JPH10127292A

JPH10127292A - エラフィン類発現ベクターおよびこれを利用したエラフィン類の製造法

Info

Publication number: JPH10127292A
Application number: JP8304233A
Authority: JP
Inventors: Mitsue Taniyama; 光恵谷山; Takashi Yamamoto; 剛史山本; Noriyuki Okawa; 則行大川; 誠 ▲図▼師; Makoto Zushi
Original assignee: Tsumura and Co
Current assignee: Tsumura and Co
Priority date: 1996-10-31
Filing date: 1996-10-31
Publication date: 1998-05-19

Abstract

(57)【要約】【課題】高価で、実質的に医薬品として利用すること
が困難なエラフィン類を経済的に、しかも簡単な手段で
製造すること。【解決手段】エラフィン類をコードする遺伝子とアル
コールオキシダーゼ１調節領域をコードする遺伝子を含
み、エラフィン類をコードする遺伝子の発現がアルコー
ルオキシダーゼ１調節領域をコードする遺伝子によって
制御されることを特徴とするエラフィン類発現ベクタ
ー。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、天然型エラフィン
またはその誘導体等のエラフィン類を有利に発現させる
ためのベクターおよびこれを利用したエラフィン類の製
造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｏ.ウィドウ（O. Wiedow）らにより、乾
癬患者からエラスターゼに特異的な阻害活性を有する物
質として、エラフィンが単離され、そのアミノ酸配列が
報告されている［J. Biol. Chem. 265,14791(1990) 及
び J. Biol. Chem. 266,3356(1991);特開平３−１４８
２９９号］。また、このエラフィンを化学合成したこ
とも報告されている［Biochem. Biophys. Res. Commun.
(1992) 185,967］。

【０００３】しかしながら、上記の天然型エラフィンは
その構造上活性酸素により影響を受けやすく、酸化によ
り活性が著しく低下することが知られている。特にエラ
スターゼは好中球により分泌されるものであるが、過剰
なエラスターゼは組織障害を惹き起こすと考えられ、同
時に好中球から大量の活性酸素が放出されるため、エラ
スターゼ阻害剤として利用するためには、酸化に対して
安定であることが望まれる。そこで、酸化に対して安定
なエラフィン誘導体が開発された（特願平４−２３４０
８５号公報；ＷＯ９４／０４６９７号公報）。

【０００４】これらのエラフィン類は、エラスターゼに
特異的な阻害剤として優れた化合物であり臨床での応用
が検討されているが、その生産性に問題があった。即
ち、エラフィン類のようなペプチドは現在、主に遺伝子
組換え技術によって生産されているが、例えばエラフィ
ン類を大腸菌を宿主として生産する場合、発現量は多い
ものの、薬理効果を有する活性型エラフィンは得られて
いなかった。また、酵母を宿主とした場合、従来技術で
はその発現量が極めて少ないために生産効率が悪く、実
際の治療に必要な量のエラフィン類を確保するのが困難
であり、その価格も極めて高くなるという問題があっ
た。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、現在高価
で、実質的に医薬品として利用することが困難なエラフ
ィン類を経済的に、しかも簡単な手段で製造することを
目的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、エラフィ
ン類を臨床で使用するため、その発現量を飛躍的に増加
させるべく鋭意研究を行った。そしてその結果、特定
のベクターおよび宿主微生物を利用すれば、従来極めて
わずかしか発現しなかったエラフィン類が効率よく発現
することを見出し本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明の目的は、エラフィン類
をコードする遺伝子とアルコールオキシダーゼ１調節領
域をコードする遺伝子を含み、エラフィン類をコードす
る遺伝子の発現がアルコールオキシダーゼ１調節領域を
コードする遺伝子によって制御されることを特徴とする
エラフィン類発現ベクターを提供することである。

【０００８】また、本発明の他の目的は、次の（ｘ）〜
（ｚ）、（ｘ）アルコールオキシダーゼ１遺伝子のプロ
モーター領域、（ｙ）エラフィン類をコードする遺伝
子、（ｚ）転写終結領域をこの配列順序で含むＤＮＡ断
片を提供することである。

【０００９】さらに、本発明の別の目的は、宿主微生物
を上記発現ベクターもしくはＤＮＡ断片で形質転換し、
これを培養することを特徴とするエラフィン類の製造法
を提供することである。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のエラフィン類発現ベクタ
ーは、少なくとも次の（ｘ）〜（ｚ）、（ｘ）アルコー
ルオキシダーゼ１遺伝子のプロモーター領域、（ｙ）エ
ラフィン類をコードする遺伝子、（ｚ）転写終結領域を
この配列順序で含むＤＮＡ断片を含むことが必要であ
る。

【００１１】エラフィン類遺伝子は、天然型エラフィン
であっても、天然型エラフィンを利用し、その一部を改
変したり、有機合成により全く人工的に製造された天然
型エラフィンに相同性の高いペプチドをコードする遺伝
子であってもよい。

【００１２】天然型エラフィンに相同性の高いペプチド
としては、例えば次の式（I）、 Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser- Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Xaa-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn- Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-Ile-Lys-Lys-Cys-Cys- Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Met-Ala-Cys-Phe-Val-Pro-Gln （I）（式中、Xaaはロイシン、イソロイシンまたはバリンを
示す）で表されるアミノ酸配列（配列番号：１）または
これと相同性を有するアミノ酸配列で表わされるエラフ
ィン誘導体を挙げることができる（ＷＯ９４／０４６９
７号公報）。

【００１３】アルコールオキシダーゼ１調節領域をコー
ドする遺伝子は、例えば、ＷＯ９０／１０６９７号公
報、特開昭６３−１６４８９１号等に開示されたものを
利用できる。

【００１４】エラフィン類遺伝子およびアルコールオキ
シダーゼ１調節遺伝子を含むベクターの構築は、公知の
プラスミド等を利用し、常法により遺伝子工学的手法を
用いて行うことができる。プラスミドとしては、例えば
ｐＰＩＣ９（インビトロゲン社製）等を利用することが
できる。

【００１５】本発明ベクターは、さらに少なくとも一種
類以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むことができ
る。これはエラフィン類遺伝子を組み込んだ微生物の分
離を容易にするためである。マーカー遺伝子は宿主微生
物が持っていない表現型（例えば、被形質転換宿主微生
物が特定アミノ酸の生合成経路に欠損を有する場合に、
その特定アミノ酸を生産する能力の回復）を宿主微生物
に与えるため、目的の微生物の分離が容易になる。

【００１６】マーカー遺伝子としては、公知のマーカー
遺伝子を利用することができるが、好ましいものとして
は、例えば、ＨＩＳ4、ＡＲＧ4、ＰＨＯ1、ゼオシン
（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性遺伝子等を挙げることができる。

【００１７】またさらに、エラフィン類の発現に際し、
菌体外にエラフィンを分泌するようにシグナルペプチド
遺伝子をエラフィン類遺伝子の前に付加することが、培
養物の分離精製上好ましい。

【００１８】シグナルペプチドとしては、公知のものを
選択、使用できるが、例えば、ＭＦα1を利用すること
がベクターの構築の際に便利であり、好ましい（ＷＯ９
４／０４６９７号公報)。

【００１９】このようにして得られたエラフィン類発現
ベクターは、常法に従いこれを用いて宿主微生物を形質
転換し、形質転換された（エラフィン類遺伝子が染色体
中に組み込まれた）微生物を適当な条件下で培養するこ
とにより、エラフィン類を製造することができる。

【００２０】本発明で有利に利用できる宿主微生物とし
て、例えばカンジダ（Candida）属、クロエケラ（Kloec
kera）属、サッカロミセス（Saccharomyces）属、シゾ
サッカロミセス（Schizosaccharomyces）属、ロドトル
ラ（Rhodotorula）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、ト
ルロプシス（Torulopsis）属、ピチア（Pichia）属、ク
ルイベロミセス（Kluyveromyces）属に含まれる酵母を
挙げることができる。これらの属に含まれる酵母はそれ
らの取り扱い上の安全性、増殖条件などがすでに確立さ
れてよく知られているものである。

【００２１】これらの中でも、エラフィン類の生産に好
適な酵母として、炭素栄養源としてのメタノール上で生
育し得る酵母、例えばカンジダ（Candida）属、クロエ
ケラ（Kloeckera）属、サッカロミセス（Saccharomyce
s）属、ロドトルラ（Rhodotorula）属、ハンセヌラ（Ha
nsenula）属、トルロプシス（Torulopsis）属、ピチア
（Pichia）属に属する酵母を用いることが好ましい。

【００２２】また、アルコールオキシダーゼ１遺伝子の
発現は、非カタボライト抑制炭素源上での増殖ならびに
炭素源欠乏の条件により誘導されるので、例えば、グル
コース、アセテート、グリセロール、エタノール、ラク
トース、ガラクトース、フルクトース、シュークロース
等のような非メタノール基質上で生育し得る酵母も本発
明の実施において有用である。

【００２３】本発明において、特に好適な宿主酵母菌株
は、例えばヒスチジンの生産能力を欠損した突然変異株
ピチア・パストリス（Pichia pastoris）ＧＳ１１５株
である。ＧＳ１１５株はヒスチジノールデヒドロゲナー
ゼコード遺伝子に影響を与えるヒスチジン合成経路の欠
損の結果として、突然変異遺伝子型ｈｉｓ４を持つヒス
チジン栄養要求変異株である。この宿主を、ＨＩＳ４
遺伝子機能をコードする配列を含むベクターで形質転換
すると、容易に形質転換宿主を選択することができる。

【００２４】本発明の実施において特に好適な他の酵母
菌株は、例えば突然変異株ピチア・パストリス（Pichia
pastoris）ＧＳ１９０である。この菌株はアルギニノ
コハク酸リアーゼコード遺伝子に影響を与えるアルギニ
ン合成経路が欠損した突然変異株である。さらに別の
好適な宿主菌株は、例えば、ヒスチジンとアルギニンの
両方の合成系路が欠損した二重栄養要求変異株ＰＰＦ１
である。ＰＰＦ１はヒスチジノールデヒドロゲナーゼコ
ード遺伝子に影響するヒスチジン合成系路と、アルギニ
ノコハク酸リアーゼコード遺伝子に影響するアルギニン
合成系路の両方が欠損している。

【００２５】好ましい形質転換方法としては、例えば、
組み込み形質転換法（integrativetransformation）、
一時的形質転換法（trangent transformation）等を挙
げることができる。

【００２６】上記の形質転換法のなかでも、特に組み込
み形質転換法を用いることが好ましい。宿主微生物への
組み込み形質転換を行う場合には、次の（ａ）〜
（ｈ）、（ａ）宿主微生物のゲノムＤＮＡの一部に相同な第一の
領域、（ｂ）アルコールオキシダーゼ１遺伝子のプロモーター
領域、（ｃ）シグナルペプチドをコードする遺伝子（ｄ）成熟型エラフィン類が分泌可能な様設計されたリ
ンカー（ｅ）エラフィン類をコードする遺伝子、（ｆ）選択マーカー遺伝子（ｇ）転写終結領域（ｈ）宿主微生物のゲノムＤＮＡの一部に相同な第二の
領域、をこの配列順序で含む、組み込み形質転換用ＤＮ
Ａ断片を用いることが好ましい。

【００２７】この組み込み形質転換用ＤＮＡ断片は、
（ａ）〜（ｈ）をこの配列順序で含む部位特異的組み込
みベクターを常法により構築し、これを適当な制限酵素
を用いて消化することにより得られる。なお、（ｄ）
のリンカーとしては、例えば次の塩基配列で示されるリ
ンカーが挙げられる。 5’ TC GAG AAA AGA GCT CAA GAA CCA AAG G 3’ 3’ C TTT TCT CGA GTT CTT GGT TTC CCA G 5’

【００２８】組み込み形質転換用ＤＮＡ断片は、（ｂ）
〜（ｇ）からなる発現カセットが宿主微生物のゲノムＤ
ＮＡの一部に相同な第一領域の３'末端と第二の領域の
５'末端の間に位置づけられるように連続して配置さ
れ、ＤＮＡの線状フラグメントを形成する。宿主微生
物のゲノムＤＮＡの一部に相同な第一及び第二の領域
は、それぞれ宿主微生物のゲノムＤＮＡの一部に相同な
ヌクレオチドを有する。例えばピチア・パストリスの場
合は、第一および第二の領域は、それぞれ少なくとも約
６５０ヌクレオチドである。また、第一および第二の
領域は、それらが宿主微生物のゲノム内での方向と同じ
になるように、その連続配置された線状フラグメント内
で互いに対して方向づけられている。

【００２９】組み込みＤＮＡ形質転換を行う場合は、一
般に酵母の細胞壁を酵素により処理をしてスフェロプラ
ストを形成させる。そのスフェロプラストを、例えば
ポリエチレングリコールのようなポリアルコールの存在
下で組み込み用ＤＮＡと接触させる。その後スフェロプ
ラストの細胞壁を再生させ、そして選択マーカー遺伝子
の発現を必要とする条件にさらすことにより形質転換酵
母細胞を選択する。

【００３０】形質転換体の培養は常法に従って行うこと
ができ、例えば、ＢＭＧＹ培地、ＦＭ２１−ＰＴＭ１−
グリセロール培地、５×ＢＡＳＡＬ・ＳＡＬＴ−ＰＴＭ
１−グリセロール培地等を利用することができる。

【００３１】本発明における形質転換微生物によるエラ
フィン類発現の調節は、適当な誘導条件下、または非誘
導条件下で形質転換株を生育させることにより達成され
る。例えば、エラフィン類の遺伝子発現は、形質転換微
生物をメタノールを含む培地上で生育させることにより
達成される。特に高いエラフィン類の発現を得るため
には、炭素エネルギー源としてメタノールを含む培地で
生育させることが好ましい。具体的には、例えば、培
地１リットルあたりメタノールを、約１０ｍｌ／時間
で、４８時間添加することにより達成される。

【００３２】エラフィン類遺伝子の発現を達成する別の
方法は、形質転換微生物を炭素飢餓にさせることであ
る。種々のカタボライト抑制（例えばエタノール、グ
ルコース、フルクトース等）および非カタボライト抑制
炭素源上で増殖させた後の炭素源飢餓は、アルコールオ
キシダーゼ１遺伝子の調節領域の支配下にあるエラフィ
ン遺伝子の発現を誘導する。

【００３３】エラフィン類遺伝子の発現を誘導するさら
に別の方法は、形質転換微生物を非カタボライト抑制、
非メタノール性炭素源（例えばグリセロール、ガラクト
ース等）を含む培地上で生育させることである。

【００３４】培養により得られたエラフィン類の分離精
製は、常法に従って行うことができ、例えば、培養液を
遠心分離して上清を得、この上清を硫安分画、透析、イ
オン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、アフィニティクロマトグラフィー等の精製手段を組
み合わせる精製方法に附すことにより、実施される。

【００３５】次に、本発明発現ベクターの構築の好まし
い一例を図面に基づき説明する。図１はｐＰＩＣ９／
ｎＥｌａｆｉｎの構築手順を示す図面である。ｐＡＭ
ＥＬＦ１８Ｒは、ＡＤＨ２プロモーターの下流にＭＦ
α1シグナルペプチド遺伝子及びその下流に天然型エラ
フィン遺伝子が組み込まれたベクターである。このも
のを制限酵素ＡｖａIIとＥｃｏＲIで消化してエラフィ
ン遺伝子の部分断片を精製する。

【００３６】また、ｐＰＩＣ９は、ピチア酵母のアル
コールオキシダーゼ１遺伝子（ＡＯＸ１）の挿入可能領
域とＭＦα1シグナルペプチド遺伝子及び選択マーカー
としてヒスチジンの合成に影響を及ぼすＨＩＳ４遺伝子
を含むバイナリーベクターである。

【００３７】ｐＰＩＣ９のＭＦα1のシグナル遺伝子部
分でクローニング可能なサイトは、ＳｎａＢI、Ｅｃｏ
ＲI、ＡｖｒII、ＮｏｔIであるが、これらを利用するこ
とにより、目的となるタンパク質のＮ末端に余分なアミ
ノ酸が付加される。これを防ぐために、シグナル切断
部分（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）より上流にあるＸｈｏIサイト
で消化し、シグナル切断部分と成熟型エラフィン類の直
結可能なリンカーを作成し、ｐＰＩＣ９／ｎＥｌａｆｉ
ｎを作成した。

【００３８】図２は、ｐＰＩＣ９／ＥＬＦ２５Ｌの構築
手順を示す図面である。ｐＹＥＬＦ２５Ｌは２５Ｌエ
ラフィン遺伝子を含むベクターであり、制限酵素Ａｖａ
IIとＥｃｏＲIで消化する。一方、ｐＰＩＣ９／ｎＥｌ
ａｆｉｎ（図１）をＮｓｉIとＥｃｏＲI で処理し、ア
ンピシリン耐性遺伝子を含む大断片を精製する。同様
にｐＰＩＣ９／ｎＥｌａｆｉｎをＮｓｉIとＡｖａIIで
処理し、３断片をライゲーションし、ｐＰＩＣ９／ＥＬ
Ｆ２５Ｌを構築する。

【００３９】図１または図２に示したベクターの増幅は
常法により、大腸菌を培養し、精製することで得られ
る。このベクターをそれぞれ、制限酵素ＢｇｌIIで消
化することにより、本発明ＤＮＡ断片を得る。

【００４０】図３は、ピチア・パストリスへのエラフィ
ン類遺伝子の導入を示す。得られたＤＮＡ断片、ＡＯ
Ｘ１５'−Ｅｌａｆｉｎ−Ｈｉｓ４−ＡＯＸ１３'
（ここで、Ｅｌａｆｉｎは、天然型またはエラフィン２
５Ｌ遺伝子を示す）を用いて、ザイモリエイス（Zymoly
ase）で処理しスフェロプラストの状態になったピチア
・パストリス（Pichia pastoris）ＧＳ１１５を形質転
換する。染色体のＡＯＸ１遺伝子と相同な領域が組換
えを起こし、染色体上にエラフィンとＨＩＳ４遺伝子が
取り込まれる。取り込まれたクローンはヒスチジンを
合成することができ、ヒスチジンのない培地で生育する
ことにより、選択することができる。

【００４１】

【実施例】次に、実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるも
のでない。

【００４２】各実施例において用いた試薬及び培地組成
は以下のとおりである。［プラスミド構築用試薬］・ＴＢＥバッファー（１リットルあたり）トリス１０.８ｇほう酸５.５ｇ０.５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）４ｍｌ・合成ＤＮＡ溶出バッファー酢酸アンモニウム０.５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）１ｍＭ・ＴＥバッファートリス−塩酸（ｐＨ７.５）１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８.０）１ｍＭ・１０×ライゲーションバッファートリス−塩酸（ｐＨ７.６）６６０ｍＭ塩化マグネシウム６６ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）１００ｍＭＡＴＰ０.６６ｍＭ

【００４３】［スフェロプラスト調製および形質転換
用試薬］・ＳＥＤＳＥ１９ｍｌ１ＭＤＴＴ１ｍｌ・ＳＥ（ｐＨ８.０）ソルビトール１ＭＥＤＴＡ２５ｍＭ・ＳＣＥ（ｐＨ５.８）ソルビトール１ＭＥＤＴＡ１ｍＭクエン酸１０ｍＭ・ＣａＳソルビトール１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７.５）１０ｍＭ塩化カルシウム１０ｍＭ・ＰＥＧ／ＣａＴポリエチレングリコール３３５０２０％トリス−塩酸（ｐＨ７.５）１０ｍＭ塩化カルシウム１０ｍＭ・ＳＯＳソルビトール１ＭＹＰＤ３０％塩化カルシウム１０ｍＭ

【００４４】［培地］・ＬＢ（１リットルあたり）トリプトン１０ｇイーストエキストラクト５ｇ塩化ナトリウム５ｇ・ＹＰＤ（１リットルあたり）イーストエキストラクト１０ｇペプトン２０ｇＤ−グルコース２０ｇ・ＲＤ（１リットルあたり）ソルビトール１８６ｇＤ−グルコース２０ｇイーストニトロゲンベース１３.４ｇビオチン０.４ｍｇＬ−グルタミン酸５０ｍｇＬ−メチオニン５０ｍｇＬ−リジン５０ｍｇＬ−ロイシン５０ｍｇＬ−イソロイシン５０ｍｇ・ＢＭＧＹ（１リットルあたり）イーストエキストラクト１０ｇペプトン２０ｇリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６.０）０.１Ｍイーストニトロゲンベース１３.４ｇビオチン０.４ｍｇグリセロール１０ｍｌ・ＦＭ２１（１リットルあたり）リン酸３.５ｍｌ硫酸銅・２水和物０.１５ｇ硫酸カリウム２.３８ｇ硫酸マグネシウム・７水和物１.９５ｇ硫酸鉄・７水和物６５ｍｇ硫酸銅・５水和物６ｍｇ硫化亜鉛・７水和物２０ｍｇ硫酸マンガン・１水和物３ｍｇ水酸化カリウム０.６５ｇビオチン８２μｇ・ＰＴＭ１（１リットルあたり）硫酸銅・５水和物６ｇヨウ化カリウム８０ｍｇ硫酸マンガン・１水和物３ｇモリブデン酸ナトリウム０.２ｇほう酸２０ｍｇ塩化コバルト５００ｍｇ塩化亜鉛２０ｇ硫酸鉄・７水和物６５ｇビオチン０.２ｇ硫酸５ｍｌ・ＹＭＰＧ（１リットルあたり）イーストエキストラクト３ｇマルトエキストラクト３ｇペプトン５ｇグリセロール１０ｇ

【００４５】［エラスターゼアッセイ用試薬］・トリス−ＮａＣｌバッファートリス−塩酸（ｐＨ７.５）０.１Ｍ塩化ナトリウム０.５Ｍアジ化ナトリウム０.０１％

【００４６】実施例１プラスミドの構築：（１）オリゴヌクレオチドの合成１）パーキンエルマーアプライドシステムズ社製３８
０Ａを用いて以下の２種のＤＮＡを合成した。１. ピチア・エラフィン１（３０ｍｅｒ）:5' TC GAG A
AA AGA GCT CAA GAA CCA GTT AAA G 3' ２. ピチア・エラフィン２（２９ｍｅｒ）:5' G ACC CT
T AAC TGG TTC TTG AGC TCT TTT C 3'

【００４７】２）得られたピチア・エラフィン１お
よび２は、共に合成後８０×９０×１ｍｍの７Ｍウレ
ア−１５％アクリルアミドゲルを用い、ＴＢＥバッフ
ァー系中、３００Ｖで２時間電気泳動した。目的のバ
ンドを切り出し、溶出バッファーに一晩浸漬することに
より溶出した。その後ＮＡＰ−５カラム（ファルマ
シア社製）を通すことにより脱塩を行い精製品とした。

【００４８】３）上記２）にて精製したピチア・エ
ラフィン１および２について、ポリヌクレオチドカイネ
ース（東洋紡社製）を用いて５'側をリン酸化した。リ
ン酸化したピチア・エラフィン１および２を混合し、
６５℃で１０分間加熱し、徐々に室温に冷却することに
よってアニーリングを行なった。

【００４９】（２）天然型エラフィン構造遺伝子の回
収ｐＡＭＥＬＦ１８Ｒ（ＷＯ９４／０４６９７号公報を参
照）５.５μｇを、ＡｖａIIおよびＥｃｏＲI（宝酒造
社製）を用いて消化した。消化後のサンプルを２％低
融点アガロースにて電気泳動し、目的のバンド（１８２
塩基対）を切り出した。次いで、０.５％アガロース濃
度になるようにＴＥバッファーを加え、６５℃で１０分
間加熱してアガロースを融解させ、フェノール抽出、フ
ェノール・クロロホルム抽出、クロロホルム抽出を行な
ってアガロースを除去した。その後エタノール沈殿を
行い目的のＤＮＡ断片の回収を行なった。

【００５０】（３）ｐＰＩＣ９／ｎエラフィン（ｐＰ
ＩＣ９／ｎＥｌａｆｉｎ）の構築１）ｐＰＩＣ９（インビトロゲン社）４μｇ分を制限
酵素ＥｃｏＲIおよびＸｈｏIにて消化し、８,０００塩
基対の断片を回収した。得られたＤＮＡ５０nｇを用
い、以下のような反応系で１６℃、１８時間ライゲーシ
ョン反応を行なった。

【００５１】ｐＰＩＣ９ＥｃｏＲI−ＸｈｏI消化物５０ｎｇ分ピチア・エラフィン１および２０.６ｎｇ（アニーリングしたもの）エラフィン構造遺伝子ＡｖａII−ＥｃｏＲI消化物５ｎｇ１０×ライゲーションバッファー１μｌ１０ｍＭＡＴＰｓ１ｍＭＴ4 ＤＮＡライゲース（タカラ社製）０.５μｌ（計１０μｌ）

【００５２】２）ライゲーション反応液を大腸菌ＪＭ
１０９に形質転換し、アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含
むＬＢ寒天培地に植菌することにより形質転換体ＪＭ１
０９／ｐＰＩＣ９／ｎエラフィンを得た。ＪＭ１０９
／ｐＰＩＣ９／ｎエラフィンは、Ｔａｑサイクルシーケ
ンシングキット（Taq cycｌe sequencing kit ; アプラ
イドバイオシステムズ社）およびＤＮＡシークエンサ
ー３７０Ａ（アプライドバイオシステムズ社）を用いて
塩基配列を確認した。

【００５３】（４）ｐＰＩＣ９／エラフィン２５Ｌ
（ｐＰＩＣ９／ＥＬＦ２５Ｌ）の構築１）ｐＰＩＣ９／ｎエラフィンをＮｓｉIおよびＥｃｏ
ＲIで消化し、１.５％アガロースで電気泳動して約７,
０００塩基対の断片（）および約８００塩基対断片を
回収した。８００塩基対断片をさらにＡｖａIIで切断
し、１.５％アガロースで電気泳動して約５００塩基対
の断片を回収した（）。

【００５４】２）ｐＹＥＬＦ２５Ｌ（ＷＯ９４／０４
６９７号公報）をＡｖａIIで消化し、１.５％アガロー
スに電気泳動して２,０００塩基対断片を回収した。そ
の後、ＥｃｏＲI で消化し、１.５％アガロースで電気
泳動して７００塩基対断片を回収した（）。

【００５５】３）得られた、およびをＴ4ＤＮ
Ａライゲース（宝酒造社製）にて結合し、大腸菌ＨＢ
１０１に形質転換してＨＢ１０１／ｐＰＩＣ９／ＥＬＦ
２５Ｌとした。ＤＮＡの確認は、制限酵素にて消化
し、予想される断片が確認されるかどうかで判断した。

【００５６】（５）上記（１）〜（４）の操作で得られ
た本発明エラフィン類発現ベクターｐＰＩＣ９／ｎエラ
フィンおよびｐＰＩＣ９／ＥＬＦ２５Ｌの塩基配列決定
のストラテジーは図４に示すとおりである。図中、線で
囲んだ部分は、合成ＤＮＡピチア・エラフィン１および
２を示し、アミノ酸をイタリックで表記した部分はシグ
ナル配列を示す。また、][は、プロセッシングを受け
る部位を示す。ｐＰＩＣ９／ｎエラフィンとｐＰＩＣ９
／ＥＬＦ２５Ｌとの相違は、４０３〜４０５位のみであ
った（上段：ｐＰＩＣ９／ＥＬＦ２５Ｌ、下段：ｐＰＩ
Ｃ９／ｎエラフィン）。さらに、本発明エラフィン類発
現ベクターｐＰＩＣ９／ＥＬＦ２５Ｌの全塩基配列を配
列表（配列番号：２）に示す。

【００５７】実施例２ピチア・パストリスを用いた天然型エラフィンおよびエ
ラフィン２５Ｌ遺伝子の発現：（１）ピチア・パストリスの形質転換（天然型エラフィ
ン）１）ＪＭ１０９／ｐＰＩＣ９／ｎエラフィンを５０μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌＬＢ培地に
て培養し、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドｐＰＩ
Ｃ９／ｎエラフィンを回収した。得られたｐＰＩＣ９
／ｎエラフィンをＢｇｌIIで消化し、０.７％アガロー
スで電気泳動し、約６,０００塩基対の断片を回収し
た。

【００５８】２）ピチア・パストリスＧＳ１１５はイ
ンビトロゲン社より入手した。ＧＳ１１５を１００ｍ
ｌＹＰＤ培地にて、３０℃で２４時間培養した。培
養液５μｌを再度１００ｍｌＹＰＤ培地に植菌し、３
０℃でＯ.Ｄ.６００が０.２〜０.３になるまで培養し
た。培養液を１,５００×ｇで１０分間遠心分離し、
菌体を回収した。菌体は２０ｍｌの滅菌水処理、２０
ｍｌのＳＥＤ処理、２０ｍｌの１Ｍソルビトール処理
を行なった。各処理ごとに菌体懸濁液は１,５００×ｇ
で１０分間遠心分離を行い、１Ｍソルビトール処理後
の菌体に２０ｍｌＳＣＥ液を加え懸濁後、２.２５μ
ｇ／ｍｌ濃度になるようにザイモリエイス（インビトロ
ゲン社製）を加え、３０℃で８分間静置後、７５０×
ｇ、１０分間遠心分離し菌体を回収した。以後各処理
ごとの遠心分離は、７５０×ｇ、１０分間とした。続い
て２０ｍｌの１Ｍソルビトール処理、２０ｍｌのＣａ
Ｓ処理を行い、最終的に１.２ｍｌのＣａＳに懸濁し、
スフェロプラストとした。

【００５９】３）上記２）のスフェロプラスト１０
０μｌに、１）で得たＤＮＡ断片１０μｇ分を加え、
室温にて１０分間放置した。１ｍｌＰＥＧ／ＣａＴを
加え、さらに１０分間放置後７５０ｇで１０分間遠心分
離した。上清を除去し、１５０μｌのＳＯＳバッファ
ーに懸濁し、室温で２０分間放置後、８５０μｌの１Ｍ
ソルビトールを加え、その２００μｌ量を１％寒天の
入ったＲＤ培地と混合し、２％ＲＤ寒天培地上に上層
した。寒天が凝固した後、３０℃で６日間の培養を行
い、形質転換体を得、ＰＩＣ／ｎエラフィンライブラ
リーとした。

【００６０】４）５ｍｌのＢＭＧＹ培地に、ＲＤ寒天
培地上に生育したコロニーを植菌し、３０℃で４８時間
培養した。その後、最終濃度０.５％になるようにメ
タノールを添加し、さらに４８時間培養した。培養液
各１ｍｌをエッペンドルフチューブに移し、１５,００
０rpｍ（１５,０００×ｇ）で５分間遠心して上清を回
収し、エラスターゼ阻害活性を測定した。

【００６１】（２）ピチア・パストリスの形質転換
（エラフィン２５Ｌ）上記（１）のピチア・パストリスの形質転換（天然型エ
ラフィン）に準じて行い、形質転換体ＰＩＣ／ＥＬＦ２
５Ｌライブラリーを得た。

【００６２】（３）エラスターゼ阻害活性の測定１）化学合成もしくはサッカロマイセスセレビジエを
用いて生合成させたヒト天然型エラフィンまたはエラフ
ィン２５Ｌ（ペプチド研究所、ＷＯ９４／０４６９７
号公報）それぞれ１ｍｇ／ｍｌをＢＭＧＹ培地、ＦＭ２
１培地またはＴｒｉｓ−ＮａＣｌバッファーを用いて１
０〜０.０１μｇ／ｍｌ濃度に希釈した。

【００６３】各サンプル１０μｌを９６穴マイクロタイ
タープレート（コーニング社製）にいれ、０.１Ｍトリ
ス−塩酸（ｐＨ７.５）、０.０１％アジ化ナトリウム
および１％１−メチル−２−ピロリジノンを含む０.
２ｍＭＮ−メトキシ−サクシニル−アラニン−アラニ
ン−プロリン−バリン−パラニトロアニリド溶液１０
０μｌと混合した。次いで、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌバッ
ファーにて溶解した０.００５ｍｇ／ｍｌヒトエラスタ
ーゼ（喀痰由来・８７５ｕ／ｍｇエラスチンプロダク
ツ社製）１０μｌを加え、３７℃で３０分間反応後、４
Ｎ酢酸溶液５０μｌを加え反応を停止した。各反応液
の４０５ｎｍの吸光度を測定した。

【００６４】２）上記（１）および（２）で得られた
培養上清を、ＢＭＧＹ培地、ＦＭ２１培地またはＴｒｉ
ｓ−ＮａＣｌバッファーを用いて適当に希釈した。各
サンプル１０μｌを１）の方法と同様に反応させて吸
光度を測定した。１）より求めた検量線をもとに培養
上清中のエラフィン類の含量を定量した。この結果を
表１に示す。

【００６５】

【表１】（単位：ｍｇ／ｌ）

【００６６】実施例３エラフィン類の製造：（１）天然型エラフィンおよびエラフィン２５Ｌ高
発現菌の培養（その１）１）１００ｍｌＹＭＰＧ培地に、ＰＩＣ／ｎエラフィ
ンまたはＰＩＣ／ＥＬＦ２５Ｌを植菌し、１０００ｍ
ｌ三角フラスコ（羽付き）中で、３０℃、３５０ｒｐ
ｍ、４８時間の条件で培養した。培養液１０ｍｌを１
００ｍｌＹＭＰＧ培地に再度植菌し、２４時間培養
後、６０ｍｌを６００ｍｌのＦＭ２１−１０％グリセロ
ール−２.４ｍｌＰＴＭ１培地に植菌し、０.０１％濃
度になるようにポリエーテルポリオール（武田薬品工業
社製）を加え１リットルジャーファーメンター（エイ
ブル社製）にて培養した。培養条件は３０℃、１,０
００ｒｐｍ、２ｖｖｍで２０時間とし、培養中のｐＨ
は２０％水酸化アンモニウムにて４.４に調節した。培
養終了まで温度、ｐＨ、溶存酸素量を測定した。

【００６７】２）その後９８.８％メタノール−１.２
％ＰＴＭ１を培養液中に添加した。添加は、０.９ｍ
ｌ／ｈで２時間、その後９０分ごとに０.６ｍｌ／ｈず
つ添加量を増加させてゆき、最終的に６.６ｍｌ／ｈと
した。メタノール添加中のｐＨは、２０％水酸化アン
モニウムにて５.９に調整した。培養はメタノールを加
えてから９６時間で終了した。

【００６８】（２）エラフィンおよびエラフィン２５
Ｌ高発現菌の培養（その２）５０ｍｌのＢＭＧＹ培地に、ＰＩＣ／ｎエラフィンま
たはＰＩＣ／ＥＬＦ２５Ｌを植菌し、３０℃で４８時
間培養した。６ｍｌの培養液を６００ｍｌのＢＭＧＹ
培地に植菌し、１リットルジャーファーメンター（エ
イブル社製）で３０℃、１,０００ｒｐｍ、２ｖｖｍで
４８時間培養した。その後、培養液中に最終濃度０.５
％になるようにメタノールを添加し、さらに９６時間培
養を行なった。培養終了まで温度、ｐＨ、溶存酸素量
を測定した。

【００６９】（３）エラフィンおよびエラフィン２５
Ｌ高発現菌の培養（その３）１）１００ｍｌのＹＭＰＧ培地に、ＰＩＣ／ｎエラフ
ィンまたはＰＩＣ／ＥＬＦ２５Ｌを植菌し、５００ｍ
ｌ三角フラスコ中で３０℃、４８時間培養した。培養
液６０ｍｌを６００ｍｌＹＭＰＧ培地に再度植菌し、２
４時間培養後、６００ｍｌを６リットルのＦＭ２１−１
０％グリセロール−２.４ｍｌＰＴＭ１培地に植菌
し、０.０１％濃度になるようにポリエーテルポリオー
ル（武田薬品工業社製）を加え、１０リットルジャー
ファーメンター（エイブル社製）にて培養した。培養
条件は３０℃、６００ｒｐｍ、２ｖｖｍで２０時間と
し、培養中のｐＨは２０％水酸化アンモニウムにて４.
４に調節した。培養終了まで温度、ｐＨ、溶存酸素量
を測定した。

【００７０】２）その後、９８.８％メタノール−１.
２％ＰＴＭ１を培養液中に添加した。添加は９ｍｌ
／ｈで２時間、その後９０分ごとに６ｍｌ／ｈずつ添加
量を増加させてゆき、最終的に６６ｍｌ／ｈとした。
メタノール添加中のｐＨは、２０％水酸化アンモニウム
にてｐＨ５.９に調整した。培養はメタノールを加えて
から９６時間で終了した。

【００７１】（４）エラフィンおよびエラフィン２５
Ｌ高発現菌の培養（その４）６００ｍｌのＢＭＧＹ培地にＰＩＣ／ｎエラフィンまた
はＰＩＣ／ＥＬＦ２５Ｌを植菌し、３０℃で４８時間
培養した。６００ｍｌ培養液を６リットルの１０％グ
リセロール添加ＢＭＧＹ培地に植菌し、１０リットル
ジャーファーメンター（エイブル社）で３０℃、６００
ｒｐｍ、２ｖｖｍで４８時間培養した。その後培養液中
に、９８.８％メタノール−１.２％ＰＴＭ１を６０ｍ
ｌ／ｈで添加し、さらに４８時間培養を行なった。培
養中のｐＨは、２０％水酸化アンモニウムを用いて５.
９に調整した。培養終了まで温度、ｐＨ、溶存酸素量
を測定した。

【００７２】（５）天然型エラフィンおよびエラフィン
２５Ｌの精製（１）上記（１）〜（４）で得られた各培養上清は０.２２μ
ｍフィルター（ミリポア社製）により濾過を行い、残
留菌体などの除去を行なった。上清を１.５Ｍ硫酸アン
モニウム−４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.５）濃
度に調整し、２００ｍｌのフェニルセファロースＨＰ
（Phenyl Sepharose HP ; ファルマシア社製）による疎
水性相互作用クロマトグラフィーを行なった。カラム
はＸＫ−５０（ファルマシア社製）を利用し、流速は
５ｍｌ／ｍin とした。サンプルを添加後、１.５Ｍ硫
酸アンモニウム−４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.
５）を２,０００ｍｌ流し、未吸着のタンパク質を除去
した。その後、２,０００ｍｌの１.１２５Ｍ硫酸アン
モニウム−４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６.５）を
流し溶出を行なった。

【００７３】この溶出液に５００ｇの硫酸アンモニウム
を加え（最終濃度２.８Ｍ）、４℃にて１８時間撹拌
後、遠心（２２,２００ｇ, ４℃, １２０ｍin）により
沈澱を回収した。沈澱は８００ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ４.４）に懸濁し、陰イオン交換クロマ
トグラフィーによりさらに精製を行なった。担体は１
００ｍｌのＳセファロースＦＦ（S Sepharose FF; ファ
ルマシア社製）とし、ＸＫ−５０カラム（ファルマシ
ア社製）を用いた。流速は１０ｍｌ／ｍin に設定し
た。サンプルアプライ後、１,０００ｍｌの５０ｍＭ
酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４.４）にてカラムを洗浄
し、０〜０.５Ｍ塩化ナトリウム濃度までリニアグラデ
ィエントをかけた。活性の認められた部分（ピーク部
分）を回収し、ＹＭ１限外濾過膜（アミコン社製）を用
いて濃縮し、ハイロード１６／６０スーパーデックス
（HiLoad 16/60 Superdex ; ファルマシア社製）７５ｐ
ｇにてゲル濾過を行ないピーク部分を回収した。

【００７４】（６）天然型エラフィンおよびエラフィ
ン２５Ｌの精製（２）上記（１）〜（４）で得られた培養液に、１／１００量
の５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.０）を加えた。攪拌
後、培養液を直接ストリームライン５０ＨＰ（STREAMLI
NE50 HP；ファルマシア製）に上昇方向に４０００ｍｌ
／ｈでアプライし、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.
０）で洗浄後（４０００ｍｌ／ｈ）、５０ｍＭ酢酸ナト
リウム（ｐＨ４.０）−０.３Ｍ塩化ナトリウムを用い
て下降方向に溶出した。得られた溶出液に、１.５Ｍの
硫酸アンモニウムを加え、１５０ｍｌのポロスＨＰ２
（POROOS HP2；パーセプティブ社製）による疎水性相互
作用クロマトグラフィーを行った。カラムはＸＫ−５
０（ファルマシア社製）を用い、流速は３０ｍｌ／ｍｉ
ｎとした。

【００７５】サンプル添加後、１.５Ｍ硫酸アンモニウ
ム−５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４.０）を１５００
ｍｌ流し、未吸着のタンパク質を除去した。その後、
５００ｍｌの０.４５Ｍ硫酸アンモニウム−５０ｍＭ
酢酸ナトリウムを流し、溶出を行った。得られた溶出
液をＹＭ３限外濾過膜（アミコン社製）を用いて濃縮
し、ハイロード２６／６０スーパーデックス（Hi-Load
26/60 Superdex；ファルマシア社製）３０ｐｇを用いて
ゲル濾過を行ない、ピーク部分を回収した。

【００７６】試験例１供給サンプルの規格検定：実施例３で得られた、精製し
た天然型エラフィンおよびエラフィン２５Ｌは以下のよ
うな方法で規格検定を行なった。１）阻害活性の測定エラスターゼ阻害活性の測定（その２）に準じた。２）タンパク質の定量および純度検定ａ）精製溶液５０μｌに等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ロー
ディングバッファーを混合し、１００℃で３分間処理し
熱変性を行なった。その後２０、１０、５、２.５、１
μｌづつ低分子量用ゲル（パジェル:アトー社製）にて
電気泳動を行いＣＢＢ法にて染色した。ｂ）１）および２）ａ）の方法よりタンパク質濃度を
予測し、約２μｇ分を５０μｌの精製水に混合した。
溶液をＣ１８カラム（ファルマシア社製）にアプライ
し、０.０８％トリフルオロ酢酸−アセトニトリル溶液
２０〜４０％の条件で溶出を行なった。溶出ピーク
の存在比を計算すると共にピーク面積よりタンパク質濃
度を求めた。

【００７７】［結果］以下の表２に、精製方法
（１）で得られた天然型および２５Ｌエラフィンの濃度
および純度を調べた結果を示す。

【００７８】

【表２】＊：合成エラフィン（ペプチド研究所）

【００７９】精製方法（１）での回収率は、全体の６
４.８％であった。これに対し、精製方法（２）は精製
方法（１）に比較し回収率が低い（約６０％）という結
果が得られたが、ｐＨ４.０にすることにより単位時間
当たりの処理量を増加させることができた。

【００８０】ＨＩＣ：エラフィン２５Ｌの回収率は８８.４％
であった。硫安沈澱：沈澱には約８８％（全体の７７.８％）の
エラフィン２５Ｌが回収された。Ｓ：０.１Ｍ塩化ナトリウム濃度付近で溶出があ
った。

【００８１】

【発明の効果】本発明によれば、従来２〜３ｍｇ／リ
ットルあるいはこれと同等の程度しか、活性型として
発現が得られなかった天然型エラフィンが、２５〜１０
０倍以上発現せしめることが可能になった。特に、本
発明者が先に開発した天然型エラフィンと高い相同性を
有するペプチド（ＷＯ９４／０４６９７号公報）をコー
ドする遺伝子をエラフィン構造遺伝子として利用すると
１００ｍｇ／リットルの高濃度で発現することが可能で
あった。従って、本発明はエラフィン類を工業的に有利
に製造し、臨床に使用する道を開くものであり、極めて
有用なものである。

【００８２】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：57 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴特徴を表す記号：Modified-site 存在位置：25 特徴を決定した方法：E 他の情報：Xaa ＝ロイシン、イソロイシンまたはバリン

【００８３】配列番号：２配列の長さ：8598 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：環状配列の種類：cDNA to mRNA 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：949..1374 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：949..1203 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：cleavage-site 存在位置：1203 特徴を決定した方法：E 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1204..1374 特徴を決定した方法：E 配列 AGATCTAACA TCCAAAGACG AAAGGTTGAA TGAAACCTTT TTGCCATCCG 50 ACATCCACAG GTCCATTCTC ACACATAAGT GCCAAACGCA ACAGGAGGGG 100 ATACACTAGC AGCAGACCGT TGCAAACGCA GGACCTCCAC TCCTCTTCTC 150 CTCAACACCC ACTTTTGCCA TCGAAAAACC AGCCCAGTTA TTGGGCTTGA 200 TTGGAGCTCG CTCATTCCAA TTCCTTCTAT TAGGCTACTA ACACCATGAC 250 TTTATTAGCC TGTCTATCCT GGCCCCCCTG GCGAGGTTCA TGTTTGTTTA 300 TTTCCGAATG CAACAAGCTC CGCATTACAC CCGAACATCA CTCCAGATGA 350 GGGCTTTCTG AGTGTGGGGT CAAATAGTTT CATGTTCCCC AAATGGCCCA 400 AAACTGACAG TTTAAACGCT GTCTTGGAAC CTAATATGAC AAAAGCGTGA 450 TCTCATCCAA GATGAACTAA GTTTGGTTCG TTGAAATGCT AACGGCCAGT 500 TGGTCAAAAA GAAACTTCCA AAAGTCGCCA TACCGTTTGT CTTGTTTGGT 550 ATTGATTGAC GAATGCTCAA AAATAATCTC ATTAATGCTT AGCGCAGTCT 600 CTCTATCGCT TCTGAACCCC GGTGCACCTG TGCCGAAACG CAAATGGGGA 650 AACACCCGCT TTTTGGATGA TTATGCATTG TCTCCACATT GTATGCTTCC 700 AAGATTCTGG TGGGAATACT GCTGATAGCC TAACGTTCAT GATCAAAATT 750 TAACTGTTCT AACCCCTACT TGACAGCAAT ATATAAACAG AAGGAAGCTG 800 CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT ACTTTCATAA 850 TTGCGACTGG TTCCAATTGA CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA 900 CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAGGA TCCAAACG 948 ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA GTT 978 Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val -85 -80 TTA TTC GCA GCA TCC TCC GCA TTA GCT GCT 1008 Leu Phe Ala Ala Ser Ser Ala Leu Ala Ala -75 -70 CCA GTC AAC ACT ACA ACA GAA GAT GAA ACG 1038 Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr -65 -60 GCA CAA ATT CCG GCT GAA GCT GTC ATC GGT 1068 Ala Gln Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly -55 -50 TAC TCA GAT TTA GAA GGG GAT TTC GAT GTT 1098 Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe Asp Val -45 -40 GCT GTT TTG CCA TTT TCC AAC AGC ACA AAT 1128 Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn -35 -30 AAC GGG TTA TTG TTT ATA AAT ACT ACT ATT 1158 Asn Gly Leu Leu Phe Ile Asn Thr Thr Ile -25 -20 GCC AGC ATT GCT GCT AAA GAA GAA GGG GTA 1188 Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val -15 -10 TCT CTC GAG AAA AGA GCT CAA GAA CCA GTT 1218 Ser Leu Glu Lys Arg Ala Gln Glu Pro Val -5 1 5 AAG GGT CCG GTG TCG ACC AAA CCG GGC TCT 1248 Lys Gly Pro Val Ser Thr Lys Pro Gly Ser 10 15 TGC CCG ATT ATC CTG ATC CGC TGC GCT TTG 1278 Cys Pro Ile Ile Leu Ile Arg Cys Ala Leu 20 25 CTG AAC CCG CCG AAC CGT TGT CTG AAA GAC 1308 Leu Asn Pro Pro Asn Arg Cys Leu Lys Asp 30 35 ACT GAC TGC CCG GGT ATC AAA AAA TGC TGC 1338 Thr Asp Cys Pro Gly Ile Lys Lys Cys Cys 40 45 GAA GGT TCT TGC GGT ATG GCA TGC TTC GTT 1368 Glu Gly Ser Cys Gly Met Ala Cys Phe Val 50 55 CCG CAG TAG TGA 1380 Pro Gln ... ... 56 57 AGCTCCTCGA GGCCCAGCTT GGCTGCAGGT CGGAAGAAGA CCCATCTGCC 1430 TAATGAGTAA TATCTGATAA GGAACGCTTT TATTTAGCTT TTTAACTACA 1480 TAGACGAATA TAATATACGA TCGGGATACA TTAGCATATT CAGCTCTTTT 1530 ACCTCTCAAT TTGCTCAAGA TTAGTATCGT GACCAATTTT AGATCATTTC 1580 GGTCAGAACA GCCACATTTT CGCGTAATTT AAAAGTTCAA TTATTGTATG 1630 CGTGACACAC TATATTAGCG TCAACTGTTA ATAAGGAAGT AGTGGATAAT 1680 AACGGTTCAG GTTGCTTCAC AATGCTTATT TCAAAATCTA AGATGTTTAA 1730 AACATTTTGG ATACTAACCA GCATAGTTCT CCTGGCATCT GCCACCGTTG 1780 ATATTAGTAA ACTACAAGAA TTCCCTAGGG CGGCCGCGAA TTAATTCGCC 1830 TTAGACATGA CTGTTCCTCA GTTCAAGTTG GGCACTTACG AGAAGACCGG 1880 TCTTGCTAGA TTCTAATCAA GAGGATGTCA GAATGCCATT TGCCTGAGAG 1930 ATGCAGGCTT CATTTTTGAT ACTTTTTTAT TTGTAACCTA TATAGTATAG 1980 GATTTTTTTT GTCATTTTGT TTCTTCTCGT ACGAGCTTGC TCCTGATCAG 2030 CCTATCTCGC AGCTGATGAA TATCTTGTGG TAGGGGTTTG GGAAAATCAT 2080 TCGAGTTTGA TGTTTTTCTT GGTATTTCCC ACTCCTCTTC AGAGTACAGA 2130 AGATTAAGTG AGAAGTTCGT TTGTGCAAGC TTATCGATAA GCTTTAATGC 2180 GGTAGTTTAT CACAGTTAAA TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA 2230 ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG CACCGTCACC CTGGATGCTG 2280 TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT GCGGGATATC 2330 GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA 2380 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC 2430 GCTTTGGCCG CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC 2480 GACTACGCGA TCATGGCGAC CACACCCGTC CTGTGGATCT ATCGAATCTA 2530 AATGTAAGTT AAAATCTCTA AATAATTAAA TAAGTCCCAG TTTCTCCATA 2580 CGAACCTTAA CAGCATTGCG GTGAGCATCT AGACCTTCAA CAGCAGCCAG 2630 ATCCATCACT GCTTGGCCAA TATGTTTCAG TCCCTCAGGA GTTACGTCTT 2680 GTGAAGTGAT GAACTTCTGG AAGGTTGCAG TGTTAACTCC GCTGTATTGA 2730 CGGGCATATC CGTACGTTGG CAAAGTGTGG TTGGTACCGG AGGAGTAATC 2780 TCCACAACTC TCTGGAGAGT AGGCACCAAC AAACACAGAT CCAGCGTGTT 2830 GTACTTGATC AACATAAGAA GAAGCATTCT CGATTTGCAG GATCAAGTGT 2880 TCAGGAGCGT ACTGATTGGA CATTTCCAAA GCCTGCTCGT AGGTTGCAAC 2930 CGATAGGGTT GTAGAGTGTG CAATACACTT GCGTACAATT TCAACCCTTG 2980 GCAACTGCAC AGCTTGGTTG TGAACAGCAT CTTCAATTCT GGCAAGCTCC 3030 TTGTCTGTCA TATCGACAGC CAACAGAATC ACCTGGGAAT CAATACCATG 3080 TTCAGCTTGA GCAGAAGGTC TGAGGCAACG AAATCTGGAT CAGCGTATTT 3130 ATCAGCAATA ACTAGAACTT CAGAAGGCCC AGCAGGCATG TCAATACTAC 3180 ACAGGGCTGA TGTGTCATTT TGAACCATCA TCTTGGCAGC AGTAACGAAC 3230 TGGTTTCCTG GACCAAATAT TTTGTCACAC TTAGGAACAG TTTCTGTTCC 3280 GTAAGCCATA GCAGCTACTG CCTGGGCGCC TCCTGCTAGC ACGATACACT 3330 TAGCACCAAC CTTGTGGGCA ACGTAGATGA CTTCTGGGGT AAGGGTACCA 3380 TCCTTCTTAG GTGGAGATGC AAAAACAATT TCTTTGCAAC CAGCAACTTT 3430 GGCAGGAACA CCCAGCATCA GGGAAGTGGA AGGCAGAATT GCGGTTCCAC 3480 CAGGAATATA GAGGCCAACT TTCTCAATAG GTCTTGCAAA ACGAGAGCAG 3530 ACTACACCAG GGCAAGTCTC AACTTGCAAC GTCTCCGTTA GTTGAGCTTC 3580 ATGGAATTTC CTGACGTTAT CTATAGAGAG ATCAATGGCT CTCTTAACGT 3630 TATCTGGCAA TTGCATAAGT TCCTCTGGGA AAGGAGCTTC TAACACAGGT 3680 GTCTTCAAAG CGACTCCATC AAACTTGGCA GTTAGTTCTA AAAGGGCTTT 3730 GTCACCATTT TGACGAACAT TGTCGACAAT TGGTTTGACT AATTCCATAA 3780 TCTGTTCCGT TTTCTGGATA GGACGACGAA GGGCATCTTC AATTTCTTGT 3830 GAGGAGGCCT TAGAAACGTC AATTTTGCAC AATTCAATAC GACCTTCAGA 3880 AGGGACTTCT TTAGGTTTGG ATTCTTCTTT AGGTTGTTCC TTGGTGTATC 3930 CTGGCTTGGC ATCTCCTTTC CTTCTAGTGA CCTTTAGGGA CTTCATATCC 3980 AGGTTTCTCT CCACCTCGTC CAACGTCACA CCGTACTTGG CACATCTAAC 4030 TAATGCAAAA TAAAATAAGT CAGCACATTC CCAGGCTATA TCTTCCTTGG 4080 ATTTAGCTTC TGCAAGTTCA TCAGCTTCCT CCCTAATTTT AGCGTTCAAA 4130 CAAAACTTCG TCGTCAAATA ACCGTTTGGT ATAAGAACCT TCTGGAGCAT 4180 TGCTCTTACG ATCCCACAAG GTGCTTCCAT GGCTCTAAGA CCCTTTGATT 4230 GGCCAAAACA GGAAGTGCGT TCCAAGTGAC AGAAACCAAC ACCTGTTTGT 4280 TCAACCACAA ATTTCAAGCA GTCTCCATCA CAATCCAATT CGATACCCAG 4330 CAACTTTTGA GTTCGTCCAG ATGTAGCACC TTTATACCAC AAACCGTGAC 4380 GACGAGATTG GTAGACTCCA GTTTGTGTCC TTATAGCCTC CGGAATAGAC 4430 TTTTTGGACG AGTACACCAG GCCCAACGAG TAATTAGAAG AGTCAGCCAC 4480 CAAAGTAGTG AATAGACCAT CGGGGCGGTC AGTAGTCAAA GACGCCAACA 4530 AAATTTCACT GACAGGGAAC TTTTTGACAT CTTCAGAAAG TTCGTATTCA 4580 GTAGTCAATT GCCGAGCATC AATAATGGGG ATTATACCAG AAGCAACAGT 4630 GGAAGTCACA TCTACCAACT TTGCGGTCTC AGAAAAAGCA TAAACAGTTC 4680 TACTACCGCC ATTAGTGAAA CTTTTCAAAT CGCCCAGTGG AGAAGAAAAA 4730 GGCACAGCGA TACTAGCATT AGCGGGCAAG GATGCAACTT TATCAACCAG 4780 GGTCCTATAG ATAACCCTAG CGCCTGGGAT CATCCTTTGG ACAACTCTTT 4830 CTGCCAAATC TAGGTCCAAA ATCACTTCAT TGATACCATT ATTGTACAAC 4880 TTGAGCAAGT TGTCGATCAG CTCCTCAAAT TGGTCCTCTG TAACGGATGA 4930 CTCAACTTGC ACATTAACTT GAAGCTCAGT CGATTGAGTG AACTTGATCA 4980 GGTTGTGCAG CTGGTCAGCA GCATAGGGAA ACACGGCTTT TCCTACCAAA 5030 CTCAAGGAAT TATCAAACTC TGCAACACTT GCGTATGCAG GTAGCAAGGG 5080 AAATGTCATA CTTGAAGTCG GACAGTGAGT GTAGTCTTGA GAAATTCTGA 5130 AGCCGTATTT TTATTATCAG TGAGTCAGTC ATCAGGAGAT CCTCTACGCC 5180 GGACGCATCG TGGCCGGCAT CACCGGCGCC ACAGGTGCGG TTGCTGGCGC 5230 CTATATCGCC GACATCACCG ATGGGGAAGA TCGGGCTCGC CACTTCGGGC 5280 TCATGAGCGC TTGTTTCGGC GTGGGTATGG TGGCAGGCCC CGTGGCCGGG 5330 GGACTGTTGG GCGCCATCTC CTTGCATGCA CCATTCCTTG CGGCGGCGGT 5380 GCTCAACGGC CTCAACCTAC TACTGGGCTG CTTCCTAATG CAGGAGTCGC 5430 ATAAGGGAGA GCGTCGAGTA TCTATGATTG GAAGTATGGG AATGGTGATA 5480 CCCGCATTCT TCAGTGTCTT GAGGTCTCCT ATCAGATTAT GCCCAACTAA 5530 AGCAACCGGA GGAGGAGATT TCATGGTAAA TTTCTCTGAC TTTTGGTCAT 5580 CAGTAGACTC GAACTGTGAG ACTATCTCGG TTATGACAGC AGAAATGTCC 5630 TTCTTGGAGA CAGTAAATGA AGTCCCACCA ATAAAGAAAT CCTTGTTATC 5680 AGGAACAAAC TTCTTGTTTC GAACTTTTTC GGTGCCTTGA ACTATAAAAT 5730 GTAGAGTGGA TATGTCGGGT AGGAATGGAG CGGGCAAATG CTTACCTTCT 5780 GGACCTTCAA GAGGTATGTA GGGTTTGTAG ATACTGATGC CAACTTCAGT 5830 GACAACGTTG CTATTTCGTT CAAACCATTC CGAATCCAGA GAAATCAAAG 5880 TTGTTTGTCT ACTATTGATC CAAGCCAGTG CGGTCTTGAA ACTGACAATA 5930 GTGTGCTCGT GTTTTGAGGT CATCTTTGTA TGAATAAATC TAGTCTTTGA 5980 TCTAAATAAT CTTGACGAGC CAAGGCGATA AATACCCAAA TCTAAAACTC 6030 TTTTAAAACG TTAAAAGGAC AAGTATGTCT GCCTGTATTA AACCCCAAAT 6080 CAGCTCGTAG TCTGATCCTC ATCAACTTGA GGGGCACTAT CTTGTTTTAG 6130 AGAAATTTGC GGAGATGCGA TATCGAGAAA AAGGTACGCT GATTTTAAAC 6180 GTGAAATTTA TCTCAAGATC TCTGCCTCGC GCGTTTCGGT GATGACGGTG 6230 AAAACCTCTG ACACATGCAG CTCCCGGAGA CGGTCACAGC TTGTCTGTAA 6280 GCGGATGCCG GGAGCAGACA AGCCCGTCAG GGCGCGTCAG CGGGTGTTGG 6330 CGGGTGTCGG GGCGCAGCCA TGACCCAGTC ACGTAGCGAT AGCGGAGTGT 6380 ATACTGGCTT AACTATGCGG CATCAGAGCA GATTGTACTG AGAGTGCACC 6430 ATATGCGGTG TGAAATACCG CACAGATGCG TAAGGAGAAA ATACCGCATC 6480 AGGCGCTCTT CCGCTTCCTC GCTCACTGAC TCGCTGCGCT CGGTCGTTCG 6530 GCTGCGGCGA GCGGTATCAG CTCACTCAAA GGCGGTAATA CGGTTATCCA 6580 CAGAATCAGG GGATAACGCA GGAAAGAACA TGTGAGCAAA AGGCCAGCAA 6630 AAGGCCAGGA ACCGTAAAAA GGCCGCGTTG CTGGCGTTTT TCCATAGGCT 6680 CCGCCCCCCT GACGAGCATC ACAAAAATCG ACGCTCAAGT CAGAGGTGGC 6730 GAAACCCGAC AGGACTATAA AGATACCAGG CGTTTCCCCC TGGAAGCTCC 6780 CTCGTGCGCT CTCCTGTTCC GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC 6830 CTTTCTCCCT TCGGGAAGCG TGGCGCTTTC TCAATGCTCA CGCTGTAGGT 6880 ATCTCAGTTC GGTGTAGGTC GTTCGCTCCA AGCTGGGCTG TGTGCACGAA 6930 CCCCCCGTTC AGCCCGACCG CTGCGCCTTA TCCGGTAACT ATCGTCTTGA 6980 GTCCAACCCG GTAAGACACG ACTTATCGCC ACTGGCAGCA GCCACTGGTA 7030 ACAGGATTAG CAGAGCGAGG TATGTAGGCG GTGCTACAGA GTTCTTGAAG 7080 TGGTGGCCTA ACTACGGCTA CACTAGAAGG ACAGTATTTG GTATCTGCGC 7130 TCTGCTGAAG CCAGTTACCT TCGGAAAAAG AGTTGGTAGC TCTTGATCCG 7180 GCAAACAAAC CACCGCTGGT AGCGGTGGTT TTTTTGTTTG CAAGCAGCAG 7230 ATTACGCGCA GAAAAAAAGG ATCTCAAGAA GATCCTTTGA TCTTTTCTAC 7280 GGGGTCTGAC GCTCAGTGGA ACGAAAACTC ACGTTAAGGG ATTTTGGTCA 7330 TGAGATTATC AAAAAGGATC TTCACCTAGA TCCTTTTAAA TTAAAAATGA 7380 AGTTTTAAAT CAATCTAAAG TATATATGAG TAAACTTGGT CTGACAGTTA 7430 CCAATGCTTA ATCAGTGAGG CACCTATCTC AGCGATCTGT CTATTTCGTT 7480 CATCCATAGT TGCCTGACTC CCCGTCGTGT AGATAACTAC GATACGGGAG 7530 GGCTTACCAT CTGGCCCCAG TGCTGCAATG ATACCGCGAG ACCCACGCTC 7580 ACCGGCTCCA GATTTATCAG CAATAAACCA GCCAGCCGGA AGGGCCGAGC 7630 GCAGAAGTGG TCCTGCAACT TTATCCGCCT CCATCCAGTC TATTAATTGT 7680 TGCCGGGAAG CTAGAGTAAG TAGTTCGCCA GTTAATAGTT TGCGCAACGT 7730 TGTTGCCATT GCTGCAGGCA TCGTGGTGTC ACGCTCGTCG TTTGGTATGG 7780 CTTCATTCAG CTCCGGTTCC CAACGATCAA GGCGAGTTAC ATGATCCCCC 7830 ATGTTGTGCA AAAAAGCGGT TAGCTCCTTC GGTCCTCCGA TCGTTGTCAG 7880 AAGTAAGTTG GCCGCAGTGT TATCACTCAT GGTTATGGCA GCACTGCATA 7930 ATTCTCTTAC TGTCATGCCA TCCGTAAGAT GCTTTTCTGT GACTGGTGAG 7980 TACTCAACCA AGTCATTCTG AGAATAGTGT ATGCGGCGAC CGAGTTGCTC 8030 TTGCCCGGCG TCAACACGGG ATAATACCGC GCCACATAGC AGAACTTTAA 8080 AAGTGCTCAT CATTGGAAAA CGTTCTTCGG GGCGAAAACT CTCAAGGATC 8130 TTACCGCTGT TGAGATCCAG TTCGATGTAA CCCACTCGTG CACCCAACTG 8180 ATCTTCAGCA TCTTTTACTT TCACCAGCGT TTCTGGGTGA GCAAAAACAG 8230 GAAGGCAAAA TGCCGCAAAA AAGGGAATAA GGGCGACACG GAAATGTTGA 8280 ATACTCATAC TCTTCCTTTT TCAATATTAT TGAAGCATTT ATCAGGGTTA 8330 TTGTCTCATG AGCGGATACA TATTTGAATG TATTTAGAAA AATAAACAAA 8380 TAGGGGTTCC GCGCACATTT CCCCGAAAAG TGCCACCTGA CGTCTAAGAA 8430 ACCATTATTA TCATGACATT AACCTATAAA AATAGGCGTA TCACGAGGCC 8480 CTTTCGTCTT CAAGAATTAA TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA 8530 GCTGACTCAT GTTGGTATTG TGAAATAGAC GCAGATCGGG AACACTGAAA 8580 AATAACAGTT ATTATTCG 8598

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＰＩＣ９／ｎエラフィンの構築手順を示す
図面。図中、記号Ｓはシグナルペプチドを示す。

【図２】ｐＰＩＣ９／ＥＬＦ２５Ｌの構築手順を示す
図面。図中、記号Ｓはシグナルペプチドを示す。

【図３】ピチア・パストリスへのエラフィン類遺伝子
の導入を示す図面。

【図４】ｐＰＩＣ９／ｎエラフィンおよびｐＰＩＣ９
／ＥＬＦ２５Ｌの塩基配列決定のストラテジー及び配列
を示す図面。以上

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 ▲図▼師誠東京都千代田区二番町12番地７株式会社ツムラ内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エラフィン類をコードする遺伝子とアル
コールオキシダーゼ１調節領域をコードする遺伝子を含
み、エラフィン類をコードする遺伝子の発現がアルコー
ルオキシダーゼ１調節領域をコードする遺伝子によって
制御されることを特徴とするエラフィン類発現ベクタ
ー。
【請求項２】さらに選択マーカー遺伝子を含む請求項
１記載の発現ベクター。
【請求項３】エラフィン類をコードする遺伝子の上流
に、さらに、シグナルペプチドをコードする遺伝子を含
む請求項１記載の発現ベクター。
【請求項４】エラフィン類が天然型エラフィンまたは
次の式（I）、 Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser- Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Xaa-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn- Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-Ile-Lys-Lys-Cys-Cys- Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Met-Ala-Cys-Phe-Val-Pro-Gln （I）（式中、Xaaはロイシン、イソロイシンまたはバリンを
示す）で表されるアミノ酸配列若しくはこれと相同性を
有するアミノ酸配列で表されるエラフィン誘導体である
請求項１記載のエラフィン類の発現ベクター。
【請求項５】請求項１記載の発現ベクターで形質転換
された微生物。
【請求項６】次の（ｘ）〜（ｚ）、（ｘ）アルコールオキシダーゼ１遺伝子のプロモーター
領域、（ｙ）エラフィン類をコードする遺伝子、（ｚ）転写終結領域をこの配列順序で含むＤＮＡ断片。
【請求項７】次の（ａ）〜（ｈ）、（ａ）宿主微生物のゲノムＤＮＡの一部に相同な第一の
領域、（ｂ）アルコールオキシダーゼ１遺伝子のプロモーター
領域、（ｃ）シグナルペプチドをコードする遺伝子（ｄ）成熟型エラフィン類が分泌可能な様設計されたリ
ンカー（ｅ）エラフィン類をコードする遺伝子、（ｆ）選択マーカー遺伝子（ｇ）転写終結領域（ｈ）宿主微生物のゲノムＤＮＡの一部に相同な第二の
領域、をこの配列順序で含む組み込み形質転換用ＤＮＡ
断片。
【請求項８】エラフィン類が天然型エラフィンまたは
次の式（I）、 Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser- Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Xaa-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn- Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-Ile-Lys-Lys-Cys-Cys- Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Met-Ala-Cys-Phe-Val-Pro-Gln （I）（式中、Xaaはロイシン、イソロイシンまたはバリンを
示す）で表されるアミノ酸配列若しくはこれと相同性を
有するアミノ酸配列で表されるエラフィン誘導体である
請求項７記載の組み込み形質転換用ＤＮＡ断片。
【請求項９】宿主微生物が、ピチア・パストリス（Pi
chia pastoris）であり、第一および第二の領域がそれ
ぞれ少なくとも約６５０ヌクレオチドである請求項７記
載の組み込み形質転換用ＤＮＡ断片。
【請求項１０】請求項７記載の組み込み形質転換用Ｄ
ＮＡ断片で形質転換された微生物。
【請求項１１】メタノール資化性酵母である請求項５
または１０記載の微生物。
【請求項１２】ピチア・パストリス（Pichia pastori
s）である請求項１１記載の微生物。
【請求項１３】請求項５または１０記載の微生物を培
養することを特徴とするエラフィン類の製造法。
【請求項１４】培養をメタノールの存在下で実施する
請求項１３記載のエラフィン類の製造法。
【請求項１５】微生物がメタノール資化性酵母である
請求項１４記載のエラフィン類の製造法。
【請求項１６】微生物がピチア・パストリス（Pichia
pastoris）である請求項１５記載のエラフィン類の製
造法。
【請求項１７】エラフィン類が天然型エラフィンまた
は次の式（I）、 Ala-Gln-Glu-Pro-Val-Lys-Gly-Pro-Val-Ser-Thr-Lys-Pro-Gly-Ser- Cys-Pro-Ile-Ile-Leu-Ile-Arg-Cys-Ala-Xaa-Leu-Asn-Pro-Pro-Asn- Arg-Cys-Leu-Lys-Asp-Thr-Asp-Cys-Pro-Gly-Ile-Lys-Lys-Cys-Cys- Glu-Gly-Ser-Cys-Gly-Met-Ala-Cys-Phe-Val-Pro-Gln （I）（式中、Xaaはロイシン、イソロイシンまたはバリンを
示す）で表されるアミノ酸配列若しくはこれと相同性を
有するアミノ酸配列で表されるエラフィン誘導体である
請求項１３記載のエラフィン類の製造法。