CN115364125B - 一种携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌在制备治疗小鼠结肠炎和结直肠癌的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌在制备治疗小鼠结肠炎和结直肠癌的药物中的应用。所述的携带内皮抑素蛋白为来源于胶原XVIII蛋白序列的长度为20‑28kDa的C端片段。所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可缓解肠炎引起的小鼠体重减轻、腹泻、结肠缩短和结肠上皮损伤。所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可显著降低结直肠肿瘤的成瘤率、减小肿瘤数量和肿瘤体积。携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌B.longum‑Endo同时能够治疗炎症性肠病和结直肠癌疾病。

Description

一种携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌在制备治疗小鼠结 肠炎和结直肠癌的药物中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及本发明涉及一种携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌在制备治疗小鼠结肠炎和结直肠癌的药物中的应用。
背景技术
炎症性肠病炎症性肠病是一组病因尚未阐明的慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)和克罗恩病(Crohn's disease,CD)。虽然炎症性肠病的发病率逐年上升，但其具体的发病原因仍知之甚少。肠道微生物群的紊乱是炎症性肠病的一个重要特征。临床上，炎症性肠病患者的肠道菌群与健康人相比有显著差异。例如，炎症性肠病患者的肠道微生物群多样性减少，肠杆菌和梭杆菌增加，厚壁菌门减少。长期以来，慢性炎症和肠道微生物群紊乱被认为是炎症性肠病发展为结直肠癌的重要危险因素。目前，临床试验表明通过口服益生菌调节肠道微生物的平衡，是预防炎症性肠病和结肠癌的一种潜在方法。
双歧杆菌Bifidobacterium是一种不活跃、大多呈分叉杆状、严格厌氧的细菌属，主要定植于人和动物的肠道内。临床发明表明双歧杆菌可治疗胃肠道疾病、缓解乳糖不耐症、增强免疫系统功能、减少幽门螺杆菌在胃肠道中的定植。长双歧杆菌Bifidobacteriumlongum属于双歧杆菌属，由于其安全性和有效性，在医药和乳制品行业被广泛应用。长双歧杆菌B.longum是人类肠道中的优势微生物群，当机体正常的微生物菌群受到干扰时，外源补充的长双歧杆菌能够快速定植于肠道内以增强肠道屏障功能(Schroeder,BO.,CellHost Microbe 2018,23:27-40；Lewis,ZT.,Microbiome 2015,3:13)。近年来，双歧杆菌还被用作生物制剂治疗结直肠癌(Singh,J.,Carcinogenesis 1997,18:833-841；Fahmy,CA.,Nutr Cancer 2019,71:688-700；Valadez-Bustos,N.,Int J Mol Sci 2019,20:4275)。双歧杆菌具有较强的肿瘤靶向能力，Yazawa等人以双歧杆菌为递送系统实现了对荷瘤小鼠的基因治疗(Yazawa,K.,Cancer Gene Ther 2000,7:269-274)。
血管生成是一个复杂的过程，受到促血管生成因子和抗血管生成因子的严密调控。肿瘤血管生成在促进肿瘤生长和转移过程中具有关键作用，抑制其生成已成为癌症治疗的一个重要靶标。内皮抑素片段是一种来源于胶原XVIII蛋白序列的长度为20-28kDa的C端片段，主要位于血管基底膜内(Perkins,GD.,Crit Care 2009,13:R52)。临床上，重组人内皮抑素Endostar已被批准用于治疗非小细胞肺癌。
发明内容
针对上述缺陷，本发明提供了一种携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌在制备治疗小鼠结肠炎和结直肠癌的药物中的应用。
为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：本发明的一种携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌在制备治疗小鼠结肠炎和结直肠癌的药物中的应用。
进一步地，所述的携带内皮抑素蛋白是一种来源于胶原XVIII蛋白序列的长度为20-28kDa的C端片段，所述的携带内皮抑素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可缓解葡聚糖硫酸钠(DSS)引起的小鼠体重减轻、腹泻、结肠缩短和结肠上皮损伤。
更进一步地，所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可有效预防或抑制结直肠癌模型中的肿瘤的发生。
更进一步地，所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可显著降低结直肠肿瘤的成瘤率、减小肿瘤数量和肿瘤体积，提高结直肠癌模型的总体生存率。
进一步地，所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可将肠炎模型的MPO活性恢复到正常模型水平，有效缓解肠炎模型中ZO-1，Occludin基因表达水平的降低，还同时明显降低肠炎模型结直肠中的促炎细胞因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)的高表达。
进一步地，所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌改善结直肠癌模型的肠道微生物群失调，显著增加结直肠癌模型肠道菌群丰富度和微生物多样。
更进一步地，所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可同时显著地增加拟杆菌门(Bacteroidota)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)的相对丰度，而显著减少脱硫杆菌门(Desulfobacterota)相对丰度。
更进一步地，所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可显著改善直肠癌模型紊乱的肠道菌群结构，乳酸杆菌属(Lactobacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、回肠杆菌属(Ileibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、阿洛巴氏菌属(Allobaculum)、狄氏副拟杆菌属(Parabateroides)和副萨特氏菌属(Parasutterella)的相对丰度均显著提高；致病菌硫酸盐还原细菌(Desulfovibrio)、结直肠癌的潜在生物标志物另枝菌属(Alistipes)的相对丰度显著降低。
更进一步地，所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可在肠道体内有效地定植增殖，携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌停止口服给药后，结直肠模型肿瘤并未生长，结直肠模型的总体存活率仍得以提高。
有益效果：本发明构建了携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌B.longum-Endo，能够同时治疗炎症性肠病和结直肠癌疾病。本发明发现，携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可在肠道体内有效地定植增殖，具有长期有效性。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌停止口服给药后，结直肠模型的肿瘤并未生长，结直肠模型的总体存活率仍得以提高。基于此结果，携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可在肠道体内有效地定植增殖，具有长期有效性。长双歧杆菌和内皮抑素在小鼠体内相互影响增强各自生理功能、协同抗炎、抗肿瘤。
(2)在该模型中，B.longum-Endo展现了更为优异的治疗炎症性肠病和抗肿瘤效果。长期口服B.longum-Endo降低了肿瘤发生率，显著减少了小鼠的肿瘤数量和肿瘤体积。与野生型B.longum相比，重组的B.longum-Endo具有更好的抗肿瘤作用，这可能与内皮抑素蛋白的表达密切相关。
附图说明
图1为本发明的内皮抑素在双歧杆菌中的克隆与表达图；
图1A为本发明SDS-PAGE电泳检测人内皮抑素基因在长双歧杆菌中的表达图；第1、2泳道：携带内皮抑素基因的长双歧杆菌；第3泳道：野生型长双歧杆菌；
图1B为本发明的重组长双歧杆菌的免疫印迹结果图：第1泳道：构建的重组长双歧杆菌中内皮抑素蛋白表达水平检测；第2泳道：野生型的长双歧杆菌中内皮抑素蛋白表达水平检测；
图1C为本发明的重组长双歧杆菌的免疫荧光结果图；左图为野生型长双歧杆菌的内皮抑素蛋白免疫荧光水平检测；右图为重组长双歧杆菌的内皮抑素蛋白免疫荧光水平检测；
图1D为本发明的菌株生长曲线测定图；图中组别分别为MRS培养基空白对照组、野生型长双歧杆菌组、两株转内皮抑素基因的重组长双歧杆菌组。
图2为本发明的长双歧杆菌缓解DSS诱导的小鼠急性炎症性肠病图；
图2A为本发明的实验过程中小鼠体重结果图；图中组别分别为无任何处理的空白对照组、进行DSS诱导但未用菌株治疗的模型组、野生型长双歧杆菌治疗组、携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌治疗组；
图2B为本发明的DSS诱导小鼠7天，小鼠疾病活动指数评分结果图；图中组别分别为无任何处理的空白对照组、进行DSS诱导但未用菌株治疗的模型组、野生型长双歧杆菌治疗组、携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌治疗组；
图2C为本发明的DSS诱导小鼠7天，解剖后小鼠结直肠形态照片图；图中组别分别为无任何处理的空白对照组、进行DSS诱导但未用菌株治疗的模型组、野生型长双歧杆菌治疗组、携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌治疗组；
图2D为本发明的小鼠结直肠长度统计图；图中组别分别为无任何处理的空白对照组、进行DSS诱导但未用菌株治疗的模型组、野生型长双歧杆菌治疗组、携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌治疗组；数据以平均值±SD表示，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,ns:无统计学差异；
图2E为本发明的小鼠结直肠H&E染色结果照片图；图中组别分别为无任何处理的空白对照组、进行DSS诱导但未用菌株治疗的模型组、野生型长双歧杆菌治疗组、携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌治疗组；
图2F为本发明的小鼠结直肠H&E染色评分结果图；图中组别分别为无任何处理的空白对照组、进行DSS诱导但未用菌株治疗的模型组、野生型长双歧杆菌治疗组、携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌治疗组；数据以平均值±SD表示，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,ns:无统计学差异。
图3为本发明的重组长双歧杆菌加快了小鼠急性炎症性肠病的恢复图；
图3A为本发明的小鼠急性肠炎恢复实验示意图；图中无任何处理的空白对照组小鼠进行自由饮用无菌水12天；进行DSS诱导但未用菌株治疗的模型组小鼠DSS诱导7天后更换为自由饮用无菌水5天；野生型长双歧杆菌治疗组小鼠DSS诱导7天后更换为自由饮用无菌水5天，实验期间都进行野生型长双歧杆菌灌胃治疗；携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌治疗组DSS诱导7天后更换为自由饮用无菌水5天，实验期间都进行重组长双歧杆菌灌胃治疗；
图3B为本发明的解剖后小鼠结直肠照片图；
图3C为本发明的小鼠结直肠H&E染色结果照片和H&E染色评分结果图；
图3D为本发明的实验第7天和第12天，小鼠结直肠组织髓过氧化物酶MPO活性水平检测结果图；数据以平均值±SD表示，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,ns:无统计学差异；
图3E为本发明的实验第7天和第12天，小鼠结直肠组织紧密连接蛋ZO-1和Occludin的mRNA表达水平检测结果图，数据以平均值±SD表示，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,ns:无统计学差异；
图3F为本发明的实验第7天和第12天，小鼠结直肠组织促炎细胞因子TNF-α,IL-1β,和IL-6的mRNA表达水平检测结果图，数据以平均值±SD表示，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,ns:无统计学差异。
图4为本发明的重组长双歧杆菌B.longum-Endo抑制AOM/DSS诱导的小鼠结直肠肿瘤的发生图；
图4A为本发明的致癌剂氧化偶氮甲烷AOM联合致炎剂DSS建立小鼠结直肠癌模型示意图。实验第一周给予小鼠正常饮用水，腹腔一次性注射AOM(10mg/kg)。第2周将正常饮用水更换为2％DSS，接着饮用正常无菌水2周，照此每3周为1个循环，重复3个循环，以建立炎性结直肠癌小鼠模型。在此期间，口服灌胃携带内皮抑素的重组长双歧杆菌治疗14天，随后停止治疗7天，如此进行4个循环；
图4B为本发明的小鼠体重结果统计图；
图4C为本发明的4周、8周、12周小鼠结直肠解剖照片图；
图4D为本发明的15周解剖小鼠，未治疗组、灌胃野生型长双歧杆菌治疗组、灌胃携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌治疗组的小鼠结直肠成瘤情况示意图；
图4E为本发明的肿瘤数量和肿瘤体积统计结果图。左图为肿瘤数量统计结果，右图为肿瘤体积统计结果。图中组别分别为进行菌株治疗的模型组、灌胃野生型长双歧杆菌治疗组、灌胃携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌治疗组；数据以平均值±SD表示，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,ns:无统计学差异；
图4F为本发明的小鼠结直肠H&E染色结果照片图；
图4G为本发明的小鼠结直肠癌肿瘤级别评分图，数据以平均值±SD表示，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001,ns:无统计学差异；
图4H为本发明的小鼠生存曲线统计结果图。
图5为本发明的口服重组长双歧杆菌B.longum-Endo改善了AOM/DSS引起的肠道菌群失调图；
图5A为本发明的肠道菌群主成分分析结果图。图中组别分别为未进行任何处理的空白对照组、无菌株治疗的AOM/DSS模型组、灌胃野生型长双歧杆菌治疗组、灌胃携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌组；
图5B为本发明的门水平肠道菌群相对丰度统计结果图；
图5C为本发明的属水平肠道菌群Firmicutes,Bacteroidota,Desulfobacterota,Actinobacteria,Verrucomicrobiota相对丰度统计结果图；
图5D为本发明的属水平肠道菌群热图聚类分析结果图；
图5E为本发明的具有显著性差异的肠道有益菌群相对丰度统计图(Lactobacillus,Bacteroides,Ileibacterium，Bifidobacterium,Allobaculum)；
图5F为本发明的具有显著性差异的肠道潜在致病菌相对丰度统计图(Desulfovibrio,Helicobacter,Alistipes,Enterorhabdus)；
图5G为本发明的野生型长双歧杆菌治疗组和携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌治疗组差异菌群统计结果图。图中以P<0.05为标准筛选差异菌群。
图6为本发明的KEGG同源基因簇(KO)热图聚类分析图；
图6A为本发明的二级水平KEGG代谢通路热图聚类分析结果图。图中组别分别为未进行任何处理的空白对照组、无菌株治疗的AOM/DSS模型组、灌胃野生型长双歧杆菌治疗组、灌胃携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌组；
图6B为本发明的三级水平KEGG代谢通路热图聚类分析结果图，图中组别分别为未进行任何处理的空白对照组、无菌株治疗的AOM/DSS模型组、灌胃野生型长双歧杆菌治疗组、灌胃携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌组。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更加全面的描述，附图中给出了本发明的若干实施例，但是本发明可以通过不同的形式来实现，并不限于文本所描述的实施例，相反的，提供这些实施例是为了使对本发明公开的内容更加透彻全面。
下面结合附图对发明内容作进一步详细说明。
实施例1
本发明的一种携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌在制备治疗小鼠结肠炎和结直肠癌的药物中的应用。所述的携带内皮抑素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可缓解DSS引起的小鼠体重减轻、腹泻、结肠缩短和结肠上皮损伤。所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌可显著降低结直肠肿瘤的成瘤率、减小肿瘤数量和肿瘤体积。所述的携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌改善AOM/DSS诱导的肠道微生物群失调。
试验例1
1.急性结肠炎小鼠模型的构建
使用3％DSS构建小鼠急性结肠炎模型。小鼠自由饮水和进食一周以适应环境。实验开始时将小鼠饮用水更换为3％DSS溶液，24h后对小鼠进行灌胃双歧杆菌治疗。实验分组如下：(1)空白对照组：每天给予无菌蒸馏水自由饮用；(2)模型组：给予3％DSS饮用水7天，每日每只老鼠灌胃含5％葡萄糖的生理盐水溶液200μL；(3)野生型长双歧杆菌B.longum组：给予3％DSS饮用水7天，每日每只老鼠灌胃野生型长双歧杆菌B.longum(1.5×1010CFU/kg/mouse)；(4)重组B.longum-Endo组：给予3％DSS饮用水7天，每日每只老鼠灌胃携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌B.longum-Endo(1.5×1010CFU/kg/mouse)。灌胃前，用含5％葡萄糖的生理盐水溶液重悬菌株。在急性结肠炎恢复实验中，小鼠给予3％DSS 7天后，将其统一更换为无菌水，自由饮用5天，其它实验操作方法与急性肠炎造模相同。实验过程中，每天对小鼠的生活状态、粪便情况(粪便形态和隐血现象)进行记录，并称量体重。实验结束时采用断颈法处死小鼠，取小鼠结直肠进行形态观察、长度测量及拍照。
2.DSS诱导的小鼠结肠炎疾病评分
2.1.疾病活动指数评分
计算小鼠体重下降百分比，对粪便稠度和隐血情况进行评估并评分，将三项计分相加除以3计算出DAI评分(0～4分)，具体DAI评分标准如表1所示。
表1
2.2结直肠组织学评分
通过显微镜对小鼠结直肠HE染色切片进行炎症严重程度、损伤深度、炎症细胞浸润三个方面的评估并进行评分，三项计分相加的结果即为结直肠组织学评分(0～9分)，具体组织学评分标准如表2所示。
表2
3.小鼠结直肠组织总RNA提取和实时荧光定量PCR(RT-PCR)
结肠组织总RNA的提取方法根据商业化试剂盒说明进行。使用微孔法测定提取后的RNA样本浓度及质量。按照逆转录聚合酶链反应试剂盒(TOYOBO，日本)将RNA样本逆转录成cDNA，采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(诺唯赞，中国南京)和ThermoFisher Scientific实时PCR扩增系统进行荧光定量PCR基因扩增。实验过程中所用实时定量PCR引物序列见表3。
表3
4.AOM/DSS诱导结直肠癌小鼠模型
参考Liang等人建立的方法，采用致癌剂氧化偶氮甲烷AOM联合致炎剂葡聚糖硫酸钠DSS建立小鼠结直肠癌模型。实验分组同急性肠炎模型。实验开始时，每只小鼠给予正常饮用水，腹腔注射AOM(10mg/kg)。第2周将正常饮用水更换为2％DSS，接着饮用正常无菌水2周，照此每3周为1个循环，重复3个循环，以建立炎性结肠癌小鼠模型。在此期间，口服灌胃B.longum或B.longum-Endo治疗14天，随后停止治疗7天，如此进行4个循环。在第15周处死所有小鼠，收集小鼠结肠组织。将小鼠结肠纵向解剖，用生理盐水多次冲洗，平铺使肠道粘膜面朝上，记录小鼠结肠肿瘤息肉的数目和大小及结肠的长度。结肠组织放入液氮中速冻后保存于-80℃。在整个动物实验过程中，对小鼠的体重及生存情况进行观察及记录。
5.16S rRNA基因测序
收集小鼠粪便进行16S rRNA基因测序，具体测序方法参照前人所述。根据粪便DNA试剂盒(51504，QIAGEN)说明书提取DNA。
16S rRNA基因的V3-V4可变区采用的特异性引物序列为：
338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)。
PCR反应条件为:94℃预变性4min，随后94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸30s，循环数25次，最后72℃彻底延伸5min。利用Illumina Mi Seq pe300平台进行标准化测序工作，对所得序列进行有效质控和过滤。利用MOTHUR软件对每个样品进行相对丰度统计、菌群门到属分类，微生物多样性分析和主成分分析(PCA)。
结果与分析
内皮抑素在长双歧杆菌中的克隆与表达
从人肝脏cDNA文库中筛选获得的人内皮抑素基因长560bp，将其克隆至温控启动子pPRPL诱导的pBV222质粒中。构建成功的pBV222-endostatin转化至长双歧杆菌Bifidobacterium longum ATCC 55813中，SDS-PAGE电泳后的考马斯亮蓝染色结果表明，重组双歧杆菌菌株成功表达分子量大小为22kDa的Endostatin蛋白(图1A，B)。重组长双歧杆菌B.longum-Endo菌株经42℃诱导培养48h，离心收集沉淀，进一步使用小鼠抗人Endostatin单克隆抗体和FITC-标记的山羊抗小鼠IgG标记菌株。如图1C所示，野生型长双歧杆菌未检测到荧光，重组菌株B.longum-Endo经表面标记后出现特异性荧光，此结果表明重组人Endostatin蛋白成功表达于长双歧杆菌中、表达量高。生长曲线测定结果表明重组长双歧杆菌B.longum-Endo的生长速度高于野生型长双歧杆菌(图1D)。
试验例2
长双歧杆菌可缓解DSS诱导的小鼠急性炎症性肠病
实验采用小鼠自由饮用3％DSS溶液7天诱导小鼠急性结肠炎模型，饮用3％DSS溶液24h后对小鼠进行灌胃长双歧杆菌处理。如图2A所示，未经DSS处理的对照组小鼠体重平稳生长，饮用3％DSS的模型组小鼠体重显著下降，长双歧杆菌B.longum和重组长双歧杆菌B.longum-Endo组小鼠体重下降现象明显得到缓解。急性结肠炎期间，正常组小鼠行动自如比较活跃，粪便成型正常；饮用3％DSS的各组模型组小鼠在给予DSS第三天起开始出现软便情况，且随着DSS饮用时间的增加，小鼠逐渐出现腹泻和血便现象。长双歧杆菌和重组长双歧杆菌组小鼠在治疗期间有一定程度的腹泻和轻度血便情况，总体的疾病活动指数评分均低于未治疗组(图2B)。剖取小鼠结直肠可以观察到，正常组小鼠结直肠形态正常，粪便成型完整。模型组与正常组相比，结直肠萎缩明显且有充血情况，粪便无形且为血便。与模型组相比，治疗组(野生型长双歧杆菌和携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌)结直肠脓肿情况大大改善，粪便不含血趋于有形便(图2C)。统计各组结直肠长度，结果如图2D所示，相比于正常组，模型组结直肠长度显著缩短；与模型组相比，治疗组结直肠长度有所增长，且差异具有统计学意义(P<0.05)。H&E染色结果显示治疗组结肠损伤明显减轻，黏膜层内腺体结构趋于完整，炎症细胞浸润情况有所缓解，总的组织学疾病评分低于模型组(图2E，F)。以上结果表明野生型长双歧杆菌和携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌可缓解DSS诱导的小鼠急性炎症性肠病。
试验例3
重组长双歧杆菌加快了小鼠急性炎症性肠病的恢复
为了进一步发明重组长双歧杆菌对小鼠炎症性肠病的作用，本发明进行了小鼠急性结肠炎的恢复性实验。如图3A所示，连续7天给予3.0％DSS造成小鼠急性上皮损伤，随后将DSS更换为正常饮水。随着正常饮用水的更换，小鼠的体重逐渐恢复。与模型组相比，野生型长双歧杆菌和重组长双歧杆菌组的小鼠肠炎恢复更为显著，疾病活动指数评分更低。治疗12天后，重组长双歧杆菌组的小鼠DAI评分仅为0.43，表明炎症几乎完全恢复。与野生型长双歧杆菌B.longum组相比，重组长双歧杆菌B.longum-Endo组的小鼠结直肠粪便成型更为完整，组织学评分更低(图3B，C)。MPO是一种由中性粒细胞释放的蛋白，能够催化生成一系列活性氧分子。MPO的活性与炎症性肠病的严重程度有关，可以作为炎症性肠病炎症的一个指标。如图3D所示，正常组小鼠结直肠的MPO活性保持一个极低的水平，模型组的MPO活性显著升高。与模型组相比，灌胃长双歧杆菌能够下调结直肠组织中的MPO水平。值得注意的是，灌胃重组长双歧杆菌B.longum-Endo 12天后，小鼠的MPO活性与正常组无明显差异。本发明还发现B.longum-Endo有效地缓解了DSS诱导的ZO-1，Occludin基因的表达水平降低(图3E)。使用RT-PCR技术对急性结小鼠结直肠中的促炎因子(TNF-α,IL-1β,IL-6)表达量进行检测，结果显示模型组小鼠在饮用3％DSS溶液后促炎细胞因子高表达；与模型组相比，双歧杆菌的治疗能够明显降低促炎细胞因子的表达。治疗12天后，重组长双歧杆菌B.longum-Endo组的降低效果最为显著，且差异具有统计学意义(图3F)。以上结果表明，重组长双歧杆菌B.longum-Endo加快了小鼠急性炎症性肠病的恢复。
3.重组长双歧杆菌B.longum-Endo抑制AOM/DSS诱导的小鼠结直肠肿瘤的发生
结直肠癌是一种慢性炎症性疾病，多种炎症介质控制其发生发展。为了探究重组长双歧杆菌B.longum-Endo是否可用于结直肠癌的治疗，本发明构建了AOM/DSS诱导的结肠炎相关结肠癌小鼠模型(图4A)。实验结果表明口服重组长双歧杆菌B.longum-Endo可以缓解由AOM/DSS引起的小鼠体重降低。相比于模型组，重组长双歧杆菌B.longum-Endo组的小鼠体重增加了11.08％(图4B)。在模型构建过程中，每隔4周随机解剖两只小鼠以监测成瘤情况。AOM/DSS诱导12周后，模型组和野生型长双歧杆菌组小鼠结直肠远端出现肉眼可见的肿瘤结节(图4C)。造模15周后解剖所有小鼠观察其肿瘤形成情况。结果显示模型组和野生型长双歧杆菌组的所有小鼠(8只)均在结肠或直肠远端出现肉眼可见的肿瘤，而重组长双歧杆菌B.longum-Endo组仅有三只小鼠成瘤。与野生型长双歧杆菌相比，重组长双歧杆菌B.longum-Endo的抗肿瘤效果更佳。如图4D-F所示，经B.longum-Endo处理的小鼠结肠肿瘤数量更少，肿瘤体积更小，肿瘤疾病评分更低(P<0.05)。生存曲线结果显示造模175天后，模型组小鼠的存活率为46.7％，野生型长双歧杆菌和重组长双歧杆菌组的小鼠存活率分别为66.49％，84％。以上结果表明重组长双歧杆菌B.longum-Endo有效预防或抑制了AOM/DSS诱导的结直肠癌肿瘤的发生，提高了小鼠的总体生存率。
试验例4
口服重组长双歧杆菌B.longum-Endo改善了AOM/DSS引起的肠道菌群失调
肠道菌群失调与结直肠癌发生密切相关。为了确定重组长双歧杆菌B.longum-Endo处理是否影响肠道菌群，本发明对AOM/DSS处理后小鼠粪便样本进行16S rRNA测序。主成分分析(PCA)结果显示模型组样本聚类在一起，且与长双歧杆菌治疗组样本明显分离，表明B.longum-Endo干预确实改变了小鼠肠道微生物组成(图5A)。口服B.longum-Endo后，小鼠肠道菌群丰富度和微生物多样性有所增加。正常小鼠的肠道微生物群以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)为主,经过AOM/DSS诱导后厚壁菌门相对丰度增加。与模型组相比，B.longum-Endo处理组的拟杆菌门的相对丰度增加了约27.19％，放线菌门丰度是模型组的两倍，而脱硫杆菌门(Desulfobacterota)的相对丰度减少了48.44％。疣微菌门(Verrucomicrobiota)是一门被划出不久的细菌，主要定植于肠道黏液外层。口服重组长双歧杆菌B.longum-Endo增加了肠道疣微菌门的相对丰度，而野生型长双歧杆菌B.longum并不能改变疣微菌门的丰度(图5C)。在属水平上，AOM/DSS处理降低了有益菌的相对丰度，增加了潜在有害菌的相对丰度；口服重组长双歧杆菌B.longum-Endo改善了紊乱的肠道菌群结构。如图5D,E所示，B.longam-Endo组的Lactobacillus、Bacteroides和Ileibacterium的相对丰度分为24.6％、0.63％、2.23％，而未治疗组仅为9.29％、0.11％、0.087％。野生型长双歧杆菌B.longum组的Bifidobacterium和Allobaculum的相对丰度与未治疗之间没有显著性差异，但是口服重组长双歧杆菌B.longam-Endo增加了Bifidobacterium和Allobaculum的相对丰度。Desulfovibrio，Helicobacter，Alistipes和Enterorhabdus是潜在的致病菌，口服重组长双歧杆菌B.longam-Endo降低了其丰度。与野生型长双歧杆菌相比，口服重组菌后三种肠道微生物菌群发生了显著变化。其中，致病菌Desulfovibrio丰度显著降低，Parabateroides和Parasutterella丰度显著提高(图5F)。以上结果表明口服重组长双歧杆菌B.longam-Endo改善了AOM/DSS引起的肠道菌群失调。
图5为本发明的口服重组长双歧杆菌B.longum-Endo改善了AOM/DSS引起的肠道菌群失调图。图5A为本发明的肠道菌群主成分分析结果图。图中组别分别为未进行任何处理的空白对照组、无菌株治疗的AOM/DSS模型组、灌胃野生型长双歧杆菌治疗组、灌胃携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌组。图5B为本发明的门水平肠道菌群相对丰度统计结果图。图5C为本发明的属水平肠道菌群Firmicutes,Bacteroidota,Desulfobacterota,Actinobacteria,Verrucomicrobiota相对丰度统计结果图。图5D为本发明的属水平肠道菌群热图聚类分析结果图。图5E为本发明的具有显著性差异的肠道有益菌群相对丰度统计图(Lactobacillus,Bacteroides,Ileibacterium，Bifidobacterium,Allobaculum)。图5F为本发明的具有显著性差异的肠道潜在致病菌相对丰度统计图(Desulfovibrio,Helicobacter,Alistipes,Enterorhabdus)。图5G为本发明的野生型长双歧杆菌治疗组和携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌治疗组差异菌群统计结果。图中以P<0.05为标准筛选差异菌群。
试验例5
细菌群落的功能预测
为了确定差异微生物的涉及的代谢通路，本发明使用KEGG pathway数据库来预测其假定功能。AOM/DSS处理后，4条代谢通路发生显著变化，包括细胞过程(cellularprocesses)、生物体系统(organismal systems)、环境信息处理(environmentalinformation processing)和人类疾病(human diseases)(表4)。口服野生型长双歧杆菌改变的代谢通路与代谢功能(metabolism functional)密切相关，而口服重组长双歧杆菌后改变的代谢通路与环境信息处理(environmental information processing)相关。在2级KEGG通路水平上，口服重组长双歧杆菌B.longum-Endo后，癌症(cancers)、内分泌代谢疾病(endocrine_and_metabolic_disease)、折叠-分类-分解(folding_sorting_and_degradation)、翻译(translation)途径被上调。在3级KEGG通路水平上，口服重组长双歧杆菌B.longum-Endo后原核防御系统(prokaryotic defense system)、硫传递系统(sulfurrelay system)、甾体激素生物合成(steroid hormone biosynthesis)、蛋白质消化吸收(protein digestion and absorption)、CD分子(CD molecules)、小细胞肺癌(small celllung cancer)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)等途径被上调(图6A)。与模型组相比，氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system)、凋亡(apoptosis)通路被显著下调。与野生型长双歧杆菌相比，氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)和赖氨酸生物合成(lysine biosynthesis)途径具有显著性变化(图6B)。表4为本发明的利用PICRUSt预测菌群KEGG代谢通路图。
表4
图6为本发明的KEGG同源基因簇(KO)热图聚类分析图。图6A为本发明的二级水平KEGG代谢通路热图聚类分析结果图。图中组别分别为未进行任何处理的空白对照组、无菌株治疗的AOM/DSS模型组、灌胃野生型长双歧杆菌治疗组、灌胃携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌组。图6B为本发明的三级水平KEGG代谢通路热图聚类分析结果图。图中组别分别为未进行任何处理的空白对照组、无菌株治疗的AOM/DSS模型组、灌胃野生型长双歧杆菌治疗组、灌胃携带内皮抑素基因的重组长双歧杆菌组。
双歧杆菌是存在于人体胃肠道内必不可少的益生菌，具有安全无毒可口服的特点。发明表明口服双歧杆菌可提高肠道免疫功能，缓解炎症性肠病及相关炎症性肿瘤的发生发展。近年来，利用益生菌作为基因工程表达载体展现出良好的应用价值。在本发明中，本发明构建了高水平表达内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌(B.longum-Endo)，首次在动物模型中证实了其抗炎和抗肿瘤能力。
本发明探讨了重组长双歧杆菌B.longum-Endo对小鼠结肠炎和结直肠癌的治疗效果。结果表明，口服B.longum-Endo能够改善小鼠的体重下降和腹泻便血情况，恢复结直肠长度、减轻结直肠的组织损伤。作为组织损伤和中性粒细胞浸润的标志，MPO活性与炎症性肠病的严重程度密切相关。临床数据表明炎症性肠病患者的MPO表达水平通常升高。DSS诱导的小鼠急性炎症性模型中，DSS诱导上调了小鼠结肠组织中的MPO表达水平，B.longum-Endo干预后MPO活性降低。在炎症性肠病炎症中，TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子的表达水平增加，本发明结果表明口服B.longum-Endo可降低炎症部位TNF-α的表达水平。灌胃治疗12天后，TNF-α的表达恢复到正常水平。IL-6是炎症过程中产生的一种多功能细胞因子，抑制IL-6/STAT3信号通路可能是治疗炎症性肠病的潜在靶点(Matsumoto,S.,Immunology2009；128:e170-180)。值得注意的是，IL-6对于重组长双歧杆菌B.longum-Endo的响应最为明显。相比于未治疗组，口服重组长双歧杆菌B.longum-Endo 12天，IL-6的表达水平降低了4.6倍。
炎症是肿瘤微环境的重要组成部分，长期的慢性炎症是肿瘤发生发展的助力因素。一项前瞻性的观察发明表明，炎症性肠病患者的结直肠癌患病率正在逐年上升。本发明构建的AOM/DSS小鼠结直肠癌模型是一种由慢性炎症驱动的炎癌转化肿瘤模型，最大程度地模拟了人类结肠癌的微环境。在该模型中，B.longum-Endo展现了更为优异的抗肿瘤效果。长期口服B.longum-Endo降低了肿瘤发生率，显著减少了小鼠的肿瘤数量和肿瘤体积。与野生型B.longum相比，重组的B.longum-Endo具有更好的抗肿瘤作用，这可能与内皮抑素蛋白的表达密切相关。内皮抑素是XVIII胶原的一段20-28kDa的蛋白水解片段，具有很强的抗血管生成活性。重组人内皮抑素因其广谱、低毒的抗肿瘤能力而被广泛应用于肿瘤治疗。内皮抑素是治疗癌症一种很有前途的药物，但是不稳定的理化特性、较短的半衰期限制了其临床应用。目前，许多发明致力于内皮抑素的基因治疗，即在体内向特定肿瘤区域传递和表达内皮抑素。Jia等人报道，内皮抑素减缓甚至阻止了肿瘤的生长，但当治疗停止时，肿瘤则迅速重新生长。本发明发现，停止口服B.longum-Endo后，小鼠结直肠肿瘤并未生长，小鼠的总体存活率也得到了提高。基于此结果，本发明认为长双歧杆菌和内皮抑素在小鼠体内相互影响增强各自生理功能、协同抗炎、抗肿瘤。
越来越多的证据表明，肠道微生物在维持肠道稳态方面发挥着至关重要的作用。肠道微生物的失调与炎症性肠病和结直肠癌的发展密切相关。例如，有益乳杆菌的减少和潜在有害肠杆菌的增加与炎症性肠病的严重程度和治疗效果呈正相关。AOM/DSS诱导增加了潜在致病菌的相对丰度，经B.longum-Endo处理后，致病菌相对丰度降低。Desulfovibrioo是一种硫酸盐还原细菌，在低营养和富营养化环境中普遍存在。内源性H2S的过量产生与结肠炎、结直肠癌的发生发展密切相关(Loubinoux,J.,FEMS MicrobiolEcol 2002,40:107-112；Carbonero,F.,Front Physiol 2012,3:448)。本发明表明，小鼠结肠组织中过量的H2S由Desulfovibrioo产生。与野生B.longum相比，B.longum-Endo处理显著降低了Desulfovibrio的相对丰度。B.longum-Endo可能通过下调Desulfovibrio丰度抑制体内H2S的产生从而抑制炎症的发展。Alistipes是拟杆菌门的一种革兰氏阴性细菌，在结直肠癌中具有致病性。目前，Alistipes已被提议作为结直肠癌的潜在生物标志物，口服重组B.longum-Endo显著降低了Alistipes的相对丰度。本发明发现肠道双歧杆菌的相对丰度只在B.longum-Endo组中显著增加，表明重组的B.longum-Endo在肠道体内有效地定植增殖。与野生型B.longum相比，B.longum-Endo小鼠的Parabacteroides和Parasutterella的相对丰度显著提高。Parabacteroides是人类和小鼠体内典型的肠道共生菌，与机体健康息息相关。本发明仅在B.longum-Endo组中发现了显著上调的高丰度Parabacteroides，这可能是其抗肿瘤原因之一。Parasutterella是一个相对较新的属。Henneke等人报道，Parasutterella与肥胖和2型糖尿病有关，但与IL-6的表达水平无关(Henneke,L.,Gutmicrobes 2022,14:2057778)。临床上IBS患者的回肠黏膜里的Parasutterella丰度异常升高(Chen YJ.,J Gastroenterol Hepatol 2018,33:1844-1852)。本发明的结果表明，口服B.longum-Endo显著增加了小鼠肠道中Parasutterella的相对丰度。总的来说，Desulfovibrio,Parabacteroides和Parasutterella可能是解释“内皮抑素”和“肠道微生物”之间关系的重要候选菌群。
本发明表明，口服重组B.longum-Endo能够有效抑制炎症反应，长期口服可调节肠道菌群平衡，抑制结直肠癌肿瘤的发生发展。口服重组B.longum-Endo菌株可能是治疗炎症性肠病和结肠炎相关癌症的一种有前途的治疗策略。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京吉芮康生物科技研究院有限公司 江苏靶标生物医药研究所有限公司
<120> 一种携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌在制备治疗小鼠结肠炎和结直肠癌的药物中的应用
<130> 2022
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 186
<212> PRT
<213> 人工序列(携带内皮抑素蛋白的氨基酸序列)
<400> 1
Glu Phe Met His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val
1 5 10 15
Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala
20 25 30
Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr
35 40 45
Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val
50 55 60
Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu
65 70 75 80
Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro
85 90 95
Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu
100 105 110
Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro
115 120 125
Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu
130 135 140
Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu
145 150 155 160
Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys
165 170 175
Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys
180 185

Claims (1)

1.一种携带内皮抑素蛋白的重组长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）在制备治疗结肠炎和结直肠癌的药物中的应用；所述的携带内皮抑素蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。
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