KR102554634B1 - L1cam에 결합하는 신규한 결합 분자 특히 항체(cd171) - Google Patents

L1cam에 결합하는 신규한 결합 분자 특히 항체(cd171) Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일클론항체 L1-OV52.24에 의해 인식되는 동일한 L1 에피토프에 결합할 수 있고/있거나 L1에의 결합에 대하여 단일클론항체 L1-OV52.24와 경쟁하는 L1에 결합하는 결합 분자, 그의 용도 및 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이며, 여기에서 L1-OV52.24의 경쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 1에 따른 시퀀스를 포함하거나 여기에서 경쇄가 시퀀스 동정 번호: 3에 의해 인코딩되고, 여기에서 L1-OV52.24의 중쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 2에 따른 시퀀스를 포함하거나 여기에서 중쇄가 시퀀스 동정 번호: 4, 결합 분자를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된다.

Description

L1CAM에 결합하는 신규한 결합 분자 특히 항체(CD171) {BINDING MOLECULES, ESPECIALLY ANTIBODIES, BINDING TO L1CAM (CD171)}
본 발명은 단일클론항체 L1-OV52.24에 의해 인식되는 동일한 L1 에피토프에 결합할 수 있고/있거나 L1에의 결합에 대하여 단일클론항체 L1-OV52.24와 경쟁하는 L1에 결합하는 결합 분자, 그의 용도 및 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이며, 여기에서 L1-OV52.24의 경쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 1에 따른 시퀀스를 포함하거나 여기에서 경쇄가 시퀀스 동정 번호: 3에 의해 인코딩되고, 여기에서 L1-OV52.24의 중쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 2에 따른 시퀀스를 포함하거나 여기에서 중쇄가 시퀀스 동정 번호: 4, 결합 분자를 인코딩하는 핵산에 의해 인코딩된다.
단일클론항체 (mAb)는 암 요법을 위한 신규하고도 중요한 기둥으로서 출현하였다 (Galluzzi L, Vacchelli E, Fridman WH, Galon J, Sautes-Fridman C, Tartour E, Zucman-Rossi J, Zitvogel L, Kroemer G: Trial Watch: monoclonal antibodies in cancer therapy. Oncoimmunology 2012, 1(1):28-37.). 지난 20여년 동안 분자 생물학은 주요 악성 질환의 치료를 위한 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 완전 인간 항체를 생성하기 위한 수단을 제공하여 왔다 (Presta LG: Molecular engineering and design of therapeutic antibodies. Curr Opin Immunol 2008, 20(4):460-470.). 지금까지, 많은 항체 및 항체-콘쥬게이트가 유럽 및 미국에서 시판을 위한 암 치료제로서 승인되었다 (Reichert JM: Marketed therapeutic antibodies compendium. MAbs 2012, 4(3)., Reichert JM: Antibodies to watch in 2014: mid-year update. mAbs 2014, 6(4):799-802.). 이들에는 미변성 항체, 항체-약물 콘쥬게이트와 마찬가지로 방사선 핵종 및 이중특이성 항체와의 콘쥬게이트가 포함된다 (Reichert JM: Antibody-based therapeutics to watch in 2011. MAbs 2011, 3(1):76-99.). 그러나, 주어진 암 항원에 대한 mAb가 표적 암 세포에 대한 그들의 능력에서 다를 수 있다는 것은 상당히 잘 알려져 있다.
최근의 연구에서 본 발명자들은 L1CAM (또한 L1으로도 불리움)이 인간 암에 대한 뛰어난 표적 분자일 수 있음을 입증하였다. L1CAM은 많은 인간 암에서 과발현되고, 좋지 않은 예후를 부여하고 세포 운동성, 침습 및 전이를 증가시킨다. 이종이식편 (Wolterink S, Moldenhauer G, Fogel M, Kiefel H, Pfeifer M, Luttgau S, Gouveia R, Costa J, Endell J, Moebius U et al: Therapeutic antibodies to human L1CAM: functional characterization and application in a mouse model for ovarian carcinoma. Cancer Res 2010, 70(6):2504-2515.) 및 인간 L1CAM 유전자 이식 마우스 (Doberstein K, Harter PN, Haberkorn U, Bretz NP, Arnold B, Carretero R, Moldenhauer G, Mittelbronn M, Altevogt P: Antibody therapy to human L1CAM in a transgenic mouse model blocks local tumor growth but induces EMT. International journal of cancer Journal international du cancer 2014.) 모델로부터의 결과는 L1CAM mAb L1-9.3 (또한 mAb 9.3으로도 불리움)이 암 요법을 위한 가망성 있는 도구가 될 수 있다는 것을 암시하였다. 이러한 mAb는 L1CAM 분자의 1. Ig-유사 도메인에 결합하고 양호한 ADCC-기능을 갖는다 (Wolterink S, Moldenhauer G, Fogel M, Kiefel H, Pfeifer M, Luttgau S, Gouveia R, Costa J, Endell J, Moebius U et al: Therapeutic antibodies to human L1CAM: functional characterization and application in a mouse model for ovarian carcinoma. Cancer Res 2010, 70(6):2504-2515.). 최근의 결과에서는 그의 IgG2a 버전에서 이러한 mAb가 면역계를 활성화하기에 아주 적절하고 암 세포의 제거를 야기하는 후보 면역 효과기 세포라는 것을 입증하였다 (Wolterink S, Moldenhauer G, Fogel M, Kiefel H, Pfeifer M, Luttgau S, Gouveia R, Costa J, Endell J, Moebius U et al: Therapeutic antibodies to human L1CAM: functional characterization and application in a mouse model for ovarian carcinoma. Cancer Res 2010, 70(6):2504-2515., Doberstein K, Harter PN, Haberkorn U, Bretz NP, Arnold B, Carretero R, Moldenhauer G, Mittelbronn M, Altevogt P: Antibody therapy to human L1CAM in a transgenic mouse model blocks local tumor growth but induces EMT. International journal of cancer Journal international du cancer 2014.). 따라서, 이러한 mAb-의존성 종양 요법이 특히 중요한 부분을 대표하는 ADCC-의존성 효과기 메카니즘에 대하여 특히 적절하다는 충분한 증거가 있다.
WO 2008/151819 (WO 2008/151819)는 L1의 제1 Ig 도메인 내의 에피토프에 결합하는 항-L1 항체 9.3을 기술하고 있다.
항체-약물 콘쥬게이트에서의 최근의 진전에서 신속한 내재화(internalization)의 특성을 갖는 mAb를 요구하고 있다. L1CAM 특이적 항체의 결합이 L1CAM 내재화 및 후속하는 표적 분자의 재순환 또는 분해를 야기할 수 있다는 것은 잘 알려져 있다 (Novak-Hofer I, Amstutz HP, Morgenthaler JJ, Schubiger PA: Internalization and degradation of monoclonal antibody chCE7 by human neuroblastoma cells. International journal of cancer Journal international du cancer 1994, 57(3):427-432.). L1CAM 분자의 내재화의 특성은 많은 다른 세포 표면 분자와 상관된다. 실제로, L1CAM 매개 세포 부착의 시그널링 및 조절에 L1CAM 내재화가 요구된다는 것은 공지되어 있다 (Schaefer AW, Kamiguchi H, Wong EV, Beach CM, Landreth G, Lemmon V: Activation of the MAPK signal cascade by the neural cell adhesion molecule L1 requires L1 internalization. The Journal of biological chemistry 1999, 274(53):37965-37973., Long KE, Asou H, Snider MD, Lemmon V: The role of endocytosis in regulating L1-mediated adhesion. The Journal of biological chemistry 2001, 276(2):1285-1290., Schaefer AW, Kamei Y, Kamiguchi H, Wong EV, Rapoport I, Kirchhausen T, Beach CM, Landreth G, Lemmon SK, Lemmon V: L1 endocytosis is controlled by a phosphorylation-dephosphorylation cycle stimulated by outside-in signaling by L1. The Journal of cell biology 2002, 157(7):1223-1232.).
L1CAM의 항체-유발 내재화가 여러 문헌에서 보고되었으나 (대부분 폴리클로날 항체를 사용) mAb에 대한 체계적인 조사가 실행되지는 않았다. 따라서, 현재 L1CAM 분자에 대한 서로 다른 에피토프의 관여가 내재화의 서로 다른 속도의 결과를 가져올 지의 여부는 알려지지 않았다. 본 발명자들은 이제 FNIII-4-5에 결합하는 L1CAM 특이적 mAb를 생성하고 mAb L1-OV52.24 (또는 OV52.24)로 불렀다. 본 발명자들은 이 mAb가 앞서 특정된 mAb L1-9.3 보다 훨씬 더 나은 내재화 속도를 갖는다는 놀라운 발견을 하였다. 본 발명자들은 추가로 mAb L1-OV52.24가 항-L1CAM 단일클론항체 5G3 및 UJ127.11 각각 보다 훨씬 더 나은 내재화 속도를 갖는다는 놀라운 발견을 하였다. L1-OV52.24의 독특한 특성은 암 세포에로의 개선되고 촉진된 약물 전달을 허용할 수 있다.
심지어 본 발명의 항체 L1-OV52.24의 일부 특성이 부분적으로 이미 기술되었음에도 불구하고, Wolterink S, Moldenhauer G, Fogel M, Kiefel H, Pfeifer M, Luttgau S, Gouveia R, Costa J, Endell J, Moebius U et al: Therapeutic antibodies to human L1CAM: functional characterization and application in a mouse model for ovarian carcinoma. Cancer Res 2010, 70(6):2504-2515.와 비교하시오, 본 발명의 항체 자체 또는 상보성 결정 영역 (CDR)의 시퀀스는 공개되거나 공중에게 획득가능하게 되지 않았다.
많은 치료학적 활성제는 단지 세포 내에서 유효하다. 이는 이러한 치료학적 활성제가 미변성된 형태로 세포 내로 들어갈 수 없는 경우에 문제를 야기한다. 따라서, 효율적으로 종양 세포 내로 내재화되고 따라서 결합제에 연결된 약제를 종양 세포 내로 표적할 수 있는 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편 등과 같은 결합제에 대한 수요가 존재한다.
단일클론항체 L1-OV52.24가 놀랍게도 실시예에서 나타낸 바와 같이 L1-OV52.24와 함께 각각 40, 60, 70 또는 90분 동안 배양된 이러한 세포의 현미경 분석에 의한 그리고 유세포분석 이미지화에 의한 둘 다로 결정된 바와 같이 L1-함유 포유동물 세포 내로의 신속하고 효율적인 내재화를 나타낸다는 것이 밝혀졌다.
따라서, L1에 결합하고 L1-OV52.24로 인식된 L1의 동일한 에피토프에 결합하는 항체 등과 같은 이러한 단일클론항체 또는 다른 결합 분자가 놀랍게도 생화학적 연구, 진단 또는 치료의 분야에서 유리하다. 특히, 활성제가 내재화에 의하여 세포 내로 취하여지는 본 발명의 결합 분자에 연결될 수 있다. 계속해서 이러한 활성제는 세포독성 또는 세포증식억제성 효과 등과 같은 세포 중에서의 소정의 효과를 발휘할 수 있다.
하나의 구체예에 있어서, 본 발명은 단일클론항체 L1-OV52.24에 의해 인식되는 동일한 L1 에피토프에 결합할 수 있는, L1에 결합하는 결합 분자에 관한 것이며, 여기에서 L1-OV52.24의 경쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 1에 따른 시퀀스를 포함하거나 바람직하게는 이를 가지거나 여기에서 경쇄가 시퀀스 동정 번호: 3에 의해 인코딩되고, 여기에서 L1-OV52.24의 중쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 2에 따른 시퀀스를 포함하거나 바람직하게는 이를 가지거나 여기에서 중쇄가 시퀀스 동정 번호: 4에 의해 인코딩된다.
시퀀스 동정 번호: 1은 VJ 도메인, 즉 L1-OV52.24의 경쇄의 가변부에 연관된다. 경쇄의 불변 도메인은 당해 기술분야에서 공지되어 있고 그의 뮤린 cDNA 시퀀스는 하기에 묘사된다.
시퀀스 동정 번호: 2는 VDJ 도메인, 즉 L1-OV52.24의 중쇄의 가변부에 연관된다. 중쇄의 불변 도메인은 당해 기술분야에서 공지되어 있고 그의 뮤린 cDNA 시퀀스는 하기에 묘사된다.
또한 L1CAM로도 알려진 L1은 막관통 단백질이고; 이는 200 내지 220 kDa의 L1 단백질 족의 구성원인 신경 세포 부착 분자이고, 치료-저항성 암에서의 강한 영향을 수반하는 액손 유도 및 세포 이동에 연관된다. 본 발명에 따른 L1은 바람직하게는 포유동물 L1 단백질, 보다 바람직하게는 인간 또는 마우스 L1 단백질로 이해된다. 인간 L1 단백질에 대한 Genbank 수탁번호는 NP_000416이고, 뮤린 L1 단백질에 대한 Genbank 수탁번호는 NP_032504이다. L1CAM은 또한 CD171로 지정되었다.
에피토프는 항체 또는 연관된 결합 분자에 의해 인식되는 항원의 일부이다. 예를 들어, 에피토프는 항체가 결합되는 항원의 특정한 조각이다. 에피토프는 배좌 에피토프 또는 선형 에피토프일 수 있다. 배좌 에피토프는 항원의 아미노산 시퀀스의 불연속 부분들로 구성된다. 이러한 에피토프는 항원의 3-차원 표면 특성 및 형태 또는 3차 구조에 기초하는 파라토프와 상호작용한다. 배좌인 에피토프의 비율은 알려지지 않았다.
L1-OV52.24가 L1의 피브로넥틴 III 4-5 도메인 내의 에피토프에 결합하고 이를 인식한다는 것이 실시예에서 입증되었다. 결합 분자에 의하여 결합되고 인식된 에피토프를 결정하기 위한 방법은 선행 기술 (Wolterink et. al., Cancer Res. (2010), 70: 2504-2515) 및 실시예에서 기술되었다. 실시예에 나타난 바와 같이, 인식된 에피토프는 바람직하게는 서로 별개의 Ig 도메인을 수반하는 일련의 L1-Fc 단백질을 구축하는 것에 의하여 결정된다. 실시예에 따른 정밀한 맵핑을 위하여, 예를 들어 Gouveia et al. (Protein Expr. Purif. (2007) 52: 182-193)에서 기술된 바와 같이, 재조합 V5-표식 L1 단편이 사용될 수 있다. 재조합 단백질은 에피토프 맵핑을 위하여 ELISA에서 또는 Western blot 분석에서 사용될 수 있다. mAb L1-OV52.24는 L1의 4-5FNIII 도메인과 반응한다. 일반적으로, 주어진 항체의 에피토프를 결정하기 위한 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있고 대상의 주어진 영역의 합성 선형 펩티드의 제조 및 항체가 상기 펩티드에 결합하는 지에 대한 후속하는 시험을 포함한다 (Epitope Mapping, A practical approach, Oxford University Press 2001, Editors: Olwyn Westwood and Frank Hay를 참조하시오). 대안으로, 대상의 영역을 커버하는 서로 다른 재조합 단백질이 제조되고 항체의 결합에 대하여 시험될 수 있다 (Oleszewski, M., Gutwein, P.,von der Lieth ,W., Rauch,U., Altevogt ,P. Characterization of the L1-neurocan binding site. Implications for L1-L1 homophilic binding. J.Biol.Chem. 275: 34478-34485 (2000)).
추가의 구체예에 있어서, 본 발명은 L1에의 결합에 대하여 단일클론항체 L1-OV52.24와 경쟁하는 결합 분자에 관한 것이며, 여기에서 L1-OV52.24의 경쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 1에 따른 시퀀스를 포함하거나 바람직하게는 이를 가지거나 여기에서 경쇄가 시퀀스 동정 번호: 3에 의해 인코딩되고, 여기에서 L1-OV52.24의 중쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 2에 따른 시퀀스를 포함하거나 바람직하게는 이를 가지거나 여기에서 중쇄가 시퀀스 동정 번호: 4에 의해 인코딩된다.
경쟁은 경쟁 결합 분석 등과 같이 숙련된 자에게 공지된 분석법에 의하여 결정될 수 있다.
L1-OV52.24의 경쇄 (VJ 도메인, 불변 도메인을 수반하지 않음; 즉 가변부)는 다음과 같다:
1 DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG TNVAWYQQKP GHSPKALIYS
51 TSYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTIRNVQS EDLAEYFCQQ YNTYPYTFGG
101 GTKLEIK (시퀀스 동정 번호: 1)
Kabat에 따른 L1-OV52.24의 경쇄 (VJ 도메인)의 CDR의 시퀀스는 다음과 같다:
CDR-L1 (또는 LCDR1): KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5)
CDR-L2 (또는 LCDR2): STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6)
CDR-L3 (또는 LCDR3): QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7)
L1-OV52.24의 중쇄 (VDJ 도메인, 불변 도메인을 수반하지 않음; 즉 가변부)의 단백질 시퀀스는 다음과 같다:
1 EVQLQQSGAE LVRPGALVKL SCKASGFNIK DYYMQWVKQR PEQGLEWIGW
51 IDPENGKTVF DPKFRGKASI SADTSSNTAY LQLSSLTSED TAVYYCARWN
101 PLAFWGQGTL VTVSS (시퀀스 동정 번호: 2)
Kabat에 따른 CDR의 시퀀스를 밑줄로 나타내었다.
Kabat에 따른 L1-OV52.24의 중쇄 (VDJ 도메인)의 CDR의 시퀀스는 다음과 같다:
CDR-H1 (또는 HCDR1): FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8)
CDR-H2 (또는 HCDR2): WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9)
CDR-H3 (또는 HCDR3: WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)
L1-OV52.24 단일클론항체의 면역글로불린 유전자의 cDNA 시퀀스는 다음과 같다:
코드: 5'UTR (부분적, 즉 시퀀스화된 한), 리더, IGKV / IGKJ 또는 IGHV/IGHD/IGHJ, IGKC 또는 IGHC
중쇄
CTGCCtCATGAATATGcAAACATGAGtCTGTGATTATAAATACAgagATATCCAtACCAAACAACtTATGAgCACTGTTTTCTCTACAGTCACTGAATCTCAAgGTCCTTACA ATGcAATGCAGCTGGGTCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCA GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAAGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCAGTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTAAAACAGTTTTTGACCCGAAGTTCCGGGGCAAGGCCAGTATATCAGCGGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGATGGAACCCCCTTGCCTTCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA (시퀀스 동정 번호: 4)
경쇄
TTTGATGACTGCTTTGCATAGATCCCTAGAGGCCAGCCCAGCTGCCCATGATTTATAAACCAGGTCTTTGCAGTGAGATCTGAAATACATCAGATCAGCATGGGCATCAAG ATGGAGTCACAGACTCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGATGGA GACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGTCACTCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCCGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTACTTCTGTCAGCAATATAACACCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG (시퀀스 동정 번호: 3)
바람직한 구체예에 있어서, 결합 분자는 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
결합 분자는 폴리펩티드로 이해되며, 이는 표시된 표적에 특이적인 결합을 나타낸다. 본 발명에 따르면, 표적인 단백질 L1이다. 따라서, 본 발명의 결합 분자는 L1에 특이적으로 결합한다. 바람직하게는, 결합 분자는 분자를 포함하는 면역글로불린, 즉 적어도 하나의 Ig 도메인 또는 항-L1 항체를 포함한다.
"특이적인 결합"은 예를 들어 Western Blot 분석 또는 ELISA로 결정되는 바와 같이 L1에의 결합 분자의 결합이 알부민 등과 같은 대조 단백질에의 결합에 비하여 적어도 50-배, 바람직하게는 적어도 100-배 더 강한 것으로 이해된다.
여기에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항-L1 항체"는 천연적으로 발생하는 항체에 대하여 구조적 유사성을 갖고 L1에 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드를 의미하고, 여기에서 결합 특이성은 폴리펩티드의 CDR로 결정된다. 따라서, "항-L1 항체"는 L1에의 결합을 수반하는 면역글로불린-파생 구조와 연관되는 것으로 의도된다. 항원-결합 단편은 전-장 항체의 적어도 하나의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩티드로 이해된다. 항원 결합 단편은 두 도메인이 함께 특정한 항원에 대하여 결합할 수 있는 방법으로 배열된 적어도 중쇄의 가변 도메인과 경쇄의 가변 도메인으로 이루어진다.
모두 단일의 부모 세포의 클론인 한 형태의 면역 세포에 의해 생성되는 것이기 때문에 단일클론항체는 동일한 단일특이성 항체이다. "단일클론항체" 및 단일클론항체의 제조는 이미 개발된 것에 속한다. 일반적으로, 단일클론항체는, 예를 들어, Winter & Milstein (Winter, G. & Milstein, C. (1991) Nature, 349, 293-299)의 공지의 방법에 따라 제조될 수 있다. 달리 단일클론항체-분비 하이브리도마를 제조하기 위하여 본 발명의 폴리펩티드를 향해 유도되는 단일클론항체는 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리 (예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 대상의 폴리펩티드로 스크리닝하는 것에 의하여 동정되고 단리될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 킷트가 상용적으로 획득가능하다 (예를 들어, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 및 the Stratagene SurfZAP Phage Display Kit, Catalog No. 240612). 게다가, 항체 디스플레이 라이브러리의 생성 및 스크리닝에서의 사용에 특히 수용가능한 방법 및 시약의 예들은, 예를 들어, U.S. Patent No. 5,223,409; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281; Griffiths et al., 1993, EMBO J. 12:725-734에서 찾을 수 있다.
"전장" 또는 "완전" 항체는 이황화물 결합에 의하여 상호-연결되고 (1) 중쇄의 면에서, 가변부 그리고 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 중쇄 불변 영역; 및 (2) 경쇄의 면에서, 경쇄 가변부 그리고 하나의 도메인 CL을 포함하는 경쇄 불변 영역을 포함하는 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 단백질을 의미한다. 용어 "완전 항체"와 관련하여, 임의의 항체는 비록 각 도메인이 돌연변이, 결실 또는 삽입 등과 같은 전체 도메인 구조를 변화시키지 않는 추가의 변형을 포함할 수 있음에도 불구하고, 천연적으로 발생하는 항체 (즉 3개 또는 4개의 불변 도메인의 중쇄 및 하나의 불변 도메인과 마찬가지로 개개 가변 도메인의 경쇄를 포함)의 전형적인 전체 도메인 구조를 갖는 것을 의미한다. 예를 들어, mAb L1-OV52.24는 전장 항체이다.
단일클론항체의 "항원-결합 단편"은 필수적으로 그로부터 단편이 파생되는 완전 단일클론항체와 동일한 기능 및 특이성을 나타내는 단일클론항체의 단편이다. 파파인으로의 제한된 단백질 가수분해 소화로 Ig 원형이 3개의 단편으로 개열된다. 각각이 하나의 전체 경쇄 및 약 절반의 중쇄를 포함하는 2개의 동일한 아미노 말단 단편이 항원 결합 단편 (Fab)이다. 크기가 유사하나 그들 사슬간 이황화물 결합을 수반하는 2개의 중쇄의 절반 카르복실 말단을 포함하는 제3의 단편이 결정화가능 단편 (Fc)이다. Fc는 탄수화물, 상보성-결합 및 FcR-결합 사이트를 포함한다. 제한된 펩신 소화는 2개의 Fab 조각 및 H-H 사슬간 이황화물 결합을 포함하는 힌지부를 포함하는 단일의 F(ab')2를 수득한다. F(ab')2는 항원 결합에 대하여 2가이다. F(ab')2의 이황화물 결합은 개열되어 Fab'를 수득할 수 있다. 게다가, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 서로 융합되어 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 형성할 수 있다.
제1 세대의 전체 크기 항체가 일부 문제점을 나타내었기 때문에, 많은 제2 세대 항체가 단지 항체의 단편을 포함하였다. 가변 도메인 (Fvs)은 하나의 VL 및 하나의 VH로 이루어지는 무손상의 항원-결합 도메인을 수반하는 가장 작은 단편이다. 단지 결합 도메인을 수반하는 이러한 단편은 효소적 접근법 또는 예를 들어 박테리아 및 진핵세포 내에서의 연관 유전자 단편의 발현에 의하여 생성될 수 있다. 서로 다른 접근법이 예를 들어 Fv 단편 단독 또는 Fv 더하기 제1 불변 도메인을 포함하는 "Y"의 상부 아암들 중의 하나를 포함하는 'Fab'-단편에 사용될 수 있다. 이러한 단편은 대개 단일 사슬 Fv (scFv)의 생산의 결과를 가져오는 2개의 사슬들 간의 폴리펩티드 연결의 도입에 의항 안정화된다. 대안으로, 이황화물-연결 Fv (dsFv) 단편이 사용될 수 있다. 단편의 결합 도메인은 임의의 불변 도메인과 결합되어 전장 항체를 생산하거나 다른 단백질 및 폴리펩티드와 융합될 수 있다.
재조합 항체 단편은 단일-사슬 Fv (scFv) 단편이다. 일반적으로, 이는 그의 항원에 대하여 높은 친화도를 갖고 다양한 숙주 내에서 발현될 수 있다. 이들 및 다른 특성은 scFv 단편이 약물에 적용가능할 뿐만 아니라 생명공학 응용에 대하여도 가능성이 있다. 상기 상술된 바와 같이, scFv 단편에 있어서 VH 및 VL 도메인은 친수성이고 가요성(flexible)인 펩티드 링커와 결합되고, 이는 발현 및 폴딩 효율을 개선한다. 대개 약 15개의 아미노산의 링커가 사용되고, 그중에서도 (Gly4Ser)3 링커가 가장 빈번하게 사용된다. scFv 분자는 사용된 링커에 따라 용이하게 단백질 가수분해로 분해될 수 있다. 유전공학 기술의 발달에 따라 이러한 제한은 실제로 기능 및 안정성의 개선에 초점을 둔 연구에 의하여 극복될 수 있다. 하나의 실시예는 VH-VL 이량체가 사슬간 이황화물 결합에 의해 안정화된 이황화물-안정화 (또는 이황화물-결합) Fv 단편의 제조이다. VL 및 VH 도메인 간의 계면에 시스테인이 도입되어 이황화물 가교를 형성하고, 이는 2개의 도메인을 서로 고정한다.
scFvs의 해리는 단량체성 scFvs의 결과를 가져오고, 이는 이량체 (다이어바디), 삼량체 (트라이어바디) 또는 TandAbs 및 플렉서바디 등과 같은 보다 큰 응집물로 착체화될 수 있다.
2개의 결합 도메인을 갖는 항체가 2개의 scFv의 단순한 폴리펩티드와의 결합을 통하거나 (scFv)2 2개의 단량체의 이량체화를 통하여 (다이어바디) 생성될 수 있다. 가장 간단한 설계는 둘 다 동일하거나, 유사한 것일 수 있거나 (2가 다이어바디) 별개의 항원에 대하여 특이성을 갖는 (이중특이성 다이어바디) 것일 수 있는 2개의 기능 항원-결합 도메인을 갖는 다이어바디이다.
또한, 중쇄의 4개의 가변 도메인 및 경쇄의 4개의 가변 도메인을 포함하는 항체 포맷이 개발되었다. 이러한 것의 예들에는 4가의 이중특이성 항체 (TandAbs 및 플렉서바디, Affimed Therapeutics AG, Heidelberg. Germany)이 포함된다. 이중특이성 다이어바디에 비하여, 이중특이성 TandAb는 단지 하나의 폴리펩티드로 이루어지는 호모다이머이다. 2개의 서로 다른 사슬로 인하여, 다이어바디는 단지 그 중 하나가 기능적인 3가지 서로 다른 이량체를 구축할 수 있다. 따라서, 이는 간단하고 저렴하게 이러한 균질한 생성물을 생산하고 정제한다. 게다가, TandAb는 대개 더 나은 결합 특성 (2배의 결합 사이트의 보유) 및 생체 내 증가된 안정성을 나타낸다. 플렉서바디는 세포 표면 상에서 서로로부터 상당히 이격된 2개의 분자를 결합하기 위한 높은 정도의 가요성을 수반하는 다가 분자의 결과를 가져오는 scFv의 다이어바디 다량체 모티브와의 조합이다. 만일 2개 이상의 기능성 항원-결합 도메인이 존재하고 만일 이들이 별개의 항원에 대하여 특이성을 갖는 경우, 항체는 다중특이성이다.
요약하면, 그 안으로 특히 기술된 시퀀스가 삽입될 수 있거나, 대안으로 필수적인 부분을 형성하는 특이적인 면역글로불린에는 본 발명의 특정한 구체예를 형성하는 하기 결합 분자가 포함되나 이들로 제한되는 것은 아니다: a Fab (경쇄 가변 (VL), 중쇄 가변 (VH), 경쇄 불변 (CL) 및 중쇄 불변 1 (CHl) 도메인들을 수반하는 1가 단편), a F(ab')2 (힌지부에서 이황화물 가교 또는 대안에 의해 결합되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편), a Fv (VL 및 VH 도메인), scFv (VL 및 VH가 링커, 예를 들어, 펩티드 링커로 결합된 단일 사슬 Fv), 이중특이성 항체 분자 (항체 또는 수용기 리간드 등과 같은 다른 펩티드 또는 단백질을 포함하나 이로 제한되지 않는 항체에 비하여 다른 결합 특이성을 갖는 제2의 기능성 성분에 결합된 여기에서 기술된 바와 같은 폴리펩티드를 포함하는 항체 분자), 이중특이성 단일 사슬 Fv 이량체, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 미니바디 (CH3에 결합된 scFv).
Fv, scFv, 다이어바디 분자 또는 도메인 항체 (Domantis)를 포함하나 이로 제한되지 않는 단일클론항체의 특정한 결합 분자 또는 항원-결합 단편은 이황화물 가교를 도입하여 VH 및 VL 도메인을 연결하는 것에 의하여 안정화될 수 있다. 이중특이성 항체는 그의 특정한 방법에 화학적 제조 또는 하이브리드로부터 (하이브리도마) 그리고 BiTE™ 기술 (펩티드 링커와의 서로 다른 특이성의 항원 결합 영역을 보유하는 분자)을 포함하나 이로 제한되지 않는 다른 기술 및 놉-인투-홀(knobs-into-holes) 공학을 포함하는 통상의 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
따라서, 단일클론항체의 결합 분자 또는 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화물-연결 Fv, scFv, (scFv)2, 2가의 항체, 이중특이성 항체, 다중특이성 항체, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디 또는 미니바디일 수 있다.
다른 바람직한 구체예에 있어서, 결합 분자는 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화된 항체이다. 키메라 항체는 그의 면역원성을 감소시키기 위하여 유전공학에 의하여 하나의 종의 면역글로불린의 적어도 하나의 영역이 다른 종의 면역글로불린의 다른 영역과 융합된 항체이다. 예를 들어 뮤린 VL 및 VH 영역이 인간 면역글로불린의 잔여부에 융합될 수 있다. 키메라 항체의 특정한 형태는 인간화된 항체이다. 인간화된 항체는 비-인간 항체의 CDR을 인코딩하는 DNA를 인간 항체-생산 DNA와 병합시키는 것에 의하여 제조된다. 따라서 단순히 CDR이 비-인간이기 때문에, 그 결과의 DNA 구조물은 대개는 비-인간의 부모 항체와 또는 키메라 항체와 같은 정도의 면역원성이 아닌 항체를 발현하고 생산하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 항체는 인간일 수 있다.
인간에의 적용을 위하여는, 예를 들어 생체 내 방지, 치료 또는 진단을 위하여는 인간 또는 적어도 인간화된 항체의 사용이 바람직하다.
본 발명의 하나의 바람직한 구체예에 있어서, 결합 분자, 특히 단일클론항체는: 인간 IgM 불변 도메인, 인간 IgGl 불변 도메인, 인간 IgG2 불변 도메인, 인간 IgG3 불변 도메인, 인간 IgG4 불변 도메인, 인간 IgE 불변 도메인 및 인간 IgA 불변 도메인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다.
결합 분자, 바람직하게는 본 발명의 단일클론항체의 문맥에서 상기 상술한 바와 같이, 천연적으로 발생하는 항체의 각 중쇄는 불변 영역과 가변 영역의 2개의 영역을 갖는다. 5가지 형태의 포유동물 면역글로불린 중쇄: γ, δ, α, μ, ε가 존재하고, 이들은 각각 면역글로불린 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE의 류로 정의한다.
여기에서 인간에 있어서는 4개의 IgG 아류 (IgG1, 2, 3 및 4)가 존재하고, 혈청 중의 풍부도의 순서로 칭호된다 (IgG1이 가장 풍부한 것임). 비록 IgG 아류의 Fc 영역들 간에는 약 95% 유사성이 존재함에도 불구하고, 힌지부의 구조는 상대적으로 상이하다. Fab 아암들 (단편 항원 결합)과 2개의 중쇄의 2개의 카르복시-말단 도메인 CH2 and CH3 간의 이 영역이 분자의 가요성을 결정한다. 상부 힌지 (아미노-말단 쪽으로의) 조각이 Fab 아암 들 간의 각도의 가변도와 마찬가지로 개개 Fab 각각의 회전 가요성을 허용한다 (Fab-Fab 가요성). 하부 힌지 영역 (카르복시-말단 쪽으로의)의 가요성은 Fc 영역에 대한 Fab-아암들의 위치를 직접적으로 결정한다 (Fab-Fc 가요성). 힌지-의존 Fab-Fab 및 Fab-Fc 가요성은 추가로 효과기 기능과 마찬가지로 상보성 활성 및 Fc 수용기 결합을 촉발함에 있어 중요할 수 있다. 따라서, 힌지 영역의 구조는 4개의 IgG 류 각각에 그들의 독특한 생물학적 프로파일을 제공한다.
힌지 영역의 길이 및 가요성은 IgG 아류 중에서 변화한다. IgG1의 힌지 영역은 아미노산 216 내지 231을 포함하고 이는 자유롭게 가요될 수 있기 때문에, Fab 단편은 그의 대칭축에 대하여 회전하고 2개의 중쇄-간 이황화물 가교 중의 제1 가교에 중심을 둔 구 내에서 움직일 수 있다. IgG2는 IgG1 보다 더 짧은 힌지를 가지며, 12개의 아미노산 잔기 및 4개의 이황화물 가교를 수반한다. IgG2의 힌지 영역은 글리신 잔기를 결여하고 있고, 이는 상대적으로 짧고 경질 폴리-프롤린 이중 나선을 포함하고, 여분의 중쇄-간 이황화물 가교에 의해 안정화된다. 이러한 특성은 IgG2 분자의 가요성을 제한한다. IgG3는 62개의 아미노산 (21개의 프롤린 및 11개의 시스테인을 포함)을 포함하고, 불요성(inflexible)의 폴리-프롤린 이중 나선을 형성하는 그의 독특한 연장된 힌지 영역 (IgG1 힌지 보다 약 4배 더 긴)으로 다른 아류와는 상이하다. IgG3에 있어서 Fab 단편이 상대적으로 Fc 단편으로부터 원위되어 분자에 더 큰 가요성을 부여한다. IgG3에서의 연장된 힌지는 또한 다른 아류에 비하여 그의 보다 높은 분자량의 원인이 된다. IgG4의 힌지 영역은 IgG1의 그것 보다 더 짧고 그의 가요성은 IgG1과 IgG2의 중간이다.
따라서, 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 결합 분자는 단일 사슬 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 scFv 및 다이어바디, 트라이어바디 또는 테트라바디 같은 scFv의 다량체, 바람직하게는 Fab, tandab, 플렉서바디 및 이중특이성 항체로부터 선택된다.
또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 결합 분자는 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
실시예로부터 고려될 수 있는 바와 같이, 항체 L1-OV52.24의 에피토프는 L1의 피브로넥틴 도메인 III 4-5 내에 존재한다. 따라서 또한 결합 분자의 에피토프, 특히 본 발명의 단일클론항체 또는 항원-결합 단편은 바람직하게는 L1의 피브로넥틴 도메인 III 4-5 내에 존재한다.
따라서, 바람직한 구체예에 있어서, 에피토프는 L1의 피브로넥틴 도메인 III 4-5 (FN III 4-5) 내에 존재한다.
L1-OV52.24는 하기 CDR 시퀀스를 갖는다: KASQNVGTNVA (LCDR1; 시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (LCDR2; 시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; 시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; 시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; 시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (HCDR3; 시퀀스 동정 번호: 10).
상기 언급된 시퀀스는 일반적으로 당해 기술분야에서 공지된 Kabat 법에 따라 결정되는 단일클론항체 L1-OV52.24의 CDR을 나타낸다.
따라서, 바람직한 구체예에 있어서, 결합 분자는 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 여기에서 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)이
a) KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)으로부터 선택되는 시퀀스들 중의 하나를 가지거나,
b) a) 이하에 언급된 시퀀스와 비교하여 적어도 하나의 보존적 아미노산 교환을 갖는 시퀀스를 갖는다.
본 발명의 이러한 단일클론항체 또는 그의 항체-결합 단편은, 예를 들어, CDR 그라프팅에 의하거나 항체의 재조합 제조에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 방법들은 당해 기술분야에서 공지되어 있다 (예를 들어 Queen, U.S. Patent No. 5,585,089 and Winter, U.S: 5,225,539, Cabilly U.S. 4,816,567을 참조하시오).
또한 CDR의 시퀀스는 바람직하게는 보존적 아미노산 교환을 야기하는 교환에 의하여 변형될 수 있다.
일반적으로, 조작은 프레임(FR)과 마찬가지로 CDR 영역에서의 변형의 결과를 가져올 수 있고 잔기의 교환, 결실 및 삽입이 포함된다. 변형은 무작위 또는 지향된 돌연변이생성을 유발할 수 있다. 이전에 기술된 바와 같은 항체 파지 디스플레이 시스템이 채용되어 소정의 및/또는 개선된 특성을 갖는 돌연변이를 선택할 수 있다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는 결합 분자가 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 상보성 결정 영역 (CDR) QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7) alc WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)을 포함하고, 여기에서 선택적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 교환이 존재하는 것을 특징으로 한다.
시퀀스 동정 번호: 7은 LCDR3 시퀀스를 나타내고 시퀀스 동정 번호: 10은 L1-OV52.24의 HCDR3 시퀀스를 나타낸다. LCDR3 및 HCDR3은 항체에 대한 결합 특성에 대하여 중요한 것으로 알려져 있다.
보다 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는 결합 분자가 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 여기에서 항-L1 단일결합항체 또는 그의 항원-결합 단편이 상보성 결정 영역 (CDR) KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)를 포함하고,
여기에서 선택적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 교환이 존재하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 구체예에 있어서, 보존적 아미노산 교환이 존재하지 않는다.
심지어 보다 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는 결합 분자가 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 여기에서 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편이 상보성 결정 영역 (CDR) KASQNVGTNVA (LCDR1; 시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (LCDR2; 시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; 시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; 시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; 시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (HCDR3; 시퀀스 동정 번호: 10)을 포함하고,
여기에서 선택적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 교환이 존재하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 구체예에 있어서, 보존적 아미노산 교환이 존재하지 않는다.
보다 바람직한 구체예에 있어서, 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG1 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
다른 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는
a) KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)으로부터 선택되는 적어도 하나의 시퀀스를 포함하거나,
b) a) 이하에 언급된 시퀀스와 비교하여 적어도 하나의 보존적 아미노산 교환을 갖는 시퀀스를 포함한다.
보다 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는 시퀀스 QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7) 및 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)를 포함하고, 여기에서 선택적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 교환이 존재한다.
심지어 보다 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는 시퀀스 KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)를 포함하고, 여기에서 선택적으로 하나 이상의 보존적 아미노산 교환이 존재한다.
바람직한 구체예에 있어서, 보존적 아미노산 교환이 존재하지 않는다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는 상보성 결정 영역 (CDR) KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)을 포함하는 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는 상보성 결정 영역 (CDR) KASQNVGTNVA (LCDR1; 시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (LCDR2; 시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; 시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; 시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; 시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (HCDR3; 시퀀스 동정 번호: 10)를 포함하는 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
본 발명의 결합 분자가 L1에 대하여 강한 친화도를 나타내는 것이 바람직하다. L1-OV52.24가 L1에 대하여 KD (M)= 2,41*10-9의 친화도를 나타낸다는 것이 밝혀졌다.
L1에 대한 친화도는 예를 들어 표면 플라스몬 공명에 의하는 것과 같은 당해 기술분야에서 공지된 방법에 의하여 결정될 수 있다. L1-OV52.24에 대한 결합 분석은 CM5 센서 칩이 장착된 BIAcore 3000을 사용하여 수행되었다. 요약하면, BIAcore CM5 칩은 EDC/NHS로 활성화되고 여러 수준의 L1-Fc가 활성화된 표면 상으로 캡쳐되었다. 잔여의 활성 사이트가 에탄올아민/HCl로 블로킹되었다. L1-OV52.24가 L1-Fc 표면에 결합되고 시간의 경과에 따라 해리되도록 허용된다. 각 밀도 표면 상으로의 각 주사에 대한 결합상 및 해리상을 속도 분석에 적용시켰다.
따라서, 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자, 바람직하게는 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 10-9, 바람직하게는 적어도 10-10 또는 10-11의 친화도 (KD)로 L1을 결합한다.
실시예 및 도면에서 나타난 바와 같이, 놀랍게도 배양 40, 60, 70 또는 90분 이후 L1-OV52.24이 효율적으로 SKOV3ip 세포 내로 내재화되는 반면에 비교 항-L1 단일클론항체 9.3은 단지 작은 정도로 내재화된다는 것이 밝혀졌다. 내재화는 형광 화합물 등과 같은 적절한 진단 화합물에로 연결되는 결합 분자를 사용하여 결정될 수 있다. 실시예에서, Alexa488가 형광 염료로 사용되었다. 내재화의 정량은 실시예에서 기술된 바와 같이 현미경 분석 및 계수에 의하거나 유세포분석 영상화에 의하여 수행될 수 있다. 두 방법들에 대하여, L1-OV52.24가 측정된 각 시점에서 9.3 항체 보다 적어도 4-배 더 효율적으로 내재화되었다는 것이 밝혀졌다. 게다가, 놀랍게도 L1-OV52.24가 측정된 시점 60분 및 90분에서 상용적으로 획득가능한 항-L1CAM 단일클론항체 5G3 및 UJ127.11 보다 더 효과적으로 내재화되었다는 것이 밝혀졌다 (도 6). 실시예에서 결정된 L1-OV52.24의 우월하고도 놀라운 내재화 특성이 도 7에 요약되었다. 놀랍게도 90분에서의 L1-OV52.24의 내재화가 각각 p-값 ≤ 0.01으로 선행기술 항-L1CAM 단일클론항체 9.3, 5G3 및 UJ127.11 중의 임의의 것의 내재화 보다 유의미하게 더 높다는 것이 밝혀졌다. 따라서, L1-OV52.24 또는 그의 항원-결합 단편 또는 L1-OV52.24와 동일한 에피토프를 인식하는 결합 분자가 특히 치료학적 활성제의 전달 (약물 전달) 또는 예를 들어 영상화 목적을 위한 진단 화합물의 전달에 특히 적절하다.
또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는 L1을 발현하는 포유동물 세포에 의해 내재화되고, 바람직하게는 여기에서 세포는 L1을 발현하는 포유동물 종양 세포, 보다 바람직하게는 SKOV3ip 세포이다.
바람직한 구체예에 있어서, 바람직하게는 세포가 SKOV3ip 세포인 L1을 발현하는 포유동물 세포에 의한 내재화는 현미경 분석 및 정량화에 의하거나 영상화 유세포분석에 의하여 결정된다. 방법은 바람직하게는 실시예에서 기술된 바와 같이 수행된다. 추가의 바람직한 구체예에 있어서, 내재화는 배양 40, 60, 70 또는 90분 후 WO 2008/151819에서 기술된 바와 같은 단일클론항체 9.3의 내재화 보다 적어도 2-배, 바람직하게는 적어도 4-배, 보다 바람직하게는 적어도 7-배, 가장 바람직하게는 적어도 10-배이다. 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 내재화는 배양 60 또는 90분 후 단일클론항체 5G3의 내재화 보다 적어도 2-배, 바람직하게는 적어도 4-배 더 높다. 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, 내재화는 배양 60 또는 90분 후 단일클론항체 UJ127.11의 내재화 보다 적어도 2-배, 바람직하게는 적어도 4-배 더 높다.
심지어 보다 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는 단일클론항체 L1-OV52.24 또는 그의 항원-결합 단편이고, 여기에서 L1-OV52.24의 경쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 1에 따른 시퀀스를 포함하고, 바람직하게는 가지거나 여기에서 경쇄가 시퀀스 동정 번호: 3에 의해 인코딩되고, 여기에서 L1-OV52.24의 중쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 2에 따른 시퀀스를 포함하고, 바람직하게는 가지거나 여기에서 중쇄가 시퀀스 동정 번호: 3 또는 그의 항원-결합 단편에 의해 인코딩된다.
바람직한 구체예에 있어서, L1-OV52.24의 경쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 1에 따른 시퀀스를 포함하고, 바람직하게는 갖고 L1-OV52.24의 중쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호:2에 따른 시퀀스를 포함하고 바람직하게는 갖는다.
시퀀스 동정 번호: 1 및 2 시퀀스들은 상기 나타낸 바와 같이 각각 VJ 도메인; 즉 L1-OV52.24의 경쇄의 가변부 및 VDJ 도메인; 즉 L1-OV52.24의 중쇄의 가변부에 연관된다.
따라서, 본 발명은 하나의 구체예에서 단일클론항체 L1-OV52.24 또는 그의 항원-결합 단편에 연관된다. 단일클론항체 L1-OV52.24는 여기에서 각각 그의 중쇄 및 경쇄의 가변부 (각각 시퀀스 동정 번호: 2 및 시퀀스 동정 번호: 1) 및/또는 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 cDNA들 (각각 시퀀스 동정 번호: 3 및 시퀀스 동정 번호: 4)로 기술된다.
특히 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는 치료학적 활성제에 연결되고, 이는 치료학적 활성제의 내재화를 허용한다.
본 발명에 따른 치료학적 활성제는 동물, 바람직하게는 포유동물, 심지어 보다 바람직하게는 인간에서 치료 또는 방지 효과를 갖는 화합물로 이해된다.
보다 바람직한 구체예에 있어서, 치료학적 활성제는 동물에서 종양 질환 및/또는 L1 발현에 연관되는 질환을 치료하거나 방지하는 데 유용한 치료 또는 방지 효과를 갖는다.
하나의 바람직한 구체예에 있어서, 치료학적 활성제는 화학요법에서 유용한 화합물, 즉 화학요법 화합물이다. 바람직한 구체예에 있어서, 치료학적 활성제는 세포독성 또는 세포증식억제성 화합물이다.
따라서, 하나의 구체예에 있어서, 본 발명은 치료학적 활성제에
바람직하게는
화학요법 화합물, 바람직하게는 알킬화제, 항신생물 항생제, 항대사물질 및 천연 공급원 유도체,
세포독성 화합물,
세포증식억제성 화합물,
사이토카인, 나노입자 또는
방사선 핵종에
연결된 본 발명의 결합 분자에 관한 것이다.
적절한 사이토카인은 예를 들어 TNFalpha, IL-2 및 IL-12이다.
적절한 화학요법 화합물은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 이러한 화합물은, 예를 들어, 알킬화제, 항신생물 항생제, 항대사물질 및 천연 공급원 유도체를 포함하여 여러 서로 다른 부류에 속한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 알킬화제의 예에는 부설판, 카로플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드 (즉, 사이톡산), 다카르바진, 이포스파미드, 로무스틴, 메콜라레타민, 멜파란, 프로카바진, 스트렙토조신 및 티오테파가 포함된다.
항신생물 항생제의 예에는 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 미토마이신 (예를 들어, 미토마이신 C), 미토크산트론, 펜토스타틴 및 플리카마이신이 포함된다.
항대사물질의 예에는 플루오로디옥시우리딘, 클라드리빈, 시타라빈, 플록소우리딘, 플루다라빈, 플루오우라실 (예를 들어, 5-플루오로우라실 (5FU)), 젬시타빈, 하이드록시우레아, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트 및 티오구아닌이 포함된다.
천연 공급원 유도체의 예에는 도세탁셀, 에토포시드, 이리노테칸, 탁산 (예를 들어 파클리탁셀), 테니포시드, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 프레드니손 및 타목시펜이 포함된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 화학요법제의 추가의 예에는 아스파라기나아제 및 미토탄이 포함된다.
게다가, 또한 C2 세라마이드가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 "연결된"은 공유 및 비-공유 연결, 바람직하게는 공유 연결을 포함하는 것으로 이해된다. 공유 연결의 구체예에 있어서, 본 발명의 결합 분자는 적절한 링커 분자를 경유하여 직접적으로 치료학적 활성제 또는 진단 화합물에 연결될 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 구체예에 있어서, 결합 분자는 링커를 경유하여 치료학적 활성제 또는 진단 화합물에 연결된다. 적절한 링커는 당해 기술분야에서 공지되어 있다.
따라서, 하나의 바람직한 구체예에 있어서 결합 분자는 선택적으로 링커를 경유하여 치료학적 활성제 및/또는 진단 화합물에 공유적으로 연결된다.
적절한 방사선 핵종에는 67/ 64Cu, 131I, 124I 또는 90Y가 포함된다. 이러한 방사선 핵종은 착체-형성 성분에 의하거나, 요오드의 경우, 직접적으로 공유 연결에 의하여 본 발명의 결합 분자에 연결될 수 있다. 착체-형성 성분은 바람직하게는 선택적으로 링커에 의하여 결합 분자에 공유적으로 연결된다.
이러한 항체 콘쥬게이트는 당해 기술분야에서 공지되어 있다 (Wu AM, Senter PD. Arming antibodies: prospects and challenges for immunoconjugates. Nature Biotechnol. 23:1137-1146, 2005, Pastan I, Hassan R, FitzGerald DJ, Kreitman RJ. Immunotoxin treatment of cancer. Annu. Rev. Med. 58:221-237, 2007, WO 90/12592, WO 2007/030642, WO 2004/067038, WO 2004/003183, US 2005/0074426, WO 94/04189).
보다 바람직한 구체예에 있어서, 치료학적 활성제는 DNA 손상 물질, 특히 악티노마이신-D, 미토마이신 C, 시스플라틴, 독소루비신, 에토포시드, 베라파밀, 포도필로톡신, 5-FU, 천연 공급원 유도체 및 탁산, 바람직하게는 파클리탁셀 및 카보플라틴으로부터 선택되는 화학요법 화합물 또는 세포독성 화합물 또는 세포증식억제성 화합물이다.
추가로, 본 발명의 결합 분자를 진단 화합물에 연결하는 것이 유리할 수 있다.
진단 화합물은 직접적 또는 간접적 검출을 통하여 신호를 생성할 수 있는 화합물이다. 하나의 바람직한 구체예에 있어서, 화합물은 포유동물 등과 같은 동물, 보다 바람직하게는 인간에 투여하기에 적절하다. 이 구체예에 있어서, 연결된 결합 분자는 시험관 내 및 생체 내 사용 둘 다에 적절할 수 있다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 화합물은 포유동물 등과 같은 동물, 보다 바람직하게는 인간에 투여하기에 적절하지 않다. 이 구체예에 있어서, 연결된 결합 분자는 시험관 내 사용에 적절할 수 있다. 따라서 진단 화합물은 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 직접적인 검출을 위하여는, 본 발명에서 사용하기에 적절한 진단 화합물은 크로모겐, 형광기, 화학발광기 (예를 들어 아크리디늄 에스테르 또는 디옥세탄), 전기화학발광 화합물, 촉매, 효소, 효소 기질, 염료, 형광 염료 (예를 들어 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 옥사진, 레조루핀, 시아닌 및 이들의 유도체), 콜로이드성 금속과 비금속 입자 및 유기 폴리머 라텍스 입자와 같은 임의의 공지된 검출가능한 마커기로부터 선택될 수 있다. 진단 화합물의 다른 예는 루테늄 또는 유로퓸 착체 및 방사성 동위원소 등과 같은 발광 금속 착체이다.
간접적 검출 시스템에는, 예를 들어, 바이오아핀 결합쌍(bioaffine binding pair)의 파트너가 포함된다. 적절한 결합쌍의 예는 합텐 또는 항원/항체, 비오틴 또는 아미노비오틴, 이미노비오틴 또는 디스티오비오틴/아비딘 또는 스트렙타비딘 등과 같은 비오틴 유사체, 당/렉틴, 핵산 또는 핵산 유사체/상보성 핵산 및 수용기/리간드 예를 들어 스테로이드 호르몬 수용기/스테로이드 호르몬이다.
따라서, 추가의 구체예에 있어서, 본 발명은 바람직하게는 방사성 핵종, 화학발광 화합물, 형광 화합물, 염료 또는 효소로부터 선택되는 진단 화합물에 연결되는 본 발명의 결합 분자에 관한 것이다.
실시예에서 나타난 바와 같이, L1-OV52.24 단일클론항체는 성공적으로 형광 화합물 또는 형광 염료에, 즉 Alexa 염료 (Alexa488)에 연결되었다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 항-L1 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은
(i) 본 발명에 따른 결합 분자를 코딩하고/하거나
(ii) 본 발명에 따른 결합 분자의 적어도 하나의 사슬을 인코딩하고/하거나
(iii) 시퀀스 동정 번호: 3에 따르고/따르거나 시퀀스 동정 번호: 4에 따르는 시퀀스를 포함하고/하거나
(iv) 시퀀스 KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10) 중의 적어도 하나의 시퀀스를 인코딩하는 시퀀스(들)을 포함하는
핵산에 관한 것이다.
보다 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 핵산은 벡터의 일부이다. 이러한 벡터는 바람직하게는 대장균 등과 같은 박테리아 중에서, 효모 세포 중에서, 곤충 세포 또는 포유동물 세포 중에서 발현하기 위한 벡터이다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산은 벡터 중의 프로모터 또는 인핸서 등과 같은 적절한 조절 시퀀스의 제어 하에 있으며 그에 의하여 숙주 세포 중에서의 발현을 허용한다. 벡터는 바람직하게는 숙주 세포 중에서 복제를 가능하게 하는 시퀀스를 포함한다.
바람직하게는, 진단 화합물에 연결되는 결합 분자는 시험관 내에서 진단 목적을 위하여 사용되고 그에 의하여 생명공학 연구를 위한 중요한 도구에 연관될 수 있다. 예를 들어, 환자의 생검 또는 체샘플은 일반적으로 본 발명의 결합 분자를 사용하여 분석될 수 있다. 따라서, 추가 구체예에서, 본 발명은 시험관 내 진단 물질로서의 또는 시험관 내 생명공학 물질로서의 본 발명의 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 보다 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 시험관 내 진단 물질로서의 또는 시험관 내 생명공학 물질로서의 진단 화합물에 연결된 본 발명의 결합 물질의 용도에 관한 것이다. 다른 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 시험관 내 생명공학 물질로서의 치료학적 활성제에 연결되는 본 발명의 결합 분자의 용도에 관한 것이다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 약물 또는 진단 물질로서의 용도를 위한 본 발명의 결합 분자에 관한 것이다.
특히 바람직한 구체예에 있어서, 약물로서의 사용을 위한 결합 분자는 상기 기술된 바와 같은 치료학적 활성제에 연결되는 결합 분자이다. 결합 분자는 치료학적 활성제를 종양 세포 내로 전달하고 여기에서 치료학적 활성제에 연결된 결합 분자가 그의 치료학적 효과를 발휘할 수 있다.
바람직한 구체예에 있어서, 치료학적 활성제는 치료학적 유효량으로 투여된다.
더욱 바람직한 구체예에 있어서, 진단제로서 사용하기 위한 결합 분자는 진단 화합물에 연결되는 결합 분자이다. 그에 의하여, 환자에 대하여 영상화를 수행하고, 그에 의하여 본 발명의 결합 분자로의 진단 또는 치료의 모니터링 등과 같은 진단을 허용할 수 있다. 따라서, 진단 화합물에 연결되는 본 발명의 결합 분자는 바람직하게는 본 발명의 치료학적 활성제에 연결되는 결합 분자에 대한 동반 진단제이다.
본 발명의 결합 분자는 바람직하게는 약제학적 조성물 내에 포함된다.
화합물이 진단 화합물 및 치료학적 활성제 둘 다인 것이 바람직하다. 하나의 예는 131I 등과 같은 특정한 방사성 핵종이고, 이는 생체 내 영상화 및 종양의 치료 둘 다에 적절할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 본 발명의 결합 분자, 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함한다. 특정한 구체예에 있어서, 용어 "약제학적으로 수용가능한"은 동물에서 그리고 보다 바람직하게는 인간에서 사용하기 위하여 연방 정부 또는 주 정부의 관리 기관에 의하여 승인되거나 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인식되는 약전에 나열된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 그와 함께 치료제가 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 의미한다. 이러한 약제학적 담체는 땅콩유, 대두유, 미네랄 오일(mineral oil), 참기름 등을 포함하나 이로 제한되지 않은 석유, 동물, 식물 또는 합성 유래의 것들을 포함하여 물 및 오일 등과 같은 멸균 액체일 수 있다. 약제학적 조성물이 경구적으로 투여되는 경우 물이 바람직한 담체이다. 약제학적 조성물이 정맥 내로 투여되는 경우 염수 및 수성 덱스트로스가 바람직한 담체이다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 주사가능한 용액을 위한 액체 담체로서 바람직하게 채용된다. 적절한 약제학적 부형제에는 녹말, 글루코스, 락토오스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 소듐스테아레이트, 글리세롤모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 원하는 경우, 조성물은 또한 소량의 적심제 또는 에멀젼화제 또는 pH 완충제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 분말, 지연-방출 제형 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 전통적인 결합제 및 트리글리세리드 등과 같은 담체로 좌약으로 제형화될 수 있다. 경구 제형에는 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 녹말, 마그네슘스테아레이트, 소듐사카린, 셀룰로오스, 마그네슘카보네이트 등과 같은 표준 담체가 포함될 수 있다. 적절한 약제학적 담체의 예들이 "Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 바람직하게는 정제된 형태로의 치료학적 유효량의 치료제를 적절한 양의 담체와 함께 포함하여 환자에의 적절한 투여를 위한 형태를 제공하도록 할 수 있다. 제형은 투여의 방법에 맞아야 한다.
바람직한 구체예에 있어서, 정규 절차에 따라 조성물은 인간 존재에의 정맥 내 투여를 위하여 적응된 약제학적 조성물로 제형화된다. 전형적으로, 정맥 내 투여를 위한 조성물은 멸균의 등장 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한 가용화제 및 주사의 위치에서의 통증을 완화시키기 위한 리도카인 등과 같은 국부 마취제를 포함할 수 있다. 일반적으로, 성분은 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사쳇(sachette) 등과 같은 기밀로 밀봉된 용기 내의 건식의 동결건조된 분말 또는 무수(water-free) 농축물로서 분리되거나 단일의 투여량 형태로 서로 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의하여 투여되어야 하는 경우, 이는 멸균의 약제학적 등급의 물 또는 염수를 포함하는 주입 용기로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의하여 투여되는 경우, 주사를 위한 멸균수 또는 염수의 앰플이 제공되어 성분이 투여 이전에 혼합되도록 할 수 있다.
본 발명의 치료제는 중성 또는 염의 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 수용가능한 염에는 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 파생되는 것 등과 같은 유리 카르복실기로 형성된 것들, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 파생되는 것 등과 같은 유리 아민기로 형성된 것들 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 및 수산화철 등으로부터 파생되는 것들이 포함된다.
특정한 장애 또는 상태의 치료에서 유효한 것일 수 있는 본 발명의 치료제의 양은 장애 또는 상태의 속성에 따를 수 있고, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 게다가, 시험관 내 분석은 선택적으로 투여량 범위를 동정하는 데 도움을 주도록 채용될 수 있다. 제형 중에서 채용되어야 하는 정확한 투여량은 또한 투여의 경로 및 질환 또는 장애의 중증도에 의존적일 수 있고, 의사의 판단 및 각 환자의 환경에 따라 결정되어야 한다. 그러나, 정맥 내 투여를 위한 적절한 투여량 범위는 일반적으로 체중 ㎏ 당 약 20 내지 500 ㎍의 활성 화합물이다. 비내 투여를 위한 적절한 투여량 범위는 일반적으로 약 0.01 pg/㎏ 체중 내지 1 ㎎/㎏ 체중이다. 유효 투여량은 시험관 내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 파생된 투여량-반응 곡선으로부터 외연될 수 있다. 일반적으로, 좌약은 0.5중량% 내지 10중량%의 범위 이내의 활성 성분을 포함할 수 있고; 경구 제형은 바람직하게는 10% 내지 95% 활성성분을 포함한다.
여러 전달 시스템, 예를 들어, 리포좀, 미세입자 및 마이크로캡슐의 사용; 치료제를 발현할 수 있는 재조합 세포의 사용 (예를 들어, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432), 레트로바이러스 또는 다른 벡터 등의 부분으로서의 치료제 핵산의 구축이 공지되어 있고 본 발명의 치료제를 전달하는 데 사용될 수 있다. 도입의 방법에는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내(intranasal), 경막외(epidural) 및 경구 경로가 포함되나 이들로 제한되는 것은 아니다. 화합물은 임의의 편리한 경로에 의하여, 예를 들어 주입에 의하거나, 볼루스 주사에 의하거나, 상피 또는 점막피부 라이닝 (구강, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의하여 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국부적일 수 있다. 게다가, 본 발명의 약제학적 조성물을 중추신경계 내로 뇌실 내 및 척수강 내 주사를 포함하여 임의의 적절한 경로에 의하여 도입시키는 것이 바람직할 수 있고; 뇌실 내 주사는, 예를 들어, 옴마야 저장소(Ommaya reservoir) 등과 같은 저장소에 부착된 뇌실 내 카테터에 의하여 용이하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 분무기 및 에어로졸화제를 수반하는 제형의 사용에 의한 폐 투여가 또한 채용될 수 있다.
특정한 구체예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물을 치료가 요구되는 영역에 국부적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어, 그리고 제한적인 방법이 아닌, 수술 동안의 국부 주입, 예를 들어 수술 이후 상처 드레싱과 함께의 국소 적용으로, 주사로, 카테터의 수단으로, 좌약으로, 또는 이식의 수단으로 달성될 수 있고, 상기 이식은 실라스틱(sialastic) 멤브레인 또는 섬유 등과 같은 막을 포함하여 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴 같은 물질이다. 하나의 구체예에 있어서, 투여는 악성 종양 또는 종양 또는 종양-전(pre-neoplastic) 조직의 부위 (또는 이전 부위(former site))에서의 직접적인 주사로 될 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 치료제는 소포, 특히 리포좀 (Langer, 1990, Science 249:1527-1533), 특히 양이온성 리포좀 (WO 98/40052) 으로 전달될 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 치료제는 제어 방출 시스템을 통하여 전달될 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 펌프가 사용될 수 있다 (Langer, 상기 문헌 ). 또 다른 구체예에 있어서, 제어 방출 시스템은 치료 표적의 근처에 위치될 수 있고, 따라서 전신 투여량의 단지 일부만이 요구될 수 있다.
본 발명의 이러한 양태의 문맥 내에서, 본 발명에는 또한 환자에 치료학적 유효량의 본 발명의 결합 분자, 바람직하게는 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 것을 포함하는 환자의 종양질환을 치료하거나 방지하기 위한 방법이 포함된다.
본 발명을 통하여, 용어 "유효량"은 주어진 분자 또는 화합물이 소정의 치료 효과를 수득하기에 충분한 양으로 투여되는 것을 의미한다. 본 발명을 통하여, 2가지 화합물이 치료학적 유효량으로 투여되는 경우, 이는 화합물들 중의 하나 또는 각각이 필요량 이하 처방의 양(subtherapeutic amount)인 것, 즉 그 자체의 각 화합물의 양이 치료 효과를 제공하기에 충분치 않으나, 화합물들의 조합이 소정의 치료 효과를 제공하는 것을 포함한다. 그러나, 이는 또한 그 자체의 화합물 각각이 치료학적 유효량으로 투여되는 것이 본 발명 내에 포함된다.
본 발명에 따르면, 용어 "종양 질환의 치료"에는 종양 질환으로 고통받는 환자에서 종양 세포의 사멸, 종양 세포의 증식의 감소 (예를 들어 적어도 30%, 적어도 50% 또는 적어도 90%로)와 마찬가지로 종양 세포의 증식의 완전 억제 둘 다 포함된다. 게다가, 이 용어에는 예를 들어 장래에 종양 세포가 될 수 있거나 그러한 경향이 있는 것과 마찬가지로 전이의 형성이 있을 수 있는 세포의 사멸에 의한 종양형성 질환의 방지가 포함된다.
본 발명에 따르면, 숙련된 자에게는 적용되어야 할 개개 요법이 예를 들어 환자의 신체적인 상태들 또는 질환의 중증도에 의존적일 수 있고 따라서 사안별로 조절되어야 한다는 것은 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 결합 분자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 약제학적 조성물과 관련하여, 상기 기술된 모든 구체예들이 또한 적용된다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 종양 질환의 치료 또는 방지에 사용되기 위한 본 발명의 결합 분자, 바람직하게는 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기에서 종양 질환은 상피 종양 질환이고/이거나 성상세포종, 핍지교종, 뇌수막종, 신경섬유종, 교모세포종, 상의세포종, 신경초종, 신경섬유육종, 수모세포종, 흑색종, 췌장암, 전립선 암종, 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 자궁내막암, 신장암, 신경아세포종, 편평상피암, 수모세포종, 간세포암, 결장암, 중피종 및 상피세포암으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 결합 분자 및 선택적으로 하나 이상의 상기한 바와 같은 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 L1에 결합하는 결합 분자에 관한 것이고, 여기에서 결합 분자는 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편이고, 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편의 상보성 결정 영역 (CDR)의 적어도 하나가
a) KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)로부터 선택되는 시퀀스들 중의 하나를 가지거나,
b) a) 이하에 언급된 시퀀스와 비교하여 적어도 하나의 보존적 아미노산 교환을 갖는 시퀀스를 갖는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예에 있어서, 본 발명은 L1에 결합하는 결합 분자에 관한 것이고, 여기에서 결합 분자가
a) KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)로부터 선택되는 시퀀스들 중의 하나
를 포함하거나,
b) a) 이하에 언급된 시퀀스와 비교하여 적어도 하나의 보존적 아미노산 교환을 갖는 시퀀스를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이러한 본 발명의 단일클론항체 또는 그의 항체-결합 단편 또는 결합 분자는 예를 들어 CDR 그라프팅에 의하거나 항체의 재조합 생산에 의하여 생산될 수 있다. 이러한 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있다 (예를 들어 Queen, U.S. Patent No. 5,585,089 및 Winter, U.S: 5,225,539, Cabilly U.S. 4,816,567을 참조하시오).
여기에서 기술되는 본 발명의 바람직한 구체예는 본 발명의 모든 결합 분자 및 단일클론항체 및 그의 항원-결합 단편에 적용된다.
도 1: Skov3ip 세포에서의 mAb L1CAM mAb 9.3의 세포 흡수 측정.
Skov3ip 세포를 Alexa488 콘쥬게이트 L1CAM mAb L1-9.3과 함께 서로 다른 시간 동안 배양시켰다. 후속하여 샘플을 고정시키고 세포 표면 결합 항체를 Alexa647에 결합된 이차 고트-항-마우스 항체를 사용하여 검출하였다. 0분의 시점에서 세포를 얼음 상에서 배양시켜 항체 내재화를 회피하도록 하였다. 샘플을 Amnis ISX 영상화 유세포분석기로 측정하고 3000개의 세포를 수집하고 Amnis IDEAS 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 0분 (A), 60분 (B) 및 90분 (C)의 시점에서 획득된 세포의 대표적인 사진을 나타내고 있다. 그 아래의 그래프의 패널은 샘플의 개별적인 정량화를 나타내고 있다. 0분 (D), 60분 (E) 및 90분 (F) 시점을 묘사하고 있다. y-축은 정규화된 빈도를 나타내고 x-축은 세포의 총 형광 세기에 대한 Alexa488-콘쥬게이트 L1CAM mAb 9.3의 개개 세포내 형광 세기를 나타내고 있다. 그래프 아래의 표는 분석에 포함된 세포의 수 (수) 및 그래프의 평균값 (평균)을 나타내고 있다. 실험은 세 번 반복되었고, 대표적인 결과를 나타내었다.
도 2: Skov3ip 세포에서의 항체 L1CAM mAb OV52.24의 세포 흡수 측정.
Skov3ip 세포를 Alexa488 콘쥬게이트 L1 mAb OV52.24와 함께 서로 다른 시간 동안 배양시켰다. 후속하여 샘플을 고정시키고 세포 표면 결합 항체를 Alexa647에 결합된 이차 고트-항-마우스 항체를 사용하여 검출하였다. 0분의 시점에서 세포를 얼음 상에서 배양시켜 항체 내재화를 회피하도록 하였다. 샘플을 Amnis ISX 영상화 유세포분석기로 측정하고 3000개의 세포를 수집하고 Amnis IDEAS 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 0분 (A), 60분 (B) 및 90분 (C)의 시점에서 획득된 세포의 대표적인 사진을 나타내고 있다. 그 아래의 그래프의 패널은 샘플의 개별적인 정량화를 나타내고 있다. 0분 (D), 60분 (E) 및 90분 (F) 시점을 묘사하고 있다. y-축은 정규화된 빈도를 나타내고 x-축은 세포의 총 형광 세기에 대한 Alexa488-콘쥬게이트 L1 mAb OV52.24의 개개 세포내 형광 세기를 나타내고 있다. 그래프 아래의 표는 분석에 포함된 세포의 수 (수) 및 그래프의 평균값 (평균)을 나타내고 있다. 실험은 세 번 반복되었고, 대표적인 결과를 나타내었다.
도 3: Skov3ip 세포에서의 L1CAM mAb 9.3 및 OV52.24의 세포 흡수 측정.
도면은 도 1 및 도 2로부터의 결과들의 개괄을 제공한다. 서로 다른 시점 0분, 60분 및 90분에 대하여 상부 패널은 L1CAM mAb 9.3에 대한 그리고 하부 패널은 L1CAM mAb OV52.24에 대한 그래프들을 나타낸다.
도 4: 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하는 Skov3ip 세포에서의 L1CAM mAb 9.3 및 OV52.24의 세포 흡수 측정.
Skov3ip 세포를 Alexa488 콘쥬게이트 L1CAM mAb 9.3 또는 OV52.24와 함께 70분 동안 배양시켰다. 후속하여 샘플을 고정시키고 세포 표면 결합 항체를 Alexa647에 결합된 이차 고트-항-마우스 항체를 사용하여 검출하였다. 계속해서 샘플을 Leica SP5 II 공초점 레이저 주사 현미경으로 가시화시켰다. 유사한 z-포지션에서 Z-절편을 획득하였다. 매 항체 n=30 마다 세포를 획득하고 정량화하였다 (A). 영상을 Fiji (ImageJ)를 사용하여 분석하고 세포의 총 형광 세기에 대한 Alexa488-콘쥬게이트 L1 mAb 9.3 및 L1-OV52.24의 세포내 형광 세기를 나타내는 막대 그래프로 플로팅하였다 (B). 실험은 세 번 반복되었고, 대표적인 결과를 나타내었다. 각각 40분 및 90분에 대한 개개 좌측 막대는 mAb 9.3에 대한 결과를 나타내고 있다. 각각 40분 및 90분에 대한 개개 우측 막대는 mAb OV52.24에 대한 결과를 나타내고 있다.
도 5: 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하는 Skov3ip 세포에서의 L1CAM mAb 5G3 및 UJ127.11의 세포 흡수 확인.
Skov3ip 세포를 Alexa488 콘쥬게이트 L1CAM mAb 5G3 및 UJ127.11와 함께 70분 동안 배양시켰다. 후속하여 샘플을 고정시키고 세포 표면 결합 항체를 Alexa647에 결합된 이차 고트-항-마우스 항체를 사용하여 검출하였다. 계속해서 샘플을 Leica SP5 II 공초점 레이저 주사 현미경으로 가시화시켰다. 유사한 z-포지션에서 Z-절편을 획득하였다. 매 항체 n=30 마다 세포를 획득하고 정량화하였다. 대표적인 결과를 나타내었다.
도 6: Skov3ip 세포에서의 항체 L1CAM mAb 9.3, OV52.24, 5G3 및 UJ127.11의 세포 흡수의 측정 및 비교.
Skov3ip 세포를 Alexa488 콘쥬게이트 L1 mAb와 함께 서로 다른 시간 동안 배양시켰다. 후속하여 샘플을 고정시키고 세포 표면 결합 항체를 Alexa647에 결합된 이차 고트-항-마우스 항체를 사용하여 검출하였다. 0분의 시점에서 세포를 얼음 상에서 배양시켜 항체 내재화를 회피하도록 하였다. 샘플을 Amnis ISX 영상화 유세포분석기로 측정하고 5000개의 세포를 수집하고 Amnis IDEAS 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각각 좌측 패널 0분, 중간 패널 60분 및 우측 패널 90분의 시점을 나타내고 있다. y-축은 정규화된 빈도를 나타내고 x-축은 세포의 총 형광 세기에 대한 Alexa488-콘쥬게이트 L1 mab의 개개 세포내 형광 세기를 나타내고 있다. 매 조건에 대한 상대 세포내 형광 세기의 평균값을 그래프로 제공하였다. 실험은 세 번 반복되었고, 대표적인 결과를 나타내었다.
도 7: Skov3ip 세포에서의 L1CAM mAb 9.3, OV52.24, 5G3 및 UJ127.11의 세포 섭취의 비교.
도면은 도 6의 대표적인 분석의 요약을 제공한다. 각 L1CAM mAb에 대한 각 실험의 평균 상대 세포내 세기에 기초하여 3가지 서로 독립적인 실험을 플로팅하였다. 값을 평균 ± 표준편차로 막대 그래프로 표현하였다. 서로 다른 L1CAM mAb의 내재화에서의 통계학적 유의미성의 증가 또는 감소의 확률을 결정하기 위하여, 3가지 독립적인 실험을 양방향, 독립적 Student's t-test를 사용하여 분석하였다. <0.05의 p-값을 통계학적으로 유의미한 것으로 고려하였다. 별표를 다음과 같이 할당하였다: * p≤0.05; ** p≤0.01; *** P≤0.001.
실시예
실시예 1
재료 및 방법
세포주
인간 난소 암종 세포 SKOV3ip를 American Type Culture Collection (Manassas, VA)로부터 수득하였다. 세포주를 German Resource Center for Biological Material (Braunschweig, Germany)에 의해 그리고 연구자에 의한 전형적인 형태학의 평가에 의한 배양을 통하여 실증하였다. 매주 시험에 의하여 마이코플라즈마-음성 배양물을 확증하였다. 10% 열-비활성화 우태혈청 (FCS) (Biochrom, Berlin, Germany), 2 mM L-글루타민 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 및 1 mM 피루브산나트륨 (Invitrogen)으로 보충된 DMEM 배지 (Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany) 중에서 세포를 배양시켰다. 모든 세포를 습윤화된 대기 중에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다.
단일클론항체
인간 L1CAM에 대한 mAb L1-9.3은 앞서 기술되었다 (Wolterink S, Moldenhauer G, Fogel M, Kiefel H, Pfeifer M, Luttgau S, Gouveia R, Costa J, Endell J, Moebius U et al: Therapeutic antibodies to human L1CAM: functional characterization and application in a mouse model for ovarian carcinoma. Cancer Res 2010, 70(6):2504-2515., WO 2008/151819).
L1의 세포막 외부를 포함하는 인간 L1-Fc 단백질로의 마우스의 면역화에 의하거나 면역화를 위한 SKOV3ip 세포를 사용하여 L1-OV52.24를 생성시켰다.
L1-OV52.24 단일클론항체의 면역글로불린 유전자의 cDNA 시퀀스를 결정하고 상기에 나타내었다 (경쇄: 시퀀스 동정 번호: 3 및 중쇄: 시퀀스 동정 번호: 4).
게다가, L1-OV52.24의 중쇄 및 경쇄 (불변 도메인을 수반하지 않는 VDJ 또는 VJ 도메인) 각각의 단백질 시퀀스를 결정하였다 (시퀀스 동정 번호: 2 및 시퀀스 동정 번호: 1). 게다가, Kabat 명명법에 따른 L1-OV52.24의 CDR 시퀀스를 결정하였다. L1-OV52.24의 CDR 시퀀스는: KASQNVGTNVA (LCDR1; 시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (LCDR2; 시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; 시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; 시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; 시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (HCDR3; 시퀀스 동정 번호: 10)이다.
두 mAb들은 IgG1 아이소타입이다.
하나의 아이소타입 대조 mAb가 Bio X Cell (West Lebanon, NH)로부터 수득되었다. L1CAM mAb를 제조업자의 지시에 따라 표지화 키트 (Invitrogen)를 사용하여 Alexa488에 콘쥬게이트시켰다. 요약하면, 100㎍의 항체를 1 바이알의 표지화 시약과 혼합시키고, 1 시간 동안 배양시키고 후속하여 컬럼 상에서 정제하였다. 표지화의 정도를 결정하여 유사한 표지화 효능을 확증하였다.
결합 상수
표면 플라즈몬 공명 ( SPR ) 평형 분석
CM5 센서 칩이 장착된 BIAcore 3000을 사용하여 결합 분석이 수행되었다. 요약하면, BIAcore CM5 칩을 EDC/NHS로 활성화시키고 여러 수준의 L1-Fc를 활성화된 표면 상으로 캡쳐시켰다. 잔여 활성 자리를 에탄올아민/HCl로 블로킹시켰다. L1-mAb를 L1-Fc 표면에 결합시키고 경시적으로 해리가 되도록 허용하였다. 각 밀도 표면 상으로의 각 주사에 대한 결합상 및 해리상을 운동학 분석에 적용시켰다.
인식된 에피토프
에피토프 특이성을 결정하기 위하여, 본 발명자들은 별개의 Ig 도메인을 운반하는 일련의 L1- Fc 단백질을 구축하였다 (Wolterink S, Moldenhauer G, Fogel M, Kiefel H, Pfeifer M, Luttgau S, Gouveia R, Costa J, Endell J, Moebius U et al: Therapeutic antibodies to human L1CAM: functional characterization and application in a mouse model for ovarian carcinoma. Cancer Res 2010, 70(6):2504-2515.에서 기술된 바와 같이). 정밀한 맵핑을 위하여 최근 기술된 재조합 V5-표식 L1 단편이 사용되었다 (Gouveia RM, Morais VA, Peixoto C, et al. Production and purification of functional truncated soluble forms of human recombinant L1 cell adhesion glycoprotein from Spodoptera frugiperda Sf9 cells. Protein Expr Purif 2007;52:182-93). 재조합 단백질이 ELISA에서 또는 Western blot 분석에서 에피토프 맵핑을 위하여 사용되었다.
항체 흡수 분석
영상화 유세포분석 (Imagestream)에 대하여
Skov3ip 세포를 트립신/EDTA로 탈착시키고, 배양 배지 중에 재-현탁시키고, 계수하고 등가의 세포 수 (200 000개의 세포)의 분획으로 구분하였다. 세포를 37℃에서 서로 다른 시점 동안 표지된 항체 (10㎍/㎖)의 연속적인 존재 중에서 또는 얼음 상에서 0분의 시점에서 배양시켰다. 각 시점에서 세포를 800 x g에서 침강시키고, 1회 얼음-냉각 PBS로 세척하고 4% PFA (Thermo Fischer)로 15분 동안 얼음 상에서 고정시켰다. 고정된 세포를 2회 PBS로 세척하고 이차 고트-항-마우스-Alexa-647 항체와 함께 25 ㎍/㎖ (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에서 20분 동안 배양시키고 후속하여 PBS로 2회 세척하였다.
공초점 레이저 주사 현미경에 대하여
25 000개의 세포를 접종시키고 8-웰 μ-슬라이드 (Ibidi, Munich, Germany) 상에서 24시간 동안 성장시켰다. 세포를 37℃에서 서로 다른 시점 동안 표지된 항체 (10㎍/㎖)의 연속적인 존재 중에서 배양시켰다. 각 시점에서 세포를 1회 얼음-냉각 PBS로 세척하고 4% PFA (Thermo Fischer)로 15분 동안 얼음 상에서 고정시켰다. 고정된 세포를 2회 PBS로 세척하고 이차 고트-항-마우스-Alexa-647 항체와 함께 25 ㎍/㎖ (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에서 20분 동안 배양시키고 후속하여 PBS로 2회 세척하였다.
영상화 유세포 및 분석
Amnis ImageStreamX (ISX) (Amnis Corp., Seattle, USA) 상에서 100%까지 설정된 488㎚ 레이저 세트 및 80%까지 설정된 561㎚ 레이저 세트로 60x 대물 및 연장된 심도 (EDF) 옵션 활성화로 샘플이 측정되었다. 채널 2 및 5와 마찬가지로 채널 1에서의 조사영역 영상(brightfield imagery)을 기록하고 샘플 당 4000개의 세포를 수집하였다. Alexa488-결합 L1 mAb에 대한 보상 대조로서 고정 후 그리고 항-마우스-Alexa647 항체로의 계수 염색 이전에 각 항체에 대한 세포의 분획을 취하였다. 세포를 얼음 상에서 개개 미콘쥬게이트 L1 mAb로 콘쥬게이트 항체와 동일 농도에서 염색시키고 항-마우스-Alexa647 항체로의 대조염색을 위한 보상 대조로서 기능하도록 동일한 항-마우스-Alexa647 이차 항체로 대조 염색하였다. ISX에 대한 개개 보상 설정으로 보상 대조를 획득하였다.
IDEAS 소프트웨어 (Amnis Corp., Seattle, USA)로 ISX 데이터의 분석을 수행하였다. 미가공 영상 파일을 오픈하고 개개 보상 파일을 사용하여 보상 매트릭스를 생성시켰다. 획득된 세포를 초점 중의 세포에 대하여 그리고 후속하여 통과에 대하여 대조하기 위하여 조사영역 영상을 사용하여 세포에 대하여 통과시켰다. 채널 5의 영상을 사용하여 "세포-표면 마스크"를 생성시킨 반면에 세기를 200의 하한 및 4095에서 미변화되어 잔류하는 상한으로 제한하여 배경을 제거하고 신호를 최적화시켰다. 채널 2에 대하여는 하한 세기에 대한 컷-오프를 150으로 그리고 4095에서 미변화되어 잔류하는 상한으로 설정하고 "채널 2"로 명명하였다. L1CAM mAb 또는 이차 항체 단독에 대하여 아이소타입 대조로의 대조 염색으로부터 두 설정들을 유도하였다. 추가적으로 "세포 표면 마스크"를 하나의 픽셀로 확장시켜 채널 2 상의 이웃하는 픽셀을 포함하도록 하였다. "세포내 신호"로 명명된 다른 마스크를 생성시키고 이를 "채널 2 및 세포-표면 마스크가 아닌 것"으로 규정하였다. 마지막으로, "상대 세포내 세기"로 칭호된 결합된 특징을 하기 정의 "세포내 신호/(세기_MC_Ch02 * 100)"로 생성시켰다. 개개 히스토그램을 플로팅하고 평균값을 결정하였다. 동일한 절차를 측정된 모든 샘플에 대하여 적용시켰다.
공초점 레이저 주사 현미경 및 분석
샘플을 HyD 검출기가 장착된 Leica SP5 II (Leica microsystems, Wetzlar, Germany) 공초점 레이저 주사 현미경으로 측정하였다. Alexa-488 콘쥬게이트 L1 mAb를 아르곤 레이저를 사용하여 488㎚에서 여기시켰고 633㎚에서의 HeNe 레이저선을 사용하여 Alexa-647을 여기시켰다. 유사한 z-포지션에서 Z-절편을 획득하였다. 매 항체 n=30 마다 세포를 획득하고 정량화하였다. 영상을 Fiji (ImageJ, NIH, Bethesda, USA)를 사용하여 분석하였고 여기에서 항-마우스-Alexa-647로의 세포 표면 계수-염색의 신호가 단일 세포의 경계와 세포내 형광 세기를 분절하고 동정하는 데 사용되었고 계속해서 총 세포 세기가 결정되었다. Excel (Microsoft, Redmond, USA)을 사용하여 세포의 총 형광 세기에 대한 Alexa488-콘쥬게이트 mAb L1-9.3 및 L1-OV52.24의 세포내 형광 세기를 나타내는 막대 그래프로 결과를 플로팅하였다.
결과
mAb L1-9.3 및 L1-OV52-54는 L1CAM 세포 표면 분자의 별개의 세포 표면 에피토프에 결합한다. mAb 9.3은 명백하게 제1 Ig 도메인 (1.Ig-L1-Fc; WO 2008/151819)으로 이루어지는 융합 단백질과 반응한다. Western blot 분석으로, mAb L1-OV52.24가 L1의 4-5FNIII 도메인을 인식한다는 것을 확인하였다. MAb L1-9.3은 제1 Ig-도메인에 결합하는 반면에 L1-OV52.24는 4-5. FNIII 중의 에피토프에 결합한다. mAb 9.3은 L1에 대하여 KD (M)= 8,5*10-11의 친화도 (Wolterink S, Moldenhauer G, Fogel M, Kiefel H, Pfeifer M, Luttgau S, Gouveia R, Costa J, Endell J, Moebius U et al: Therapeutic antibodies to human L1CAM: functional characterization and application in a mouse model for ovarian carcinoma. Cancer Res 2010, 70(6):2504-2515.를 참조하시오)를 갖는 반면에, mAb L1-OV52.24는 L1에 대하여 KD (M)= 2,41*10-9의 친화도를 갖는다. L1-OV52.24가 Western Blot 분석 및 FACS 분석 실험에서 뛰어나게 수행된다는 것이 밝혀졌고 면역조직화학 (IHC) 실험에서 잘 수행된다는 것이 밝혀졌다.
본 발명자들은 상기 재료 및 방법부에서 개괄된 바와 같이 SKOV3ip 세포 내에서 Alex-488 콘쥬게이트 mAb를 사용하여 내재화 분석을 실행하였다. FACS 및 형광 분석을 결합하고 수 천개의 세포의 정량화를 허용하는 ImagestreamX 분석에 의하여 내재화가 측정되었다. 데이터를 IDEAS 소프트웨어로 분석하였다. L1-9.3의 분석은 최종 시점에서 7.8%의 평균으로 0분, 60분 및 90분의 시점에서 느린 내재화를 나타내었다 (도 1 A 내지 F). 대조적으로, mAb L1-OV52.24는 훨씬 빠르게 내재화되었고 최종 시점에서 40%의 평균값에 도달하였다 (도 2 A 내지 F). 데이터를 도 3에서 직접적으로 비교하였다.
이러한 결과를 입증을 위하여 부착된 세포에 대하여 유사한 분석을 실행하였다. SKOV3ip 세포를 커버슬립 상에서 성장시키고 Alexa-콘쥬게이트 항체에 대하여 내재화를 허용하였다. 레이저 주사 현미경 및 세포의 시각적 계수로 정량화를 수행하였다. 염색 실시예를 도 4a에 나타내었고 결과를 도 4b에 요약하였다. 이러한 결과는 Imagestream 분석에 의해 수득된 데이터를 확증하고 mAb L1-OV52.24가 거의 10배 더 높은 내재화 속도를 유발한다는 것을 보여주고 있다. 이 결과는 예기치 못한 것이고 mAb-L1-OV52.24가 항체-약물 콘쥬게이트의 전달에 적절하다는 것을 암시하고 있다.
실시예 2
재료 및 방법
세포주
인간 난소 암종 세포 SKOV3ip를 American Type Culture Collection (Manassas, VA)로부터 수득하였다. 세포주를 German Resource Center for Biological Material (Braunschweig, Germany)에 의해 그리고 연구자에 의한 전형적인 형태학의 평가에 의한 배양을 통하여 실증하였다. 매주 시험에 의하여 마이코플라즈마-음성 배양물을 확증하였다. 10% 열-비활성화 우태혈청 (FCS) (Biochrom, Berlin, Germany), 2 mM L-글루타민 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 및 1 mM 피루브산나트륨 (Invitrogen)으로 보충된 DMEM 배지 (Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany) 중에서 세포를 배양시켰다. 모든 세포를 습윤화된 대기 중에서 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다.
단일클론항체
인간 L1CAM에 대한 mAb L1-9.3, 5G3 및 UJ127.11은 앞서 기술되었다 (Wolterink S, Moldenhauer G, Fogel M, Kiefel H, Pfeifer M, Luttgau S, Gouveia R, Costa J, Endell J, Moebius U et al: Therapeutic antibodies to human L1CAM: functional characterization and application in a mouse model for ovarian carcinoma. Cancer Res 2010, 70(6):2504-2515).
L1의 세포막 외부를 포함하는 인간 L1-Fc 단백질로의 마우스의 면역화에 의하거나 면역화를 위한 SKOV3ip 세포를 사용하여 L1-OV52.24를 생성시켰다.
L1-OV52.24 단일클론항체의 면역글로불린 유전자의 cDNA 시퀀스를 결정하고 상기에 나타내었다 (경쇄: 시퀀스 동정 번호: 3 및 중쇄: 시퀀스 동정 번호: 4).
게다가, L1-OV52.24의 중쇄 및 경쇄 (불변 도메인을 수반하지 않는 VDJ 또는 VJ 도메인) 각각의 단백질 시퀀스를 결정하였다 (시퀀스 동정 번호: 2 및 시퀀스 동정 번호: 1). 게다가, Kabat 명명법에 따른 L1-OV52.24의 CDR 시퀀스를 결정하였다. L1-OV52.24의 CDR 시퀀스는: KASQNVGTNVA (LCDR1; 시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (LCDR2; 시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; 시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; 시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; 시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (HCDR3; 시퀀스 동정 번호: 10)이다.
mAb L1-9.3, L1-OV52.24 및 UJ127.11들은 IgG1 아이소타입이다. mAb 5G3은 IgG2a 아이소타입이다. 대응하는 아이소타입 대조 mAb가 Bio X Cell (West Lebanon, NH)로부터 수득되었다. L1CAM mAb를 제조업자의 지시에 따라 표지화 키트 (Invitrogen)를 사용하여 Alexa488에 콘쥬게이트시켰다. 요약하면, 100㎍의 항체를 1 바이알의 표지화 시약과 혼합시키고, 1 시간 동안 배양시키고 후속하여 컬럼 상에서 정제하였다. 표지화의 정도를 결정하여 유사한 표지화 효능을 확증하였다. Alexa488에 콘쥬게이트된 mAb 5G3을 Novus Biologicals (Littleton, USA)로부터 구입하였다.
항체 흡수 분석
영상화 유세포분석 (Imagestream)에 대하여
Skov3ip 세포를 트립신/EDTA로 탈착시키고, 배양 배지 중에 재-현탁시키고, 계수하고 등가의 세포 수 (200 000개의 세포)의 분획으로 구분하였다. 세포를 37℃에서 서로 다른 시점 동안 표지된 항체 (10㎍/㎖)의 연속적인 존재 중에서 또는 얼음 상에서 0분의 시점에서 배양시켰다. 각 시점에서 세포를 800 x g에서 침강시키고, 1회 얼음-냉각 PBS로 세척하고 4% PFA (Thermo Fischer)로 15분 동안 얼음 상에서 고정시켰다. 고정된 세포를 2회 PBS로 세척하고 이차 고트-항-마우스-Alexa-647 항체와 함께 25 ㎍/㎖ (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에서 20분 동안 배양시키고 후속하여 PBS로 2회 세척하였다.
공초점 레이저 주사 현미경에 대하여
25 000개의 세포를 접종시키고 8-웰 μ-슬라이드 (Ibidi, Munich, Germany) 상에서 24시간 동안 성장시켰다. 세포를 37℃에서 서로 다른 시점 동안 표지된 항체 (10㎍/㎖)의 연속적인 존재 중에서 배양시켰다. 각 시점에서 세포를 1회 얼음-냉각 PBS로 세척하고 4% PFA (Thermo Fischer)로 15분 동안 얼음 상에서 고정시켰다. 고정된 세포를 2회 PBS로 세척하고 이차 고트-항-마우스-Alexa-647 항체와 함께 25 ㎍/㎖ (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에서 20분 동안 배양시키고 후속하여 PBS로 2회 세척하였다.
영상화 유세포 및 분석
Amnis ImageStreamX (ISX) (Amnis Corp., Seattle, USA) 상에서 100%까지 설정된 488㎚ 레이저 세트 및 80%까지 설정된 561㎚ 레이저 세트로 60x 대물 및 연장된 심도 (EDF) 옵션 활성화로 샘플이 측정되었다. 채널 2 및 5와 마찬가지로 채널 1에서의 조사영역 영상을 기록하고 샘플 당 10.000개의 세포를 수집하였다. Alexa488-결합 L1 mAb에 대한 보상 대조로서 고정 후 그리고 항-마우스-Alexa647 항체로의 계수 염색 이전에 각 항체에 대한 세포의 분획을 취하였다. 세포를 얼음 상에서 개개 미콘쥬게이트 L1 mAb로 콘쥬게이트 항체와 동일 농도에서 염색시키고 항-마우스-Alexa647 항체로의 대조염색을 위한 보상 대조로서 기능하도록 동일한 항-마우스-Alexa647 이차 항체로 대조 염색하였다. ISX에 대한 개개 보상 설정으로 보상 대조를 획득하였다.
IDEAS 소프트웨어 (Amnis Corp., Seattle, USA)로 ISX 데이터의 분석을 수행하였다. 미가공 영상 파일을 오픈하고 개개 보상 파일을 사용하여 보상 매트릭스를 생성시켰다. 획득된 세포를 초점 중의 세포에 대하여 그리고 후속하여 통과에 대하여 대조하기 위하여 조사영역 영상을 사용하여 세포에 대하여 통과시켰다. 채널 5의 영상을 사용하여 "세포-표면 마스크"를 생성시킨 반면에 세기를 200의 하한 및 4095에서 미변화되어 잔류하는 상한으로 제한하여 배경을 제거하고 신호를 최적화시켰다. 채널 2에 대하여는 하한 세기에 대한 컷-오프를 150으로 그리고 4095에서 미변화되어 잔류하는 상한으로 설정하고 "채널 2"로 명명하였다. L1 mAb 또는 이차 항체 단독에 대하여 아이소타입 대조로의 대조 염색으로부터 두 설정들을 유도하였다. 추가적으로 "세포 표면 마스크"를 하나의 픽셀로 확장시켜 채널 2 상의 이웃하는 픽셀을 포함하도록 하였다. "세포내 신호"로 명명된 다른 마스크를 생성시키고 이를 "채널 2 및 세포-표면 마스크가 아닌 것"으로 규정하였다. 마지막으로, "상대 세포내 세기"로 칭호된 결합된 특징을 하기 정의 "세포내 신호/(세기_MC_Ch02 * 100)"로 생성시켰다. 개개 히스토그램을 플로팅하고 평균값을 결정하였다. 동일한 절차를 측정된 모든 샘플에 대하여 적용시켰다.
공초점 레이저 주사 현미경
샘플을 HyD 검출기가 장착된 Leica SP5 II (Leica microsystems, Wetzlar, Germany) 공초점 레이저 주사 현미경으로 측정하였다. Alexa-488 콘쥬게이트 L1 mAb를 아르곤 레이저를 사용하여 488㎚에서 여기시켰고 633㎚에서의 HeNe 레이저선을 사용하여 Alexa-647을 여기시켰다. 유사한 z-포지션에서 Z-절편을 획득하였다. 매 항체 n=30 마다 세포를 획득하였다. 대표 영상을 나타내었다.
통계학
적어도 3개의 독립적인 실험의 조건들 간에서의 통계학적 유의미성의 증가 또는 감소의 확률을 Student's t-test을 사용하여 결정하였다. 양방향, 독립적 t-test가 수행되었다. 값을 평균±표준편차로 막대 그래프로 표현하였다. <0.05의 p-값을 통계학적으로 유의미한 것으로 고려하였다. 그래프에서의 유의미성을 별표를 사용하는 것에 의하여 나타내었다. 별표를 다음과 같이 할당하였다: * p≤0.05; ** p≤0.01; *** P≤0.001.
결과
실시예 2의 결과를 도 5 내지 7에 나타내었다. 본 발명자들은 상기 재료 및 방법부에서 개괄된 바와 같이 SKOV3ip 세포 내에서 Alex-488 콘쥬게이트 mAb를 사용하여 내재화 분석을 실행하였다. FACS 및 형광 분석을 결합하고 수 천개의 세포의 정량화를 허용하는 ImagestreamX 분석에 의하여 내재화가 측정되었다. 데이터를 IDEAS 소프트웨어로 분석하였다. 분석은 선행기술의 단일클론항체 L1-9.3, 5G3 및 UJ127.11에 대하여 시점 0분, 60분 및 90분에서 느린 내재화를 나타내었다 (도 6). 대조적으로, 본 발명의 mAb L1-OV52.24는 훨씬 빠르게 내재화되었고 최종 시점에서 41,7%의 평균값에 도달하였다 (도 6). 데이터를 도 7에 요약하였다. 놀랍게도 90분에서의 L1-OV52.24의 내재화가 통계학적으로 각각 p-값 ≤ 0.01로 선행기술 항-L1 단일클론항체 9.3, 5G3 및 UJ127.11 중의 임의의 것의 내재화 보다 더 높다는 것이 밝혀졌다.
이러한 결과를 입증을 위하여, 부착된 세포에 대하여 유사한 분석을 실행하였다. SKOV3ip 세포를 커버슬립 상에서 성장시키고 Alexa-콘쥬게이트 항체에 대하여 내재화를 허용하였다. 레이저 주사 현미경 및 세포의 시각적 계수로 정량화를 수행하였다. 염색 실시예를 도 5에 나타내었다. 이러한 결과는 Imagestream 분석에 의해 수득된 데이터를 확증하고 mAb L1-OV52.24가 놀랍게도 L1CAM에 대하여 지향되는 선행기술 항체와 비교하여 더 높은 내재화 속도를 유발한다는 것을 보여주고 있다. 이 결과는 예기치 못한 것이고 mAb-L1-OV52.24가 항체-약물 콘쥬게이트의 전달에 적절하다는 것을 암시하고 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des ?fentlichen Rechts <120> Novel binding molecule binding to L1 <130> D69332PC <150> EP 14003383.8 <151> 2014-09-30 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain VJ domain of L1-OV52.24 <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain VDJ domain of L1-OV52.24 <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Lys Thr Val Phe Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Ser Ile Ser Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asn Pro Leu Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 816 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain sequence <400> 3 tttgatgact gctttgcata gatccctaga ggccagccca gctgcccatg atttataaac 60 caggtctttg cagtgagatc tgaaatacat cagatcagca tgggcatcaa gatggagtca 120 cagactcagg tctttgtata catgttgctg tggttgtctg gtgttgatgg agacattgtg 180 atgacccagt ctcaaaaatt catgtccaca tcagtaggag acagggtcag cgtcacctgc 240 aaggccagtc agaatgtggg tactaatgtg gcctggtatc aacagaaacc aggtcactct 300 cctaaagcac tgatttactc gacatcctac cggtacagtg gagtccctga tcgcttcaca 360 ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatccgca atgtgcagtc tgaagacttg 420 gcagagtact tctgtcagca atataacacc tatccgtaca cgttcggagg ggggaccaag 480 ctggaaataa aacgggctga tgctgcacca actgtatcca tcttcccacc atccagtgag 540 cagttaacat ctggaggtgc ctcagtcgtg tgcttcttga acaacttcta ccccaaagac 600 atcaatgtca agtggaagat tgatggcagt gaacgacaaa atggcgtcct gaacagttgg 660 actgatcagg acagcaaaga cagcacctac agcatgagca gcaccctcac gttgaccaag 720 gacgagtatg aacgacataa cagctatacc tgtgaggcca ctcacaagac atcaacttca 780 cccattgtca agagcttcaa caggaatgag tgttag 816 <210> 4 <211> 1490 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain sequence <400> 4 ctgcctcatg aatatgcaaa catgagtctg tgattataaa tacagagata tccataccaa 60 acaacttatg agcactgttt tctctacagt cactgaatct caaggtcctt acaatgcaat 120 gcagctgggt catcttcttc ctgatggcag tggttacagg ggtcaattca gaggttcagc 180 tgcagcagtc tggggctgag cttgtgaggc caggggcctt agtcaagttg tcctgcaaag 240 cttctggctt caacattaaa gactactata tgcagtgggt gaagcagagg cctgaacagg 300 gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtaa aacagttttt gacccgaagt 360 tccggggcaa ggccagtata tcagcggaca catcctccaa cacagcctac ctgcagctca 420 gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtgc tagatggaac ccccttgcct 480 tctggggcca agggactctg gtcactgtct ctgcagccaa aacgacaccc ccatctgtct 540 atccactggc ccctggatct gctgcccaaa ctaactccat ggtgaccctg ggatgcctgg 600 tcaagggcta tttccctgag ccagtgacag tgacctggaa ctctggatcc ctgtccagcg 660 gtgtgcacac cttcccagct gtcctggagt ctgacctcta cactctgagc agctcagtga 720 ctgtcccctc cagccctcgg cccagcgaga ccgtcacctg caacgttgcc cacccggcca 780 gcagcaccaa ggtggacaag aaaattgtgc ccagggattg tggttgtaag ccttgcatat 840 gtacagtccc agaagtatca tctgtcttca tcttcccccc aaagcccaag gatgtgctca 900 ccattactct gactcctaag gtcacgtgtg ttgtggtaga catcagcaag gatgatcccg 960 aggtccagtt cagctggttt gtagatgatg tggaggtgca cacagctcag acgcaacccc 1020 gggaggagca gttcaacagc actttccgct cagtcagtga acttcccatc atgcaccagg 1080 actggctcaa tggcaaggag ttcaaatgca gggtcaacag tgcagctttc cctgccccca 1140 tcgagaaaac catctccaaa accaaaggca gaccgaaggc tccacaggtg tacaccattc 1200 cacctcccaa ggagcagatg gccaaggata aagtcagtct gacctgcatg ataacagact 1260 tcttccctga agacattact gtggagtggc agtggaatgg gcagccagcg gagaactaca 1320 agaacactca gcccatcatg aacacgaatg gctcttactt cgtctacagc aagctcaatg 1380 tgcagaagag caactgggag gcaggaaata ctttcacctg ctctgtgtta catgagggcc 1440 tgcacaacca ccatactgag aagagcctct cccactctcc tggtaaatga 1490 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 5 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 6 Ser Thr Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 7 Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 8 Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Met Gln 1 5 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 9 Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Lys Thr Val Phe Asp Pro Lys Phe Arg 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 10 Trp Asn Pro Leu Ala Phe 1 5

Claims (18)

  1. L1에 결합하는 결합분자로서,
    상기 결합 분자가 항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편이거나,
    상기 결합 분자가 단일 사슬 항체이거나,
    상기 결합 분자가 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고,
    상기 결합분자는 상보성 결정 영역(CDR) LCDR1인 KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5), LCDR2인 STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6), LCDR3인 QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7), HCDR1인 FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8), HCDR2인 WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9) 및 HCDR3인 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)을 포함하는 결합 분자.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 결합 분자는 scFv 및 다이어바디, 트라이어바디 또는 테트라바디 같은 scFv의 다량체, Fab, tandab, 플렉서바디 및 이중특이성 항체로부터 선택되는 결합 분자.
  3. 제 1 항에 있어서,
    여기에서 에피토프가 L1의 피브로넥틴 도메인 III 4-5 (FN III 4-5) 내에 존재하는 결합 분자.
  4. 제 1 항에 있어서,
    항-L1 단일클론항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)이 상기 KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5)를 갖는 LCDR1, STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6)를 갖는 LCDR2, QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7)를 갖는 LCDR3, FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8)를 갖는 HCDR1, WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9)를 갖는 HCDR2 또는 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10)를 갖는 HCDR3의 시퀀스와 비교하여 적어도 하나의 보존적 아미노산 교환을 갖는 것을 특징으로 하는 결합 분자.
  5. 제 1 항에 있어서,
    (i) 적어도 10-9 M의 친화도 (KD)로 L1을 결합하거나,
    (ii) L1을 발현하는 포유동물 세포에 의해 내재화되는 결합 분자.
  6. 제 1 항에 있어서,
    단일클론항체 L1-OV52.24 또는 그의 항원-결합 단편이고,
    여기에서 L1-OV52.24의 경쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 1에 따른 시퀀스를 가지거나 여기에서 경쇄가 시퀀스 동정 번호: 3에 의해 인코딩되고, 여기에서 L1-OV52.24의 중쇄의 가변부가 시퀀스 동정 번호: 2에 따른 시퀀스를 가지거나, 여기에서 중쇄가 시퀀스 동정 번호: 4에 의해 인코딩되는 결합 분자.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    (a) 치료학적 활성제, 또는
    (b) 진단 화합물에 연결되는 결합 분자.
  8. 제 1 항의 항-L1 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포.
  9. (i) 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 따른 결합 분자를 코딩하거나
    (ii) 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 따른 결합 분자의 적어도 하나의 사슬을 인코딩하고,
    (iii) 시퀀스 동정 번호: 3에 따르거나 시퀀스 동정 번호: 4에 따른 시퀀스를 포함하고,
    (iv) 시퀀스 KASQNVGTNVA (시퀀스 동정 번호: 5), STSYRYS (시퀀스 동정 번호: 6), QQYNTYPYT (시퀀스 동정 번호: 7), FNIKDYYMQ (시퀀스 동정 번호: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (시퀀스 동정 번호: 9) 및 WNPLAF (시퀀스 동정 번호: 10) 를 인코딩하는 시퀀스를 포함하는 핵산.
  10. 약물 또는 진단 시약으로서의 사용을 위한 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항의 결합 분자.
  11. 종양 질환의 치료 또는 방지에서 사용하기 위한 것이고, 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항의 결합 분자.
  12. 제 11 항에 있어서,
    종양 질환이 상피 종양 질환이거나 성상세포종, 핍지교종, 뇌수막종, 신경섬유종, 교모세포종, 상의세포종, 신경초종, 신경섬유육종, 수모세포종, 흑색종, 췌장암, 전립선 암종, 두경부암, 유방암, 폐암, 난소암, 자궁내막암, 신장암, 신경아세포종, 편평상피암, 간세포암, 결장암, 중피종 및 상피세포암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 결합 분자.
  13. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항의 결합 분자 및 선택적으로 하나 이상의 약제학적으로 수용가능한 담체를 포함하고, 종양 질환의 치료 또는 방지에 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  14. 제 7 항에 있어서,
    화학요법 화합물, 세포독성 화합물, 세포증식억제 화합물, 사이토카인, 나노입자 및 방사성 핵종으로부터 선택되는 치료학적 활성제에 연결되는 결합 분자.
  15. 제 7 항에 있어서,
    방사성 핵종, 화학발광 화합물, 형광 화합물, 염료 및 효소로부터 선택되는 진단 화합물에 연결되는 결합 분자.
  16. 제 7 항에 있어서,
    결합 분자가 선택적으로 링커를 통해 (a) 치료학적 활성제 또는 (b) 진단 화합물에 공유적으로 연결되는 결합 분자.
  17. 제 5 항에 있어서,
    (i) 적어도 10-10M의 친화도(KD)로 L1을 결합되거나,
    (ii) L1을 발현하는 포유동물 세포에 의해 내재화되며, 여기서 세포는 SKOV3ip 세포인 결합 분자.
  18. 제 9 항에 있어서,
    핵산이 백터의 일부인 핵산.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107118271B (zh) * 2016-12-21 2021-01-22 四川百利药业有限责任公司 可用于富集人l1cam蛋白的抗原多肽和单克隆抗体
EP3755327A4 (en) * 2018-02-23 2021-11-24 REMD Biotherapeutics, Inc. CALCITONIN GENE-RELATED PEPTIDE ANTAGONIST ANTIBODIES (CGRP)
WO2020003210A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Kangwon National University University-Industry Cooperation Foundation Anti-l1cam antibodies and uses thereof
WO2020010235A1 (en) * 2018-07-05 2020-01-09 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Car t cells that target b-cell antigens
CN108949997A (zh) * 2018-08-24 2018-12-07 南京求臻基因科技有限公司 一种肺癌检测标志物及诊断试剂盒
CN112239505B (zh) * 2020-10-13 2022-05-20 上海良润生物医药科技有限公司 重组抗cd171八价抗体及神经来源外泌体的捕获方法
CN112010980B (zh) * 2020-10-13 2021-01-22 上海良润生物医药科技有限公司 重组抗cd171双特异抗体及神经来源外泌体的捕获方法
WO2023078224A1 (zh) * 2021-11-03 2023-05-11 同润生物医药(上海)有限公司 新型抗l1cam抗体
CN114933636B (zh) * 2022-06-24 2023-05-09 浙江省人民医院 靶向l1cam的多肽及其应用
WO2024062038A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Elthera Ag Novel binding molecules binding to l1cam

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE768377T1 (de) 1988-09-02 1998-01-02 Dyax Corp Herstellung und Auswahl von Rekombinantproteinen mit verschiedenen Bindestellen
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE69027210T2 (de) 1989-04-21 1997-01-23 Us Health Rekombinantes antikörper-toxin-fusion-protein
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
ES2113940T3 (es) 1990-12-03 1998-05-16 Genentech Inc Metodo de enriquecimiento para variantes de proteinas con propiedades de union alteradas.
DE69233697T2 (de) 1991-03-01 2008-01-24 Dyax Corp., Cambridge Verfahren zur Entwicklung von bindenden Mikroproteinen
DE69233750D1 (de) 1991-04-10 2009-01-02 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer Rezeptoren mittels Phagemiden
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
AU4953693A (en) 1992-08-25 1994-03-15 Medac Gesellschaft Fur Klinische Spezialpraparate Mbh Antibody/radioisotope conjugate for tumor diagnosis and/or therapy
US5837283A (en) 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
GB0209893D0 (en) 2002-04-30 2002-06-05 Molmed Spa Conjugate
KR100470535B1 (ko) 2002-06-27 2005-02-22 재단법인서울대학교산학협력재단 유피에이 항체 부착 이뮤노리포좀
US20040202666A1 (en) 2003-01-24 2004-10-14 Immunomedics, Inc. Anti-cancer anthracycline drug-antibody conjugates
AU2006287416A1 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Medimmune, Llc Toxin conjugated Eph receptor antibodies
SI2502938T1 (sl) * 2006-10-27 2015-05-29 Genentech, Inc. Protitelesa in imunokonjugati in njihove uporabe
CA2691075C (en) * 2007-06-15 2017-04-11 Daniela Gast Treatment of tumors using specific anti-l1 antibody
AU2008201871A1 (en) * 2008-04-16 2009-11-26 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Oeffentlichen Rechts Inhibition of angiogenesis and tumor metastasis
WO2014100740A1 (en) * 2012-12-21 2014-06-26 Seattle Genetics, Inc. Anti-ntb-a antibodies and related compositions and methods

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cancer Res, 제70권 제6호 2504-15면 (2010)
인용발명1

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Publication number Publication date
US10400037B2 (en) 2019-09-03
WO2016050702A1 (en) 2016-04-07
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