ES2351693T3

ES2351693T3 - Fagos que presentan epítopes mejorados.

Info

Publication number: ES2351693T3
Application number: ES04006079T
Authority: ES
Inventors: William Markland; Robert Charles Ladner; Bruce Lindsay Roberts; Arthur Charles Ley
Original assignee: Dyax Corp
Current assignee: Dyax Corp
Priority date: 1991-03-01
Filing date: 1992-02-28
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2012-02-28
Also published as: DK0573611T3; JP3447731B2; JP4146512B2; DE69233795D1; ES2219638T3; AU1578792A; CA2105303A1; ATE439435T1; EP0573611B9; JPH07501923A; WO1992015677A1; JPH07501203A; DE69233325T2; EP1279731A1; US20090234101A1; DE69233697T2; EP1820858A1; EP0575485A1; ATE363532T1; EP0573611A1

Abstract

Un método para identificar proteínas de fijación que se fijan a una diana, comprendiendo el método los pasos de (a) proporcionar una biblioteca de fagos filamentosos, en donde (i) cada fago en la biblioteca presenta en su superficie al menos una copia de una proteína quimérica de la cubierta codificada por un primer gen de fago, en donde la proteína quimérica de la cubierta comprende un dominio de fijación potencial que es un mutante de un dominio proteínico conocido extraño a dicho fago, y en donde dicho fago comprende adicionalmente un segundo gen de fago que codifica la proteína nativa de la cubierta del fago; (ii) cada fago en la biblioteca comprende al menos una copia de una proteína quimérica de la cubierta codificada por un primer gen de fago, en donde la proteína quimérica de la cubierta se presenta en la superficie del fago, en donde la proteína quimérica de la cubierta comprende un dominio de fijación potencial que es un mutante de un dominio proteínico conocido extraño a dicho fago, en donde cada fago comprende un segundo gen de fago que comprende un codón de leucina como codón de iniciación y que codifica la proteína nativa de la cubierta del fago; o (iii) cada fago en la biblioteca presenta en su superficie al menos una copia de una proteína quimérica de la cubierta codificada por un primer gen de fago, en donde la proteína quimérica de la cubierta comprende un dominio de fijación potencial que es un mutante de un dominio proteínico conocido extraño a dicho fago, y en donde la proteína quimérica de la cubierta comprende un fragmento susceptible de ensamblamiento de una proteína de la cubierta de dicho fago sin la porción de pelos de la proteína de la cubierta; (b) poner en contacto dicha biblioteca de fagos filamentosos con la diana; y (c) separar los fagos sobre la base de su afinidad para la diana.

Description

Fagos que presentan epítopes mejorados.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere a la expresión y presentación de bibliotecas de epítopes o dominios proteínicos de fijación potencial en la superficie de fagos filamentosos, y al cribado de dichas bibliotecas para identificar epítopes de proteínas de fijación, respectivamente.

Exposición de la descripción

La secuencia de aminoácidos de una proteína determina su estructura tridimensional (3D), que determina a su vez la función de la proteína. Algunos residuos en la cadena polipeptídica son más importantes que otros en la determinación de la estructura 3D de una proteína. Las sustituciones de aminoácidos que están expuestos a disolventes tienen menos probabilidad de afectar a la estructura 3D que las sustituciones en loci internos.

La "ingeniería de proteínas" es la técnica de manipular la secuencia de una proteína a fin de alterar sus características de fijación. Los factores que afectan a la fijación de las proteínas son conocidos, pero el diseño de nuevas superficies complementarias ha resultado difícil.

Con el desarrollo de las técnicas de DNA recombinante, se ha hecho posible obtener una proteína mutante por mutación del gen que codifica la proteína nativa y expresión posterior del gen mutado. Se conocen varias estrategias de mutagénesis. Una de ellas, la "cirugía de proteínas", implica la introducción de una o más mutaciones predeterminadas en el gen de elección. Se expresa un solo polipéptido de secuencia completamente predeterminada, y se evalúan sus características de fijación.

En el otro extremo se halla la mutagénesis aleatoria por medio de mutágenos relativamente inespecíficos tales como radiación y diversos agentes químicos.

Es posible variar aleatoriamente nucleótidos predeterminados utilizando una mezcla de bases en los ciclos apropiados de un procedimiento de síntesis de ácido nucleico. La proporción de bases en la mezcla, para cada posición de un codón, determinará la frecuencia con la que se encontrará cada aminoácido en los polipéptidos expresados a partir de la población de DNA degenerada. Oliphant et al., (OLIP86) y Oliphant y Struhl (OLIP87) han demostrado la ligación y clonación de oligonucleótidos fuertemente degenerados, que se utilizaron en la mutación de promotores. Dichos autores sugirieron que podrían utilizarse métodos similares en la variación de regiones codificantes de proteínas. Sin embargo los mismos no explican cómo sería posible:

a) elegir los residuos de proteína a variar, o b) seleccionar o cribar mutantes con propiedades deseables. Reidhaar-Olson y Sauer (REID88a) han utilizado oligonucleótidos sintéticos degenerados para variar simultáneamente dos o tres residuos de la totalidad de los 20 aminoácidos. Véase también Vershon et al., (VERS86a; VERS86b). Reidhaar-Olson y Sauer no describen los límites acerca de cuántos residuos podrían modificarse de una vez ni mencionan el problema de la abundancia desigual del DNA codificante de aminoácidos diferentes.

Varios investigadores han dirigido epítopes antigénicos extraños no mutados a la superficie de un fago, fusionado a una proteína nativa de la superficie del fago, y demostrado que los epítopes eran reconocidos por anticuerpos.

Dulbecco (DULB86) sugiere un procedimiento para incorporación de un epítope antigénico extraño en una proteína de la superficie viral de tal modo que la proteína quimérica expresada se presenta en la superficie del virus de una manera tal que el epítope extraño es accesible a un anticuerpo. En 1985 Smith (SMIT85) comunicó la inserción de un segmento no funcional del gen de la endonucleasa EcoRI en el gen III del bacteriófago f1, "en fase". La proteína del gen III es una proteína menor de la cubierta necesaria para la infectividad. Smith demostró que los fagos recombinantes eran adsorbidos por un anticuerpo inmovilizado producido contra la endonucleasa EcoRI, y podían ser eluidos con ácido. De la Cruz et al., (DELA88) han expresado un fragmento de la región de repetición de la proteína del circumsporozoíto de Plasmodium falciparum en la superficie de M13 como una inserción en la proteína del gen III. Dichos investigadores demostraron que los fagos recombinantes eran a la vez antigénicos e inmunógenos en los conejos, y que dicho fago recombinante podía utilizarse para mapeado del epítope B. Los investigadores sugieren que un fago recombinante similar podría utilizarse para mapeado del epítope T y para el desarrollo de
vacunas.

McCafferty et al. (MCCA90) expresaron una fusión de un fragmento Fv de un anticuerpo al terminal N de la proteína pIII. El fragmento Fv no estaba mutado.

Ladner, Glick y Bird, WO 88/06630 (publicado el 7 de septiembre de 1988 y que tiene prioridad respecto a la solicitud US 07/021046, asignada a Genex Corp.) (LGB) especulan que diversos dominios de anticuerpos monocatenarios (SCAD) pueden cribarse respecto a fijación a un antígeno particular por variación del DNA codificante de las regiones determinantes de la combinación de un anticuerpo monocatenario, subclonación del gen SCAD en el gen gpV del fago lambda de tal modo que se presenta una quimera SCAD/gpV en la superficie exterior del fago lambda, y selección de los fagos que se fijan al antígeno por cromatografía de afinidad.

Parmley y Smith (PARM88) sugirieron que una biblioteca de epítopes que exhibe todos los hexapéptidos posibles podría construirse y utilizarse para aislar epítopes que se fijan a anticuerpos. En la exposición de la biblioteca de epítopes, los autores no sugerían que era deseable equilibrar la representación de aminoácidos diferentes. Tampoco proponían que la inserción debería codificar un dominio completo de la proteína exógena. Se considera que los epítopes son péptidos no estructurados en oposición a las proteínas estructuradas. Scott y Smith (SCOT90) y Cwirla et al. (CWIR90) prepararon "bibliotecas de epítopes" en las cuales epítopes hexapeptídicos potenciales para un anticuerpo diana eran mutados aleatoriamente por fusión de oligonucleótidos degenerados, codificación de los epítopes, con el gen III del fago fd, y expresión del gen fusionado en células infectadas con fago. Las células fabricaban fago de fusión que presentaba los epítopes en su superficie; los fagos que se fijaban al anticuerpo inmovilizado eran eluidos con ácido y estudiados. Devlin et al. (DEVL90) cribaron análogamente, utilizando el fago M13, respecto a 15 epítopes aleatorios de residuos reconocidos por estreptavidina.

Las bibliotecas de Scott y Smith, Cwirla et al, y Devlin et al., proporcionaban un muestreo fuertemente sesgado de los aminoácidos posibles en cada posición. Su preocupación fundamental en el diseño del oligonucleótido degenerado que codificaba su reacción variable era asegurarse de que la totalidad de los 20 aminoácidos eran codificables en cada posición; una consideración secundaria era la minimización de la frecuencia de aparición de señales de parada. Como consecuencia, Scott y Smith y Cwirla et al emplearon NNK (N = mezcla igual de G, A, T, C; K = mezcla igual de G y T) en tanto que Devlin et al utilizaron NNS (S = mezcla igual de G y C). No se hizo intento alguno de minimizar la relación de frecuencias del aminoácido más favorecido al menos favorecido, o igualar la tasa de aparición de aminoácidos ácidos y básicos.

Devlin et al caracterizaron varios péptidos de fijación de estreptavidina seleccionados por afinidad, pero no midieron las constantes de afinidad para estos péptidos. Cwirla et al sí determinaron la constante de afinidad para sus péptidos, pero quedaron decepcionados al encontrar que sus mejores hexapéptidos óptimos tenían afinidades (350-300 nM), "órdenes de magnitud" más débiles que el del epítope nativo Met-Encefalina (7 nM) reconocido por el anticuerpo diana. Cwirla et al especulaban que los péptidos portadores de fago con afinidades mayores se mantenían fijados en condiciones de elución ácida, debido posiblemente a interacciones multivalentes entre el fago (que llevaba aproximadamente 4 copias de pIII) y la diana divalente IgG. Scott y Smith pudieron descubrir péptidos cuya afinidad para el anticuerpo diana (A2) era comparable a la del epítope de referencia miohemeritrina (50 nM). Sin embargo, Scott y Smith expresaron también su preocupación en el sentido de que se perdían algunos péptidos de afinidad alta, posiblemente por fijación irreversible del fago de fusión a la diana.

Ladner, et al, WO 90/02809, describen un proceso para la generación e identificación de nuevas proteínas de fijación que tienen afinidad para una diana predeterminada. En este proceso, un gen que codifica un dominio de fijación potencial (distinto de un péptido meramente epitópico), gen que se obtiene por mutagénesis aleatoria de un número limitado de codones predeterminados, se fusiona a un elemento genético que hace que el producto de expresión quimérica resultante se presente en la superficie exterior de un virus (especialmente un fago filamentoso) a una célula. Se utiliza luego selección cromatográfica para identificar virus o células cuyo genoma incluye un gen fusionado de esta clase que codificaba la proteína que se fijaba a la diana cromatográfica. Ladner, et al, exponen varios métodos de recuperación del gen de interés cuando los virus o células están fijados tan fuertemente a la diana que no pueden eliminarse por lavado en forma viable. Éstos se dejan crecer luego in situ en la matriz cromatográfica, fragmentando la matriz y utilizando la misma como inoculante en una vasija de cultivo, degradando el enlace entre la matriz y el material diana, y degradando los virus o células pero recuperando luego su DNA. Sin embargo, estos métodos recuperarán también virus o células que están fijados de modo inespecífico al material diana.

WO 90/02809 abordaba también estrategias para mutagénesis, con inclusión de una que proporciona la totalidad de los 20 aminoácidos en proporciones sustancialmente iguales, pero únicamente en el contexto de mutagénesis de dominios proteínicos, no de péptidos epitópicos.

Sumario de la invención

La presente invención tiene por objeto resolver las deficiencias arriba expuestas. La presente invención se refiere a métodos como se definen en las reivindicaciones. En una realización, se utiliza una biblioteca de "fago de presentación" para identificar dominios de fijación con alta afinidad para una diana predeterminada. Los dominios de fijación potenciales se presentan en la superficie del fago. Esto se consigue por expresión de un gen fusionado que codifica una proteína quimérica de la superficie exterior que comprende el dominio de fijación potencial y al menos una porción funcional de una proteína de la cubierta nativa del fago. La realización preferida utiliza un patrón de mutagénesis semialeatoria, denominado "diversificación", que enfoca las mutaciones en aquellos residuos de un dominio de fijación parental que tienen mayor probabilidad de afectar a sus propiedades de fijación y tienen probabilidad mínima de destruir su estructura subyacente. Como resultado, si bien cualquier fago presenta sólo un dominio de fijación extraño individual (aunque posiblemente en copias múltiples) la biblioteca de fagos presenta colectivamente millares, incluso millones, de dominios de fijación diferentes. La biblioteca de fagos se somete a cribado por técnicas de separación por afinidad a fin de identificar aquellos fagos que contienen dominios de fijación exitosos (afinidad alta), y estos fagos se recuperan y caracterizan a fin de determinar la secuencia de los dominios de fijación exitosos. Estos dominios de fijación exitosos pueden servir luego como los dominios de fijación parental para otra tanda de diversificación por separación y afinidad.

En otra realización de la invención, el fago de presentación exhibe en su superficie una proteína quimérica de la superficie exterior que comprende una porción funcional de una proteína nativa de la superficie exterior y un epítope potencial. En una biblioteca de epítopes constituida por estos fagos de presentación, la región correspondiente al epítope extraño es hipervariable. La biblioteca se somete a cribado con un anticuerpo u otra proteína de fijación de interés y se identifican los epítopes de afinidad alta. Las referencias a presentación, mutagénesis y cribado de dominios de fijación potenciales serían aplicables, mutatis mutandis, a la presentación, mutagénesis y cribado de epítopes potenciales, a no ser que se indique otra cosa.

Como se ha mencionado previamente, cuando se presentan en un solo fago varias copias de la proteína quimérica de la cubierta, existe un riesgo de que se produzca fijación irreversible, especialmente si la diana es multivalente (como sucede en el caso del anticuerpo). En este caso, los fagos eluidos en último lugar por un gradiente de elución no serán los únicos que lleven los epítopes o dominios de fijación de afinidad máxima, sino que más bien serán aquéllos que tengan una afinidad suficientemente alta para mantenerse en la diana en las condiciones de elución iniciales, pero no tan alta como para fijarse irreversiblemente. Como resultado, la metodología conocida en la técnica puede fallar en cuanto a la recuperación de epítopes o elementos de fijación de afinidad muy alta, que para muchos propósitos son las especies más deseables.

Los autores de la presente invención se proponen hacer frente al problema de la fijación irreversible por incorporación de una secuencia enlazadora en la proteína quimérica de la cubierta, entre el epítope o dominio de fijación extraño, y la secuencia nativa para la proteína de la cubierta de fago de tipo salvaje, que puede ser escindida por una proteasa específica del sitio. En este caso, la biblioteca de fagos se incuba con la diana inmovilizada. Los fagos de menor afinidad son eluidos de la diana y únicamente se retiene la fase sólida (que lleva el fago de afinidad alta). La secuencia enlazadora mencionada anteriormente se escinde, y se liberan las partículas de fago, dejando atrás el epítope o dominio de fijación fijado atrás. Es posible recuperar luego las partículas (y secuenciar su DNA para determinar la secuencia del epítope correspondiente o dominio de fijación) o el péptido fijado (y secuenciar directamente sus aminoácidos). Se prefiere el primer método de recuperación, dado que el DNA codificante puede amplificarse in vitro utilizando PCR o in vivo por transfección de células hospedadoras adecuadas con el fago de presentación de afinidad alta. Si bien la producción de proteínas de fusión con enlazadores escindibles se conoce en la técnica, el uso de tales enlazadores para facilitar la escisión controlada de una proteína quimérica de la cubierta de un fago no ha sido consignado
previamente.

Otro método de abordar la fijación irreversible es apropiado cuando los dominios de fijación son "mini-proteínas", es decir, péptidos relativamente pequeños cuya estabilidad estructural es atribuible fundamentalmente a la presencia de una o más reticulaciones covalentes, v.g., puentes disulfuro. Como en el ejemplo anterior, los fagos de afinidad baja se separan en primer lugar. Los fagos fijados restantes, de afinidad alta, se tratan luego con un reactivo que destruye la reticulación, tal como ditiotreitol en el caso de un dominio con enlaces disulfuro, pero no escinde los enlaces peptídicos o modifica las cadenas laterales de los aminoácidos que no están reticulados. Esto dará como resultado usualmente una desnaturalización suficiente para liberar el fago completamente o para permitir su elución por otros
medios.

Estos dos métodos, por supuesto, no son mutuamente excluyentes.

En las bibliotecas de fagos de presentación de epítopes conocidas previamente, el genoma del fago se alteraba por reemplazamiento del gen codificante de la proteína del gen III de M13 de tipo salvaje con uno que codificaba una proteína quimérica de la cubierta. Como resultado, las 5 copias normales de la proteína del gen III de tipo salvaje se reemplazaban todas ellas por la proteína quimérica de la cubierta, con lo cual cada fago tenía 5 sitios de fijación potenciales para la diana, y por consiguiente una avidez potencial muy alta. Con epítopes (o dominios de fijación) de afinidad alta, esto podría contribuir perfectamente a la fijación irreversible.

Un método de la presente invención para reducción de la avidez de un fago de presentación, especialmente fago de presentación de epítopes, por su diana, y por consiguiente de aliviar el problema de la fijación irreversible, consiste en modificar por ingeniería genética el fago de modo que contenga dos genes cada uno de los cuales exprese una proteína de la cubierta, codificando una la proteína de la cubierta de tipo salvaje, y el otro la proteína quimérica de la cubierta cognada. Así, los fagos que llevan epítopes o dominios de fijación idénticos pueden llevar todavía relaciones diferentes de moléculas de proteína de tipo salvaje a moléculas de la cubierta quiméricas, y por consiguiente tener avideces diferentes. La relación media para la biblioteca dependerá de los niveles relativos de expresión de los dos genes cognados.

Puede ser ventajoso poder modular la relación de la proteína quimérica de la cubierta a su proteína de la cubierta cognada de tipo salvaje. Por ejemplo, al principio del proceso evolutivo, la afinidad de los dominios de fijación por su diana puede ser bastante baja, especialmente si aquéllos están basados en un dominio de fijación parental que no tiene afinidad alguna para la diana.

La modulación puede conseguirse poniendo el gen quimérico bajo el control de un promotor regulable.

Si bien puede ser posible poner el gen de tipo salvaje cognado bajo el control de un segundo promotor, regulado de modo diferente, esto puede ser inviable si, como ocurre en el gen III de M13, el gen forma parte de un operón policistrónico. En este caso, la expresión del gen de tipo salvaje puede reducirse reemplazando su codón de inicio metionina con un codón de inicio leucina.

El gen III de M13, como se ha indicado previamente, codifica una de las proteínas menores de la cubierta de este fago filamentoso (5 copias por fago). Teniendo en cuenta las dificultades con la fijación irreversible consignadas por aquéllos que modifican este gen a fin de que se presente un epítope extraño en la cubierta del fago, el uso de la proteína principal de la cubierta de M13 se desincentivaba claramente. No obstante, los autores de la presente invención han encontrado que las proteínas quiméricas principales de la cubierta son de hecho útiles para presentación de dominios de fijación potenciales para propósitos de cribado aun cuando (de hecho, a veces gracias a que) las mismas se encuentran en un número superior a 1000 copias de esta proteína por fago. Se cree que la proteína principal de la cubierta (VIII) podría ser análogamente útil en la construcción de una biblioteca de fagos de epítopes.

Los autores de la presente invención han desarrollado también un enlazador adecuado para la unión de dominios de fijación potenciales (o péptidos epitópicos) para esta proteína principal de la cubierta, y quizás también para otras proteínas.

Por último, en la proporción en que algunos de los problemas experimentados con las bibliotecas de epítopes se han atribuido al uso de patrones de mutagénesis que conducen a asignaciones fuertemente sesgadas de aminoácidos, la presente invención está dirigida también a una diversidad de patrones mejorados que conducen a bibliotecas de fagos de epítopes menos sesgadas y por consiguiente más eficientes.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra de qué modo puede utilizarse un fago como fago genético. En (a) se encuentra una proteína de tipo salvaje de la pre-cubierta alojada en la bicapa lipídica. El péptido señal se encuentra en el espacio periplásmico. En (b) ha quedado atrapado a análogamente una proteína quimérica de la pre-cubierta, con un dominio de fijación potencial interpuesto entre el péptido señal y la secuencia de la proteína madura de la cubierta. En (c) y (d), el péptido señal se ha escindido de las proteínas de tipo salvaje y quimérica, respectivamente, pero ciertos residuos de la secuencia de la proteína de la cubierta interaccionan con la bicapa lipídica para evitar que la proteína madura pase totalmente al periplasma. En (e) y (f), la proteína madura de tipo salvaje y la proteína quimérica se ensamblan en la cubierta de un fago de DNA monocatenario a medida que emerge el mismo en el espacio periplásmico. El fago pasará a través de la membrana exterior al medio, donde el mismo puede recuperarse y evaluarse cromatográficamente.

La Figura 2 muestra los C_{\alpha}s de la proteína de la cubierta del fago f1.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas I. Estrategia de presentación A. Consideraciones Generales

La presente invención contempla que un dominio de fijación potencial (pbd) o un epítope potencial se presentará en la superficie de un fago en la forma de una fusión con una proteína (de la superficie externa) (OSP) de la cubierta del fago. Esta proteína quimérica de la superficie externa es el producto procesado del polipéptido expresado por un gen de presentación injertado en el genoma del fago; por consiguiente: 1) el genoma del fago tiene que permitir la introducción del gen de presentación por tolerancia de material genético adicional o por disponer de material genético reemplazable; 2) el virión tiene que ser capaz de empaquetar el genoma después de aceptar la inserción o sustitución del material genético, y 3) la presentación de la proteína OSP-IPBD en la superficie del fago no debe destruir suficientemente la estructura del virión para interferir con la propagación del fago.

Cuando la partícula viral se ensambla, las proteínas de su cubierta pueden fijarse por sí mismas al fago: a) desde el citoplasma, b) desde el periplasma, o c) desde el interior de la bicapa lipídica. El producto de expresión inmediato del gen de presentación tiene que exhibir, en su terminal amino, un péptido señal funcional de secreción, tal como la señal phoA (MKQSTIALALLPLLFTPVTKA), si la proteína de la cubierta se fija al fago desde el periplasma o desde el interior de la bicapa lipídica. Si es necesaria una señal de secreción para la presentación del dominio de fijación potencial, en una realización especialmente preferida, la célula bacteriana en la cual se expresa el gen híbrido es de una cepa "que permite la secreción".

La secuencia de DNA que codifica el epítope o dominio de fijación extraño debería preceder a la secuencia codificante de la proteína de la cubierta apropiada si el terminal amino de la proteína de la cubierta procesada es normalmente su extremo libre, y debería seguir a aquélla si el terminal carboxi es el extremo libre normal.

El camino morfogenético del fago determina el ambiente en el cual el IPBD tendrá oportunidad de plegarse. Se prefieren fagos ensamblados periplásmicamente cuando los IPBDs contienen disulfuros esenciales, dado que tales IPBDs no pueden plegarse en el interior de una célula (estas proteínas pueden plegarse después que el fago se libera de la célula). Se prefieren fagos ensamblados intracelularmente cuando el IPBD necesita grupos prostéticos grandes o insolubles (tales como agrupaciones Fe_{4}S_{4}), dado que el IPBD no puede plegarse si se secreta debido a que falta el grupo prostético.

Cuando se introduce diversificación, infecciones múltiples podrían generar GPs híbridas que llevan el gen para una PBD, pero teniendo al menos algunas copias de un PBD diferente en sus superficies; es preferiblemente minimizar esta posibilidad por infección de las células con fago en condiciones que den como resultado una multiplicidad de infección (MOI) baja.

Para un bacteriófago dado, la OSP preferida es usualmente una que está presente en la superficie del fago en el número máximo de copias, dado que esto permite la flexibilidad máxima en la variación de la relación de OSP-IPBD a la OSP de tipo salvaje y proporciona también la máxima probabilidad de obtención de una separación satisfactoria por afinidad. Además, una proteína presente en una sola copia o un pequeño número de copias realiza usualmente una función esencial en la morfogénesis o la infección; la mutación de una proteína de esta clase por adición o inserción es probable que dé como resultado una reducción de la viabilidad de la GP. Sin embargo, una OSP tal como la proteína gIII de M13 puede ser una elección excelente como OSP para causar la presentación del PBD.

Se prefiere que el gen osp de tipo salvaje se preserve. El fragmento del gen ipbd puede insertarse en una segunda copia del gen osp receptor o en un gen osp de nueva producción por ingeniería genética. Se prefiere que el gen osp-ipbd se halle bajo control de un promotor regulado. El proceso de la presente invención fuerza la evolución de los PBDs derivados de IPBD de tal modo que algunos de ellos desarrollan una nueva función, a saber, fijación a una diana seleccionada. La situación del gen que se somete a evolución sobre un gen duplicado es una imitación del escenario generalmente aceptado para la evolución de familias de proteínas. Está actualmente aceptado en general que la duplicación de genes es el primer paso en la evolución de una familia de proteínas a partir de una proteína ancestral. Por contar con dos copias de un gen, el proceso fisiológico afectado puede tolerar mutaciones en uno de los genes. Este proceso está perfectamente entendido y documentado para la familia de las globinas (véase DICK83, p65ff, y CREI84, p117-125).

El usuario debe seleccionar un sitio en el gen OSP candidato para insertar un fragmento de gen ipbd. Las cubiertas de la mayoría de los bacteriófagos están altamente ordenadas. El fago filamentoso puede describirse por una red helicoidal; el fago isométrico, por una red icosaédrica. Cada monómero de cada proteína principal de la cubierta está situado en un punto de la red y ejerce interacciones definidas con cada uno de sus vecinos. Las proteínas que están ajustadas en la red por realizar algunos de los contactos normales de la red, pero no todos, tienen probabilidad de desestabilizar el virión de las maneras siguientes: a) abortando la formación del virión, b) haciendo inestable el virión, o c) dejando lagunas en el virión de tal modo que el ácido nucleico no esté protegido. Así, en el bacteriófago, es importante retener en las proteínas de fusión OSP-IPBD modificadas por ingeniería genética a aquellos residuos de la OSP parental que interaccionan con otras proteínas en el virión. Para M13 gVIII, es preferible retener la proteína madura entera, mientras que para M13 gIII, podría ser suficiente retener los últimos 100 residuos (o incluso menos). Una proteína gIII truncada de esta clase podaría expresarse en paralelo con la proteína gIII completa, dado que se requiere la proteína gIII para la infectividad del fago.

El gen de presentación se sitúa aguas abajo de un promotor conocido, preferiblemente un promotor regulado tal como lacUV5, tac, o trp.

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B. Fagos Filamentosos

Los fagos filamentosos, que incluyen M13, f1, fd, If1, Ike, Xf, Pf1, y Pf3, presentan interés particular. El ciclo de vida completo del fago filamentoso M13, un vector común de clonación y secuenciación, es perfectamente conocido. La estructura genética (SCHA78) de M13 es bien conocida al igual que la estructura física del virión (BANN81, BOEK80, CHAN79, ITOK79, KAPL78, KUHN85b, KUHN87, MAKO80, MARV78, MESS78, OHKA81, RASC86, RUSS81, SCHA78, SMIT85, WEBS78, y ZIMM82); véase RASC86 para una revisión reciente de la estructura y función de las proteínas del la cubierta.

Marvin y colaboradores (MARV78, MAKO80, BANN81) han determinado una estructura aproximada en 3D del virión del fago estrechamente afín f1 por una combinación de genética, bioquímica, y difracción de rayos X a partir de fibras del virus. La Figura 2 está dibujada conforme al modelo de Banner et al. (BANN81) y muestra únicamente los C_{\alpha}s de la proteína. Los huecos aparentes en la vaina cilíndrica están llenados realmente por grupos laterales de proteína de tal modo que el DNA en su interior está protegido. El término amino de cada monómero proteínico se encuentra en el exterior del cilindro, mientras que el término carboxi se encuentra en un radio menor, próximo al DNA. Aunque otros fagos filamentosos (v.g. Pf1 o Ike) tienen simetría helicoidal diferente, todos ellos tienen cubiertas compuestas de muchos monómeros \alpha-helicoidales cortos con el término amino de cada monómero en la superficie del virión.

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1. Proteína Principal de la Cubierta de M13 (gVIII)

La proteína principal de la cubierta de M13 está codificada por el gen VIII. La cubierta de la proteína madura de 50 aminoácidos del gen VIII se sintetiza como una pre-cubierta de 73 aminoácidos (SCHA78; ITOK79). Los primeros 23 aminoácidos constituyen una secuencia señal típica que hace que el polipéptido naciente se inserte en la membrana celular interna. Si la pre-cubierta se inserta en la membrana por sí misma o debido a la acción de componentes de secreción del hospedador, tales como SecA y SecY, sigue siendo cuestión controvertida, pero no tiene efecto alguno sobre la operación de la presente invención.

Una peptidasa señal de E. coli (SP-I) reconoce los aminoácidos 18, 21, y 23, y, en menor grado, el residuo 22, y corta entre los residuos 23 y 24 de la pre-cubierta (KUHN85a, KUHN85b, OLIV87). Después de la retirada de la secuencia señal, el término amino de la cubierta madura está localizado en el lado periplásmico de la membrana interna; el término carboxi se encuentra en el lado citoplásmico. Aproximadamente 3000 copias de la proteína madura de la cubierta de 50 aminoácidos se asocian al lado una de otra en la membrana interna.

Los autores de la presente invención han construido un gen tripartito que comprende:

1): DNA codificante de una secuencia señal que dirige la secreción de las partes (2) y (3) a través de la membrana interna,

2): DNA codificante de la secuencia BPTI madura, y

3): DNA codificante de la proteína de M13 gVIII madura.

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Este gen es la causa de que BPTI aparezca en forma activa en la superficie del fago M13.

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2. Proteínas Menores de la Cubierta de M13, Generalidades

Un dominio de fijación o epítope introducido puede presentarse también en un fago filamentoso como una porción de una proteína quimérica menor de la cubierta. Éstos están codificados por los genes III, VI, VII y IX, y cada uno de ellos está presente en aproximadamente 5 copias por virión y está relacionado con morfogénesis o infección. En contraste, la proteína principal de la cubierta está presente en más de 2500 copias por virión. Las proteínas III, VI, VIII y IX de los genes están presentes en los extremos del virión.

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3. La Proteína Menor de la Cubierta de M13 gIII

El DNA monocatenario del fago circular está asociado con aproximadamente 5 copias de la proteína del gen III y se extrude luego a través del parche de la proteína de la cubierta asociada a la membrana de tal manera que el DNA está encerrado en una vaina helicoidal de proteína (WEBS78). El DNA no tiene sus bases apareadas (lo que podría imponer restricciones severas en el genoma del virus); en lugar de ello, las bases se intercalan unas con otras independientemente de la secuencia.

Smith (SMIT85) y de la Cruz et al (DELA88) han demostrado que las inserciones en el gen III son causa de que aparezcan nuevos dominios de proteína en la superficie exterior del virión. El gen de la miniproteína puede estar fusionado al gen III en el sitio utilizado por Smith y por de la Cruz et al, en un codón correspondiente a otro límite de dominio o a un bucle de la superficie de la proteína, o al término amino de la proteína madura.

Todos los trabajos publicados utilizan un vector que contiene un solo gen III modificado de fd. Así, la totalidad de las 5 copias de gIII están modificadas idénticamente. El gen III es muy grande (1272 p.b. o aproximadamente 20% del genoma del fago) y es dudoso si un duplicado del gen entero puede estar insertado de manera estable en el fago. Adicionalmente, la totalidad de las 5 copias de la proteína gIII se encuentran en un extremo del virión. Cuando moléculas diana bivalentes (tales como anticuerpos) se fijan a un fago pentavalente, el complejo resultante puede ser irreversible. La fijación irreversible del fago a la diana interfiere fuertemente con el enriquecimiento por afinidad de las GPs que llevan las secuencias genéticas que codifican el nuevo polipéptido que tiene la afinidad máxima para la diana.

Con objeto de reducir la probabilidad de formación de complejos irreversibles, puede utilizarse un segundo gen sintético que codifica únicamente la porción del terminal carboxi de III. Podría, por ejemplo, producirse por ingeniería genética un gen que comprende (desde 5' a 3'):

1): un promotor (preferiblemente regulado),

2): un sitio de fijación de ribosoma,

3): un codón de inicio,

4): una secuencia que codifica un péptido señal funcional que dirige la secreción de las partes (5) y (6) a través de la membrana interna,

5): DNA codificante de un dominio de fijación potencial,

6): DNA codificante de los residuos 275 a 424 de la proteína gIII de M13,

7): un codón de parada de la traducción, y

8): (opcionalmente) una señal de parada de la transcripción.

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Obsérvese que en la proteína gIII, el resto aminoterminal es responsable de la fijación de pelo (a saber, de la infectividad) y el resto carboxiterminal del empaquetamiento, de tal modo que la proteína quimérica gIII arriba descrita es capaz de ensamblarse en la cubierta viral, pero no contribuye a la infectividad.

Abandonamos el gen III de tipo salvaje de tal modo que esté presente algo de proteína del gen III inalterada.

Así pues, el gen híbrido puede comprender DNA codificante de un dominio de fijación potencial enlazado operativamente a una secuencia señal (v.g.; la secuencia señal de los genes bacterianos phoA o bla o la secuencia señal del gen III del fago M13) y a DNA codificante de al menos una porción funcional de una proteína de la cubierta (v.g., las proteínas del gen III o el gen VIII de M13) de un fago filamentoso (v.g., M13). El producto de expresión se transporta a la membrana interna (bicapa lipídica) de la célula hospedadora, con lo cual el péptido señal se escinde para dejar una proteína híbrida procesada. El término C del componente semejante a la proteína de la cubierta de esta proteína híbrida está atrapado en la bicapa lipídica, de tal modo que la proteína híbrida no escapa al espacio periplásmico. (Esto es típico de la proteína de la cubierta de tipo salvaje.) A medida que el DNA monocatenario de la partícula de fago naciente pasa al espacio periplásmico, el mismo recoge a la vez la proteína de la cubierta de tipo salvaje y la proteína híbrida de la bicapa lipídica. La proteína híbrida está por tanto fagocitada en la vaina superficial del fago filamentoso, dejando el dominio de fijación potencial expuesto en su superficie externa.

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4. Proteínas de la Cubierta de Pf3

Construcciones similares podrían hacerse con otros fagos filamentosos. Pf3 es un fago filamentoso bien conocido que infecta las células de Pseudomonas aeruginosa que alojan un plásmido IncP-1. El genoma entero ha sido secuenciado (LUIT85) y las señales genéticas implicadas en la replicación y el ensamblaje se conocen (LUIT87). La proteína principal de la cubierta de PF3 es inusual en el sentido de que no posee péptido señal alguno que dirija su secreción. La secuencia tiene residuos cargados ASP_{7}, ARG_{37}, LYS_{40} y PHE_{44}-COO^{-}, lo cual es coherente con el hecho de que el término amino se encuentre expuesto. Por ello, para hacer que un IPPD aparezca en la superficie de Pf3, los autores de la presente invención han construido un gen tripartito que comprende:

1): una secuencia señal que se sabe causa la secreción en P. aeruginosa (conocida preferiblemente por causar secreción de IPBD) fusionada en marco a,

2): un fragmento del gen que codifica la secuencia IPBD, fusionado en marco a,

3): DNA codificante de la proteína madura de la cubierta de Pf3.

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Opcionalmente, se introduce DNA codificante de un enlazador flexible de 1 a 10 aminoácidos entre el fragmento del gen ipbd y el gen de la proteína de la cubierta de Pf3. Opcionalmente, el DNA que codifica el sitio de reconocimiento para una proteasa específica, tal como el activador del plasminógeno tisular o el factor Xa de la coagulación de la sangre, se introduce entre el fragmento del gen ipbd y el gen de la proteína de la cubierta de Pf3. Los aminoácidos que forman el sitio de reconocimiento para una proteasa específica pueden servir también para la función de un enlazador flexible. Este gen tripartito se introduce en Pf3 de tal modo que no interfiere con la expresión de cualesquiera genes Pf3. Para reducir la posibilidad de recombinación genética, la parte (3) está diseñada de modo que tenga numerosas mutaciones silenciosas con relación al gen de tipo salvaje. Una vez que se ha escindido la secuencia señal, el IPBD se encuentra en el periplasma y la proteína madura de la cubierta actúa como ancla y señal de ensamblaje del fago. Es indiferente que esta proteína de fusión se detenga en la bicapa lipídica por una ruta diferente de la ruta seguida por la proteína de la cubierta de tipo salvaje.

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Construcción del Gen

La secuencia codificante estructural del gen de presentación codifica una proteína quimérica de la cubierta y cualquier señal de secreción requerida. Una "proteína quimérica de la cubierta" es una fusión de una primera secuencia de aminoácidos (que corresponde esencialmente a al menos una porción funcional de una proteína de la cubierta del fago) con una segunda secuencia de aminoácidos, v.g., un dominio extraño a y no sustancialmente homólogo con cualquier dominio de la primera proteína. Una proteína quimérica puede presentar un dominio extraño que se encuentra (si bien en una proteína diferente) en un organismo que expresa también la primera proteína, o puede ser una fusión "interespecífica", "intergenérica", etc. de estructuras proteínicas expresadas por clases de organismos diferentes. El dominio extraño puede aparecer en el terminal amino o el terminal carboxi de la primera secuencia de aminoácidos (con o sin un espaciador intercalado), o puede interrumpir la primera secuencia de aminoácidos. La primera secuencia de aminoácidos puede corresponder exactamente a una proteína de la superficie del fago, o puede estar modificada, v.g., para facilitar la presentación del dominio de fijación.

Un sitio preferido para inserción del gen ipbd en el gen del fago osp es uno en el cual: a) el IPBD está plegada en su forma original, b) los dominios OSP están plegados en sus formas originales, y c) no existe interferencia alguna entre los dos dominios.

Si existe un modelo del fago que indica que el término amino o carboxi de una OSP está expuesto a disolvente, entonces el término expuesto de dicha OSP madura se convierte en el candidato principal para inserción del gen ipbd. Es suficiente un modelo 3D de baja resolución.

En ausencia de una estructura 3D, los términos amino y carboxi de la OSP madura son los candidatos óptimos para inserción del gen ipbd. Una fusión funcional puede requerir residuos adicionales entre los dominios IPBD y OSP para evitar interacciones indeseables entre los dominios. Un DNA de secuencia aleatoria o DNA codificante de una secuencia específica de una proteína homóloga al IPBD o la OSP puede estar insertado entre el fragmento osp y el fragmento ipbd en caso necesario.

La fusión en un límite de dominio dentro de la OSP es también un enfoque adecuado para obtener una fusión funcional. Smith aprovechó un límite de esta clase cuando subclonó de DNA heterólogo en el gen III de f1 (SMIT85).

Los criterios para identificación de dominios OSP adecuados para causar la presentación de un IPBD son algo diferentes de los utilizados para identificar un IPBD. Cuando se identifica una OSP, el tamaño no es tan importante debido que el dominio OSP no aparecerá en la molécula de fijación final ni será necesario sintetizar el gen repetidas veces en cada tanda de diversificación. Los problemas principales de diseño son que: a) la fusión OSP:: IPBD causa la presentación de IPBD, b) la construcción genética inicial sea razonablemente conveniente, y c) el gen osp::ipbd sea genéticamente estable y se manipule fácilmente. Existen varios métodos de identificación de dominios. Los métodos que están basados en las coordenadas atómicas han sido revisados por Janin y Chothia (JANI85). Estos métodos utilizan matrices de distancias entre carbonos_{\alpha} (C_{\alpha}), planos de división (cf. ROSE85), o superficie oculta (RASH84). Chothia y colaboradores han correlacionado el comportamiento de muchas proteínas naturales con la estructura de dominios (de acuerdo con su definición). Rashin predijo correctamente la estabilidad de un dominio que comprendía los residuos 206-316 de la termolisina (VITA84, RASH84).

Muchos investigadores han utilizado proteólisis parcial y análisis de la secuencia de proteínas para aislar e identificar dominios estables. (Véase, por ejemplo, VITA84, POTE83, SCOT87a, y PABO79.) PABO et al., utilizaron calorimetría como indicador de que el represor CI del colifago)\ contiene dos dominios; dichos investigadores utilizaron luego proteólisis parcial para determinar la localización del límite de dominio.

Si la única información estructural disponible es la secuencia de aminoácidos de la OSP candidato, es posible utilizar la secuencia para predecir vueltas y bucles. Hay una gran probabilidad de que algunos de los bucles y vueltas sean predichos correctamente (cf. Chou y Fasman (CHOU74)); estas localizaciones son también candidatos para inserción del fragmento del gen ipbd.

La fusión de uno o más dominios nuevos a una proteína puede hacer que la capacidad de la nueva proteína para ser exportada de la célula sea distinta de la capacidad de la proteína parental. El péptido señal de la proteína de la cubierta de tipo salvaje puede funcionar como polipéptido auténtico, pero ser incapaz de exportación directa de una fusión. Para utilizar el camino dependiente de Sec, puede ser necesario un péptido señal diferente. Así, para expresar y presentar una proteína quimérica del gen VIII de BPTI/M13, los autores de la invención encontraron necesario utilizar un péptido señal heterólogo (el de phoA).

Los fagos que presentan péptidos que tienen afinidad alta para la diana pueden ser muy difíciles de eluir de la diana, en particular una diana multivalente. Es posible introducir un sitio de escisión para una proteasa específica, tal como el Factor Xa de coagulación de la sangre, en la proteína de fusión de tal modo que el dominio de fijación pueda ser escindido del paquete genético. Dicha escisión tiene la ventaja de que todos los fagos resultantes tienen proteínas idénticas de la cubierta y por consiguiente son igualmente infectivos, aun cuando los fagos presentadores del polipéptido pueden ser eluidos de la matriz de afinidad sin escisión. Este paso permite la recuperación de genes valiosos que podrían perderse en caso contrario. De acuerdo con el conocimiento de los autores de la presente invención, nadie ha descrito o sugerido la utilización de una proteasa específica como medio para recuperar un paquete genético que contenga información o convertir una población de fagos que varíe en infectividad en fagos que tengan infectividad idéntica.

Existen cierto número de proteasas muy específicas. Si bien la invención no reside en la elección de ninguna proteasa particular, la proteasa es con preferencia suficientemente específica de tal modo que en las condiciones de escisión, la misma escindirá el enlazador pero no ningún otro polipéptido esencial para la viabilidad del fago, o (excepto en casos raros) el dominio de fijación potencial de epítope. Es posible que la elección de condiciones de escisión particulares, v.g., temperatura baja, pueda hacer factible la utilización de una proteasa que en caso contrario sería inadecuada.

Los sistemas de coagulación de la sangre y de complementación contienen cierto número de proteasas muy específicas. Usualmente, las enzimas en las etapas iniciales de una cascada son más específicas que las últimas. Por ejemplo, el Factor X, (F.X_{a}) es más específico que lo es la trombina (CP. Tabla 10-2 de COLM87). El F.X_{a} bovino escinde después de la secuencia Ile-Glu-Gly-Arg, mientras que F.X_{a} humano escinde después de Ile-Asp-Gly-Arg. En caso deseado, puede utilizarse cualquier par proteasa-enlazador. Si se utiliza trombina, los enlazadores sensibles a trombina más preferidos son los encontrados en fibrinógeno, Factor XIII y protrombina. Preferiblemente, se tomaría la secuencia enlazadora de la especie de la que se obtiene la trombina; por ejemplo, si va a utilizarse trombina de bovino, entonces se utilizará un enlazador tomado de fibrinógeno de bovino o F.XIII de bovino.

El Factor XI_{a} humano escinde el Factor IX humano en dos sitios (COLM87, p.42):

Q T S K L T R_{145}/ A E A V F y

S F N D F T R_{180}/ V V G G E.

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Así pues, podría incorporarse cualquiera de estas secuencias (especialmente las porciones subrayadas) como enlazador entre el PBD y el dominio de anclaje de superficie GP (GPSAD) y utilizar F.XI_{a} humano para escindirlos.

La calicreína humana corta el F.XII humano en R_{353} (COLM87, p. 258):

L F S S M T R_{353}/ V V G G L V.

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Esta secuencia tiene una similitud significativa con los sitios hF.XI_{a} anteriores. Sería posible incorporar la secuencia SSMTRVVG como enlazador entre PBD y GPSAD, y escindir PBD de la GP con calicreína humana.

El F.XII_{a} humano corta F.XI humano en R_{369} (COLM87, p. 256):

K I K P R_{369}/ I V G G T.

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Podría incorporarse KIKPRIVG como enlazador entre PBD y GPSAD. PBD podría escindirse luego de GP con hF.XII_{a}.

Otras proteasas que se han utilizado para escindir proteínas de fusión incluyen enteroquinasa, colagenasa, quimosina, uroquinasa, renina, y ciertas peptidasas señal. Véase Rutter, US 4769326.

Cuando se busca un inhibidor de proteasa, la proteasa diana y otras proteasas que tienen especificidad de sustrato similar no se prefieren para escindir el PBD de la GP. Se prefiere que un enlazador que se asemeja al sustrato de la proteasa diana no se incorpore en ningún sitio en el fago de presentación debido a que esto podría hacer innecesariamente más difícil la separación de ligantes excelentes del resto de la población.

Si existe impedimento estérico de la escisión del enlazador especifica del sitio, el enlazador puede modificarse de tal manera que el sitio de escisión se vea más expuesto, v.g., por interposición de glicinas (para flexibilidad adicional) o prolinas (para elongación máxima) entre el sitio de escisión y la mayor parte de la proteína GUAN91 mejoró la escisión de trombina de una proteína de fusión GST por introducción de un enlazador rico en glicina (PGISGGGGG) inmediatamente detrás del sitio de escisión de trombina (LVPRGS). Un enlazador adecuado puede identificarse también por diversificación y selección.

Las secuencias de partes reguladoras del gen se toman de las secuencias de elementos reguladores naturales: a) promotores, b) secuencias Shine-Dalgarno, y c) terminadores de la transcripción. Los elementos reguladores podrían diseñarse también a partir del conocimiento de secuencias de consenso de regiones reguladoras naturales. Las secuencias de estos elementos reguladores están conectadas a las regiones codificantes; se insertan también sitios de restricción en o adyacentes a las regiones reguladoras para transmitir una manipulación conveniente.

La función esencial de la separación por afinidad es separar las GPs que llevan PBDs (derivados de IPBD) que tienen afinidad alta para la diana de las GPs que llevan PBDs que tienen afinidad baja para la diana. Si el volumen de elución de un fago depende del número de PBDs en la superficie del fago, entonces un fago que contenga muchos PBDs con afinidad baja, GP(PBD_{w}), podría co-eluirse con un fago que contenga menos PBDs con afinidad alta, GP (PBD_{s}). La regulación del gen de presentación es preferiblemente tal que la mayor parte de los fagos presenten suficiente PBD para efectuar una separación satisfactoria de acuerdo con afinidad. El uso de un promotor regulable para controlar el nivel de expresión del gen de presentación permite un ajuste fino del comportamiento cromatográfico de la población diversificada.

La inducción de la síntesis de genes modificados por ingeniería genética en células vegetativas bacterianas ha sido realizada por el uso de promotores regulados tales como lacUV5, trpP, o tac (MANI82). Los factores que regulan la cantidad de proteína sintetizada son suficientemente bien conocidos de tal modo que pueden producirse ahora una gran variedad de proteínas heterólogas en E. coli, B. subtilis y otras células hospedadoras en cantidades al menos en cantidades moderadas (SKER88, BETT88). Preferiblemente, el promotor para el gen de presentación está sujeto a regulación por un inductor químico pequeño. Por ejemplo, el promotor lac y el promotor híbrido trp-lac (tac) son regulables con isopropil-tiogalactosido (IPTG). El promotor para el gen construido no precisa proceder de un gen osp natural; puede utilizarse cualquier promotor regulable funcional en bacterias. Se prefiere un promotor que no fugue.

Las porciones codificantes de los genes a sintetizar se diseñan al nivel de proteína y se codifican luego en DNA. Si bien la consideración primaria en el diseño de las secuencias de DNA es la obtención de la población diversa de dominios de fijación potenciales (o epítopes) deseada, se presta también consideración a proporcionar sitios de restricción que faciliten la manipulación ulterior de los genes, minimización del potencial para recombinación y mutación espontánea, y consecución de una traducción eficiente en las células hospedadoras seleccionadas.

La presente invención no está limitada a ningún método particular de síntesis o construcción de DNA. Pueden utilizarse sintetizadores de DNA convencionales, con modificaciones apropiadas de reactivos para la producción de DNA diversificado (similares a los utilizados actualmente para la producción de sondas mixtas).

Los fagos se modifican por ingeniería genética y se transfectan luego a las células hospedadoras, v.g. E. coli, B. subtilis, o P. aeruginosa, adecuadas para amplificación. La presente invención no está limitada a ningún método de transformación de células con DNA o a ninguna célula hospedadora particular.

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El dominio potencial de fijación inicial (IPBD)

En virtud de la presente invención, pueden obtenerse proteínas que se pueden fijar específicamente a dianas distintas de los sitios de combinación de antígeno de los anticuerpos. Para los propósitos de las reivindicaciones adjuntas, una proteína P es una proteína de fijación si para cualquier diana distinta del dominio variable de un anticuerpo, la constante de disociación K_{D} (P, A) es < 10^{-6} moles/litro (preferiblemente, < 10^{-7} moles/litro). La exclusión del "dominio variable de un anticuerpo" tiene por objeto dejar claro que para los propósitos de esta invención, una proteína no debe considerarse como una "proteína de fijación" meramente porque la misma sea antigénica. No obstante, un antígeno puede calificarse sin embargo como una proteína de fijación porque el mismo se fije específicamente a una sustancia distinta de un anticuerpo, v.g., una enzima a su sustrato, o una hormona a su receptor celular. Adicionalmente, debería señalarse que la expresión "proteína de fijación" puede incluir una proteína que se fija específicamente al Fc de un anticuerpo, v.g., la proteína estafilocócica A.

Si bien la presente invención puede utilizarse para desarrollar nuevos anticuerpos por diversificación de codones correspondientes a la región hipervariable del dominio variable de un anticuerpo, su utilidad primaria reside en el desarrollo de proteínas de fijación que no son anticuerpos o incluso dominios variables de anticuerpos. Pueden obtenerse nuevos anticuerpos por técnicas inmunológicas; en cambio, no se pueden obtener nuevas enzimas, hormonas, etc.

La mayor parte de las proteínas de gran tamaño se pliegan en glóbulos distinguibles denominados dominios. La estrategia de presentación se perfecciona primeramente por modificación de un fago genético de modo que presente un dominio estructurado estable (el "dominio de fijación potencial inicial", IPBD) para el cual puede obtenerse una molécula de afinidad (que puede ser un anticuerpo). El éxito de las modificaciones se mide fácilmente mediante, v.g., determinación de si el fago genético modificado se fija a la molécula de afinidad. Para el propósito de identificación de IPBDs, las definiciones de "dominio" que acentúan la estabilidad -retención de la estructura global frente a fuerzas perturbadoras tales como temperaturas elevadas o agentes caotrópicos- se ven favorecidas, aunque no se ignoran por completo las coordenadas atómicas y la homología de secuencias de proteína. Cuando un dominio de una proteína es responsable fundamentalmente de la capacidad de la proteína para fijarse específicamente a una diana dada, se hace referencia al mismo en esta memoria como un "dominio de fijación" (BD).

El IPBD se selecciona con vistas a su tolerancia para mutagénesis extensa. Una vez que se sabe que el IPBD puede presentarse en la superficie de un fago y someterse a selección por afinidad, el gen que codifica el IPBD se somete a un patrón especial de mutagénesis múltiple, denominado en esta memoria "diversificación" que, después de pasos apropiados de clonación y amplificación conduce a la producción de una población de fagos, cada uno de los cuales presenta un solo dominio de fijación potencial (un mutante del IPBD), pero que presenta colectivamente una multitud de dominios de fijación potenciales diferentes aunque estructuralmente afines (PBDs). Cada fago genético lleva la versión del gen pbd que codifica el PBD presentada en la superficie de dicho fago particular. Se utiliza luego selección por afinidad para identificar el fago de presentación que lleva los PBDs con las características de fijación deseadas, y estos fagos de presentación pueden amplificarse luego. Después de uno o más ciclos de enriquecimiento por selección de afinidad y amplificación, el DNA que codifica los dominios de fijación exitosos (SBDs) puede recuperarse luego del fago seleccionado.

En caso necesario, el DNA del fago que contiene el SBD puede "diversificarse" ulteriormente, utilizando un SBD de la última tanda de diversificación como el "dominio de fijación parental potencial" (PPBD) para la generación siguiente de PBDs, y el proceso continúa hasta que el experto en la técnica está satisfecho con el resultado. En dicho momento, el SBD puede producirse por cualquier medio convencional, con inclusión de síntesis química.

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El dominio de fijación potencial inicial puede ser: 1) un dominio de una proteína existente naturalmente, 2) un dominio no existente naturalmente que corresponde sustancialmente en secuencia a un dominio existente naturalmente, pero que difiere del mismo en secuencia por una o más sustituciones, inserciones o deleciones, 3) un dominio que corresponde sustancialmente en secuencia a un híbrido de subsecuencias de dos o más proteínas existentes naturalmente, o 4) un dominio artificial diseñado totalmente sobre bases teóricas fundamentado en el conocimiento de las geometrías de los aminoácidos y la evidencia estadística de preferencias de estructura secundaria de los aminoácidos. (No obstante, las limitaciones de un diseño a priori de la proteína impulsaron la presente invención.) Usualmente, el dominio será un dominio de fijación conocido, o al menos un homólogo del mismo, pero puede derivarse de una proteína que, si bien no posee una actividad de fijación conocida, posee una estructura secundaria o superior que se presta por sí misma a actividad de fijación (hendiduras, ranuras, etc.). La proteína a la que es afín el IPBD no precisa tener afinidad específica alguna para el material diana.

En la determinación de si debería considerarse que las secuencias "se corresponden sustancialmente", deberían considerarse las cuestiones siguientes: el grado de semejanza de secuencia cuando las secuencias están alineadas para ajuste óptimo de acuerdo con algoritmos estándar, la similitud en los patrones de conectividad de cualesquiera reticulaciones (v.g., enlaces disulfuro), el grado hasta el cual las proteínas tienen estructuras tridimensionales similares, como se indica, v.g., por análisis de difracción de rayos X o NMR, y el grado en el que las proteínas secuenciadas tienen actividad biológica similar. En este contexto, debe indicarse que entre los inhibidores de serina-proteasa, existen familias de proteínas reconocidas como homólogas en las cuales existen pares de miembros con una homología de secuencia tan pequeña como 30%.

Un IPBD candidato debería satisfacer los criterios siguientes:

1): que existe un dominio que se mantendrá estable en las condiciones de su uso propuesto (el dominio puede comprender la proteína entera que se insertará, v.g., BPTI, \alpha-conotoxina GI o CMTI-III),

2): que puede obtenerse el conocimiento de la secuencia de aminoácidos, y

3): que puede obtenerse una molécula que tiene afinidad específica y elevada para el IPBD, AfM(IPBD).

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Preferiblemente, con objeto de guiar la estrategia de diversificación, puede obtenerse el conocimiento de la identidad de los residuos en la superficie exterior del dominio, y sus reacciones espaciales; sin embargo, esta consideración es menos importante si el dominio de fijación es pequeño, v.g., inferior a 40 residuos.

Preferiblemente, el IPBD no es mayor que lo necesario, dado que pueden sintetizarse químicamente SBDs pequeños (por ejemplo inferiores a 40 aminoácidos) y que es más fácil disponer sitios de restricción en secuencias de aminoácidos más pequeñas. Para PBDs inferiores a aproximadamente 40 residuos, una ventaja adicional es que el gen pbd diversificado entero puede sintetizarse en una sola pieza. En dicho caso, es preciso disponer únicamente sitios de restricción adecuados en el gen osp. Una proteína más pequeña minimiza la tensión metabólica en el fago o el hospedador de la GP. El IPBD es preferiblemente más pequeño que aproximadamente 200 residuos. El IPBD tiene que ser también suficientemente grande para tener una afinidad de fijación y especificidad aceptable. Para un IPBD que carezca de reticulaciones covalentes, tales como enlaces disulfuro, el IPBD tiene preferiblemente al menos 40 residuos; el mismo puede ser tan pequeño como 6 residuos si contiene una reticulación.

Existen muchos IPBDs candidatos, por ejemplo, el inhibidor de la tripsina pancreática bovina (BPTI, 58 residuos), CMTI-III (29 residuos), crambina (46 residuos), el tercer dominio de ovomucoide (56 residuos), la enterotoxina termoestable (ST-Ia de E. coli) (18 residuos), \alpha-Conotoxina GI (13 residuos), \mu-Conotoxina GIII (22 residuos), la miniproteína Conus King-Kong (27 residuos), la lisozima T4 (164 residuos), y la azurina (128 residuos). La Tabla 50 enumera varios IPBDs preferidos.

En algunos casos, una proteína que tenga cierta afinidad para la diana puede ser un IPBD preferido aun cuando no se cumplan óptimamente algunos otros criterios. Por ejemplo, el dominio V1 de CD4 es una buena elección como IPBD para una proteína que se fija a gp120 de HIV. Es sabido que las mutaciones en la región 42 a 55 de V1 afectan notablemente a la fijación de gp120 y que otras mutaciones tienen mucho menos efecto o destruyen por completo la estructura de V1. Análogamente, el factor de necrosis tumoral (TNF) sería una elección inicial satisfactoria si se desea una molécula semejante a TNF que tenga mayor afinidad para el receptor de TNF.

Dado que incluso mutaciones superficiales pueden reducir la estabilidad del PBD, el IPBD seleccionado debería tener una temperatura de fusión elevada (50ºC es aceptable, cuanto más alta mejor; BPTI funde a 95ºC) y ser estable en un amplio intervalo de pH (8,0 a 3,0 es aceptable; se prefiere 11,0 a 2,0), a fin de que los SBDs derivados del IPBD seleccionado por mutación y selección-por-fijación retengan estabilidad suficiente. Preferiblemente, las sustituciones en el IPBD que producen los diversos PBDs no reducen el punto de fusión del dominio por debajo de \approx 40ºC. Pueden presentarse mutaciones que aumenten la estabilidad de los SBDs con relación al IPBD, pero el proceso de la presente invención no depende de que ocurra esto. Las proteínas que contienen reticulaciones covalentes, tales como disulfuros múltiples, son suficientemente estables por regla general. Una proteína que tenga al menos dos disulfuros y tenga como mínimo un disulfuro por cada 20 residuos puede suponerse que será suficientemente estable.

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Si la diana es una proteína u otra macromolécula, una realización preferida del IPBD es una proteína pequeña tal como el inhibidor III de la tripsina de Cucurbita máxima (29 residuos), BPTI de Bos taurus (58 residuos), crambina de semilla de colza (46 residuos), o el tercer dominio del ovomucoide de Coturnix coturnis Japonica (codorniz japonesa) (56 residuos), dado que las dianas de esta clase tienen hendiduras y ranuras que pueden acomodar proteínas pequeñas de maneras muy específicas. Si la diana es una macromolécula que carece de una estructura compacta, tal como almidón, la misma debería tratarse como si fuera una molécula pequeña. Las macromoléculas extendidas con estructura 3D definida, tales como el colágeno, deberían tratarse como moléculas grandes.

Si la diana es una molécula pequeña, tal como un esteroide, una realización preferida del IPBD es una proteína de aproximadamente 80-200 residuos, tal como ribonucleasa de Bos taurus (124 residuos), ribonucleasa de Aspergillus oryzae (104 residuos), lisozima de clara de huevo de Gallus gallus (129 residuos), azurina de Pseudomonas aeruginosa (128 residuos) o lisozima T4 (164 residuos), dado que tales proteínas tienen hendiduras y ranuras en las cuales pueden encajar las moléculas diana pequeñas. El Banco de Datos de Proteínas de Brookhaven contiene estructuras 3D para todas las proteínas enumeradas. Genes que codifican proteínas tan grandes como la lisozima T4 pueden manipularse por técnicas estándar para los propósitos de esta invención.

Si la diana es un mineral, insoluble en agua, se considera la naturaleza de la superficie molecular del mineral. Los minerales que tienen superficies lisas, tales como el silicio cristalino, se abordan mejor con proteínas medianas a grandes, tales como ribonucleasa, como IPBD con objeto de disponer de área de contacto y especificidad suficientes. Los minerales con superficies rugosas y con ranuras, tales como las zeolitas, podrían ser fijados por moléculas pequeñas, tales como BPTI, o proteínas mayores tales como la lisozima T4.

BPTI es un IPBD especialmente preferido debido a que cumple o supera todos los criterios: es una proteína pequeña muy estable con una estructura 3D bien conocida.

Los polipéptidos pequeños tienen ventajas potenciales sobre los polipéptidos mayores cuando se utilizan como agentes terapéuticos o diagnósticos, con inclusión (pero sin carácter limitante) de:

a): mejor penetración en los tejidos,

b): eliminación más rápida de la circulación (importante para agentes de formación de imágenes),

c): menor antigenicidad, y

d): mayor actividad por unidad de masa.

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Así pues, sería deseable poder emplear la combinación de diversificación y selección por afinidad para identificar pequeños polipéptidos que se fijen a una diana de elección.

Sin embargo, los polipéptidos de este tamaño presentan desventajas como moléculas de fijación. De acuerdo con Olivera et al. (OLIV90a): "Peptides in this size range normally equilibrate among many conformations (in order to have a fixed conformation, proteins generally have to be much larger)." La fijación específica de un péptido a una molécula diana requiere que el péptido asuma una conformación que es complementaria al sitio de fijación.

En una realización, la presente invención resuelve estos problemas, en tanto que retiene las ventajas de los polipéptidos más pequeños, por fomento de la biosíntesis de nuevas mini-proteínas que tienen las características de fijación deseadas. Las mini-proteínas son polipéptidos pequeños (usualmente con menos de aproximadamente 60 residuos, más preferiblemente menos de 40 residuos ("micro-proteínas")) que, si bien son demasiado pequeñas para tener una conformación estable como resultado de fuerzas no covalentes exclusivamente, están reticuladas covalentemente (v.g., por enlaces disulfuro) en una conformación estable y por consiguiente tienen actividades biológicas más típicas de moléculas proteínicas mayores que de polipéptidos no restringidos de tamaño comparable.

Cuando se diversifican las mini-proteínas, los residuos que están reticulados covalentemente en la molécula parental quedan inalterados, estabilizando con ello la conformación. Por ejemplo, en la diversificación de una mini-proteína unida con disulfuro, ciertas cisteínas son invariantes, de tal modo que en las condiciones de expresión y presentación, se forman reticulaciones covalentes (v.g., enlaces disulfuro entre uno o más pares de cisteínas), y constriñen sustancialmente la conformación que puede ser adoptada por los aminoácidos linealmente hipervariables intermedios. Dicho de otro modo, se crea por ingeniería genética un entramado restrictivo en polipéptidos que en caso contrario están aleatorizados extensamente.

Una vez que se ha caracterizado una mini-proteína con características de fijación deseadas, la misma puede producirse, no sólo por técnicas de DNA recombinante, sino también por métodos de síntesis no biológicos.

Para el propósito de las reivindicaciones adjuntas, una mini-proteína tiene entre aproximadamente 8 y aproximadamente 60 residuos. Un puente disulfuro intracatenario que conecta los aminoácidos 3 y 8 de un polipéptido de 16 residuos se dirá en esta memoria que tiene una extensión de 4. Si los aminoácidos 4 y 12 están también unidos por disulfuro, entonces su puente tiene una extensión de 7. En conjunto, las 4 cisteínas dividen el polipéptido en 4 segmentos intercisteínicos (1-2, 5-7, 9-11, y 13-16). (Obsérvese que no existe segmento alguno entre Cys3 y Cys4.)

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El patrón de conectividad de una mini-proteína reticulada es una descripción simple de la localización relativa de los términos de las reticulaciones. Por ejemplo, para una mini-proteína con dos enlaces disulfuro, el patrón de conectividad "1-3, 2-4" significa que la primera cisteína reticulada está unida por disulfuro a la tercera cisteína reticulada (en la secuencia primaria), y la segunda a la cuarta.

Las mini-proteínas diversificadas unidas por disulfuro descritas en esta memoria se clasifican en varias clases.

Las mini-proteínas de clase I son aquéllas que exhiben un solo par de cisteínas capaz de interaccionar para formar un enlace disulfuro, teniendo dicho enlace una extensión de no más de 9 residuos. Este puente disulfuro tiene preferiblemente una extensión de al menos dos residuos; esto es función de la geometría del enlace disulfuro. Cuando el espaciamiento es de dos o tres residuos, un residuo es preferiblemente glicina a fin de reducir la tensión en los residuos puenteados. El límite superior del espaciamiento es menos preciso; sin embargo, en general, cuanto mayor es el espaciamiento, tanto menor es la restricción de la conformación impuesta sobre los residuos de aminoácidos linealmente intermedios por el enlace disulfuro.

Se prefiere especialmente un puente disulfuro con una extensión de 4 ó 5. Si la extensión se aumenta a 6, la influencia restrictiva se reduce. En este caso, se prefiere que al menos uno de los residuos incluidos sea un aminoácido que impone restricciones en cuanto a la geometría de la cadena principal. La prolina impone la máxima restricción. Valina e isoleucina restringen la cadena principal en menor proporción. La posición preferida para este residuo no cisteína restrictivo es adyacente a una de las cisteínas invariables; sin embargo, puede ser uno de los otros residuos puenteados. Si la extensión es de siete, se prefiere incluir dos aminoácidos que limiten la conformación de la cadena principal. Estos aminoácidos podrían encontrarse en cualquiera de las siete posiciones, pero preferiblemente son los dos residuos puenteados que son inmediatamente adyacentes a las cisteínas. Si la extensión es de ocho o nueve, pueden proporcionarse aminoácidos de restricción adicionales.

Pueden aparecer aminoácidos adicionales en el lado amino de la primera cisteína o el lado carboxi de la segunda cisteína. Solamente los aminoácidos "no extendidos" inmediatamente próximos es probable que posean un efecto significativo sobre la conformación de la extensión.

Las mini-proteínas de clase II son aquéllas que exhiben un solo enlace disulfuro que tiene una extensión mayor que 9 aminoácidos. Los aminoácidos puenteados forman estructuras secundarias que contribuyen a estabilizar su conformación. Preferiblemente, estos aminoácidos intermedios forman estructuras supersecundarias en horquilla tales como las esquematizadas a continuación:

100

En el diseño de una estructura en horquilla adecuada, puede copiarse una estructura real de una proteína cuya conformación tridimensional sea conocida, diseñarse la estructura utilizando datos de tendencia de estructuras secundarias para los aminoácidos individuales, etc., o combinarse los dos métodos. Preferiblemente, se utilizan como modelo una o más estructuras reales, y utilizarse los datos de frecuencia para determinar qué mutaciones pueden hacerse sin destruir la estructura.

Preferiblemente, no más de tres aminoácidos se encuentran entre la cisteína y el comienzo o el final de la hélice \alpha o la cadena \beta.

Son también posibles estructuras más complejas (tales como una doble horquilla).

Las mini-proteínas de clase III son aquéllas que exhiben una pluralidad de enlaces disulfuro. Las mismas pueden exhibir también opcionalmente estructuras secundarias tales como las expuestas anteriormente con relación a las mini-proteínas de Clase II. Dado que el número de topologías posibles de los enlaces disulfuro aumenta rápidamente con el número de enlaces (2 enlaces, 3 topologías; 3 enlaces, 15 topologías; 4 enlaces, 105 topologías) el número de enlaces disulfuro no excede preferiblemente de 4. Son preferibles dos enlaces disulfuro a 3, y 3 a 4. Con 2 o más enlaces disulfuro, las extensiones de los puentes disulfuro no exceden preferiblemente de 30, y el mayor segmento de cadenas intercisteínicas no excede preferiblemente de 20.

Las mini-proteínas de clase III existentes naturalmente, tales como la enterotoxina termoestable ST-Ia, tienen frecuentemente pares de cisteínas que están agrupados (-C-C- o -C-X-C-) en la secuencia de aminoácidos. El agrupamiento reduce el número de topologías realizables, y puede ser ventajoso.

Mini-Proteínas con Dedos Metálicos. Las mini-proteínas pueden ser las reticuladas por enlaces disulfuro. Otra clase importante de mini-proteínas son análogos de proteínas de dedo. Las proteínas de dedo se caracterizan por estructuras de dedo en las cuales un ion metálico está coordinado por dos residuos Cys y dos His, formando una configuración tetraédrica a su alrededor. El ion metálico es en la mayoría de los casos cinc (II), pero puede ser hierro, cobre, cobalto, etc. El "dedo" tiene la secuencia de consenso (Phe o Tyr) - (1 AA)-Cys-(2-4 AAs)-Cys-(3 AAs)-Phe- (5 AAs)-Leu-(2 AAs)-His-(3 AAs)-His-(5 AAs) (BERG88; GIBS88). La presente descripción abarca mini-proteínas con uno o dos dedos.

Puede introducirse diversidad adicional en una biblioteca de fagos de presentación con dominios de fijación potenciales por tratamiento del fago con enzimas (preferiblemente no tóxicas) y/o reactivos químicos que puedan modificar selectivamente ciertos grupos laterales de las proteínas, y afectar con ello a las propiedades de fijación de los PBDs presentados. Utilizando métodos de separación por afinidad, los autores de la invención han enriquecido las GPs modificadas que se fijan a la diana predeterminada. Dado que el dominio de fijación activo no está especificado por completo genéticamente, es preciso repetir la modificación post-morfogénesis en cada tanda de enriquecimiento. Este enfoque
es particularmente apropiado con IPBDs de mini-proteínas dado que se pretende la síntesis química de estos SBDs.

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Péptidos epitópicos

La presente invención se refiere también a la identificación de péptidos epitópicos que se fijan a una diana que es el sitio de fijación de epítope de un anticuerpo, lectina, enzima, u otra proteína de fijación. En el caso de un anticuerpo, el péptido epitópico tendrá al menos 4 aminoácidos y más preferiblemente 6 u 8 aminoácidos como mínimo. Usualmente, el mismo tendrá menos de 20 aminoácidos, pero no existe límite superior alguno fijado. En general, sin embargo, el péptido epitópico será un epítope "lineal" o "secuencial". Típicamente, en la construcción de una biblioteca para presentación de péptidos epitópicos, se modificarán la totalidad o la mayoría de las posiciones de los aminoácidos del epítope potencial. No obstante, es deseable que entre aquellos aminoácidos permitidos en una posición particular, exista una representación relativamente igual, como se expone más adelante en el contexto de la mutagénesis de dominios proteínicos.

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Estrategia de diversificación-mutagénesis para obtener dominios de fijación potenciales (o epítopes) con diversidad deseada

Cuando el número de secuencias de aminoácidos diferentes que pueden obtenerse por mutación del dominio es grande en comparación con el número de dominios diferentes que se pueden presentar en cantidades detectables, la eficiencia de la evolución forzada se incrementa notablemente por elección cuidadosa los residuos que deben modificarse. En primer lugar, se identifican los residuos de una proteína conocida que se sabe afectarán probablemente a su actividad de fijación (v.g., residuos superficiales) y no degradarán probablemente en grado excesivo su estabilidad. A continuación, la totalidad o algunos de los codones que codifican estos residuos se modifican simultáneamente para producir una población diversificada de DNA. La población de DNA diversificada se utiliza para expresar una diversidad de dominios de fijación potenciales, cuya capacidad para fijarse a la diana de interés puede evaluarse a continuación.

El método de la presente invención se distingue por tanto adicionalmente de otros métodos en la naturaleza de la población altamente diversificada que se produce y de la cual se seleccionan las nuevas proteínas de fijación. Se fuerza el dominio de fijación potencial presentado para muestrear el "espacio de secuencia" próximo de secuencias de aminoácidos afines de una manera eficiente y organizada. Cuatro son los objetivos que guían los diversos planes de diversificación utilizados en esta memoria, preferiblemente: 1) que esté disponible un número muy grande (v.g. 10^{7}) de variantes; 2) que aparezca realmente un porcentaje muy alto de las variantes posibles en cantidades detectables, 3) que la frecuencia de aparición de las variantes deseadas sea relativamente uniforme, y 4) que la variación ocurra únicamente en un número limitado de residuos de aminoácidos, muy preferiblemente en residuos que tengan grupos laterales dirigidos hacia una región común en la superficie del dominio de fijación potencial.

Esto debe diferenciarse del simple uso de agentes mutágenos indiscriminados tales como radiación e hidroxilamina para modificar un gen, en los cuales no existe control alguno (o muy oblicuo) en cuanto al sitio de mutación. Muchas de las mutaciones afectarán a residuos que no forman parte del dominio de fijación. Además, dado que a un nivel de mutagénesis razonable, cualquier codón modificado es probable que se caracterice por un solo cambio de base, únicamente se explorarán una gama limitada y sesgada de posibilidades. Igualmente remoto es el uso de técnicas de mutagénesis orientada que emplean oligonucleótidos mutagénicos de secuencia no aleatorizada, dado que estas técnicas no se prestan en sí mismas a la producción y el testado de un gran número de variantes. Si bien se conocen técnicas de mutagénesis aleatoria enfocadas, la importancia del control de la distribución de la variación ha sido en gran parte pasada por alto.

El término "DNA diversificado" (vgDNA) se refiere a una mezcla de moléculas de DNA de la misma o similar longitud que, una vez alineadas, varían en ciertos codones de tal modo que codifican en cada uno de dichos codones una pluralidad de aminoácidos diferentes, pero que codifican únicamente un solo aminoácido en otras posiciones de codón. Debe entenderse adicionalmente que en el DNA diversificado, los codones que son variables, y la gama y frecuencia de aparición de los diferentes aminoácidos que codifica un codón variable dado, se determinan previamente por el sintetizador del DNA, aun cuando el método de síntesis no permite conocer a priori la secuencia de cualquier molécula de DNA individual en la mezcla. El número de codones variables diseñados en el DNA diversificado preferiblemente no es mayor que 20 codones, y más preferiblemente no mayor que 5-10 codones. La mezcla de aminoácidos codificada en cada codón variable puede diferir de un codón a otro. Una población de fagos de presentación en la cual se ha introducido DNA diversificado se dice análogamente que está "diversificada".

Cuando el DNA que codifica una porción de un dominio conocido de una proteína se diversifica, el dominio original se conoce como el parental de los dominios de fijación potenciales (PPBD), y la multitud de dominios mutantes codificados como resultado de la diversificación se designan colectivamente como los "dominios de fijación potenciales" (PBD), dado que su capacidad de fijación a la diana predeterminada no se conoce entonces.

A continuación se considerará la manera en la que se genera una población diversa de dominios de fijación potenciales a fin de facilitar la selección de un fago portador de PBD que se fija con la afinidad requerida a la diana de elección. Los dominios de fijación potenciales se diseñan primeramente al nivel de aminoácidos. Una vez que se ha modificado qué residuos deben mutagenizarse, y qué mutaciones se permitirán en dichas posiciones, es posible diseñar luego el DNA diversificado que debe codificar los diversos PBDs a fin de asegurarse de que existe una probabilidad razonable de que si un PBD tiene afinidad para la diana, se detectará el mismo. Por supuesto, el número de transformantes independientes obtenidos y la sensibilidad de la tecnología de separación por afinidad impondrán límites en cuanto a la extensión de la diversificación posible dentro de cualquier tanda de diversificación individual.

Existen muchas vías para generar diversidad en una proteína. En un extremo, se modifican unos pocos residuos de la proteína todo lo posible ("Mutagénesis Enfocada"), v.g., se selecciona una serie de 5 a 7 residuos y se varía cada uno de ellos por 13-20 posibilidades. Un plan alternativo de mutagénesis ("Mutagénesis Difusa") consiste en variar muchos más residuos por una serie de elecciones más limitada (véase VERS86a y PAKU86). El patrón de diversificación adoptado puede caer entre estos extremos.

No existe límite fijo alguno en cuanto al número de codones que pueden mutarse simultáneamente. No obstante, es deseable adoptar una estrategia de mutagénesis que dé como resultado una probabilidad razonable de que una secuencia PBD posible sea presentada de hecho por al menos un fago. Preferiblemente, la probabilidad de que una muteína codificada por el vgDNA y compuesta por los aminoácidos menos favorecidos en cada posición diversificada sea presentada por al menos un transformante independiente en la biblioteca es al menos 0,50, y más preferiblemente al menos 0,90. (Las muteínas compuestas de aminoácidos más favorecidos tendrían por supuesto más probabilidad de existir en la misma biblioteca.)

Preferiblemente, la diversificación es tal que haga que una población típica de transformantes presente 10^{6}-10^{7} secuencias de aminoácidos diferentes por medio de, preferiblemente, no más de 10 veces más (más preferiblemente no más de 3 veces más) secuencias de DNA diferentes.

Para una mini-proteína que carece de hélices \alpha y cadenas \beta, se diversificará preferiblemente, en cualquier tanda de mutación dada, cada uno de 4-6 codones no cisteínicos de tal modo que cada uno de ellos codifique al menos 8 de los 20 aminoácidos posibles. La diversificación en cada codón podría estar hecha a la medida para dicha posición. Preferiblemente, la cisteína no es una de las sustituciones potenciales, aunque no se excluye.

Cuando la mini-proteína es una proteína de dedos metálicos, en una estrategia de diversificación típica, los dos residuos Cys y dos residuos His, y opcionalmente también los residuos Phe/Tyr, Phe y Leu mencionados anteriormente, se mantienen invariables y se varían una pluralidad (usualmente 5-10) de los otros residuos.

Cuando la mini-proteína es del tipo que exhiba una sola o más hélices \alpha y cadenas \beta, el conjunto de modificaciones potenciales de aminoácidos en cualquier posición dada se selecciona para favorecer aquéllas que tienen menos probabilidad de destruir la estructura secundaria en dicha posición. Dado que el número de posibilidades en cada aminoácido variable es más limitado, el número total de aminoácidos variables puede ser mayor sin alterar la eficiencia de muestreo del proceso de selección.

Para la última clase mencionada de mini-proteínas, así como dominios distintos de mini-proteínas, se diversificarán preferiblemente no más de 20 y más preferiblemente 5-10 codones. No obstante, si se emplea mutagénesis difusa, el número de codones que se diversifican puede ser mayor.

La decisión en cuanto a cuáles son los residuos a modificar se facilita por el conocimiento de qué residuos se encuentran en la superficie del dominio y cuales están ocultos en el interior.

Los residuos a modificar en el PPBD se seleccionan por consideración de varios factores, que incluyen: a) la estructura 3D del PPBD, b) secuencias homólogas a PPBD, y c) modelización del PPBD y mutantes del PPBD. Cuando el número de residuos que podrían influir fuertemente en la fijación sin impedir el plegado normal del PPBD es mayor que el número que debería variarse simultáneamente, el usuario debería seleccionar un subconjunto de dichos residuos para variar al mismo tiempo. El usuario selecciona los niveles de diversificación de prueba y calcula las abundancias de diversas secuencias. La lista de residuos modificados y el nivel de diversificación en cada residuo modificado se ajustan hasta que la diversificación compuesta es compatible con la sensibilidad de la separación por afinidad y el número de transformantes independientes que pueden producirse.

Una vez seleccionados los residuos a modificar, se decide a continuación la gama de aminoácidos a permitir en cada residuo variable. El nivel de diversificación total es el producto del número de variantes en cada residuo modificado. Cada residuo modificado puede tener un esquema de diversificación diferente, produciendo 2 a 20 posibilidades distintas. El conjunto de aminoácidos que son codificados potencialmente por un codón diversificado dado se conoce como "conjunto de sustitución".

La computadora que controla un sintetizador de DNA, tal como la Milligen 7500, puede programarse para sintetizar cualquier base de un oligonucleótido (nt) con cualquier distribución de nucleótidos tomando algunos sustratos nt (v.g. nt-fosforamiditos) de cada uno de dos o más depósitos. Alternativamente, los sustratos nt pueden mezclarse en cualesquiera relaciones y disponerse en uno de los depósitos suplementarios para la denominada síntesis de "botella sucia". Cada codón podría programarse de modo diferente. La "mezcla" de bases en cada posición de nucleótido del codón determina la frecuencia relativa de aparición de los diferentes aminoácidos codificados por dicho codón.

Los codones diversificados sencillamente son aquéllos en los cuales las posiciones de nucleótidos que están degeneradas se obtienen a partir de una mezcla de dos o más bases mezcladas en proporciones equimolares. Estas mezclas se describen en la presente memoria descriptiva por medio del código estandarizado de "nucleótidos ambiguos". En este código, por ejemplo, en el codón degenerado "SNT", "S" denota una mezcla equimolar de bases G y C, "N", una mezcla equimolar de la totalidad de las 4 bases, y "T", la base simple invariable timidina.

Los codones diversificados de manera compleja son aquéllos en los cuales al menos una de las tres posiciones está ocupada por una base de una mezcla no equimolar de dos o más bases.

Pueden utilizarse codones diversificados de manera simple o compleja para conseguir el conjunto de sustitución deseado.

Si no se dispone de información alguna que indique que un aminoácido o clase de aminoácidos particular es apropiado, se procura sustituir todos los aminoácidos con la misma probabilidad debido a que la representación de una mini-proteína por encima del nivel detectable es antieconómica. Cantidades iguales de cada uno de los cuatro nucleótidos en cada posición en un codón (NNN) produce la distribución de aminoácidos en la cual cada aminoácido está presente en proporción al número de codones que lo codifican. Esta distribución presenta la desventaja de dar dos residuos básicos por cada residuo ácido. Adicionalmente, existen 6 veces más R, S, y L que W o M. Si se sintetizan 5 codones con esta distribución, cada una de las 243 secuencias que codifican cualquier combinación de L, R y S son 7776 veces más abundantes que cada una de las 32 secuencias que codifican cualquier combinación de W y M. Para tener 5 Ws presentes a niveles detectables, es necesario tener cada una de las secuencias (L, R, S) presentes en un exceso de 7776 veces.

Está aceptado generalmente que la secuencia de aminoácidos en una proteína o polipéptido determina la estructura tridimensional de la molécula, con inclusión de la posibilidad de una estructura no definida. Entre los polipéptidos de longitud y secuencia definidas, algunos de ellos tienen una estructura terciaria definida y la mayoría carecen de ella.

Residuos de aminoácidos particulares pueden influir en la estructura terciaria de un polipéptido definido de diversas maneras, entre las cuales se incluyen las siguientes:

a): por afectación a la flexibilidad de la cadena principal del polipéptido,

b): por adición de grupos hidrófobos,

c): por adición de grupos cargados,

d): por adición de enlaces de hidrógeno, y

e): por formación de reticulaciones, tales como disulfuros, quelación con iones metálicos, o unión a grupos prostéticos.

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Flexibilidad:

GLY es el aminoácido más pequeño, que tiene dos hidrógenos unidos al C_{\alpha}. Dado que GLY no tiene C_{\beta} alguno, el mismo confiere la flexibilidad máxima a la cadena principal. Así pues, GLY aparece con gran frecuencia en las vueltas inversas, particularmente en asociación con PRO, ASP, ASN, SER, y THR.

Los aminoácidos ALA, SER, CYS, ASP, ASN, LEU, MET, PHE, TYR, TRP, ARG, HIS, GLU, GLN, y LYS tienen carbonos \beta no ramificados. De éstos, los grupos laterales de SER, ASP, y ASN establecen frecuentemente enlaces de hidrógeno con la cadena principal, y por consiguiente pueden adoptar conformaciones de la cadena principal que son energéticamente desfavorables respecto a las otras. VAL, ILE y THR tienen carbonos \beta ramificados, lo cual hace más favorable la conformación extendida de la cadena principal. Así, VAL e ILE se observan más a menudo en las hojas \beta. Dado que el grupo lateral de THR puede formar fácilmente enlaces de hidrógeno con la cadena principal, el mismo tiene menos tendencia a existir en una hoja \beta.

La cadena principal de prolina está restringida particularmente por el grupo cíclico lateral. El ángulo \varphi está siempre próximo a -60º. La mayoría de las prolinas se encuentran cerca de la superficie de la proteína.

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Carga:

LYS y ARG llevan una sola carga positiva para cualquier pH inferior a 10,4 ó 12,0, respectivamente. No obstante, los grupos metileno, cuatro y tres respectivamente, de estos aminoácidos son susceptibles de interacciones hidrófobas. El grupo guanidinio de ARG es capaz de donar 5 hidrógenos simultáneamente, mientras que el grupo amino de LYS puede donar solamente 3. Adicionalmente, las geometrías de estos grupos son muy diferentes, por lo que dichos grupos a menudo no son intercambiables.

ASP y GLU llevan una sola carga negativa para cualquier valor de pH superior a \approx 4,5 y 4,6, respectivamente. Dado que ASP tiene un solo grupo metileno, son posibles pocas interacciones hidrófobas. La geometría de ASP se presta por si misma a la formación de enlaces hidrógeno con los nitrógenos de la cadena principal, lo cual es coherente con el hecho de que ASP se encuentre muy a menudo en vueltas inversas y al comienzo de las hélices. GLU se encuentra más a menudo en hélices \alpha y particularmente en la porción aminoterminal de estas hélices, dado que la carga negativa del grupo lateral tiene una interacción estabilizadora con el dipolo de la hélice (NICH88, SALI88).

HIS tiene un pK de ionización en el campo fisiológico, a saber 6,2. Este pK puede verse alterado por la proximidad de grupos cargados o de donantes o aceptores de hidrógeno. HIS es capaz de formar enlaces con iones metálicos tales como cinc, cobre, y hierro.

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Enlaces de hidrógeno:

Aparte de los aminoácidos cargados, SER, THR, ASN, GLN, TYR y TRP pueden participar en enlaces de hidrógeno.

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Reticulaciones:

La forma de reticulación más importante es el enlace disulfuro formado entre dos tioles, y especialmente los tioles de residuos CYS. En un ambiente adecuadamente oxidante, estos enlaces se forman espontáneamente. Dichos enlaces pueden estabilizar en gran medida una conformación particular de una proteína o mini-proteína. Cuando está presente una mezcla de reactivos tiol oxidados y reducidos, tienen lugar reacciones de intercambio que permiten que predomine la conformación más estable. En relación con los disulfuros en proteínas y péptidos, véase también KATZ90, MATS89, PERR84, PERR86, SAUE86, WELL86, JANA89, HORV89, KISH85, Y SCHN86.

Otras reticulaciones que se forman sin necesidad de enzimas específicas incluyen:

1) (CYS)_{4}:Fe: Rubredoxina (en CREI84, P.376)

2) (CYS)_{4}:Zn: Aspartato-Transcarbamilasa (en CREI84, P.376) y dedos de Zn (HARD90)

3) (HIS)_{2}(MET)(CYS):: Cu Azurina (en CREI84, P.376) y Proteína de pepino Basic "Blue" Cu (GUSS88)

4) (HIS)_{4}:Cu: CuZn superóxido-dismutasa

5) (CYS)_{4}:(Fe_{4}S_{4}): Ferredoxina (en CREI84, P.376)

6) (CYS)_{2}(HIS)_{2}:Zn: Dedos de Zn (GIBS88)

7) (CYS)_{3}(HIS):Zn: Dedos de Zn (GAUS87, GIBS88)

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Las reticulaciones que tienen (HIS)_{2}(MET)(CYS):Cu presentan la ventaja potencial de que HIS y MET no pueden formar otras reticulaciones sin Cu.

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Codones Diversificados Simplemente

Los codones siguientes diversificados simplemente son útiles debido a que codifican un conjunto relativamente equilibrado de aminoácidos:

1): SNT, que codifica el conjunto [L, P, H, R, V, A, D, G]: a) un (D) ácido y un (R) básico, b) ambos alifáticos (L, V) e hidrófobos aromáticos (H), c) grupos laterales grandes (L, R, H) y pequeños (G, A), d) aminoácidos rígidos (P) y flexibles (G), e) cada aminoácido codificado una sola vez.

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2): RNG, que codifica el conjunto [M, T, K, R, V, A, E, G]: a) uno ácido y dos básicos (no óptimo, pero aceptable), b) hidrófilos e hidrófobos, c) cada aminoácido codificado una sola vez.

3): RMG, que codifica el conjunto [T, K, A, E]: a) uno ácido, uno básico, uno hidrófilo neutro, b) 3 hélices \alpha favorables, c) cada aminoácido codificado una sola vez.

4): VNT, que codifica el conjunto [L, P, H, R, I, T, N, S, V, A, D, G]: a) uno ácido, uno básico, b) todas las clases: cargados, neutros, hidrófilos, hidrófobos, rígidos y flexibles, etc, c) cada aminoácido codificado una sola vez.

5): RRS, que codifica el conjunto [N, S, K, R, D, E, G^{2}]: a) dos ácidos, dos básicos, b) dos hidrófilos neutros, c) únicamente glicina codificada dos veces.

6): NNT, que codifica el conjunto [F, S, Y, C, L, P, H, R, I, T, N, V, A, D, G]: a) 16 secuencias de DNA que proporcionan 15 aminoácidos diferentes; únicamente se repite serina, y todos los demás están presentes en cantidades iguales (esto permite un muestreo muy eficiente de la biblioteca.), b) existen números iguales de aminoácidos ácidos y básicos (D, y R, una sola vez cada uno), c) todas las clases principales de aminoácidos están presentes: ácidos, básicos, hidrófobos alifáticos, hidrófobos aromáticos, e hidrófilos neutros.

7): NNG, que codifica el conjunto [L^{2}, R^{2}, S, W, P, Q, M, T, K, V, A, E, G, parada]: a) una preponderancia considerable de residuos que favorecen la formación de hélices \alpha [L, M, A, Q, K, E; y, en menor proporción, S, R, T]; b) codifica 13 aminoácidos diferentes. (VHG codifica un subconjunto del conjunto codificado por NNG que codifica 9 aminoácidos en 9 secuencias de DNA diferentes, con ácidos y bases iguales, y siendo 5/9 favorables para hélice \alpha.)

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Para la diversificación inicial, se prefiere NNT en la mayoría de los casos. Sin embargo, cuando el codón codifica un aminoácido a incorporar en una hélice \alpha, se prefiere NNG.

A continuación, se analizan varias diversificaciones simples en cuanto a la eficiencia con la que pueden muestrearse las bibliotecas.

Se han consignado bibliotecas de hexapéptidos aleatorios codificados por (NNK)^{6} (SCOT90, CWIR90). La Tabla 130 muestra el comportamiento esperado de dichas bibliotecas. NNK produce codones simples para PHE, TYR, CYS, TRP, HIS, GLN, ILE, MET, ASN, LYS, ASP, y GLU (conjunto \alpha); dos codones - para cada uno de VAL, ALA, PRO, THR y GLY (conjunto \varphi), y tres codones para cada uno de LEU, ARG, y SER (conjunto \Omega). Se han separado los 64.000.000 de secuencias posibles en 28 clases, que se muestran en la Tabla 130A, basadas en el número de aminoácidos de cada uno de estos conjuntos. La clase mayor es \varphi\Omega\alpha\alpha\alpha\alpha con \approx 14,6% de las secuencias posibles. Aparte de cualquier selección, la totalidad de las secuencias comprendidas en una clase tienen la misma probabilidad de producirse. La Tabla 130B muestra la probabilidad de que una secuencia de DNA dada tomada de la biblioteca (NNK)^{6} codifique un hexapéptido perteneciente a una de las clases definidas; obsérvese que únicamente \approx 6,3% de las secuencias de DNA pertenecen a la clase \varphi\Omega\alpha\alpha\alpha\alpha.

La Tabla 130C muestra los números esperados de secuencias en cada clase para bibliotecas que contienen números variables de transformantes independientes (a saber 10^{6}, 3\cdot10^{6}, 10^{7}, 3\cdot10^{7}, 10^{8}, 3\cdot10^{8}, 10^{9}, y 3\cdot10^{9}). Para 10^{6} transformantes independientes (ITs), se espera encontrar 56% de la clase \Omega\Omega\Omega\Omega\Omega\Omega, pero sólo 0,1% de la clase \alpha\alpha\alpha\alpha\alpha\alpha. La gran mayoría de las secuencias observadas proceden de clases para las cuales se muestrea menos del 10% de la clase. Supóngase que se aísla un péptido de, por ejemplo, la clase \varphi\varphi\Omega\Omega\alpha\alpha por fraccionamiento de la biblioteca para fijación a una diana. Considérese cuánto se conoce acerca de péptidos que están relacionados con la secuencia aislada. Dado que únicamente se muestreó el 4% de la clase \varphi\varphi\Omega\Omega\alpha\alpha, no se puede llegar a la conclusión de que los aminoácidos del conjunto \Omega sean de hecho los óptimos del conjunto \Omega. Podría disponerse LEU en la posición 2, pero podrían ser mejores ARG o SER. Aun cuando se aislara un péptido de la clase \Omega\Omega\Omega\Omega\Omega\Omega, existe una probabilidad apreciable de que no estuvieron presentes en la biblioteca miembros mejores de la clase.

Con una biblioteca de 10^{7} ITs, se observa que varias clases se han muestreado completamente, pero que la clase \alpha\alpha\alpha\alpha\alpha\alpha está muestreada solamente en un 1,1%. Para 7,6\cdot10^{7} ITs, se espera una presentación del 50% de todas las secuencias de aminoácidos, pero las clases que contienen 3 o más aminoácidos del conjunto \alpha están todavía deficientemente muestreadas. Conseguir una toma de muestras completa de la biblioteca (NNK)^{6} requiere aproximadamente 3\cdot10^{9} ITs, 10 veces más que la mayor biblioteca (NNK)^{6} consignada hasta ahora.

La Tabla 131 muestra las expectativas de una biblioteca codificada por (NNT)^{4}(NNG)^{2}. Las expectativas de abundancia son independientes del orden de los codones o de codones intercalados no modificados. Esta biblioteca codifica 0,133 veces tantas secuencias de aminoácidos, pero se encuentran solamente 0,0165 veces tantas secuencias de DNA. Así, 5,0\cdot10^{7} ITs (es decir 60 veces menos que el valor requerido para (NNK)^{6}) proporciona un muestreado prácticamente completo de la biblioteca. Los resultados serían ligeramente mejores para (NNT)^{6} y ligeramente, pero no mucho, peores para (NNG)^{6}. el factor controlador es la relación de secuencias de DNA a secuencias de aminoácidos.

La Tabla 132 muestra la relación de # secuencias de DNA/# secuencias de AA para los codones NNK, NNT, y NNG. Para NNK y NNG, se ha supuesto que el PBD se presenta como parte de un gen esencial, tal como el gen III en el fago Ff, como se indica por la frase "suponiendo que las paradas desaparecen". No es necesario en modo alguno que se utilice dicho gen esencial. Si se utiliza un gen no esencial, el análisis sería ligeramente diferente; el muestreo de NNK y NNG sería ligeramente menos eficiente. Obsérvese que (NNT)^{6} proporciona un número 3,6 veces mayor de secuencias de aminoácidos que (NNK)^{5}, pero requiere 1,7 veces menos secuencias de DNA. Obsérvese también que (NNT)^{7} proporciona dos veces más secuencias de aminoácidos que (NNT)^{6}, pero 3,3 veces menos secuencias de DNA.

Así pues, si bien es posible utilizar una mezcla simple (NNS, NNK, o NNN) para obtener la totalidad de los 20 aminoácidos en una posición particular, estas mezclas simples conducen a un conjunto fuertemente sesgado de aminoácidos codificados. Este problema puede resolverse por el uso de codones diversificados de manera compleja.

Se presentará a continuación en primer lugar la mezcla calculada (véase WO 90/02809) para minimizar la relación de aminoácido más favorecido a aminoácido menos favorecido cuando la distribución de nt está sometida a dos restricciones: abundancias iguales de aminoácidos ácidos y básicos y el número menor posible de codones de parada. Se ha simplificado la búsqueda de una disminución óptima de nt por limitación de la tercera base a T o G (C o G es equivalente). No obstante, debe indicarse que la presente invención abarca el uso de codones diversificados de manera compleja, en los cuales la tercera base no está limitada a T o G (o a C o G).

La distribución óptima (el codón "fxS") se muestra en la Tabla 10A y produce moléculas de DNA que codifican cada aminoácido tipo con las abundancias indicadas. Obsérvese que esta química codifica la totalidad de los 20 aminoácidos, siendo equiprobables los aminoácidos ácidos y básicos, y que el aminoácido más favorecido (serina) está codificado sólo 2.454 veces más a menudo que el aminoácido menos favorecido (triptófano). El codón "fxS" vg mejora la toma de muestras óptimamente para péptidos que contienen varios de los aminoácidos [F, Y, C, W, H, Q, I, M, N, K, D, E] para los cuales NNK o NNS proporcionan un solo codón. Sus ventajas de muestreo son más acusadas cuando la biblioteca es relativamente pequeña.

Los resultados de búsqueda de sólo el codón diversificado de manera compleja que minimiza la relación de aminoácido más favorecido a menos favorecido, sin limitaciones adicionales, se muestran en la Tabla 10B. Los cambios son pequeños, lo que indica que la insistencia en la igualdad de ácidos y bases y la minimización de codones de parada es poco costosa. Obsérvese también que, sin restricción de la utilización, la prevalencia de aminoácidos ácidos y básicos resulta apreciablemente próxima. Por otra parte, la relajación de la restricción deja una distribución en la cual el aminoácido menos favorecido es sólo 0,412 veces tan prevalente como SER.

Las ventajas de un codón NNT se exponen en otro lugar de la presente solicitud. El NNT no optimizado proporciona 15 aminoácidos codificados por sólo 16 secuencias de DNA. Es posible mejorar NNT con el codón diversificado de manera compleja que se muestra en la Tabla 10C. Esto proporciona 5 aminoácidos (SER, LEU, HIS, VAL, ASP) en cantidades muy aproximadamente iguales. Ocho aminoácidos más (PHE, TYR, ILE, ASN, PRO, ALA, ARG, GLY) están presentes con 78% de la abundancia de SER. THR y CYS se mantienen aproximadamente con la mitad de la abundancia de SER. Cuando se diversifica DNA para mini-proteínas unidas por disulfuro, a menudo es deseable reducir la prevalencia de CYS. Esta distribución permite que se observen 13 aminoácidos a nivel alto y no proporciona parada alguna; la distribución optimizada de fxS permite solamente 11 aminoácidos con prevalencia alta.

El codón NNG puede optimizarse también. Cuando se utilizan T, C, A, G equimolares en NNG, se obtienen dosis dobles de LEU y ARG. La Tabla 10D muestra un codón NNG aproximadamente optimizado. En esta diversificación, existen 4 aminoácidos igualmente más favorecidos: LEU, ARG, ALA, y GLU. Obsérvese que existe un solo aminoácido ácido y un solo aminoácido básico en este conjunto. Existen dos aminoácidos igualmente menos favorecidos: TRP y MET. La relación de lfaa/mfaa es 0,5258. Si se repite 6 veces este codón, los péptidos compuestos totalmente por TRP y MET son 2% tan comunes como los péptidos compuestos enteramente por los aminoácidos más favorecidos. Se hace referencia a esto como "la prevalencia de (TRP/MET)^{6} en el NNG^{6} vgDNA optimizado".

Cuando se sintetiza vgDNA por el método de la "botella sucia", algunas veces es deseable utilizar sólo un número limitado de mezclas. Una mezcla muy útil se conoce como la "mezcla NNS optimizada", para la cual se dan los promedios de las dos primeras posiciones de la mezcla fxS: T_{1} = 0,24 C_{1} = 0,17, A_{1} = 0,33, G_{1} = 0,26, siendo la segunda posición idéntica a la primera, C_{3} = G_{3} = 0,5. Esta distribución proporciona los aminoácidos ARG, SER, LEU, GLY, VAL, THR, ASN, y LYS en una proporción mayor que 5%, y ALA, ASP, GLU, ILE, MET, y TYR en una proporción mayor que 4%.

Presenta interés un codón adicional diversificado de manera compleja. Este codón es idéntico al codón optimizado NNT en las dos primeras posiciones y tiene T:G::90:10 en la tercera posición. Este codón proporciona 13 aminoácidos (ALA, ILE, ARG, SER, ASP, LEU, VAL, PHE, ASN, GLY, PRO, TYR y HIS) en proporción mayor que 5,5%. THR con 4,3% y CYS con 3,9% son más comunes que los LFAAs de NNK (3,125%). Los 5 aminoácidos restantes están presentes en proporción menor que 1%. Este codón tiene la característica de que están presentes todos los aminoácidos; las secuencias que tienen más de 2 de los aminoácidos de abundancia baja son raras. Cuando se aísla un SBD utilizando este codón, se puede tener una seguridad razonable de que se han testado los 13 primeros aminoácidos en cada posición. Podría utilizarse un codón similar, basado en NNG optimizado.

Varios de los codones diversificados simples o complejos preferidos codifican un conjunto de aminoácidos que incluye cisteína. Esto significa que algunos de los dominios de fijación codificados presentarán una o más cisteínas además de las cisteínas invariantes unidas por disulfuro. Por ejemplo, en cada posición codificada por NNT, existe una probabilidad de 1 en 16 de obtener cisteína. Si se modifican así 6 codones, la fracción de dominios que contienen cisteínas adicionales es 0,33. Los números impares de cisteínas pueden conducir a complicaciones, véase Perry y Wetzel (PERR84). Por el contrario, muchas proteínas que contienen disulfuro contienen cisteínas que no forman disulfuros, v.g. tripsina. La posibilidad de cisteínas desapareadas puede abordarse de diversas maneras:

En primer lugar, la población de fagos diversificada puede hacerse pasar sobre un reactivo inmovilizado que se une fuertemente a los tioles libres, tal como SulfoLink (número de catálogo 44895 H de Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois, 61105). Otro producto de Pierce es TNB-tiol-agarosa (número de catálogo 20409H). BioRad vende Affi-gel 401 (catálogo 153-4599) para este propósito.

En segundo lugar, puede utilizarse una diversificación que excluye cisteínas, tal como:

NHT que da [F,S,Y,L,P,H,I,T,N,V,A,D],

VNS que da [L^{2},P^{2},H,Q,R^{3},I,M,T^{2},N,K,S,V^{2},A^{2},E,D,G^{2}],

NNG que da [L^{2},S,W,P,Q,R^{2},M,T,K,R,V,A,E,G, parada],

SNT que da [L,P,H,R,V,A,D,G],

RNG que da [M,T,K,R,V,A,E,G],

RMG que da [T,K,A,E],

VNT que da [L,P,H,R,I,T,N,S,V,A,D,G], o

RRS que da [N,S,K,R,D,E,G^{2}]

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Sin embargo, cada uno de estos esquemas tiene una o más desventajas, con relación a NNT: a) se permiten menos aminoácidos, b) los aminoácidos no se proporcionan uniformemente, c) los aminoácidos ácidos y básicos no son igualmente probables, o d) existen codones de parada. No obstante, NNG, NHT, y VNT son casi tan útiles como NNT. NNG codifica 13 aminoácidos diferentes y una sola señal de parada. Únicamente dos aminoácidos aparecen dos veces en la mezcla 16 veces mayor.

En tercer lugar, es posible enriquecer la población respecto a fijación a la diana preseleccionada, y evaluar post hoc las secuencias seleccionadas respecto a cisteínas suplementarias. Aquéllas que contienen más cisteínas que las cisteínas proporcionadas por restricción estructural pueden ser perfectamente utilizables. Es posible que aparezca un enlace disulfuro distinto del diseñado. Esto no significa que el dominio de fijación definido por la secuencia de DNA aislada sea en modo alguno inadecuado. La idoneidad de los dominios aislados se determina óptimamente por evaluación química y bioquímica de los péptidos sintetizados químicamente.

En último lugar, es posible bloquear los tioles libres con reactivos, tales como reactivo de Ellman, yodoacetato, o yoduro de metilo, que fijan específicamente los tioles libres y que no reaccionan con los disulfuros, y dejan luego el fago modificado en la población. Debe entenderse que el agente de bloqueo puede alterar las propiedades de fijación de la mini-proteína; por ello, podría utilizarse una diversidad de reactivos de bloqueo en la expectativa de que se encuentren dominios de fijación diferentes. La población diversificada de fagos de presentación bloqueada por tiol se fracciona respecto a fijación. Si la secuencia de DNA de la mini-proteína de fijación aislada contiene un número impar de cisteínas, se utilizan entonces medios sintéticos para preparar mini-proteínas que tengan todos los enlaces posibles y en las cuales el tiol impar esté bloqueado adecuadamente. Nishiuchi (NISH82, NISH86, y los artículos citados en dichos documentos) describen métodos de síntesis de péptidos que contienen una pluralidad de cisteínas de tal modo que cada tiol está protegido con un tipo diferente de grupo de bloqueo. Estos grupos pueden eliminarse selectivamente de tal modo que puede controlarse el apareamiento de los disulfuros. Se contempla la utilización de un esquema de esta clase con la alteración de que un solo tiol permanece bloqueado, o se desbloquea y se bloquea de nuevo después con un reactivo diferente.

El uso de codones NNT o NNG diversificados conduce a un muestreo muy eficiente de bibliotecas diversificadas debido a que la relación de (secuencias de aminoácidos diferentes)/(secuencias de DNA diferentes) está mucho más próxima a la unidad que lo está para NNK o incluso para el codón vg optimizado (fxS). Sin embargo, en cada caso se suprimen unos cuantos aminoácidos. Tanto NNT como NNG permiten miembros de todas las clases importantes de aminoácidos: hidrófobos, hidrófilos, ácidos, básicos, neutros hidrófilos, pequeños, y grandes. Después de seleccionar un dominio de fijación, puede ser deseable una diversificación y selección subsiguientes para conseguir una mayor afinidad o especificidad. Durante esta segunda diversificación, pueden investigarse las posibilidades de aminoácidos pasados por alto en la diversificación precedente.

En la segunda tanda de diversificación, una estrategia preferida consiste en variar cada posición por un nuevo conjunto de residuos que incluye el o los aminoácidos que se encontraban en dicha posición en los dominios de fijación exitosos, y que incluyen el mayor número posible de los residuos que se excluyeron en la primera tanda de diversificación.

Así pues, las tandas de diversificación posteriores testan tanto las posiciones de aminoácidos no mutadas previamente, como las sustituciones de aminoácidos en una posición previamente mutada que no estaban dentro del conjunto de sustitución previo.

Si la primera tanda de diversificación es totalmente infructuosa, debería utilizarse un patrón de diversificación diferente. Por ejemplo, puede definirse si más de un conjunto de interacción dentro de un dominio, los residuos modificados en la tanda de diversificación siguiente deberían ser de un conjunto diferente que el sondado en la diversificación inicial. Si se encuentran fallos repetidos, puede cambiarse a un IPBD diferente.

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Selección por afinidad de mutantes de fijación a la diana

En la presente invención se utiliza inicialmente separación por afinidad para comprobar que el sistema de presentación está funcionando, es decir, que una proteína quimérica de la superficie externa ha sido expresada y transportada a la superficie del fago y está orientada de tal manera que el dominio de fijación insertado es accesible al material diana. Cuando se utiliza para este propósito, el dominio de fijación es un dominio de fijación conocido para una diana particular y dicha diana es la molécula de afinidad utilizada en el proceso de separación por afinidad. Por ejemplo, un sistema de presentación puede validarse utilizando inserción de DNA codificante de BPTI en un gen que codifica una proteína de la superficie externa del fago de interés, y testando la fijación a anhidro-tripsina, que es fijada normalmente por BPTI.

Si el fago se fija a la diana, entonces se tendrá la confirmación de que el dominio de fijación correspondiente es de hecho presentado por el fago. Los fagos que presentan el dominio de fijación (y que por consiguiente se fijan a la diana) se separan de aquéllos que no lo hacen.

Después que se ha validado el sistema de presentación, es posible utilizar una población diversificada de fagos que presenten una diversidad de dominios de fijación potencial diferentes, y utilizar tecnología de separación por afinidad para determinar lo bien que se fijan los mismos a una o más dianas. Esta diana no precisa ser una diana fijada por un dominio de fijación conocido que es parental respecto a los dominios de fijación presentados, es decir, puede seleccionarse para fijación a una nueva diana.

Por ejemplo, puede diversificarse un dominio de fijación de BPTI y testarse respecto a fijación, no a tripsina, sino a otra serina-proteasa, tal como elastasa de los neutrófilos humanos o catepsina G, o incluso a una diana totalmente inconexa, tal como mioglobina de corazón de caballo.

El término "medios de separación por afinidad" incluye, pero sin carácter limitante: a) cromatografía en columna de afinidad, b) elución discontinua de un material matriz de afinidad, c) elución discontinua de un material de afinidad fijado a una placa, d) clasificación de células activada por fluorescencia, y e) electroforesis en presencia de material diana. "Material de afinidad" se utiliza con el significado de un material con afinidad para el material a purificar, denominado el "analito". En la mayoría de los casos, la asociación del material de afinidad y el analito es reversible de tal manera que el analito puede liberarse del material de afinidad una vez que se han eliminado las impurezas.

Si se va a utilizar cromatografía de afinidad, entonces:

1): las moléculas del material diana deben ser de tamaño y reactividad química suficientes para ser aplicables a un soporte sólido adecuado para separación por afinidad,

2): después de la aplicación a una matriz, el material diana no reacciona preferiblemente con el agua,

3): después de la aplicación a una matriz, el material diana preferiblemente no se fija a o degrada las proteínas de manera inespecífica, y

4): las moléculas del material diana tienen que ser suficientemente grandes para que la fijación del material a una matriz permita una superficie inalterada suficiente (generalmente al menos 500 \ring{A}^{2}, con exclusión del átomo que está conectado al enlazador) para la fijación de proteína.

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La cromatografía de afinidad es el medio de separación preferido, pero pueden utilizarse también FACS, electroforesis, u otros medios.

La presente invención hace uso de separación por afinidad de fagos para enriquecer una población en aquellos fagos portadores de genes que codifican proteínas con propiedades de fijación deseables.

La presente invención puede utilizarse para seleccionar dominios de fijación que se fijan a uno o más materiales diana, y/o que fallan en cuanto a la fijación a uno o más materiales diana. La especificidad, por supuesto, es la capacidad de una molécula de fijación para fijarse fuertemente a un conjunto limitado de materiales diana, en tanto que se fija más débilmente o no se fija en absoluto a otro conjunto de materiales diana de los cuales debe distinguirse el primer conjunto.

Puede utilizarse como diana prácticamente cualquier molécula que sea adecuada para separación por afinidad. Dianas posibles incluyen, pero sin carácter limitante, péptidos, proteínas solubles e insolubles, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, otras moléculas orgánicas (monómeras o polímeras), compuestos inorgánicos, y compuestos organometálicos. Las serina-proteasas son una clase especialmente interesante de materiales diana potenciales.

Para cromatografía, FACS, o electroforesis puede ser necesario enlazar covalentemente el material diana a una segunda entidad química. Para cromatografía, la segunda entidad es una matriz, para FACS es un colorante fluorescente, y para electroforesis la segunda entidad es una molécula fuertemente cargada. En muchos casos, no se requiere acoplamiento alguno dado que el material diana tiene ya la propiedad deseada de: a) inmovilidad, b) fluorescencia, o c) carga. En otros casos, se requiere acoplamiento químico o físico.

No es necesario que el material diana real se utilice en la preparación del análogo inmovilizado o marcado que va a ser utilizado en la separación por afinidad; en lugar de ello, pueden ser más convenientes análogos reactivos adecuados del material diana. Los materiales diana que no tienen grupos funcionales reactivos pueden inmovilizarse creando primeramente un grupo funcional reactivo por el uso de cualquier reactivo potente, tal como un halógeno. En algunos casos, los grupos reactivos del material diana real pueden ocupar una parte de la molécula diana que debe dejarse inalterada. En tal caso, pueden introducirse grupos funcionales adicionales por química de síntesis.

Se utilizan ampliamente dos métodos muy generales de inmovilización. El primero consiste en biotinilar el compuesto de interés y fijar luego el derivado biotinilado a avidina inmovilizada. El segundo método consiste en generar anticuerpos para el material diana, inmovilizar los anticuerpos por cualquiera de numerosos métodos, y fijar luego el material diana a los anticuerpos inmovilizados. El uso de anticuerpos es más apropiado para materiales diana de mayor tamaño; las dianas pequeñas (aquéllas que comprenden, por ejemplo, 10 o menos átomos distintos de hidrógeno) pueden estar sumergidas tan completamente en un anticuerpo que quede expuesta una porción muy pequeña de la diana en el complejo diana-anticuerpo.

Puede utilizarse también inmovilización no covalente de moléculas hidrófobas sin recurrir a anticuerpos. Un compuesto, tal como 2,3,3-trimetildecano se mezcla con un precursor de matriz, tal como alginato de sodio, y la mezcla se extrude en una solución endurecedora. Las perlas resultantes tendrán 2,3,3-trimetildecano dispersado completamente y expuesto en la superficie.

Otros métodos de inmovilización dependen de la presencia de funcionalidades químicas particulares. Un polipéptido presentará -NH_{2} (N-terminal; lisinas), -COOH (C-terminal; ácidos aspárticos, ácidos glutámicos), -OH (serinas; treoninas; tirosinas), y -SH (cisteínas). Un polisacárido tiene grupos -OH libres, al igual que el DNA, que tiene una cadena principal de azúcar.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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La tabla siguiente es una revisión no exhaustiva de grupos funcionales capaces de reaccionar y reactivos de inmovilización potenciales:

1

La extensa bibliografía sobre cromatografía de afinidad y técnicas afines proporcionarán ejemplos adicionales.

Matrices adecuadas para uso como materiales de soporte incluyen poliestireno, vidrio, agarosa y otros soportes cromatográficos, y pueden fabricarse en perlas, hojas, columnas, pocillos, y otras formas en caso deseado. Suministradores de material soporte para cromatografía de afinidad incluyen: Applied Protein Technologies Cambridge, MA; Bio-Rad Laboratories, Rockville Center, NY; Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Los materiales diana se fijan a la matriz de acuerdo con las instrucciones del fabricante de cada preparación de matriz prestando consideración a la presentación satisfactoria de la diana.

Al principio del proceso de selección, pueden aplicarse concentraciones relativamente altas de materiales diana a la matriz para facilitar la fijación; las concentraciones de la diana pueden reducirse subsiguientemente a fin de seleccionar SBDs de mayor afinidad.

La población del fago de presentación se aplica a una matriz de afinidad en condiciones compatibles con el uso propuesto de la proteína de fijación y la población se fracciona por paso de un gradiente de algún soluto a través de la columna. El proceso enriquece los PBDs que tienen afinidad para la diana y para los cuales la afinidad para la diana se ve menos afectada por los eluyentes utilizados. Las fracciones enriquecidas son aquéllas que contienen fagos de presentación viables que se eluyen de la columna para concentración mayor del eluyente.

Preferiblemente, los eluyentes son capaces de debilitar las interacciones no covalentes entre los PBDs presentados y el material diana inmovilizado. Preferiblemente, los eluyentes no destruyen el fago; el mensaje genético correspondiente a las miniproteínas exitosas se amplifica muy convenientemente por reproducción del fago más bien que por procedimientos in vitro tales como la PCR. La lista de eluyentes potenciales incluye sales (con inclusión de Na+, NH_{4}+, Rb+, SO_{4}- -, H_{2}PO_{4}-, citrato, K+, Li+, Cs+, HSO_{4}-, CO_{3}- -, Ca++, Sr++, Cl-, PO_{4}- - -, HCO_{3}-, Mg++, Ba++, Br-, HPO_{4}- - y acetato), ácido, calor, compuestos conocidos que se fijan a la diana, y material soluble de la diana (o análogos de los mismos).

Los solutos neutros, tales como etanol, acetona, éter, o urea, se utilizan frecuentemente en la purificación de proteínas y se sabe que debilitan las interacciones no covalentes entre proteínas y otras moléculas. Muchas de estas especies son, sin embargo, muy nocivas para las bacterias y bacteriófagos. Se sabe que la urea no deteriora M13 hasta 8M. La sal común es un soluto preferido para la formación de gradientes en la mayoría de los casos. La disminución del pH es también un eluyente muy preferido. En algunos casos, la matriz preferida no es estable a pH bajo, por lo que sal común y urea son los reactivos más preferidos. Pueden utilizarse también otros solutos que debilitan generalmente la interacción no covalente entre las proteínas y el material diana de interés.

Los fagos de presentación no eluidos contienen DNA que codifica dominios de fijación que tienen una afinidad suficientemente alta para el material diana como para resistir las condiciones de elución. El DNA que codifica tales dominios de fijación exitosos puede recuperarse de una diversidad de maneras. Preferiblemente, los fagos de presentación fijados se eluyen simplemente por medio de un cambio en las condiciones de elución. Alternativamente, es posible cultivar el fago in situ o extraer la matriz que contiene la diana con fenol (u otro disolvente adecuado) y amplificar el DNA por PCR o por técnicas de DNA recombinante. O bien, si un sitio para una proteasa específica se ha modificado por ingeniería genética en el vector de presentación, la proteasa específica se utiliza para escindir el dominio de fijación de la GP.

La variación del material soporte (poliestireno, vidrio, agarosa, celulosa, etc.) en el análisis de los clones que llevan SBDs se utiliza para distinguir fagos que se fijan al material soporte más bien que a la diana.

Los fagos cosechados se enriquecen luego en el fenotipo de fijación a la diana por el uso de separación por afinidad que implica el material diana inmovilizado en una matriz de afinidad. Los fagos que no logran fijarse al material diana se eliminan por lavado. Puede ser deseable incluir en el tampón un agente bactericida, tal como azida, para evitar el crecimiento bacteriano. Los tampones utilizados en cromatografía incluyen: a) cualesquiera iones u otros solutos necesarios para estabilizar la diana, y b) cualesquiera iones u otros solutos necesarios para estabilizar los PBDs derivados del IPBD.

La recuperación de fagos que presentan fijación a una columna de afinidad se consigue típicamente por recogida de las fracciones eluidas de la columna con un gradiente de un agente caotrópico como se ha descrito arriba, o del material diana en forma soluble; las fracciones que se eluyen más tarde en el gradiente están enriquecidas en el fago de afinidad alta. Los fagos eluidos se amplifican luego en células hospedadoras adecuadas.

Si algún fago de afinidad alta no puede eluirse de la diana en forma viable, es posible:

1): saturar la matriz con un medio nutriente y cultivar el fago deseado in situ,

2): separar partes de la matriz y utilizarlas para inocular el medio de crecimiento,

3): degradar química o enzimáticamente el enlace que mantiene unida la diana a la matriz a fin de que las GPs unidas todavía a la diana se eluyan, o

4): degradar el fago y recuperar el DNA con fenol u otro disolvente adecuado; el DNA recuperado se utiliza para transformar células que regeneran GPs.

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Es posible utilizar combinaciones de estos métodos. Debe recordarse que lo que se desea recuperar de la matriz de afinidad no es el fago per se, sino la información contenida en él en cuanto a la secuencia del epítope o dominio de fijación exitoso.

Como se describe en WO 90/02809, es posible modificar la separación por afinidad del método descrito a fin de seleccionar una molécula que se fije al material A pero no al material B, o que se fije a la vez a A y B en sitios competidores o no competidores, o que no se fije a las dianas seleccionadas.

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Producción subsiguiente

Utilizando el método de la presente invención, es posible obtener un fago replicable que presenta un nuevo dominio de proteína que tiene afinidad y especificidad altas para un material diana de interés. Un fago de este tipo lleva a la vez realizaciones de aminoácidos del dominio de proteínas de fijación y una realización de DNA del gen que codifica el nuevo dominio de fijación. La presencia del DNA facilita la expresión de una proteína que comprende el nuevo dominio de proteína de fijación dentro de un sistema de expresión de nivel alto, que no precisa ser el mismo sistema utilizado durante el proceso de desarrollo.

Es posible proceder a la producción de la nueva proteína de fijación de diversas maneras, que incluyen: a) alteración del gen codificante del dominio de fijación de tal modo que el dominio de fijación se exprese con una proteína soluble, no fijada a un fago (sea por deleción de codones 5' de aquéllos que codifican el dominio de fijación o por inserción de codones de parada 3' de aquéllos que codifican el dominio de fijación), b) desplazamiento del DNA codificante del dominio de fijación a un sistema de expresión conocido, y c) utilización del fago como un sistema de purificación. (Si el dominio es suficientemente pequeño, puede ser factible preparar el mismo por métodos convencionales de síntesis de péptidos).

Como se ha mencionado previamente, una ventaja inherente del uso de una mini-proteína como un IPBD es que es probable que el SBD derivado se comporte también como una mini-proteína y pueda obtenerse por medio de síntesis química. (El término "síntesis química", como se utiliza en esta memoria, incluye el uso de agentes enzimáticos en un ambiente exento de células).

Los péptidos pueden sintetizarse químicamente en solución o sobre soportes. Pueden emplearse diversas combinaciones de síntesis gradual y condensación de fragmentos.

Durante la síntesis, las cadenas laterales de los aminoácidos se protegen para impedir la ramificación. Varios grupos protectores diferentes son útiles para la protección de los grupos tiol de las cisteínas:

1): 4-metoxibencilo (MBzl; Mob) (NISH82; ZAFA88), eliminable con HF;

2): acetamidometilo (Acm) (NISH82; NISH86; BECK89c), eliminable con yodo; iones mercurio (v.g., acetato mercúrico); nitrato de plata; y

3): S-para-metoxibencilo.

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Otros grupos protectores de tiol pueden encontrarse en trabajos estándar de referencia tales como Greene, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (1981).

Una vez que la cadena de polipéptido se ha sintetizado, tienen que formarse los enlaces disulfuro. Agentes oxidantes posibles incluyen aire (NISH86), ferricianuro (NISH82), yodo (NISH82), y ácido perfórmico. Temperatura, pH, disolvente, y productos químicos caotrópicos pueden afectar al curso de la oxidación.

Un gran número de mini-proteínas con una pluralidad de enlaces disulfuro han sido sintetizadas químicamente en forma biológicamente activa.

Los dominios de fijación exitosos pueden, solos o como parte de una proteína de mayor tamaño, utilizarse para cualquier propósito para el cual sean adecuadas las proteínas de fijación, con inclusión de aislamiento o detección de materiales diana. En apoyo de este propósito, las nuevas proteínas de fijación pueden acoplarse directa o indirectamente, covalente o no covalentemente, a un marcador, vehículo o soporte.

Cuando se utilizan como producto farmacéutico, las nuevas proteínas de fijación pueden estar contenidas con vehículos o adyuvantes adecuados.

Todas las células utilizadas en los ejemplos que siguen son células de E. coli.

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Ejemplo I Presentación de BPTI como fusión a la proteína del gen VIII de M13

El Ejemplo I implica la presentación de BPTI en M13 como una fusión a la proteína madura de la cubierta del gen VIII. Cada construcción de DNA se confirmó por digestión con restricción y secuenciación del DNA.

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1. Construcción del Vector de Presentación secuencia señal viii::bpti::proteína madura de la cubierta de viii

Los vectores de clonación operativos son M13 y fagémidos derivados de M13. La construcción inicial se realizó en el fagémido basado en f1 pGEM-3Zf (-)^{TM} (Promega Corp., Madison, WI.).

Se construyó un gen que codificaba, sucesivamente: i) un promotor lacUV5 modificado, ii) una secuencia Shine-Dalgarno, iii) la secuencia señal de VIII de M13, iv) BPTI maduro, v) proteína madura de la cubierta del gen VIII de M13, vi) codones de parada múltiples, y vii) un terminador de la transcripción. Este gen se ilustra en la Tabla 102. El operador de lacUV5 es el lacO simétrico que permita una represión más fuerte en ausencia de IPTG. El segmento más largo que es idéntico al gen VIII de tipo salvaje está minimizado de tal modo que la recombinación genética con el gen VIII coexistente es improbable.

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i) OCV basado en pGEM-3Zf

pGEM-3Zf^{TM} (Promega Corp., Madison, WI.) es un vector que contiene el gen amp, el origen de replicación bacteriano, el origen de replicación del bacteriófago f1, un operón lacZ que contiene una secuencia de sitios de clonación múltiples, y las secuencias de fijación de las polimerasas T7 y SP6.

Se introdujeron sitios BamHI y SalI en los límites del operón lacZ (para facilitar la eliminación del operón lacZ y su reemplazamiento con el gen sintético); este vector se denomina pGEM-MB3/4.

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ii) OCV basado en M13mp18

M13mp18 (YANI85) es un vector (New England Biolabs, Beverly, MA.) constituido por el total del genoma del fago más un operón lacZ que contiene un sitio de clonación múltiple (MESS67). Se introdujeron los sitios BamHI y SalI en M13mp18 en los extremos 5' y 3' del operón lacZ; este vector se denomina M13-MB1/2.

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B) Gen sintético

Se construyó un gen sintético (secuencia señal VIII::bpti maduro::proteína madura de la cubierta de VIII) a partir de 16 oligonucleótidos sintéticos, sintetizados por Genetic Designs Inc. Houston, Texas, por un método similar a los indicados en KIMH89 y ASHM89. La Tabla 102 contiene una versión anotada de esta secuencia. Se fosforilaron los oligonucleótidos, con la excepción de las moléculas más próximas a 5', utilizando métodos estándar; se reasociaron y se ligaron por etapas. Los salientes se rellenaron con DNA polimerasa T4 y el DNA se clonó en el sitio HincII de pGEM-3Zf(-); el constructo inicial es pGEM-MB1. El DNA bicatenario de pGEM-MB1 se cortó con PstI, se rellenó con DNA-polimerasa T4 y se ligó a un enlazador SalI (New England Biolabs) de tal modo que el gen sintético está limitado por sitios BamHI y SalI (Tabla 102). El gen sintético se obtuvo en una casete BamHI-SalI y se clonó en pGEM-MB3/4 y M13-MB1/2 utilizando los sitios BamHI y SalI introducidos, para generar pGEM-MB16 y M13-MB15, respectivamente. La inserción sintética se secuenció. El Sitio de Fijación de Ribosoma (RBS) original era erróneo (AGAGG en lugar del AGGAGG diseñado) y se detectó que no expresaba proteína alguna in vivo o in vitro.

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C) Alteraciones del gen sintético i) Sitio de fijación de ribosoma (RBS)

En pGEM-MB16, se reemplazó un fragmento de DNA SacI-NheI (que contenía el RBS) con un oligonucleótido que codificaba un nuevo RBS muy similar al RBS de E. coli phoA que se sabe funciona.

RBS original supuesto (5'-a-3')

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Nuevo RBS (5'-a-3')

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Los RBSs supuestos se escriben con minúsculas y el codón de inicio metionina está subrayado y en negrilla. El producto resultante es pGEM-MB20. La expresión in vitro del gen transportado por pGEM-MB20 produjo una nueva especie de proteína del tamaño esperado, aproximadamente 14,5 kd.

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ii) Promotor tac

Para obtener mayor expresión de la proteína de fusión, el promotor lacUV5 se cambió a un promotor tac. En pGEM-MB16, se reemplazó un fragmento BamHI-HpaII (que contenía el promotor lacUV5) con un oligonucleótido que contenía la secuencia -35 del promotor trp (compárese RUSS82) convirtiendo el promotor lacUV5 en tac. El vector se denomina pGEM-MB22.

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Las variantes de promotor y RBS del gen de la proteína de fusión se construyeron como sigue:

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Los genes sintéticos de pGEM-MB20 y pGEM-MB26 se clonaron de nuevo en el vector de fago alterado M13-MB1/2 para generar los fagos M13-MB27 y M13-MB28 respectivamente.

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iii. Secuencia del Péptido Señal

La expresión in vitro del gen sintético regulado por tac y el "nuevo" RBS produjo una nueva proteína del tamaño esperado para la proteína no procesada (\approx 16 kd). La expresión in vivo produjo también una nueva proteína de tamaño completo; no pudo apreciarse proteína procesada alguna en el fago o en los extractos de células por tinción con plata o por análisis Western con anticuerpo anti-BPTI.

Por ello se analizó la secuencia señal de la fusión. La Tabla 106 muestra cierto número de secuencias señal típicas. Se cree generalmente que los residuos cargados que son de mayor importancia y se representan en negrilla y subrayados. Cada secuencia señal contiene un tramo largo de residuos sin carga que son en su mayoría hidrófobos; éstos se representan en minúsculas. A la derecha, entre paréntesis, se muestra la longitud del tramo de residuos sin carga. Puede verse que las fusiones de la señal del gen VIII a BPTI y la señal del gen III a BPTI tienen segmentos sin carga relativamente cortos. Estos segmentos cortos sin carga pueden reducir o impedir el procesamiento de los péptidos de fusión. Es sabido que la secuencia señal del gen III es capaz de dirigir: a) la inserción del péptido que comprende (BPTI maduro)::(proteína madura del gen III) en la bicapa lipídica, y b) la translocación de BPTI y la mayor parte de la proteína madura del gen III a través de la bicapa lipídica (véase más adelante). El hecho de que el gen III se mantiene anclado en la bicapa lipídica hasta que se ensambla el fago está dirigido por la región de anclaje desprovista de carga próxima al término carboxi de la proteína madura del III (véase Tabla 116) y no por la secuencia señal de secreción. La secuencia señal phoA puede dirigir la secreción de BPTI maduro al periplasma de E. coli (MARK86). Adicionalmente, existe controversia acerca del mecanismo por el cual la proteína madura auténtica del gen VIII viene a estar en la bicapa lipídica antes del ensamblaje del fago.

Así pues, se reemplazó el DNA codificante del gen VIII - secuencia señal supuesta por cada uno de los DNAs codificantes de: 1) la secuencia señal phoA, 2) la secuencia señal bla y 3) la señal del gen III de M13. Cada uno de estos reemplazamientos produce un gen tripartito que codifica una proteína de fusión que comprende, sucesivamente: (a) un péptido señal que dirige la secreción al periplasma de las partes (b) y (c), derivadas de un primer gen; (b) un dominio de fijación inicial potencial (BPTI en este caso), derivado de un segundo gen en (este caso, el segundo gen es un gen animal); y (c) una señal estructural de empaquetamiento (la proteína madura de la cubierta del gen VIII), derivada de un tercer gen.

El proceso por el cual la fusión IPBD::señal de empaquetamiento llega a la superficie del fago se ilustra en la Figura 1. En la Figura 1a, se observa que la proteína auténtica del gen VIII aparece (por el proceso que sea) en la bicapa lipídica de tal modo que tanto el término amino como el término carboxi se encuentran en el citoplasma. La peptidasa señal I escinde la proteína del gen VIII liberando el péptido señal (que es absorbido por la célula) y la proteína madura de la cubierta del gen VIII que abarca la bicapa lipídica. Muchas copias de la proteína madura de la cubierta del gen VIII se acumulan en la bicapa lipídica en espera del ensamblaje del fago (Figura 1c). Algunas secuencias señal son capaces de dirigir la translocación de proteínas muy grandes a través de la bicapa lipídica. Si se insertan codones adicionales detrás de los codones que codifican el sitio de escisión de la peptidasa señal I de una secuencia señal potente de esta clase, los aminoácidos codificados se translocarán a través de la bicapa lipídica como se muestra en la figura 1b. Después de la escisión por la peptidasa señal I, los aminoácidos codificados por los codones añadidos se encontrarán en el periplasma pero anclados a la bicapa lipídica por la proteína madura de la cubierta del gen VIII, Figura 1d. El DNA del fago circular monocatenario se extrude a través de una parte de la bicapa lipídica que contiene una concentración elevada de la proteína madura de la cubierta del gen VIII; el término carboxi de cada molécula de proteína de la cubierta se empaqueta cerca del DNA, mientras que el término amino está empaquetado en el exterior. Dado que la proteína de fusión es idéntica a la proteína madura de la cubierta del gen VIII dentro del dominio trans-bicapa, la proteína de fusión se co-ensamblara con la proteína madura autentica de la cubierta del gen VIII como se muestra en la Figura 1e.

En cada caso, el resto de la proteína madura de la cubierta del gen VIII tiene por objeto coensamblarse con la proteína autentica madura de la cubierta de VIII para producir partículas de fago que tienen dominios BPTI presentados en la superficie. La fuente y el carácter de la secuencia señal de secreción no son importantes dado que la secuencia señal se corta y se degrada. La señal estructural de empaquetamiento, sin embargo, es muy importante porque tiene que co-ensamblarse con la proteína auténtica de la cubierta para producir una vaina de virus activa.

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a) Péptido Señal de Fosfatasa Alcalina Bacteriana (phoA)

El constructo pGEM-MB26 contiene un fragmento SacI-AccIII que contiene el nuevo RBS y secuencias que codifican la metionina de inicio y el péptido señal de la pro-proteína VIII del gen M13. Este fragmento se reemplazó con un dúplex (reasociado a partir de cuatro oligonucleótidos) que contenían el RBS y DNA codificante de la metionina de inicio y el péptido señal de PhoA (INOU82); el fago es pGEM-MB42. M13MB48 es un derivado deGemMB42. Un fragmento de DNA BamHI-SalI de GenMB42, que contenía el constructo génico, se ligó en un vector M13MB1/2 escindido análogamente, dando lugar a M13MB48.

PhoA RBS y secuencia del péptido señal

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b) Péptido señal de \beta-lactamasa

Para permitir la transferencia del promotor de \beta-lactamasa (amp) y DNA codificante del péptido señal en el gen (BPTI maduro)::(proteína madura de la cubierta de VIII), se introdujo primeramente un sitio AccIII el gen amp adyacente a los codones para el sitio de escisión del péptido señal de \beta-lactamasa (C_{2504}\rightarrowT y A_{2501}\rightarrowG); el vector es pGEM-MB40. Se ligó luego un enlazador BamHI en el sitio AatII en el nucleótido 2260, 5' respecto al promotor; el vector es pGEM-MB45. El fragmento BamHI-AccIII contiene ahora el promotor amp, amp RBS, la metionina de inicio y el péptido señal de \beta-lactamasa. Este fragmento se utilizo para reemplazar el fragmento correspondiente de pGEM-MB26 a fin de generar un constructo pGEM-MB46.

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Secuencias del promotor del gen amp y el péptido señal

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c) M13-señal del gen III::bpti::proteína madura de la cubierta de VIII

Puede construirse también M13-MB51 que podría transportar un gen Km^{R} y un fragmento del gen M13-gen III-péptido señal fusionado al fragmento del gen BPTI::proteína madura de la cubierta de VIII, descrito previamente. Dado que M13-MB51 no contiene cantidad alguna del gen III, el fago no puede formar placas, pero puede hacer dar células Km^{R}. Pueden obtenerse partículas de fago infeccioso por la vía de un fago adyuvante. La secuencia señal del gen III es capaz de dirigir (BPTI)::proteína madura del gen III) a la superficie del fago (véase más adelante).

Sumario de variantes de la proteína de fusión del péptido señal

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2. Análisis de los Productos Proteínicos Codificados por los Genes Sintéticos (péptido-señal::bpti-maduro::proteína de la cubierta de VIII) i) Análisis in vitro

Se utilizo un sistema procariota acoplado de transcripción/traducción (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) para el análisis in vitro de los productos proteínicos codificados por el gen sintético BPTI/VIII y los derivados.

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La Tabla 107 enumera los productos proteínicos codificados por los vectores enumerados que se visualizan por fluorografía estándar después de síntesis in vitro en presencia de ^{35}S-metionina y separación de los productos utilizando electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. En cada muestra, puede verse un producto de pre-\beta-lactamasa (\approx31 kd). Éste se deriva del gen amp que es el gen de selección común para los vectores. Adicionalmente, pueden verse, como se indica, un producto (pre-BPTI/VIII) codificado por el gen sintético y variantes. la migración de estas especies (\approx14,5 kd) es coherente con el tamaño esperado de las proteínas codificadas.

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ii) Análisis in vivo

Los vectores detallados en las secciones (B) y (C) se transfectaron recientemente en la cepa de E. coli XL1-Blue^{(TM)} (Stratagene, La Jolla, CA) y en la cepa SEF'. La cepa de E. coli SE6004 (LISS85) lleva la mutación pr1A4 y es más permisiva en secreción que las cepas que llevan el pr1A de tipo salvaje. SE6004 es F^{-} y se deleciona por lacI; así pues, las células no pueden ser infectadas por M13 y los promotores lacUV5 y tac no pueden ser regulados con IPTG. La cepa SEF' se deriva de la cepa SE6004 (LISS85) por cruzamiento con XL1-Blue^{(TM)}; la F' en XL1-Blue^{(TM)} lleva Tc^{R} y lacI^{q}. SE6004 es estreptomicina^{R}, Tc^{S} mientras que XL1-Blue^{(TM)} es estreptomicina^{S}, Tc^{R} de tal modo que ambas cepas parentales pueden ser destruidas con la combinación de Tc y estreptomicina. SEF' retiene el fenotipo permisivo en secreción de la cepa parental, SE6004 (pr1A4).

Los transfectantes recientes se cultivaron en medio NZYCM (SAMB89) durante 1 hora. Se añadió IPTG a lo largo del intervalo de 1,0 \muM a 0,5 mM (para desreprimir lacUV5 y tac) y se dejaron en cultivo durante 1,5 horas más.

Partes alícuotas de células que expresaban las proteínas purificadas por la inserción sintética junto con controles (sin vector alguno, con vector falso, y sin IPTG) se lisaron en tampón de carga del gel SDS y se sometieron a electroforesis en geles con 20% de poliacrilamida que contenían SDS y urea. Los geles duplicados se tiñeron con plata (Daiichi, Tokio, Japón) o se electrotransfirieron a una matriz de nailon (Immobilon de Millipore, Bedford, MA) para análisis Western utilizando anticuerpos policlonales anti-BPTI de conejo.

La Tabla 108 enumera las proteínas interesantes observadas por tinción con plata y análisis Western de geles idénticos. Puede verse claramente por análisis Western que existen especies de proteínas inducibles por IPTG que contienen epítopes de BPTI en las cepas de test que están ausentes de las cepas de control. En XL1-Blue^{(TM)}, la migración de esta especie es predominantemente la de la forma no procesada de la pro-proteína, aunque una pequeña proporción de la proteína parece migrar en un tamaño coherente con el de una forma totalmente procesada. En SEF', predomina la forma procesada, existiendo solamente una banda débil que corresponde a la especie no procesada.

Así pues, en la cepa SEF', se ha producido una proteína de fusión tripartita que es escindida específicamente detrás de la secuencia señal de secreción. Los autores de la invención creen que la proteína madura comprende BPTI seguido por la proteína de la cubierta del gen VIII y que el resto de proteína de la cubierta se extiende a través de la membrana. Una o más copias, quizás centenares de copias, de esta proteína se co-ensamblaran en el fago derivado de M13 o fagémidos semejantes a M13. Esta construcción permitirá a) mutagenizar el dominio BPTI, b) presentar cada una de las variantes en la cubierta de uno o más fagos (un solo tipo por fago), y c) recuperar aquellos fagos que presenten variantes que tengan nuevas propiedades de fijación con respecto a los materiales diana de elección por los autores de la invención.

Rasched y Oberer (RASC86) comunican que los fagos producidos en células que expresan dos alelos del gen VIII, que tienen diferencias dentro de los primeros 11 residuos de la proteína madura de la cubierta, contienen algo de cada una de las proteínas. Así, dado que se ha conseguido el procesamiento in vivo del gen de fusión phoA (señal) ::BPTI::VIII madura, es muy probable que la co-expresión de este gen con VIII de tipo salvaje llegue a la producción de dominios BPTI portadores de fago en su superficie. La mutagénesis del dominio BPTI de estos genes proporcionara una población de fago, llevando cada fago un gen que codifica la variante de BPTI presentada en la superficie del fago.

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Fago de Presentación de VIII: Producción, Preparación y Análisis i. Producción del Fago

El OCV puede cultivarse en XL1-Blu^{(TM)} en ausencia de IPTG. Típicamente, se toma un taco de una placa y se cultiva en 2 ml de medio, que contiene células diluidas recientemente, durante 6 a 8 horas. Después de la centrifugación de este cultivo, se titula el sobrenadante. Se mantiene éste como un stock de fago para infección ulterior, producción del fago, y presentación del producto génico de interés.

Una dilucion de 100 veces de un cultivo nocturno reciente de células SEF' en 500 ml de medio NZCYM se deja en cultivo hasta una densidad de células de 0,4 (Ab 600 nm) en una máquina de sacudidas a 37ºC. Se añade a este cultivo una cantidad suficiente del stock de fago para dar una MOI de 10 junto con IPTG para dar una concentración final de 0,5 mM. El cultivo se mantiene durante 2 horas más.

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ii. Preparación y Purificación del Fago

El cultivo bacteriano productor de fago se centrifuga para separar el fago en el sobrenadante del sedimento bacteriano. Se añade al sobrenadante una cuarta parte, en volumen, de solución de precipitación de fago (20% PEG, acetato de amonio 3,75M) y PMSF hasta una concentración final de 1 mM. Se deja la misma en hielo durante dos horas, después de lo cual se recupera el fago precipitado por centrifugación. Se redisuelve el sedimento de fago en TrisEDTA que contiene 0,1% de Sarkosyl y se deja a 4ºC durante 1 hora, después de lo cual se separan por centrifugación cualesquiera bacterias y residuos bacterianos. El fago en el sobrenadante se reprecipita con PEG durante una noche a 4ºC. El sedimento de fago se resuspende en medio LB y se reprecipita otras dos veces para eliminar el detergente. El fago se guarda en medio LB a 4ºC, se titula, y se utiliza para análisis y estudios de fijación.

Un esquema más severo de purificación del fago implica centrifugación en un gradiente de CsCl (3,86 g de CsCl disueltos en tampón NET (NaCl 0,1M, EDTA 1 mM, Tris 0,1M, pH 7,7) para completar 10 ml). Se mezclan 10^{12} a 10^{13} fagos en tampón TE Sarkosyl con 5 ml de tampón NET de CsCl y se centrifugan durante una noche a 34K rpm en, por ejemplo, una ultracentrífuga Sorvall OTD-65B. Se separan cuidadosamente partes alícuotas de 400 \mul. Se separan partes alícuotas de 5 \mul de las fracciones y se analizan por electroforesis en gel de agarosa después de calentar a 65ºC durante 15 minutos junto con el tampón de carga de gel que contiene 0,1% de SDS. Las fracciones que contienen el fago se agrupan, se reprecipita el fago y se redisuelve finalmente en medio LB hasta una concentración de 10^{12} a 10^{13} fagos por ml.

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iii. Análisis del Fago

Los fagos de presentación se analizan utilizando métodos estándar de electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con plata del gel o electrotransferencia a una matriz de nailon seguida por análisis con antisuero anti-BPTI (análisis Western). La presentación de proteínas heterólogas se cuantifica por comparación con diluciones seriadas de la proteína de partida, por ejemplo BPTI, junto con las muestras de fago de presentación en la electroforesis y los análisis Western. Un método alternativo implica correr una dilucion seriada de dos veces de un fago en la cual tanto la proteína principal de la cubierta como la proteína de fusión se tiñen con plata. La comparación de las relaciones de las dos especies proteínicas permite estimar el número de proteínas de fusión por fago, dado que el número de proteínas codificadas por el gen VIII por fago (\approx3000) es conocido.

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Incorporación de la proteína de fusión en bacteriófago

La expresión in vivo de la proteína de fusión BPTI:VIII procesada, codificada por los vectores GemMB42 y M13MB48, indicaba que el producto de fusión procesado está localizado probablemente en el interior de la membrana celular. Así, el mismo podría ser incorporado en el fago y sería posible que el resto BPTI se presentara en la superficie del fago.

Se infectaron células SEF' con M13MB48 o M13mp18, como control. Los fagos resultantes se sometieron a electroforesis (\approx10^{11} fagos por pista) en un gel de poliacrilamida al 20% que contenía urea, seguido por electrotransferencia a una matriz de nailon y análisis Western utilizando suero de conejo anti-BPTI. Se observo una sola especie de proteína en el fago derivado de infección con el fago de stock M13MB48 que no se observaba en la infección de control.

Esta proteína migraba a un tamaño aparente de \approx12 kd, coherente con el de la proteína de fusión totalmente procesada.

El análisis Western del lisado bacteriano de SEF' con o sin infección de fago demostró otra especie de proteína de aproximadamente 20 kd. Esta especie está presente también, en menor grado, en preparaciones de fago que se precipitaron simplemente con PEG sin purificación ulterior (por ejemplo, utilizando detergente no iónico o por centrifugación en gradiente de CsCl). Una comparación de las preparaciones de fago M13MB48 realizadas en presencia o ausencia de detergente a1, demostró que el tratamiento con Sarkosyl y la purificación en gradiente de CsCl eliminaban el contaminante bacteriano mientras que no tenían efecto alguno sobra la presencia de la proteína de fusión BPTI:VIII. Esto indica que la proteína de fusión se ha incorporado y es un constituyente del cuerpo del fago.

La evolución temporal de la producción de fagos y la incorporación de BPTI:VIII se siguió después de la infección y después de la inducción con IPTG. La producción de fago y la incorporación de la proteína de fusión parecían ser máximas al cabo de dos horas. Esta evolución temporal se utilizó en las producciones y análisis del fago ulteriores.

La electroforesis en poliacrilamida de las preparaciones de fago, seguida por tinción con plata, demostró que las preparaciones estaban esencialmente exentas de especies de proteínas contaminantes, y que estaba presente una banda proteínica suplementaria en el fago derivado de M13MB48, que no estaba presente en el fago de control. El tamaño de la nueva proteína era coherente con el observado por análisis Western. Un análisis similar de un fago BPTI:VIII incorporado diluido serialmente demostró que la relación de proteína de fusión a proteína principal de la cubierta era por regla general aproximadamente 1:150. Dado que el fago contiene aproximadamente 3000 copias del producto del gen VIII, la población de fago contiene, por término medio, 10's de copias de proteína de fusión por fago.

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Alteración de la metionina de inicio del gen natural VIII

El OCV M13MB48 contiene el gen sintético que codifica la proteína de fusión BPTI:VIII en la región intergénica del vector de fago M13mp18 modificado. El resto del vector está constituido por el genoma de M13. Para aumentar la incorporación en el fago de la proteína de fusión, se decidió reducir la producción del producto natural del gen VIII por alteración del codón de metionina de inicio de este gen a CTG. En tales casos, la metionina se incorpora, pero la velocidad de inicio se reduce. El cambio se realizó por mutagénesis de oligonucleótidos orientada.

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Los análisis del fago derivado de este vector modificado indicaban que existía un aumento significativo en la relación de proteína de fusión a proteína principal de la cubierta. Estimaciones cuantitativas indicaron que en una población de fagos se incorporaban tantas como 100 copias de la fusión BPTI-VIII por fago.

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Presentación de la proteína de fusión BPTI:VIII por bacteriófago

Se había demostrado que la proteína de fusión BPTI:VIII está incorporada en el cuerpo del fago. Este fago se analizó ulteriormente para demostrar que el resto BPTI estaba accesible a anticuerpos específicos y por tanto se presentaba en la superficie del fago.

Se añadió IgG anti-BPTI policlonal purificada de conejo a un título conocido de fago. Después de la incubación, se añaden perlas de proteína A-agarosa para fijar la IgG y se dejan incubar durante una noche. Las perlas de IgG-proteína A y cualquier fago fijado se separan por centrifugación seguido por una nueva titulación del sobrenadante a fin de determinar la pérdida de fago. El fago fijado a las perlas puede eluirse también con ácido y titularse. El ensayo incluye controles, tales como un stock de fago WT (M13mp18) e IgG purificada de suero normal pre-inmune de conejo.

La Tabla 140 muestra que si bien el título del fago WT no se altera por IgG anti-BPTI, BPTI-IIIMK (control positivo, véase más adelante), demostraba una caída significativa en el título con o sin la adición suplementaria de perlas de proteína A. (Obsérvese que, dado que el resto BPTI forma parte de gIIIp que fija el fago a los pili bacterianos, esto es de esperar). Dos lotes de fago M13MB48 (que contenían la proteína de fusión BPTI:VIII) demostraron una reducción significativa en el título, a juzgar por las pfus, cuando se añadieron anticuerpos anti-BPTI y perlas de proteína A. La caída inicial en el título con el anticuerpo solo, difiere algo entre los dos lotes de fago. La recuperación del fago inmunoprecipitado, si bien no era cuantitativa, era significativa cuando se comparó con el control de fago WT.

En la Tabla 141 y la Tabla 142 se muestran controles adicionales. Los datos demostraban que la pérdida de título observada por el fago que contenía BPTI:VIII es resultado de la presentación de epítopes de BPTI por estos fagos y la interacción específica con anticuerpo anti-BPTI. No pudo demostrarse interacción alguna significativa con perlas proteína-agarosa o IgG purificada a partir de suero normal de conejo. La mayor caída de título para el lote M13MB48 cinco refleja el mayor nivel de incorporación de la proteína de fusión en esta preparación.

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Funcionalidad del resto BPTI en el fago de presentación BPTI-VIII

Las dos secciones anteriores demostraron que la proteína de fusión BPTI:VIII se ha incorporado en el cuerpo del fago y que el resto BPTI se presenta en la superficie del fago. Para demostrar que la molécula presentada es funcional, se realizaron experimentos de fijación de una manera prácticamente idéntica a la descrita en la sección previa excepto que se utilizaron proteasas en lugar de anticuerpos. El fago de presentación y los controles se dejaron interaccionar con proteasas inmovilizadas o proteasas desactivadas inmovilizadas. La fijación se evalúa por la pérdida de título del fago de presentación o por determinación del fago fijado a las perlas.

La Tabla 143 muestra los resultados de un experimento en el cual se dejó que el fago de presentación de BPTI.VIII, M13MB48, se fijara a perlas de anhidro-tripsina-agarosa. Había una caída de título significativa comparada con el fago WT (BPTI no presentado). Una agrupación de fagos (agrupación 5AA), contiene cada uno una extensión diversificada de 5 aminoácidos en la interfaz BPTI:proteína principal de la cubierta, demostraba una caída similar en el título. En el control (Tabla 143), se observó muy poca fijación inespecífica del fago de presentación, llevando las perlas de agarosa una proteína inconexa (estreptavidina).

La fijación real del fago de presentación se demuestra por los datos presentados para los experimentos en la Tabla 144. El control negativo es M13mp18 y el control positivo es BPTI-IIIMK, un fago en el cual se ha demostrado que se presenta y es funcional el resto BPTI, unido a la proteína del gen III. M13MB48 y M13MB56 se fijan ambos a las perlas de anhidro-tripsina de una manera comparable a la del control positivo, siendo 40 a 60 veces mejores que el control negativo (fago no presentado). Por tanto, se demostró la funcionalidad del resto BPTI, en la proteína principal de fusión de la cubierta.

Adicionalmente, la Tabla 145 compara la fijación a tripsina activa y desactivada por un fago. Los fagos de control, M13mp18 y BPTI-III MK, demostraron fijación similar a la detallada en otro lugar en la presente solicitud. Obsérvese que la fijación relativa se mejora con tripsina debido a la aparente reducción acusada en la fijación inespecífica del fago WT a la proteasa activa. M13.3X7 y M13.3X11, cada uno de los cuales contiene extensiones del enlazador "EGGGS" en la interfaz del dominio, se fijaban a anhidro-tripsina y tripsina de una manera similar al fago BPTI-IIIMK. La fijación, con relación a un fago sin presentación, era \approx100 veces mayor en el ensayo de fijación de anhidro-tripsina y al menos 1000 veces mayor en el ensayo de fijación de tripsina. La fijación de otra variante del enlazador "EGGGS" (M13.3Xd) era similar a la de M13.3X7.

Para demostrar la especificidad de fijación, se repitieron los ensayos con perlas de elastasa de neutrófilos humanos (HNE) y se compararon con lo observado con las perlas de tripsina, Tabla 146. BPTI tiene una afinidad muy alta para tripsina y una afinidad baja para HNE, por lo que un fago de presentación BPTI debería reflejar estas afinidades cuando se utiliza en ensayos de fijación con estas perlas. Los controles negativo y positivo para fijación de tripsina eran como ya se ha descrito arriba, incluyéndose un control positivo adicional para las perlas de HNE, BPTI (K15L, MGNG)-III MA. Los resultados, presentados en la Tabla 146, confirmaron esta predicción. Los fagos M13MB48, M13.3X7 y M13.3X11 demostraron una fijación satisfactoria a la tripsina, con relación al fago WT y el control HNE (BPTI(K15L,MGNG)-III MA), siendo comparable al fago BPTI-III MK. Inversamente, tenía lugar una fijación insuficiente cuando se utilizaron perlas HNE, con la excepción del fago de control HNE-positivo.

Tomados en su conjunto, los datos acumulados demostraban que cuando BPTI forma parte de una proteína de fusión con la proteína principal de la cubierta del fago M13, la molécula se presenta a la vez en la superficie del fago y una proporción importante del mismo es funcional con una manera de fijación específica de proteasa.

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Ejemplo II Construcción del vector de presentación BPTI/GEN III

Se condujeron manipulaciones del DNA de acuerdo con procedimientos estándar como se describen en Maniatis et al. (MANI82) O Sambrook et al.(SAMB89. Primeramente se separó el gen lacZ de M13-MB1/2. Se cortó M13-MB1/2RF con BamHI y SalI y se aisló el fragmento grande. El fragmento recuperado de 6819 pb se rellenó con enzima Klenow, se ligó a un enlazador HindIII 8mero, y se utilizó para transfectar células XL1-Blue^{(TM)} (Stratagene, La Jolla, CA) que se extendieron subsiguientemente en placas respecto a formación de calvas. Se preparó el RF DNA a partir de calvas seleccionadas y se eligió un clon, M13-MB1/2-delta, que contenía sitios regenerados BamHI y SalI y un nuevo sitio HindIII, todos ellos 500 pb aguas arriba del sitio BglII (6935).

Se introdujo un sitio NarI singular en los codones 17 y 18 del gen III (cambiando los aminoácidos de H-S a G-A, Cf. Tabla 110) en M13-MB1/2-delta:

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La presencia de un sitio singular NarI en el nucleótido 1630 se confirmó por análisis con enzimas de restricción; el nuevo vector es M13-MB1/2-delta-NarI. Se preparó el fago MK por clonación del fragmento de 1,3 kb BamHI Km^{R} del plásmido pUC4K (Pharmacia, Piscataway, NJ) en M13-MB1/2-delta-NarI. El fago MK se desarrolla satisfactoriamente como M13 de tipo salvaje, lo que indica que los cambios en el sitio de escisión de la proteína del gen III no son detectablemente deletéreos para el fago.

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Inserción del gen sintético BPTI

Se construyó el vector de expresión BPTI-III por medios estándar. La fusión sintética bpti-VIII contiene un sitio NarI que comprende los dos últimos codones de la región codificante de BPTI. Se introdujo un segundo sitio NarI aguas arriba de la región codificante de BPTI por ligación del adaptador que se muestra a M13-MB26 cortado con AccIII:

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La muestra de ligación se cortó luego con NarI y un fragmento de DNA de 180 pb que codificaba BPTI. El RF DNA del fago MK se digirió con NarI, se desfosforiló, y se ligó al fragmento de 180 pb. Se utilizaron muestras de ligación para transfectar XL1-Blue^{(TM)} que se extendieron en placas para calvas Km^{R}. El DNA, aislado del fago derivado de las calvas, se testó respecto a hibridación a una sonda de DNA bicatenario fosforilada con ^{32}P, correspondiente al gen BPTI. Se hicieron preparaciones RF en gran escala para clones que exhibieran una señal de hibridación fuerte. El análisis por digestión con enzimas de restricción confirmó la inserción de una sola copia del gen sintético BPTI en el gen III de MK para generar el fago MK-BPTI. La secuenciación subsiguiente del DNA confirmó que la secuencia del gen de fusión bpti-III es correcta y que el marco de lectura correcto se mantiene. la Tabla 116 muestra la región codificante entera, la traducción en secuencia de proteínas, y las partes funcionales de la cadena polipeptídica.

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Expresión del gen de fusión BPTI-III in vitro

Se añadió RF DNA de MK-BPTI a un extracto procariota acoplado de transcripción-traducción (Amersham). Se produjeron proteínas radiomarcadas recién sintetizadas y se separaron subsiguientemente por electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida al 15%. El DNA de MK-BPTI dirige la síntesis de una proteína de fusión del gen III no procesada que es 7 Kd más larga que el gen III WT, coherentemente con la inserción de 58 aminoácidos de BPTI en la proteína del gen III. Se inmunoprecipitaron las proteínas radiomarcadas a partir del extracto procariota exento de células. Ni la IgG anti(proteína VIII del gen M13) de conejo, ni la IgG normal de conejo eran capaces de inmunoprecipitar la proteína del gen III codificada por MK o por MK-BPTI. Sin embargo, la IgG anti-BPTI de conejo es capaz de precipitar la proteína del gen III codificada por MK-BPTI pero no por MK. Esto confirma que el aumento en tamaño de la proteína III codificada por MK-BPTI es atribuible a la inserción de la proteína BPTI.

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Análisis Western

Se recuperaron fagos de cultivos por precipitación con PEG. Para separar las células residuales, los fagos recuperados se resuspendieron en un tampón rico en sal y se centrifugaron, de acuerdo con las instrucciones para el kit de mutagénesis MUTA-GENE^{(R)} M13 in vitro (Número de Catálogo 170-3571, Bio-Rad, Richmond, CA). Se sometieron a electroforesis partes alícuotas de fago (que contenían hasta 40 \mug de proteína) en un gen de SDS-urea-poliacrilamida al 12,5% y las proteínas se electrotransfirieron a una hoja de Immobilon. Se desarrollaron transferencias Western utilizando suero de conejo anti-BPTI, que se había incubado previamente con un extracto de E. coli, seguido por anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado a fosfatasa alcalina. Se detecta una proteína inmunoreactiva de 67 Kd en las preparaciones del fago MK-BPTI pero no en las del fago MK. El tamaño de la proteína inmunoreactiva es coherente con el tamaño predicho de una proteína de fusión BPTI-III procesada (6,4 Kd + 60 Kd). Estos datos indican que los epítopes específicos de BPTI se presentan en la superficie del fago MK-BPTI pero no en la del fago MK.

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Neutralización del título de fago con anhidro-tripsina inmovilizada en agarosa

La anhidro-tripsina es un derivado de tripsina que tiene el sitio activo serina convertido en deshidroalanina. La anhidro-tripsina retiene la fijación específica de tripsina pero no la actividad de proteasa. Al contrario que los anticuerpos policlonales, no se espera que la anhidro-tripsina fije BPTI no plegado o fragmentos incompletos.

Los fagos MK-BPTI y MK se diluyeron a una concentración de 1,4\cdot10^{12} partículas por ml en tampón TBS (PARM88) que contenía 1,0 mg/ml de BSA. Se añadieron 30 \mul de fago diluido a 2, 5 ó 10 \mul de una suspensión espesa al 50% de anhidro-tripsina inmovilizada en agarosa (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) en tampón TBS/BSA. Después de la incubación a 25ºC, se separaron partes alícuotas, se diluyeron en caldo LB enfriado en hielo y se titularon respecto a unidades formadoras de calvas en un césped de células XL1-Blue^{(TM)}. La Tabla 114 muestra que la incubación del fago MK-BPTI con anhidro-tripsina inmovilizada da como resultado una pérdida muy importante de título durante un periodo de 4 horas, mientras que no se observa dicho efecto con el fago MK (control). La reducción en el título de fago es también proporcional a la cantidad de anhidro-tripsina inmovilizada añadida al fago MK-BPTI. La incubación con 5 \mul de una suspensión al 50% de estreptavidina inmovilizada en agarosa (Sigma, St. Louis, MO) en tampón TBS/BSA no reduce el título de ninguno de los fagos MK-BPTI o MK. Estos datos son coherentes con la presentación de una proteína BPTI funcional correctamente plegada en la superficie del fago MK-BPTI pero no en la del fago MK. Los dominios BPTI desplegados o incompletos no se espera que fijen anhidro-tripsina. Adicionalmente, los dominios BPTI desplegados se espera que sean inespecíficamente adherentes.

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Neutralización del título de fago con anticuerpo anti-BPTI

Los fagos MK-BPTI y MK se diluyeron a una concentración de 4\cdot10^{8} unidades formadoras de calvas por ml en caldo LB. Se añadieron 15 \mul de fago diluido a un volumen equivalente de suero anti-BPTI de conejo o suero normal de conejo (diluidos ambos 10 veces en caldo LB). Después de incubación a 37ºC, se tomaron partes alícuotas, se diluyeron por 10^{4} en caldo LB enfriado en hielo y se titularon respecto a pfus en un césped de XL1-Blue^{(TM)}. La incubación del fago MK-BPTI con suero anti-BPTI da como resultado una pérdida continua del título a lo largo de un periodo de dos horas, mientras que no se observa dicho efecto con el fago MK. Como era de esperar, el suero normal de conejo no reduce el título de ninguno de los fagos MK-BPTI o MK. Antes de la incubación del suero anti-BPTI con proteína BPTI auténtica pero no con una cantidad equivalente de proteína de E. coli, se bloquea la capacidad del suero para reducir el título del fago MK-BPTI. Estos datos con coherentes con la presentación de epítopes específicos de BPTI en la superficie del fago MK-BPTI pero no en la del fago MK. Dicho de un modo más específico, los datos indican que estos epítopes BPTI están asociados con la proteína del gen III y que la asociación de esta proteína de fusión con un anticuerpo anti-BPTI bloquea su capacidad para mediar la infección de las células.

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Neutralización del título de fago con tripsina

Los fagos MK-BPTI y MK se diluyeron a una concentración de 4\cdot10^{8} unidades formadoras de calvas por ml en caldo LB. Los fagos diluidos se añadieron a un volumen equivalente de tripsina diluido a diversas concentraciones en caldo LB. Después de la incubación a 37ºC, se separaron partes alícuotas, se diluyeron por 10^{4} en caldo LB enfriado en hielo y se titularon respecto a unidades formadoras de calvas en un césped de XL1-Blue^{(TM)}. La incubación del fago MK-BPTI con 0,15 \mug de tripsina da como resultado una pérdida del 70% en el título después de 2 horas, mientras que se observa solamente una pérdida de 15% en el título para el fago MK. Una reducción en la cantidad de tripsina añadida al fago da como resultado una reducción en la pérdida de título. Sin embargo, para todas las concentraciones de tripsina investigadas, los fagos MK-BPTI son más sensibles a la incubación con tripsina que el fago MK. Por tanto, la asociación de la proteína de fusión BPTI-III presentada en la superficie del fago MK-BPTI con tripsina bloquea su capacidad para mediar la infección de las células.

La reducción en el título de fago MK por tripsina es un ejemplo de un fenómeno que es probablemente general: las proteasas, en caso de estar presentes en cantidad suficiente, degradarán las proteínas en el fago y reducirán su infectividad. La presente solicitud enumera varios medios que pueden utilizarse para resolver este problema.

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Sistema de selección por afinidad Selección por Afinidad con Anhidro-Tripsina Inmovilizada

Los fagos MK-BPTI y MK se diluyeron a una concentración de 1,4\cdot10^{12} partículas por ml en tampón TBS (PARM88) que contenía 1,0 mg/ml de BSA. Se añadieron 4,0 x 10^{10} fagos a 5 \mul de una suspensión al 50% de perlas de anhidro-tripsina inmovilizadas en agarosa (Pierce Chemical Co.) o perlas de estreptavidina inmovilizadas en agarosa (Sigma) en TBS/BSA. Después de una incubación de tres horas a la temperatura ambiente, se redujeron las perlas a un sedimento por centrifugación durante 30 segundos a 5000 rpm en una microcentrífuga y se recogió la fracción sobrenadante. Las perlas se lavaron 5 veces con tampón TBS/Tween (PARM88) y después de cada lavado se redujeron las perlas a un sedimento por centrifugación y se retiró el sobrenadante. Finalmente, se resuspendieron las perlas en tampón de elución (HCl 0,1N que contenía 1,0 mg/ml de BSA ajustado a pH 2,2 con glicina) y después de una incubación de 5 minutos a la temperatura ambiente, se redujeron las perlas a un sedimento por centrifugación. El sobrenadante se separó y se neutralizó por adición de tampón Tris-HCl 1,0M, pH 8,0.

Se aplicaron partes alícuotas de las muestras de fago a una membrana Nytran utilizando un equipo de filtración Minifold de Schleicher y Schuell (Keene, NH) y se inmovilizó el DNA de fago en la membrana Nytran por estufado a 80ºC durante 2 horas. El filtro tratado en la estufa se incubó a 42ºC durante 1 hora en solución de prelavado (MANI82) y solución de pre-hibridación (5Prima-3Prima, West Chester, PA). El fragmento de DNA de 1,0 Kb NarI (base 1630)/XmnI (base 2646) de MK RF se marcó radiactivamente con ^{32}P-dCTP utilizando un kit de oligomarcación (Pharmacia, Piscataway, NJ). La sonda radiactiva se añadió al filtro Nytran en solución de hibridación (5Prima-3Prima) y, después de incubación durante una noche a 42ºC, se lavó y se autorradiografió el filtro.

La eficiencia de este sistema de selección por afinidad puede determinarse semi-cuantitativamente utilizando un procedimiento de hibridación puntual. La exposición de las perlas de anhidro-tripsina tratadas con fago MK-BPTI a tampón de elución libera el fago MK-BPTI fijado. Las perlas de estreptavidina no retienen el fago MK-BPTI. Las perlas de anhidro-tripsina no retienen el fago MK. En el experimento representado en la Tabla 115, se estima que 20% de los fagos MK-BPTI totales estaban fijados a 5 \mul de la anhidro-tripsina inmovilizada y se recuperaban subsiguientemente por lavado de las perlas con tampón de elución (pH 2,2 HCl/glicina). En las mismas condiciones, no se fijaba fago MK-BPTI detectable alguno y se recuperaba subsiguientemente de las perlas de estreptavidina. La cantidad de fago MK-BPTI recuperada en la fracción de elución es proporcional a la cantidad de anhidro-tripsina inmovilizada añadida al fago. No se fijaba fago MK detectable alguno a las perlas inmovilizadas de anhidro-tripsina o estreptavidina y no se recuperó fago alguno con tampón de elución. Estos datos indican que el sistema de selección por afinidad arriba descrito puede utilizarse para seleccionar respecto a fagos que presentan una proteína específica plegada
(en este caso, BPTI). No es de esperar que los dominios BPTI desplegados o incompletos fijen anhidro-tripsina.

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Selección por Afinidad con Anticuerpos Anti-BPTI

Los fagos MK-BPTI y MK se diluyeron a una concentración de 1\cdot10^{10} partículas por ml en solución salina tamponada con Tris (PARM88) que contenía 1,0 mg/ml de BSA. Se añadieron 2\cdot10^{8} fagos a 2,5 \mug de IgG anti-BPTI biotinilada de conejo en TBS/BSA o anticuerpo IgG biotinilado anti-ratón de conejo (Sigma) en TBS-BSA, y se incubaron durante una noche a 4ºC. Una suspensión al 50% de estreptavidina-agarosa (Sigma) se lavó tres veces con tampón TBS antes de incubación con 30 mg/ml de BSA en tampón TBS durante 60 minutos a la temperatura ambiente, se lavó tres veces con tampón TBS-Tween (PARM88) y se resuspendió a una concentración final de 50% en este tampón. Las muestras que contenían fago e IgG biotinilada se diluyeron con TBS/Tween antes de la adición de estreptavidina-agarosa en tampón TBS/Tween. Después de una incubación de 60 minutos a la temperatura ambiente, las perlas de estreptavidina-agarosa se redujeron a un sedimento por centrifugación durante 30 segundos y se recogió la fracción sobrenadante. Las perlas se lavaron 5 veces con tampón TBS/Tween y, después de cada lavado, se redujeron las perlas a un sedimento por centrifugación y se separó el sobrenadante. Finalmente, las perlas estreptavidina-agarosa se resuspendieron en tampón de elución (HCl 0,1N que contenía 1,0 mg/ml de BSA ajustado a pH 2,2 con glicina), se incubaron 5 minutos a la temperatura ambiente, y se peletizaron por centrifugación. Se retiró el sobrenadante y se neutralizó por adición de tampón Tris-HCl 1,0M, pH 8,0.

Se aplicaron partes alícuotas de las muestras de fago a una membrana Nytran utilizando un aparato Minifold Schleicher y Schuell. Se inmovilizó el DNA de fago en la membrana Nytran por estufado a 80ºC durante 2 horas. Se lavaron los filtros durante 60 minutos en solución de prelavado (MANI82) a 42ºC y se incubaron luego a 42ºC durante 60 minutos en solución de pre-hibridación Southern (5Prima-3Prima). El fragmento de DNA de 1,0 Kd NarI (1630 pb)/XmnI (2646 pb) de MK RF se marcó radiactivamente con ^{32}P-\alpha dCTP utilizando un kit de oligomarcación (Pharmacia, Piscataway, NJ). Las membranas Nytran se transfirieron de la solución de pre-hibridación a una solución de hibridación Southern (5Prima-3Prima) a 42ºC. Se añadió la sonda radioactiva a la solución de hibridación y, después de incubación durante una noche a 42ºC, se lavó el filtro tres veces 2 x SSC, 0,1% SDS a la temperatura ambiente y una sola vez a 65ºC en 2 x SSC, 0,1% SDS. Las membranas Nytran se sometieron a autorradiografía. La eficiencia del sistema de selección por afinidad puede determinarse semi-cuantitativamente utilizando el procedimiento de hibridación puntual anterior. La comparación de las manchas A1 y B1 o C1 y D1 indica que la mayoría del fago no se pegaba a las perlas estreptavidina-agarosa. El lavado con tampón TBS/Tween separa la mayor parte de los fagos que están asociados inespecíficamente con perlas de estreptavidina. La exposición de las perlas de estreptavidina a tampón de elución libera el fago fijado únicamente en el caso de los fagos MK-BPTI que se han incubado previamente con IgG anti-BPTI biotinilada de conejo. Estos datos indican que el sistema de selección por afinidad arriba descrito puede utilizarse para seleccionar fago que presente un antígeno específico (en este caso BPTI). Se estima un factor de enriquecimiento de al menos 40 veces basado en el cálculo:

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Ejemplo III Extensiones de los límites BPTI:VIII

Para aumentar la flexibilidad entre BPTI y gVIIIp maduro, se introdujeron codones para extensiones peptídicas entre estos dominios.

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Adición de extensiones de bloques a la interfaz de la proteína de fusión

El producto del gen III de M13 contiene regiones "semejantes a tallos" como implica la visualización micrográfica electrónica del bacteriófago (LOPE85). La secuencia de aminoácidos predicha de esta proteína contiene motivos repetitivos, que incluyen:

glu.gly.gly.gly.ser (EGGGS) siete veces

gly.gly.gly.ser (GGGS) tres veces

glu.gly.gly.gly.thr (EGGGT) una vez.

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La finalidad de esta sección fue insertar, en la interfaz del dominio, extensiones de unidades múltiples que reflejaran especularmente los motivos repetitivos observados en el producto del gen III.

Se sintetizaron dos oligonucleótidos sintéticos. Se seleccionó la tercera base de estos codones a fin de que la traducción del oligonucleótido en la dirección opuesta produjera SER. Cuando se reasocian los oligonucleótidos sintéticos, dan la secuencia dúplex unitaria siguiente (un enlazador EGGGS):

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El dúplex tiene un saliente 5' común de dos pares de bases (GC) en ambos extremos del enlazador, lo que permite para ambos la ligación de unidades múltiples y la posibilidad de clonarse en la secuencia de reconocimiento singular NarI presente en los OCV's M13MB48 y Gem MB42. Este sitio está posicionado a la distancia de 1 codón del DNA que codifica la interfaz. La clonación de un enlazador EGGGS (o enlazador múltiple) en el sitio del vector NarI destruye esta secuencia de reconocimiento. La inserción del enlazador EGGGS en orientación inversa conduce a la inserción de GSSSL en la proteína de fusión.

La adición de un solo enlazador EGGGS en el sitio NarI del gen representado en la Tabla 113 conduce al gen siguiente:

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Obsérvese que no existe preselección alguna para la orientación del o de los enlazadores insertados en el OCV y que podrían existir enlazadores múltiples de cualquier orientación (con la secuencia de aminoácidos predicha EGGGS o GSSSL) o una mezcla de orientaciones (repeticiones invertidas de DNA).

Se estableció una escalera de enlazadores múltiples de longitud creciente por reasociación y ligación de los dos oligonucleótidos de partida que contenían diferentes proporciones de extremos 5' fosforilados y no fosforilados. La lógica subyacente en este contexto es que la ligación procede desde el extremo 3' no fosforilado de un oligonucleótido al extremo 5' fosforilado de otro. El uso de una mezcla de oligonucleótidos fosforilados y no fosforilados permite la formación de un elemento de control en toda la extensión de la formación del enlazador múltiple. Una escalera que muestra una gama de tamaños de inserción era detectada fácilmente por electroforesis en gel de agarosa que abarcaba 15 pb (1 unidad dúplex-5 aminoácidos) hasta más de 600 pares de bases (40 enlazadores ligados-200 aminoácidos).

Repeticiones invertidas largas pueden conducir a inestabilidad genética. Por ello, los autores de la invención seleccionaron eliminarlas, antes de ligación al OCV, por digestión de la población de enlazadores múltiples con las enzimas de restricción AccIII o XhoI, dado que los enlazadores, cuando se ligan "cabeza con cabeza" o "cola con cola", generan estas secuencias de reconocimiento. Dicha digestión reduce significativamente el intervalo de tamaños de los enlazadores múltiples a un valor comprendido entre 1 y 8 unidades enlazadoras (es decir entre 5 y 40 aminoácidos en pasos de 5), como se evaluó por electroforesis en gel de agarosa.

Los enlazadores se ligaron (como una agrupación de tamaños de inserción diferentes o como fragmentos discretos purificados en gel) en los OCVs escindidos con NarI M13MK48 o GemMB42 utilizando métodos estándar. Después de ligación, se añadió la enzima de restricción NarI para separar el OCV auto-ligante de partida (dado que la inserción del enlazador destruye la secuencia de reconocimiento de NarI). Se utilizó esta mezcla para transformar células XL-1 Blue y se extendió adecuadamente para calvas (OCV M13MB48) o colonias resistentes a ampicilina (OCV GemMB42).

Los transformantes se cribaron utilizando análisis de DNA por hibridación puntual con una de dos sondas oligonucleotídicas marcadas con ^{32}P. Una sonda estaba constituida por una secuencia complementaria al DNA codificante del bucle P1 de PBTI, mientras que la segunda tenía una secuencia complementaria al DNA codificante de la región interfaz del dominio. Los candidatos enlazadores adecuados se sondarían positivamente con la primera sonda y negativamente o deficientemente con la segunda. Se utilizaron clones purificados de calvas para generar stocks de fago para análisis de fijación y presentación de BPTI, mientras que el RF DNA derivado de células infectadas con fago se utilizó para análisis con enzimas de restricción y secuenciación. Las secuencias de inserción representativas de clones seleccionados analizadas son como sigue:

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Se cree que estos enlazadores oligómeros, muy flexibles, son útiles para unir un dominio de fijación a la proteína principal de la cubierta (gen VIII) de fagos filamentosos a fin de facilitar la presentación del dominio de fijación en la superficie del fago. Los mismos pueden ser también útiles en la construcción de OSPs quiméricos asimismo para otros paquetes genéticos.

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Incorporación en fago de proteínas de fusión con extensión interdominios

Se utilizó una agrupación de fagos que contenía una extensión pentapeptídica diversificada en la interfaz BPTI:proteína de la cubierta para infectar células SEF'. Utilizando los criterios de la sección anterior, se determinó que las proteínas de fusión extendidas se incorporaban en el fago. La electroforesis en gel del fago generado, seguida por tinción con plata o análisis Western con suero de conejo anti-BPTI, mostró proteínas de fusión que migraban análogamente a, pero de modo sensiblemente más lento que, la proteína de fusión de partida.

Con relación a las extensiones de "enlazador EGGGS" de la interfaz de dominio, se analizaron de manera análoga stocks de fago individuales que se había predicho contendrían una o más extensiones de unidades de 5 aminoácidos. La migración de las proteínas de fusión extendidas era fácilmente distinguible de la proteína de fusión parental cuando se examinaba por análisis Western o tinción con plata. Los clones analizados con mayor detalle incluían M13.3x4 (que contiene un solo enlazador EGGGS invertido con una secuencia de aminoácidos predicha de GSSSL), M13.3x7 (que contiene un enlazador correctamente orientado con una secuencia de aminoácidos predicha de EGGGS), M13.3x11 (que contiene tres enlazadores con una inversión y una secuencia de aminoácidos predicha para la extensión de EGGGSGSSSLGSSSL) y M13.3xd que contiene una extensión constituida por al menos 5 enlazadores de 25 aminoácidos.

Las proteínas de fusión extendidas se incorporaron todas ellas en fago a niveles altos (como promedio estaban presentes 10's de copias por fago y, cuando se analizaron por electroforesis en gel, migraban en tasas coherentes con el tamaño predicho de la extensión). Los clones M13.3x4 y M13.3x7 migraban a una posición muy similar pero discerniblemente diferente de la proteína de fusión parental, mientras que M13.3x11 y M13.3xd eran notablemente mayores.

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Ejemplo IV Fago peptídico

En los ejemplos que siguen se utilizaron los materiales y métodos siguientes.

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1. Fago peptídico

HPQ6, una mini-proteína supuesta enlazada por disulfuros, se presentaba en el fago M13 como una inserción en la proteína del gen III (gIIIp). M13 tiene aproximadamente 5 copias de gIIIp por virión. Los fagos se construyeron por métodos estándar. HPQ6 incluye la secuencia CHPQFPRC característica del péptido E de fijación de estreptavidina de Devlin (DEVL90), así como un sitio de reconocimiento F.X_{a} (véase la Tabla 820). Se demostró que los fagos HPQ6 se fijaban a estreptavidina.

Se utilizó como control un fago de presentación inconexo sin afinidad alguna para estreptavidina, MKTN.

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2. Estreptavidina

Disponible comercialmente, inmovilizada en perlas de agarosa (Pierce). La estreptavidina (StrAv) inmovilizada en perlas de agarosa al 6% a una concentración de 1 a 2 mg por ml de gel, se proporcionó como una suspensión espesa al 50%. Disponible también como proteína libre (Pierce) con una actividad específica de 14,6 unidades por mg (1 unidad fijará 1 \mug de biotina). Se prepara una solución stock de 1 mg por ml en PBS que contiene 0,01% de azida.

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3. D-Biotina

Disponible comercialmente (Boehringer Mannheim) en forma cristalizada. Se prepara una solución stock de 4 mM.

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4. Recubrimiento con estreptavidina de las placas de pocillos de microtitulación

Se utilizan tiras o placas Immulon (#2 o #4). Se añaden 100 \mul de stock StrAv a cada pocillo de 250 \mul de capacidad y se incuban durante una noche a 4ºC. Se retira el stock y se reemplaza con 250 \mul de PBS que contiene BSA a una concentración de 1 mg por ml, y se deja a 4ºC durante una hora más. Antes de utilizarlos en un ensayo de fijación de fagos, los pocillos se lavan rápidamente 5 veces con 250 \mul de PBS que contiene 0,1% de Tween.

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5. Ensayos de Fijación Ensayo de Perlas

Entre 10 y 20 \mul de la suspensión de perlas StrAv (5 a 10 \mul de volumen de perlas) se lavan 3 veces con tampón de fijación (TBS que contiene BSA a una concentración de 1 mg por ml) inmediatamente antes del ensayo de fijación. Se añaden a cada microtubo 50 a 100 \mul de tampón de fijación que contiene fago de control o fago de presentación de péptido (10^{8} a 10^{11} unidades totales formadoras de calvas - pfu's). Se deja que transcurra la fijación durante 1 hora a la temperatura ambiente utilizando un rotor punta con punta. Las perlas se centrifugan brevemente y se retira el sobrenadante. Se lavan las perlas cinco veces más con 1 ml de TBS que contiene 0,1% de Tween, consistiendo cada lavado en una incubación de 5 minutos y una centrifugación breve. Finalmente, los fagos fijados se eluyen de las perlas StrAv por una incubación de 10 minutos con tampón de citrato de Ph 2 que contiene 1 mg por ml de BSA, y que se neutraliza subsiguientemente con 260 \mul de Tris 1M de pH 8. El número de fagos presente en cada paso se determina como unidades formadoras de calvas (pfu's) después de diluciones apropiadas y extensión en placas en un césped de F' que contiene E. coli.

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Ensayo de placas

Se añaden a cada pocillo recubierto con StrAv 100 \mul de tampón de fijación (PBS con 1 mg por ml de BSA) que contiene una cantidad conocida de fago (entre 10^{8} y 10^{11} pfu's). La incubación transcurre durante 1 hora a la temperatura ambiente, seguida por eliminación del fago no fijado y 10 lavados rápidos con PBS y 0,1% de Tween. Los fagos fijados se eluyen con 250 \mul de tampón de citrato de pH 2 que contiene 1 mg por ml de BSA y neutralización con 60 \mul de Tris 1M de pH 8. El número de fagos presentes en cada paso se determina como unidades formadoras de calvas (pfu's) después de diluciones apropiadas y extensión en placas en un césped de F' que contiene E. coli.

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Ejemplo V Efecto del Ditiotreitol (DTT) sobre la Fijación del Fago de Presentación a Estreptavidina-Agarosa Experimentos preliminares de control a. Utilización de biotina conjugada con HRP y perlas de estreptavidina

Se determinó que la capacidad de fijación de las perlas de agarosa StrAv para biotina conjugada con HRP era \approx1 \mug (equivalente a \approx150 pmol de biotina) por cada 5 \mul de perlas (la cantidad utilizada en estos experimentos).

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b. Efecto del DTT sobre la fijación de biotina conjugada con HRP a las perlas StrAv

Se incubaron 5 \mul de perlas StrAv con 10 ng de biotina-HRP en tampón de fijación (TBS-BSA) en presencia de cantidades variables de DTT (reducidas al menos en un 99%). Después de una incubación de 15 minutos a la temperatura ambiente, se lavaron dos veces las perlas en tampón de fijación y se añadió un sustrato de HRP. Se dejó que transcurriera el revelado del color y se anotó de una manera semicuantitativa. La Tabla 827 muestra que la fijación de la peroxidasa de rábano picante biotinilada (HRP) no se ve afectada en gran medida por concentraciones de DTT inferiores a 20 mM. N.B. Las concentraciones de DTT de 20 y 50 mM inhibían también la interacción de HRP y sustrato en ausencia de perlas de StrAv, teniendo por tanto un efecto general negativo en este sistema.

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Efecto de DTT sobre la infectividad del fago de presentación HPQ6

Se añadieron 10^{8} pfu's de HPQ6 a tampón de fijación (TBS-BSA) en presencia de diferentes concentraciones de DTT. Se incubaron a la temperatura ambiente durante 1 hora y luego se diluyeron y se extendieron en placas para determinar el título como pfu's. La Tabla 828 muestra el efecto de DTT sobre la infectividad del fago HPQ6. Por tanto, o bien DTT no tiene efecto alguno sobre las infectividades de los fagos a lo largo de esta gama de concentraciones, o los efectos se invierten por dilución del fago. A partir de estos experimentos de control resulta evidente que puede utilizarse DTT a concentraciones inferiores a 10 mM en estudios acerca del efecto de los agentes reductores sobre la fijación del fago de presentación de péptido a StrAv.

La Tabla 829 muestra el efecto de DTT sobre la fijación de los fagos HPQ6 y MKTN a las perlas StrAv. El efecto más significativo de DTT sobre la fijación de HPQ6 a StrAv ocurría entre 0,1 y 1,0 mM DTT, una concentración para la cual no se observaba efecto negativo alguno en los experimentos de control preliminares. Estos resultados indican claramente que, en el caso del fago de presentación HPQ6, DTT tiene un efecto acusado sobre la fijación a StrAv y que la presencia de un potente disulfuro en el péptido presentado es un requerimiento para una buena fijación.

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Ejemplo VI Liberación del fago de presentación fijado a estreptavidina por escisión del factor Xa

El fago HPQ6 contiene un sitio de reconocimiento F.X_{a} de bovino (YIEGR/IV). En muchos casos, IEGR es un sitio de reconocimiento suficiente para F.X_{a}, pero los autores de la invención han extendido el sitio en ambas direcciones para facilitar una escisión eficiente. El efecto de la preincubación del fago HPQ6 con F.X_{a} en cuanto a la fijación a las perlas StrAv se muestra en la Tabla 832. Así, si bien esta concentración de F.X_{a} (2,5 unidades) no tenía efecto medible alguno sobre el título del fago de presentación tratado, la misma tenía un efecto muy acusado sobre la capacidad del fago de presentación tratado para fijarse a StrAv. Esto es coherente con la secuencia de reconocimiento de StrAv que se separa por la acción de F.X_{a}, reconociendo y escindiendo la secuencia YIEGR/IV.

La Tabla 833 muestra el efecto del tratamiento con F.X_{a} de HPQ6 después de fijación a StrAv. ¿Es posible separar el fago de presentación fijado a su diana por el uso de F.X_{a} en lugar de pH o elución de agente caotrópico? Se dejó que los fagos de presentación HPQ6 se fijaran a StrAv y se incubaron luego o bien en tampón F.X_{a} o en el mismo tampón junto con 2,5 unidades de F.X_{a} durante 3 horas. La cantidad eluida se comparó con el número total de fagos fijado a juzgar por una elución a pH 2. Por consiguiente, mientras los fagos de presentación se separan lentamente en el tampón solo, la presencia de F.X_{a} aumenta significativamente esta tasa.

La eliminación del fago de presentación HPQ6 de StrAv por F.X_{a} se estudió también como función de la cantidad de enzima añadida y el tiempo de incubación, como se muestra en la Tabla 834. N.B. para concentraciones mayores de la enzima (1,2 U durante 1 hora o 2,5 U durante 2 horas), se observó una pérdida de infectividad del fago tratado tal como se midió por pfu's.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 10 Abundancias obtenidas de diversos codones vg

19

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TABLA 10 (continuación)

21

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TABLA 10 (continuación)

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TABLA 10 (continuación)

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TABLA 10 (continuación)

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TABLA 102b Secuencia anotada de gen después de inserción del enlazador SalI

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TABLA 102b (continuación)

31

32

TABLA 102b (continuación)

33

Anótense las equivalencias de enzima siguientes:

34

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TABLA 107 Análisis de transcripción/traducción in vitro de especies señal codificada por vector ::BPTI::proteína VIII madura

36

TABLA 108 Análisis Western^{a} de especies señal:: BPTI::proteína madura VIII expresadas in vivo

37

TABLA 109 Gen III de M13

38

TABLA 110 Introducción de NarI en el gen III

39

TABLA 113 Secuencia Anotada del gen Ptac::RBS (GGAGGAAATAAA)::Señal phoA::bpti maduro:: Señal-phoA::BPTI maduro::proteína de la cubierta madura

40

TABLA 113 (continuación)

41

TABLA 113 (continuación)

42

TABLA 114 Neutralización del Título de Fago Utilizando Anhidro-Tripsina Inmovilizada en Agarosa

43

TABLA 115 Selección por Afinidad del Fago MK-BPTI sobre Anhidro-Tripsina Inmovilizada

44

TABLA 116 Traducción de señal-III::bpti::III madura

45

TABLA 116 (continuación)

46

TABLA 116 (continuación)

47

TABLA 116 (continuación)

48

TABLA 116 (continuación)

50

TABLA 130 Muestreo de una Biblioteca codificada por (NNK)^{6}

51

TABLA 130 (continuación)

52

TABLA 130 (continuación)

53

TABLA 130 (continuación)

54

TABLA 130 (continuación)

55

TABLA 130 (continuación)

56

TABLA 130 (continuación)

57

TABLA 130 (continuación)

58

TABLA 131 Muestreo de una biblioteca codificada por (NNT)^{4}(NNG)^{2}

59

TABLA 131 (continuación)

62

TABLA 131 (continuación)

63

TABLA 131 (continuación)

64

TABLA 132 Eficiencias relativas de varios codones de diversificación simples

65

TABLA 140 Efecto de IgG anti-BPTI sobre el título de fago

66

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TABLA 141 Efecto de anti-BPTI o proteína A sobre el título de fago

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TABLA 142 Efecto de anti-BPTI y suero no inmune sobre el título de fago

68

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TABLA 143 Pérdida en título de fago de presentación con anhidrotripsina

69

TABLA 144 Fijación del Fago de Presentación a Anhidrotripsina

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TABLA 145 Fijación del Fago de Presentación a anhidrotripsina o Tripsina

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TABLA 146 Fijación del Fago de Presentación a Tripsina o Elastasa de Neutrófilos Humanos

73

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TABLA 820 Fago de Fijación de Estreptavidina

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TABLA 827 Efecto de DTT sobre la fijación de HRP biotinilada a estreptavidina-agarosa

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TABLA 828 Efecto de DTT sobre la infectividad del fago de presentación HPQ6

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TABLA 829 Efecto de la presencia de DTT sobre la fijación de fago de presentación a perlas estreptavidina-agarosa

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TABLA 832 Efecto de la preincubación del fago de presentación HPQ6 con factor X_{a} sobre la fijación a perlas de estreptavidina

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TABLA 833 Tratamiento con FX_{a} del fago de presentación HPQ6 después de fijación a estreptavidina

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TABLA 834 Separación del fago de presentación HPQ6 de estreptavidina por FX_{a}

80

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Citas

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Las páginas 140-148 siguientes se refieren a realizaciones preferidas de la invención, en donde el término "reivindicación" quiere decir "realización".

Claims

1. Un método para identificar proteínas de fijación que se fijan a una diana, comprendiendo el método los pasos de

(a) proporcionar una biblioteca de fagos filamentosos, en donde

(i): cada fago en la biblioteca presenta en su superficie al menos una copia de una proteína quimérica de la cubierta codificada por un primer gen de fago, en donde la proteína quimérica de la cubierta comprende un dominio de fijación potencial que es un mutante de un dominio proteínico conocido extraño a dicho fago, y en donde dicho fago comprende adicionalmente un segundo gen de fago que codifica la proteína nativa de la cubierta del fago;

(ii): cada fago en la biblioteca comprende al menos una copia de una proteína quimérica de la cubierta codificada por un primer gen de fago, en donde la proteína quimérica de la cubierta se presenta en la superficie del fago, en donde la proteína quimérica de la cubierta comprende un dominio de fijación potencial que es un mutante de un dominio proteínico conocido extraño a dicho fago, en donde cada fago comprende un segundo gen de fago que comprende un codón de leucina como codón de iniciación y que codifica la proteína nativa de la cubierta del fago;

: o

(iii): cada fago en la biblioteca presenta en su superficie al menos una copia de una proteína quimérica de la cubierta codificada por un primer gen de fago, en donde la proteína quimérica de la cubierta comprende un dominio de fijación potencial que es un mutante de un dominio proteínico conocido extraño a dicho fago, y en donde la proteína quimérica de la cubierta comprende un fragmento susceptible de ensamblamiento de una proteína de la cubierta de dicho fago sin la porción de pelos de la proteína de la cubierta;

(b) poner en contacto dicha biblioteca de fagos filamentosos con la diana; y

(c) separar los fagos sobre la base de su afinidad para la diana.

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2. El método de la reivindicación 1, alternativa (i), en donde el dominio de fijación potencial comprende un epítope potencial.

3. El método de cualquiera de la reivindicación 1, alternativa (i), y la reivindicación 2, en donde el primer gen de fago comprende adicionalmente una secuencia señal de secreción citoplásmica que codifica un péptido señal, en donde la secuencia señal de secreción se selecciona del grupo constituido por las secuencias señal de los genes phoA, bla y geneIII.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el péptido señal dirige una proteína codificada por el primer gen de fago a la membrana interna de la célula hospedadora bacteriana infectada por dicho fago, en donde el péptido señal se separa, dando como resultado una proteína madura quimérica de la cubierta.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la proteína madura quimérica de la cubierta comprende al menos una porción de una proteína del gen VIII del fago.

6. El método de la reivindicación 5, en donde dicha proteína quimérica se ensambla con una proteína de tipo salvaje de la cubierta del fago en la cubierta del fago.

7. El método de la reivindicación 1, alternativa (ii), en donde el dominio de fijación potencial comprende un epítope potencial.

8. El método de cualquiera de la reivindicación 1, alternativas (i) o (ii), y las reivindicaciones 2-7, en donde los dominios de fijación potenciales comprenden al menos una variación parcialmente aleatoria de una o más posiciones predeterminadas de aminoácidos de dicho dominio conocido para obtener aleatoriamente en cada una de dichas posiciones un aminoácido perteneciente a un conjunto predeterminado de dos o más aminoácidos, presentándose los aminoácidos de cada conjunto en dicha posición en proporciones predeterminadas esperadas, dando así como resultado una diferenciación entre los dominios de fijación potenciales.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la diferenciación entre dichos dominios de fijación potenciales de dicha biblioteca está limitada a no más de aproximadamente 20 residuos de aminoácidos predeterminados de una secuencia de aminoácidos que codifica el dominio.

10. El método de la reivindicación 9, en donde para cada conjunto, la relación de la probabilidad de aparición del aminoácido más favorecido a la del aminoácido menos favorecido es menor que aproximadamente 2,6.

11. El método de cualquiera de la reivindicación 1, alternativas (i) o (ii), y las reivindicaciones 2-10, en donde para cualquier dominio de fijación potencial, la probabilidad de que el mismo sea presentado por al menos un fago en dicha población es al menos 50%.

12. El método de cualquiera de la reivindicación 1, alternativas (i) o (ii), y las reivindicaciones 2-11, en donde para cualquier dominio de fijación potencial, la probabilidad de que el mismo sea presentado por al menos un fago en dicha población es al menos 90%.

13. El método de cualquiera de la reivindicación 1, alternativas (i) o (ii), y las reivindicaciones 2-12, en donde dicha biblioteca de fagos filamentosos se caracteriza por la presentación de al menos 10^{5} dominios de fijación potenciales diferentes.

14. El método de cualquiera de la reivindicación 1, alternativas (i) o (ii), y las reivindicaciones 2-13, en donde el dominio de fijación potencial se selecciona del grupo constituido por (a) dominios de fijación de inhibidor de la tripsina pancreática de bovino, crambina, inhibidor III de la tripsina de Cucurbita maxima, una enterotoxina termoestable de Escherichia coli, una alfa-, mu- u omega-conotoxina, apamina, caribdotoxina, inhibidor de la proteasa secretora de los leucocitos, cistatina, eglina, inhibidor de la proteasa de cebada, ovomucoide, lisozima T4, lisozima de clara de huevo de gallina, ribonucleasa, azurina, factor de necrosis tumoral, y CD4, y (b) dominios al menos sustancialmente homólogos con cualquiera de los dominios precedentes y que tienen un punto de fusión de al menos 50ºC.

15. Un método para identificar epítopes que se fijan en una diana, comprendiendo el método los pasos de

(a): proporcionar una biblioteca de fagos filamentosos, en donde cada fago en la biblioteca comprende un primer gen de fago y un segundo gen de fago, en donde cada fago expresa en su superficie al menos una copia de una proteína quimérica de la cubierta que comprende un epítope potencial, en donde la proteína quimérica de la cubierta está codificada por el primer gen de fago, y en donde cada fago expresa en su superficie la proteína de tipo salvaje de la cubierta del fago codificada por el segundo gen de fago;

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: cada fago en la biblioteca expresa en su superficie al menos una copia de una proteína quimérica de la cubierta que comprende un epítope potencial, en donde la proteína quimérica de la cubierta está codificada por un primer gen de fago, y en donde cada fago comprende adicionalmente un segundo gen de fago que comprende un codón de leucina como codón de iniciación y que codifica la proteína nativa de la cubierta del fago;

(b): poner en contacto dicha biblioteca de fagos filamentosos con la diana; y

(c): separar los fagos sobre la base de su afinidad para la diana.

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16. El método de cualquiera de la reivindicación 15, alternativas primera y segunda, en donde el primer gen de fago comprende una secuencia señal de secreción citoplásmica que codifica un péptido señal, en donde la secuencia señal de secreción se selecciona del grupo constituido por las secuencias señal de los genes phoA, bla y geneIII.

17. El método de la reivindicación 16, en donde el péptido señal dirige una proteína codificada por el primer gen de fago a la membrana interna de la célula hospedadora bacteriana infectada por dicho fago, en donde el péptido señal se separa, dando como resultado una proteína madura quimérica de la cubierta.

18. El método de la reivindicación 17, en donde la proteína madura quimérica de la cubierta comprende al menos una porción de una proteína del gen VIII del fago.

19. El método de la reivindicación 17, en donde dicha proteína quimérica está ensamblada con una proteína de tipo salvaje de la cubierta del fago en la cubierta del fago.

20. El método de la reivindicación 1, alternativa (i), en donde la proteína quimérica de la cubierta comprende un fragmento susceptible de ensamblamiento de una proteína de la cubierta de dicho fago sin la producción de pelos de la proteína de la cubierta.

21. El método de la reivindicación 1, alternativa (i), en donde el segundo gen de fago comprende adicionalmente un codón de leucina como codón de iniciación.

22. El método de la reivindicación 1, alternativa (iii), en donde cada fago comprende adicionalmente un segundo gen de fago que codifica la proteína nativa de la cubierta del fago.

23. El método de la reivindicación 1, alternativa (iii), en donde cada fago comprende adicionalmente un segundo gen de fago que comprende un codón de leucina como codón de iniciación y que codifica la proteína nativa de la cubierta del fago.