JP2716191B2 - エグリン変異体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、プロテアーゼ阻害物質エグリンＢ及びエグ
リンＣの変異体、これらの変異体の製造のために適当な
ハイブリドベクター並びにこれらのハイブリドベクター
により形質転換された宿主微生物、並びにこれらのハイ
ブリドベクター、形質転換された宿主微生物及びエグリ
ン変異体の製造方法に関する。

〔従来の技術〕

ヒル〔ヒルド・メディシナリス（Hirudo medicinali
s）から単離されそしてエグリン（eglin）Ｂ及びエグリ
ンＣと称される２種類のプロテアーゼ阻害物資が独国出
願公開No.2808396に記載されている。これらのペプチド
はそれぞれ70個のアミノ酸から成り、約8100の分子量を
有し、そしてキモトリプシン、ズブチリシン、動物及び
ヒトの顆粒球プロテアーゼであるエラスターゼ及びカテ
プシンＧ、並びに肥満細胞（mast cell）プロテアーゼ
であるチマーゼ（chymase）に対する強力な阻害物質で
ある。

エグリンＣは下記の一次構造： を有する。

エグリンＣは、既知のプロテアーゼ阻害物質のほとん
どのものとは異り、ジスルフィド橋を全く含有しない。
その比較的小さい分子サイブを考慮して、このものは、
酸、水酸化アルカリ溶液又は熱による変性の観点、及び
蛋白質分解の観点から非常に安定である。エグリンＢの
一次構造は、35位のアミノ酸チロシンがヒスチジンによ
り置き換えられていることによりエグリンＣのそれとは
異る。

エグリンは、ヒト及び動物の顆粒球エラスターゼ並び
にヒト顆粒球カテプシンＧに対する既知阻害物質の中で
も最も強力なものに属する。生物体におけるこれらの細
胞性プロテアーゼの制御されない放出又は過剰な放出は
炎症過程を強化し、そして非特異的蛋白質分解により組
織の破壊を惹起する。細胞内消化を担当するこれらの酵
素は生理的（中性ないし弱アルカリ性）媒体中では最適
に活性であり、そして天然組織物質（例えばエラスチ
ン）及び液性因子（例えば血液凝固因子及び補体因子）
が迅速に破壊されそして不活性化される。従って、従来
から知られている性質のため、エグリンは医療（抗炎
症、消炎、敗血性ショック、肺気腫、膵臓繊維症等）に
おける使用について特に興味深い。

最近、遺伝子組換え法によりエグリンを製造すること
が可能となった（ヨーロッパ特許出願No.146785を参照
のこと）。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の課題は、エグリンＢ又はエグリンＣから出発
して新規なプロテアーゼ阻害物質を製造することであ
る。

〔課題を解決するための手段〕

前記の課題は、活性中心領域中の１個、２個又は３回
のアミノ酸（アミノ酸45及び46、Leu-Asp）の他のアミ
ノ酸による置き換えにより天然エグリンＢ及びＣと異る
エグリン変異体を提供する本発明により解決された。本
発明に従って得られるエグリン変異体は驚くべき性質を
有する。すなわち、これらはある種のプロテアーゼの阻
害における増加した特異性により、あるいはエグリンＢ
及びＣにより阻害されないか又はほとんど阻害されない
プロテアーゼ、例えばトリプシン又はトロンビンに対す
る阻害により、エグリンＢ及びエグリンＣから区別され
る。

〔具体的な記載〕

本発明は特に、次の式（Ｉ）： （式中、Ｒは水素又はアセチル基であり、ＷはTyr又はH
isであり、ＸはThr,Ser又はProであり、ＹはLeu,Met,Ar
g,Lys,Phe,Tyr又はTrpであり、そしてＺはAsp,Glu,Gln,
Asn,Ala,Ser又はThrであり、但しＹがLeuでありそして
ＺがAspである場合にはＸはThr以外である）で表わされ
る化合物、並びにその塩に関する。

本発明は特に、Ｒがアセチル基であり、ＷがTyrであ
り、そして（１）ＸがThrであり、ＹがArg又はLysであ
りそしてＺがAsp,Glu,Gln,Asn,Ala,Ser又はThrである
か、あるいは（２）ＸがProであり、ＹがMetでありそし
てＺがAspであるか、あるいは（３）ＸがThrであり、Ｙ
がPhe,Tyr,Trp又はMetでありそしてＺがAspである化合
物、及びその塩に関する。

本発明は主として、Ｒがアセチル基であり、ＷがTyr
であり、ＸがThrであり、ＹがArgであり、そしてＺがAs
p又はSerである式（Ｉ）の化合物、及びその塩に関す
る。

本発明は特に、Ｒがアセチル基であり、ＷがTyrであ
り、ＸがThrであり、ＹがArgであり、ＺがAspである式
（Ｉ）の化合物、及びその塩に関する。

式（Ｉ）の新規化合物は遊離の形でのみならず、それ
らの塩、特にそれらの医薬として許容される塩の形でも
存在することができる。これらは遊離アミノ基又はグア
ニジノ基を有する幾つかのアミノ酸残基を含有するか
ら、本発明の化合物は例えば酸付加塩の形で存在するこ
とができる。好ましい酸付加塩は特に、一般に医薬とし
て許容される酸との生理的に許容される塩である。適当
な無機酸はハロゲン化水素酸（例えば塩酸）であるが、
しかしさらに硫酸及びリン酸又はピロリン酸であり、適
当な有機酸は特にスルホン酸（例えばベンゼンスルホン
酸もしくはｐ−トルエンスルホン酸、又は低級アルカン
スルホン酸、例えばメタンスルホン酸）であり、そして
さらにカルボン酸、例えば酢酸、乳酸、パルミチン酸及
びステアリン酸、リンゴ酸、酒石酸、アスコルビン酸、
並びにクエン酸である。エグリン化合物はまた、遊離カ
ルボキシル基を有するアミノ酸残基を含有するから、こ
れらはさらに金属塩、特にアルカリ金属塩又はアルカリ
土類金属塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシ
ウム塩又はマグネシウム塩の形で、あるいはアンモニア
又は生理的に許容される有機窒素含有塩基からのアンモ
ニウム塩の形で存在することができる。しかしながら、
これらは遊離カルボキシル基及び遊離アミノ基（及びグ
アニジノ基）を同時に含有することがあるから、これら
はまた内部塩の形でも存在し得る。

本発明のエグリン変異体及びその塩はそれ自体既知の
方法により、例えば遺伝子操作法により、例えば前記エ
グリン変異体のいずれかをコードするDNAを含有する形
質転換された宿主微生物を培養し、そして該エグリン変
異体又はその塩を単離することにより製造することがで
きる。本発明のエグリン変異体及びその塩は特に、 ａ）エグリン変異体をコードするDNAを調製し、 ｂ）このDNAをベクターに導入し、 ｃ）得られたハイブリドベクターを形質転換により宿主
微生物に導入し、 ｄ）この形質転換された宿主微生物を前記エグリン変異
体の発現を許容する条件下で培養し、そして ｅ）該エグリン変異体又はその塩を単離する、ことによ
り製造される。

エグリン変異体をコードするDNA 本発明は、エグリン変異体、特に、前に特に好ましい
として記載したエグリン変異体のいずれか、をコードす
るヌクレオチド配列を含有するDNAに関する。

本発明のDNAは好ましくは、その末端に、適当な制限
部位を含みそして該DNAのベクターへの挿入を可能にす
るフランキング配列を有するのが好ましい。

本発明のDNAは、それ自体既知の方法により製造する
ことができる。例えば、DNAを化学的に調製することが
でき、又は化学合成により断片を調製しそしてあらかじ
め定められたように酵素的に連結することができ、ある
いはエグリンＢ又はエグリンＣをコードするDNAを１又
は複数の段階において変異せしめることができる。

DNAの化学合成はそれ自体既知の方法により行われ
る。適当な方法はS.A.Narang 〔Tetrahedron 39,3（198
3）〕及びヨーロッパ特許出願No.146785に記載されてい
る。

本発明のDNAの製造はまた、エグリンＢ又はエグリン
ＣをコードするDNAの変異によっても行うことができ
る。好ましくは、「部位特定変異誘発（site directed
mutagenesis）として知られる方法が用いられる〔M.J.Z
oller等、Meth.Enzym 100,468（1983）を参照のこ
と〕。この方法においては、単鎖エグリンDNAがバクテ
リオファージM13中にクローニングされ、変異を指令す
るヌクレオチドを含有する相補的オリゴヌクレオチドと
ハイブリダイズされ、ハイブリダイゼーション生成物が
補完されて二本鎖が形成され、生じた二本鎖バクテリオ
ファージが形質転換によって適当なエッシエリシヤ・コ
リ(Escherichia coli)宿主に導入され、そして形質転換
されたE.コリ細胞を培養した後、エグリン変異体をコー
ドするDNAを含有する細胞を上記オリゴヌクレオチドと
のハイブリダイゼーションにより固定する。

エグリン変異体をコードするDNAを含有する発現ベクタ
ーの製造 本発明はエグリン変異体をコードするDNA配列を含有
する発現ベクターにも関し、このDNA配列は発現制御配
列により、該発現ベクターにより形質転換された宿主細
胞中で前記エグリン変異体が発現されるように制御され
る。

本発明の発現ベクターは、例えば発現制御配列を含有
するベクターDNAにエグリン変異体をコードするDNAを挿
入して、該発現制御配列が該DNA配列を制御するように
することにより製造される。

適当なベクターの選択は形質転換のために用意される
宿主細胞に基く。適当な宿主は例えば微生物、例えば酵
母、例えばサッカロミセス・セレビシエー(Saccharomyc
es cerevisiae)、及び特に細菌株、特にエッセリシャ・
コリの株、そしてさらにバシルス・ズブチリス(Bacillu
s subtilis)、並びに高等性物、特に樹立されたヒト又
は動物の細胞系である。好ましい宿主細胞はE.コリ(E.c
oli)の株である。

原理的には、選択された宿主中で複製し、そしてエグ
リン変異体をコードする本発明のDNA配列を発現せしめ
るすべてのベクターが適当である。

E.コリ株中でのエグリン変異体の発現のために適当な
ベクターの例にはバクテリオファージ、例えばバクテリ
オファージの誘導体、又はプラスミド、例えば特にプラ
スミドcol E1及びその誘導体、例えばpMB9,pSF2124,pBR
317,又はpBR322がある。本発明の好ましいベクターはpB
R322に由来する。適当なベクターは完全なレプリコンを
含有し、そして発現プラスミドにより形質転換された微
生物の表現型マーカーによる選択及び固定を可能にする
マーカー遺伝子を含有する。適当なマーカー遺伝子は宿
主微生物に例えば抗生物質、重金属等に対する耐性を付
与する。さらに、本発明の好ましいベクターは、前記レ
プリコン及びマーカー遺伝子領域とは別に制限エンドヌ
クレアーゼ認識配列を含有し、これによってエグリン変
異体をコードするDNA配列及び適当な場合には発現制御
配列をそれらの部位に挿入することができる。

発現を制御するために幾つかの発現制御配列を使用す
ることができる。使用される発現制御配列は特に、形質
転換されるべき宿主細胞の強く発現される遺伝子の制御
配列である。ハイブリドベクターとしてpBR322が使用さ
れ、そして宿主微生物としてE.コリが使用される場合、
適当な発現制御配列（特に、プロモーター及びリボゾー
ム結合部位を含有する）は、例えばラクトースオペロ
ン、トリプトファンオペロン、アラビノースオペロン等
の発現制御配列、β−ラクタマーゼ遺伝子の発現制御配
列、及びファージＮ−遺伝子又はファージfd−レヤープ
ロテイン遺伝子等の対応する配列である。β−ラクタマ
ーゼ遺伝子（β−lac−遺伝子）のプロモーターがプラ
スミドpBR322中にすでに含まれている場合、該プラスミ
ドに他の発現制御配列が挿入されなければならない。本
発明において好ましい発現制御配列はトリプトファンオ
ペロン（trp po）のそれである。

酵母における複製及び発現のために適当なベクターは
酵母複製起点及び酵母用選択遺伝子マーカーを含有す
る。酵母複製起点、例えば染色体自律複製セグメント
（ars）を含有するハイブリドベクターは形質転換の後
酵母細胞内で染色体外に維持され、そして有糸分裂の間
に自律複製される。さらに、酵母２μ−プラスミドDNA
に相同な配列を含有するハイブリドベクターを使用する
ことができる。この様なハイブリドベクターは細胞内に
すでに存在する２μプラスミドとの組換により導入さ
れ、又は自律複製する。酵母用の適当なマーカー遺伝子
は特に、宿主に抗生物質耐性を付与する遺伝子である
か、又は栄養要求性酵母変異株の場合には宿主の欠陥を
補完する遺伝子である。対応する遺伝子は、例えば抗生
物質シクロヘキシミドに対する耐性を付与し、又は栄養
要求性酵母変異株において原栄養性を提供する遺伝子で
あり、例えばura3,leu2,his3又は特にtrp1遺伝子であ
る。好ましくは、酵母ハイブリドベクターはさらに細菌
宿主特にE.コリのための複製起点及びマーカー遺伝子を
含有し、これによってハイブリドベクター及びその前駆
体の作製及びクローニングを細菌宿主中で行うことがで
きる。酵母での発現のために適当な発現制御配列は例え
ばtrpl,adhI,adh II又はpho5遺伝子のそれであり、そし
てさらに解糖系に関与するプロモーター、例えばpgk及
びgapdhプロモーターである。

本発明は特に、発現制御配列及びエグリン変異体をコ
ードするDNA配列を含有する複製及び表現型選択が可能
な発現ベクターに関し、該DNA配列は転写開始シグナル
及び停止シグナル並びに翻訳開始シグナル及び終止シグ
ナルと共に、この発現プラスミドにより形質転換された
宿主細胞中でエグリン変異体が発現されるように、該発
現プラスミド中で前記発現制御配列の制御のもとに置か
れる。

効果的な発現を達成するため、エグリン変異体をコー
ドする遺伝子は発現制御配列に対して正しく（「相」
（phase）を合わせて）配置されなければならない。発
現制御配列を、該発現制御配列に天然に連結されている
遺伝子コード配列（例えば、β−lacプロモーターを使
用する場合にはβ−lacコード配列）のATGと主（main）
mRNA開始部との間の領域内で、好ましくは自らの翻訳開
始シグナル（ATG）及び翻訳終止シグナル（例えばTAG）
を有するエグリン変異体遺伝子に連結する。こうするこ
とにより効果的な転写及び翻訳が保証される。

微生物の形質転換 本発明はさらに、形質転換された宿主細胞の製造方法
に関し、この方法はエグリン変異体をコードしておりそ
して発現制御配列により制御されるDNA配列を含有する
発現ベクターにより宿主細胞を形質転換することを含ん
で成る。

適当な宿主細胞は例えば前記の微生物、例えばサッカ
ロミセス・セレビシエー、バチルス・ズブチリス、及び
特にエッセリシヤ・コリである。本発明の発現プラスミ
ドによる形質転換は、例えば文献に記載されているよう
にして、例えばS.セレビシエーについてはA.Hinnen等、
Proc.Natl.Acad.Sci.USA75,1929（1978）;B.ズグチリス
についてはAnagnostopoulos等、J.Bacteriol.81,741（1
961）；及びE.コリについてはM.Mandel等、J.Mol.Biol.
53,159（1970）に記載されている方法により行われる。
形質転換された宿主細胞は有利には、発現プラスミド中
のマーカー遺伝子がそれに対して耐性を付与する殺生物
剤が添加された選択栄養培地から単離される。発現プラ
スミドを含有しない細胞はこの様な培地中で殺される。

本発明はまた、上記の方法により得られる形質転換さ
れた宿主細胞に関する。

形質転換された宿主細胞の培養及びエグリン変異体の回
収 形質転換された宿主細胞はエグリン変異体の製造のた
めに使用される。エグリン変異体の製造方法は、前記の
形質転換された宿主細胞を培養し、そしてこの宿主細胞
から生成物を遊離せしめそして単離することを含んで成
る。

本発明は特に式（Ｉ）のエグリン変異体及び該化合物
の塩の製造方法に関し、この方法においては、質化性炭
素源及び窒素源を含有する液体栄養培地中で、式（Ｉ）
のエグリン変異体をコードしておりそして発現制御配列
により制御されるDNA配列を含有する発現プラスミドに
より形質転換された宿主細胞を培養し、該宿主細胞から
生成物を遊離せしめそして単離し、そして所望によりこ
の方法により得られた式（Ｉ）の複数の化合物の混合物
を個々の成分に分離し、そして所望により得られた塩を
遊離ペプチドに、又は得られたペプチドを塩に転換す
る。

本発明の形質転換された宿主細胞はそれ自体既知の方
法により培養される。例えば、本発明の形質転換された
宿主微生物を培養するために種々の炭素源を使用するこ
とができる。例えば好ましい炭素源は資化性炭水化物、
例えばグルコース、マルトース、マンニトールもしくは
ラクトース、又は酢酸塩であり、これらはそれ自体とし
て又は適当な混合物として使用することができる。好ま
しい窒素源は例えばアミノ酸、例えばカザミノ酸、ペプ
チド及び蛋白質、並びにこれらの分解生成物、例えばト
リプトン、ペプトン又は肉エキス、さらには酵母エキ
ス、マルトエキス、並びにアンモニウム塩、例えば塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム又は硝酸アンモニウム
であり、これらはそれ自体として又は適当な混合物とし
て使用される。使用することができる無機塩は例えば、
ナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムの
硫酸塩、塩化物、リン酸塩及び炭酸塩である。

さらに、培地は例えば増殖促進物質、例えば微量元
素、例えば鉄、亜鉛、マンガン等、及び好ましくは選択
圧を与えそして発現プラスミドを失った細胞の増殖を防
止する物質を含有する。例えば、発現プラスミドがamp^R
遺伝子を含有する場合には培地にアンピシリンが添加さ
れる。この様な抗生物質の添加はまた、抗生物質に感受
性の汚染微生物を殺す効果を有する。

培養はそれ自体既知の方法により行われる。培養条件
例えば温度、培地のpH値、及び発酵時間はエグリン変異
体の最大力価が得られるように選択される。例えば、E.
コリ又は酵母株は、好気的条件下で、攪拌又は振とうし
ながら、約20℃〜40℃、好ましくは約30℃の温度におい
て、そして４〜９のpH値、好ましくはpH7において、４
〜20時間、好ましくは８〜12時間、液深培養する。発現
生成物は細胞内に蓄積する。

細胞密度が適切な値に達した時培養を停止し、そして
微生物の細胞から生成物を遊離せしめる。このため、細
胞を例えば洗剤、例えばSDS又はトリトンで処理するこ
とにより破壊し、あるいはリゾチーム又は類似の作用を
する酵素により溶解する。これに代えて、又はこれに加
えて、機械的力、例えば剪断力（例えば、メープレス、
フレンチプレス、ダイノーミル等による）、又はガラス
ビーズもしくは酸化アルミニウムとの攪拌、又は例えば
液体窒素中での凍結と例えば30℃〜40℃での解凍との反
復、又は超音波を用いて細胞を破壊する。遠心分離の
後、蛋白質、核酸及び他の細胞成分を含有する得られた
混合物中の蛋白質をそれ自体既知の方法により濃縮す
る。例えば、ポリエチレンイミン処理により非蛋白質成
分の大部分を除去することができ、そしてエグリン化合
物を含む蛋白質を、例えば硫酸アンモニウム又は他の塩
により溶液を飽和せしめることにより沈澱せしめる。細
菌性蛋白質もまた、酢酸による酸性化（例えば0.1％、p
H3〜５）により沈澱せしめることができる。エグリン変
異体のさらなる濃縮は、ｎ−ブタノールにより酢酸エチ
ル上清を抽出することにより達成することができる。他
の精製段階には、例えばクロマトグラフィー、例えばイ
オン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、ゲル浸透クロ
マトグラフィー、分配クロマトグラフィー、HPLC、逆相
HPLC等が含まれる。例えば、ゲル電気泳動又はキャリヤ
ーを用いない電気泳動によりチャージした後、混合成分
を、適当なセファデックスカラムを用いて分子サイズに
従う透析により分離し、又はアフィニティークロマトグ
ラフィーのために適切なキャリヤーに連結された抗体、
特にモノクローナル抗体又はアンヒドロキモトリプシン
によるアフィニティークロマトグラフィーにより、ある
いは他の方法、特に文献において知られている方法によ
り成分を分離する。

例えば、発現されたエグリン変異体の単離は次の段階
を含んで成る。遠心分離により培養液から細胞を単離
し、例えばダイノーミル（Dyno-Mill）により細胞を破
壊して粗精製物を調製し、遠心分離により不溶性成分を
除去し、１％酢酸により細菌蛋白質を沈澱せしめ、セフ
ァデックスG50（又はG75）上でゲル濾過し、そして適当
であれば逆相HPLCにかける。塩の除去は、例えばセファ
デックスG25により行う。

エグリン変異体を検出するためには、抗エグリン抗
体、例えばラビットから得られるポリクローナル抗体、
又はハイブリドーマ細胞から得られるモノクローナル抗
体、例えばセルライン299S18-20（CNCM I-361）、299S2
0-1（CNCM I-362）又は299S20-10（CNCM I-363）により
分泌されるモノクローナル抗体を用いて、あるいは標的
プロテアーゼ、例えばヒト白血球エラスターゼ（HLE）
又はカテプシンＣ（CatC）〔U.Seemller等、Hoppe-Se
yler′s Z.physiol.Chem.358,1105（1977）;U.Seemll
er等、Meth.Enzym.80,804（1981）を参照のこと〕の阻
害により、試験することができる。

例えばＲがＨ又はアセチル基である式（Ｉ）の化合物
から成る、本発明の方法に従って得られる式（Ｉ）の化
合物の混合物は、それ自体既知の方法により個々の成分
に分離することができる。適当な分離法は、例えばクロ
マトグラフィー、例えば吸着クロマトグラフィー、イオ
ン交換クロマトグラフィー、HPLC又は逆相HPLC、さらに
多段分配法又は電気泳動法、例えば酢酸セルロース上で
の電気泳動又はゲル電気泳動、特にポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（PAGE）である。

方法に依存して、本発明の化合物は遊離の形で、又は
酸付加塩、内部塩もしくは塩基との塩の形で存在する。
遊離化合物は酸付加塩からそれ自体既知の方法で得るこ
とができる。また、酸又は塩基、例えば前記の塩を形成
するものとの反応及び蒸発又は凍結乾燥による濃縮によ
って遊離化合物から医薬として許容される酸付加塩又は
金属塩を得ることができる。内部塩は、pHを適切な中性
点に調整することにより得ることができる。

医薬製剤 式（Ｉ）の新規なエグリン変異体は価値ある薬理学的
性質を有し、そしてプロテアーゼ阻害剤の使用を必要と
する疾患状態の予防又は治療において使用することがで
きる。

この新規なエグリン変異体はプロテアーゼ阻害剤とし
て次の様に天然エグリンＢ及びＣとは異る活性プロフィ
ールを示す。幾つかのプロテアーゼに対する阻害作用が
上昇し、又は天然エグリンにより阻害されないプロテア
ーゼの幾つかはエグリン変異体により強く阻害され、他
方エグリンの天然標的プロテアーゼの幾つか、例えば顆
粒球エラスターゼに対する阻害作用は低下し、又は消失
する。例えば、Ｒが水素又はアセチル基であり、ＷがTy
r又はHisであり、ＸがProであり、ＹがMet^-であり、そ
してＺがAspである式（Ｉ）の化合物は、天然エグリン
と比較して、ヒト及び動物の顆粒球エラスターゼに対す
る上昇した阻害作用を示し、そしてそれ故に、天然エグ
リンと同様に、例えば肺気腫、ARDS（acute respirator
y distress Syndrome;急性呼吸困難症候群）、敗血性シ
ョック、リューマチ性関節炎及び膵臓繊維症の治療のた
めに使用することができる。天然エグリンとは異なり、
Ｒ及びＷが式（Ｉ）について前記した意味を有し、Ｘが
Thrであり、ＹがArg又はLysであり、そしてＺがAspであ
る式（Ｉ）の化合物はトリプシンに対して顕著な阻害作
用を有し、そして顆粒球エラスターゼ及びカテプシンＣ
に対してはわずかな作用を有するのみである。これは特
に、Ｒがアセチル基であり、ＷがTyrであり、ＸがThrで
あり、ＹがArgであり、そしてＺがAspである式（Ｉ）の
化合物においてそうである。これらの化合物は、アプロ
チニンと同様に、例えば膵臓炎、外傷性膵臓性及び出血
性ショックの治療のために使用することができる。R,W
及びＸが式（Ｉ）について前記した意味を有し、ＹがAr
g又はLysであり、そしてＺがAspである式（Ｉ）の化合
物はトロンビンに対する顕著な阻害作用を有し、そして
好ましくはアンチトロンビンIIIと組み合わせて、例え
ば血栓症、血栓塞栓症、敗血性及び外傷後ショック並び
に凝固異状症の治療のために使用することができる。

本発明は、本発明の化合物又はその医薬として許容さ
れる塩の少なくとも一種類を含有し、適当な場合にはさ
らに常用の医薬として許容されるキャリヤー及び／又は
アジュバンドを含有する医薬組成物に関する。

これらの組成物は特に上記の疾患の場合に使用され、
例えば非経腸的に、例えば静脈内に、皮肉に、皮下に又
は筋肉内に投与され、あるいは局所投与される。

本発明はまた、特に上記の症状の場合にヒト又は動物
体の予防的及び治療的処理のための、本発明の新規化合
物又はそれを含有する医薬組成物の使用に関する。

投与量は特に、特定の投与形及び治療又は予防の目的
に依存する。単位投与のサイズ及び投与スケジュールは
存在する特定の不全の個々の評価に基いて決定すること
ができ、関連する因子、例えば血液因子を決定するため
の必要な方法は当業者によく知られている。

トロンビン阻害性エグリン変異体の場合、注射におけ
る療法的有効量は約0.005〜約0.1mg/kg体重の範囲であ
る。約0.01〜0.05mg/kgの範囲が好ましい。投与は静脈
内注射、筋肉注射又は皮下注射により行われる。従っ
て、単位投与形での非経腸投与のための医薬調製物は、
投与方法に依存して約0.4〜約7.5mgの本発明の化合物を
含有する。上記の成分に加えて、これらの医薬組成物は
通常さらに、pHを約3.5〜７に維持するためのリン酸緩
衝液、そしてさらに浸透圧を調整するための塩化ナトリ
ウム、マンニトール又はソルビトールを含有する。これ
らは凍結乾燥形でもよく、又は溶解した形でもよく、そ
して溶液は好ましくは抗菌性防腐剤、例えば0.2〜0.3％
４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル又はエチルエス
テルを含有する。

トロンビン阻害性エグリン変異体を局所使用するため
の調製物は、水溶性、ローションもしくはゼリー、油性
溶液もしくは懸濁液、又は脂肪含有軟こうもしくは特に
乳化軟こうの形であることができる。例えば、本発明の
活性成物又はその医薬として許容される塩をpH4〜6.5の
水性緩衝液中に溶解し、そして所望により他の活性成
分、例えば抗−炎症剤及び／又はポリマー増粘剤、例え
ばポリビニルピロリドン、及び又は防腐剤を添加するこ
とにより水溶液の形の製剤が得られる。活性成分の濃度
は10mlの溶液又は10gのゼリー当り約0.1〜1.5mg、好ま
しくは0.25〜1.0mgである。局所投与のための油状形は
例えば、本発明の活性成分又はその医薬として許容され
る塩を油に懸濁せしめることにより得られ、この場合、
適当であれば湿潤剤、例えばステアリン酸アルミニウ
ム、及び／又はHLB値（親水性−親脂性バランス）が10
未満である界面活性剤、例えば多価アルコールの脂肪酸
モノエステル、例えばモノステアリン酸グリセロール、
ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノステアレー
ト又はソルビタンモノオレエートを添加する。例えば、
本発明の活性成分又はその塩を、適当であれば10未満の
HLB値を有する界面活性剤の添加と共に、伸展性脂肪基
剤中に懸濁せしめることにより脂肪含有軟こうが得られ
る。本発明の活性成分又はその塩の水溶液を、10未満の
HLB値を有する界面活性剤の添加と共に軟い伸展性脂肪
基剤中ですりつぶすことにより乳化軟こうが得られる。
これらの局所投与形のすべてが防腐剤を含有することが
できる。活性成分の濃度は約10gの基剤に対して約0.1〜
1.5mg、好ましくは0.25〜1.0mgである。

エラスターゼ阻害性エグリン変異体の投与は静脈内注
射により、又は肺内に、例えばバード（Bird）装置を用
いる吸入により行われる。従って、単位投与形の非経腸
投与用の医薬製剤は、投与の態様に従って投与当り約10
〜50mgの本発明の化合物を含有する。活性成分に加え
て、これらの医薬組成物は通常さらに浸透圧を整えるた
めに塩化ナトリウム、マンニトール又はソルビトールを
含有する。これらは凍結乾燥形でも溶解した形でもよ
く、そして溶液は好ましくは抗菌性防腐剤、例えば0.2
〜0.3％の４−ヒドロキシ安息香酸メチルエステル又は
エチルエステルを含有する。

エラスターゼ阻害性エグリン変異体の局所用製剤は実
質的に上記のものに対応する。

肺内投与により呼吸器を処理するための吸入製剤は例
えば、薬理学的活性成分を溶液又は懸濁液の滴の形で分
散することができるエーロゾル又はスプレーである。薬
理学的活性成分が溶液の形で含まれる製剤は、これとは
別に、適当な推進剤、そしてさらに必要であれば追加の
溶剤及び／又は安定剤を含有する。推進ガスの代りに圧
縮空気を使用することもでき、そしてこれは必要に応じ
て適当な圧縮及び放出装置を用いて作ることができる。
医療において知られておりそして使用されているバード
呼吸装置が投与のために特に適当であり、この場合、活
性成分の溶液が装置に導入され、そしてわずかな過剰圧
を伴って気化され、そして患者の呼吸の際に肺に導入さ
れる。

エラスターゼ阻害性エグリン変異体の場合、体重約70
kgの温血動物（ヒト又は動物）のための投与量は、年
齢、個体の状態及び疾患の種類に依存し、肺内経路で投
与される場合には吸入（１日１〜２回）当り約10mg〜約
30mgであり、そして例えば長期間注入により静脈内投与
される場合には約10mg〜約1000mg/日である。ELISAのご
とき免疫学的方法により決定することができる療法的に
有効な咯痰濃度及び血漿濃度は10〜100μg/ml（約１〜1
0μmol/l）の範囲である。

トリプシン阻害性エグリン変異体の投与は、例えば非
経腸的に、例えば静脈内注射、筋肉内注射、又は皮下注
射により行われる。療法的有効量は体重kg当り約１〜20
mgの活性成分の範囲である。この医薬製剤は約0.1〜約1
00mg/ml溶液の濃度で活性成分を含有する。活性成分に
加えて、これらの医薬製剤さらに緩衝剤、例えばリン酸
緩衝剤（上記参照のこと）、及び浸透圧調整用の塩化ナ
トリウム、マンニトール又はソルビトールを含有する。

殺病害虫剤 式（Ｉ）の新規なエグリン変異体はまた植物の病虫害
の駆除のためのプロテイナーゼ阻害剤として使用するこ
ともできる。植物の種々の属に自然に存在するセリンプ
ロテアーゼ阻害物質から、植物害虫、真菌及び他の微生
物におけるセリンプロテアーゼを阻害することによりエ
グリン変異体がこれらの生物に対する効果的な保護をも
たらすことが予想される。さらに、外来性プロテアーゼ
阻害物質、例えばエグリンＢもしくはＣ又は式（Ｉ）の
エグリン変異体をコードするDNAにより単子葉植物及び
双子葉植物のいずれをも形質転換することができる。対
応する活性プロテイナーゼ阻害物質の発現が、形質転換
された植物に、植物病害虫による攻撃に対する保護を提
供する。

発現制御配列及び本発明の化合物をコードするDNAを
含有する適当な発現ベクターによる植物の形質転換のた
めに既知の方法例えば、プロトプラスト又は単離された
組織断片と適当なベクターを含有するアグロバクテリウ
ムとの同時培養及びこれに続く完全植物の再生、あるい
は適当な未修飾又は修飾ウイルス、例えばTMV（タバコ
モザイクウイルス）又はCaMV（カリフラワーモザイクウ
イルス）によるベクターの移行が好ましい。他の方法
は、例えば、PEGによる、エレクトロポレーションによ
る、単離されたプロトプラスト、植物カルスもしくは胚
へのDNAのマイクロインジェクションによる、又はマイ
クロプロジェクティル・ボンバードメント（microproje
ctile bombardment）による単離されたDNAの直接移行
（好ましくは、単子葉植物、例えばトウモロコシ、オー
ト、大麦、稲、サトウモロコシ、小麦、サトウキビ等の
場合）である。

本発明の化合物をコードするDNA分子は植物の形質転
換のために適当である。Ｒがアセチルであり、ＷがTyr
であり、ＸがThrであり、ＹがArgであり、そしてＺがAs
pである式（Ｉ）のエグリン変異体をコードするDNA分子
が好ましい。対応する好ましいエグリン変異体のプロテ
アーゼ阻害作用はトウモロコシ害虫ダイアブロチカ・ビ
ルギフェラ(Diabrotica virgifera)（ウエスタン・コー
ン・ルート虫）を用いる試験により述べることができ
る。この害虫の腸組織のホモジネートに好ましいエグリ
ン変異体を添加することにより蛋白質分解活性の顕著な
阻害が生ずる。

本発明は特に、次の例に記載するエグリン変異体、そ
れをコードするDNA、該DNAを含有する発現プラスミド、
該プラスミドを含有する宿主微生物、及びこれらの製造
方法に関する。

次に例により本発明をさらに具体的に説明するが、こ
れにより本発明の範囲を限定するものではない。

例1.エグリンＣ遺伝子のM13のクローニング 約0.5μｇの230bp EcoRI-BamHI断片（完全なエグリン
Ｃ遺伝子を含有する）を10μｇのプラスミドpML 147か
ら、制限エンドヌクレアーゼEcoRI及びBamHIによる消
化、及びそれに続く1.5％低融点アガロース中での電気
泳動により単離する。このDNA断片（10mg）を40ngのM13
mp 8（EcoRI及びBamHIによりあらかじめ消化したもの）
と混合し、そして50mM Tris-HCl（pH7.4）、10mM MgC
l₂,10mM ATP,10mMジチオスレイトール中0.125ユニット
のT4 DNAリガーゼの存在下、15μｌの溶量中でインキュ
ベートする〔Zoller等、Methods Enzym 100,468-500（1
983）〕。得られる溶液を用いてE.コリJM 101株（Zolle
r等、上記参照のこと）を形質転換する。形質転換混合
物をX-Gal（IPTG−指示寒天）プレート（Zoller等、上
記）上にコートする。40個の青（野性型プラーク）及び
650個の無色のプラークが得られる。

例2.M13mp 8単鎖のDNAの調製 E.コリJM 101の培養物（Ｌ培地:1中10gのバクトト
リプトン、5gのバクト酵用エキス、5gのNaCl、5gのグル
コース、0.1gのアンピシリン中でOD₆₂₃＝約0.5まで増殖
したもの）を2mlを無色プラーク（寒天プレートから取
ったもの、例１を参照のこと）共にインキュベートし、
そして37℃、180回転／分にて約４〜５時間維持する。
次に、増殖した培養物をエッペンドルフ遠心管中で５分
間遠心する。上清を新たな遠心管に移し、再び遠心し、
200μｌの20％のポリエチレングリコール、1.5M NaClを
加え、そして全体を室温にて20分間保持し、そして次に
再度遠心する。上清を廃棄し、ペレットを100μｌの50m
M Tris-HCl（pH7.8）、1mM EDTA（TE）に溶解する。こ
の混合物を50μｌのフェノール/TEと混合し（室温にて1
5分間）、そして次にエッペンドルフ遠心管中で５分間
遠心する。10μｌの酢酸ナトリウム（pH6）及び３容量
の無水エタノール（250μｌ）を100μｌの上清に添加
し、そして全体を−20℃にて一夜保持し、そして上記の
ようにして10分間遠心する。ペレットを1mlの80％エタ
ノールで洗浄し、そして再び遠心する。ペレットを室温
にて10分間乾燥し、そして次に50μｌのTEに溶解する。
この溶液は約５μｇのM13mp8単鎖DNAを含有する。

例3.〔Arg⁴⁵〕−エグリンＣをコードする遺伝子の調製 a.変異体オリゴヌクレオチドのキナーゼ処理変異誘発の
ため、下記のヌクレオチドを化学合成により調製する。

10μｌのオリゴヌクレオチド（10D/ml＝500ng）を、2
0μｌの0.07M Tris-HCl（pH7.6）、0.01M MgCl₂,50mMジ
チオスレイトール中で〔−³²P〕ATP及びT4オリヌクレオ
チドキナーゼ（ベーリンガー）と共にキナーゼ処理する
（Molecular Cloning,A Laboratory Manual,T.Maniatis
等編、125頁を参照のこと）。キナーゼ処理したオリゴ
ヌクレオチドを10μｌのTEに溶解する。（50ng/μ
ｌ）。

10μｌの50mM Tris-HCl（pH7.8）、100mM MgCl₂中１
μｇのM13mp 8単鎖DNA及び50ngのキナーゼ処理されたオ
リゴヌクレオチドプライマーを45℃（30分間）に保持
し、そして次に室温（５分間）に保持する（アニールさ
せる）。

次に、この混合物に下記のものを添加する。

１μｌずつの10mM dATP,dGTP,dCTP及びdTTP; １μｌのT4DNAリガーゼ； ２μｌの50mMジチオスレイトール； １μｌの10mM ATP; １μｌの5mg/mlのゼラチン； １μｌの10倍濃度のKlenow緩衝液〔0.66M Tris-HCl（pH
7.6）、50mM MgCl₂,50mM ジチオスレイトール〕； １μｌのDNAポリメラーゼ（Klenow断片）＝2.5ユニッ
ト。

この混合物を22℃にて５分間そして次に15℃にて16時
間保持し、そして最後に１％アガロース中で電気泳動に
より分離する。生ずる環状二本鎖DNAを臭化エチジウム
で可視化し、そして電気溶出によりゲルから単離する
（15μｌのTE中約10ng）。

こうして得られた５μｌ（＝約3.5ng）のDNAを用いて
E.コリJM 101を形質転換し、そしてX-Gal/IPTG指示プレ
ート（例１を参照のこと）にコートする。約100倍の無
色のプラークが得られる。

これらのプラークの40個を用いて2mlのE.コリJM101培
養物（例２を参照のこと）に接種する。培養（例２）の
後、E.コリ細胞を上清（ファージ及び単鎖DNAを含有す
る）から遠心分離する（細胞ペレットは対応する変異し
た二本鎖DNAをすでに含有する）。

各場合に40個のファージ上清50μｌをニトロセルロー
ス上で濾過し、洗浄し（２×TE）、真空下で80℃にて２
時間保持し、そしてサザン法〔J.Mol.Biol.98,503-517
（1975）〕に従って、前記のオリゴヌクレオチドプライ
マーを放射性プローブとして用いて（ハイブリダイゼー
ション）、変異したDNA配列（III、前記スキームを参照
のこと）の存在について試験する。これは、〔Arg⁴⁵〕
エグリンＣ遺伝子を含有する12個の可能性あるファージ
上清をもたらす。これらの陽性ファージ上清の４個を希
釈（約1:105）し、E.コリJ M101株と混合し、そして指
示寒天上にコートする。３個ずつの生ずるプラークのフ
ァージを単離する。これから上記のようにして単鎖DNA
を単離する。これら12個の単鎖DNAをSanger〔Science21
4,1205（1981）;Proc.Natl.Acad.Sci.USA.74,5463（197
7）〕法に従って配列決定する。12個すべての単鎖DNAが
目的とする変異したエグリンＣ配列を示す。

次に、ミニプレパラーション法により、対応するE.コ
リ細胞ペレット（上記）から、各変異した二本鎖DNA
（プラスミドM13mp 8中〔Arg⁴⁵〕エグリンＣ遺伝子）を
調製する。制限エンドヌクレアーゼEcoRI及びBamHIによ
る制限消化により、変異した遺伝子を含有するEcoRI-Ba
mHI挿入部をベクターから切り取り、単離し、そしてベ
クターpHRi 148/EcoRI/BamHI（ヨーロッパ特許出願No.1
46785）中にクローン化する。これにより生ずるプラス
ミドpJB 618を単離し、そしてE.コリHB 101株に形質転
換する。プラスミドpJB618により形質転換された株をE.
コリ HB101/pJB 618と称する。

例4.〔Pro⁴⁴〕−エグリンＣをコードする遺伝子の調製 〔Thr⁴⁴〕→〔Pro⁴⁴〕変異は、例３に記載したのと同
様にして行われる。変異系オリゴヌクレオチドは次の構
造： を有する。エグリンＣ遺伝子の変異は次のスキームに示
される。

変異混合物を処理して、18個の可能性ある 〔Pro⁴⁴〕−エグリンＣ変異体が得られる。

〔Pro⁴⁴〕−エグリンC DNAをベクターpHRi148/EcoRI/Ba
mHI中にクローニングすることにより、例３に記載した
のと同様にしてプラスミドpJB591を得る。このプラスミ
ドにより形質転換されたE.コリHB 101株をE.コリHB 101
株/pJB591と称する。

例5.〔Arg⁴⁵,Ser⁴⁶〕−エグリンＣをコードする遺伝子
の調製 〔Leu⁴⁵,Asp⁴⁶〕→〔Arg⁴⁵,Ser⁴⁶〕の変異を例３に記
載したのと同様にして行う。変異原オリゴヌクレオチド
は次の構造： を有する。

エグリンＣの変異は次のスキームにより表わされる。

変異混合物を処理した後、12個の可能性ある〔Arg⁴⁵,
Ser⁴⁶〕−エグリンＣ変異体遺伝子が得られる。例３に
記載したのと同様にして、 〔Arg⁴⁵,Ser⁴⁶〕−エグリンＣ−DNAをベクターpHRi 148
/EcoRI/BamHIにクローニングすることによりプラスミド
pML147/bを得る。このプラスミドにより形質転換された
E.コリHB 101株をE.コリHB 101/pML147/bと称する。

例6.形質転換されたE.コリ株の培養 形質転換されたE.コリHB 101株を5mlのＬ培地（例２
を参照のこと）中で、37℃、250回転／分にて培養す
る。次に、この一夜培養物1mlを25mlののM9培地に移
す。M9培地は次の組成を有する（ｌ当り）。

Na₂HPO₄・7H₂O 13.25g KH₂PO₄ 3.0g NaCl 0.5g NH₄Cl 1.0g CaCl₂・2H₂O 0.015g MgSO₄・7H₂O 0.25g カザミノ酸 2.5g ビタミンB₁ 0.0099g グルコース 5.0g アンピシリン 0.1g 培養を37℃にて250回転／分で行う。８〜10時間後、
培養物はエグリンＣ変異体の最高力価を達成する〔U.Se
emller等、Hoppe-SeylerS′ Z.Physiol.Chem.358,110
5（1977）〕に従ってプロテアーゼヒト白血球エラスタ
ーゼを測定することにより決定する〕。

例7.エグリン変異体の単離及び精製 生産（overproducing）E.コリ株をダイノミルにより
機械的に破砕する。細胞破片をソルバル遠心機中で9000
回転／分にて遠心分離する。酸に対するエグリン変異体
の高い安定性のため、上清中の外来蛋白質の大部分が約
20％の酢酸による沈澱によって除去することができる。
10mlの40％酢酸水溶液を100mlの上清に10分間以内にピ
ペットで滴加する。この酸性溶液（pH3.4）を氷で冷却
しながら１時間攪拌する。沈澱した外来蛋白質及び他の
細胞成分をソルバル遠心機中で9000回転／分にて30分間
遠心する。上清を、ビルティス・フリーズモビール（Vi
rtis Freezemobile）中で一夜凍結乾燥する。

乾燥した黄味がかった凍結乾燥物を10mlの10mM Tris-
HCl（pH7.8）中に溶解し、そして短時間遠心して溶液を
透明にする（ソルバルSS34:15000回転／分。10分間）。
この透明な黄色上清を100cmの長さ及び直径2.5cmの平衡
化したセファデックスＧ−50スーパーファインカラム
（ファルマシア）に加える。10mM Tris-HCl（pH7.8）に
より最大20ml/時の流速で溶出を行う。溶出液の吸光度
を280nmにて記録する。10mlの画分を集める。溶出ダイ
アグラムは問題のエグリン変異体を含有する高いピーク
（画分31-40）を示す。これらの画分中のエグリン変異
体の純度をSDSゲル電気泳動及びHPLCにより確認する。
ゲル濾過後、エグリン変異体の純度は約99％である。

エグリン変異体画分からの緩衝液の除去を、YM−２膜
（MWCO2000）を用いるアミコン濃縮セルを用いて行う。
限界濾過の後、サンプルを再び凍結乾燥する。無色の粉
末が得られ（約250mg/100mlダイ／ミル破砕物）、これ
を−20℃にて貯蔵する。

例8.エグリン変異体の物理化学的性質 a.〔Pro⁴⁴〕−エグリンＣ 例７に従って精製した〔Pro⁴⁵〕−エグリンＣをFAB-M
Sによる分子量の決定にかける。分子イオンピーク（M-H
⁺）を8130.6において確認する。従って、この方法に従
って得られた生成物はＮ−アセチル−〔Pro⁴⁴〕−エグ
リンＣ（M-H⁺の理論値:8130.07）である。

このエグリン変異体のトリプシン分解により７個の断
片が生じ、この内、変異Thr⁴⁴→Pro⁴⁴を含有する４個の
断片のみがＮ^α−アセチル−エグリンＣの対応する断片
（ヨーロッパ特許出願No.146785を参照のこと）と異
る。このエグリン変異体はＮ^α−アセチル−〔Pro⁴⁴〕
−エグリンＣと命名される。

PAGE-SDSゲル電気泳動〔U.K.Laemmli,Nature227,680-
685（1970）を参照のこと〕において、Ｎ^α−アセチル
−〔Pro⁴⁴〕−エグリンはＮ^α−アセチル−エグリンＣ
と同様の挙動を示す。

b.〔Arg⁴⁵〕−エグリンＣ 精製された〔Arg⁴⁵〕−エグリンＣの分子量の決定
は、8175.4〔M-H⁺〕の値をもたらす。従って、この場合
においてもＮ−アセチル化合物が存在する（M-H⁺の理論
値は8175である）。トリプシンによる酵素分解によっ
て、この化合物がＮ^α−アセチル−〔Arg⁴⁵〕−エグリ
ンＣであることが明らかになる。

PAGE-SDSゲル電気泳動において、Ｎ^α−アセチル−
〔Arg⁴⁵〕−エグリンＣもまたＮ^α−アセチル−エグリ
ンＣと同様の挙動を示す。

c.〔Arg⁴⁵,Ser⁴⁶〕−エグリンＣ 精製された〔Arg⁴⁵,Ser⁴⁶〕−エグリンＣの分子量の
決定は8148.7〔M-H⁺〕の値を与える。従って、この場合
にも、Ｎ−アセチル化合物が存在する（M-H⁺の理論量は
8149.1である）。この化合物がＮ^α−アセチル−〔Arg
⁴⁵,Ser⁴⁶〕−エグリンＣであることが示される。

PAGE-SDSゲル電気泳動において、Ｎ^α−アセチル−
〔Arg⁴⁵,Ser⁴⁶〕−エグリンＣもまたＮ^α−アセチル−
エグリンＣと同様の挙動を示す。

例9.エグリン変異体の動態的（kinetic）特徴 阻害定数Kiの決定を、N.Braum等〔Biol.Chem.Hoppe-S
eyler 368,299-308（1987）〕に従って、プロテアーゼ
−阻害物質−基質混合物からのｐ−ニトロアニリンの放
出の定常反応速度を測定することにより行う。阻害物質
濃度のみを変える。OD₄₀₅対時間の曲線が直線的であっ
たから、ｐ−ニトロアニリンの放出は10〜20分間に入
る。種々の勾配からKiを決定することができる。使用さ
れるプロテアーゼは白血球エラスターゼ（HLE）、キモ
トリプシン及びトリプシンである。阻害定数の例を次の
表に示す。

この結果が示すところによれば、Leu⁴⁵をArg⁴⁵と交換
することによりエグリンＣ変異体が得られ、この変異体
は天然エグリンＣとは対照的に、非常に強いトリプシン
阻害物質であるが、しかし弱いHLE阻害物質である。

例10.酵母での〔Arg⁴⁵〕−エグリンＣ及びＮ^α−アセチ
ル〔Arg⁴⁵〕−エグリンＣの発現酵母での外来遺伝子発
現系は、外来遺伝子の挿入のためのユニーク制限部位に
より分離されタンデム配置された強力な酵母プロモータ
ー、好ましくは誘導性プロモーター、及び酵母転写停止
シグナルを必要とする。発現ベクターはまた、酵母での
自律複製を可能にしそしてプラスミドの高コピー数を導
く酵母DNA配列を含有する。これらの配列は好ましくは
酵母２μ配列である。ベクターはまた、酵母選択マーカ
ー、好ましくは酵母LEU2遺伝子、並びにE.コリでの増幅
のための複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含むpB
R322 DNA配列を有する。

前記の適当な発現系はヨーロッパ特許出願No.100,561
に公表されており、そして酵母中で非常に効率的である
ことが示されている。外来遺伝子は酵母酸性ホスファタ
ーゼの誘導体PH05プロモーターの制御のもとに発現され
る。PH05プロモーター、外来遺伝子及びPH05転写停止シ
グナルがタンデムにプラスミドpJDB 202に挿入される。
このものは酵母２μ配列、酵母LEU 2遺伝子、E.コリ複
製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含有する。

発現プラスミドpJDB 207R/PH05−〔Arg⁴⁵〕EGLを次の
様にして作製する。

ａ）pJDB 207ベクターの断片の単離 ６μｇのプラスミドpJDB 207R/IF（α−３）（EP100,
561）を制限エンドヌクレアーゼBamHIにより完全消化す
る。6.85kb及び1.15kbのサイズの生ずるDNA断片をエタ
ノールで沈澱せしめ、400μｌの50mM Tris-HCl（pH8.
0）中に再懸濁し、そして4.5ユニットのウシ腸アルカリ
ホスファターゼ（ベーリンガー・マンハイム）を添加す
る。この混合物を37℃にて１時間インキュベートする。
次に、65℃にて1.5時間インキュベートしてホスファタ
ーゼを不活性化する。この溶液を150mM NaClに調整す
る。DNA溶液を、150mM NaCl及び1mM EDTAを含有する10m
M Tris-HCl（pH7.5）により平衡化されたDE52（ワット
マン）イオン交換体の100μｌのベッドに適用する。同
じ緩衝液で洗浄した後、400μｌの10mM Tris-HCl（pH7.
5）、1.5M NaCl及び1mM EDTAによりDNAを溶出し、そし
てエタノールで沈澱せしめる。トリス−ボレート−EDTA
緩衝液（pH8.3）中0.6％低融点アガロースゲル上で大6.
85kb BamHI断片を小断片から単離する。

ｂ）534bp PH05プロモーター断片の単離 10μｇのプラスミドp31/R（EP 100,561）を制限エン
ドヌクレアーゼEcoRI及びBamHIにより消化する。生ずる
３個の断片をTris−ボレート−EDTA緩衝液（pH8.3）中
で0.6％低融点アガロースゲル上で分離する。mRNA出発
部位を含むPH05プロモーターを含有する534bp BamHI-Ec
oRI断片を単離する。

ｃ）〔Arg⁴⁵〕エグリンＣのコード配列を含有する230bp
DNA断片の単離 ８μｇのプラスミドpJB618を制限エンドヌクレアーゼ
BamHI及びEcoRIにより消化する。生ずる２個のDNA断片
を0.6％低融点アガロースゲル上Tris−ボレート−EDTA
緩衝液（pH8.3）中で分離する。230bp断片を単離する。

ｄ）DNA断片の連結 適切な接着末端を有する３種類のDNA断片を１反応で
連結する。0.1pmole（0.45μｇ）の6.85kb BamHIベクタ
ー断片、0.2pmole（70ng）の534bp BamHI-EcoRI PH05の
プロモーター断片、及び0.2pmole（29ng）のpJB618の23
0bp EcoRI-BamHI断片を連結する。これら３種類のDNA断
片のすべてが低融点アガロースの小ゲルブロックに含ま
れている。３個のアガロースゲル断片をプールし、65℃
にて液化し、そして２倍に稀釈する。合計270μｌの60m
M Tris-HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂,10mM DTT,1mM ATP中
で、16ユニットのT4DNAリガーゼ（ベーリンガー・マン
ハイム）を用いて、15℃にて16時間連結を行う。この連
結混合物の10μｌのアリコートを100μｌのカルシウム
処理された形質転換受容性（transformation competen
t）E.コリHB101細胞に加える。

24個の形質転換されたamp^Rコロニーを100μg/mlのア
ンピシリンを含有するLB培地中に別々に増殖せしめる。
Holmes等〔Anal.Biochem.114,193（1981）〕の方法によ
りプラスミドDNAを調製し、そしてHind III/EcoRI二重
消化により分析する。600bp EcoRI-Hind III断片の出現
により、特定のクローンが正しい方向で発現ベクターに
挿入されたPH05プロモーター〔Arg⁴⁵〕エグリンＣ−DNA
断片を有するが示される。予想通り、約50％のクローン
が正しい方向の挿入部を有する。これらのクローンの１
つを単離し、そしてpJB207R/PH05−〔Arg⁴⁵〕EGLと称す
る。

ｅ）サッカロミセス・セレビシエーGRF18の形質転換 プラスミドpJDB207R/PH05〔Arg⁴⁵〕EGLをサッカロミ
セス・セレビシエーGRF18（α,his 3−11,his 3−15,Le
u 2−3,Leu 2−112,can^R）にHinnen等〔Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA75,1929（1978）〕により記載された形質転換
法を用いて導入する。形質転換された酵母細胞を、ロイ
シンを欠く酵母最少培地プレート上で選択する。形質転
換された単一コロニーを単離し、そしてサッカロミセス
・セレビシエーGRF18/pJDB207R/PH05−〔Arg⁴⁵〕EGLと
命名する。

ｆ）サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207R/PH0
5−〔Arg⁴⁵〕EGLの発酵並びに〔Arg⁴⁵〕−エグリンＣ及
びＮ^α−アセチル−〔Arg⁴⁵〕−エグリンＣの回収 サッカロミセス・セレビシエーGRF18/pJDB207R/PH05
−〔Arg⁴⁵〕−EGLの細胞を、0.03g/lのKH₂PO₄を含有す
る3l最少培地中で、ミニバイオリアクター（Mini-Biore
actor）中30℃にて増殖せしめ、そしてOD₆₀₀＝1.9にて
収得する。

〔Arg⁴⁵〕−エグリンＣ及びＮ^α−アセチル−〔Arg⁴⁵〕
−エグリンＣが約2:1（w/w）の比率で発現される。例７
においてE.コリについて記載した方法に従って、両生成
物を酵母細胞ホモジネートから単離することができる。

例11.医薬製剤 例７に従って調製されたＮ^α−アセチル−〔Arg⁴⁵〕
−エグリンＣを含有する溶液を0.9％NaCl溶液に対して
透析する。次に同じNaCl溶液で稀釈することにより溶液
の濃度を1mg/ml又は10mg/mlに調整する。これらの溶液
を限外濾過（0.22μｍの孔を有する膜）により無菌化す
る。

この無菌化溶液は静脈内投与のため、又は長期間の点
滴注入のための直接使用することができる。

微生物の寄託 E.コリHB 101/pML147株が1988年１月28日に、Deutsch
e Sammlung von Mikroorganismen（DSM）,Mascheroder
weg 1b,D-3300 Braumschweigに、No,DSM 4380として寄
託された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＢＥ 1/21 ＡＢＮ 9/99 ＡＣＤ 15/09 ＡＣＪ Ｃ１２Ｐ 21/02 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 ダーク ハインツ ドイツ連邦共和国，7888 ラインフェル デン，ボッカーレシュトラーセ 14 (72)発明者 マンフレート リールシュ スイス国，4125 リーエン，リュッティ リンク 26

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の式（Ｉ）： （式中、Ｒは水素又はアセチル基であり、ＷはTyr又はH
   isであり、ＸはThr,Ser又はProであり、ＹはLeu,Met,Ar
   g,Lys,Phe,Tyr又はTrpであり、そしてＺはAsp,Glu,Gln,
   Asn,Ala,Ser又はThrであり、但しＹがLeuでありそして
   ＺがAspである場合にはＸはThr以外である） で表わされる化合物、並びその塩。
2. 【請求項２】Ｒがアセチル基であり、ＷがTyrであり、
   そして（１）ＸがThrであり、ＹがArg又はLysでありそ
   してＺがAsp,Glu,Gln,Asn,Ala,Ser又はThrであるか、あ
   るいは（２）ＸがProであり、ＹがMetでありそしてＺが
   Aspであるか、あるいは（３）ＸがThrであり、ＹがPhe,
   Tyr,Trp又はMetでありそしてＺがAspである、請求項１
   に記載の式（Ｉ）の化合物、及びその塩。
3. 【請求項３】Ｒがアセチル基であり、ＷがTyrであり、
   ＸがThrであり、ＹがArgであり、そしてＺがAsp又はSer
   である、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物、及びその
   塩。
4. 【請求項４】Ｎ^α−アセチル〔Arg⁴⁵〕−エグリンＣで
   ある請求項１に記載の化合物。
5. 【請求項５】請求項１〜４のいずれか１項に記載の式
   （Ｉ）の化合物又はその医薬として許容される塩を含ん
   で成るプロテアーゼ阻害剤。
6. 【請求項６】請求項１〜４のいずれか１項に記載の式
   （Ｉ）の化合物及びその塩の製造方法であって、式
   （Ｉ）の化合物をコードするDNAを含有する形質転換さ
   れた宿主微生物を培養し、そしてこの培養物から式
   （Ｉ）の化合物又はその塩を単離する、ことを含んで成
   る方法。
7. 【請求項７】請求項１〜４項のいずれか１項に記載の式
   （Ｉ）の化合物をコードするDNA配列を含有するDNA。
8. 【請求項８】請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合
   物をコードしそして発現制御配列により制御されるDNA
   配列を含有する発現ベクター。
9. 【請求項９】請求項８に記載の発現ベクターを含有する
   宿主微生物。
10. 【請求項１０】請求項１〜４のいずれか１項に記載の式
    （Ｉ）の化合物をコードするDNA配列を含有するDNAの製
    造方法であって、化学合成によって該DNAを調製する
    か、又は、化学合成によってその断片を調製しそしてこ
    れらを一定の態様で酵素的に連結し、あるいはエグリン
    Ｂ又はエグリンＣをコードするDNAを１又は複数の段階
    において変異せしめる、ことを含んで成る方法。
11. 【請求項１１】請求項１〜４のいずれか１項に記載の式
    （Ｉ）の化合物をコードしそして発現制御配列によって
    制御されるDNA配列を含有する発現ベクターの製造方法
    であって、発現制御配列を含有するDNAベクターに式
    （Ｉ）の化合物をコードするDNA配列を挿入して該発現
    制御配列が該DNA配列を制御するようにする、ことを含
    んで成る方法。
12. 【請求項１２】請求項11の方法に従って得られる発現ベ
    クターを含有する宿主微生物の製造方法であって、式
    （Ｉ）の化合物をコードしそして発現制御配列により制
    御されるDNA配列を含有する発現ベクターを用いて宿主
    を形質転換する、ことを含んで成る方法。