JPH11511963A

JPH11511963A - クニッツタイプのプラスマカリクレイン阻害剤

Info

Publication number: JPH11511963A
Application number: JP9501470A
Authority: JP
Inventors: エスデニス，マーク; エーラザラス，ロバート
Original assignee: ジェネンテックインコーポレーテッド
Priority date: 1995-06-05
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 1999-10-19
Also published as: EP0832232B1; DE69635447D1; EP0832232B9; DE69635447T2; US5780265A; WO1996039519A1; ATE310087T1; ZA964608B; AU6048296A; CA2220130A1; EP0832232A1; DE69635447T4; IL122116A0

Abstract

(57)【要約】プラスマカリクレインを阻害できる、強力で特異的なセリンプロテアーゼ阻害剤が提供される。阻害剤は、プラスマカリクレインの阻害が示されている疾病と障害の治療のための薬理組成物で提供される。

Description

【発明の詳細な説明】クニッツタイプのプラスマカリクレイン阻害剤発明の分野本発明は、プラスマカリクレイン阻害活性を有するクニッツタイプ(Kunitz-ty pe)ドメインを少なくとも１つ含む新規ポリペプチドに関する。本発明はさらに、これらの新規ポリペプチドをコードするＤＮＡと、これらのプラスマカリクレイン阻害剤を生産するための組換え材料および方法に関する。本発明はまた新規プラスマカリクレイン阻害剤を含み、プラスマカリクレインの阻害が示される疾病および障害の治療用の薬理組成物に関する。関連分野カリクレインカリクレインは、血管拡張の内因性経路のコンタクトシステムに関与する多因子凝固カスケードのセリンプロテアーゼである。カリクレインはまた高分子量キノーゲン（ＨＭＷＫ）を分裂させてブラジキニン（強力な血管拡張剤および内皮細胞活性剤）を生成させ、プロウロキナーゼとプラスミノーゲン（フィブリン溶解性）を活性化でき、表面結合第XII因子から第XIIa因子の相互活性化をフィードバックする。さらに、エラスターゼを放出させる好中球を刺激することもできる。第XIIa因子とカリクレインは共に、フィブリン溶解を起こすプラスミンを生成することができる。このように、コンタクト活性化経路において中心的役割を果たすにもかかわらず、プラスマカリクレインは、フィブリンの沈澱と溶解の両方、血圧調節、炎症システムの補体活性化と支持に関与している。コンタクト活性化経路とカリクレイン−キニンシステムの総説としては、Bhoola，K.D.，ら（１９９２）Pharmacological Rev.，44(1):1-80と、Wachtfogel，Y.T.,(1993),Th romb.Res.,72:1-21参照。プレカリクレインはカリクレインの前駆体であって、分子量８０，０００Ｄａのポリペプチド鎖１本を含む糖タンパク質であり、正常プラスマに約５０μｇ／ｍｌ（６００ｎＭ）の濃度で存在している。血液中では、７５％のプレカリクレインが高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）に結合して循環している。カリクレインは、ジスルフィド結合した、４３，０００と３３，０００−３６，０００Ｄａの２本の鎖からなる。カリクレインの軽鎖は酵素ドメインを含んでおり、重鎖は凝固の表面依存性活性化に必要とされているようである。生理的機能の種々の列（array）における役割のために、治療的介入の型としてプラスマカリクレインの制御は広く研究されてきた。疾病におけるコンタクト活性化経路コンタクト活性化は、炎症と凝固の制御の一部に関与する表面媒介経路である。この経路に関与するタンパク質は、第XII因子（ハーゲマン因子）、プレカリクレイン（フレッチャー(Fletcher)因子）、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）およびＣ１阻害剤（Schmaier，A．H.ら、Hemostasis and Thrombosis: Basic Pr inciples and Clinical Practice (Colman，R．W.，Hirsh，J.，Marder，V.,& Sa lzman，E．W.，編)１９８７、１８−３８頁、J.B．Lipponcott Co.，フィラデルフィア）である。チモーゲン第XII因子とプレカリクレインが、この経路における最初のイベントとして活性型セリンプロテアーゼに変換される。このプラスマプロテアーゼシステムの関与が、敗血症ショック、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、散在性血管内凝固（ＤＩＣ）および種々の他の疾病状態を含む種々の臨床的発現に、重要な役割を果たすことが示唆されてきた（Coleman R．W.(1989)N.E ngl.J.Med320:1207-1209;Bone,R.C.(1992)Arch．Intern．Med.152:1381-1389）。内因性凝固のコンタクトシステムと補体システムは、敗血症および敗血症ショック、特に致死的敗血症ショックの場合、過剰に活性化される。致死的ショックの病原に役割を果たしていると考えられる、多くの血管作動性のメディエーター、例えばブラジキニン、FXIIa、FXIIf およびＣ５ａ、の発生に、コンタクトシステムが関与し得る。ブラジキニン、FXIIa、XIIfは強力な低血圧症のインデューサーであり、Ｃ５ａは血管拡張、血管透過のインデューサーである。FXII、プレカリクレインおよび高分子量キニノーゲンは、非致死性ショックの間では、かなり減少するが、致死性敗血症ショックの間では、各々正常値の３０％、５７％、２７％にまで著しく抑えられる。これらの変化は、敗血症状態がグラム陽性菌、グラム陰性菌のいずれによるものであっても起こる。コンタクト活性化経路はまた、フィブリン沈澱および溶解の両方に関与しており、好中球活性化、補体活性化、および血圧制御の引き金にもなっている。敗血症ショック敗血症ショックは、合衆国の集中治療ユニットの最も一般的なヒトの死因である（Parillo，J.E.ら（１９９０），Ann.Int.Med.113:227-242;Schmeichel C J ．& McCormic D.,(1992)Bio Technol．10:264-267）。それは血流を侵害する感染のローカルな病巣により通常開始される。敗血症とショックは、グラム陰性、グラム陽性細菌、カビ（fungal）微生物のいずれの感染によっても起こり得る。これらの生物はすべて、共通のパターンの心臓血管の機能不全を誘導するようである。最近、積極的な液体注入療法が、敗血症ショックの治療の最初の手段として受け入れられてきている。液体の適当な注入により、心臓の出力上昇と血管の抵抗の低下がおこる。治療を行っても、敗血症ショックにより、系統的な血管抵抗を大きく減少させ、血流分配不全が拡大する。積極療法は、約５０％の割合で、ショックと死亡を防ぐ。非常に低い血管抵抗から起こる、応答のない（unresp onsive）低血圧症は、液体注入では治すことができない。敗血症ショックによる死亡のうち、約７５％が継続的な低血圧症であり、残りは複数の器官系の不全による。敗血症ショックにおける心臓出力増加と血管拡張は、炎症メディエーターの作用に寄与している。敗血症ショックでは、カリクレイン−キニン系の成分が枯渇し、この系の活性化を示唆している。このことは心臓ショックの場合ではおこらず、カリクレイン−キニン系が敗血症の鍵であることを示唆している（Martinez -Brotons F.ら(1987)Thromb.Haemostas.58:709-713）。図１に示すように、実際に敗血症ショックが起こっている間、ＤＩＣと低血圧症は起こっておらず、多くの生理システムの種々の成分の間で知られている相互作用は、コンタクト経路の活性化が敗血症ショック、多臓器不全、死亡の状態を起こしているかもしれないことを、示唆している（Bone，R.C.,上述）。ＡＲＤＳＡＲＤＳは複雑な肺の障害であり、合衆国で年間１５０，０００人が罹患し、死亡率が５０％である。白血球、血小板、および凝固の蛋白分解経路および補体が、ＡＲＤＳを媒介している。ＡＲＤＳは、コンタクト活性化経路の活性化およびＣ１阻害剤の枯渇に関与している。肺血症に誘導されたＡＲＤＳは、トラウマ誘導ＡＲＤＳに比べて、より深刻なＤＩＣとフィブリン溶解を招き、フィブリン分解産物の増加とATIIIレベルの減少を招く（Carvalho，A.C.ら(1988)J.Lab.Cli n.Med.112:270-277）。散在性血管内凝固散在性血管内凝固（ＤＩＣ）は、組織損傷と侵入微生物の応答によって起こる障害であり、広い範囲でのフィブリン沈澱とフィブリノーゲンレベルの枯渇で特徴づけられる（Muller-Berghaus,G(1989)Semin.Thromb.Hemostasis,15:58-87）。プロトロンビンと活性化した一部のトロンボプラスチンの時間が延長される。ＤＩＣは、多くの種類の疾病の臨床の場で観察されてきた（Fruchtman，S.M.&Ra nd，J.H．Thrombosis in Cardiovascular Disorders，Fuster,V &Verstraete M. 編(1992)501-513頁、W.B.Saunders、フィラデルフィア）。低血圧症、ＤＩＣ、好中球活性化はすべてに、第XIIa因子、プラスマキノ−ゲン、およびカリクレインの相互作用により開始される。これら３種のタンパク質のいずれかが欠損しても、血小板、他の凝固因子、および内皮細胞によるシステムの重複のためのうっ血性の障害は起こらない。プラスマカリクレイン阻害剤敗血症ショックとそれに関連した障害に対する多数の治療のアプローチが同定されており、例えば種々のサイトカイン拮抗薬、Ｍａｂｓ（エンドトキシン、組織因子、腫瘍表皮壊死症因子（ＴＮＦ）、好中球などへの）、キニン拮抗薬、細菌透過性増加タンパク質、ＰＡＦ拮抗薬、Ｃ１阻害剤、ＤＥＧＲ−ＦＸａ、および活性化プロテインＣなどが、その他のものの中から同定されている。疾病の複雑な性質のため、複数の薬剤または複数の経路に作用する薬剤を含むアプローチが、敗血症ショックの治療に有効である可能性がある（Schmeichel C.J.&McCorm ick D.,上述）。凝固、コンタクト活性化、フィブリン溶解、炎症、補体活性化、および低血圧経路のプロテアーゼを可逆的に阻害する、強力なセリンプロテアーゼ阻害剤は、これらの経路により影響される疾病の治療の１つのアプローチである。タンパク質阻害剤は、種々の生理プロセスでのプロテアーゼの制御において重要な役割を担う。プラスマカリクレインの主な生理的阻害剤はＣ１阻害剤、不可逆的に阻害するセルピン（serpin）である。Ｃ１阻害剤は、また、第XIIa因子、および補体経路プロテアーゼＣｌｒとＣｌｓの主要な生理的阻害剤である。他の主要なカリクレイン阻害剤であるα２−マクログロブリンは、キニン生成機能を阻害するが、エステル分解活性は部分的にしか阻害しない。抗トロンビンIIIもまた、カリクレインを阻害するが、ヘパリンが存在してもその速度は遅い。α２ −抗プラスミンとα１−抗トリプシンはカリクレインをほとんど阻害しない。Ｐ₁ の位置にＡｒｇ、Ｐ₂の位置にＡｌａを含むα₁プロテイナーゼ阻害剤の変異体（α₁−プロテイナーゼ阻害剤−ピッツバーグ）は、Ｃ１阻害剤に比べて、第XII f因子（FXIIf）とカリクレインの阻害剤としてより強力であることが示されてきた（Schapira,M.ら(1987)J.Clin.Invest 80:582-585;Patston,P.A.ら(1990)J.Bi ol.Chem.265:10786-10791）。この変異体で処理したラットは、ＦXIIfの注射による低血圧症から部分的に保護された。最近、E.coliからの１４２残基タンパク質であるエコチンが、約１６０ｐＭのＫ₁で強力にプラスマカリクレインを阻害することが示された。しかしながらエコチンは完全には選択的でなく、第XIIa因子、第Xa因子、およびヒト白血球エラスターゼも強力に阻害する（Seymour,J.L.ら(1994)Biochemistry33:3949-3958）ウシ膵臓トリプシン阻害剤（ＢＰＴＩ、アプロチニン）は、セリンプロテアーゼ阻害剤のクニッツドメインファミリーのよく研究されたメンバーであり、約３０ｎＭのＫ₁でプラスマカリクレインを穏やかに阻害する（Fritz,H.,およびWund erer,G.,(1983)Arzeim-Forsch.Drug Res.33.479-494;Creighton,T.E.,およびCha rles,I.G.(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.52:511-519）。しかしながら、ＢＰＴＩはプラスミンの阻害剤としてより強力である。アプロチニンは、急性の膵臓炎、敗血症、および出血性ショック、成人呼吸困難症候群および多数の（multiple）トラウマなどを含む種々の臨床場面で用いられている。最近、臨床と心肺バイパスモデルの両方でその可能性が示されている（Westaby，S.,(1993)Ann.Thorac.Surg.55:1033-1041;Watchfogel,T.,ら(1993)J . Thorac.Cardiovasc.Surg.106:1-10）。クニッツタイプセリンプロテアーゼの広いスペクトルのため、アプロチニンは、コンタクト活性化経路により開始される凝固カスケードの活性化を防ぐことができる。虚血症および低酸素症による組織損傷から起こる好中球と他の炎症反応の活性化もまた防ぐことができる。これらの利点は、そのカルクレインまたはプラスミン阻害活性に由来すると考えられている。しかしながら、アプロチニンはあまり強力でなく、選択的でないという事実が、これらの効果の解釈を困難にしている。血液損失の減少、好中球の脱顆粒の防止、血小板活性化と結集、およびカリクレイン−Ｃｑ−阻害剤とＣ１−Ｃ１阻害剤複合体の生成により証明されたように、刺激を受けた体外灌流の間、アプロチニンは、コンタクト、好中球、および血小板活性化システムを阻害する（Watchfogel,T.,ら(1993)J.Thorac.Cardiovasc. Surg.106:1-10）。それは、ブタのＬＰＳ誘導内毒素ショックの間、プラスマカリクレインを阻害するために用いられており、動脈低血圧を防ぐ結果となる（se ibeck,M.(1993)J.Trauma34:193-198）。アプロチニンは、血流力学におけるプラスマカリクレイン−キニンシステムの関与および肝硬変の患者の腎臓の機能を調べるためにも用いられている（MacGilchrist,A.,(1994)Clin.Sci.87:329-335）。アプロチニンは、腎臓の流れと濾過を改善するので、腎臓の水力学（hydrodyn amics）にも有利であることが示されている。 Traysylol（商標）（アプロチニン、バイエルＡＧ、Leverkusen,ドイツ）は現在、バイパス手段の間、心肺バイパス循環を通って最初の血液通過においてマスで（massively）活性化されたプラスマのコンタクトシステムを阻害することが示されている（Westsby,S.(1993)Ann.Thorac.Surg.55:1033-41）。アプロチニンは、心肺バイパスの間カリクレインシステムのコンタクト活性化を阻害し、ヘパリンとの協同作用で、内因性凝固カスケードの阻害を通じてトロンビンの生成を防ぐ（Westaby,上述）。Trayslol（商標）はまた、敗血症、出血性ショック、術後の壊死の膵臓炎、術後の肺のエンボリズムの予防に用いられている。クニッツドメインクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤（例えばＢＰＴＩ、アプロチニン）は、よく性質が知られているタンパク質ファミリーであり、該ファミリーには、長い結合ループを有する特徴的な三次折り畳み構造を含み、そのループが同系のセリンプロテアーゼの活性部位にフィットするという構造のホモロジーが広く存在する（Bode，W.,およびHuber,R.,(1992)Eur.J.Biochem.204:433-451）。クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤は、ゆっくり、しっかりと結合するセリンプロテアーゼの可逆的阻害剤であることが知られており、活性部位に結合して通常のメカニズムに従って阻害する（Laskowski,Jr.,M.Kato,I.,(1980)Ann.Rev.Bi ochem.49:593-626）。Ｐ₁とＰ₁’残基の間の開裂はそれが起こった場合も非常にゆっくりである（Bode,W.およびHuber,R.,(1992)Eur.J.Biochem.204:433-451;La skowski,M.,Jr.およびKato,I.,(1980)Annu.Rev.Biochem.49:593-626；Ｐ₁残基は、基質あるいは阻害剤に結合する分裂ペプチドの前の位置を指し、SchecterおよびBerger(1967)Biochem.Biophys.Res.Commun.,27:157-162で定義されたＳ₁結合部位にフィットする。残基の番号は、ＢＰＴＩの番号に対応し、残基１５はＰ₁ の位置である。）。結合ループのいくつかのコンタクト残基（位置１１，１５，１７，および１９）が、クニッツドメインのなかで比較的変化しやすい（Creighton,T.E.およびI. G.Charles,(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.52:511-519）。位置１３は通常Ｐｒｏである。位置１２はほとんど常にＧｌｙである。ジスルフィド結合を形成する位置１４と３８のシステイン残基は、常にクニッツドメインの中にみられる。しかしながら、システインに代えてＡｌａ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＴｈｒなどの他の残基が置換してもよい（Marks,C.B.ら(1987)Science,235:1370-1 373）。アルツハイマーアミロイドβプロテイン前駆体（ＡＰＰＩ）の５８残基のクニッツプロテアーゼ阻害剤ドメイン、および他のクニッツドメインは、残基１３と３９が、残基１７と３４と同様に、非常に近位である（図３）（Hynes,T.R.ら(1 990)Biochemistry 29:10018-10022）。位置１６と１８の残基は、一般にクニッツドメインの中で比較的変わりにくい（Creighton,T.E.およびI.G.Charles,(198 7)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.52:511-519）。しかしながら、これらの位置における異なる残基も結合を変えるかもしれない。したがって、位置１１から１９，３４，３８，および３９の残基は、すべて、セリンプロテアーゼに対する結合親和性および特性に影響を及ぼすかもしれない（図３）。他の残基も同様に重要である。例えば、他のクニッツドメインは位置５２に種々の残基を有しているが、ＡＰＰＩとＢＰＴＩは位置５２にメチオニンを有している（図２）。この位置のメチオニンは、タンパク質の生産に関して有利となり得る他の残基によって置換されることができる。例えば、メチオニンは、酸化に対する感受性が高くメチオニンスルホキシドを形成するが、これは精製を複雑にっすることができる。またタンパク質を、融合タンパク質として組換えて生産し、メチオニンの位置でＣＮＢｒで開裂させることができる（Auerswald,E.A.ら(1 988)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369:27-35）。したがって、インタクトな生産物を生産するためには。目的とするタンパク質中の他のメチオニン残基を除くことが必要である。位置５２の置換は、クニッツドメインの第一結合ループから遠く離れているので、阻害活性において重要な作用を有しているとは考えられていない（図３）。カリクレインおよびＦXIaなどのトリプシン様プロテアーゼの基質および阻害剤は、Ｐ₁残基にＡｒｇまたはＬｙｓを有している（欧州特許公報Ｏ３３９９４２Ａ２）。しかしながらメチオニンは、場合によってはＰ₁の位置に見られることがあるが、依然としてセリンプロテアーゼの強い阻害剤である（McGrath,M.E. ら(1991)J.Biol.Chem.266:6620-6625）。クニッツドメインのＰ₁の位置にＶａｌ，ＬｅｕまたはＩｌｅ等の残基を導入すると、ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）の強力な阻害剤となり、同時に野生型の阻害活性を失う（Beckmann,J.ら(1991 )Eur.J.Biochem.176:675-682;Sinha,S.ら(1991)J.Biol.Chem.266:21011-21013）。最近、ＢＰＴＩに構造が類似しているＡＰＰＩは（Hynes,T.ら(1990)Biochemi stry 29:10018-10022）、組織因子−第VIIa因子（ＴＦ-ＦVIIa）の強力で特異的な活性部位阻害剤を選択するために、変異体の多数のライブラリのファージのディスプレイのための骨格として用いられた（Dennis,M.S.,およびLazarus,R.A.,( 1994)J.BIol.Chem.269:22129-22136;Dennis,M.S.,およびLazarus,R.A.,(1994)J. BIol.Chem.269:22137-22144）。組織因子−第VIIa因子に対して、この研究で生産された変異体を直接比較すると、Ｐ₁残基をＬｙｓからＡｒｇへ代えることにより、プラスマカリクレインに対する結合親和性の９５倍の増加を示す。このデータは、以前ＢＰＴＩについてＰ₁の位置のＡｒｇとＬｙｓについて示されたものと矛盾しない（Scott,C.F.らBlood 69:1431-1436）。この研究で、Ｐ₁の位置のＬｙｓをＡｒｇへ変換すると、２０倍の強さのプラスマカリクレイン阻害剤となった。これらの研究ではどれも、プロテアーゼが、組織因子−第VIIa因子、第XIa因子またはプラスミンなどの他のセリンプロテアーゼの阻害を示したため、プラスマカリクレインの特異的阻害剤を示唆しなかった。ＡＰＰＩは、容易にE.coliなどのバクテリア（Castro,M.ら(1990)FEBS Lett.2 67:207-212）およびP.pastorisなどの酵母で発現した。タンパク質のＸ線結晶構造は、知られている（Hynes,T.R.ら(1990)BIochemistry29:10018-10022）。さらに、それはヒトの配列由来であって、治療に有用な変異体に対する免疫原性を最小限にするであろう。最近の進歩にもかかわらず、対象となる治療手段を進歩させるために、プラスマカリクレインの強力で特異的な阻害剤の必要性が残されている。発明の要旨本発明は、凝固、コンタクト活性化、フィブリン溶解、炎症、補体活性化、低血圧経路のプロテアーゼの、強力な可逆的阻害剤となる組成物を提供する。特に、本発明は、プラスマカリクレインの強力な阻害剤を提供する。本発明の組成物は、セリンプロテアーゼ阻害剤ポリペプチドを含む。本発明のポリペプチド阻害剤は、プラスマカリクレインの強力な阻害剤となり得る、非天然の（non-native ）クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインを少なくとも１つ含む。好適な実施態様において、本発明は、非天然の（non-native）クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドを提供し、該クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインは、第１結合ループＸａａ₅−Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂’−Ｘａａ₃’ −Ｘａａ₄’およびＸａａ₁₉’を含む第２結合ループを有するドメインであって、Ｘａａ₅は、Ｐｒｏ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｒｇ，およびＬｅｕからなる群から選ばれるアミノ酸；Ｘａａ₄は、Ｇｌｙアミノ酸；Ｘａａ₃は、Ｈｉｓ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，Ｌｅｕ，ＧｌｙおよびＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸；Ｘａａ₂はＣｙｓ；Ｘａａ₁はＡｒｇ；Ｘａａ₁’は、ＡｌａおよびＧｌｙからなる群から選ばれるアミノ酸；Ｘａａ₂’は、Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ，ＴｒｐおよびＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸；Ｘａａ₃’は、ＨｉｓおよびＩｌｅからなる群から選ばれるアミノ酸；Ｘａａ₄’は、Ｐｒｏ、Ｔｙｒ，ＬｅｕおよびＴｒｐからなる群から選ばれるアミノ酸；およびＸａａ₁₉’は、Ｖａｌ、Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，ＳｅｒおよびＰｈｅからなる群から選ばれるアミノ酸である。本発明のさらに好適な実施態様において、ポリペプチドは以下の配列を有するクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインを含み：Ｒ₁−Ｘａａ₅−Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂’ −Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’−Ｒ₂−Ｘａａ₁₉’−Ｒ₃ Ｒ₁は１０アミノ酸ペプチドで、アミノ酸位置Ｘａａ₁₁に相当するアミノ酸はＣｙｓであり；Ｒ₂は１４アミノ酸ペプチドで、アミノ酸位置Ｘａａ₁₅’に相当するアミノ酸はＣｙｓであり；Ｒ₃は２４アミノ酸ペプチドで、アミノ酸位置Ｘａａ₂₃’、Ｘａａ₃₆’、Ｘａａ₄₀’に相当するアミノ酸はＣｙｓである。本発明のこの態様に従って本発明のポリペプチドは、上述のごとく定義されたＸａａ₅− Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂’−Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’のアミノ酸を含む第１の結合ループと、Ｘａａ₁₉’のアミノ酸を含む第２の結合ループを含む約５８アミノ酸のクニッツタイプドメインを含む。クニッツタイプドメインの例としては、からなる群より選ばれたＲ₁を有し、からなる群より選ばれたＲ₂を有し、からなる群より選ばれたＲ₃を有する。好適なポリペプチドはまた、プラスマカリクレインを阻害しかつクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインを含むポリペプチドを含み、該クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインは、上述の第１と第２の結合ループを有し、Ｒ₁はＡＰＰＩのアミノ酸残基１−１０（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）あるいはその保存性の（conservative）アミノ酸置換物を表し、Ｒ₂はＡＰＰＩのアミノ酸残基２０−３３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）あるいはその保存性の（cons ervative）アミノ酸置換物を表し、Ｒ₃はＡＰＰＩのアミノ酸残基３５−５８（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）あるいはその保存性の（conservative）アミノ酸置換物を表す。好適な実施態様において、ポリペプチドは、Ｘａａ₅−Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂’−Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’の第１結合ループと、Ｘａａ₁₉’を含む第２の結合ループを含み、Ｘａａ₅はＧｌｕ，Ａｓｐ，Ｐｒｏ群から選ばれたアミノ酸；Ｘａａ₄はＧｌｙ；Ｘａａ₃はＨｉｓ；Ｘａａ₂ はＣｙｓ；Ｘａａ₁はＡｒｇ；Ｘａａ₁’はＡｌａ；Ｘａａ₂’はＡｌａ；Ｘａａ₃ ’はＨｉｓ；Ｘａａ₄’はＰｒｏ；およびＸａａ₁₉’はＶａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒから選ばれるクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインを含む。本発明に従えば、セリンプロテアーゼ阻害剤はプラスマカリクレインの強力な阻害が可能である。したがって本発明で好適なポリペプチドは、プラスマカリクレインに対するみかけの解離定数（Ｋ_i ^*）が約５００ピコモル（ｐＭ）未満である。より好ましくは、本発明のポリペプチドは、プラスマカリクレインに対するＫ_i ^*は約３００ｐＭ未満であり、最適には約１００ｐＭ未満である。本発明の好適な実施態様において、セリンプロテアーゼ阻害剤は、プラスマカリクレインを強力かつ特異的に阻害することができる。本発明のこの態様において、セリンプロテアーゼインヒビターはプラスマカリクレインを阻害するが、第Ｘａ因子、組織因子−第VIIa因子、トロンビン、第XIIa因子、または活性化プロテインＣなどの凝固カスケードの他のセリンプロテアーゼを検知されるほどには阻害しない。さらなる実施態様において、本発明は、発明のポリペプチドをコードする分離された核酸、好ましくはＤＮＡを含む混合物を包含する。本発明はさらに、ＤＮＡ分子とリンクして働く発現制御配列と；ＤＮＡ分子を含み、制御配列がベクターで形質転換された宿主細胞に認識される発現ベクター、好ましくはプラスミドと；ベクターで形質転換された宿主細胞を含む。本発明の好適な発現ベクターは、例えばｐＢＲ３２２、ｐｈＧＨ１，ｐＢＯ４７５，ｐＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３−２、ｐＤＲ５４０，およびｐＰＬ−ラムダから選択されてもよく、最適なベクターはｐＳＡｌｚ１である。本発明の発現ベクターを含む好適な宿主細胞は、例えば、E.coli K12株294（A TCCNo.31446）、E.coli株JM101株、E.coli B、E.coli X1776(ATCCNo.31537)、E. coli c600、E.coli W3110(F-,ガンマ-,プロトロピック、ATCCNo.27325)、Bachil lus subtis 、Salmonella typhimurium、Serratia marcesans、Psudomonas 種から選択されてもよく、最適な宿主細胞は、E.coli W3110(ATCCNo.27325)、およびこれらの誘導体、例えばプロテアーゼ欠損株27C7(ATCC No.55244)などである。本発明の組成物は、上記アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸配列を精製または合成する工程、核酸配列を適当な宿主内で発現させることができる適当な発現ベクターに結さつする工程、核酸配列が結さつされている発現ベクターで宿主を形質転換する工程、核酸配列の発現に適した条件で宿主を培養する工程を含む方法によって製造してもよく、このとき選択された核酸配列によりコードされたタンパク質は、宿主によって発現される。好ましくは、その後ポリペプチドは宿主細胞培養から回収される。この方法で、結さつ工程は、さらにアミノ酸配列が宿主により分泌される適当な発現ベクターに核酸を結さつし、核酸が適当な分泌シグナルとリンクして働くようにしてもよい。分泌シグナルは、リーダー配列、例えばｓｔＩＩ，ｌａｍＢ，ヘルペスｇＤ、ｌｐｐ、アルカリンホスファターゼ、インベルターゼ、およびアルファ因子から構成される群から選択されてもよく、好ましくはｓｔＩＩである。本発明はさらにここで記載された組成物の治療への適用まで拡張する。したがって本発明は薬理的に許容されるな賦形剤（excipient）と精製された本発明のポリペプチドを含む薬理組成物を含む。これらの適用は、例えば、プラスマカリクレイン阻害が示されているほ乳類の治療方法で、薬理的に有効な量の薬理組成物をほ乳類に投与することを含む治療方法を含む。そのような徴候としては、炎症、敗血症ショック、低血圧症、ＡＲＤＳ、ＤＩＣ、心肺バイパス手術、手術後の手術からの出血（bleeding from po stoperative surgery）が含まれる。図面の説明図１：凝固、コンタクト、フィブリン溶解、炎症、および補体経路を調節する選択された酵素とメディエーターの概略図。これらの経路の活性化は、示された臨床状態を招く。図２：ほ乳類由来のクニッツドメインの配列を並べた図。並べられているのは、アルツハイマーアミロイドβプロテイン前駆体からのＡＰＰＩ（残基１−５８残基）（ＳＥＱＩＤＮＯ．３４）；ヒトＴＥＰＩ（組織因子タンパク質阻害剤またはＬＡＣＩ、Broze Jr.,G.J.ら(1990)Biochemistry 29:7539-7546）からのＴＥＰＩ−ＫＤＩ（クニッツドメイン１）（残基２２−７９）（ＳＥＱＩＤＮＯ．３５）、ＴＥＰＩ−ＫＤ２（残基９３−１５０）（ＳＥＱＩＤＮＯ．３６）ＴＥＰＩ−ＫＤ３（残基１８５−２４２）（ＳＥＱＩＤＮＯ．３７）；各々ヒトインター−α−トリプシン阻害剤のＩＴＩ−ＫＤ１およびＩＴＩ−ＫＤ２（残基２２ −７９および７８−１３５）（ＳＥＱＩＤＮＯ．３８と３９）（Vetr,H.ら(1989 )FEBS Lett 245:137-140）；コラーゲンα３（ＶＩ）鎖前駆体のコラーゲンα３（ＶＩ）（残基２８９９−２９５６）（ＳＥＱＩＤＮＯ．４０）（Chu,M.L.(199 0)らEMBO J.9:385-393）；ＨＫＩＢ９（７−６０）（ＳＥＱＩＤＮＯ．４１）ヒトクニッツタイププロテアーゼ阻害剤ＨＫＩＢ９（Norris,K.，１９９４年１月１９日に提出された遺伝子バンクデータベースより（１９９３年１２月３１日、公開３９．０））；ＢＰＴＩ（１−５８）（ＳＥＱＩＤＮＯ．４２）、アプロチニンまたはウシ塩基性膵臓トリプシン阻害剤（Creighton,T.E.,およびCharles ,I.G.(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.52:511-519）。不変配列のモチーフ配列もリストされている。図３：ＡＰＰＩと他のクニッツドメインのモデル。数字は、ＡＰＰＩと他のクニッツドメインで見いだされた残基を意味する；残基１５は残基Ｐ₁に相当する。影のついた領域は、ＡＩＰＰと他のクニッツドメインの第１（残基１１−１９）と第２（残基３４を含む）結合ループを意味する。位置１４と３８、５と５５、および３０と５１のシステイン残基の間のジスルフィド結合は、点線で示されている。図４Ａと図４Ｂ：選択されたクニッツドメインのプラスマカリクレインとＦXI a因子へのみかけの平衡解離定数の決定。阻害活性は、種々の阻害剤濃度における活性比（阻害割合／非阻害割合）で表されている。みかけの平衡解離定数は、方程式１へのデータの非線形回帰分析により決定された。図４Ａでは、以下の存在における０．５ｎＭプラスマカリクレインの活性比が示される：ＡＰＰＩ（●）、ＢＰＴＩ（■）、ＫＡＬＩ−１０（○）、およびＫＡＬＩ−ＤＹ（□）。図４Ｂにおいて、以下の存在における３．５ｎＭ第XIa因子の活性比が示される：ＡＰＰＩ（●）、ＢＰＴＩ（■）、ＫＡＬＩ−１０（○）、およびＫＡＬＩ− ＤＹ（□）。Ｋ_i ^*値は、表IIIとIVで示される。図５Ａと図５Ｂ：ＡＰＰＩ（●）、ＢＰＴＩ（■）、およびＫＡＬＩ−ＤＹ（ □）の濃度が、ＡＰＴＴアッセイ（図５Ａ）でのエラグ酸により開始される、またはＰＴアッセイ（図５Ｂ）でのＴＦ膜により開始される、凝固時間の延長の倍数に対してプロットされている。非阻害凝固時間は、ＡＰＴＴとＰＴで、各々３３．６秒と１４秒であった。発明の詳細な説明Ｉ．定義説明全般に用いられている略語は：ＦXIIaが第XIIa因子；ＨＭＷＫが高分子量キノーゲン；ＦXIaが第XIa因子；ＦXaが第Xa因子；ＴＦが組織因子；ＦVIIaが第 VIIa因子；ＢＰＴＩは塩基性膵臓トリプシン阻害剤；ＡＰＰＩはアルツハイマーアミロイドβ−タンパク質前駆体阻害剤；Ｋ_i ^*がみかけの平衡解離定数；ＢＳＡがウシ血清アルブミン；ＨＰＬＣが高速液体クロマトグラフィー；ＰＴがプロトロンビン時間；ＡＰＴＴが活性化部分的トロンビン時間。「クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメイン」「クニッツタイプドメイン」「クニッツドメイン」などは、１９３６年に結晶型ではじめて単離された（Kunitz，M.およびNorthop,J.H.,(1936)J.Gen.Physiol.19:991-1007）セリンプロテアーゼ阻害剤ＢＰＴＩ（ウシ膵臓トリプシン阻害剤；CreightonおよびCharl es(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.52:511-519）のシステイン残基の保存を特徴とする約５８アミノ酸残基タンパク質ドメインを意味し、互換的に用いられている。クニッツドメインはシステイン残基の位置、３次折り畳み構造、構造的特徴が共通している。図３は、システイン残基の位置を示す、アルツハイマーアミロイドβタンパク質前駆体のクニッツドメインの３次構造のモデルである。１，２，または３のクニッツドメインを含有するタンパク質のファミリーが同定されている。そのファミリーは；ＬＡＣＩ（リポタンパク質結合凝固阻害剤、ＴＥＰＩまたは組織因子蛋白阻害剤；Broze Jr.,G.J.ら(1990)Biochemistry 29: 7539-7546）も；ＡＰＰＩ（アルツハイマーアミロイドβタンパク質前駆体；Hyn es,T.R.ら(1990)BIochemistry 29:10018-10022）；ヒトタイプVIコラーゲンα３鎖（ＷＯ９３／１４１１９参照）およびインターαトリプシン阻害剤（Hochstra sser,K.,E.,(1985)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 366:473）。図２は、ほ乳類由来のクニッツドメインの配列を並べたものである。クニッツドメインは、アカウミガメ卵白、ケロニアニン（chelonianin）（Kato,I.,およびTominaga,N.,(1979)Fed .Proc.38:3342-3357）、およびβ₁ブンガロトキシン（bungarotoxin）（Kondo,K .,ら(1982)J.Biochem.91:1519）のＢ鎖でも同定されている。これらはまた多くのヘビ毒液でも同定されている。クニッツドメインは、通常ジスルフィド結合で存在する特異的な間隔で配置された６つのシステインを含む（Bode,W.,およびHu ber,R.,(1992)Eur.J.Biochem.204:433-451）。これらの３つのジスルフィド橋は、タンパク質を安定させ、クニッツドメインの３次元折り畳み特性全体に部分的に関与している（図３）。５８残基クニッツタイプセリンプロテアーゼＢＰＴＩおよびＡＰＰＩでは、システインは残基５，１４，３０，３８，５１，および５５に存在している。しかしながら１つのシステイン橋を除去しても、大きな構造の変化はもたらされない（Eigenbrot,C.,ら(1990)Protein Eng.3:591-598）。クニッツドメインタイプセリンプロテアーゼ阻害剤の結晶構造は、ＢＰＴＩ（上述）およびＡＰＰＩ（Hynes,T.R.ら(1990)BIochemistry 29:10018-10022）で決定されている。中央の逆平行な３本鎖βシートおよびＣ末端αヘリックスがドメインの核を形成している（Bode,W.,およびHuber,W.,上述）。コアドメインのセグメントは、適当に折り畳まれたタンパク質の外にさらされた第１結合ループを支持する骨格を形成する（「第１結合ループ」はここで定義されたもの）（Bo de,W.,およびHuber,W.,上述）。第２結合ループは、第１結合ループとともに、クニッツドメインと同系のプロテアーゼターゲットとの間の相互作用を定義することに関与する（「第２結合ループ」はここで定義されたもの）（Ruhlman,A., ら（1 973）J.Mol.Biol.77:417-436）。ここで用いられる「非天然」とは、天然に存在するクニッツドメインと異なるアミノ酸配列を有するクニッツタイプドメインを意味する。天然に存在するクニッツドメインは、例えば、図２および関連分野の説明に記載されたものである。本発明の非天然クニッツタイプドメインのアミノ酸配列は、天然に存在するクニッツドメインと、少なくともここに記載された第１および第２結合ループが修飾されている理由で相違している。１つの実施態様において、非天然クニッツタイプドメインは、天然に存在するクニッツドメインの１またはそれ以上のアミノ酸の置換により、天然に存在しているクニッツドメインから得られる。そのような修飾は例えば、天然に存在するクニッツドメインをコードするＤＮＡ配列の変換により行うことができる。いくつかの例では、非天然クニッツタイプドメインは、天然に存在するクニッツドメインの１つまたはそれ以上のアミノ酸側の鎖の直接の化学修飾により、天然に存在するクニッツタイプドメインから得ることが可能である。クニッツドメインの「第１の結合ループ」は、Ｐ₅−Ｐ₄−Ｐ₃−Ｐ₂−Ｐ₁−Ｐ₁ ’−Ｐ₂’−Ｐ₃’−Ｐ₄’（ＢＰＴＩとＡＰＰＩの残基１１−１９）を指す。「第２の結合ループ」は、Ｐ₁₉’−Ｐ₂₀’−Ｐ₂₁’−Ｐ₂₂’−Ｐ₂₃’−Ｐ₂₄’（ＢＰＴＩとＡＰＰＩの残基３４−３９）を指す。「Ｐ₁」という用語は、ここでは、以前Schecter,I.,およびBerger,A.,(1967)B iochem.biophys.Res.Commun．27:157-162により定義されたように、セリンプロテアーゼ阻害剤に結合した分裂ペプチドの前の位置を意味するように用いられている。同様にして「Ｐ₁」という用語は、セリンプロテアーゼ阻害剤に結合した分裂ペプチドの後の位置を意味するように用いられている。数字の増加は、分裂結合に先立つおよび後にくる（すなわちＰ₂’とＰ₃’）次の連続した位置を意味する。残基の数字は、ＢＰＴＩのそれに対応し、残基１５がＰ₁位置となる。本発明のポリペプチドにおいて、記号Ｘａａはアミノ酸位置に関してＰと入れ替わる。したがって、Ｘａａ₁はＰ₁と、Ｘａａ₁’はＰ₁’と均等である。ＡＰＰＩは、ヒトアルツハイマー症アミロイドβタンパク質前駆体、残基２８７−３４４からの５８アミノ酸ポリペプチドを意味する（Castro,M.ら(1990)FEB S Lett.267:207-212）。このタンパク質において、Ｐ₅−Ｐ₄−Ｐ₃−Ｐ₂−Ｐ₁− Ｐ₁’−Ｐ₂’−Ｐ₃’−Ｐ₄’は、第１結合ループの残基１１−１９に対応する。Ｐ₁₉’は第２結合ループの残基３４に対応する。本発明の範囲で「アミノ酸」という用語は、天然に存在するＬアルファアミノ酸または残基を意味する。アミノ酸を意味する通常用いられる１および３文字の略語をここで用いている（Lehninger,A.L.,Biochemistry,第２版、７１−９２頁（１９７５）Worth Publishers,ニューヨーク）。本発明の範囲で用いられる「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に均等なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味する。保存的アミノ酸変化は、得られるタンパク質のアミノ酸配列内の静かな（silent）変化となる。例えば、類似する極性の１つまたはそれ以上のアミノ酸は、機能的均等物として作用し、タンパク質のアミノ酸配列内の静かな（silent）変化となる。保存的アミノ酸置換は、Taylor,W.R.,(1986)J.Mol.Biol.188:233-258の表１、２４０ページのアミノ酸置換として定義される。最大の保存的アミノ酸置換は以下のものを含む：（１）親水性：Ｈｉｓ，Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｍｅｔ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ａｌａ；（２）中性疎水性：Ｃｙｓ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；（３）極性：Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ；（４）酸性／負に荷電：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；（５）荷電：Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ；（６）塩基性／正に荷電：Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ；（７）塩基性：Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；（８）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；および（９）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ，Ｈｉｓ。さらにいくつかの特定のアミノ酸に代えて構造の類似したアミノ酸が置換できる。構造の類似した群は以下のものを含む：（Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，およびＶａｌ）；（ＰｈｅおよびＴｙｒ）；（ＬｙｓおよびＡｒｇ）；（ＧｌｎおよびＡｓｎ）；（ＡｓｐおよびＧｌｕ）：および（ＧｌｙおよびＡｌａ）。保存的アミノ酸置換の例示は好適には以下のものに従う：Ａｌａに代えてＧｌｙまたはＳｅｒ；Ａｒｇに代えてＬｙｓ；Ａｓｎに代えてＧｌｎまたはＨｉｓ；Ａｓｐに代えてＧｌｕ；Ｃｙｓに代えてＳｅｒ；Ｇｌｎに代えてＡｓｎ；Ｇｌｕに代えてＡｓｐ；Ｇｌｙに代えてＡｌａまたはＰｒｏ；Ｈｉｓに代えてＡｓｎまたはＧｌｎ；Ｉｌｅに代えてＬｅｕまたはＶａｌ；Ｌｅｕに代えてＩｌｅまたはＶａｌ；Ｍｅｔに代えてＡｒｇ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕ；Ｐｈｅに代えてＭｅｔ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒ；Ｓｅｒに代えてＴｈｒ；Ｔｈｒに代えてＳｅｒ；Ｔｒｐに代えてＴｙｒ；Ｔｙｒに代えてＴｒｐまたはＰｈｅ；Ｖａｌに代えてＩｌｅまたはＬｅｕ。「発現ベクター」は、適当な宿主内で、ＤＮＡによりコードされたタンパク質の発現に作用し得る適当な制御配列にリンクして働くＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構成物を意味する。そのような制御配列は通常、転写に作用するプロモーター、転写を制御する任意のオペーレーター配列、適当なｍＲＮＡリボゾーム結合部位をコードする配列、転写と翻訳の終了を制御する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または「ファージミド」または単にゲノムへの挿入を可能にするものであってよい。適当な宿主にいったん形質転換されれば、ベクターは複製し、宿主ゲノムとは独立に機能することができ、いくつかの場合、ゲノムそれ自体に融合することもあり得る。本明細書で、「プラスミド」「ベクター」または「ファージミド」とは、プラスミドが現在ベクターの最も一般的に用いられる型であるので、相互に変換可能なものとして用いられることもある。しかしながら本発明は、均等な機能を提供し、この分野で知られあるいは知られるようになる他の型の発現ベクターを含むことを意図している。「作用的にリンクされた」とは、２つのＤＮＡまたはポリペプチド配列の関係を述べるとき、それらが互いに機能的に関連していることを単に意味する。例えば、前配列は、それがシグナル配列として機能するならば、ペプチドと作用的にリンクされており、シグナル配列の開裂を含む可能性の高いマチュア形のタンパク質の分泌関与している。プロモーターは、配列の転写を制御するならコード配列に作用的にリンクしている。リボゾーム結合部位は、翻訳させるように位置しているなら、コード配列に作用的にリンクしている。発見および好適な実施態様本発明者は、クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤の第１および第２の結合ループ位置に見いだされる、特定の鍵となるアミノ酸配列の入れ替えまたは置換が、プラスマカリクレインに対する阻害剤の強さを、飛躍的に改善できることを発見した。したがって本発明は、プラスマカリクレインを強く阻害するようにデザインされた非天然クニッツタイプドメインを１またはそれ以上含むポリペプチドを提供する。本発明によれば、クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤の残基Ｐ₅−Ｐ₄− Ｐ₃−Ｐ₂−Ｐ₁−Ｐ₁’−Ｐ₂’−Ｐ₃’−Ｐ₄’に対応する残基１１−１９および３４は、プラスマカリクレインの強力な阻害が達成されるような天然に存在するアミノ酸の中から選択される。セリンプロテアーゼサブサイトとクニッツタイプドメインセリンプロテアーゼ阻害剤の第１結合ループの側鎖との間の多くの相互作用のうち（Ｐ₅−Ｐ₄’）（Bode，W.,およびHuber,R.,(1992)Eur.J.Biochem.20 4:433-451;Laskowski,Jr.,M.Kato,I.,(1980)Ann.Rev.Biochem.49:593-626）、Ｐ₁ 残基の特異性ポケットとの相互作用が効果的に重要で、したがって特異性決定の第１要素であることを表す（図３参照）。クニッツタイプドメイン／セリンプロテアーゼ複合体において、クニッツタイプドメインの残基１５の側鎖は、分裂ペプチド結合の前のＰ₁位置をうめる。本発明の好適な実施態様によれば、プラスマカリクレインは、Ａｒｇが位置１５（Ｐ₁）にみられるクニッツタイプドメインを含むポリペプチドにより強く阻害される。好適なポリペプチドは、位置Ｐ₁ にＡｒｇを有するクニッッドメインを含むが、ＬｙｓもまたＰ₁にみられる。クニッツタイプドメインの結晶構造は、セリンプロテアーゼと接触すると考えられる、第１の結合ループ内の他の残基を明らかにする（Hynes,T.R.ら(1990)上述；Bode,W.およびHuber,R.,(1992)上述;Kossiakoff,A.A.(1993)ら,Biochem.Soc .Trans.21:614-618）。Ｐ₁位置のアミノ酸は、通常、セリンプロテアーゼ活性部位への阻害剤の親和性を支配するが（Scott,C.F.ら(1987)Blood 69:1431-1436;L askowski,Jr.,M.Kato,I.,(1980)上述；Beckmann,J.ら(1988)Eur.J.Biochem.176: 675-682;Sinha,S.ら(1991)J.Biol.Chem.266:21011-21013）、この領域外の残基（第２の結合ループの残基３４と同様に１１−１４と１６−１９）もまた、セリンプロテアーゼへの結合親和性と特異性での役割をになうことが知られている（Koss iakoff,A.A.(1993)ら,上述;Roberts,B.L.ら(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:2 429-2433）。本発明者は、位置１５のＡｒｇに加えて、第１の結合ループの位置１１−１４と１６−１９のアミノ酸残基が、位置１１（Ｐ₅）におけるＳｅｒ、Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｅｕ，Ａｓｐ，Ｐｒｏ，またはＧｌｕ；位置１２（Ｐ₄）におけるＧｌｙ；位置１３（Ｐ₃）におけるＧｌｙ，Ｔｈｒ，Ｈｉｓ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，またはＬｅｕ；位置１６（Ｐ₁’）におけるＡｌａまたはＧｌｙ；位置１７（Ｐ₂’）におけるＳｅｒ，Ａｌａ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ，またはＴｒｐ；位置１８（Ｐ₃’）におけるＨｉｓまたはＩｌｅ；および位置１９（Ｐ₄’）におけるＰｒｏ，Ｔｙｒ，Ｌｅｕ，またはＴｒｐであるとき、強力なプラスマカリクレイン阻害剤となることを発見した。通常、クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤の位置１４（および３８）に存在するＣｙｓは保存される。位置３４（Ｐ₁₉’）での第２の結合ループにおいてアミノ酸Ｐｈｅ，Ｖａｌ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，およびＳｅｒが好ましい。より好ましくは、位置１５のＡｒｇに加えて、第１の結合ループの位置１１− １４と１６−１９のアミノ酸残基が、位置１１（Ｐ₅）におけるＡｓｐ，Ｐｒｏ，またはＧｌｕ；位置１２（Ｐ₄）におけるＧｌｙ；位置１３（Ｐ₃）におけるＨｉｓ，Ｐｒｏ，Ａｒｇ，またはＬｅｕ；位置１６（Ｐ₁’）におけるＡｌａまたはＧｌｙ；位置１７（Ｐ₂’）におけるＡｌａ，Ｌｅｕ，Ａｓｎ，またはＴｒｐ；位置１８（Ｐ₃’）におけるＨｉｓまたはＩｌｅ；および位置１９（Ｐ₄’）におけるＰｒｏ，Ｔｙｒ，Ｌｅｕ，またはＴｒｐであるとき、強力なプラスマカリクレイン阻害剤となる。通常、クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤の位置１４（および３８）に存在するＣｙｓは保存される。位置３４（Ｐ₁₉’）での第２の結合ループにおいて、アミノ酸Ｖａｌ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，およびＳｅｒが好ましい。本発明者はまた、プラスマカリクレインへの有効性を増加する非天然クニッツタイプドメインの少なくとも１つを含むポリペプチドが、ヒトプラスマに見いだされる第XIa因子セリンプロテアーゼも阻害することを発見した。これに対し、非天然クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤は、FXIIa、FXa、トロンビン、 TF -FVIIa、または活性化プロテインＣの阻害剤ではなかった。したがって、選択されたクニッツ阻害剤の変形体の多くがプラスミンをわずかに阻害するが、選択された変形体では、中程度の（＞６０％）阻害が観察された。本発明の好適な実施態様によれば、本発明のポリペプチドは、非天然クニッツタイプドメインを少なくとも１つ含み、プラスマカリクレインを阻害するが、プラスミンを阻害しない。本発明のこの態様によれば、ポリペプチドは、第２の結合ループの位置１１がＧｌｕ，Ａｓｐ，またはＰｒｏ；位置１２−１９が各々Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｃｙｓ，Ａｒｇ，Ａｌａ，Ａｌａ，Ｈｉｓ、およびＰｒｏ、位置３４がＶａｌ，Ｔｙｒ，またはＴｒｐであるクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインを含む。この群のポリペプチドから特に好ましいものは、位置１１がＡｓｐであるクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインを含むポリペプチドである。したがって本発明は、上述の第１または第２の結合ループを有するクニッツタイプドメインを少なくとも１つポリペプチドを提供する。クニッツタイプドメインの残りの残基は、クニッツタイプドメインの３次構造全体が保持されるような天然に存在するアミノ酸から選ばれる。したがってクニッツタイプドメインに特徴的なシステイン残基は、通常位置５，１４，３０，３８，５１，および５５に保持される。本発明の好適な実施態様において、種々のクニッツタイプドメインの第１または第２の結合ループの側面（flanking）残基は、天然に存在するクニッツタイプドメインを構成する残基から選ばれる。例えば、典型的なクニッツタイプドメインは５８アミノ酸から構成される。本発明によれば、アミノ酸残基１１−１９と３４は、上述のごとく、プラスマカリクレインの強力な阻害が達成するように選択される。側面残基、すなわち残基１−１０、２０−３３，および３５−５８は、上述のごとく適当なシステイン残基の保存に加えて、適当な３次元構造と所望の活性が保持されるように、天然に存在するクニッツドメインの対応する残基から選ばれてもよい。本発明の好適な実施態様において、側面残基１−１０，２０−３３，および３５−５８は、この分野でよく知られた他のクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤の対応する側面領域から選ばれる。そのようなクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤は、図２に記載されたものを含む。したがって好適な実施態様において、残基１−１０はから選ばれ、残基２０−３３はから選ばれ、残基３５−５８はから選ばれ、それは、図２に示すように、アルツハイマーアミロイドβプロテイン前駆体、残基２８７−３４４（Castro,M.ら(1990)FEBS Lett.267:207-212）からのＡＰＰＩ（残基１−５８）（ＳＥＱＩＤＮＯ．３４）；ヒトＴＥＰＩ（組織因子タンパク質阻害剤またはＬＡＣＩ、Broze Jr.,G.J.ら(1990)Biochemistry 2 9:7539-7546）からのＴＥＰＩ−ＫＤ１（クニッツドメイン１）（残基２２−７９）（ＳＥＱＩＤＮＯ．３５）、ＴＥＰＩ−ＫＤ２（残基９３−１５０）（ＳＥＱＩＤＮＯ．３６）ＴＥＰＩ−ＫＤ３（残基１８５−２４２）（ＳＥＱＩＤＮＯ．３７）；各々ヒトインター−α−トリプシン阻害剤のＩＴＩ−ＫＤ１およびＩＴＩ−ＫＤ２（残基２２−７９および７８−１３５）（ＳＥＱＩＤＮＯ．３８と３９）（Vetr,H.ら(1989)FEBS Lett 245:137-140）；コラーゲンα３（ＶＩ）鎖前駆体のコラーゲンα３（ＶＩ）（残基２８９９−２９５６）（ＳＥＱＩＤＮＯ．４０）（Chu,M.L.(1990)らEMBO J.9:385-393）；ＨＫＩＢ９（７−６０）（ＳＥＱＩＤＮＯ．４１）ヒトクニッツタイププロテアーゼ阻害剤ＨＫＩＢ９（Norr is,K.，１９９４年１月１９日に提出された遺伝子バンクデータベースより（１９９３年１２月３１日、公開３９．０））；ＢＰＴＩ（１−５８）（ＳＥＱＩＤＮＯ．４２）、アプロチニンまたはウシ塩基性膵臓トリプシン阻害剤（Creigh ton,T.E.,およびCharles,I.G.(1987)Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.52:5 11-519)のクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインの均等残基に対応している。本発明の好適な実施態様によれば、上述の第１または第２の結合ループの残基は、ＡＰＰＩの側面領域１−１０（ＳＥＱＩＤＮＯ．６），２０−３３（ＳＥＱＩＤＮＯ．１４），３５−５８（ＳＥＱＩＤＮＯ．２３）で提供される。当業者であれば、得られるポリペプチドはここで定義されたようにプラスマカリクレインを強力に阻害することができることを念頭にいれて、上述の保存アミノ酸置換がここで述べられたようにポリペプチド全体に実施できることが理解できるであろう。熟練した技術者は、クニッツタイプドメインがより大きな機能性タンパク質の中にみられることを認識するであろう。セリンプロテアーゼ阻害剤ＴＦＰＩは、例えば、３つのクニッツタイプドメインを含む。したがって、本発明は、上述のごとく、強力にプラスマカリクレインを阻害することが期待され得るクニッツタイプドメインを少なくとも１つ含むポリペプチドを含有する。平衡解離定数の決定本発明によれば、１またはそれ以上の上述の非天然クニッツタイプドメインを含むポリペプチドは、プラスマカリクレインを強力に阻害することができる。本発明者は、プラスマカリクレインを強力に阻害することが期待されるクニッツタイプドメイン変異体の第１と第２の結合ループに見いだされるアミノ酸を考慮にいれた。強力な阻害は、ポリペプチドのプラスマカリクレインに対するみかけの解離定数（Ｋ_i ^*）が約５００ピコモル（ｐＭ）未満であるときに起こる。より好ましくは、本発明のポリペプチドは、プラスマカリクレインに対するＫ_i ^*は約３００ｐＭ未満であり、最適には約１００ｐＭ未満である。みかけの解離定数（Ｋ_i ^*）は、堅く結合した阻害剤由来の方法（Bieth,J.,(19 74)Proteinase Inhibitors,vol:463-469;Williams,J.W.Morrison,J.F.,(1979)Me thods Enzymeol 63:437-467）を用い、クニッツドメインとセリンプロテアーゼの相互作用で観察されたように（Bode,W.およびHuber,R.,(1992)上述;Laskowski ,Jr.,M.Kato,I.,(1980)Ann.Rev Biochem.上述）、酵素と阻害剤が１：１の化学量で可逆的複合体を形成すると仮定して、決定されることができる。データは、非線形回帰分析により方程式１に適用する。ここでＶ_i/Ｖ_oは、活性比（非阻害割合で除した定常状態の阻害割合）、[Ｅ_o] はプラスマカリクレイン活性部位の総濃度、[Ｉ_o]は阻害剤総濃度である。ヒトプラスマに見いだされる他の関連するセリンプロテアーゼとのみかけのＫ_i 値を測定することにより、ＡＰＰＩ、ＢＰＴＩなどの天然に存在するクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤の相対的特異性を、非天然クニッツドメインを１またはそれ以上含むポリペプチドと同様に、決定することができる。連続的に希釈したポリペプチド阻害剤の部分標本に、活性化プロテインＣ，トロンビン、ＦXa、ＦXIa、ＦXIIa、組織因子−ＦVIIa、またはプラスミンを加えることができる。インキュベーションと適当な基質の添加の後、実施例部分で記載するように、阻害剤濃度に対する活性比のプロットを行う。本発明によれば、トリプシンアフィニティクロマトグラフィーと逆相高速クロマトグラフィーで精製された、選択された変異体は、プラスマカリクレインを、みかけの解離定数（Ｋ_i ^*）約３００ｐＭ未満で、強力に阻害する。特定の例として、そのような変異体、ＫＡＬＩ−ＤＹは、ＡＰＰＩと６つの鍵となる残基（１１Ａｓｐ，１３Ｈｉｓ，１７Ａｌａ，１８Ｈｉｓ，１９Ｐｒｏ，および３４Ｔｙｒ）が異なっているが、プラスマカリクレインをＫ_i ^*＝１５±１４ｐＭで阻害し、天然に存在するセリンプロテアーゼ阻害剤、ＡＰＰＩと比較して１０，０００倍を越える結合親和性の増加を示している。ＡＰＰＩのような天然に存在するクニッツセリンプロテアーゼ阻害剤と同様に、変異体も、第ＸＩａ因子を、高い親和性、Ｋ_i ^*値が約０．３から１５ｎＭの範囲で阻害した。ＫＡＬＩ−ＤＹは、第ＸＩａ因子をＫ_i ^*＝８．２±３．５ｎＭで阻害した。ＫＡＬＩ−ＤＹはプラスミン、トロンビン、第Xa因子、第XIIa因子、活性化プロテインＣ，または組織因子−第VIIa因子を阻害しなかった。プロテアーゼの特異性と一致して、ＫＡＬＩ−ＤＹと他の非天然阻害剤は、プロトロンビン時間アッセイで凝固時間を延長しなかったが、活性化部分的トロンボプラスチン時間アッセイでは１μＭで３．５倍を越えて凝固時間を延長した。凝固アッセイＢＰＴＩおよびＡＰＰＩなどの天然クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤と比較して、プラスマカリクレインに対する本発明のポリペプチド阻害剤の増加した親和性は、活性化部分的トロンボプラスチンタイム（ＡＰＴＴ）アッセイにおける凝固時間の延長能力に反映される。本発明の範囲の好適なポリペプチド阻害剤は、活性化部分的トロンボプラスチンタイム（ＡＰＴＴ）アッセイにおける凝固時間を延長したが、プロトロンビンタイム（ＰＴ）アッセイでは延長しなかった。当業者によって理解されるであろうが、ＡＰＴＴアッセイは、凝固の内因性経路の測定の指標である。したがって、好適な実施態様において、本発明によるポリペプチドは、ＡＰＴＴアッセイで少なくとも１倍、通常約２から４倍凝固時間を延長する。好適な実施態様において、本発明の阻害剤は、凝固時間を３．５倍の率で延長する。化学合成クニッツドメイン変異体を製造する１つの方法は、タンパク質の化学合成と、その後のネイティブなコンフォメーション、すなわち正しいジスルフィド結合架橋を得るために適当な酸化条件における処理を含む。このことは、当業者によく知られた方法論を用いて達成される（Kelley,R.F.およびWinkler,M.E.Genetic E ngineering Principles and Methods, の中(Setlow,J.K.,編).,Plenum Press,N.Y .,(1990)12巻 1-19頁 ; Stewart,J.M.およびYoung,J.D.(1984)Solid Phase Pept ide Synthesis,Pierce Chemical Co.Rockford,IL）。本発明のポリペプチド、特に５８アミノ酸残基を含むものは、固相ペプチド合成（Merrifield,(1964)J.Am.Chem.Soc.,85:2149;Houghten,(1985)Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 82:5132）を用いて調製することができる。固相合成は、上述のStewa rtおよびYoungの２と４ページの図１−１と１−２に示されるように、保護されたアミノ酸の適当な樹脂への結合により、推定されるペプチドのカルボキシ末端から開始する。この発明のポリペプチドの合成において、そのαアミノ基が適当に保護されたものカルボキシル末端アミノ酸は、クロロメチル化ポリスチレン樹脂へ結合する（上述のStewartおよびYoungの図１〜４、１０ページ参照）。 αアミノ保護基を、例えばメチレンクロライドのトリフロロ酢酸（ＴＦＡ）で除去し、例えばＴＥＡ中で中和した後、合成の次のサイクルをすすめることができる。残りのαアミノ酸、および必要であれば、側鎖で保護されたアミノ酸は、ついで順次縮合により所望の順序で結合され、樹脂に結合した中間化合物を得る。あるいは、成長する固相ポリペプチド鎖へのペプチド添加の前に、いくつかのアミノ酸を互いに結合してペプチドを形成してもよい。２つのアミノ酸、アミノ酸とペプヂド、あるいはペプチドとペプチドの間の縮合は、アジド法、無水混合酸法、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法、活性エステル法（ｐ−ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ［ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム＝ヘキサフルオロホスフェート］法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法）、およびウッドワード剤（Woodward Reagent）Ｋ法などの通常の縮合方法にしたがって行うことができる。固相法におけるペプチド鎖の延長の場合、ペプチドはＣ末端アミノ酸で不溶性キャリアに結合している。不溶性キャリアとしては、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシ基と反応して後で容易に分裂する結合を形成するもの、例えば、クロロメチル樹脂とブロモメチル樹脂などのハロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、アミノメチル樹脂、ペンズヒドリルアミン樹脂、およびｔ−アルキルオキシカルボニル −ヒドラジド樹脂を用いることができる。ペプチドの化学合成に共通なことは、その鎖が完全に組み立てられた後、その基が完全に除かれるまで、その部位に適当な保護基を有する種々のアミノ酸部分の反応性側鎖基を保護することである。そのものがカルボキシル基で反応し、ついでαアミノ保護基を選択的に除去して、その場所で引続き反応させる間、アミノ酸またはフラグメントのαアミノ基を保護することもまた共通している。したがって、合成の工程として、側鎖保護基を有する種々のこれらの残基を含むペプチド鎖中の所望の配列内に位置する各アミノ酸残基を含む中間化合物が製造されることが、共通している。ついでこれらの保護基は、共通して実質的にほぼ同時に除去され、精製の後所望の産物が生産される。 αおよびεアミノ側鎖基を保護するために適用可能な保護基を例示すれば、ベンジルオキシカルボニル（Ｚと省略）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、Ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＮＯ₂］、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＯＭｅ）］、ｔ−ブトキシカルボニル、（Ｂｏｃ）、ｔ−アミイオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボロニルカルボニル、アダマチロキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２プロピルオキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホニルイエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオニル（Ｐｐｔ）、ジメチロホスフィノチオニル（Ｍｐｔ）、などがある。カルボキシ基の有力な基の例としては、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、ｔ− ブチルエステル（ｏｂｕｔ）、４−ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）、などがある。アミノ基とカルボキシル基以外の官能基を有するアルギニン、システイン、セリンなどの特異的アミノ酸が、必要な場合適当な保護基で保護されるこ液体ＨＦおよび１またはそれ以上の硫黄を含有するスカベンジャーなどの薬剤で、とが望ましい。例えば、アルギニン中のグアニジノ基は、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマチロキシカルボニル（adamatyl oxycarbonyl）、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、４−メトキシ−２、６−ジメチルベンゼンスルホニル（Ｍｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニスルホニル（Ｍｔｓ）、などにより保護されることができる。システインのチオール基は、ｐ−メトキシベンジル、トリフェニルメチル、アセチルアミノメチルエチルカルバモイル、４−メチルベンジル、２，４，６−トリメチル−ベンジル（Ｔｍｂ）等で保護されることができ、セリンのヒドロキシル基はベンジル、ｔ−ブチル、アセチル、テトラヒドロピラニル等で保護されることができる。上述のStewartとYoungは、ペプチド調製のための手順に関する詳細な情報を提供する。αアミノ基の保護は、１４−１８頁に記載されており、側鎖ブロックは１８−２８頁に記載されている。アミン、ヒドロキシル、およびスルフヒドリル官能基の保護基の表は１４９−１５１頁に載せられている。所望のアミノ酸配列が完成した後、樹脂からペプチドを分離するだけでなく、残りすべての側鎖保護基を分離する薬剤、例えば液体ＨＦおよび１またはそれ以上の硫黄を含有するスカベンジャーなどの薬剤を用いた処理により、中間ペプチドが樹脂支持体から除去される。ＨＦ分離の後、タンパク配列をエーテルで洗浄し、より大容量の希酢酸に移し、水酸化アンモニウムで約ｐＨ８．０に調節して撹拌する。好ましくは、ポリペプチドの残基のアルキル化を防ぐために、（例えばメチオニン、システイン、チロシン残基のアルキル化）チオ−クレゾールとクレゾール清掃具混合物が用いられる。樹脂はエーテルで洗浄し、すぐにより大容量の希酢酸に移して溶解させ、分子間の架橋を最小化する。２５０μＭポリペプチド濃度は、０．１Ｍ酢酸溶液の約２リットル中に希釈する。ついでこの溶液を、撹拌して、そのｐＨを水酸化アンモニウムを用いて約８．０に調節する。ｐＨ調節により、ポリペプチドは所望のコンフォメーション配置をとる。クニッツドメインは上述の化学合成によっても、準合成（semisynthesis）によっても生産され得る。化学合成または準合成製造方法は、非天然アミノ酸残基の取り込みを可能にする。このことはクニッツドメインでなされており、記載されている（Beckmann,J.ら(1988)Eur.J.Biochem.176:675-682;Bigler,T.L.ら(199 3)Prot.Sci.2:786-799）。ここで述べたクニッツタイプドメインを１またはそれ以上含有するポリペプチドに対しては、大きな生分子の化学合成のための米国特許５，４０３，７３７号に記載された化学結さつ技術が、特に有用である。変異および合成技術本発明のポリペプチドをコードできる変異体ＤＮＡを製造するためには、種々の技術が利用できる。例えば、ＡＰＰＩ分子の様な天然クニッツタイプドメインに関し、生成タンパク質のアミノ酸配列の変化をコードしている天然に存在するＤＮＡ配列を基礎として、変異ＤＮＡを製造することが可能である。これらの変異体ＤＮＡは、本発明のポリペプチドを得るために用いることができる。その例示として、ＡＰＰＩ（Castroら、上述）または他の天然に存在するクニッツドメインポリペプチドをコードする発現ベクターを入手して、部位特異的変異（Kunkelら(1991)Methods Enzymol.204:125-139;Carter,P.,ら(1986)Nucl.Aca d.Res.13:4331;Zoller,M.J.ら(1982)Nucl.Acids Res.10:6487）、カセット変異（Wells,J.A.,ら(1985)Gene 34:315）制限選択変異（Wells,J.A.,ら(1986)Philo s.Trans，R.Soc.London Ser A317,415）または他の知られた技術をＤＮＡに施すことができる。ついで変異ＤＮＡは、親のＤＮＡの代わりに、適当な発現ベクターへ挿入して、用いられる。変異ＤＮＡを有する発現ベクターを含有する宿主細菌を増殖させることにより、クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤変異体が生産され、これは上述したように分離が可能である。上述したクニッツタイプドメインを１またはそれ以上含むポリペプチドのためには、クニッツタイプドメインを、例えば大きな生体分子の化学的合成のために米国特許５，４０３，７３７号に記載されたように、化学的結さつ技術を用いて、より大きな生体分子中に結さつすることができる。オリゴヌクレオチドで媒介される変異は、本発明のクニッツタイプ変異体の調製のために好適な方法である。この技術は、Adelmanら(1983)ＤＮＡ、2:183に記載されたようにこの分野でよく知られている。要するに、１本鎖型のプラスミドまたはバクテリオファージでＡＰＰＩの未変化また天然のＤＮＡ配列を含むものをテンペレートとし、そのテンペレートへ所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして、天然のクニッツタイプドメイン、例えばＡＰＰＩの天然または変化されていないＤＮＡを変化させる。ハイブリダイズの後、ＤＮＡポリメラーゼを用いてテンペレートの第２の相補鎖全体を合成し、こうしてオリゴヌクレオチドをプライマーとして取り込み、クニッツドメインサブユニットＤＮＡ中の選択的変化をコードするようになる。一般的に、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが用いられる。最適のオリゴヌクレオチドは、変異をコードするヌクレオチドの両側のテンペレートに完全に相補的な１２から１５のヌクレオチドであろう。このことは、オリゴヌクレオチドが、１本鎖ＤＮＡテンペレート分子に適当にハイブリダイズすることを確実にする。オリゴヌクレオチドは、例えばCreaら(1987)Proc.Nat l.Acad.Sci.USA,75:5765に記載されたような、当業者に知られた技術により容易に合成される。１本鎖ＤＮＡテンペレートもまた２本鎖プラスミド（または他の）ＤＮＡの変性により生成できる。天然ＤＮＡ配列の変化のために（例えば、アミノ酸配列変異体の生成のために）、オリゴヌクレオチドは、適当なハイブリダイゼーション条件において１本鎖テンペレートにハイブリダイズする。ついで合成のプライマーとしてオリゴヌクレオチドを用いてテンペレートの相補鎖を合成するために、ＤＮＡ合成酵素、通常ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノーフラグメントが添加される。こうして、ＤＮＡの１本の鎖がクニッツドメインの変異型をコードし、他方の鎖が（元のテンペレート）がネイティブな、変化していないクニッツドメインの配列をコードするようなヘテロデュプレックス（heteroduplex）分子が形成される。ついでこのヘテロデュプレックス分子を適当な宿主内に、通常E.coli２７Ｃ７などの原核細胞中に形質転換する。細胞が増殖した後、アガロースプレート上に塗布し、３２リン酸で同位体標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてスクリーニングし、変異ＤＮＡを含むバクテリアのコロニーを同定する。ついで変異領域を除去し、タンパク質生産に適したベクターに、通常適当な宿主の形質転換に代表的に用いられる発現ベクターに移す。すぐ前に記載した方法は、プラスミドの両方の鎖が変異を含むようなヘテロデュプレックス分子を作製するように修正できる。修正は以下の通りである：１本鎖オリゴヌクレオチドが、上述のごとく１本鎖テンペレートにアニールされる。デオキシリボアデノシン（ｄＡＴＰ）、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）、デオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の３種のデオキシリボヌクレオチド混合物が、ｄＣＴＰ−（αＳ）と呼ばれる修正チオデノキシリボシトシン（アマシャム社から得ることができる）に混合される。この混合物はテンペレート−オリゴヌクレオチド複合体に添加される。この混合物へのＤＮＡポリメラーゼの添加により、変異塩基以外はテンペレートと同じＤＮＡ鎖が生成する。さらに、この新しいＤＮＡ鎖は、ｄＣＴＰに代えてｄＣＴＰ−（αＳ）を含むであろう。これは制限エンドヌクレアーゼ消化から保護する機能を有する。二本鎖ヘテロデュプレックスのテンペレート鎖に適当な制限酵素で刻み目をつけた（nicked）後、テンペレート鎖は、変異される部位を含む領域を過ぎて、Ex o IIIヌクレアーゼあるいは他の適当なヌクレアーゼで消化されることができる。ついで、反応は一部のみ１本鎖である分子を残して停止される。ついで完全に２本鎖のＤＮＡホモデュプレックスが、全４種のデオキシリボヌクレオチド３リン酸、ＡＴＰ、およびＤＮＡリガーゼの存在下、ＤＮＡポリメラーゼを用いて形成される。このホモデュプレックス分子は、上述したように、E.coli２７Ｃ７などの適当な宿主細胞に形質転換できる。１以上のアミノ酸が置換されたクニッツドメイン変異体をコードするＤＮＡは、いくつかの方法のうちの１つにより生成されることができる。アミノ酸がポリペプチド鎖中で互いに近くに位置するとき、所望のアミノ酸置換の全てをコードする１つのオリゴヌクレオチドで同時に変異させることができる。しかしながら、もしアミノ酸が互いにいくらか離れて位置するときは（約１０アミノ酸より離れている）、所望の変換をすべてコードする１つのオリゴヌクレオチドを生成することはより困難である。代わりに、２つの代替可能な方法のうちの１つを用いることができる。第１の方法は、置換される各アミノ酸のために別のオリゴヌクレオチドが生成される。オリゴヌクレオチドはついで１本鎖テンペレートＤＮＡに同時に変性され、テンペレートから合成されたＤＮＡの第２の鎖は所望のアミノ酸置換のすべてをコードするようになる。別の方法は、所望の変異体を得るために、２あるいはそれ以上の回数の変異を含む。第１回目は、シングル変異のために記載されたものである：野生型ＤＮＡは、テンペレートとして用いられ、第１の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドがこのテンペレートに変性され、ヘテロデュプレックスＤＮＡ分子がついで生成される。変異の第２回目は、テンペレートとして第１回目の変異で製造された変異ＤＮＡを利用する。こうしてこのテンペレートがすでに１またはそれ以上の変異を含む。さらなる所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドは、ついでこのテンペレートに変性され、このとき得られるＤＮＡ鎖は、第１回目と第２回目の変異からの変異をコードする。この得られるＤＮＡは、第３回目のテンペレート等として用いられることができる。クニッツドメイン変異体の組換え体の発現に好適なベクターは、ｐＳＡｌｚ１である。このベクターは、実施例１で述べるように、E.coliの複製オリジン、アルカリンホスファターゼプロモーター、ｓｔＩＩシグナル配列、ＡＰＰＩ変異体遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。他の好適なベクターは、ｐＢＯ４７５，ｐＲ１Ｔ５，およびｐＲ１Ｔ２Ｔ（ファルマシアバイオテクノロジー）である。これらのベクターは、プロテインＡのＺドメインがその後にくる適当なプロモーターを含み、ベクターに挿入された遺伝子が融合タンパク質として発現される。これらのベクターについては以下さらに述べる。ここで述べたベクターの関連する性質を組み合わせることにより、標準的な技術を用いて、他の好適なベクターを構築することができる。ベクターの関連する性質には、プロモーター、リボゾーム結合部位、ＡＰＰＩ変異体遺伝子、または遺伝子融合体（プロテインＡのＺドメインとＡＰＰＩ変異体とそのリンカー）、シグナル配列、抗生物質耐性マーカー、コピー数、および適当な複製オリジンが含まれる。 E.coliでは、クニッツドメインは、インタクトな分泌タンパク質（Castro,M. ら(1990)FEBS Lett.267:207-212）、細胞内で発現されたタンパク質（Altman,J. D.ら(1991)Protein ENg.4:593-600）、または融合タンパク質（Sinha,S.ら(1991 )J.Biol.Chem.266:21011-21013;Lauritzen,C.ら(1991)Prot.Express.Purif.2:37 2-378;Auerswald,E.A.ら(1988)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 369:27-35）として発現された。宿主細胞は、原核生物でも、真核生物でもよい。原核生物は、親ポリペプチド、セグメント置換ポリペプチド、前記置換ポリペプチド、ポリペプチド変異体を生産するための、ＤＮＡ配列のクローニングと発現に好適である。例えば、E.co li Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣNo.３１４４６）、E.coliＢ、E.coliＸ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ．３１５３７）、およびE.coliｃ６００およびｃ６００ｈｆｌ，E. coli Ｗ３１１０（Ｆ−、ガンマー、プロトトロピック／ＡＴＣＣＮｏ．２７３２５）、Bachillus subtilisなどのバチルス、およびSalmonella-typhimuriumまたはSerratia marcesansなどの他の腸内菌科目、および種々のシュードモナス種を用いることができる。好適な原核生物はE.coliＷ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）とノンサプレッサー誘導体２７Ｃ７（ＡＴＣＣ５５，２４４）である。原核生物内で発現すると、ポリペプチドは典型的にＮ末端メチオニンまたはホルミルメチオニンを有し、グリコシル化されていない。融合タンパク質の場合、Ｎ末端メチオニンまたはホルミルメチオニンは、融合タンパク質のアミノ末端または融合タンパク質のシグナル配列に存在する。これらの例は、もちろん制限的ではなく、説明を意図したものである。原核生物に加えて、真核生物、例えば酵母培養、または多細胞生物由来の細胞を使用することができる。原則として、そのような細胞の如何なるものも使用可能である。しかしながら最も興味を引くのは脊椎動物の細胞であり、脊椎動物の培養液中の増殖（組織培養）は再生産可能な手順となった（Tissue Culture ，Kr useおよび Patterson編（1973）Academic Press）。そのような有用な宿主のセルラインの例としては、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルライン、Ｗ１３８，２９３、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、ＭＤＣＫセルラインがある。酵母の発現系は、クニッツドメインを生産するために用いられた（Wagner,S.L.ら(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.186:1138-1145; Vedvi ck，T.ら(1991)J.Indust.Microbiol．7:197-202）。特に酵母Pochia pastoris が、Saccharomyces cerevisiae αメイティングファクターのプレプロシグナル配列とP ．pastorisアルコールオキシダーゼＡＯＸ１プロモーターと末端配列を用いて、好適に用いられる。ヘテロなタンパク質を発現するために一般的に用いられる他の酵母発現ベクターと宿主もまた用いられる。遺伝子融合上述の手順の変法として、遺伝子融合の使用があり、この方法ではＡＰＰＩ変異体をコードする遺伝子が、ベクター内で、他のタンパク質または他のタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子と連結される。この結果、ＡＰＰＩ変異体は、宿主により他のタンパク質との融合体として生産される。「他の」タンパク質とはしばしば、細胞により分泌可能なタンパク質またはペプチドであり、これにより所望のタンパク質の培地からの分離と精製を可能にし、所望のタンパク質を細胞内にとどめている場合必要となる宿主細胞の破壊の必要性を除く。また、融合タンパク質は、細胞内で発現されることができる。これは大量に発現する融合タンパク質を用いる場合に有用である。遺伝子融合の使用は、本質的ではないが、E.coliでのヘテロなタンパク質の発現と、その後のこれらの遺伝子産物の精製を容易にすることができる（Harris,T .J.R．Genetic Engineeringの中 Williamson,R.,編(1983)Academic，London，４巻１２７頁;Uhen,M.およびMoks,T.,(1990)Methods Enzymol．185:129-143）。プロテインＡ融合体は、プロテインＡの、またはより具体的にはプロテインＡのＺドメインの、ＩｇＧとの結合が、融合タンパク質の精製のための「アフィニティハンドル」を提供するために、しばしば用いられる（Nilsson,B.およびAbrahmse n,L.(1990)Methods Enzymol.185:144-161）。また、多くのヘテロなタンパク質が、直接E.coli内で発現するときは分解されるが、融合タンパク質として発現するときは安定することもみられる（Marston,F.A.O.,(1986)BIochem J.,240:1）。融合タンパク質として発現されたＡＰＰＩ変異体は、ネイティブな構造を得るために、適当に折り畳まれることができ、または折り畳みを要求する。適当に折り畳まれた融合タンパク質は、活性型となりセリンプロテアーゼ阻害剤として有用となる。より好適には、その分野で知られた方法により、融合タンパク質から得られた、正しく折り畳まれたタンパク質である。融合タンパク質は、メチオニンで開裂させるシアノーゲンブロミド、ＡｓｎとＧｌｙの間で開裂させるヒドリキシルアミンなどの化学物質により、開裂させることができる。標準の組換えＤＮＡ法を用いて、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基ペアを、ＡＰＰＩ変異体遺伝子の５’末端の直前に挿入することができる。または、融合タンパク質のタンパク質分解的開裂を用いることができ、最近評論されている（Carter,P.in Protein Purification:From Molecular Mechanisms to Large-Scale Process ， Ladisch，M.R.，Wilson,R.C.，Painton,C.C.，およびBuilder,S.E.,編(1990)American Chemical Society Symposium Series No．42 7,Ch13,181-193頁）。第Ｘａ因子、トロンビン、ズブチリシン、およびそれらの変異体、などのプロテアーゼは、融合タンパク質をうまく開裂するのに用いられてきた。代表的には、用いられるプロテアーゼにより、開裂しやすいペプチドリンカーが、「他の」タンパク質（例えば、プロテインＡのＺドメイン）と対象のタンパク質、例えばＡＰＰＩ変異体、との間に挿入される。組換えＤＮＡ法を用いて、リンカーをコードするヌクレオチド塩基ペアは、他のプロテインをコードする遺伝子または遺伝子フラグメントの間に挿入される。正しいリンカーを含有する部分的に精製された融合タンパク質の蛋白分解性開裂は、ついでネイティブ融合タンパク質でも、還元された、あるいは変性した融合タンパク質でも行うことができる。タンパク質は、融合タンパク質として発現するとき、適当に折り畳まれていても、または折り畳まれていなくてもよい。また、開裂部位を含む特異的ペプチドリンカーは、プロテアーゼに接近可能でもそうでなくともよい。これらのファク 1ターは、融合タンパク質が変性され再度折り畳まれるかどうかを決定し、その場合、これらの手順は開裂の前または後に用いられるかどうかを決定する。変性と再度折り畳みが必要なとき、典型的にタンパク質は、グアニジンＨＣｌなどのカオトロープ（chaotrope）処理され、ついでレドックスバッファー、例えば、適当な割合、ｐＨ、および温度下の、還元および酸化されたジチオスレイトールまたはグルタチオン、を用いて処理され、対象のタンパク質は再度折り畳まれてネイティブな構造となる。有用性コンタクト活性化システムが、敗血症ショック、心肺バイパス手術、成人呼吸困難症候群、および血管浮腫（Bone,R.C.,(1992),Arch.Intern.Med.152:1381-13 89;Colman,R.W.,(1989)N Engl.J.Med.320:1207-1209）などの、種々の臨床場面で重要な役割を担っていることが示唆されている。コンタクトシステムの阻害剤はしたがって、炎症および／または血栓症の障害の制御において重要な役割を担っている。ここで述べたポリペプチドは、コンタクト経路活性化または好中球活性化における介在が示されている疾病の治療において有用である（例えば、炎症、凝固、フィブリン溶解、および補体活性化）。より具体的には、この阻害剤は、プラスマカリクレイン（およびＦＸＩａ）の阻害が示される（図１参照）疾病の治療、例えば、背景のセクションで詳細に説明したように、敗血症または敗血症ショック、炎症、ＡＲＤＳ、ＤＩＣ、低血圧症、心肺バイパス手術、および術後の処置の出血の治療に特に有用である。ここで述べたポリペプチドは、急性のまたは慢性の療法の臨床の場面で好適に用いられる。急性療法が示される徴候の方が慢性療法のそれよりも好ましいことが予想される。外来または変異ヒトタンパク質の薬理的用途は、免疫原性で有り得る。しかしながら外来タンパク質は、急性の徴候を治療するのに用いられる。そのようなタンパク質の例としては、ストレプトキナーゼ、フィブリン溶解性に作用し、通常急性の心筋梗塞の治療に用いられるストレプトコッカス由来のタンパク質がある。ここで述べた薬剤は、免疫反応を誘発するかもしれないが、ＢＰＴＩなどの関連外来タンパク質は、ヒトの臨床に用いられており、重大な免疫反応を誘発することは予想されない。ここで述べた薬剤へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共有結合は、他のタンパク質で観察されたように、免疫原性と毒性を減少させ、半減期を延長するかも知れない（Karte N.V.,(1990)J．Immunol ．144:209-213;Poznansky,M.J.ら(1988)FEB 239:18-22;Abuchowski,A.ら(1977)J .Biol.Chem.252:3582-3586）。アプロチニンは、好中球の脱顆粒、血小板活性化と凝集の防止と同様に、血液損失とカリクレイン−Ｃ１−阻害剤およびＣ１−Ｃ１−阻害剤複合体の減少により証明されたように、刺激された体外灌流の間、コンタクト、好中球、および血小板活性化システムを阻害する（Westaby,S.,(1993)Ann.Thor.Surg.55:1033-104 1;Wachtfogel,Y.,ら(1993)J.Thorac.Cardiovasc.Surg.106:1-10）。それは、ＬＰＳがブタの内毒素ショックを誘導し、動脈の低血圧を防ぐ間に、用いられた（ Seibeck,M.,ら(1993)J.Trauma34:193-198）。肝硬変の患者では、アプロチニンは腎臓の機能とろ過を改善させる（MacGilchrist A.,(1994)Clin.Sci.87:329-33 5）。ここで述べたプラスマカリクレインクニッツドメイン阻害剤は、これらのおよび関連する徴候の治療に好適に用いられる。本発明のポリペプチドは、アプロチニンが用いられたのと全く同様に、プラスマカリクレインで媒介される機能の調節の治療に有用である。本ポリペプチドは、プラスマカリクレインの可能性と特異性が増加するという利点を提供し、低投与の処方を可能にする。本発明のポリペプチドの有効投与は、関連する技術に従って決定される。組成物の選択、投薬の頻度、投薬される組成物の量は、治療される特定の疾病と、深刻さ、用いたポリペプチドの性質、患者の全体的な条件、治療する医者の判断によるであろう。代表的な投与のレジメは、アプロチニンなどの他の類似するタンパク質を使用したときのこれらの疾病状態の治療に類似するであろう。代表的には、本発明の組成物は、約１％から約９５％の、好ましくは約１０％から約５０％の活性成分を含有するであろう。好ましくは、投与は、静脈注射、短期注入（infusion）により行われるであろう。最適の治療効果を達成するために、維持投与が要求される。そのよな維持投与は、１日の間、反復された個々の注射または継続的滴下注入などにより、反復的に行われることができる。静脈注射または短期注入としては、通常約１〜１，０００ｍｇの間で成人に投与され、好ましくは約１〜１００ｍｇの間である。約０．５〜約５０ｍｇの維持投与が予想される。他の効果的な投与量は、当業者が投与反応カーブをつくるいう日常的試みで、容易に決定される。本発明のポリペプチドを含む薬理組成物は、いかなる適当な方法でも投与されることができ、非経口、局所（topical）、経口、または、局所（local）（例えばエアゾールまたは経皮）またはこれらの組み合わせを含む。組成物は好ましくは薬理的に許容されるキャリアとともに投与されることができ、キャリアの性質は投与のモードにより異なり、例えば、経口投与のときは、通常固定のキャリアを、Ｉ．Ｖ．投与の時は液体塩溶液キャリアである。本発明の組成物は、本発明の主題とタンパク質に適合するような薬理的に許容される成分を含む。これらは通常懸濁液、溶液およびエリキシル、および特に、リン酸塩バッファー、生理的食塩水、ダルベッコメデイア（Dulbecco's Media）など生理的バッファーを含む。エアゾールもまた用いられることができ、またはスターチ、糖、微粒子セルロース、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、バインダー、分解剤、など（経口固体調製の場合、例えば粉末、カプセル、錠剤）も用いられることができる。ここで用いられているように、「薬理的に許容される」という用語は、通常、その動物、とりわけヒトへの使用が、連邦または州政府の監視局により是認された、または合衆国薬局方または他の一般に認められた薬局方にリストされたことを意味する。選択の処方は、種々の前述のバッファー、またはむしろ例えば、薬理的グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウム、炭酸マグネシウムなどのを含む賦形剤を用いて、達成されることができる。組成物の「ＰＥＧ化」は、その分野で知られた技術を用いて達成される（例えば、国際特許公開No.WO92/16555,米国特許No.5,122,614 t o Enzen，および国際特許公開No．WO92/00748参照）。経口組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、支持された放出処方（sustained release formul ations）、または粉末の形態をとることができる。本発明は、ある特定の方法と材料を参照して議論される必要性を有している。これらの特定の方法と材料の議論は、本発明の範囲への制限を全く構成するものではないこと、本発明は、本発明の結果を完遂するために適したあらゆるすべての代替材料と方法まで拡大することが理解されるであろう。実施例１プラスマカリクレイン阻害剤の構築と精製方法ヒト第VIIa因子、第Xa因子、第XIa因子、活性化プロテインＣ、およびトロンビンはHaematologic Technologies Inc.(Essex Jct.，VT)より購入した。ヒトプラスマカリクレインと第XIIa因子はエンザイムリサーチラボラトリー、インク（ South Bend，IN）より購入した。ＡＰＰＩ配列をコードする遺伝子は、Castro， M．ら(1990)FEBS Lett.267:207-212に記載されている。組換えヒト組織因子_1-24 ₃ （ＴＦ）はPaborsky,L.R.,ら(1989)Biochemistry 28:8072-8077およびPaborsky ,L.R.,ら(1991)J.Biol.Chem.266:21911-21916に記載されているように、E.coli 内で生産した。ＢＰＴＩ（商標Trasylol）はベーリンガーマンハイム（インディアナポリス、IN）から入手した。ウシトリプシンとＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００はシグマケミカルズ、インクから購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、第ＶフラクションはCalbiochem（La Jolla,CA）から入手した。ヒトプラスミン、Ｓ−２３０２，Ｓ−２２５１，およびＳ−２３６６は、Kabi Vitrum（Swede n）およびスペクトロザイムFXaはAmerican Diagnostica（Greenwich,CT）から購入した。E.coli株XL1-ブルーは、Stratagene（La Jolla,CA）から入手した。他の全ての入手した薬剤は、市販で入手可能な最高級のものであった。プラスミドｐＳＡｌｚ１は、ＡＰＰＩ配列をコードする合成遺伝子を、ＡＰＰＩのペリプラズムと培地への分泌のために、適当な発現ベクターに挿入することにより構築された。ｐＳＡｌｚ１ベクターは、Castroらにより記載されたように（Castro，M.ら(1990)上述）、アルカリンホスファターゼプロモーター、stII分泌シグナル、ＡＰＰＩ遺伝子、ｆ１およびｃｏｌＥ１複製オリジン、アンピシリン耐性遺伝子を含有していた。ｐＳＡｌｚ１ベクターを用いたＡＰＰＩ変異体の構築は、以前述べられた部位特異的オリゴヌクレオチド変異（Kunkel,T.A.ら(19 91)Methods Enzymol.204:125-139）により行った。選択されたクローンは、ジデオキシ配列分析（Sanger,F.ら(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463-5467）により分析した。ＡＰＰＩか選択された変異体のどちらかをコードするファージミドを、クニッッドメイン阻害剤の発現のために、E.coliＷ３１１０のデリバティブであるE.co li 株２７Ｃ７、中に形質転換した。一晩飽和させた培養液を、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２５０ｍｌの低リン酸最小培地（Chang,C.N .ら(1987)Genes 5 5:189-196）に接種し（１％）、２０時間３７℃で増殖させた。阻害剤は、stIIシグナル配列のおかげでペリプラズム中へ分泌され、結局培地中へ漏出した。細胞と破砕物は、遠心分離（８０００×ｇ、１０分）により除去した。上清は、１ＭのＮａＯＨでｐＨ７．５−８．５に調整し、製造者の推薦に従って調製した１ｍｌトリプシン−アフィゲル（Affigel）（バイオラッドラボラトリーズ、リッチモンド、ＣＡ）アフィニティカラム上にのせた。カラムは、１００ｍＭトリスｐＨ８、１００ｍＭのＮａＣｌ、および２０ｍＭのＣａＣｌ₂ で洗浄し、阻害剤を、４ｍｌ、１０ｍＭのＨＣｌ、０．５ＭのＫＣｌで溶出させた。阻害剤はさらに、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（２５０×４．６ｍｍ，ＶＹＤＡＣ）を用いて精製した。それを０．１％トリフルオロ酢酸にロードし、ＣＨ₃ＣＮの５から４０％の勾配で１ｍｌ／分で溶出した。溶出パターンは、Ａ₂₁₄とＡ₂₈₀の両方でモニターした。３０から３５％ＣＨ₃ＣＮの間で、各阻害剤について、単一の非常にはっきりとしたピークが検出された。阻害剤の配列は、質量分析のためのarticulated 電気スプレー源を備えたSciex API3 マススペクトル計を用いて質量が適当であることを確かめた。ウマのミオグロビン（ＭＷ＝１６，９５１Ｄａ）の複数荷電されたイオンを較正手段として用いた。結果プラスマカリクレインの強力な阻害剤のクニッツドメインの位置１１−１９と３４で好適なアミノ酸を調べるために部位特異的変異体がなされた。ＡＰＰＩの部位特異的変異体は以下の式を有する。Ｒ₁−Ｘａａ₅−Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂’− Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’−Ｒ₂−Ｘａａ₁₉’−Ｒ₃ Ｒ₁は、ＡＰＰＩのアミノ酸残基１−１０、ＶＲＥＶＣＳＥＱＡＥ（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）を表し、Ｒ₂はＡＰＰＩのアミノ酸残基２０−３３、ＲＷＹＦＤＶＴＥＧＫＣＡＰＦ（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）を表し、Ｒ₃はＡＰＰＩのアミノ酸残基３５から５８、ＹＧＧＣＧＧＮＲＮＮＦＤＴＥＥＹＣＡＡＶＣＧＳＡ（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）を表す。この例で用いられるＡＰＰＩ配列は、ネイティブな配列のＭｅｔがＡｌａで置換されるような、残基５２の追加された変異である。この変異は阻害活性に影響をもたらすとは考えられていない。得られた天然に存在しないクニッツドメインを下記表Ｉにリストする。表Ｉにリストされたクニッツドメイン変異体は、一般的に強力で選択的なプラスマカリクレインの阻害をもたらす（実施例２と３を参照）。プラスマカリクレインを阻害する他の配列は、下記表IIに記載する。実施例２平衡解離定数の決定方法表Ｉにリストされたクニッツドメイン変異体についてみかけの解離定数（Ｋ_i ^* ）を決定した。Ｋ_i ^*値は、堅く結合した阻害剤からの方法（Bieth,J.,(1974)Pro teinase Inhibitors ,(Fritz,H.,Tschesche,H.,Greene,L.J.,およびTruscheit,E. ,編)、463-469頁,Springer-Verlag，ニューヨーク;Williams,J.W.Morrison,J.F. ,(1979)上述）を用い、クニッツドメインとセリンプロテアーゼの相互作用で観察されたように（Bode,W.およびHuber,R.,(1992)上述;Laskowski,Jr.,M.Kato,I. ,(1980)上述）、酵素と阻害剤が１：１の化学量で可逆的複合体を形成すると仮定して、決定した。阻害剤のストックの濃度は、活性化部位滴定トリプシンでの滴定（Jameson,G. W.,ら(1973)Biochem.J.,131:107-117）により正確に決定した。８０ｎＭのトリプシンに、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ₂、および０．０５％のTriton X-100で希釈した阻害剤の部分標本を添加したものを、室温で１時間のインキュベーションした後、５ｍＭのＮα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリドを２０μｌ添加して全体が１５０ μｌとした。ついで４０５ｎＭでの吸光度の変化をモニターした。決定された濃度は阻害剤とトリプシンが１：１の化学量と推定した。選択されたＡＰＰＩ変異体（表Ｉ）によるプラスマカリクレインの阻害は、２５℃で５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂、および０．００５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で、同じ希釈阻害剤溶液の部分標本を用いて決定された。反応（２００μＬ）はミクロタイタープレート中で行い、１．５時間のインキュベーションの後、レート基質（０．７ｍＭのＳ２３０２）は４０２ｎｍでモニターした。フラクション速度対阻害剤濃度のプロットを、非線形回帰分析により方程式１に適用し、みかけの平衡解離定数（Ｋ_i ^* ）を決定した。方程式Ｉ：ここでＶ_i/Ｖ_oは、活性比（非阻害割合で除した定常状態の阻害割合）、[Ｅ_o] はプラスマカリクレイン活性部位の総濃度、[Ｉ_o]は阻害剤総濃度である。結果表Ｉに記載されたクニッツドメイン阻害剤は、１０から３００ｐＭまでの範囲のみかけの解離定数を有していた（表IIIおよび表IV）。ＡＰＰＩの位置１１（Ｐ₅）におけるＰｒｏ、ＡｓｐまたはＧｌｕ、位置１３（Ｐ₃）におけるＨｉｓ、位置１５（Ｐ₁）におけるＡｒｇ、位置１６（Ｐ₁’）と１７（Ｐ₂’）におけるＡｌａ、位置１８（Ｐ₃’）におけるＨｉｓ、位置１９（Ｐ₄’）におけるＰｒｏ、および位置３４（Ｐ₁₉’）におけるＶａｌまたはＴｙｒから構成される下記表IIIのコンセンサス配列が、表IIからのいくつかの観察をもとに明らかとなったもので、その結果は表IVに示されている。位置１５（Ｐ₁）にＡｒｇ、位置１３、１７、１８および１９にＨｉｓ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、およびＰｒｏを各々有するＡＰＰＩの変異体は、プラスマカリクレインを強力に阻害することが見いだされた。これらの変異体では、位置１１（Ｐ₅）ではＰｒｏ、Ａｓｐ、またはＧｌｕが好ましいことが観察され、位置３４（Ｐ₁₉’）ではＶａｌまたはＴｙｒが好ましい。クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤の、位置３８（Ｐ₂₃’）のシステインとジスルフィド結合を形成する位置１４（Ｐ₂ ）のシステインは変化がなく保持されていた。Ｇｌｙはほとんど常にクニッツタイプドメインの位置１２（Ｐ₄）に見いだされ、変わらない。特に、コンセンサスタイプのクニッツドメインのうち、位置１１にＡｓｐを含む変異体は、みかけの平衡解離定数が５０ｐＭ未満であった。そのような変異体の１つであるＫＡＬＩ−ＤＹは、ＡＰＰＩの１０，０００倍より強く、およびＢＰＴＩ（アプロチニン、Trasylol（商標））より３，０００倍より強く、プラスマカリクレインを阻害した。実施例３特異性アッセイ方法ＡＰＰＩ、ＢＰＴＩ、およびクニッツドメイン変異体の、凝集に関与する他のセリンプロテアーゼに対する、特異性を調べるアッセイを、以下の方法で実施した。５００ｎＭに希釈された種々の阻害剤の部分標本（３０μＬ）を、適当なバッファー中の各プロテアーゼ（１００μＬ）とともに、インキュベートした。基質／阻害剤の混合物の室温、２時間のインキュベートの後、適当な基質（２０μ Ｌを添加し、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。非阻害のものと基質加水分解速度を測定するために、インヒビターと酵素を欠くコントロールを各々アッセイした。酵素と基質は、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、１００ｍＭＮａＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ₂と０．００５％のトリトンＸ−１００中で、以下の通りスクリーニングした。トロンビン（６．２ｎＭ）、０．７ｍＭのＳ２３６６；ＦＸａ（２．５ｎＭ）、０．７ｍＭスペクトロザイムｆＸａ；ＦＸＩａ（１．８ｎＭ）、０．７ｍＭＳ２３６６；活性化プロテインＣ（７．６ｎＭ）、０．７ｍＭＳ２３３６；プラスミン（３２ｎＭ）、０．７ｍＭＳ２２５１；第XIIa因子（１４ｎＭ）、０．７ｍＭＳ２３０２、ＴＦ（７７ｎＭ）−ＦＶＩＩａ（１４ｎＭ）、０．７ｍＭＳ２３６６とプラスマカリクレイン（３．５ｎＭ）、０．７ｍＭＳ２３０２。ＦＸＩａアッセイは１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡも含む。ＦＸＩａの全体の濃度は、活性部位の濃度を意味する。この実験では、トロンビン、ＴＦ−ＦＶＩＩＡ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、およびプラスミンの濃度はおおよそのもので、製造者の仕様にしたがって決められる。結果実施例２に記載されたクニッツドメイン阻害剤の相対特異性を決定するために、ヒトプラスマ中に見いだされる他の関連するセリンプロテアーゼの阻害も、測定した。セリンプロテアーゼ（１から２０ｎＭ）を、１００ｎＭ阻害剤の存在下でアッセイした。残りの蛋白分解活性のフラクションは、表IVに示されている。選択されたすべてのクニッツドメイン変異体がFXIaを阻害したが、どれもFXIIa 、Fxa、トロンビン、ＴＦ−ＦVIIa、またはプロテインＣを容易に検知できるほど阻害しなかった（表IV）。選択されたクニッツ阻害剤のほとんどがプラスミンをほんのわずか阻害し、ＫＡＬＩ−３８、ＫＡＬＩ−４２、およびＫＡＬＩ−４８では、中程度の（＞６０％）阻害が観察された。しかしながら、実施例２のコンセンサス変異体（表III）はプラスミンを容易に検知できるほどには阻害しなかった。FXIaが、コンセンサス変異体を含む選択された阻害剤により阻害された割合を、さらにＫ_i ^*を測定することにより調べた。ＡＰＰＩ、ＢＰＴＩ、ＫＡＬＩ− Ｄ、およびＫＡＬＩ−ＤＹ存在下のプラスマカリクレイン（０．５ｎＭ）の阻害は図４Ａに示されている。ＡＰＰＩ、ＢＰＴＩ、ＫＡＬＩ−１０およびＫＡＬＩ −ＤＹによるＦXIa（３．５ｎＭ）の阻害は図４Ｂに示されており、Ｋ_i ^*値は表I IIとIVに示されている。実施例４凝固アッセイ方法正常なヒトプラスマの凝固時間は、ＭＬＡＥｌｅｃｔｒａ８００コアグロメーター（メディカルラボラトリーアートメーションインク、プレザントビル、Ｎ．Ｙ．）およびＤａｄｅ剤（バクスターヘルスケアセンターコープ、マイアミＦＬ）を用いて行った。凝固時間は、目視で決定した。活性化部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）アッセイのために、活性化時間は１２０秒に、獲得（acquisition）時間はアッセイの予想される結果により３００から６００秒に設定した。クエン酸塩の正常ヒトプラスマと阻害剤を併せてインキュベートした。サンプル（プラスマと阻害剤）と活性剤（アクチンＦＳ）を自動的にピペットで測り、併せて３７℃２分インキュベートし、ついでＣａＣｌ₂を添加し、凝固時間を目視で決定した。阻害剤とプラスマの全体のインキュベーション時間は、活性剤添加前に約３分、ＣａＣｌ₂添加前に５分とした。結果特異性アッセイから予想されたように、ＫＡＬＩ−ＤＹは、内因性凝固経路の物差しであるＡＰＴＴでの凝固時間を延長したが、外因性凝固経路の物差しであるＰＴでの凝固時間を延長しなかった（図５Ａ）。ＫＡＬＩ−ＤＹは、ＡＰＰＩ、ＦＸＩａ阻害剤（Ｋ_i ^*＝２．７ｎＭ）またはＢＰＴＩ、カリクレイン阻害剤（Ｋ_i ^*＝４５ｎＭ）より著しく有効であった。加えて、プラスマカリクレインはプラスマ中に６００ｎＭ存在したが、２５０ｎＭのＫＡＬＩ−ＤＹは凝固時間を２倍に延長した。ＫＡＬＩ−ＤＹは、ＡＰＴＴにより測定された方法による濃度において表面媒介接触活性化経路の凝固時間を延長した。ＫＡＬＩ−ＤＹ１μＭにおいて、３．５倍を越える凝固時間の延長、ＡＰＰＩ、ＢＰＴＩで各々２．８と１．８倍の延長がみられた（図５Ａ）。これに対し、ＫＡＬＩ−ＤＹ、ＢＰＴＩ、ＡＰＰＩは、組織因子で開始されるＰＴアッセイでは凝固時間を検知できるほどには延長しなかった（図５Ｂ）。ここで引用された文献は、明白に参照として取り込まれたものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年７月１０日【補正内容】請求の範囲１．非天然のクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメイン含むポリペプチドであって、該クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインが第１結合ループ：Ｘａａ₅−Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂’−Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’と、Ｘａａ₁₉’を含む第２結合ループとを有しており、Ｘａａ₅は、Ｐ，Ｄ，Ｅ，Ｓ，Ｔ，Ｒ，およびＬからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄は、Ｇ；Ｘａａ₃は、Ｈ，Ｐ，Ｒ，Ｌ，ＧおよびＴからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂はＣ；Ｘａａ₁はＲ；Ｘａａ₁’は、ＡおよびＧからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂’は、Ａ，Ｌ，Ｎ，ＷおよびＳからなる群から選ばれ；Ｘａａ₃’は、ＨおよびＩからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄’は、Ｐ，Ｙ，ＬおよびＷからなる群から選ばれ；およびＸａａ₁₉’は、Ｖ，Ｙ，Ｗ，ＳおよびＦから選ばれ；かつ該ポリペプチドはプラスマカリクレインに対し、約５００ｐＭ未満のＫ_i ^* を有するポリペプチド。２．Ｘａａ₅は、Ｐ，Ｄ，およびＥからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄は、Ｇ；Ｘａａ₃は、Ｈ，Ｐ，Ｒ，およびＬからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂はＣ；Ｘａａ₁はＲ；Ｘａａ₁’は、ＡおよびＧからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂’は、Ａ，Ｌ，Ｎ，およびＷからなる群から選ばれ；Ｘａａ₃’は、ＨおよびＩからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄’は、Ｐ，Ｙ，ＬおよびＷからなる群から選ばれ；およびＸａａ₁₉’は、Ｖ，Ｙ，Ｗ，およびＳから選ばれた請求の範囲第１項記栽のポリペプチド。３．配列Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂-Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂ ’−Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’がＧＨＣＲＡＡＨＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）で、かつＸａａ₅がＤ，Ｅ，およびＰから選ばれ、Ｘａａ₁₉’はＶ，Ｗ，およびＹから選ばれた請求の範囲第２項記載のポリペプチド。４．クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインが配列Ｒ₁−Ｘａａ₅−Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂’− Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’−Ｒ₂−Ｘａａ₁₉’−Ｒ₃ を有し、Ｒ₁は１０アミノ酸ペプチドで、アミノ酸位置Ｘａａ₁₁に相当するアミノ酸はＣ；Ｒ₂は１４アミノ酸ペプチドで、アミノ酸位置Ｘａａ₁₅’に相当するアミノ酸はＣ；およびＲ₃は２４アミノ酸ペプチドで、アミノ酸位置Ｘａａ₂₃’、Ｘａａ₃₆’、Ｘａａ₄ ₀ ’に相当するアミノ酸はＣである請求の範囲第１項記載のポリペプチド。６．Ｒ₁はＡＰＰＩのアミノ酸残基１−１０（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）あるいはその保存性アミノ酸置換物を表し；Ｒ₂はＡＰＰＩのアミノ酸残基２０−３３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）あるいはその保存性アミノ酸置換物を表し；Ｒ₃はＡＰＰＩのアミノ酸残基３５−５８（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）あるいはその保存性アミノ酸置換物を表す請求の範囲第５項記載のポリペプチド。７．Ｘａａ₅は、Ｐ，Ｄ，およびＥからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄は、Ｇ；Ｘａａ₃は、Ｈ，Ｐ，Ｒ，およびＬからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂はＣ；Ｘａａ₁はＲ；Ｘａａ₁’は、ＡおよびＧからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂’は、Ａ，Ｌ，Ｎ，およびＷからなる群から選ばれ；Ｘａａ₃’は、ＨおよびＩからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄’は、Ｐ，Ｙ，ＬおよびＷからなる群から選ばれ；およびＸａａ₁₉’は、Ｖ，Ｙ，Ｗ，およびＳから選ばれた請求の範囲第６項記載のポリペプチド。８．配列Ｘａａ₅−Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂ ’−Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’がＤＧＨＣＲＡＡＨＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）で、かつＸａａ₁₉’が、Ｖ，Ｗ，およびＹから選ばれた請求の範囲第７項記載のポリペプチド。９．請求の範囲第１項記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。１０．ＤＮＡと作用的にリンクした発現制御配列をさらに含有する請求の範囲第９項記載のＤＮＡ。１１．請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。１２．請求の範囲第１１項記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。１３．ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求の範囲第１２項記載の宿主細胞を培養することを含む、宿主細胞内でセリンプロテアーゼ阻害剤をコードするＤＮＡ分子を発現させる方法。１４．薬理的に許容される賦形剤と、請求の範囲第１項記載のポリペプチドを含む薬理組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/64 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．非天然のクニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメイン含むポリペプチドであって、該クニッツタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインが第１結合ループ：Ｘａａ₅−Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂’−Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’と、Ｘａａ₁₉’を含む第２結合ループとを有しており、Ｘａａ₅は、Ｐ，Ｄ，Ｅ，Ｓ，Ｔ，Ｒ，およびＬからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄は、Ｇ；Ｘａａ₃は、Ｈ，Ｐ，Ｒ，Ｌ，ＧおよびＴからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂はＣ；Ｘａａ₁はＲ；Ｘａａ₁’は、ＡおよびＧからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂’は、Ａ，Ｌ，Ｎ，ＷおよびＳからなる群から選ばれ；Ｘａａ₃’は、ＨおよびＩからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄’は、Ｐ，Ｙ，ＬおよびＷからなる群から選ばれ；およびＸａａ₁₉’は、Ｖ，Ｙ，Ｗ，ＳおよびＦから選ばれ；かつプラスマカリクレインを阻害可能なポリペプチド。２．Ｘａａ₅は、Ｐ，Ｄ，およびＥからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄は、Ｇ；Ｘａａ₃は、Ｈ，Ｐ，Ｒ，およびＬからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂はＣ；Ｘａａ₁はＲ；Ｘａａ₁’は、ＡおよびＧからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂’は、Ａ，Ｌ，Ｎ，およびＷからなる群から選ばれ；Ｘａａ₃’は、ＨおよびＩからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄’は、Ｐ，Ｙ，ＬおよびＷからなる群から選ばれ；およびＸａａ₁₉’は、Ｖ，Ｙ，Ｗ，およびＳから選ばれた請求の範囲第１項記載のポリペプチド。３．配列Ｘａａ₅−Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂ ’−Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’がＤＧＨＣＲＡＡＨＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）で、かつＸａａ₁₉’が、Ｖ，Ｗ，およびＹから選ばれた請求の範囲第２項記載のポリペプチド。４．クニッッタイプセリンプロテアーゼ阻害剤ドメインが配列Ｒ₁−Ｘａａ₅−Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂’− Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’−Ｒ₂−Ｘａａ₁₉’−Ｒ₃ を有し、Ｒ₁は１０アミノ酸ペプチドで、アミノ酸位置Ｘａａ₁₁に相当するアミノ酸はＣ；Ｒ₂は１４アミノ酸ペプチドで、アミノ酸位置Ｘａａ₁₅’に相当するアミノ酸はＣ；およびＲ₃は２４アミノ酸ペプチドで、アミノ酸位置Ｘａａ₂₃’、Ｘａａ₃₆’、Ｘａａ₄ ₀ ’に相当するアミノ酸はＣである請求の範囲第１項記載のポリペプチド。５．からなる群より選ばれたＲ₁を有し、からなる群より選ばれたＲ₂を有し、からなる群より選ばれたＲ₃を有する請求の範囲第４項記載のポリペプチド。６．Ｒ₁はＡＰＰＩのアミノ酸残基１−１０（ＳＥＱＩＤＮＯ：６）あるいはその保存性アミノ酸置換物を表し；Ｒ₂はＡＰＰＩのアミノ酸残基２０−３３（ＳＥＱＩＤＮＯ：１４）あるいはその保存性アミノ酸置換物を表し；Ｒ₃はＡＰＰＩのアミノ酸残基３５−５８（ＳＥＱＩＤＮＯ：２３）あるいはその保存性アミノ酸置換物を表す請求の範囲第５項記載のポリペプチド。７．Ｘａａ₅は、Ｐ，Ｄ，およびＥからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄は、Ｇ；Ｘａａ₃は、Ｈ，Ｐ，Ｒ，およびＬからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂はＣ；Ｘａａ₁はＲ；Ｘａａ₁’は、ＡおよびＧからなる群から選ばれ；Ｘａａ₂’は、Ａ，Ｌ，Ｎ，およびＷからなる群から選ばれ；Ｘａａ₃’は、ＨおよびＩからなる群から選ばれ；Ｘａａ₄’は、Ｐ，Ｙ，ＬおよびＷからなる群から選ばれ；およびＸａａ₁₉’は、Ｖ，Ｙ，Ｗ，およびＳから選ばれた請求の範囲第６項記載のポリペプチド。８．配列Ｘａａ₅−Ｘａａ₄−Ｘａａ₃−Ｘａａ₂−Ｘａａ₁−Ｘａａ₁’−Ｘａａ₂ ’−Ｘａａ₃’−Ｘａａ₄’がＤＧＨＣＲＡＡＨＰ（ＳＥＱＩＤＮＯ：７２）で、かつＸａａ₁₉’が、Ｖ，Ｗ，およびＹから選ばれた請求の範囲第７項記載のポリペプチド。９．請求の範囲第１項記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ。１０．ＤＮＡと作用的にリンクした発現制御配列をさらに含有する請求の範囲第９項記載のＤＮＡ。１１．請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。１２．請求の範囲第１１項記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。１３．ポリペプチドの発現に適した条件下で、請求の範囲第１２項記載の宿主細胞を培養することを含む、宿主細胞内でセリンプロテアーゼ阻害剤をコードするＤＮＡ分子を発現させる方法。１４．薬理的に許容される賦形剤と、請求の範囲第１項記載のポリペプチドを含む薬理組成物。１５．薬理的に有効な量の、請求の範囲第１４記載の組成物を、ほ乳類へ投与することを含む、プラスマカリクレインの阻害が示されるほ乳類の治療方法。