち、ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリ
ダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０
．０２％ＢＳＡおよび５００（μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ）より構成される
緩衝液中、６５℃で８時間ないし一夜実施する。１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子
ＤＮＡおよび５〜２０×１０⁶ｃｐｍの³²Ｐ標識されたプローブを含有するプレ
ハイブリダイゼーション混合物中、６５℃で４８時間、フィルターをハイブリダ
イズさせる。２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％フィコール（Ｆｉｃｏ
ｌｌ）および０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィルター
の洗浄を行う。これに次いで、オートラジオグラフィーの前に０．１×ＳＳＣ中
５０℃で４５分間洗浄する。使用することができる高ストリンジェンシーの他の
条件は当該技術分野で公知である。（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照さ
れたい）。

【００４５】 別の態様において、中程度のストリンジェンシーの条件下でＡＮＧ−７核酸に
ハイブリダイズ可能である核酸が提供される。例として、そして制限としてでな
く、中程度のストリンジェンシーのこうした条件を使用する手順は後に続くとお
りである。すなわち、ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーショ
ンを、６×ＳＳＣ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ
、０．０２％ＰＶＰ、０．２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．０２％ＢＳＡ
および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡより構成される緩衝液中、５５℃で
８時間ないし一夜実施する。１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２
０×１０⁶ｃｐｍの³²Ｐ標識されたプローブを含有するプレハイブリダイゼーシ
ョン混合物中、５５℃で２４時間、フィルターをハイブリダイズさせる。２×Ｓ
ＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）および０．０
１％ＢＳＡを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィルターの洗浄を行う。

【００４６】 別の態様において、低ストリンジェンシーの条件下でＡＮＧ−７核酸にハイブ
リダイズ可能である核酸が提供される。例として、そして制限としてでなく、低
ストリンジェンシーのこうした条件を使用する手順は後に続くとおりである。す
なわち、ＤＮＡを含有するフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５
０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ポリビニル
ピロリドン（ＰＶＰ）、０．１％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、１％ウシ血清ア
ルブミン（ＢＳＡ）および５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含有する溶液
中、４０℃で６時間前処理する。以下の改変、すなわち０．０２％ＰＶＰ、０．
０２％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精
子ＤＮＡ、１０％（重量／容積）デキストラン硫酸、および５〜２０×１０⁶ｃ
ｐｍの³²Ｐ標識プローブを伴う同一の溶液中で、ハイブリダイゼーションを実施
する。フィルターを、ハイブリダイゼーション混合物中、４０℃で１８〜２０時
間インキュベートし、そしてその後、２×ＳＳＣ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．４）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳを含有する溶液中、５５℃
で１．５時間洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液で置き換え、そして追加の１．５
時間インキュベートする。フィルターを吸い取って乾燥させ、そしてオートラジ
オグラフィーのため露出させる。使用することができる低ストリンジェンシーの
他の条件は当該技術分野で公知である（例えば、交差種（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃ
ｉｅｓ）ハイブリダイゼーションに使用されるもの）。（ＳｈｉｌｏとＷｅｉｎ
ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：６７８９−
６７９２（１９８１）もまた参照されたい）。

【００４７】 低、中程度および高ストリンジェンシーの条件は当業者に公知であり、そして
、特定の核酸配列の塩基組成、および該核酸配列が由来する特定の生物体に依存
して予測可能に変動することができる。こうした条件に関する手引きについては
、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版、コールド スプリング ハーバー
プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、ＮＹ、ｐｐ
．９．４７−９．５７（１９８９））；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎ ｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （グリー
ン パブリッシング アソシエーツ アンド ワイリー インターサイエンス（
Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅ
ｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ＮＹ（１９８９））を参照されたい。

【００４８】 特定の一例、しかし制限としてでなく提示されるＡＮＧ−７核酸のクローニン
グの特定の態様は、後に続くとおりである。

【００４９】 発現クローニング（当該技術分野で公知の技術）のためには、当該技術分野で
既知の方法により発現ライブラリーを構築する。例えば、ｍＲＮＡ（例えばヒト
）を単離し、ｃＤＮＡを調製し、そしてその後、それがその後導入される宿主細
胞によりそれが発現されることが可能であるような発現ベクター（例えばバクテ
リオファージ誘導体）に連結する。その後、多様なスクリーニングアッセイを使
用して、発現されたＡｎｇ−７ポリペプチドについて選択することができる。一
態様において、抗Ａｎｇ−７特異的抗体を選択に使用することができる。

【００５０】 別の態様において、選択の前にゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリー中の所望
の配列を増幅するのにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する。例えば配列
番号１から選択されるような既知のＡＮＧ−７配列を表すオリゴヌクレオチドを
ＰＣＲにおいてプライマーとして使用することができる。典型的な一態様におい
て、該オリゴヌクレオチドは、異なる種のＡＮＧ−７の間の配列の同一性のＡＮ
Ｇ−７の保存されたセグメントの少なくとも部分を表す。合成オリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして利用して、潜在的目的の供給源（ＲＮＡもしくはＤＮＡ）
、典型的にはｃＤＮＡライブラリーからの核酸を使用するＰＣＲにより、ＡＮＧ
−７遺伝子内の特定の配列を増幅することができる。ＰＣＲは、例えば、パーキ
ン−エルマー シータス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）サーマルサ
イクラーおよびＴａｑポリメラーゼ（ジーンアンプ（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ））の使
用により実施することができる。増幅されているＤＮＡは、いずれかの真核生物
種からのｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡを包含することができ
る。当業者は、ＰＣＲ反応での使用のための数種の異なる縮重プライマーを合成
することを選ぶことができる。

【００５１】 既知のＡＮＧ−７配列と単離されている関係した核酸との間のより大きいもし
くはより小さい程度のヌクレオチド配列の類似性を見込むように、ＰＣＲ反応の
プライミングで使用されるハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを
変動させることもまた可能である。交差種ハイブリダイゼーションのためには、
低ストリンジェンシー条件を典型的に使用する。同一種のハイブリダイゼーショ
ンのためには、中程度にストリンジェントな条件をより典型的に使用する。関係
したＡＮＧ−７核酸のセグメントの成功裏の増幅の後に、そのセグメントを分子
的にクローン化しかつ配列決定し、そして完全なｃＤＮＡもしくはゲノムクロー
ンを単離するためのプローブとして利用することができる。これは、順に、下述
されるとおり、完全なヌクレオチド配列の決定、その発現の分析、および機能分
析のためのそのタンパク質産物の産生を可能にすることができる。この様式で、
Ａｎｇ−７ポリペプチドをコードする付加的な核酸およびＡｎｇ−７ポリペプチ
ド変異体を同定することができる。

【００５２】 上の方法は、それによりＡＮＧ−７核酸を得ることができる方法の以下の一般
的記述を制限することを意味していない。いかなる真核生物細胞も、潜在的に、
ＡＮＧ−７核酸の分子クローニングのための核酸供給源として作用することがで
きる。Ａｎｇ−７ポリペプチドをコードする核酸は、ブタ、ウシ、ネコ、鳥類、
ウマ、イヌおよびヒトのような哺乳動物の供給源、ならびに付加的な霊長類の供
給源を包含する脊椎動物の供給源から単離することができる。ＤＮＡはクローン
化されたＤＮＡ（例えばＤＮＡ「ライブラリー」）から当該技術分野で既知の標
準的手順により、化学合成により、ｃＤＮＡクローニングにより、または所望の
細胞から精製されたゲノムＤＮＡもしくはそのフラグメントのクローン化により
得ることができる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ ｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、第２版、コールド ス
プリング ハーバー ラボラトリー プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリ
ングハーバー（１９８９）；Ｇｌｏｖｅｒ（編）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ 、ＭＲＬ プレス リミテッド（ＭＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．）、英国・オックスフォード 第Ｉ、ＩＩ巻。（１９
８５）を参照されたい）。ゲノムＤＮＡ由来のクローンは、コーディング領域に
加えて調節およびイントロンＤＮＡ領域を含有することができ；ｃＤＮＡ由来の
クローンはエキソン配列のみを典型的に含有することができる。供給源が何であ
れ、核酸の伝播のために該核酸を適するベクター中に分子的にクローン化するこ
とができる。

【００５３】 ゲノムＤＮＡからのＡＮＧ−７核酸の分子クローニングにおいて、ＤＮＡフラ
グメントが生成され、そのいくつかはＡＮＧ−７遺伝子をコードすることができ
る。該ＤＮＡは多様な制限酵素を使用して特定の部位で切断することができる。
あるいは、ＤＮＡを断片化するためにマンガンの存在下でＤＮアーゼを使用する
ことができるか、もしくは、ＤＮＡは例えば超音波処理によるように物理的に剪
断することができる。その後、限定されるものでないがアガロースおよびポリア
クリルアミドゲル電気泳動、ならびにカラムクロマトグラフィーを挙げることが
できる標準的技術により、直鎖状のＤＮＡフラグメントを大きさにより分離する
ことができる。

【００５４】 ＤＮＡフラグメントが生成されれば、所望の遺伝子を含有する特定のＤＮＡフ
ラグメントの同定を多数の方法で達成することができる。例えば、ＡＮＧ−７遺
伝子、（いずれかの種の）ｃＤＮＡもしくはその特異的ＲＮＡ、またはそれらの
フラグメントの一部分を精製しかつ標識することができ、標識されたプローブへ
の核酸ハイブリダイゼーションにより、生成されたＤＮＡフラグメントをスクリ
ーニングすることができる（例えば、ＢｅｎｔｏｎとＤａｖｉｓ、Ｓｃｉｅｎｃ ｅ １９６：１８０（１９７５）；ＧｒｕｎｓｔｅｉｎとＨｏｇｎｅｓｓ、Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７２：３９６１（１９７５）を参
照されたい）。プローブに対する実質的な同一性をもつＤＮＡフラグメントがハ
イブリダイズすることができる。制限酵素消化（１回もしくは複数）、および利
用できる場合は既知の制限地図により期待されるものとのフラグメントの大きさ
の比較により、適切なフラグメントを同定することもまた可能である。遺伝子の
特性に基づき、さらなる選択を実施することができる。

【００５５】 あるいは、その発現された産物の物理的、化学的もしくは免疫学的特性に基づ
くアッセイにより、遺伝子の存在を検出することができる。例えば、例えばＡｎ
ｇ−７ポリペプチドについて既知のものと類似のもしくは同一の電気泳動の移動
、等電点電気泳動の挙動、タンパク質分解性消化地図、脈管形成の調節、受容体
結合活性、もしくは抗原性の特性を有するポリペプチドを産生する、ｃＤＮＡク
ローン、もしくは適正なｍＲＮＡをハイブリッド選択する（ｈｙｂｒｉｄ−ｓｅ
ｌｅｃｔ）ＤＮＡクローンを選択することができる。Ａｎｇ−７ポリペプチドに
特異的に結合する免疫血清もしくは抗体を使用して、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定
法）型の手順で結合することによりＡｎｇ−７ポリペプチドを合成するクローン
を推定的に同定することができる。

【００５６】 ＡＮＧ−７核酸は、核酸ハイブリダイゼーション、次いでインビトロ翻訳によ
るｍＲＮＡの選択によってもまた同定することができる。この手順において、ハ
イブリダイゼーションにより相補ｍＲＮＡを単離するのにフラグメントを使用す
る。こうしたＤＮＡフラグメントは、典型的には、別の種（例えばヒト、マウス
など）の入手可能な精製されたＤＮＡを表す。単離されたｍＲＮＡのインビトロ
翻訳産物の免疫沈降分析もしくは機能アッセイ（例えば、脈管形成の阻害、イン
ビトロでの内皮管形成、腫瘍阻害もしくはＴＩＥ受容体への結合）が、ｍＲＮＡ
、および従って所望の配列を含有する相補ＤＮＡフラグメントを同定する。加え
て、Ａｎｇ−７ポリペプチドに対し特異的に向けられる固定された抗体への細胞
から単離されたポリソームの吸着により、特異的ｍＲＮＡを選択することができ
る。（吸着されたポリソームからの）選択されたｍＲＮＡを鋳型として使用して
、放射標識されたＡＮＧ−７ ｃＤＮＡを合成することができる。その後、放射
標識されたｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡをプローブとして使用して、他のゲノムＤ
ＮＡフラグメントのなかからＡＮＧ−７核酸フラグメントを同定することができ
る。

【００５７】 ＡＮＧ−７ゲノムＤＮＡを単離することに対する代替は、限定されるものでな
いが、既知の配列からの遺伝子配列それ自身を化学的に合成すること、もしくは
Ａｎｇ−７ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを作成すること
を挙げることができる。例えば、ＡＮＧ−７遺伝子のｃＤＮＡクローニングのた
めのＲＮＡを、Ａｎｇ−７ポリペプチドを発現する細胞から単離することができ
る。他の方法が可能である。

【００５８】 同定かつ単離されたＡＮＧ−７核酸を、その後、適切なクローニングベクター
に挿入することができる。当該技術分野で既知の多数のベクター−宿主系を使用
することができる。可能なベクターは、限定されるものでないがプラスミドもし
くは改変されたウイルスを挙げることができる。ベクター系は宿主細胞と適合性
であるように選択する。こうしたベクターは、ほんの少し例を挙げれば、限定さ
れるものでないがλ誘導体のようなバクテリオファージ、酵母の組込みおよびセ
ントロメアベクター、２μプラスミドならびにそれらの誘導体、あるいはｐＢＲ
３２２、ｐＵＣもしくはｐＲＳＥＴＣ（インヴィトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇ
ｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）プラスミド誘導体またはＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリフォルニア
州ラホヤ）のようなプラスミドを挙げることができる。クローニングベクター中
へのＡＮＧ−７核酸の挿入は、例えば相補的付着末端を有するクローニングベク
ターにＤＮＡフラグメントを連結することにより達成することができる。しかし
ながら、ＤＮＡを断片化するのに使用された相補的制限部位がクローニングベク
ター中に存在しない場合は、ＤＮＡ分子の端を酵素的に改変することができる。
あるいは、所望のいかなる部位もＤＮＡ末端にヌクレオチド配列（リンカー）を
連結することにより生じさせることができ；これらの連結されたリンカーは制限
エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特定の化学的に合成されたオリゴヌク
レオチドを含むことができる。制限部位は、所望の制限部位（１個もしくは複数
）をコードするプライマー（１種もしくは複数）を使用する核酸のＰＣＲ増幅に
より核酸に導入することもまたできる。代替の一方法において、切断されたベク
ターおよびＡＮＧ−７核酸を単独重合的尾付加（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃ
ｔａｉｌｉｎｇ）により改変することができる。組換え分子は、形質転換、トラ
ンスフェクション、感染、電気穿孔法などを介して宿主細胞に導入することがで
き、その結果、該遺伝子配列の多くのコピーが生成される。

【００５９】 別の方法においては、ＡＮＧ−７遺伝子は、「ショットガン」アプローチでの
適するクローニングベクターへの挿入後に同定しかつ単離することができる。例
えば、大きさの分画（ｓｉｚｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）によるＡＮＧ−
７遺伝子についての濃縮をクローニングベクターへの挿入前に行うことができる
。特定の態様において、単離されたＡＮＧ−７遺伝子、ｃＤＮＡもしくは合成さ
れたＤＮＡ配列を組込む組換えＤＮＡ分子での宿主細胞の形質転換は、遺伝子の
複数のコピーの生成を可能にする。従って、形質転換体を成長させること、形質
転換体から組換えＤＮＡ分子を単離すること、および必要な場合は単離された組
換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することにより、該遺伝子を大量で得る
ことができる。

【００６０】 本特殊な場合において、ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡを、別の既知のアンジオポエチ
ンＡｎｇ−１との相同性により単離した。簡潔には、参照としてＡｎｇ−１の推
定されるアミノ酸配列を使用する、発現される配列標識（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）（「ＥＳＴ」）データベース（国立バイオテクノロ
ジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））に対するＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓ
ｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２（
１９９７））により、ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡのフラグメントを単離した。重なり
合う配列を伴う２個のＥＳＴを単離した。Ａｎｇ−７ポリペプチドをコードする
完全長のｃＤＮＡフラグメントは、放射活性に標識されたＥＳＴを使用して完全
長のヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりクローン化した
。ヒトＡＮＧ−７ ｃＤＮＡ（配列番号１）のその後の分析は４９３アミノ酸の
１個の読取り枠（配列番号２）を同定した。推定されるアミノ酸配列は約５７ｋ
Ｄａのポリペプチドをコードする。ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡのその後の分析は、そ
れがＳＤＳ ＰＡＧＥにより決定されるようなその見かけの分子量の組換え的に
発現されるポリペプチドの合成を指図することを確認する。ヒトＡｎｇ−７ポリ
ペプチドは、Ａｎｇ−１および−２ポリペプチドにそれぞれ２３．９％および２
３．５％類似である。アミノ酸の保存は２種のタンパク質の長さ全体に分布され
る。Ａｎｇ−７ポリペプチドの発現の特徴は、該ポリペプチドが心組織、子宮、
乳腺および脳梁を包含する多様な大いに血管化された組織中で発現されることを
示す。

【００６１】 ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡをもつ１個のクローン、ＡＮＧ−７−ｃＤＮＡ／ｐＧＥ
Ｍを、寄託登録第ＤＳＭ １３５６２で、２０００年６月２６日にＤＳＭＺドイ
ツ微生物・細胞培養コレクション有限会社（ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａ
ｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋ
ｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｄ−３
８１２４、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、独国）に寄託した。この寄託物は、特許
手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ｔｈｅ Ｂｕｄａ
ｐｅｓｔ Ｔｒｅａｔｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｃ
ｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｅｐｏｓｉｔ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａ
ｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｐｒｏｃ
ｅｄｕｒｅ）およびその下での規制（ブダペスト条約）の規定のもとになされた
。Ａｎｇ−７ポリペプチド、フラグメント、変異体、誘導体および類似物： 本発明は、Ａｎｇ−７ポリペプチド、ならびにそれらの生物学的に活性のまた
は診断上もしくは治療上有用なフラグメント、変異体、誘導体および類似物、な
らびに、脈管形成の調節におけるそれらの使用にさらに関する。一態様において
、Ａｎｇ−７ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸配列を有する。別の態様にお
いて、Ａｎｇ−７ポリペプチドは、配列番号２のフラグメント、変異体、誘導体
もしくは類似物である。該Ａｎｇ−７ポリペプチド、フラグメント、変異体、誘
導体もしくは類似物は生物学的に活性である。生物学的に活性のＡｎｇ−７ポリ
ペプチド、フラグメント、変異体、誘導体もしくは類似物は、例えば、例えば実
施例９（下）のＨＵＶＥＣアッセイに記述されるような内皮管形成に影響を及ぼ
すこと、または腫瘍細胞の成長もしくは増殖に影響を及ぼすこと（例えば実施例
１０を参照されたい）によるような、脈管形成を調節する該分子の能力を指す。
あるいは、所望の免疫原性もしくは抗原性を有するこうしたポリペプチド、フラ
グメント、変異体、誘導体もしくは類似物は、イムノアッセイで、免疫感作に、
Ａｎｇ−７ポリペプチド活性の阻害に、など使用することができる。同様に、目
的の所望のＡｎｇ−７の特性（例えば、脈管形成の阻害）を保持する、あるいは
欠くもしくは阻害するＡｎｇ−７のフラグメント、変異体、誘導体もしくは類似
物は、こうした特性の誘導物質もしくは阻害剤、およびその生理学的相関物とし
て使用することができる。特定の一態様は、脈管形成を阻害するために被験体に
投与することができるＡｎｇ−７フラグメントに関する。Ａｎｇ−７のフラグメ
ント、変異体、誘導体もしくは類似物は、限定されるものでないが本明細書に記
述されるアッセイを挙げることができる当該技術分野で既知の手順により、所望
の活性について試験することができる。

【００６２】 別の態様において、Ａｎｇ−７ポリペプチド、フラグメント、変異体、誘導体
もしくは類似物は、最低１０の連続するアミノ酸を有する。他の態様において、
Ａｎｇ−７ポリペプチド、フラグメント、変異体、誘導体もしくは類似物は、最
低２０もしくは５０の連続するアミノ酸より成る。別の態様において、Ａｎｇ−
７ポリペプチド、フラグメント、変異体、誘導体もしくは類似物は、３５、１０
０もしくはなお２００アミノ酸より大きくない。Ａｎｇ−７ポリペプチドのフラ
グメント、変異体、誘導体および類似物は、限定されるものでないが、Ａｎｇ−
７ポリペプチドに実質的に類似である（例えば、多様な態様において、同一の大
きさのアミノ酸配列にわたって最低６０％、もしくは７０％、もしくは８０％、
もしくは９０％、もしくは９５％まで同一）領域を含んで成る分子を挙げること
ができ、ここでは、整列が当該技術分野で既知のコンピュータ配列比較／整列プ
ログラムによりなされる整列された配列と比較されるか、またはコーディング核
酸がストリンジェント、中程度にストリンジェント、もしくは低ストリンジェン
シーの条件下でＡＮＧ−７核酸にハイブリダイズすることが可能である。

【００６３】 Ａｎｇ−７ポリペプチドの変異体、誘導体もしくは類似物は、機能的に同等な
分子を提供する置換、付加もしくは欠失によりＡｎｇ−７配列を変えることによ
り作成することができる。Ａｎｇ−７ポリペプチドの変異体、誘導体もしくは類
似物としては、限定されるものでないが、その中で機能的に同等なアミノ酸残基
（すなわち保存的置換）がＡｎｇ−７ポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の代
わりに用いられてサイレントな変化をもたらす変えられた配列を包含する、該配
列の全部もしくは一部の一次アミノ酸配列として含有するものを挙げることがで
きる。例えば、該配列内の１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基を、機能的同等
物として作用する類似の極性、疎水性もしくは親水性の別のアミノ酸により置換
してそれによりサイレントな変化をもたらすことができる。該配列内のアミノ酸
の置換は、該アミノ酸が属する分類の他のメンバーから選択することができる。

【００６４】 Ａｎｇ−７ポリペプチドの変異体、フラグメント、誘導体および類似物は当該
技術分野で既知の多様な方法により産生することができる。それらの産生をもた
らす操作は遺伝子もしくはタンパク質レベルで発生することができる。例えば、
クローン化されたＡＮＧ−７遺伝子もしくはｃＤＮＡ配列は、当該技術分野で既
知の多数の戦略のいずれかにより改変することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ ａｎｕａｌ 、第２版、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス
（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）を参照されたい）
。該配列を制限エンドヌクレアーゼ（１種もしくは複数）で適切な部位で切断し
、次いで所望の場合はさらに酵素的に改変し、単離し、そしてインビトロで連結
することができる。Ａｎｇ−７ポリペプチド、またはそのフラグメント、変異体
、誘導体もしくは類似物をコードする核酸の産生において、改変された核酸は適
正な翻訳の読み枠に留まり、その結果、読み枠は、翻訳終止シグナルもしくは合
成を妨害する他のシグナルにより中断されない。ＡＮＧ−７核酸は、翻訳、開始
および／もしくは終止配列を創製および／もしくは破壊するようにインビトロも
しくはインビボで突然変異することもまたできる。Ａｎｇ−７ポリペプチドをコ
ードする核酸配列は、コーディング領域中に変異を創製しそして／または新たな
制限エンドヌクレアーゼ部位を形成もしくは現存するものを破壊しかつさらなる
インビトロ改変を助長するように突然変異させることもまたできる。限定される
ものでないが化学的突然変異誘発、インビトロ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔ
ｃｈｉｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１（１９７８））
、ＴＡＢ（商標）リンカー（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））の使用、な
どを挙げることができる当該技術分野で既知のいずれかの突然変異誘発技術を使
用することができる。

【００６５】 Ａｎｇ−７ポリペプチド配列の操作はタンパク質レベルでもまた行うことがで
きる。（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護
基／封鎖基による誘導体化、タンパク質分解性の切断、抗体分子もしくは他の細
胞リガンドへの連結などにより）翻訳の間もしくは後に化学的に改変されるＡｎ
ｇ−７ポリペプチドの変異体、誘導体もしくは類似物が本発明の範囲内に包含さ
れる。限定されるものでないが特異的化学的切断（例えば臭化シアンによる）；
酵素的切断（例えば、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアー
ゼなどによる）；例えばＮａＢＨ₄による改変、アセチル化、ホルミル化、酸化
および還元、もしくはツニカマイシンの存在下での代謝的合成などを挙げること
ができる既知の技術により、多数の化学的改変のいずれかを実施することができ
る。

【００６６】 加えて、Ａｎｇ−７ポリペプチド、もしくはそれらのフラグメント、変異体、
誘導体および類似物を化学的に合成することができる。例えば、所望のドメイン
を含んで成る、もしくはインビトロで所望の活性を媒介するＡｎｇ−７ポリペプ
チドの一部分に対応するペプチド、もしくはフラグメントは、例えば自動化ペプ
チド合成機を使用する化学合成法の使用により合成することができる。Ａｎｇ−
７ポリペプチド類似物は、所望の場合は、Ａｎｇ−７ポリペプチド配列中に置換
もしくは付加として非古典的アミノ酸もしくは化学物質のアミノ酸類似物を導入
することにより製造することができる。非古典的アミノ酸は、限定されるもので
ないが、普遍的アミノ酸のＤ異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、２
−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、２−アミ
ノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン
、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグ
リシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β
−アラニン、セレノシステイン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃα
−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸のような特注のアミノ酸、および一般
的なアミノ酸類似物を挙げることができる。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）も
しくはＬ（左旋性）であることができる。

【００６７】 一態様において、Ａｎｇ−７ポリペプチド、またはそのフラグメント、誘導体
もしくは類似物は、異なるタンパク質のアミノ酸配列にペプチド結合を介してそ
のアミノもしくはカルボキシ末端で結合された、Ａｎｇ−７ポリペプチドまたは
その変異体、フラグメント、誘導体もしくは類似物（典型的には、Ａｎｇ−７ポ
リペプチドの最低１個のドメインもしくはモチーフ、またはＡｎｇ−７ポリペプ
チドの最低１０の連続するアミノ酸より成る）を含んで成るキメラもしくは融合
タンパク質である。一態様において、こうしたキメラタンパク質は、該タンパク
質をコードする核酸の組換え発現により産生させることができる。キメラ産物は
、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を適正な読み枠で当該技術分
野で既知の方法により相互に連結すること、および当該技術分野で公知の方法に
よりキメラ産物を発現することにより作成することができる。あるいは、キメラ
産物はタンパク質合成技術により（例えば、自動化ペプチド合成機の使用により
）作成することができる。 ＡＮＧ−７核酸もしくはＡｎｇ−７ポリペプチドの発現 さらなる一態様において、宿主細胞はＡＮＧ−７核酸を発現する構築物を含ん
で成る。こうした宿主細胞は、哺乳動物細胞のような高等真核生物細胞、酵母細
胞のような低級真核生物細胞、もしくは細菌細胞のような原核生物細胞であるこ
とができる。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクシ
ョン、ＤＥＡＥ−デキストランに媒介されるトランスフェクション、もしくは電
気穿孔法（Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 、第２版、ＡｐｐｌｅｔｏｎとＬａｎｇ、パラマウント
パブリッシング（Ｐａｒａｍｏｕｎｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）、コネチカット
州イーストノーウォーク（１９９４））、塩化カルシウムに媒介される形質転換
、酢酸リチウムに媒介される形質転換などにより達成することができる。

【００６８】 宿主細胞中の構築物は、Ａｎｇ−７ポリペプチド、またはそのフラグメント、
変異体、誘導体もしくは類似物を産生するのに慣習的な様式で使用することがで
きる。ＡＮＧ−７核酸由来のＲＮＡを使用してこうしたポリペプチドを産生させ
るのに、細胞を含まない翻訳系もまた使用することができる。あるいは、Ａｎｇ
−７ポリペプチド、そのフラグメント、変異体、誘導体もしくは類似物は、慣習
的なペプチド合成機により合成的に製造することができる。

【００６９】 ＡＮＧ−７核酸は、適切なプロモーターの制御下で哺乳動物細胞、酵母、細菌
、昆虫もしくは他の細胞中で発現させることができる。代表的発現ベクターは、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー
、（１９８９））により記述されるもののような、プラスミド、ファージおよび
／もしくはウイルスベクター配列を包含する。例えば、適するベクターは、アデ
ノウイルスベクター、レンチウイルスベクターを包含するレトロウイルスベクタ
ー、ワクシニアウイルスベクター、サイトメガロウイルスのウイルスベクターお
よびバキュロウイルスベクター（例えば、Ｋｎｏｐｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ． ２６６：７２８５（１９９１）を参照されたい）などを包含する。ＳＶ４０
ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０開始点（ｏｒｉｇｉｎ）、
初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル酸化部位を、
必要とされる転写されない遺伝子要素を提供するのに使用することができる。代
表的な有用なベクターはｐＲｃ／ＣＭＶおよびｐｃＤＮＡ３ベクター（インヴィ
トロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州サンディエゴ）を包含
する。

【００７０】 核酸の転写を指図することが可能なプロモーターは、誘導可能もしくは構成的
プロモーターであることができ、また、ウイルスおよび細胞のプロモーターを包
含する。哺乳動物宿主細胞における発現に適するウイルスプロモーターは、前初
期サイトメガロウイルスプロモーター（Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ ４１：５
２１−３０（１９８５））およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら
、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−６４（１９８１））を包含する。
哺乳動物宿主細胞中での核酸の発現に適する細胞のプロモーターは、限定される
ものでないがマウスメタロチオネイン−１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、
米国特許第４，５７９，８２１号明細書）およびテトラサイクリン応答性のプロ
モーター（ＧｏｓｓｅｎとＢｕｊａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ８９：５５４７−５１（１９９２）；Ｐｅｓｃｉｎｉら、Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ． ２０２：１６６４−６７（１９９
４））を挙げることができる。転写終止シグナルもまた、典型的には目的のコー
ディング配列の下流に配置される。適する転写終止シグナルは、ＳＶ４０からの
初期もしくは後期ポリアデニル酸化シグナル（ＫａｕｆｍａｎとＳｈａｒｐ、Ｍ ｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２：１３０４−１９（１９８２））、アデノウイル
ス５ ｅ１Ｂ領域からのポリアデニル酸化シグナル、およびヒト成長ホルモン遺
伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．９
：３７１９−３０（１９８１））を包含する。

【００７１】 哺乳動物細胞におけるＡＮＧ−７核酸の転写は、ベクター中にエンハンサー配
列を挿入することにより増大される。エンハンサーは、プロモーターに作用して
その転写を増大させる、通常は約１０から３００ｂｐまでの、ＤＮＡのｃｉｓに
作用する要素である。例は、複製起点の後ろ側（ｌａｔｅ ｓｉｄｅ）のＳＶ４
０エンハンサー（ｂｐ １００ないし２７０）、サイトメガロウイルス初期プロ
モーターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサー、およびア
デノウイルスエンハンサーを包含する。

【００７２】 哺乳動物細胞は、リン酸カルシウム沈殿法（例えば、Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌ ｌ １４：７２５（１９７８）；ＣｏｒｓａｎｏとＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔ ｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３（１９８１）；Ｇｒａｈａｍと
Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６（１９７３）を参照さ
れたい）；リポフェクション（例えばＦｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７４１３−１７（１９８７）を参照されたい
）、ならびに微小注入法および電気穿孔法（例えば、Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢ Ｏ Ｊ． １：８４１−４５（１９８２）を参照されたい）を包含する多数の方法
によりトランスフェクションすることができる。哺乳動物細胞は、ＳＶ４０、Ｃ
ＭＶなどのようなウイルスで形質導入することができる。ウイルスベクターの場
合、クローン化されたＤＮＡ分子は、ウイルス粒子での感受性の細胞の感染によ
り導入することができる。レンチウイルスを包含するレトロウイルスおよびアデ
ノウイルスベクターは、とりわけ遺伝子治療の方法においてＡＮＧ−７核酸また
はそれらのフラグメント、変異体、誘導体もしくは類似物を使用する場合に、哺
乳動物細胞中でのＡＮＧ−７核酸の発現での使用に好ましい。

【００７３】 ＡＮＧ−７核酸を含有する細胞を同定するのに、選択可能なマーカーを典型的
に使用する。選択可能なマーカーは、一般に、クローン化されたＤＮＡ分子と一
緒に細胞中に導入され、そしてネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレ
キセートのような薬物に対する耐性を賦与する遺伝子を包含する。選択可能なマ
ーカーは宿主細胞における栄養要求性を補完することもまたできる。なお他の選
択可能なマーカーは、ＡＮＧ−７核酸を含有する細胞を同定するためのβ−ガラ
クトシダーゼもしくは緑色蛍光タンパク質のような検出可能なシグナルを提供す
る。選択可能なマーカーは増幅可能であることができる。こうした増幅可能な選
択可能なマーカーは、宿主ゲノム中に組込まれた配列の数を増幅するのに使用す
ることができる。

【００７４】 ＡＮＧ−７核酸を発現するのに多様な哺乳動物細胞培養系を使用することがで
きる。哺乳動物発現系の例は、サル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７系統（例えば、Ｇ
ｌｕｚｍａｎ、Ｃｅｌｌ ２３：１７５（１９８１）を参照されたい）、および
、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣ
Ｋ、２９３、ＷＩ３８、ＨＥＫ、ＨＵＶＥＣ細胞系のような適合性ベクターを発
現することが可能な他の細胞系を包含する。インビトロでのヒト細胞の培養およ
び細胞の不死化の方法は当業者に既知である。

【００７５】 組換えポリペプチドの長期間の高収量産生のためには安定な発現が好ましい。
例えば、ＡＮＧ−７核酸を含有する構築物を安定に発現する細胞系を工作するこ
とができる。ウイルスの複製開始点を含有する発現ベクターを使用することより
もむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーターおよびエン
ハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル酸化部位、など）および選択
可能なマーカーにより、ＡＮＧ−７核酸で形質転換することができる。哺乳動物
細胞へのこうした発現ベクターの導入後に、工作された細胞を集積培地（ｅｎｒ
ｉｃｈｅｄ ｍｅｄｉａ）中で１〜２日間成長させ、そしてその後選択培地に切
り替えることができる。発現ベクター中の選択可能なマーカーは選択に対する抵
抗性を賦与し、そして、細胞がベクターを染色体中に安定に組込みかつフォーカ
スを形成するよう成長することを可能にし、このフォーカスを順にクローン化し
かつ細胞系に拡張することができる。

【００７６】 限定されるものでないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（「ｔｋ」
）（例えば、Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７）を参照され
たい）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（「ｈｐ
ｒｔ」（例えば、Ｓｚｙｂａｌｓｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ ４８：２０２６（１９６２）を参照されたい）およびアデニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（「ａｐｒｔ」）（例えば、Ｌｏｗｙら、 Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０）を参照されたい）を挙げることができる多
数の選択系を使用することができ、そして、それぞれｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^-もしく
はａｐｒｔ^-細胞中で使用することができる。代謝拮抗物質耐性もまた、ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ（「ｄｈｆｒ」）（メトトレキセートに対する耐性を賦与す
る）（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７
：３５６７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１０：７３
１（１９８１））；ｇｐｔ（ミコフェノール酸に対する耐性を賦与する）（Ｍｕ
ｌｌｉｇａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０
７２。（１９８１））；ネオマイシン（アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐
性を賦与する）（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ． １５０：１（１９８１））；およびハイグロマイシン（ハイグロマイシンに対
する抵抗性を賦与する）（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９
８４））についての選択の基礎として使用することができる。

【００７７】 ＡＮＧ−７核酸は、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ ）、シゾサッカロミセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、糸状菌、ならびに、形質転換および／もしくはトラン
スフェクションに敏感に反応する他の単および多細胞生物体中でもまた発現させ
ることができる。ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ ｉａｅ ）中でのクローン化された遺伝子の発現方法は当該技術分野で公知である
。（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８５巻、Ｇｏ
ｅｄｄｅｌ（編）、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、
カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）中、“Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 、ＧｕｔｈｒｉｅとＦｉｎｋ（編）、アカデミック プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９１）中、“Ｇｕｉｄｅ
ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ”を参照されたい）。糸状菌（例えばアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ）の株）もまたＡＮＧ−７核酸を発現するのに使用することができる
。培養された哺乳動物細胞および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での異種遺伝子およ
びｃＤＮＡの発現方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、第２版、ニューヨーク州コ
ールドスプリングハーバー（１９８９））に詳細に論考される。当業者に明らか
であるとみられるとおり、文献中で十分に確立された調節配列、ベクターおよび
方法を使用して、鳥類、昆虫および植物細胞のような他の宿主細胞中でＡＮＧ−
７核酸を発現することができる。

【００７８】 細菌中での発現に有用な組換え発現ベクターは、典型的には、宿主細胞の形質
転換を可能にする複製開始点および選択可能なマーカー（例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ ）のアンピシリンもしくはテトラサイクリン耐性遺伝子、またはビール
酵母菌（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＲＰ１もしくはＵＲＡ３遺伝子）、な
らびに下流の構造配列の転写を指図する高度に発現される遺伝子由来のプロモー
ターを包含する。こうしたプロモーターは、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（
ＰＧＫ）のような解糖酵素、α因子、酸ホスファターゼ、熱ショックタンパク質
、翻訳伸長因子などをコードするオペロン由来であることができる。異種ＡＮＧ
−７核酸は、適切な相で、翻訳開始および終止配列、ならびに好ましくは翻訳さ
れたタンパク質の細胞周辺腔もしくは細胞外媒体中への分泌を指図することが可
能なリーダー配列と集成する。場合によっては、異種配列は、所望の特徴（例え
ば、発現された組換え産物の安定化もしくは単純化された精製）を分け与えるＮ
末端同定ペプチドを包含する融合タンパク質をコードすることができる。形質転
換のための適する原核生物宿主は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌ ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス属（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およ
びブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）内の多様な種を包含するが、
とは言え他者もまた慣例の選択の問題として使用することができる。

【００７９】 細菌の使用に有用な発現ベクターは、公知のクローニングベクターｐＢＲ３２
２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝子要素を含んで成るプラスミド由来の選択可
能なマーカーおよび細菌の複製開始点を含んで成る。他のベクターは、限定され
るものでないがｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター（ストラタジーン（Ｓｔａｒａ
ｔａｇｅｎｅ））、ＰＫＫ２２３−３（ファルマシア ファイン ケミカルズ（
Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、スウェーデン・ウプサ
ラ）およびＧＥＭ１（プロメガ バイオテック（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ
）、ウィスコンシン州マディソン）を挙げることができる。これらのｐＢＲ３２
２の「バックボーン」区分を、適切なプロモーターおよび発現されるべき構造配
列と組み合わせる。

【００８０】 有用な発現ベクターは、所望のポリペプチドの精製での容易さのため、もしく
は可溶性のポリペプチドを産生するための融合パートナーをさらに含んで成る。
商業的融合ベクターの例は、限定されるものでないが、ｐＥＴ３２ａ（ノヴァジ
ェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ウィスコンシン州マディソン）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２
（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））およびｐＣＹＢ３（ニュー イングラ
ンド バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチュー
セッツ州ビバリー）を挙げることができる。とりわけ細菌細胞中でのＡｎｇ−７
ポリペプチド、またはそれらのフラグメント、変異体、誘導体もしくは類似物の
高レベル発現のため、融合パートナーの使用を回避する発現ベクターもまた構築
することができる。例えば、Ｐｉｌｏｔ−Ｍａｔｉａｓら（Ｇｅｎｅ １２８：
２１９−２２５（１９９３））により記述されるような翻訳カップリング（ｔｒ
ａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を至適化するためのベクターを作
成することができる。あるいは、ＡＮＧ−７核酸は、それ自身が目的のＡｎｇ−
７ポリペプチドの可溶化で補助するタンパク質もしくはペプチドをコードする別
個の付属プラスミドとともに共発現することができる。（例えば、Ｍａｋｒｉｄ
ｅｓ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６０：５１２（１９
９６）を参照されたい）。

【００８１】 適する宿主株の形質転換、および適切な細胞密度までの宿主株の成長の後に、
選択されたプロモーターを適切な手段（例えば温度の移動もしくは化学的誘導）
により抑制解除し、そして細胞を付加的期間の間培養する。細胞は、典型的には
、遠心分離により収穫し、物理的もしくは化学的手段により崩壊させ、そして生
じる粗抽出物をさらなる精製のため保持する。タンパク質の発現で使用される微
生物細胞は、凍結−融解の循環、超音波処理、機械的崩壊、もしくは細胞溶解剤
の使用を包含するいずれかの便宜的方法により崩壊させることができ；こうした
方法は当業者に公知である。

【００８２】 Ａｎｇ−７ポリペプチドは、固体支持体に結合された抗Ａｎｇ−７抗体を使用
するアフィニティークロマトグラフィー、およびＬｏｂａｎｅｎｋｏｖら（Ｏｎ ｃｏｇｅｎｅ ５：１７４３−５３（１９９０））により記述されたような配列
特異的クロマトグラフィーのような多数の確立された方法を使用して、ならびに
エピトープ標識されたＡｎｇ−７ポリペプチドに対する抗体（例えば抗ＨＩＳ₄
、ｍｙｃ、ＦＬＡＧなど）を使用して単離することができる。付加的な単離方法
は、とりわけ、液体クロマトグラフィー、高圧液体クロマトグラフィー、ＦＰＬ
Ｃ、勾配遠心分離およびゲル電気泳動のような精製手段を包含する。タンパク質
精製の方法は当該技術分野で既知であり、そして本明細書に記述される組換えポ
リペプチドの精製に適用することができる。（全般的に、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏ ｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 、シュプリンガー−フェアラーク（Ｓｐｒ
ｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（１９８２）を参照されたい）。 抗Ａｎｇ−７抗体 別の態様において、本発明は、脈管形成の調節での使用のための抗Ａｎｇ−７
抗体を提供する。こうした抗体は、Ａｎｇ−７ポリペプチドまたはそれらのフラ
グメント、変異体、誘導体もしくは類似物に結合することができる。Ａｎｇ−７
ポリペプチドは、抗血清、もしくは例えばＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎ ａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５））の方法に従ってモノクローナル抗体
を生じさせるのに使用することができる。こうしたモノクローナル抗体は、その
後、治療、治療的使用、もしくは診断試験の基礎を形成することができる。

【００８３】 非ヒト抗血清またはモノクローナル抗体（例えばマウス、ウサギ目、ブタもし
くはウマ）の産生は、例えば、動物をアジュバントとともにもしくは伴わずにＡ
ｎｇ−７ポリペプチド、フラグメント、変異体、誘導体もしくは類似物で免疫化
することにより達成することができる。モノクローナル抗体の産生のためには、
抗体産生細胞を免疫化された動物から得、不死化しかつスクリーニングするか、
もしくは抗原に結合する抗体の産生について最初にスクリーニングし、そしてそ
の後不死化する。非ヒト抗体の抗原結合領域（例えば、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ
’）₂、Ｆｖもしくは超可変領域）を、組換えＤＮＡ技術によりヒト抗体の枠組
み中に移して実質的にヒトの分子を産生させることが望ましいことができる。こ
うした「人化」分子の製造方法は一般に公知であり、そして、例えば、米国特許
第４，８１６，５６７号；同第４，８１６，３９７号；同第５，６９３，７６２
号；および同第５，７１２，１２０号明細書；国際特許公開第ＷＯ ８７／０２
６７１号および同第ＷＯ ９０／００６１６号明細書；ならびに欧州特許公開第
０，２３９，４００号明細書（それらの開示は引用により本明細書に組み込まれ
る）に記述される。あるいは、ヒトモノクローナル抗体もしくはその部分は、Ｈ
ｕｓｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−８１（１９８９））により一般
に示される方法に従って、Ａｎｇ−７ポリペプチドに特異的に結合する抗体をコ
ードするＤＮＡ分子についてヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリーを最初にスクリー
ニングすることにより同定することができる。その後、ＤＮＡ分子をクローン化
しかつ増幅して、所望の特異性の抗体（もしくは結合ドメイン）をコードする配
列を得ることができる。ファージディスプレイ技術は、Ａｎｇ−７ポリペプチド
に結合する抗体を選択するための別の技術を提供する。（例えば、国際特許公開
第ＷＯ ９１／１７２７１号および同第ＷＯ ９２／０１０４７号明細書、なら
びにＨｕｓｅら、上記を参照されたい）。

【００８４】 抗体は、Ａｎｇ−７ポリペプチドの発現を指図する発現ベクターを使用する遺
伝子免疫感作によってもまた産生させることができる。移入された遺伝子により
コードされるタンパク質に対する特異的抗体応答を生じさせるのに、粒子砲撃に
媒介される遺伝子移入（Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２−５４（１
９９２）；Ｅｉｓｅｎｂａｕｍら、ＤＮＡ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７
９１−９７（１９９３）；ＪｏｈｎｓｔｏｎとＴａｎｇ、Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４３ Ｐｔ．Ａ：３５３−６５（１９９４）；Ｖａｈｌｓｉｎｇら、 Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ． １７５：１１−２２（１９９４））、およびレトロ
ウイルス遺伝子移入（Ｗａｎｇら、ＤＮＡ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：７
９９−８０５（１９９３）；Ｓｔｏｖｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ ｌ． ６：５６８−７１（１９９４）；Ｌａｕｂｅら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔ ｈｅｒ． ５：８５３−６２（１９９４））が使用されている。これらの方法は、
タンパク質精製を必要とすることなしに抗体の産生を可能にする。こうした方法
は、Ａｎｇ−７ポリペプチドに特異的な抗体の一団を産生させるのに使用するこ
とができる。モノクローナル抗体もまたこれらの方法を使用して生成させること
ができる。

【００８５】 Ａｎｇ−７ポリペプチドに対する抗体は、腫瘍生検サンプル、組織および器官
の切片、末梢血液細胞などのような生物学的サンプル中のＡｎｇ−７ポリペプチ
ドを検出するための試薬として使用することができる。こうした抗体は、Ａｎｇ
−７ポリペプチドのレベルを検出および／もしくは定量するためのイムノアッセ
イで使用することもまたできる。本発明での使用に適するイムノアッセイは、限
定されるものでないが、酵素免疫測定法、イムノブロット、阻害もしくは競争反
応、サンドイッチアッセイ、放射免疫沈降法などを挙げることができる。（例え
ば、米国特許第４，６４２，２８５号；同第４，３７６，１１０号；同第４，０
１６，０４３号；同第３，８７９，２６２号；同第３，８５２，１５７号；同第
３，８５０，７５２号；同第３，８３９，１５３号；同第３，７９１，９３２号
明細書；およびＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、コールド スプリング ハーバー パブリケーシ
ョンズ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）
、ニューヨーク（１９８８）を参照されたい）。

【００８６】 一アッセイにおいて、Ａｎｇ−７ポリペプチドは、標識された抗体、好ましく
は標識されたモノクローナル抗体を使用して同定および／もしくは定量する。抗
体を組織もしくは細胞と反応させ、そしてその後組織もしくは細胞を検査して、
該抗体が標的のＡｎｇ−７ポリペプチドに特異的に結合したかどうかを決定する
。こうしたアッセイは、典型的に、免疫複合体形成に伝導性の条件下で実施する
。標識されない一次抗体を、一次抗体と反応性である標識とともに、Ａｎｇ−７
ポリペプチドを検出するのに使用することができる。例えば、一次抗体は、一次
抗体を特異的に検出するよう作成された標識された二次抗体により間接的に検出
することができる。あるいは、抗Ａｎｇ−７抗体を直接標識することができる。
放射性核種、粒子（例えば、金、フェリチン、磁性粒子および赤血球）、蛍光団
（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）、化学発光剤（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）
、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素阻害剤、リガンド（とりわけハプテン）
などのような、広範な標識を使用することができる。

【００８７】 抗Ａｎｇ−７ポリペプチドは、例えば多様な組織中で本発明のポリペプチドの
レベルを検出するための診断アッセイで使用することができる。なぜなら、正常
の対照組織サンプルに比較した該タンパク質の過小発現は、異常な脈管形成、例
えば腫瘍の存在を検出することができるからである。宿主由来のサンプル中のタ
ンパク質のレベルを検出するのに使用されるアッセイは当業者に公知であり、そ
してラジオイムノアッセイ、競争結合アッセイ、ウェスタンブロット分析、ＥＬ
ＩＳＡアッセイおよび「サンドイッチ」型アッセイを包含する。診断アッセイは
、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの検出もまた包含する。
ＡＮＧ−７核酸および／もしくはＡｎｇ−７ポリペプチドの使用方法： 別の態様において、脈管形成を調節するためのＡｎｇ−７化合物の投与のため
の方法および組成物が提供される。Ａｎｇ−７化合物は、限定されるものでない
が、本明細書に記述されるところのＡｎｇ−７ポリペプチド、それらのフラグメ
ント、変異体、誘導体および類似物を挙げることができる。こうしたＡｎｇ−７
化合物は、本明細書に記述されるところのＡｎｇ−７ポリペプチド、フラグメン
トもしくは変異体をコードするＡＮＧ−７核酸、ならびに下により完全に記述さ
れるようなＡＮＧ−７アンチセンス核酸をさらに包含することができる。好まし
くない脈管形成のような、脈管形成を伴う障害は、Ａｎｇ−７ポリペプチド、そ
れらのフラグメント、変異体、誘導体および／もしくは類似物、ならびに／また
はＡＮＧ−７核酸の投与のような脈管形成を阻害するＡｎｇ−７化合物を使用す
る。同様に、脈管形成が不完全であるもしくは所望される障害は、ＡＮＧ−７ア
ンチセンス核酸、またはＡｎｇ−７の機能を阻害するＡｎｇ−７ポリペプチド、
そのフラグメント、変異体、誘導体もしくは類似物投与により治療することがで
きる。別の態様において、Ａｎｇ−７化合物はポリクローナル、モノクローナル
および人化抗体のような抗体を包含する。

【００８８】 該化合物は治療的もしくは予防的に投与することができる。それらは以下の実
施例により立証されるとおり、有効量でインビボ、エクスビボもしくはインビト
ロで宿主細胞と接触させることができる。 遺伝子治療 本発明のＡｎｇ−７ポリペプチドをコードするＡＮＧ−７核酸は遺伝子治療の
方法で使用することができる。遺伝子治療は、被験体内の疾患もしくは臨床状態
の治療のために、その被験体における外因性起源の核酸配列の発現を提供する方
法を指す。こうした遺伝子治療は、限定されるものでないが、癌、創傷治癒、糖
尿病性網膜症、黄斑変性、心血管系疾患、および胎盤の血管新生の調節を包含す
る生殖器系の脈管形成を伴う臨床状態を挙げることができる疾患もしくは臨床状
態の治療、または人工妊娠中絶薬としての使用に関与することができる。被験体
への核酸の送達は、直接（この場合に患者は核酸もしくは核酸を運搬するベクタ
ーに直接曝露される）または間接的（この場合には細胞を最初にインビトロで該
核酸で形質転換し、その患者に移植する）のいずれかであることができる。これ
らの２種のアプローチは、それぞれ、インビボもしくはエクスビボ遺伝子治療と
して知られる。例えば、Ａｎｇ−７ポリペプチド、またはそのフラグメントもし
くは変異体を、エクスビボで、該ポリペプチド、フラグメントもしくは変異体を
コードするポリヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）で細胞を工作することに
より、組換え的に発現させることができ、その後、工作された細胞を、該ポリペ
プチドで治療されるべき患者に提供する。細胞は、Ａｎｇ−７ポリペプチド、フ
ラグメントもしくは変異体をコードするＲＮＡを含有するレトロウイルス／レン
チウイルス粒子の使用により、当該技術分野で既知の手順によってもまた工作す
ることができる。例示的方法を後述する。

【００８９】 遺伝子治療の方法の全般的総説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら（Ｃｌｉｎ ｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３））；ＷｕとＷ
ｕ（Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１））；Ｔｏｌｓｔｏｓｈ
ｅｖ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−
５９６（１９９３））、Ｍｕｌｌｉｇａｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−
９３２（１９９３））；ＭｏｒｇａｎとＡｎｄｅｒｓｏｎ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７（１９９３））；およびＭａｙ（ＴＩＢＴ ＥＣＨ １１：１５５−２１５（１９９３））を参照されたい。使用することが
できる組換えＤＮＡ技術の当該技術分野で公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃ ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ ｙ 、ジョン ワイリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ
）、ニューヨーク（１９９３））；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆ ｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ 、ストックトン プレス（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（
１９９０））；ならびに米国特許第６，０７７，６６３号；同第６，０７７，８
３５号；同第６０７７，７０５号；および同第６，０７５，０１２号明細書に記
述されるものを包含する。遺伝子治療に他の外因性配列を使用する方法は、ＡＮ
Ｇ−７核酸を使用する遺伝子治療にもまた応用可能である。（例えば、米国特許
第６，０６６，６２４号明細書を参照されたい）。

【００９０】 定義された細胞集団に、潜在的に治療的な遺伝子を移入するためのいくつかの
方法が既知である。（例えばＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２
６−３１（（１９９３）を参照されたい。）これらの方法は： １）直接遺伝子移入。（例えばＷｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６
５−６８（１９９０）を参照されたい）。 ２）リポソームに媒介されるＤＮＡ移入。（例えば、Ｃａｐｌａｎら、Ｎａｔｕ ｒｅ Ｍｅｄ． ３：３９−４６（１９９５）；Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． １：１５−１７（１９９５）；ＧａｏとＨｕａｎｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ． １７９：２８０−８５（１９９１）を参照
されたい）。 ３）レトロウイルスに媒介されるＤＮＡ移入。（例えば、Ｋａｙら、Ｓｃｉｅｎ ｃｅ 、２６２：１１７−１９（１９９３）；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８−１３（１９９２）を参照されたい）。上で挙げられたレトロ
ウイルスプラスミドベクターが由来することができるレトロウイルスはレンチウ
イルスを包含する。それらは、限定されるものでないが、モロニーマウス白血病
ウイルス、脾壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類
の白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増
殖性肉腫ウイルスおよび乳房腫瘍ウイルスのようなレトロウイルスをさらに挙げ
ることができる。 一態様において、レトロウイルスプラスミドベクターはモロニーマウス白血病ウ
イルス由来である。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を具体的
に説明する例は、以下、すなわちＣｌｏｗｅｓら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ ． ９３：６４４−６５１（１９９４））；Ｋｉｅｍら（Ｂｌｏｏｄ ８３：１４
６７−１４７３（１９９４））；ＳａｌｍｏｎｓとＧｕｎｚｂｅｒｇ（Ｈｕｍａ ｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３））；およびＧ
ｒｏｓｓｍａｎとＷｉｌｓｏｎ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ． ３：１１０−１１４（１９９３））をさらに包含する。 ４）ＤＮＡウイルスに媒介されるＤＮＡ移入。こうしたＤＮＡウイルスは、アデ
ノウイルス（好ましくはＡｄ−２もしくはＡｄ−５に基づくベクター）、ヘルペ
スウイルス（好ましくは単純ヘルペスウイルスに基づくベクター）、およびパル
ボウイルス（好ましくは「欠損」もしくは非自律性パルボウイルスに基づくベク
ター、より好ましくはアデノ随伴ウイルスに基づくベクター、最も好ましくはＡ
ＡＶ−２に基づくベクター）を包含する。（例えば、Ａｌｉら、Ｇｅｎｅ Ｔｈ ｅｒａｐｙ １：３６７−８４（１９９４）；米国特許第４，７９７，３６８号
および同第５，１３９，９４１号明細書（それらの開示は引用により本明細書に
組み込まれる）を参照されたい。）アデノウイルスは、それらが広範な宿主範囲
を有し、休止期のまたはニューロンもしくは肝細胞のような末期的に分化した細
胞を感染させることができ、そして本質的に非腫瘍形成性のようであるという利
点を有する。アデノウイルスは、宿主ゲノム中に組込むようでない。それらは染
色体外に存在するため、挿入的突然変異誘発の危険は大きく低下される。アデノ
随伴ウイルスはアデノウイルスに基づくベクターと類似の利点を表す。しかしな
がら、ＡＡＶはヒト第１９染色体上に部位特異的組込みを表す。 を包含する。

【００９１】 ＫｏｚａｒｓｋｙとＷｉｌｓｏｎ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３（１
９９３））はアデノウイルスに基づく遺伝子治療の総説を提示する。Ｂｏｕｔら
（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４））はアカ
ゲザルの呼吸器上皮に遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクターの使用を
立証した。Ｈｅｒｍａｎら（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０：１
２３９−１２４９（１９９９））は、フェーズＩ臨床試験における、ヒト前立腺
への単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を含有する複製欠損アデノウイルスの
前立腺内注入、その後プロドラッグ、ガンシクロビルの静脈内投与を記述する。
遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１））；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ
ら（Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２））；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ
ら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３））；およ
びＴｈｏｍｐｓｏｎ（Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｓ．１１：１−８（１９９９））に見出
すことができる。

【００９２】 目的の遺伝子を移入するための特定のベクター系の選択は多様な因子に依存す
ることができる。１つの重要な因子は標的細胞集団の性質である。レトロウイル
スベクターは広く研究されておりかつ多数の遺伝子治療の応用で使用されている
が、これらのベクターは一般に非分裂細胞を感染させるのに適しない。加えて、
レトロウイルスは腫瘍形成性に対する潜在能力を有する。しかしながら、レンチ
ウイルスベクターの分野での最近の発展は、これらの制限のいくつかを回避する
ことができる。（Ｎａｌｄｉｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：２６３−７（１
９９６）を参照されたい。） 本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを用いる遺伝子治療は、その必要な
被験体（例えば患者もしくは哺乳動物）に、診断と同時にもしくはその直後に提
供される。当業者は、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するいず
れかの適する遺伝子治療ベクターを本発明に従って使用することができることを
認識するであろう。こうしたベクターを構築するための技術は既知である。（例
えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ ３９２ ２５−３０（１９９８）；Ｖ
ｅｒｍａ、Ｎａｔｕｒｅ ３８９ ２３９−４２（１９９８）を参照されたい）
。標的部位へのベクターの導入は既知技術を使用して達成することができる。

【００９３】 一態様において、ＡＮＧ−７核酸を発現ベクターに挿入する。ＡＮＧ−７核酸
は、Ａｎｇ−７ポリペプチド、フラグメント、変異体、誘導体もしくはキメラタ
ンパク質をコードする。とりわけ、こうした発現ベクター構築物は、ＡＮＧ−７
核酸（例えばｃＤＮＡもしくはコーディング領域の一部分）に操作可能に連結さ
れたプロモーターを典型的に含んで成り、該プロモーターは誘導可能もしくは構
成的、そして場合によっては組織特異的である。

【００９４】 別の態様において、内在性のＡＮＧ−７核酸が不完全である場合、該不完全な
配列は、外因性のＡＮＧ−７をコードする配列、およびゲノム中の所望の部位で
相同的組換えを促進する領域により隣接されるいずれかの他の所望の配列により
置き換えることができ、従って外因性のＡＮＧ−７核酸の染色体内発現を提供す
る。（例えば、ＫｏｌｌｅｒとＳｍｉｔｈｉｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；Ｚｉｊｌｓｔｒ
ａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９））；米国特許第５，
６３１，１５３号；同第５，６２７，０５９号；同第５，４８７，９９２号；お
よび同第５，４６４，７６４号明細書を参照されたい。）。

【００９５】 核酸は、受容体を特異的に発現する細胞型に標的を定めるのに使用することが
できる、受容体に媒介されるエンドサイトーシス（例えば、ＷｕとＷｕ、Ｊ．Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照されたい）
などにかけられるリガンドに連結して核酸を投与することにより、核に進入する
ことが既知であるペプチドに連結してもまた投与することができる。別の態様に
おいて、核酸−リガンド複合体を形成することができ、ここで、リガンドは、エ
ンドソームを崩壊させる融合原性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）のウイルスペプチドを
含んで成り、核酸がリソゾーム分解を回避することを可能にする。

【００９６】 なお別の態様において、核酸は、特定の受容体に標的を定めることにより、細
胞の特異的取込みおよび発現にインビボで標的を定めることができる（例えば、
国際特許公開第ＷＯ ９２／０６１８０号；同第ＷＯ ９２／２２６３５号；同
第ＷＯ ９２／２０３１６号；同第ＷＯ ９３／１４１８８号、および同第ＷＯ
９３／２０２２１号明細書を参照されたい）。あるいは、核酸を細胞内に導入
しそして相同的組換えにより発現のため宿主細胞ＤＮＡ内に組込むことができる
。（例えば、ＫｏｌｌｅｒとＳｍｉｔｈｉｅｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９９８）；Ｚｉｊｌｓｔｒａ
ら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）；米国特許第５，６３
１，１５３号；同第５，６２７，０５９号；同第５，４８７，９９２号；および
同第５，４６４７６４号明細書を参照されたい）。） 特定の一態様において、ＡＮＧ−７核酸を含有するウイルスベクターを使用す
る。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒら
、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７：５８１−５９９（１９９３）を参照された
い）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングお
よび宿主細胞ＤＮＡ中への組込みに必要でないレトロウイルス配列を欠失するよ
う改変されている。遺伝子治療で使用されるべきＡＮＧ−７核酸を、患者への該
遺伝子の送達を助長するベクター中にクローン化する。レトロウイルスベクター
についてのより多くの詳細は、Ｂｏｅｓｅｎら（Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２
９１−３０２（１９９４））に見出すことができ、これは、造血幹細胞を化学療
法に対しより抵抗性にするために、該幹細胞にｍｄｒｌ遺伝子を送達させるため
のレトロウイルスベクターの使用を記述する。

【００９７】 遺伝子治療への他のアプローチは、電気穿孔法、リポフェクション、リン酸カ
ルシウムに媒介されるトランスフェクションもしくはウイルス感染のような方法
により組織培養物中の細胞に遺伝子を移入することを必要とする。典型的には、
該方法は細胞への選択可能なマーカーの移入を包含する。その後、細胞を、移入
された遺伝子を取込みかつ発現している細胞を単離するための選択下におく。選
択された細胞をその後、患者に送達させる。

【００９８】 外来遺伝子の細胞中への導入のための多数の技術が当該技術分野で既知であり
（例えば、ＬｏｅｆｆｌｅｒとＢｅｈｒ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：
５９９−６１８（１９９３）；Ｃｏｈｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１
７：６１８−６４４（１９９３）；Ｃｌｉｎｅ、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２
９：６９−９２（１９８５）を参照されたい）、そして本発明により使用するこ
とができる。該技術は、典型的に、細胞への核酸の安定な移入を提供し、その結
果該核酸は該細胞により発現可能であり、また、その細胞の子孫により遺伝可能
かつ発現可能である。

【００９９】 生じる組換え細胞は、当該技術分野で既知の多様な方法により患者に送達する
ことができる。典型的には、細胞を皮下に注入する。あるいは、組換え皮膚細胞
を皮膚移植片として患者に適用することができる。組換え血液細胞（例えば、造
血幹細胞もしくは先祖細胞）は典型的に静脈内に投与する。使用に構想される細
胞の量は、所望の効果、患者の病状などに依存し、そして当業者により決定する
ことができる。

【０１００】 遺伝子治療の目的上核酸を導入することができる細胞は、いずれかの所望の利
用可能な細胞型を包含し、そして、限定されるものでないが、内皮細胞、前立腺
細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞、血液細胞（Ｔ
リンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球および
顆粒球のような）、多様な幹細胞もしくは先祖細胞（とりわけ、骨髄、臍帯血、
末梢血、胎児肝などから得られるもののような造血幹細胞もしくは先祖細胞）を
挙げることができる。遺伝子治療に使用される細胞は、一般に患者に対し自己で
あるが、しかし、患者との適合性について型分類することができる異種細胞を使
用することができる。

【０１０１】 Ａｎｇ−７ポリペプチド、またはそれらのフラグメント、変異体、誘導体もし
くは類似物の投与： 本発明は、有効量のＡｎｇ−７化合物の被験体への投与方法を提供する。例え
ば、好ましくない脈管形成は、有効量のＡｎｇ−７ポリペプチド、そのフラグメ
ント、変異体、誘導体もしくは類似物の投与により治療もしくは予防することが
できる。一態様において、こうしたポリペプチドは、増大された（正常もしくは
所望のに関して）脈管形成を伴う疾患もしくは臨床状態において治療的に（予防
的にを包含する）投与し、それにより脈管形成を阻害する。別の態様において、
こうしたポリペプチドは、脈管形成が疾患もしくは臨床状態の原因もしくは治療
に関連性のあることができる疾患もしくは臨床状態において、該疾患もしくは臨
床状態を阻害するために治療的に（予防的にを包含する）投与する。本発明の疾
患もしくは臨床状態は、限定されるものでないが、癌、創傷治癒、腫瘍形成、糖
尿病性網膜症、黄斑変性、心血管系疾患などを挙げることができる。

【０１０２】 典型的には、Ａｎｇ−７化合物は処方に先立ち実質的に精製する。被験体は、
限定されるものでないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどを挙げ
ることができる動物であることができ、そして典型的には哺乳動物、そして特定
の一態様においてはヒトである。別の特定の態様においては、非ヒト哺乳動物が
被験体である。Ａｎｇ−７化合物が核酸を含んで成る場合に使用することができ
る製剤および投与方法は上述され；付加的な適切な製剤および投与経路は下述さ
れるもののなかから選択することができる。

【０１０３】 例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル中の被包化、該化合物を発
現することが可能な組換え細胞、受容体に媒介されるエンドサイトーシス（例え
ば、ＷｕとＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９
８７）を参照されたい）、レトロウイルスもしくは他のベクターの一部としてＡ
ＮＧ−７核酸を含んで成る発現ベクターの構築などのような多様な送達系が既知
であり、かつ、Ａｎｇ−７化合物を投与するのに使用することができる。導入方
法は、限定されるものでないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、
硬膜外および経口の経路を挙げることができる。該化合物はいずれかの便宜的な
経路、例えば注入もしくはボーラス注入、上皮もしくは粘膜皮膚の内側を通る吸
収（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜）などにより投与することができ、ま
た、他の生物学的に活性の作用物質と一緒に投与することができる。投与は全身
性もしくは局所であることができる。

【０１０４】 特定の一態様において、Ａｎｇ−７化合物を治療の必要な領域に局所に投与す
ることが望ましいことができ；この投与は、例えば、そして制限としてでなく、
外科手術の間の局所注入、局所適用（例えば外科手術の後の創傷包帯とともに）
、注入により、カテーテルによって、坐剤によって、もしくは埋植物によって（
該埋植物は、多孔性、非多孔性、もしくはｓｉａｌａｓｔｉｃ膜のような膜を包
含するゼラチン性素材のものである）、または繊維により達成することができる
。一態様において、投与は、悪性腫瘍または腫瘍性もしくは前腫瘍性（ｐｒｅ−
ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）組織の部位（もしくは前の部位（ｆｏｒｍｅｒ ｓｉｔ
ｅ））での直接注入によることができる。

【０１０５】 別の態様において、Ａｎｇ−７化合物は小胞、とりわけリポソーム中で送達さ
せることができる（Ｌａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３
３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒ ａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ 、Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎとＦｉｄｌｅｒ（編）、リス（Ｌｉｓｓ）、
ニューヨーク中、ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓ
ｔｅｉｎ、上記、ｐｐ．３１７−３２７）；米国特許第６，０７７，６６３号お
よび同第６，０７１，５３３号明細書を参照されたい）。

【０１０６】 なお別の態様において、Ａｎｇ−７化合物は制御放出系中で送達させることが
できる。一態様においてはポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上記
；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２
０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９
８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８
９）を参照されたい）。別の態様においてはポリマー性素材を使用することがで
きる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒ ｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ 、ＬａｎｇｅｒとＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ プレス
（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、フロリダ州ボカラトン（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃ ｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ 、ＳｍｏｌｅｎとＢａｌｌ
（編）、ワイリー（Ｗｉｌｅｙ）、ニューヨーク（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒと
Ｐｅｐｐａｓ、Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃ ｈｅｍ． ２３：６１（１９８３）；Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９
０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２３：３５１（１９
８９）；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）
を参照されたい）。なお別の態様において、制御放出系は治療標的の近傍に置く
ことができ、従ってほんの少量の全身用量のみを必要とする（例えば、Ｇｏｏｄ
ｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅ ｄ Ｒｅｌｅａｓｅ 、上記、第２巻中、ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参
照されたい）。他の制御放出系は、例えばＬａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４
９：１５２７−１５３３（１９９０））による総説で論考される。

【０１０７】 本発明は、Ａｎｇ−７化合物を投与するための製薬学的組成物もまた提供する
。こうした組成物は、治療上有効な量のＡｎｇ−７化合物および製薬学的に許容
できる担体を含んで成る。「製薬学的に許容できる」という用語は、動物、およ
びより典型的にはヒトでの使用について連邦もしくは州政府の規制当局により承
認された、または米国薬局方もしくは他の一般に認識される薬局方に列挙された
を意味する。「担体」という用語は、それとともにＡｎｇ−７化合物が投与のた
め処方される希釈剤、補助物質、賦形剤、安定剤もしくはベヒクルを指す。

【０１０８】 製薬学的に許容できる担体は、例えば組成物を安定化する、または作用物質の
吸収を増大もしくは減少させるように作用する生理学的に許容できる化合物を含
有することができる。生理学的に許容できる化合物は、例えば、ブドウ糖、ショ
糖もしくはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオ
ンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質または他の安定剤もしく
は賦形剤を包含することができる。他の生理学的に許容できる化合物は、湿潤剤
、乳化剤、分散助剤もしくは保存剤（微生物の成長もしくは作用を予防するのに
とりわけ有用である）を包含する。担体は、水、およびラッカセイ油、ダイズ油
、鉱物油、ゴマ油のような石油、動物、植物もしくは合成起源のものを包含する
油などのような滅菌の液体をさらに包含する。水は、製薬学的組成物を静脈内に
投与する場合に典型的な担体である。生理的食塩水溶液ならびに水性ブドウ糖お
よびグリセロール溶液もまた、とりわけ注入可能な溶液の液体担体として使用す
ることができる。多様な保存剤が公知であり、かつ、例えばフェノールおよびア
スコルビン酸を包含する。適する製薬学的賦形剤は、デンプン、ブドウ糖、乳糖
、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナ
トリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂
乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを包含する。当
業者は、生理学的に許容できる化合物を包含する製薬学的に許容できる担体の選
択は例えば該ポリペプチドの投与経路および特定のポリペプチドの特定の物理化
学的特徴に依存することを知っているであろう。例えば、アルミニウムモノステ
アレートもしくはゼラチンのような生理学的に許容できる担体は、被験体に投与
された製薬学的組成物の吸収の速度を遅延させる遅延剤としてとりわけ有用であ
る。担体、安定剤もしくは補助物質のさらなる例は、Ｍａｒｔｉｎ、Ｒｅｍｉｎ ｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ． 、第１５版（マック パブリッシング カ
ンパニー（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ． Ｃｏ．）、イーストン、１９７５）（引用に
より本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。製薬学的組成物は、所望
の場合は、リポソーム、微小球体もしくは他のポリマーマトリックス中に組込む
こともまたできる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ 、第１巻（ＣＲＣ プレス（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）、フロリダ州ボカラ
トン、１９８４）（引用により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。例
えばリン脂質もしくは他の脂質より成るリポソームは、非毒性であり、生理学的
に許容でき、かつ、作成および投与することが比較的単純である代謝可能な担体
である。

【０１０９】 インビボで実施される場合に、本発明のベクターを含有する製薬学的組成物の
投与方法は、当該技術分野で公知であり、かつ、限定されるものでないが経口で
、腫瘍内に、静脈内に、筋肉内にもしくは腹腔内投与を挙げることができる。投
与は連続的にもしくは間歇的に達成することができ、そして例えば他の治療組成
物を用いる場合でそうであるように、治療されるべき被験体および病状とともに
変動することができる（Ｌａｎｄｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅ ｓ． １２：１０３−１１１（１９９２）；Ａｕｌｉｔｚｋｙら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃ ａｎｃｅｒ ２７：４６２−６７（１９９１）；Ｌａｎｔｚら、Ｃｙｔｏｋｉｎ ｅ ２：４０２−０６（１９９０）；Ｓｕｐｅｒｓａｘｏら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅ ｓ． ５：４７２−７６（１９８８）；Ｄｅｍｅｔｒｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃ ｏｌ． ７：１５４５−５３（１９８９）；およびＬｅＭａｉｓｔｒｅら、Ｌａｎ ｃｅｔ ３３７：１１２４−２５（１９９１）を参照されたい）。

【０１１０】 製薬学的組成物は、溶液、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持
続放出製剤などの形態をとることができる。組成物は、トリグリセリドのような
伝統的な結合剤および担体を含む坐剤として処方することができる。経口製剤は
、製薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、
サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準的担体
を包含することができる。

【０１１１】 製薬学的組成物は、患者への投与に適正な製剤を提供するように、適する量の
担体と一緒に、典型的には精製された形態の治療上有効な量のＡｎｇ−７化合物
を含有することができる。製剤は投与様式に適するべきである。

【０１１２】 一態様において、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合された製薬学的組成物
として、慣例の手順に従って処方する。典型的には、静脈内投与のための組成物
は滅菌の等張の水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤、
および注入の部位の疼痛を和らげるための局所麻酔薬もまた包含することができ
る。一般に、成分は別個に、もしくは単位投与剤形中に一緒に混合されてのいず
れかで供給する。（例えば、Ａｎｇ−７化合物の量を示すアンプルもしくはサシ
ェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）のような密封して封止された容器中の水分を含まない凍
結乾燥された粉末もしくは水を含まない濃縮物として。）組成物を注入（ｉｎｆ
ｕｓｉｏｎ）により投与するべきである場合、それは滅菌の製薬学的等級の水も
しくは生理的食塩水を含有する注入瓶を用いて分注することができる。組成物を
注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）により投与する場合は、成分を投与前に混合するこ
とができるように、滅菌の注射用蒸留水もしくは生理的食塩水のアンプルを提供
することができる。

【０１１３】 Ａｎｇ−７化合物は中性もしくは塩の形態として処方することができる。製薬
学的に許容できる塩は、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸など由来のもの
のような遊離アミノ基で形成されるもの、および水酸化ナトリウム、カリウム、
アンモニウム、カルシウム、鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−
エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど由来のもののような遊離
カルボキシル基で形成されるものを包含する。

【０１１４】 脈管形成の調節により示されるような特定の障害もしくは病状の治療で有効で
あることができるＡｎｇ−７化合物の量は、該障害もしくは病状の性質に依存す
ることができ、そして標準的臨床技術により決定することができる。加えて、至
適の投薬量範囲を同定するのを助けるのに、インビトロアッセイを場合によって
は使用することができる。製剤中で使用されるべきＡｎｇ−７化合物の正確な用
量は、投与経路および疾患もしくは障害の重症度にもまた依存することができ、
そして実務医の判断および各患者の情況に従って決定すべきである。静脈内投与
に適する投薬量範囲は、一般に体重１キログラムあたり約２０〜５００マイクロ
グラムの活性のＡｎｇ−７化合物である。鼻内投与に適する投薬量範囲は、一般
に約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重ないし１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効用量は、イン
ビトロもしくは動物モデル試験系から生じられる用量応答曲線から外挿すること
ができる。坐剤は、一般に０．５％ないし１０重量％の範囲の有効成分を含有し
；経口製剤は典型的に１０％ないし９５％の有効成分を含有する。

【０１１５】 本発明は、本発明の製薬学的組成物の成分の１種もしくはそれ以上で充填され
た１個もしくはそれ以上の容器を含んで成る製薬学的パックもしくはキットもま
た提供する。場合によっては、製薬学的もしくは生物学的製品の製造、使用もし
くは販売を規制する政府機関により規定された形態の通知が、こうした容器（１
個もしくは複数）に伴うことができ、この通知はヒト投与のための製造、使用も
しくは販売の当局による承認を反映する。 脈管形成に関係した疾患の治療 別の態様において、Ａｎｇ−７ポリペプチド、またはそれらのフラグメント、
変異体、誘導体もしくは類似物、あるいはこうしたポリペプチドをコードするＡ
ＮＧ−７核酸のようなＡｎｇ−７化合物は、脈管形成に関係することができる疾
患もしくは臨床状態を治療するのに使用することができる。いずれかの特定の理
論により拘束されることを意図しないが、多くの疾患の開始および／もしくは進
行は脈管形成に依存すると考えられている。例えば、腫瘍形成は脈管形成に緊密
に関連する。こうした腫瘍は、横紋筋肉腫、網膜芽腫、ユーイング肉腫、神経芽
腫および骨肉腫のような充実性腫瘍、ならびに聴神経腫、神経線維腫、トラコー
マおよび化膿性肉芽腫のような良性腫瘍を包含する。従って、腫瘍の形成もしく
は進行は、脈管形成を阻害することにより治療することができ；Ａｎｇ−７ポリ
ペプチド、フラグメント、変異体、誘導体および類似物、もしくはＡＮＧ−７核
酸を腫瘍に投与することは、さらなる腫瘍の成長および／もしくは進行を阻害す
ることができる。同様に、組換えＡｎｇ−７ポリペプチド、フラグメントもしく
は変異体を発現する細胞を使用することができる。あるいは、減少された脈管形
成は心血管系疾患に関連する。従って、脈管形成を増大させるＡｎｇ−７化合物
を使用して脈管形成を治療することができる。上述された方法論のいずれかを、
こうした脈管形成に関係した疾患の治療に適用することができる。

【０１１６】 好ましくない脈管形成を伴う他の疾患もしくは臨床状態もまた類似の様式で治
療することができる。こうした他の疾患もしくは病状は、限定されるものでない
が、眼の新生血管疾患、老人性黄斑変性、糖尿病性網膜症、角膜移植片拒絶、血
管新生性の緑内障および水晶体後線維増殖、流行性角結膜炎、ビタミンＡ欠乏症
、コンタクトレンズ過剰装着、アトピー性角膜炎、上縁結膜炎、翼状片、乾性角
結膜炎、シェーグレン症候群、酒さ性ざ瘡、ｐｈｙｌｅｃｔｅｎｕｌｏｓｉｓ、
梅毒、ミコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）感染症、脂質変性、化学物
質火傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅ ｘ ）感染症、帯状疱疹ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｚｏｓｔｅｒ）感染症、原生動
物感染症、カポジ肉腫、モーレン潰瘍、テリエン辺縁変性、辺縁角質溶解、慢性
関節リウマチ、全身性狼瘡、多発性関節炎、ヴェーゲナーサルコイドーシス、強
膜炎、スティーヴェンズ−ジョンソン病、ｐｅｒｉｐｈｉｇｏｉｄ放射状角膜切
開、角膜ｇｒａｐｈ拒絶、鎌状赤血球貧血、サルコイドーシス、梅毒、弾力線維
性偽黄色腫、ページェット病、静脈閉塞、動脈閉塞、頸動脈閉塞性疾患、慢性ブ
ドウ膜炎／硝子体炎、ライム病、全身性エリテマトーデス、未熟性網膜症、イー
ルズ病、ベーチェット病、網膜炎もしくは脈絡膜炎を引き起こす感染症、推定眼
ヒストプラスマ症、ベスト病、近視、眼の痘痕（ｐｉｔ）、シュタルガルト病、
扁平部炎、慢性網膜剥離、過粘稠度症候群、トキソプラスマ症、外傷ならびにレ
ーザー後合併症を挙げることができる。他の疾患は、皮膚潮紅、線維血管もしく
は線維組織の異常増殖、慢性関節リウマチ、変形性関節症、潰瘍性大腸炎、クロ
ーン病、バルトネラ症、アテローム硬化症、血管腫、オースラー−ウェーバー−
ランデュ病、遺伝性出血性毛細管拡張症および白血病に関連するものを包含する
。 ＡＮＧ−７発現のアンチセンス調節： 特定の一態様において、Ａｎｇ−７の機能はＡＮＧ−７アンチセンス核酸の使
用により阻害される。本発明は、Ａｎｇ−７ポリペプチドの機能を阻害するため
の、Ａｎｇ−７ポリペプチドまたはそのフラグメントもしくは変異体をコードす
る遺伝子もしくはｃＤＮＡにアンチセンスである最低６ヌクレオチドの核酸の投
与を提供する。本明細書で使用されるところのＡＮＧ−７「アンチセンス」核酸
は、なんらかの配列の相補性のゆえにＡＮＧ−７ ＲＮＡ（典型的にはｍＲＮＡ
）の一部分にハイブリダイズする核酸を指す。アンチセンス核酸は、ＡＮＧ−７
ｍＲＮＡのコーディングおよび／もしくは非コーディング領域に相補的である
ことができる。しかしながら、絶対的な相補性（典型的だが）は必要とされない
。本明細書で言及されるところの「ＲＮＡの最低一部分に相補的な」配列は、Ｒ
ＮＡとハイブリダイズして安定な二重鎖を形成することが可能であるのに十分な
相補性を有する配列を意味する。二本鎖ＡＮＧ−７アンチセンス核酸の場合には
、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験することができるか、もしくは三重鎖形成をアッ
セイすることができる。ハイブリダイズする能力は相補性の程度およびアンチセ
ンス核酸の長さの双方に依存することができる。一般に、ハイブリダイズする核
酸が長くなるほど、それが含有しかつ安定な二重鎖（もしくは場合により三重鎖
）をなお形成することができる塩基の不適正が多くなる。当業者は、ハイブリダ
イズされた複合体の融点を決定する標準的手順の使用により不適正の耐えられる
程度を確かめることができる。

【０１１７】 こうしたアンチセンス核酸は、Ａｎｇ−７の機能を阻害する作用物質としての
有用性を有し、また、上述されたとおり、疾患もしくは臨床状態の治療もしくは
予防で使用することができる。本発明のアンチセンス核酸は、二本鎖もしくは一
本鎖のＲＮＡもしくはＤＮＡであるオリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体で
あることができ、これらは細胞に直接投与することができるか、もしくは外因性
の導入された核酸配列の転写により細胞内で産生させることができる。

【０１１８】 特定の一態様において、本発明により提供されるＡＮＧ−７アンチセンス核酸
は脈管形成を予防するのに使用することができる。本発明は、上述されたような
製薬学的に許容できる担体中に有効量の本発明のＡＮＧ−７アンチセンス核酸を
含んで成る製薬学的組成物をさらに提供する。別の態様において、本発明は、本
発明のＡＮＧ−７アンチセンス核酸を含んで成る有効量の組成物を細胞に提供す
ることを含んで成る真核生物細胞中でのＡＮＧ−７核酸配列の発現の阻害方法に
向けられる。ＡＮＧ−７アンチセンス核酸およびそれらの用途を詳細に下述する
。

【０１１９】 ＡＮＧ−７アンチセンス核酸は最低６ヌクレオチドのものであり、そして典型
的にはオリゴヌクレオチド（６から約５０ヌクレオチドもしくはそれ以上までの
範囲にわたる）である。特定の局面において、該オリゴヌクレオチドは最低１０
ヌクレオチド、最低１５ヌクレオチド、最低１００ヌクレオチドであるか、もし
くは最低２００ヌクレオチドであることができる。オリゴヌクレオチドはＤＮＡ
もしくはＲＮＡまたはキメラ混合物、あるいはそれらの誘導体であることができ
、かつ、一本鎖もしくは二本鎖であることができる。誘導体は、下述されるとお
り、塩基部分、糖部分もしくはリン酸バックボーンで改変することができる。誘
導体は、ペプチドのような他の付属基、または、細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇ
ｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：６５５３−５
６（１９８９）；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ８４：６４８−５２（１９８７）；国際特許公開第ＷＯ ８８／０９
８１０号明細書を参照されたい）もしくは血液脳関門（例えば、国際特許公開第
ＷＯ ８９／１０１３４号明細書を参照されたい）を横切る輸送を助長する作用
物質、ハイブリダイゼーションに誘発される切断剤（例えばＫｒｏｌら、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：９５８−７６（１９８８）を参照されたい）、また
は挿入剤（例えばＺｏｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−４９（１９８８
）を参照されたい）を包含することができる。

【０１２０】 本発明の一態様において、ＡＮＧ−７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典
型的には一本鎖ＤＮＡとして提供される。該オリゴヌクレオチドは、当該技術分
野で公知の置換基を用いて、その構造のいずれの位置でも改変することができる
。ＡＮＧ−７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば５−フルオロウラシル
、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサン
チン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル
）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カル
ボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシル
ケオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１
−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチ
ルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−
メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル
−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシ
メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテ
ニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、プソイドウラシル、ケオシン
、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−
チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル
、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３
−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、２，６−ジアミノプリ
ンなどのような最低１個の改変された塩基部分を含むことができる。別の態様に
おいて、オリゴヌクレオチドは、例えばアラビノース、２−フルオロアラビノー
ス、キシルロースおよびヘキソースのような最低１個の改変された糖部分を含ん
で成る。

【０１２１】 なお別の態様において、該オリゴヌクレオチドは、例えばホスホロチオエート
、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホ
スホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステルおよび
ホルムアセタールもしくはそれらの類似物のような最低１個の改変されたリン酸
バックボーンを含んで成る。

【０１２２】 なお別の態様において、該オリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオ
チドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡと特異的な二本
鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通常のβ−単位に反して、鎖が相互に平行
に走る（Ｇａｕｔｉｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：６６２５−
４１（１９８７）を参照されたい）。オリゴヌクレオチドは、別の分子（例えば
、ペプチド、ハイブリダイゼーションに誘発される架橋剤、輸送剤、ハイブリダ
イゼーションに誘発される切断剤など）に結合することができる。

【０１２３】 本発明のオリゴヌクレオチドは当該技術分野で既知の標準的方法により（例え
ば、商業的に入手可能な自動化ＤＮＡ合成機の使用により）合成することができ
る。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、Ｓｔｅｉｎら（Ｎｕ ｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：３２０９（１９８８）を参照されたい）の方
法により合成することができ、また、メチホスホネートオリゴヌクレオチドは、
制御された細孔のガラスポリマー支持体の使用により製造することができる（Ｓ
ａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：７４４８
−５１（１９８８）を参照されたい）などである。

【０１２４】 特定の一態様において、ＡＮＧ−７アンチセンスオリゴヌクレオチドは、触媒
的ＲＮＡもしくはリボザイムを含んで成る（例えば、国際特許公開第ＷＯ ９０
／１１３６４号明細書；Ｓａｒｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１２２２−
２５（１９９０）を参照されたい）。別の態様において、オリゴヌクレオチドは
、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド（例えば、Ｉｎｏｕｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：６１３１−４８（１９８７）を参照されたい）、もしく
はキメラのＲＮＡ−ＤＮＡ類似物（例えば、Ｉｎｏｕｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ． ２１５：３２７−３０（１９８７）を参照されたい）である。

【０１２５】 代替の一態様において、本発明のＡＮＧ−７アンチセンス核酸は、外因性の配
列からの転写により細胞内で産生される。例えば、それが細胞により取り込まれ
るようなベクターをインビボで導入することができ、その細胞内でベクターもし
くはその一部分が転写されて本発明のアンチセンス核酸（ＲＮＡ）を産生する。
該ベクターはＡＮＧ−７アンチセンス核酸もしくはその一部分をコードする配列
を含有することができる。細胞の内側にあれば、それが転写されて所望のアンチ
センスＲＮＡを産生することができる限り、ベクターはエピソームに留まること
ができるか、もしくは染色体に組込まれたようになることができる。こうしたベ
クターは、当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術の方法により構築すること
ができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、もしくは当該技術分野で既知の
他者であることができ、かつ、哺乳動物細胞中での複製および発現に使用するこ
とができる。ＡＮＧ−７アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、哺乳動
物、典型的にはヒトの細胞中で作用するように、当該技術分野で既知のいずれか
のプロモーターにより制御することができる。該プロモーターは誘導可能もしく
は構成的であることができる。誘導可能なプロモーターは、限定されるものでな
いがＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａ ｔｕｒｅ ２９０：３０４−１０（１９８１）を参照されたい）、ラウス肉腫ウ
イルスの３’ＬＴＲ中に含有されるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌ ｌ ２２：７８７−９７（１９８０）を参照されたい）、ヘルペスチミジンキナ
ーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１４４１−４５（１９８１）を参照されたい）、メタロチオネイ
ン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２
（１９８２）を参照されたい）などを挙げることができる。 動物モデル： 本発明は動物モデルもまた提供する。一態様において、脈管形成を伴う疾患お
よび障害の動物モデルが提供される。こうした動物は、その染色体中のＡＮＧ−
７遺伝子と（典型的には、抗生物質耐性遺伝子のような異種配列の挿入により）
生物学的に不活性にされている外因性のＡＮＧ−７遺伝子との間の相同的組換え
を促進することにより、まず、生じさせることができる。例えば、相同的組換え
は、胚由来幹（ＥＳ）細胞を、相同的組換えが起こるような挿入で不活性にされ
たＡＮＧ−７遺伝子を含有するベクターで形質転換すること、次いでＥＳ細胞を
胚盤胞に注入すること、および里親の母親に胚盤胞を埋植すること、次いでＡＮ
Ｇ−７遺伝子が不活性化されているキメラ動物（「ノックアウト動物」）の誕生
により実施する（例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８
８−１２９２（１９８９）；米国特許第５，６３１，１５３号；同第５，６２７
，０５９号；同第５，４８７，９９２号；および同第５，４６４７６４号明細書
を参照されたい）。キメラ動物を繁殖させて付加的ノックアウト動物を生じさせ
ることができる。こうした動物はマウス、ハムスター、ヒツジ、ブタ、畜牛など
であることができ、そして典型的には非ヒト哺乳動物である。特定の一態様にお
いてはノックアウトマウスが生じられる。ノックアウト動物は、脈管形成亢進状
態に関連する疾患もしくは障害を発症するもしくはそれらを発症する素因を作ら
れていることが期待され、そして、脈管形成を減少させかつ従ってこうした疾患
および障害を治療もしくは予防する能力について分子をスクリーニングもしくは
試験するのに有用であることができる。

【０１２６】 別の態様において、ＡＮＧ−７遺伝子を組込んでおりかつ過剰発現するトラン
スジェニック動物は、脈管形成低下を伴う疾患および障害の動物モデルとしての
使用を有する。トランスジェニック動物は、脈管形成低下状態を発症するもしく
はそれに対する素因を作られていることが期待されるか、または腫瘍形成のよう
な脈管形成を必要とする疾患に対する増大された抵抗性を表す。従って、これら
の動物はこうした疾患および障害、またはこうした疾患および障害に対する抵抗
性の動物モデルとしての使用を有することができる。 実施例 以下の実施例は具体的に説明するために（しかし特許請求される発明を制限す
るためでなく）提供される。

【０１２７】 実施例１： アンジオポエチンリガンドファミリーのメンバーを同定するために、国立バイ
オテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）からの発現さ
れる配列標識（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇ）（ＥＳＴ）デ
ータベースを使用して、ＢＬＡＳＴ検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９−４０２（１９９７））を実施した。Ａ
ｎｇ−１のアミノ酸配列をプローブとして使用した。この検索はヒトＥＳＴ（受
託番号ＡＡ７７３２３４）を同定した。このＥＳＴの対応するアミノ酸配列は、
Ａｎｇ−１に対し、＋２の読み枠中で有意の配列の同一性を示した。確率（Ｐ）
値は４．４×１０^-28であり、これは同定されたＥＳＴがアンジオポエチンのフ
ァミリーに属するタンパク質のフラグメントをコードすることを強く示す。該Ｅ
ＳＴがアンジオポエチンタンパク質（「Ａｎｇ−７」と呼称された）のフラグメ
ントをコードするというさらなる証拠が、ＥＳＴ（ＡＡ７７３２３４）の推定さ
れるアミノ酸配列を使用してスイスプロット（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ）データベー
スのＢＬＡＳＴ検索を実施した場合に得られた。Ａｎｇ−７の部分的アミノ酸配
列とのＡｎｇ−１およびＡｎｇ−２の整列について得られたＰ値はそれぞれ３．
２×１０^-32および２．６×１０^-34であった。

【０１２８】 ＥＳＴデータベースのさらなる検索は別のＥＳＴ（受託番号ＡＡ２５５５９０
）を同定し、これもまたＡＮＧ−７ ｃＤＮＡの一部分をコードした。ＤＮＡ配
列分析は、ＥＳＴ ＡＡ２５５５９０のヌクレオチド配列がＥＳＴ ＡＡ７７３
２３４の配列の一部分に重なり合うことを示した。ＥＳＴ ＡＡ７７３２３４は
容易に入手可能でなかったため、ＥＳＴ ＡＡ２５５５９０核酸をその後の実験
でプローブとして使用した。

【０１２９】 実施例２： Ａｎｇ−７をコードする完全長のｃＤＮＡクローンを得るために、ＥＳＴ Ａ
Ａ２５５５９０を使用してヒトｃＤＮＡライブラリーをプロービングした。簡潔
には、ＥＳＴ ＡＡ２５５５９０は、ベクターｐＴ７Ｔ３Ｄ−Ｐａｃ（ファルマ
シア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャージー州ピーパック）中、Ｎｏｔ Ｉ
とＥｃｏ ＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の間に配置される。該プラスミドを
制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩで直鎖状にした。製造元の説明書に従い、
ストリップ（Ｓｔｒｉｐ）−ＥＺ Ｔ３キット（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、
テキサス州オースティン）を使用して、アンチセンスの［³²Ｐ］で放射活性に標
識されたＲＮＡプローブを生成させた。ヒト普遍的ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕ
ｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ）（ＨＵＣＬ）一次膜
（ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）、米国カリフォルニア州ラホヤ）を放射活性に標識されたＲＮＡプローブと
ハイブリダイズさせることにより、ＨＵＣＬをスクリーニングした。ハイブリダ
イゼーションおよび洗浄は製造元により推奨されるとおり実施した。（ストリッ
プ（Ｓｔｒｉｐ）−ＥＺキット手引書を参照されたい）。洗浄後、膜をリン画像
形成装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）スクリーンに曝露し、フジ（Ｆｕｊ
ｉ）Ｂａｓ−１５００スキャナーで走査し、そして放射活性シグナルの強度をＴ
ＩＮＡ ２．０ソフトウェア（レイテスト（Ｒａｙｔｅｓｔ）、独国・シュトラ
ウベンハルト）を用いて評価した。ハイブリダイゼーションの特徴の分析は位置
Ｌ０４に１個のシグナルを示した。対応する二次アレイ膜を同一条件下でハイブ
リダイズさせた。１個のハイブリダイゼーションシグナルが二次アレイ膜状の位
置Ｇ１９に検出された。独特のクローンＬ０４Ｇ１９を供給元から得た。Ｌ０４
Ｇ１９クローンの分析は、それが約２．２キロ塩基（「ｋｂ」）の１個の挿入物
を含有したことを示した。ＤＮＡ配列分析は、このｃＤＮＡクローンがＡＮＧ−
７ ｃＤＮＡの完全長のコーディング配列を含有したことを確認した。

【０１３０】 実施例３： Ｌ０４Ｇ１９ ｃＤＮＡのＤＮＡ配列分析は、該ｃＤＮＡが２，１７３塩基対
（「ｂｐ」）長（短いポリＡ尾を包含する）であることを示した。ＡＮＧ−７
ｃＤＮＡ配列を図１（配列番号１）に示す。該ｃＤＮＡは１，４３２ｂｐの１個
の読取り枠を有する。該読取り枠は４９３アミノ酸残基の１個のポリペプチドを
コードする（配列番号２；図２）。ヒトアンジオポエチン−１（配列番号３）、
ヒトアンジオポエチン−２（配列番号４）、ヒトアンジオポエチン−３（配列番
号５）およびヒトアンジオポエチン−４（配列番号６）の配列とのＡｎｇ−７の
アミノ酸配列の類似性の整列を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ソフトウェアパッ
ケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ、ウィスコンシン州マディソン）中のＭＥＧＡＬＩＧＮ
（商標）エキスパート配列分析ソフトウェアを使用して実施した。図３を参照す
れば、Ａｎｇ−７ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端部分は、他のアンジオポエ
チン中でもまた見出される特徴的なコイルドコイルおよびフィブリノーゲン様ド
メインを含有する。Ａｎｇ−７ポリペプチドとＡｎｇ−１および−２ポリペプチ
ドとの間の全体的類似性指標は、それぞれ２３．９％および２３．５％である。
重要なことには、既知のアンジオポエチンの間で保存されているアミノ酸残基の
大部分がＡｎｇ−７中にもまた存在する（図３を参照されたい）。このアミノ酸
配列の保存は、Ｌ０４Ｇ１９ ｃＤＮＡクローンがアンジオポエチンファミリー
の１メンバーをコードすることを確認する。

【０１３１】 実施例４： ＡＮＧ−７遺伝子の組織発現の特徴を検査した。簡潔には、ＥＳＴ ＡＡ２５
５５９０をコードするプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで直鎖状
にした。製造元の説明書に従い、ストリップ（Ｓｔｒｉｐ）−ＥＺ Ｔ３キット
（アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）、米国テキサス州オースティン）を使用して、ア
ンチセンスの［³²Ｐ］で放射活性に標識されたＲＮＡプローブを生成させた。ヒ
ト多組織発現アレイ（クロンテック ラボラトリーズ インク（Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、米国カリフォルニア州パロアルト
）を、放射活性に標識されたＲＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ハイブリ
ダイゼーションおよび洗浄はストリップ（Ｓｔｒｉｐ）−ＥＺキット手引書で推
奨されるとおり実施した。洗浄後、膜をリン画像形成装置スクリーンに曝露し、
フジ（Ｆｕｊｉ）Ｂａｓ−１５００スキャナーで走査し、そして放射活性シグナ
ルの強度をＴＩＮＡ ２．０ソフトウェア（レイテスト（Ｒａｙｔｅｓｔ）、独
国・シュトラウベンハルト）を用いて評価した。生じるヒストグラムを図４に提
示し、そして、ＡＮＧ−７ ＲＮＡが心組織（左および右心房、左および右心室
）、子宮、乳腺および脳梁組織中で強く発現されることを立証する。大いに血管
化されるこれらの組織中でのＡＮＧ−７ ＲＮＡの発現は、Ａｎｇ−７ポリペプ
チドがＡｎｇ−１および−２ポリペプチドと同様に脈管形成である役割を担って
いる可能性があることを示す。

【０１３２】 実施例５： ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡがＡｎｇ−７ポリペプチドに翻訳されるかどうかを試験
するため、および、Ａｎｇ−７ポリペプチドの分子量を決定するため、ＡＮＧ−
７ ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）により増幅した。ＰＣＲ増
幅のためには、ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡの５‘端に相補的である５’プライマー（
５’ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＴＧＴＧＣＧＴ３’（配列番
号７））を、ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡの３‘端に相補的である３’プライマー（５
’ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＧＴＴＣＧＧ３’（配列番
号８））とともに使用した。翻訳の効率を増大させるために、コザック翻訳開始
コンセンサス配列もまた５’プライマー中に包含した。ＰＣＲフラグメントのそ
の後のクローニングを助長するために、制限酵素Ｅｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩの制限認識配列をそれぞれ５’および３’プライマーに導入した。増幅さ
れたｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−
）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、オランダ・グロニンゲン）
のＥｃｏ ＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ制限部位にクローン化して、ｐｃＤＮＡ
３．１／ａｎｇ７／ｍｙｃｈｉｓを創製した。

【０１３３】 ＡＮＧ−７ ＲＮＡ転写物を、製造元の説明書に従って、ｐｃＤＮＡ３．１／
ａｎｇ７／ｍｙｃｈｉｓのＴ７プロモーターから合成した。インビトロ翻訳は、
製造元の説明書（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国ウィスコンシン州マディソ
ン）に従ってウサギ網状赤血球ライセートを使用して実施した。インビトロ翻訳
により産生された生じるタンパク質を、［³⁵Ｓ］メチオニンを使用して標識した
。標識されたタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−１２％ポリアクリルアミ
ドゲルでの電気泳動により分離し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化
した。図５はこの実験の結果を描く。とりわけ、レーン１：以下のタンパク質、
すなわち卵アルブミン（４６ｋＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０ｋＤ
ａ）、トリプシンインヒビター（２１．５ｋＤａ）、リゾチーム（１４．３ｋＤ
ａ）、およびアプロチニン（６．５ｋＤａ）を包含するレインボウ（Ｒａｉｎｂ
ｏｗ）［¹⁴Ｃ］メチル化タンパク質分子量マーカー（アマーシャム（Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ）、英国バッキンガム州リトルシャルフォント）。レーン２は、哺乳動物
発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）（インヴィトロジェン（
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、オランダ・グロニンゲン）のＴ７プロモーターを使用
するＡＮＧ−７ ＲＮＡのインビトロ翻訳産物を含有した。レーン３は、哺乳動
物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）のＳＰ６プロモーター
を使用するインビトロ翻訳産物（陰性対照）を含有した。レーン４は、インビト
ロ翻訳系（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国・マディソン）からの陽性対照を
含有した。

【０１３４】 約６０キロダルトンの１個の主バンドが検出された。該主バンドの観察された
分子量は、組換えＡｎｇ−７ポリペプチドの計算された分子量（約５７．１ｋＤ
ａ）よりわずかにより大きかった。この差異は、Ａｎｇ−７ポリペプチド中のい
くつかの潜在的グリコシル化部位のグリコシル化により説明することができる。

【０１３５】 実施例６： ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡを真核生物細胞中でインビボで組換え的に発現させるこ
とができるかどうかを決定するために、ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡを３種の真核生物
発現ベクター中にクローン化し、そしてその後組織培養細胞にトランスフェクシ
ョンした。

【０１３６】 ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡは、上述されたような発現ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１
／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタ
ログ番号Ｖ８５５２０）にクローン化した。ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡはｐＩＲＥＳ
（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カタログ番号６０６０−１）およびｐＺ
ｅｏ（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カタログ番号Ｖ８５０−
０１））にもまたクローン化した。検出および精製を助長するために、ポリヒス
チジン標識（ｔａｇ）を各発現ユニットのＣ末端コーディング領域中に包含した
。

【０１３７】 発現構築物を、ＤＯＳＰＥＲリポソームトランスフェクション試薬（ベーリン
ガー マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、カタログ番号
１７８１９９５）を使用してチャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞に
トランスフェクションした。簡潔には、０．５×１０⁶個のＣＨＯ細胞を基礎培
地（ＤＭＥＭ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ、カタログ番号４１９６５−０３
９）；２ｍＭ Ｌ−グルタミン（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ、カタログ番号
２５０３０−０２４）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１５００ＩＵ／ｍｌ
）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ、カタログ番号１５１４０−１１４）、およ
び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号Ｆ２４４
２））中で６穴プレートの各ウェルに植え付けた。３７℃で一夜インキュベーシ
ョンの後に培地を廃棄し、そして５００μｌの基礎培地（ＦＢＳを含まない）を
５μｇのＤＮＡと混合し、かつ、２５μｌのＤＯＳＰＥＲを各ウェルに添加した
。プレートを室温で１５分インキュベートし、そしてその後追加の５２０μｌ／
ウェルの基礎培地（ＦＢＳを含まない）を添加した。細胞を３７℃で追加の３時
間インキュベートした。インキュベーション後に追加の３ｍｌ／ウェルの基礎培
地を添加した。翌日、培地を廃棄し、そして３ｍｌ／ウェルの新鮮基礎培地を添
加した。細胞を追加の２日間インキュベートし、収穫し、そしてその後、テトラ
（Ｔｅｔｒａ）−Ｈｉｓ抗体（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ番号３４６
７０）を使用するウェスタンブロットで、Ａｎｇ−７ポリペプチドの細胞質発現
を分析した。ウェスタンブロットは製造元の説明書に従って実施し、そして３レ
ーンを含有した。レーン１はタンパク質分子量マーカーを含有し；レーン２はＣ
ＨＯ細胞からの培地（陰性対照）を含有し；そして、レーン３はＡｎｇ−７ポリ
ペプチドを発現する一過性にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞を含有した
。ウェスタンブロット分析を図６に示し、ここでＡｎｇ−７ポリペプチドのバン
ドを矢印により印を付ける。約５７ｋＤａの１個のバンドがＡＮＧ−７ ｃＤＮ
ＡでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞中で観察されたが、しかしベクター
単独でトランスフェクションされた細胞中でされなかった。（レーン２および３
を比較されたい。）従って、ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡは哺乳動物細胞中で一過性に
発現され、そして期待された分子量のポリペプチドを産生した。

【０１３８】 実施例７： 組換えＡｎｇ−７ポリペプチドを安定に発現する細胞クローンを生成させるた
めに、ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡクローンをヒト系統にトランスフェクションし、そ
してその後安定なトランスフェクション体を選択した。簡潔には、ヒト胚腎細胞
系ＨＥＫ２９３を、サイトメガロウイルスプロモーターの制御下で、ＡＮＧ−７
ｃＤＮＡを含有する発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ａｎｇ７／ｍｙｃｈｉｓ
もしくはｐＩＲＥＳでトランスフェクションした。トランスフェクションは実施
例６に上述されたとおり実施した。トランスフェクション後に、細胞を９６穴プ
レートに植え付け、そして選択培地（０．７５ｍｇ／ｍｌジェネチシン（ギブコ
（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ、カタログ番号１０１３１−０２７）を含む基礎培地）
中で培養した。

【０１３９】 Ａｎｇ−７の組換え発現は、テトラ（Ｔｅｔｒａ）−Ｈｉｓ抗体（キアゲン（
Ｑｉａｇｅｎ）、カタログ番号３４６７０）およびＦＩＴＣ標識二次抗体（ヤギ
抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合物（ディアノヴァ（Ｄｉａｎｏｖａ）、カタログ
番号１１５−０９５−０６２））を使用するラブ−テック（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）チ
ャンバースライド（ナルゲン ヌンク（Ｎａｌｇｅｎｅ Ｎｕｎｃ）、カタログ
番号１５４５３４）上での免疫蛍光染色により検出した。ラブ−テック（Ｌａｂ
−Ｔｅｋ）スライドのウェルあたり約４×１０⁴個の細胞を植え付け、そしてＣ
Ｏ₂インキュベーター中で一夜インキュベートした。培地を廃棄し、そして細胞
をＰＢＳ（カルシウム／マグネシウム／重炭酸ナトリウムを含まないＰＢＳ ダ
ルベッコ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ、カタログ番号１４１９０−０９４）
）で一度洗浄した。その後、２００μｌ／ウェルの氷冷メタノールの添加および
−２０℃で１０分間のインキュベーションにより、細胞を固定した。固定の後、
３％ＢＳＡを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−ＢＳＡ）で細胞を２回洗浄し、そしてそ
の後ＰＢＳ−ＢＳＡにより３７℃で３０分間ブロッキングした。ブロッキング後
に、ＰＢＳ−ＢＳＡ中テトラ（Ｔｅｔｒａ）−Ｈｉｓ抗体の５０倍希釈物１００
μ／ウェルを添加した。スライドを３７℃で２時間インキュベートした。一次抗
体とのインキュベーション後に、細胞をＰＢＳで１０回洗浄し、そしてその後、
二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ複合物）の１００倍希釈物１００μｌ
／ウェルを添加した。スライドを３７℃で１時間インキュベートした。スライド
をＰＢＳで１０回洗浄し、ウェルの分離グリッドを除去し、そしてその後スライ
ドを抗退色固定媒体ＲＯＴＩ（商標）ヒストキット（Ｈｉｓｔｏｋｉｔ）（カー
ル ロス（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）、カタログ番号６６３８．１）およびカバーガ
ラスで覆った。固定媒体の硬化（通常一夜）の後、スライドを蛍光顕微鏡で観察
した。陽性クローンを２４穴プレートに拡張し、そして、実施例６で上述された
ようなウェスタンブロット上で細胞ライセートを分析することにより、組換えタ
ンパク質の発現レベルを比較した。ウェスタンブロット分析を図７に描く。ウェ
スタンブロットのレーン１はタンパク質分子量マーカーを含有し；レーン２はＨ
ＥＫ２９３細胞からの培地（陰性対照）を含有し；およびレーン３はＡｎｇ−７
ポリペプチドを発現する安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞を
含有した。陽性クローンを、下述されるようなさらなる分析に選択した。

【０１４０】 Ａｎｇ−７ポリペプチドはそのＮ末端に分泌シグナルを有し、これはそれが分
泌性タンパク質であることを示唆する。組換え的に発現されるＡｎｇ−７ポリペ
プチドが細胞により分泌されるかどうかを決定するため、安定にトランスフェク
ションされたＨＥＫ２９３細胞クローン、番号６２からの馴化培地を、Ａｎｇ−
７ポリペプチドの存在について分析した。簡潔には、実施例８により完全に記述
されるとおりＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、＃３０
４０５０）を使用して、タンパク質を馴化培地から部分的に精製した。溶出され
たカラム画分を、上述されたとおりウェスタンブロット上で分析した。ウェスタ
ンブロット分析を図８に描く。ウェスタンブロットのレーン１はＨＥＫ２９３細
胞からの馴化培地（陰性対照）を含有し；およびレーン２はＡｎｇ−７ポリペプ
チドを発現する安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞クローンか
らの馴化培地を含有した。

【０１４１】 図８を参照すれば、安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞系か
らの馴化培地は、テトラ（Ｔｅｔｒａ）−Ｈｉｓ抗体と反応したポリペプチドを
含有した一方、トランスフェクションされないＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地
は、こうした交差反応するポリペプチドを欠いた。この実験は、Ａｎｇ−７ポリ
ペプチドが培地中に分泌されることを確認する。

【０１４２】 実施例８： Ａｎｇ−７ポリペプチドをさらに特徴づけるため、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（キアゲ
ン（Ｑｉａｇｅｎ）、＃３０４０５０）を使用してそれを馴化培地から精製した
。簡潔には、クローン６２からの馴化培地を３日後に収集した。１錠の「完全」
プロテイナーゼ阻害剤（「完全」プロテイナーゼ阻害剤カクテル錠；ベーリンガ
ー マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）（ロシュ ディア
グノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））カタログ番号１６
９７４９８）を、収集された培地の各５０ｍｌに添加した。その後、イミダゾー
ル（シグマ（Ｓｉｇｍａ）；カタログ番号Ｉ−２３９９）を８ｍＭの最終濃度ま
で添加した。培地を１６００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を新たなチュー
ブに移し、そして５００μｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースの５０％スラリーを培地
の各５０ｍｌに添加した。チューブを４℃で６０分間穏やかに揺すった。Ｎｉ−
ＮＴＡ樹脂を１６００×ｇで１０分間の遠心分離により収集し、そして上清を廃
棄した。樹脂を洗浄緩衝液中に懸濁すること、次いで同一条件下での遠心分離に
より、樹脂を洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ８．０；３００ｍＭ
ＮａＣｌ；１０ｍＭイミダゾール）で２回洗浄した。洗浄した後、樹脂を再度洗
浄緩衝液に再懸濁し、そして１ｍｌカラムに移した（カラムあたり０．５〜１ｍ
ｌの樹脂床）。結合されたＡｎｇ−７ポリペプチドを、溶出緩衝液（５０ｍＭ
ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ８．０；３００ｍＭ ＮａＣｌ；２５０ｍＭイミダゾール）
を使用して４個の５００μｌ部分に溶出した。画分は、上述されたようなテトラ
（Ｔｅｔｒａ）−Ｈｉｓ抗体を使用するウェスタンブロットにより分析した。ウ
ェスタンブロットを図９Ａに描く。単離されたタンパク質の純度をクマシー染色
されたＳＤＳゲル上で分析し、そしてこの分析を図９Ｂに描く。

【０１４３】 図９Ａを参照すれば、ウェスタンブロッティングは、約６２〜６４ｋＤａに１
個の二重線のバンドを示した。クマシー染色されたＳＤＳゲルとのウェスタンブ
ロット分析の比較は、同一の分子量の対応する二重線を示した。（図９Ａおよび
９Ｂを比較されたい）。Ａｎｇ−７ポリペプチドの二重線の存在は、異なるグリ
コシル化された形態のＡｎｇ−７が安定にトランスフェクションされた細胞によ
り分泌されることを示唆する。

【０１４４】 実施例９： 内皮管形成に対するＡＮＧ−７遺伝子発現の影響を、マトリゲル（Ｍａｔｒｉ
ｇｅｌ）中のＨＵＶＥＣ毛細管様機構を検査することにより決定した。Ｅｃｏ
ＲＶおよびＰｍｅ１での消化によりｐｃＤＮＡ３．１／ａｎｇ７／ｍｙｃｈｉｓ
からＡＮＧ−７ ｃＤＮＡを切り出すことにより、ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡを含有
するアデノウイルス発現ベクターを構築した。生じるフラグメントを、ｐＳｈｕ
ｔｔｌｅ−ＣＭＶ（Ｈｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：２５０９−１４（１９９８））の対応する部位にクローン化した。ｐＳｈ
ｕｔｔｌｅ−ＣＭＶは、トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）（すなわちＡＮ
Ｇ−７ ｃＤＮＡ）がサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）プロモーターの制御
下にある、アデノウイルスシャトルベクターである。この構築物を、プラスミド
ｐＡｄＥａｓｙ（「ＡｄＥＺ」）（Ｈｅら、上記）でとの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ）中での組換えにより、アデノウイルスバックボーンに移入した。生じる組換え
体を制限エンドヌクレアーゼＰａｃ１で直鎖状にし、そしてその後、標準的方法
によりＨＥＫ２９３細胞（マイクロビックス インク（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｉｎ
ｃ）、カナダ・オンタリオ）にトランスフェクションした。トランスフェクショ
ン１０日後（ウイルスプラークの出現後）に、複数回の凍結−融解によりベクタ
ー粒子を細胞から収穫した。その後、粒子を使用して、９１１上皮細胞（イント
ロジーン（Ｉｎｔｒｏｇｅｎｅ）、オランダ・ライデン）を感染させた。複数の
実験に十分なベクターを得るために、９１１細胞の連続的により大きい培養物へ
のウイルス粒子の３回の継代を実施した。このウイルスストックを「Ａｄ−Ａｎ
ｇ７」と命名した。この粗ストックを以下の実験で使用した。

【０１４５】 ＨＵＶＥＣを、第０日に２４穴プレート中でウェルあたり細胞１．２５×１０⁴ 個でプレート培養した。細胞をＡｄ−Ａｎｇ７ストック、対照ベクターＡｄ−
Ｅｚ、もしくはＡｄ−ＶＥＧＦストック（血管内皮増殖因子）に感染させた。２
００μｌの各ウイルスストックを第０日にウェルに添加した。プレートを５％Ｃ
Ｏ₂中、３７℃で５日間インキュベートした。第６日に、細胞を、細胞３×１０⁴ 個／ウェルの密度で、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）で被覆された２４ウェル
プレートに広めた。マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）で被覆されたプレートは以
下のとおりに調製した。すなわち、マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）基底膜マト
リックス（ベクトン ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））
を氷上４℃で一夜融解した。予め冷却されたピペット、ピペットチップ、プレー
トおよびチューブを使用した。２４ウェルプレートのウェルを被覆するのに０．
３μｌ／ウェルのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（４℃で）を使用した。マト
リゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）は３７℃で２時間重合させた。マトリゲル（Ｍａｔ
ｒｉｇｅｌ）で被覆されたウェルへのＨＵＶＥＣの添加後に、プレートを５％
ＣＯ₂かつ３７℃で２４時間インキュベートした。全部の試験は三重のウェルで
実施した。各ウェル中の最終容積は１ｍｌである。

【０１４６】 ２４時間の３７℃、５％ ＣＯ₂でのインキュベーション後に、各ウェルを低
倍率の顕微鏡下でチェックした（１０倍の倍率の反転顕微鏡）。その後、プレー
トをジフ−クイック（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ）で染色し、そして対照を多様な濃
度と比較するために写真を撮影した。

【０１４７】 以下の表はプロトコルを要約する。

【０１４８】

【表１】

【０１４９】

【表２】

【０１５０】 結果は以下のとおりであり、ここで、管形成の長さはセンチメートルで示す。
（ＳＥＭは平均の標準誤差を示す。）

【０１５１】

【表３】

【０１５２】 本実施例からみることができるとおり、対照細胞、およびベクター単独（Ａｄ
−ＥＺ）に感染した細胞は、類似の量の管形成を示した。ＶＥＧＦの発現もまた
、類似のレベルの管形成を生じさせた。対照的に、Ａｎｇ−７ポリペプチドの発
現は管形成を顕著に阻害した。従って、本実験は、Ａｎｇ−７ポリペプチドが脈
管形成を阻害することを立証する。

【０１５３】 実施例１０： Ｂ１６マウス黒色腫の転移におけるＡＮＧ−７ のインビボ発現の効果を検査
した。簡潔には、アデノウイルスベクター（Ａｄ−Ａｎｇ−７）を用いてＡＮＧ
−７ ｃＤＮＡをエクスビボで送達させ、次いで、トランスフェクションされた
細胞をマウスに導入した。７４匹の雌性Ｃ ５７ Ｂｌ／６（６〜８週齢）を使
用した。エクスビボ投与のためには、粗ライセート（実施例９で上述されたとお
り調製された）もしくは精製されたベクターのいずれかを使用した。アデノウイ
ルスベクターは以下のとおり精製した。すなわち、プロトコルはＦａｌｌｕｘら
（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：２１５−２２（１９９６））の
変法である。大スケール精製のためには、９１１細胞をマルチトレイ細胞ファク
トリー（Ｍｕｌｔｉ−ｔｒａｙ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒｙ）（ヌクロン（Ｎｕ
ｃｌｏｎ）、デンマーク）中でプレート培養した。細胞が８５％コンフルエンス
に到達した場合に、それらを組換えアデノウイルスに感染させた。感染後（感染
後約４８〜７２時間）、細胞が細胞変性効果を示した場合に、細胞を収穫しそし
て遠心分離した。細胞ペレットを少容量の培地に再懸濁し、３周期の凍結および
融解を実施し、そして崩壊された細胞をペレットにして細胞破片を除去した。ウ
イルス粒子を含有する上清を、３ｍｌのｄ＝１．２５ｇ／ｍｌで上置きされたｄ
＝１．４ｇ／ｍｌの１ｍｌより構成される不連続塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配
上に層状に積み重ねた。勾配を１５１，０００×ｇで２時間遠心分離した。１．
２５／１．４の密度の境界のウイルス粒子の不透明なバンドを収集し、そしてｄ
＝１．３ｇ／ｍｌの均一なＣｓＣｌ溶液上に負荷した。この第二の勾配を１５１
，０００×ｇで１８時間回転させた。ウイルス粒子の単一のバンドを収集し、そ
して０．１３５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭトリス ｐＨ７．
５に対し１時間２回透析した。第二のかつ最後の透析は、１０％グリセロールの
添加を伴う同一の緩衝液に対して実施した。ストックの力価を、２９３もしくは
９１１細胞を使用するプラークアッセイにより測定した。

【０１５４】 マウス黒色腫の転移からのＢ１６．Ｆ１０細胞を、以下のアデノウイルス発現
ベクター、すなわちＡｄ−Ｅ１（対照）、Ａｄ−Ａｎｇ７もしくはＡｄ−ＶＥＧ
Ｆの１種に２４時間感染させた。感染した細胞を、２４のインキュベーション期
間の終了時にマウスの側方尾静脈中に静脈内に注入した。各注入の細胞濃度は、
０．２ｍｌのＰＢＳ中細胞２×１０⁵個であった。第０日はマウスへの注入の日
付であった。

【０１５５】 動物を週２回体重測定した。群１（対照）からの２匹の動物を第１４日に殺し
、肺を収集しそして転移の数を決定した。転移の計数後、動物の残余（各群で１
０匹）を第１４日に殺した。その時点で、肺を収集し、秤量し、そして転移の数
を計数した。

【０１５６】 以下の表は実験プロトコルを要約する。

【０１５７】

【表４】

【０１５８】 以下の表５は各群からの肺重量を要約する。ＳＥＭは「平均の標準誤差」であ
る。

【０１５９】

【表５】

【０１６０】 以下の表６は各群からの肺転移の数を要約する。ＳＥＭは「平均の標準誤差」
である。

【０１６１】

【表６】

【０１６２】 本データからみることができるとおり、ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡを過剰発現する
腫瘍細胞を受領するマウスにおける平均肺重量は、対照動物におけるよりも顕著
により低かった。ＡＤ−ＶＥＧＦおよびＡｄ−Ａｎｇ７処理された動物における
平均肺重量は同様であった。より重要なことに、また、表６を参照すれば、肺転
移の平均数は、対照およびＶＥＧＦ処理された動物と比較して、Ａｎｇ−７ポリ
ペプチドを過剰発現する腫瘍細胞において１０倍以上より少なかった。従って、
本データは、ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡの過剰発現が腫瘍細胞の成長を阻害すること
を示す。

【０１６３】 本明細書に記述される実施例および態様は具体的説明の目的上のみであること
、ならびに、それに照らして、多様な改変もしくは変更が、当業者に示唆される
ことができかつ本出願の技術思想および範囲、ならびに付属として付けられる請
求の範囲の範囲内に包含されるべきであることが、理解される。本明細書で引用
される全部の刊行物、特許および特許出願は、これにより、全部の目的上そっく
りそのまま引用により組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 発明にかかる、ＡＮＧ−７ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を描く。

【図２】 発明にかかる、ヒトＡｎｇ−７ポリペプチドのアミノ酸配列を描く。該配列は
アミノ酸の１文字記号で示す。

【図３】 発明にかかる、Ａｎｇ−１（配列番号３）、Ａｎｇ−２（配列番号４）、Ａｎ
ｇ−３（配列番号５）およびＡｎｇ−４（配列番号６）のものとのＡｎｇ−７（
配列番号２）のアミノ酸配列の整列を描く。同一のアミノ酸を箱により示す。

【図４】 発明にかかる、ヒト組織中のＡＮＧ−７ ＲＮＡの発現の特徴を描く。多様な
組織中でのＡＮＧ−７ ＲＮＡの発現レベルを示す。水平軸に沿って、参照数字
が以下の組織を同定する：

【表７】

【図５】 発明にかかる、Ａｎｇ−７ ＲＮＡのインビトロ翻訳の結果を描く。レーン１
：以下のタンパク質、すなわち卵アルブミン（４６ｋＤａ）、カルボニックアン
ヒドラーゼ（３０ｋＤａ）、トリプシンインヒビター（２１．５ｋＤａ）、リゾ
チーム（１４．３ｋＤａ）、およびアプロチニン（６．５ｋＤａ）を含有するレ
インボウ（Ｒａｉｎｂｏｗ）［¹⁴Ｃ］メチル化タンパク質分子量マーカー（アマ
ーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、英国バッキンガム州リトルシャルフォント）。
レーン２：哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）（イ
ンヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、オランダ・グロニンゲン）のＴ７
プロモーターを使用するＡＮＧ−７ ＲＮＡのインビトロ翻訳産物。レーン３：
哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ（−）のＳＰ６プロモ
ーターを使用するＲＮＡのインビトロ翻訳産物（陰性対照）。レーン４：インビ
トロ翻訳系（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、米国・マディソン）からの陽性対照
。

【図６】 発明にかかる、ＡＮＧ−７発現構築物で一過性にトランスフェクションされた
ＣＨＯ細胞の細胞抽出物のウェスタンブロット分析を描く。レーン１：タンパク
質分子量マーカー。レーン２：ＣＨＯ細胞（陰性対照）。レーン３：Ａｎｇ−７
ポリペプチドを発現する一過性にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞。Ａｎ
ｇ−７ポリペプチドのバンドは矢印により印を付ける。

【図７】 発明にかかる、安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞クローン
の細胞ライセート中のＡｎｇ−７ポリペプチドのウェスタンブロット分析を描く
。レーン１：タンパク質分子量マーカー。レーン２：ＨＥＫ２９３細胞からの細
胞ライセート（陰性対照）。レーン３：Ａｎｇ−７ポリペプチドを発現する安定
にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞からの細胞ライセート。

【図８】 発明にかかる、Ａｎｇ−７ポリペプチドを発現する安定にトランスフェクショ
ンされたＨＥＫ２９３細胞クローンからの馴化培地のウェスタンブロット分析を
描く。レーン１：ＨＥＫ２９３細胞からの馴化培地（陰性対照）。レーン２：Ａ
ｎｇ−７ポリペプチドを発現する安定にトランスフェクションされたＨＥＫ２９
３細胞クローンからの馴化培地。

【図９Ａおよび９Ｂ】 発明にかかる、馴化培地からのＡｎｇ−７ポリペプチドの精製の結果を描く。
図９Ａ：ウェスタンブロット分析；図９Ｂ：精製されたＡｎｇ−７ポリペプチド
のクマシー染色されたＳＤＳゲル。図９Ｂ中の矢印は組換えＡｎｇ−７ポリペプ
チドの位置を示す。各図について、レーン１〜５はＮｉ−ＮＴＡアガロースカラ
ムから溶出された画分１〜５である。レーン「ｎｅｇ．Ｃ」は陰性対照（ＨＥＫ
２９３細胞からの馴化培地）を示す。図９Ｂにおいて、二重のバンドはおそらく
Ａｎｇ−７ポリペプチドの異なるグリコシル化の形態を表す。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｋ 37/24 // Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＤ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 ビク，マレサ ドイツ・デー−51065ケルン・アンドレア ス−グリフイウス−シユトラーセ26 (72)発明者 ツボフ，ドミトリ ドイツ・デー−51061ケルン・ロゲンドル フシユトラーセ59 (72)発明者 ドウボワ−ストリングフエロー，ナタリー アメリカ合衆国カリフオルニア州94707バ ークリー・ジアラムデア1008 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 DA06 DA11 DA12 EA02 EA04 GA11 HA17 4C084 AA02 BA01 BA08 BA22 BA23 CA53 DB01 MA66 ZA361 ZA362 ZB211 ZB212 ZB261 ZB262 ZC611 ZC612 4C087 AA02 BB65 BC83 MA66 ZA36 ZB21 ZB26 ZC61

Claims (33)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 治療上有効な用量の単離されたＡｎｇ−７ポリペプチド、そ
   のフラグメント、変異体、誘導体もしくは類似物を哺乳動物に投与することを含
   んで成る、脈管形成の阻害方法。
2. 【請求項２】 Ａｎｇ−７ポリペプチドがヒトＡｎｇ−７（配列番号２）で
   ある、請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。
4. 【請求項４】 投与がインビボで実施される、請求項１記載の方法。
5. 【請求項５】 製薬学的担体を投与することをさらに含んで成る、請求項１
   記載の方法。
6. 【請求項６】 投与がエクスビボである、請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 ＡＮＧ−７核酸でトランスフェクションされた組換え細胞を
   調製すること、および該細胞を哺乳動物に投与することをさらに含んで成る、請
   求項６記載の方法。
8. 【請求項８】 Ａｎｇ−７ポリペプチドが組換え的に発現される、請求項１
   記載の方法。
9. 【請求項９】 Ａｎｇ−７ポリペプチドが、ポリペプチドの発現をもたらす
   条件下でＡＮＧ−７核酸を含有する細胞を培養すること、および細胞培養物から
   Ａｎｇ−７ポリペプチドを回収することにより組換え的に発現される、請求項８
   記載の方法。
10. 【請求項１０】 Ａｎｇ−７ポリペプチドが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発
    現される、請求項８記載の方法。
11. 【請求項１１】 Ａｎｇ−７ポリペプチドが発現された哺乳動物細胞である
    、請求項８記載の方法。
12. 【請求項１２】 ＡＮＧ−７核酸が発現ベクター中でプロモーターに操作可
    能に連結される、請求項９記載の方法。
13. 【請求項１３】 ＡＮＧ−７核酸がヒトＡＮＧ−７の配列（配列番号１）を
    有する、請求項９記載の方法。
14. 【請求項１４】 治療上有効な量の単離されたＡｎｇ−７ポリペプチド、そ
    のフラグメント、変異体、誘導体もしくは類似物を患者に投与することを含んで
    成る、抗脈管形成療法の必要な患者の治療方法。
15. 【請求項１５】 治療上有効な量のＡｎｇ−７ポリペプチド、そのフラグメ
    ント、変異体、誘導体もしくは類似物を被験体に投与することを含んで成る、抗
    脈管形成療法の必要な被験体における疾患の治療方法。
16. 【請求項１６】 疾患が腫瘍である、請求項１５記載の方法。
17. 【請求項１７】 Ａｎｇ−７ポリペプチドがヒトＡｎｇ−７（配列番号２）
    である、請求項１５記載の方法。
18. 【請求項１８】 被験体がヒトである、請求項１５記載の方法。
19. 【請求項１９】 投与がインビボで実施される、請求項１５記載の方法。
20. 【請求項２０】 製薬学的担体を投与することをさらに含んで成る、請求項
    １５記載の方法。
21. 【請求項２１】 投与がエクスビボである、請求項１５記載の方法。
22. 【請求項２２】 ＡＮＧ−７核酸でトランスフェクションされた組換え細胞
    を調製すること、および該細胞を被験体に投与することをさらに含んで成る、請
    求項２１記載の方法。
23. 【請求項２３】 Ａｎｇ−７ポリペプチドが組換え的に発現される、請求項
    １５記載の方法。
24. 【請求項２４】 Ａｎｇ−７ポリペプチドが、該ポリペプチドの発現をもた
    らす条件下でＡＮＧ−７核酸を含有する細胞を培養することにより組換え的に発
    現され、そして細胞培養物からＡｎｇ−７ポリペプチドが回収される、請求項２
    ３記載の方法。
25. 【請求項２５】 Ａｎｇ−７ポリペプチドが、哺乳動物細胞、酵母細胞、細
    菌細胞もしくは昆虫細胞中で発現される、請求項２３記載の方法。
26. 【請求項２６】 Ａｎｇ−７ポリペプチドが哺乳動物細胞で発現される、請
    求項２３記載の方法。
27. 【請求項２７】 ＡＮＧ−７核酸が発現ベクター中でプロモーターに操作可
    能に連結される、請求項２４記載の方法。
28. 【請求項２８】 発現ベクターが、アデノウイルスベクター、レトロウイル
    スベクターもしくはレンチウイルスベクターである、請求項２４記載の方法。
29. 【請求項２９】 ＡＮＧ−７核酸がヒトＡＮＧ−７の配列（配列番号１）を
    有する、請求項２４記載の方法。
30. 【請求項３０】 有効量のＡｎｇ−７ポリペプチドまたはそのフラグメント
    、変異体、誘導体、類似物もしくは製薬学的に許容できる塩を内皮細胞に投与す
    ることを含んで成る、内皮管形成の阻害方法。
31. 【請求項３１】 Ａｎｇ−７ポリペプチドがヒトＡｎｇ−７である、請求項
    ３０記載の方法。
32. 【請求項３２】 有効量のＡｎｇ−７ポリペプチド、またはそのフラグメン
    ト、変異体、誘導体、類似物もしくは製薬学的に許容できる塩を腫瘍細胞に投与
    することを含んで成る、腫瘍細胞の成長の阻害方法。
33. 【請求項３３】 Ａｎｇ−７ポリペプチドがヒトＡｎｇ−７である、請求項
    ３２記載の方法。