BR112012016982B1 - bactéria de ácido lático recombinante de grau alimentício e composição terapêutica - Google Patents
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Abstract
BACTÉRIAS PROBIÓTICAS RECOMBINANTES PARA A PREVENÇÃO E TRATAMENTO DA DOENÇA INFLAMATÓRIA DO INTESTINO (IBD) E SÍNDROME DO INTESTINO IRRITÁVEL (IBS) A presente invenção refere-se ao campo geral da terapia de doenças inflamatórias intestinais (IBD) e/ou síndrome do intestino irritável (IBS). Assim, a invenção refere-se a uma molécula selecionada a partir da proteína trappin-2 ou uma fração ativa da proteína trappin-2, um elemento das proteínas da família WAP, ou uma fração ativa do elemento das proteínas da família WAP, ou um elemento das proteínas da família Serpina, ou uma fração ativa de um elemento das proteínas da família Serpina para o tratamento da síndrome do intestino irritável (IBS). A invenção também se refere a uma bactéria recombinante de grau alimentício que inclui um gene selecionado a partir de um gene que codifica para a proteína trappin-2, ou uma fração ativa da proteína trappin-2, um gene que codifica para um elemento das proteínas da família WAP, ou uma fração ativa de um elemento das proteínas da família WAP, ou um gene que codifica para um elemento das proteínas da família serpina, ou uma fração ativa de um elemento das proteínas da família serpina.
Description
[001] A presente invenção refere-se ao campo geral da terapia de doenças inflamatórias do intestino, como doenças inflamatórias intestinais (IBD), doenças pulmonares, como a fibrose cística e doenças obstrutivas crônicas broncopulmonares (BPCO), doença articular inflamatória (por exemplo, osteoartrite), Doenças Urogenitais inflamatórias e doenças associadas com sintomas de dor visceral crônica, tais como síndrome de intestino irritável (IBS).
[002] O tratamento de desordens inflamatórias crônicas como IBD representa grande um desafio médico uma vez que estes afligem vários milhões de pessoas. Sua maior incidência está entre os países desenvolvidos e tem aumentado constantemente nas últimas 3 décadas. Terapias atuais para IBD precisam muito ser melhoradas, uma alta porcentagem de pacientes (entre 20 e 40%) resistentes a quaisquer formas de tratamentos, efeitos colaterais graves e custos elevados, sendo também associados a drogas atualmente disponíveis (glicocorticoides e terapias de anticorpo monoclonal). Além disso, os mecanismos envolvidos na patogênese da IBD não são totalmente compreendidos, e o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes ou mesmo curas para IBD depende de melhor compreensão da regulação da resposta inflamatória. Vários estudos têm demonstrado um papel crucial para proteases na manutenção da resposta inflamatória crônica do trato gastrintestinal [Vergnolle,N. 2005.; Cenac,N. et al., 2007; Hyun,E., et al, 2008; Vergnolle, N., et al, 2004]. Portanto, os inibidores de protease endógena parecem ser cruciais para o controle das respostas inflamatórias intestinais.
[003] Baseado neste conhecimento, inventores propõem que a entrega os inibidores de protease para o GIT, poderia ser usada para o tratamento de uma IBD e/ou síndrome do intestino irritável (IBS).
[004] O uso de probióticos para o tratamento de IBD agora foi proposto por vários anos e vários estudos relataram alguns efeitos benéficos que essas bactérias probióticas testadas isoladamente ou em combinação [Hedin, C. et al, 2007; Sartor, R. B. 2004]. A estratégia de usar bactérias recombinantes de grau alimentício não patogénicas como veículos de entrega de moléculas anti- inflamatórias no nível da mucosa já tem sido usada para entregar a anti- inflamatório citocina IL-10 [Steidler, L., et al., 2000]. Ensaios clínicos da Fase 1 têm demonstrado que a cepa Lactococcus lactis administrada oralmente expressando citocina IL-10, era segura, sem efeitos colaterais graves ocorrendo nesses pacientes [Braat, H., et al., 2006]. No entanto, a atividade de doença diminuída em pacientes de doença de Crohn tratados com IL-10 L. lactis recombinante de alguma forma foi limitada. Esta eficácia limitada poderia ser explicada pelo fato de que entrega de IL-10 sempre foi relatada tendo apenas discretos efeitos benéficos contra o desenvolvimento de colite [Braat, H. et al., 2003]. Uma escolha melhor na natureza da molécula anti-inflamatória entregue pelo L. lactis, poderia assim melhorar consideravelmente a eficácia do tratamento. Aqui, os inventores propõem usar uma bactéria de grau alimentício para expressar e entregar anti-protease trappin-2 no intestino.
[005] A invenção baseia-se na descoberta que o uso de uma bactéria de grau alimentício para entregar uma molécula anti-inflamatória como trappin-2 fornece uma segurança e eficiência melhor do que os tratamentos existentes. Assim, a invenção refere-se a uma molécula selecionada a partir da proteína trappin-2 ou uma fração ativa da proteína trappin-2, um membro das proteínas famílias WAP ou uma fração ativa do membro das proteínas famílias WAP ou um membro das proteínas da família Serpina ou uma fração ativa de um membro das famílias outras proteínas para o tratamento da síndrome de intestino irritável (IBS).
[006] Um objeto de invenção diz respeito a uma bactéria recombinante de grau alimentício que inclui um gene selecionado a partir de um gene que codifica para a proteína trappin-2 ou uma fração ativa da proteína trappin-2, um gene que codifica para um membro das proteínas famílias WAP ou uma fração ativa de um membro das proteínas da família WAP ou um gene que codifica para um membro das proteínas da família Serpina ou uma fração ativa de um membro das proteínas da família Serpina.
[007] Outro aspecto da invenção refere-se a uma composição terapêutica composta por uma bactéria recombinante de grau alimentício, conforme definido acima.
[008] Como usado aqui, o termo "trappin-2" (também conhecido como elafina, inibidor específico de elafina (ESI) ou SKALP para anti-leucoprotease de pele) da família WAP, denota um inibidor de baixo peso molecular (9,9 kDa) inibidor de HNE (elastase de neutrófilo humano) e proteinase 3, que é secretado no trato respiratório [Sallenave et al., 1991 e 1993]. Juntamente com (Al-Pi) e SLPI, trappin-2 compreende uma parte integrante do "escudo anti-elastase" no pulmão. Uma sequência exemplar de gene humano de trappin-2 está depositada no banco de dados Genbank sob o número de adesão S58717.
[009] Como usado aqui, o termo "Família WAP" para "Proteína ácida de Soro de leite" designa uma família de proteínas contendo trappin-2 e ps20.
[010] Como usado aqui, a termo "família Serpina" para os inibidores de protease serina denota uma família de inibidores de protease serina que se assemelham na sequência de aminoácidos e mecanismo de inibição, mas diferem em sua especificidade para enzimas proteolíticas. Esta família inclui alfa 1-antitripsina (Al- Pi), angiotensinogen, ovalbumina, antiplasmina, proteína alfa 1-antiquimotripsina, proteína de ligação de tiroxina, inativadores de complemento 1, antitrombina III, cofator de heparina II, inativadores de plasminogênio, proteína do gene Y, inibidor de ativador de plasminogênio placentário e proteína de cevada Z. Esta família não inclui o inibidor de protease de leucócitos secretores (SLPI) [Thierry Moreau et al, 2008]. Alguns membros da família serpina podem ser substratos ao invés de inibidores de endopeptidases serina, e algumas serpinas ocorrem em plantas onde sua função não é conhecida.
[011] Neste documento, o termo "proteína alfa 1 - antitripsina" denota uma glicoproteína. Alfa 1-antitripsina é também referida como inibidor de alfa-1 protease (A1PI) porque ele é um inibidor de protease serina (serpina), inibindo a uma grande variedade de proteases. Ele protege tecidos de enzimas das células inflamatórias, especialmente elastase. Uma sequência exemplar de gene humano Alfa 1-antitripsina está depositada no banco de dados Genbank sob o número de adesão NC008290 .
[012] Neste documento, o termo "uma fração ativa de denota uma fração de uma proteína com a atividade da proteína completa". Por exemplo, uma fração ativa da proteína trappin-2 denota uma fração da proteína que conserva a capacidade de inibir FINE ou uma fração ativa das proteínas das famílias Serpina denota uma fração da proteína que conserva a capacidade de inibição.
[013] Neste documento, o termo "bactéria de grau alimentício" denota uma bactéria que é amplamente utilizada em alimentos fermentados e possui um perfil de segurança perfeito reconhecido pelo GRAS (geralmente reconhecido como seguro) e status QPS (presunção de segurança qualificada) nos EUA e Comunidade Europeia, respectivamente. Essa bactéria pode ser segura em alimentos funcionais ou aditivos alimentares, com alegações relativas a manter a boa saúde e bem-estar ou prevenção da doença.
[014] Como usado neste documento, o termo "bactéria probiótica" denota uma bactéria que ingerida viva em quantidades adequadas pode exercer efeitos benéficos sobre a saúde humana. Elas são agora amplamente utilizadas como aditivos alimentares por seus efeitos de promoção da saúde. A maioria das bactérias probióticas são bactéria de ácido lático (LAB), e entre eles cepas dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium são as bactérias probióticas mais amplamente utilizadas.
[015] Neste documento, o termo "thyA gene" denota, o gene que codifica para a timidilato sintase, que é uma enzima gerando monofosfato timidina (dTMP), que posteriormente é fosforilada para trifosfato de timidina, usado na síntese e reparação de DNA.
[016] Como usado neste documento, o termo "Síndrome do intestino irritável (IBS)" é um termo para uma variedade de condições patológicas, causando desconforto no trato gastrointestinal. É um distúrbio intestinal funcional caracterizado por dor abdominal crônica, desconforto, inchaço e alteração dos hábitos intestinais, na ausência de qualquer causa orgânica.
[017] Como usado aqui, o termo "doenças inflamatórias intestinais (IBD)" é um grupo de doenças inflamatórias do cólon e do intestino delgado. Os principais tipos de IBD são doença de Crohn, colite ulcerativa e pouchite. Proteínas e usos das mesmas:
[018] Um primeiro objeto da invenção refere-se a uma molécula selecionada a partir da proteína do trappin-2 ou uma fração ativa da proteína trappin-2, um membro das proteínas famílias WAP ou uma fração ativa do membro as proteínas de famílias de WAP, ou uma molécula selecionados a partir da família de serpina ou uma fração ativa da família Serpina para o tratamento da síndrome de intestino irritável (IBS).
[019] Em uma modalidade preferida, o membro da família Serpina é proteína alfa1-antitripsina.
[020] Em uma encarnação preferida, disse fração da proteína é composto por, pelo menos, 75% da identidade de tal proteína, de preferência ainda mais, pelo menos, 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 99%.
[021] Normalmente tal proteína ou fração da proteína da mesma pode ser usada em combinação com um agente anti-inflamatório.
[022] Proteínas da invenção ou frações das proteínas das mesmas podem ser produzidas por qualquer técnica conhecida na técnica tais como, sem limitação, qualquer técnica química, biológica, genética ou enzimática, sozinho ou em combinação(ões). a. Sabendo a sequência de aminoácidos da sequência desejada, uma pessoa versada na técnica pode prontamente pode produzir uma parte relevante das referidas proteínas ou fração da proteína, por técnicas padrão para a produção de proteínas. Por exemplo, eles podem ser sintetizados usando método de fase sólida conhecido, de preferência usando um aparelho de síntese de proteína disponível no mercado (como o da Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) e seguindo as instruções do fabricante.
[023] Como alternativa, as proteínas ou fração das proteínas da invenção da mesma podem ser sintetizadas por técnicas de DNA recombinante como são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, estes fragmentos podem ser obtidos como produtos de expressão do DNA após incorporação das sequencias de DNA codificando o polipeptídeo desejado em vetores de expressão e a introdução de tais vetores em adequados hospedeiros procariotos ou eucariotos que expressarão a proteína desejada ou fração da proteína, a partir da qual podem ser mais tarde usadas técnicas bem conhecidas.
[024] Proteínas ou fração das proteínas da invenção podem ser usada em uma forma (por exemplo, purificado) ou contida em um vetor, tal como uma membrana ou vesícula lipídica (por exemplo, lipossomas). Bactérias de grau alimentício
[025] Um objeto de invenção diz respeito a uma bactéria recombinante de grau alimentício que inclui um gene selecionado a partir de um gene que codifica para a proteína trappin-2 ou uma fração ativa da proteína trappin-2, um gene que codifica para um membro das proteínas famílias WAP ou uma fração ativa de um membro das proteínas da família WAP ou um gene que codifica para um membro das proteínas da família Serpina ou uma fração ativa de um membro das proteínas da família Serpina.
[026] Em uma modalidade preferida, a bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção é uma bactéria probiótica.
[027] Em uma modalidade preferida, a bactéria probiótica de acordo com a invenção compreende um gene auxotrófico defeituoso, através do qual a sobrevivência da tal bactéria é estritamente dependente da presença de compostos específicos.
[028] Em outra modalidade preferida, o gene auxotrófico de acordo com a invenção é o gene thyA codificando timidilato sintase.
[029] Em outra modalidade preferida, o gene auxotrófico de acordo com a invenção é gene alanina racemase (ar) (Bron et al, 2002).
[030] Inativação do gene thyA da bactéria probiótica de acordo com a invenção rende este auxotrófico para timidina que está ausente do trato gastrointestinal (GIT). Este mutante thyA recombinante será capaz de entregar sua proteína de interesse, mas não sobreviverá e assim, persiste no GIT limitando sua difusão e conferindo a contenção biológica solicitada para bactérias recombinantes. Resultados semelhantes podem ser obtidos com o gene aéreo.
[031] Em outra modalidade preferida, o gene selecionado é inserido no gene thyA.
[032] De preferência, o gene recombinante está localizado no cromossomo no locus do gene thyA que assim é inativado pela ruptura do gene. Como usado neste documento, o termo "perturbação do gene" denota interrupção pela inserção de um fragmento de DNA, ruptura por supressão do gene, ou uma parte dele, bem como a troca do gene ou a uma parte por outro fragmento de DNA e a interrupção é induzida por técnicas de DNA recombinante e não por mutação espontânea. Preferencialmente, a interrupção é a troca do gene, ou uma parte dele, por outro gene funcional. De preferência, o gene defeituoso thyA recombinante é um gene mutante não reversivo.
[033] Como usados neste documento, o termo " mutante não reversivo" denota que a frequência de reversão é inferior 10"8, de preferência a frequência de reversão é inferior a 10"10, ainda mais de preferência, a frequência de reversão é inferior a 10"12, ainda mais de preferência, a frequência de reversão é inferior a 10~14, mais de preferência, a frequência de reversão não é detectável usando os métodos de rotina conhecidos para o perito na técnica.
[034] Em uma modalidade preferida, o gene de acordo com a invenção codifica para a proteína alfa 1-antitripsina, ou outros membros da família Serpina tais como antiplasmina, alfa 1-antiquimotripsina.
[035] Em uma modalidade preferida, a cepa de bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção é uma cepa L. lactis ou cepa Lactobacillus casei ou uma cepa L. lactis htrA [Poquet et al., 2000] ou uma cepa Lactobacillus plantarum de uma cepa Bifidobacterium longum.
[036] Em uma modalidade preferida, a cepa de bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção é uma cepa de Lactobacillus casei.
[037] Em uma modalidade mais preferida, o gene de acordo com a invenção codifica para trappin-2.
[038] De fato, os inventores mostraram que trappin-2 se manifesta naturalmente na mucosa colônica humana, com uma proeminente expressão em células epiteliais intestinais (Motta et al.) e que, pacientes com IBD mostram baixa regulagem de trappin-2 nos tecidos em comparação com indivíduos saudáveis (Motta et al).
[039] Além disso, os inventores demonstraram em modelos diferentes de colite, nessa super-expressão de trappin-2 é protetora contra o desenvolvimento de colite (na expressão constitutiva e transitória). Além disso, super-expressão de trappin-2 em modelos de colite é capaz de inibir completamente o aumento da elastase e tripsina, como atividades associadas à colite.
[040] Finalmente, super-expressão de trappin-2 em camundongos também é capaz de inibir significativamente aumento induzido por colite de citocinas pró- inflamatórias e quimiocinas (IL-6, I1-17A, TNF-alfa, Interferon-gama, MCP-1 e KC).
[041] Todos estes resultados são a favor da entrega de trappin-2 e outras proteases da família WAP ou Serpina que têm propriedades semelhantes para tratar IBD. Conforme os resultados abaixo, bactérias de grau alimentício são os meios mais seguros e eficientes para entregar este tipo de proteases para o intestino.
[042] Em outra modalidade preferida, o gene de acordo com a invenção codifica para a proteína alfa 1-antitripsina.
[043] Na verdade, a proteína alfa 1-antitripsina inibe a atividades como de tripsina associadas com IBD (como colite) e, portanto, tem efeitos similares como trappin-2.
[044] Em outra encarnação preferida, a cepa de bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção é uma cepa de casei Lactobacillus, que compreende um gene que codifica para trappin-2.
[045] Em outra modalidade preferida, a cepa de bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção é uma cepa de Lactobacillus casei, que compreende um gene que codifica para trappin-2 inseridas no gene thyA.
[046] Em outra modalidade, a bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção é útil para o tratamento de condições inflamatórias intestinais.
[047] Em outra modalidade preferida, a bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção é útil para o tratamento de IBD e/ou IBS.
[048] As condições inflamatórias podem ser selecionadas de IBD, IBS, doença pulmonar inflamatória, doença articular inflamatória ou doença inflamatória urogenital. Composições
[049] Outro objeto da invenção refere-se a uma composição terapêutica composta por uma bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção.
[050] Em uma modalidade preferida, composição terapêutica de acordo com a invenção destina-se para administração mucosa para um objeto.
[051] Na outra administração preferencial, a composição terapêutica de acordo com a invenção destina-se a administração oral para um objeto. Por exemplo, as composições podem ser na forma de uma suspensão, comprimido, cápsula, pílula, granulado ou em pó.
[052] Em uma composição líquida terapêutica, a bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção está presente, livre e não imobilizada, em suspensão. A suspensão tem uma composição que garante condições fisiológicas para uma bactéria probiótica, para que em particular a pressão osmótica dentro da célula não cause a lise.
[053] Em uma composição sólida terapêutica, a bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção pode estar presente na forma livre, de preferência liofilizada, ou em forma imobilizada. Por exemplo, a bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção pode ser colocada em uma matriz de gel que protege as células.
[054] Uma composição sólida terapêutica destinada a administração oral e que contém a bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção em forma imobilizada ou não-imobilizada preferencialmente é fornecida com um revestimento resistente ao suco gástrico. Assim, assegura-se que a bactéria de grau alimentício contida na composição terapêutica pode passar pelo estômago sem impedimentos e sem danos e a liberação da bactéria de grau alimentício ocorre primeiro nas regiões intestinais superiores.
[055] Em outro aspecto da invenção, a composição terapêutica contém suficientes unidades formadoras de colônia (CFU) da bactéria de grau alimentício capaz de formar a proteína de acordo com a invenção, para que com administração múltipla da composição terapêutica de acordo com o paciente, o estado da IBD ou IBS seja melhorado, a progressão de IBD ou IBS seja parada, e/ou os sintomas de IBD ou IBS possam ser aliviados. De acordo com a invenção, em particular é fornecido uma composição terapêutica que contém 1x10 8-1x1011, preferencialmente 1x10 9-1x1010 CFU da bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção.
[056] Em uma modalidade mais preferida da invenção, a composição terapêutica contendo a bactéria de grau alimentício é administrada de forma intraretal. A administração retal preferencialmente realiza-se sob a forma de supositório, enema ou espuma. Administração intra-retal é particularmente adequada para doenças intestinais inflamatórias crônicas que afetam as seções intestinais inferiores, por exemplo, o cólon. Administrações intranasais são também adequadas para tratar doenças pulmonares crônicas, como fibrose cística e BPCO.
[057] Em outro aspecto a invenção refere-se a uma composição alimentícia composta por uma bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção.
[058] Em uma modalidade preferida, a composição alimentícia de acordo com a invenção destina-se para administração oral para um objeto. Por exemplo, composições podem ser sob a forma de uma suspensão, comprimido, cápsula, pílula, granulado, pó ou iogurte.
[059] Em uma modalidade preferida, a composição dos alimentos pode conter 1x108-1x1011, preferencialmente 1x109-1x1010 CFU da bactéria de grau alimentício de acordo com a invenção.
[060] Em uma modalidade preferida, a composição dos alimentos pode ser administrada ao paciente em uma dose diária de 1010 bactérias.
[061] A invenção será ainda ilustrada pelas seguintes figuras e exemplos. No entanto, esses exemplos e figuras não devem ser interpretados de qualquer maneira que limite o escopo da presente invenção. FIGURAS
[062] Figura 1: diferenças de peso (A), Pontuação macroscópica (B), espessura da parede (C) e atividade de mieloperoxidase (MPO) (D) nos tecidos do cólon de ratos que tinham água ou água + DSS (3%) em seus bebedouros, e que receberam tratamentos orais diários por 7 dias com L. lactis tipo selvagem, ou cepas L. lactis recombinantes expressando elafina ou IL-10. Observaram-se diferenças significativas em relação aos camundongos tratados com PBS que receberam DSS * para p<0,05, ** para p< 0,01, e *** para p < 0,005. Significativas diferenças em relação ao camundongo tratado com L. /actw do tipo selvagem foram notadas Φ para P<0,05, Φ Φ para P<0,01 e Φ Φ Φ para P<0,05. Diferenças significativas entre o grupo PBS + DSS e o grupo PBS-água foram notadas # para p< 0.05, # # para p< 0,01, e # # # para p< 0,005. Diferenças significativas em relação ao grupo IL-10 recombinante L. lactis foram notadas w para p < 0,05, w w para p < 0,01 e w w w para p < 0,005.
[063] Figura 2: atividade tipo de tripsina(A) e atividade de elastase (B) em lavagens do lúmen do cólon de camundongos que tinham água ou água + DSS (3%) em seus bebedouros, e que receberam tratamentos orais diários por 7 dias com tipo selvagem L. lactis, cepas recombinantes L. lactis expressando Elafina ou IL-10. ε significa níveis indetectáveis. Observaram-se diferenças significativas em relação aos camundongos tratados com PBS que receberam DSS * para p<0.05, ** para p<0.01. Diferenças significativas em relação aos camundongos tratados com L. lactis de tipo selvagem foram notadas Φ para p<0.05. Diferenças significativas entre o grupo PBS + DSS e o grupo PBS-água foram notadas # para p < 0.05, # # para p < 0,01, e # # # para p < 0,005.
[064] Figura 3: Pontuação macroscópica (A), espessura da parede (B), e atividade de mieloperoxidase (MPO) (C) nos tecidos do cólon de camundongos que tinham água ou água + DSS (3%) em seus bebedouros, e que receberam tratamentos orais diários por 7 dias com Lb. casei tipo selvagem, ou cepas Lb. casei recombinantes expressando Elafina. Observaram-se diferenças significativas em relação aos camundongos tratados com PBS que receberam DSS * para p<0,05, ** para p<0,01, e *** para p<0,005. Observaram-se diferenças significativas em relação aos camundongos tratados com Lb. casei tipo selvagem Φ para p<0.05, Φ Φ para p<0.01, e Φ Φ Φ for p< p<0.005.
[065] Figura 4: atividade tipo de tripsina (A) e atividade de elastase (B) em lavagens do lúmen do cólon de camundongos que tinham água ou água + DSS (3%) em seus bebedouros, e que receberam tratamentos orais diários por 7 dias com tipo selvagem Lb. casei , cepas recombinantes Lb. casei expressando Elafina. Observaram-se diferenças significativas em relação aos camundongos tratados com PBS que receberam DSS * para p< 0.05 e diferenças significativas em relação aos camundongos tratados com Lb. casei tipo selvagem Φ para p < 0.05 e Φ Φ para p< 0,01.
[066] Figura 5: concentração da proteína RANTES (A), TNFα (B), IL-6 (C), MCP- 1 D, KC (E), INF/ (F) e IL-17 (G) detectada nos tecidos do cólon de camundongos que tinham água ou água + DSS (3%) em seus bebedouros, e que recebeu tratamentos orais diários por 7 dias com tipo selvagem Lb. casei ou recombinante Lb. casei expressando Elafina. ε significa níveis indetectáveis. Observaram-se diferenças significativas em relação aos camundongos tratados com PBS que receberam DSS * para p<0.05, ** para p<0.01, e *** para p<0.005. Φ apresentou significantes diferenças para p< 0.05, em comparação com os camundongos tratados com L. lactis do tipo selvagem. Diferenças significativas entre o grupo PBS + DSS e o grupo PBS-água foram notadas # para p<0.05, # # para p<0,01, e # # # para p<0,005.
[067] Figura 5: concentração da proteína de IL-2 (A), IL-4 (B), IL-5 (C), IL-10 (D) e IL-13 (E) detectada nos tecidos do cólon de camundongos que tinham água ou água + DSS (3%) em seus bebedouros, e que receberam tratamentos orais diários por 7 dias com Lb. casei tipo selvagem ou Lb. casei recombinante expressando Elafina. Observaram-se diferenças significativas em relação aos camundongos tratados com PBS que receberam DSS * para p<0.05, ** para p<0.01. Observaram-se diferenças significativas em relação aos camundongos tratados com Lb. casei tipo selvagem Φ para p<0.05, Φ Φ para P<0.01.
[068] Figura 7: Número Total de comportamentos de dor (A) ou o número de contrações abdominais e comportamento de lambidas, alongamento e esmagamento (B) em camundongos que receberam intracolonialmente PBS (n = 5), ou óleo de mostarda (0,01% (v/v) em etanol a 70%) e que receberam por 7 dias anteriores, pré-tratamentos por intubação oral de PBS (n = 8), L. lactis tipo selvagem (n = 8), ou L. lactis recombinante expressando Elafina (n = 8) ou IL-10 (n = 5). Observaram-se diferenças significativas em relação aos camundongos tratados com PBS que receberam óleo de mostarda * para p<0.05, ** para p<0.01, e *** para p<0.005. Φ apresentou significantes diferenças para p< 0.05, em comparação com os camundongos tratados com L. lactis do tipo selvagem.
[069] Figura 8: elafina secretada por L. lactis tipo selvagem e cepas htrA. Experimentos de Western Blot realizados com anticorpos anti-elafina em extratos celulares (C) e sobrenadantes (S) de tipo selvagem (ts) ou cepas htrA (htrA). Produção de Elafina foi induzida por nisina de culturas da fase exponencial de cepas ts ou htrA (ambas contendo o vetor de expressão onde a expressão do gene de elafina pode ser induzida pela adição de nisina).
[070] Figura 9: efeitos protetores de L. lactis ts e cepas htrA mutantes em DSS 5% - induzido pelo modelo de colite. As atividades Macroscópica (A), danos histológicos (B) e de MPO (C) foram avaliadas em diferentes grupos de 10 camundongos tratados com água (controle negativo) ou com DSS 5%. Dois primeiros grupos de controle foram tratados i) com a água e alimentados por via oral com PBS (grupo de controle negativo) e ii) com DSS 5% e oralmente alimentados com PBS (grupo de controle positivo). Outros grupos foram tratados com DSS 5% > e com qualquer cepa ts (TS), cepa ts expressando elafina (Elafina) e a cepa mutante htrA expressando elafina (Elafina+).
[071] Figura 10: efeitos protetores de cepa L. casei ts e cepas L. casei expressando SOD, expressando elafina e expressando IL-10 modelo de colite em induzido pelo DSS 5% >. As atividades Macroscópica (A), danos histológicos (B) e de MPO (C) foram avaliadas em diferentes grupos de 10 camundongos tratados com água (controle negativo) ou com DSS 5%. Dois primeiros grupos de controle foram tratados i) com a água e alimentados por via oral com PBS (grupo de controle negativo) e ii) com DSS 5% e oralmente alimentados com PBS (grupo de controle positivo). Todos os outros grupos foram tratados com DSS 5% > e com cepa L. casei ts (TS) ou cepas L. casei expressando superóxido dismutase (SOD), elafina (Elafina) ou IL-10. *e * indicam que os dados são significativamente diferentes (P < 0,05) a partir dos dados obtidos com L. casei ts.
[072] Figura 11: atividade de Mieloperoxidase (MPO) (D) nos tecidos do cólon de camundongos. Atividade de Mieloperoxidase (MPO) (D) foi medida nos tecidos do cólon de camundongos que tinham água ou água + DSS (3%) em seus bebedouros, e que receberam tratamento oral diário por 7 dias i) L. lactis TS, L. lactis de recombinação e cepas de htrA L. lactis expressando Elafina ou IL-10 e com ii) cepa L. casei TS e expressando SOD, expressando elafina e cepas de L. casei expressando IL-10. *e * indicam que os dados são significativamente diferentes (p < 0,05) a partir dos dados obtidos com L. casei ts.
[073] Figura 12: secreção de Elafina em uma cepa L. lactis TS onde o gene elafina se manifesta sob o controle de um promotor induzível EDTA - [Llull D e Poquet I.2004; EP 1 537 215 e FR 98 16462]. A cepa L. lactis TS expressando elafina foi cultivada durante a noite na presença (+) ou não (-) de EDTA, um agente quelante (nesta construção, a expressão do gene elafina é controlada por um promotor de lactococcal que pode ser induzido pela adição de EDTA: no cromossomo, este promotor controla a expressão de genes que codificam um sistema específico de absorção de ABC para zinco e é deprimido sob condições de ausência de zinco que podem ser imitadas pela adição de EDTA). Proteínas, em seguida, foram extraídas e fracionadas entre células (C) e frações sobrenadante (S) e experimentos Western blot foram realizados utilizando anticorpos anti-elafina. Exemplo Material e métodos
[074] Clonagem de Elafina em bactérias lácticas ácidas recombinantes (Lactococcus lactis e Lactobacillus casei)
[075] Clonagem e expressão de elafina em bactérias de ácido láctico
[076] O Gene que codifica para elafina foi PCR amplificado a partir de plasmídeo DK6-elafina(14). Sequências dos primers utilizados foram: a. 5' adiante de Elafina (CCAATGCATCAGCAGCTGTCACGGG AGTTCC) (SEQ ID N. ° 1); e 3' reverso Elafina (GGACTAGTCCTCACTGGGGAACGAAACA CG) (SEQ ID N° 2). Primers foram projetados para eliminar os primeiros códons da região de elafina de codificação para Peptídeo de sinal (PS) e foi substituído por PS da proteína Usp45 (PSusp4s), a principal proteína secretada de L. lactis. Para esse objetivo, produto de PCR foi digerido, purificado e clonado em pSEC, um vetor de secreção de L. lactis. No pSEC resultante do plasmídeo: elafina, elafina é fundido na estrutura com um fragmento de DNA codificando para RBS e Expressão PSusP45- do cassete é controlado pelo promotor induzível VnisA, cuja atividade depende da concentração da nisina usada. Este plasmídeo, em seguida, foi introduzido em uma cepa de L. lactis compreendendo os genes reguladores de nisina nisR et nisK (L. lactis NZ9000) para dar origem a cepa recombinante: NZ(pSEC:elafm). As ferramentas usadas (replicons, promotor, RBS e SP) são funcionais em cepas de lactobacilos, como Lactobacillus casei e Lb. plantarum. Estas duas cepas (cada um compreendendo genes nisRK em seus cromossomos) foram escolhidas devido à sua capacidade de persistência no trato digestivo (até 4 dias, ao contrário de 24 a 48 fir em L. lactis. Além disso, nós demonstramos recentemente que a cepa Lb. casei BL23 possui propriedades anti-inflamatórias em um modelo de colite induzida por DSS [Rochat et al., 2007]. Temos, portanto, em nossa disposição cepas não-imuno-moduladoras fracamente (L. lactis) e fortemente (Lb. plantarum) persistentes como cepas imuno- moduladoras altamente persistentes (Lb. casei), nos permitindo avaliar a viabilidade de combinar os efeitos anti-inflamatórios intrínsecos das cepas usadas com que as moléculas super-expressadas.
[077] Para a indução do promotor PnisA, L. lactis recombinante foram cultivadas para OD600 = ~04-0.6 e então induzidas com 10 ng/ml de nisina (Sigma) durante 1h. A funcionalidade desta indução foi então testada como segue: culturas NZ (pSEC:elafina) (final OD600 =~1) foram separados em granulados e frações sobrenadantes e o conteúdo em elafina foi medido por ELISA e/ou Western Blot. Animais
[078] Camundongos C57B16 (6-8 semanas de idade) foram obtidos a partir de Janvier (St Quentin Fallavier) e foram mantidos à temperatura ambiente, sob 12 h de ciclos claro/escuro e tendo livre acesso a comida e água, exceto no dia anterior a indução de colite, onde eles jejuaram por 12h. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados de animais e serviços veterinários. Indução de colite e projeto de estudo
[079] Inflamação do cólon foi induzida por tratamentos com Sulfato de Sódio Dextrano (DSS). Em detalhes, DSS foi dissolvido na água potável (3 ou 5% peso/vol.) e os animais eram livres para beber esta solução por 7 dias. O consumo de água foi medido nos grupos tratados com DSS e em comparação com grupos de camundongos naive bebendo água potável: não foi observada diferença para o volume de líquido consumido, entre camundongos que beberam água e beberam DSS. Os camundongos foram tratados diariamente por via oral, com 100 μl de 5.109 unidades formadoras de colônia (cfu) de tipo selvagem, L. lactis e Lb. casei recombinante com elafina ou meio bacteriano sozinho. O primeiro tratamento iniciado ao mesmo tempo em que DSS foi adicionado à água potável e o último tratamento foi no dia do sacrifício (dia 7). Taxa de sobrevivência e peso corporal foram medidos diariamente após a indução da colite. No dia 7 após a adição de DSS na água potável, os camundongos foram sacrificados e dois cólons foram colhidos para medir vários parâmetros de inflamação: classificação macroscópica, espessura do intestino, atividade mieloperoxidase (MPO), atividade proteolítica, expressão de citocinas. Medição de parâmetros inflamatórios
[080] O dano macroscópico foi avaliado como descrito anteriormente (5'15'16). Brevemente, quando observados, os seguintes parâmetros receberam uma pontuação de 1 : hemorragia, edema, estenose, ulceração, sangue fecal, muco e diarreia. O eritema marcou um máximo de 2, dependendo do comprimento da área que está sendo afetada (0: ausente, 1 : menos de 1 cm, 2 : mais de 1 cm). A adesão foi marcada com base em sua gravidade (0 : ausente, 1 : moderada, 2 : grave).
[081] MPO foi medido como um índice de infiltração de granulócitos, como descrito anteriormente (5'15'16), nos tecidos do cólon coletados no momento do sacrifício. Amostras de tecido foram homogeneizadas em uma solução de 0,5 % de brometo de hexadeciltrimetilamônio em tampão fosfato (pH 6) e centrifugado a 13.000 X G por 2 min. Sobrenadantes foram adicionados a um tampão contendo 1 % de peróxido de hidrogênio e O-dianisidina dihidro cloreto. Valores de densidade óptica da solução enzimática foram lidos por 2 min. a 450 nm.
[082] Para medidas de proteína citocina e quemoquina, amostras colônicas congeladas coletadas no sacrifício foram homogeneizadas usando um politron de 30 s a 4°C em 500μ1 de tampão de lise celular (20mM Tris-Hcl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton X-100, 2.5 mM pirofosfato de sódio, beta-glicerofosfato de ImM, 1 mM Na3V04, 1 μg/ml leupeptina; Cell Signalling, Sigma) suplementado com coquetel anti-proteases (Roche Diagnostics, Meylan, França). Após a centrifugação (10.000Xg, 10 min, 4°C), sobrenadantes foram filtrados em colunas QIAshredder (Qiagen, França) e cinquenta microlitros deste homogeneizado foram utilizados para a dosagem simultânea de citocinas e quimiocinas usando matriz de esfera citométrica no classificador de célula fluorescente FACSCalibur. Valores brutos foram normalizados para o peso do tecido (média de 30 a 50 mg) e concentrações de citocina foram inferidas a partir de curvas padrão com a ajuda do software FCAP Array®. Em conformidade com as informações do fabricante, foram considerados somente os valores acima do limite de detecção de citocinas. Atividade de protease serina em tecidos do cólon e lavagem luminal
[083] Como descrito anteriormente (17), após o sacrifício, foi extirpado todo o cólon e 1ml.
[084] PBS foi instilado e lavado duas vezes através do lúmen. Atividades proteolíticas (tripsina-semelhante e atividade da elastase) foram medidas naquelas lavagens luminais. Atividades tripsina e elastase-semelhantes foram medidas usando Tosil-Gly-Pro-Arg-nitroanilida (150 μM, Sigma) e MeO-sucini 1- Ala-Ala-Pro-Val-nitroanilida (100 μM, Sigma, Saint Quentin Fallavier, França) respectivamente como substratos. Amostras (20 μl para a atividade de tripsina ou 10 μl para atividade de elastase) foram ressuspensas em seu respectivo tampão : 100 nmM Tris/HCl, ImM CaCl2, pH=8 para a atividade de tripsina e 50 mM Tris- HCl, 500 mM NaCl, 0,1% Triton X100 para atividade de elastase. A mudança de absorbância a 405 nm foi determinada durante 30 minutos a 37 °C, com um leitor de microplaca NOVOstar™ (BMG Labtech, França). A atividade foi comparada com a diluição padrão conhecida de tripsina do pâncreas suíno (Sigma) ou elastase de neutrófilo humano (Sigma). A concentração de proteínas em lavagens luminais foi determinada usando a dosagem colorimétrica de ácido bicinchoninico em microplaca (BCA kit®, Pierce, Thermo Scientific, Courtaboeuf, França) e foi usada para padronizar a atividade proteolítica em cada amostra.
[085] Indução e medição dos comportamentos de dor visceral em resposta ao óleo de mostarda
[086] Culturas das três cepas L. lactis de (L. lactis wt, L. lactis-Elaim, L. lactis-lL- lO) foram realizadas em meio M17 (Oxoid) complementado com glicose (0,5%>) complementados com cloranfenicol (10 μg/mL) a 30°C sem agitação. Bactérias de culturas durante a noite foram cultivadas em meio fresco a 1/50 (p/p) até OD6oo=0.4 a 0,6. Bactérias, em seguida, foram cultivadas para mais um abeto com nisina (1 ng/mL), adicionadas para permitir a expressão da proteína recombinante. Bactérias foram coletadas por centrifugação a 450 g e lavadas com PBS esterilizado. As pelotas foram ressuspensas em PBS esterilizado com uma concentração final de 5x1010 cfu/mL. Grupos de 4 a 8 camundongos foram tratados diariamente com 100μl (5xl09 cfu) de suspensão bacteriana por administração intragástrica durante sete dias. No dia 8, os camundongos foram administrados com 50 μl de PBS ou óleo de mostarda (0,01% (p/p) em etanol 70%) por instilação intracolônica, executada sob anestesia ligeira com isoflurano. O número de respostas comportamentais relacionadas à dor (retrações abdominais, desconforto no abdômen, alongamento, e esmagamento do abdômen inferior contra o chão), em seguida, foram contados por 20 min. Estatísticas
[087] Foram feitas comparações entre grupos usando um teste t de Student de 2 caudas com correção de Bonferroni. Dados são expressos como média ± SEM, e um valor P menor que 0,05 foi considerado significativo. Resultados
[088] Lactococcus lactis recombinante que expressa elafina protege contra o desenvolvimento de colite DSS em camundongos.
[089] Como esperado, a colite induzida por DSS (5% DSS) causou a perda de peso severa em todos os grupos de camundongos em comparação aos camundongos de controle que beberam água. Nenhum dos tratamentos de bactérias lácticas modificou significativamente essa perda de peso (Fig. 1A). DSS na água potável também causou danos macroscópicos, espessura de parede maior e maior atividade MPO nos tecidos do cólon (Fig. 1 B, C, D). Camundongos que foram tratados com L. lactis tipo selvagem não mostraram diminuição significativa na espessura da parede do cólon e na atividade MPO, apenas uma ligeira diminuição na pontuação de dano macroscópico observou-se nesse grupo, em comparação com camundongos tratados somente com DSS. Em contraste, os camundongos tratados com L. lactis recombinante expressando elafina mostraram após a indução de colite DSS uma pontuação de dano significativamente reduzida macroscópico e menos aumento significativo na espessura da parede do cólon, mas a atividade MPO não foi diferente do grupo de DSS sozinho (Fig. 1, B, C, D). Além disso, camundongos tratados com L. lactis recombinante expressando citocinas IL-10 mostraram pontuação de dano macroscópico e atividade MPO reduzidas após a indução de colite DSS, mas a espessura da parede não foi modificada por este tratamento, em comparação DSS sozinho (Fig. 1, B, C, D). Em camundongos não-inflamados, nenhum dos tratamentos modificou os parâmetros inflamatórios comparados aos camundongos naive de controle.
[090] O aumento DSS-induzido na atividade tripsina-semelhante foi significativamente reduzido em camundongos tratados com L. lactis recombinante expressando elafina, mas não foi alterado em camundongos tratados com L. lactis tipo selvagem ou L. lactis recombinante expressando IL-10 (Fig. 2A). O tratamento só com L. lactis recombinante expressando elafina foi capaz de reduzir significativamente o aumento DSS-induzido na atividade da elastase (Fig. 2B).
[091] Lactobacillus casei recombinante expressando qualquer elafina protege contra o desenvolvimento de colite DSS em camundongos.
[092] Embora o tratamento de camundongos com Lb. casei tipo selvagem tenha reduzido significativamente as pontuações macroscópicas observadas após a indução de colite DSS, este tratamento não conseguiu reduzir a espessura da parede e atividade MPO maiores em comparação com DSS sozinho (Fig. 3 A, B, C). Por outro lado, tratamentos com Lb. casei recombinante expressando elafina reduziu significativamente todos os parâmetros de inflamação: pontuação de dano macroscópico, espessura da parede do cólon e atividade MPO (Fig. 3A, B, C).
[093] O aumento DSS-induzido na atividade tripsina-semelhante foi significativamente reduzido em camundongos tratados com Lb. casei recombinante expressando elafina, em comparação com camundongos tratados com Lb. casei tipo selvagem (Fig. 4A). O nível de atividade da elastase foi também significativamente reduzido em camundongos com colite (DSS) tratados com Lb. casei recombinante expressando elafina, em comparação com camundongos inflamados (colite) tratados com Lb. casei tipo selvagem, ou mesmo em comparação com camundongos inflamados tratados com PBS (Fig. 4B).
[094] A expressão de proteína do quemoquina RANTES não foi aumentada significativamente pela colite DSS no ponto de observado (7 dias após o início do tratamento de DSS). Lb. casei tipo selvagem ou secretor de elafina não conseguiu modificar o nível de expressão de RANTES nos camundongos tratados com DSS (Fig. 5 A). TNFa, IL-6, MCPl , KC, INFy e IL-17A foram significativamente aumentados por colite DSS, 7 dias após a indução (Fig. 5B a G). O tratamento de camundongos com Lb. casei recombinante expressando elafina reduziu significativamente a expressão de proteínas de IL-6, MCPl, KC e IL-17 (Fig. 5C, D, E, G), mas não conseguiu reduzir o nível de expressão de outras citocinas pró- inflamatórias, tais como TNFa e INFy (Fig. 5B e F). Curiosamente, enquanto colite DSS não causou qualquer aumento de citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 (Fig. 6 A a E), o tratamento de camundongos com Lb. casei recombinante para elafina aumentou significativamente a expressão dessas citocinas, mas apenas em um contexto de colite (após o tratamento de DSS). Este aumento de citocinas Th2 em resposta ao Lb. casei recombinante para elafina poderia explicar, pelo menos em parte, os efeitos anti-inflamatórios desta bactéria recombinante. Os níveis de IL2, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 não foram modificados por qualquer um dos outros tratamentos em camundongos não-inflamados ou inflamados (DSS) (Fig. 6 A a E).
[095] Lactococcus lactis recombinante para a expressão de elafina diminui o comportamento de dor visceral
[096] A administração intracolônica de óleo de mostarda causou um aumento significativo do número de comportamentos de dor: tanto o número de retrações abdominais quanto o número de comportamentos de dor integrados como desconforto, alongamento e esmagamento contra o chão (Fig. 7 e B). Considerando todos os comportamentos juntos, o tratamento com IL-10 recombinante tipo selvagem ou L. lactis secretor de elafina não teve efeito (Fig. 7A). Ao considerar apenas os comportamentos de dor integrados, L. lactis elafina- , mas não IL-10- recombinante ou tipo selvagem reduziu significativamente o número de comportamentos de dor (Fig. 7B). Além disso, apenas L. lactis recombinante que expressa elafina induziu uma notável diminuição do número de comportamentos de dor em comparação com o tratamento de PBS ou com o tratamento de L. lactis tipo selvagem (Fig. 7B). Resultados com cepa htrA
[097] L. lactis expressa somente uma protease extracelular de manutenção chamada htrA, que degrada todas as proteínas exportadas desdobradas (Poquet et al, 2000 e pedidos de patente US 6.994.997 e FR2787810). Uma cepa L. lactis mutante inativada no htrA gene foi construída e deixada aumentar a taxa de produção de várias proteínas heterólogas secretadas em L. lactis (Poquet et al, 2000 e Miyoshi et al, 2002). De acordo com a invenção, o cassete de expressão de elafina foi clonado em mutante htrA. Níveis de produção de elafina em mutante htrA e a cepa tipo selvagem (wt) foram comparados por experimentos de Western blot (Fig. 8). Observou-se um aumento significativo de elafina secretada no sobrenadante do mutante htrA em comparação com a cepa wt. Assim, a cepa htrA irá permitir maior níveis de produção e secreção de elafina.
[098] Essas duas cepas foram então testadas no modelo de colite DSS-induzida e confirmamos in vivo que o mutante htrA protege os camundongos contra danos de colite melhor do que a cepa wt (Fig. 9 A, B e C). Resultados comparativos
[099] Os efeitos protetores de IL-10, superóxido dismutase (SOD) e cepas L. casei que produzem elafina foram avaliados em paralelo em modelo de colite DSS 5%-induzido. Deve-se lembrar que L. casei possui duas grandes diferenças em relação a L. lactis: i) maior persistência no GIT e ii) propriedades anti- inflamatórias intrínsecas (Rochat et al, 2007; Watterlot et al, 2010). Como mostrado na Fig. 10A/B/C, os melhores efeitos protetores sobre os três critérios (macroscópico, histológico e atividade MPO) são obtidos com cepa L. casei produtora de elafina, seguida de cepa L. casei produtora de SOD. A cepa L. casei produtora de IL-10 forneceu apenas fracos efeitos.
[0100] Além disso, L. casei produtor de elafina proporcionou uma melhor proteção do que as duas cepas L. lactis (cepa L. Lactis wt e htrA) (Fig. 11).
[0101] Estes resultados são mais surpreendentes, considerando o fato de que a elafina possui atividades antibacterianas in vitro e in vivo [Simpson AJ et al, 1999]. Assim, aquele versado na técnica esperaria uma produção fraca ou nula pelo hospedeiro da bactéria. Pelo contrário, os resultados obtidos pelos inventores mostram uma produção muito boa de elafina pelo probiótico e, portanto, um efeito terapêutico.
[0102] Além disso, estudos in vitro e in vivo (incluindo estudos clínicos) mostraram que a falta do escudo antimicrobiano hospedeiro é potencialmente deletéria em doenças do cólon [Salzman NH et al, 2003 e Bevins CL et al, 2009].
[0103] Assim, a atividade pleiotrópica anti-microbialanti-inflamatória de elafina a torna uma molécula terapêutica candidata muito boa em comparação com IL-10.
[0104] Indução EDTA da expressão de Promotor Zinco (PZn) zitR- controlada em L. lactis.
[0105] A produção de elafina em L. lactis impulsionada por PZn zitR [Llull D e Poquet I. 2004] foi testada por análise Western blot após 1 h de indução com 1 mM de EDTA. Amostras de culturas não-induzidas, pellet celular (C) e sobrenadante (S), produzem níveis muito baixos de produção e secreção de elafina, enquanto culturas induzidas resultam em níveis mais altos de expressão e secreção (Fig. 12). REFERÊNCIAS:
[0106] Em todo este pedido, várias referências descrevem o estado da técnica para que esta invenção pertence. As divulgações dessas referências são incorporadas por referência à presente divulgação.
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Claims (7)
1. Bactéria de ácido lático recombinante de grau alimentício, caracterizada pelo fato de que compreende um gene recombinante que codifica para a proteína elafina ou uma fração ativa da proteína elafina.
2. Bactéria de ácido lático recombinante de grau alimentício, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a bactéria de ácido lático compreende um gene defeituoso auxotrófico, pelo qual a sobrevivência da dita bactéria de ácido lático é estritamente dependente da presença de compostos específicos.
3. Bactéria de ácido lático recombinante de grau alimentício, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o gene defeituoso auxotrófico é thyA.
4. Bactéria de ácido lático recombinante de grau alimentício, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o gene selecionado é inserido no lugar do gene defeituoso auxotrófico.
5. Bactéria de ácido lático recombinante de grau alimentício, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir de Bifidobacterium, Lactococcus lactis ou Lactobacillus.
6. Bactéria de ácido lático recombinante de grau alimentício, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir de Lactococcus lactis htrA, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum e Bifidobacterium longum.
7. Composição terapêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma bactéria de ácido lático recombinante de grau alimentício, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
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