JP2017536089A

JP2017536089A - Ｌ１ｃａｍ（ｃｄ１７）と結合する抗体などの結合性分子

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Publication number: JP2017536089A
Application number: JP2017517081A
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Inventors: アルテヴォーク、ペーター; リュツトガウ、サンドラ; モルデンハウアー、ゲルハルト; ハージン、ヨーン
Original assignee: ドイチェスクレブスフォルシュングスツェントルムシュティフトゥングデスエッフェントリッヒェンレヒツ
Priority date: 2014-09-30
Filing date: 2015-09-28
Publication date: 2017-12-07
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Abstract

モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４に認識される同じＬ１エピトープと結合可能で、及び／又は、Ｌ１との結合において前記モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４と拮抗する、Ｌ１と結合する結合性分子を提供する。Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部分はＳＥＱＩＤＮｏ．１の配列をもつか、又は、前記軽鎖はＳＥＱＩＤＮｏ．３でコードされる。また、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部分はＳＥＱＩＤＮｏ．２の配列をもつか、又は、前記重鎖はＳＥＱＩＤＮｏ．４でコードされる。さらに、結合性分子をコードする核酸類と利用方法、並びに、結合性分子からなる薬学的組成物を提供する。

Description

本発明は、Ｌ１と結合する結合性分子であって、モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４によって認識される同じＬ１エピトープと結合する、及び／又は、Ｌ１との結合においてモノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４と拮抗する結合性分子に係る。Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部分は、ＳＥＱＩＤＮｏ．1の配列をもつか、又は、前記軽鎖はＳＥＱＩＤＮｏ．３によってコードされる。また、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部分は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２の配列をもつか、又は、前記重鎖はＳＥＱＩＤＮｏ．４によってコードされる。さらに、本発明は、前記結合性分子をコードする核酸、その利用方法、並びに前記結合性分子からなる薬学的組成物に係る。

モノクローナル抗体類は（ｍＡｂｓ）、癌治療における新規で重要な柱となっている［非特許文献１］。過去二十年間に、分子生物学によって主要な悪性疾患［非特許文献２］を治療するためにキメラ型抗体、ヒト化抗体又は完全なヒト抗体を調製する手段が提供されてきた。今日まで、数多くの抗体類及び抗体−複合体が、欧州及び米国で上市された癌治療薬として認可されている［非特許文献３及び４］。これらの薬には、非変性抗体、抗体薬複合体のみならず放射性核種との複合体や二重特異性抗体［非特許文献５］が含まれる。しかし、目的の癌抗原に対するモノクローナル抗体類は、癌細胞への標的能力に差異があることが周知である。

最近の研究において、本発明者らは、Ｌ１ＣＡＭ（Ｌ１とも称する）がヒト癌の優れた標的分子であることを明らかにした。Ｌ１ＣＡＭは、多くのヒト癌において過剰発現し、予後不良を起こし、細胞運動性、浸潤及び転移などを増大させる。ゼノグラフトモデル［非特許文献６］及びヒトＬ１ＣＡＭトランスジェニックマウスモデル［非特許文献７］の結果から、Ｌ１ＣＡＭｍＡｂＬ１−９．３（ｍＡｂ９．３とも称する）が癌治療のために有望なツールとなる可能性が示唆された。このｍＡｂドメインは、Ｌ１ＣＡＭ分子の第１のＩｇ様ドメインと結合し、良好なＡＤＣＣ機能を有する［非特許文献６］。最近の研究結果では、ＩｇＧ２ａのｍＡｂが免疫系活性化に好適であり、免疫エフェクター細胞を駆り出して癌細胞を駆逐することが示された［非特許文献６及び７］。従って、ｍＡｂ依存的腫瘍治療の重要な担い手となるＡＤＣＣ依存的作用機構に対して、このｍＡｂが特に好適であるという十分な証拠がある。
また、特許文献１は、Ｌ１の第１のＩｇドメイン内でエピトープと結合する抗Ｌ１抗体９．３を開示する。

抗体薬複合体の最近の進歩により、迅速に内在化する機能を有するｍＡｂが求められている。Ｌ１ＣＡＭ特異的抗体と結合させてＬ１ＣＡＭの内在化を起こし、続いて標的分子の再利用又は分解が起きることが良く知られている［非特許文献８］。Ｌ１ＣＡＭ分子は、その他多数の細胞表面分子と共通して、この内在化の機能を有する。事実、Ｌ１ＣＡＭの内在化は、Ｌ１ＣＡＭ介在細胞の接着シグナリング及び接着調節に必要なことが知られている［非特許文献９−１１］。

WO 2008/151819

Galluzzi L, Vacchelli E, Fridman WH, Galon J, Sautes-Fridman C, Tartour E, Zucman-Rossi J, Zitvogel L, Kroemer G: Trial Watch: Monoclonal antibodies in cancer therapy. Oncoimmunology 2012, 1(1):28-37. Presta LG: Molecular engineering and design of therapeutic antibodies. Curr Opin Immunol 2008, 20(4):460-470. Reichert JM: Marketed therapeutic antibodies compendium. MAbs 2012, 4(3). Reichert JM: Antibodies to watch in 2014: mid-year update. mAbs 2014, 6(4):799-802. Reichert JM: Antibody-based therapeutics to watch in 2011. MAbs 2011, 3(1):76-99. Wolterink S, Moldenhauer G, Fogel M, Kiefel H, Pfeifer M, Luttgau S, Gouveia R, Costa J, Endell J, Moebius U et al: Therapeutic antibodies to human L1CAM: functional characterization and application in a mouse model for ovarian carcinoma. Cancer Res 2010, 70(6):2504-2515. Doberstein K, Harter PN, Haberkorn U, Bretz NP, Arnold B, Carretero R, Moldenhauer G, Mittelbronn M, Altevogt P: Antibody therapy to human L1CAM in a transgenic mouse model blocks local tumor growth but induces EMT. International journal of cancer Journal international du cancer 2014. Novak-Hofer I, Amstutz HP, Morgenthaler JJ, Schubiger PA: Internalization and degradation of monoclonal antibody chCE7 by human neuroblastoma cells. International journal of cancer Journal international du cancer 1994, 57(3):427-432. Schaefer AW, Kamiguchi H, Wong EV, Beach CM, Landreth G, Lemmon V: Activation of the MAPK signal cascade by the neural cell adhesion molecule L1 requires L1 internalization. The Journal of biological chemistry 1999, 274(53):37965-37973. Long KE, Asou H, Snider MD, Lemmon V: The role of endocytosis in regulating L1-mediated adhesion. The Journal of biological chemistry 2001, 276(2):1285-1290. Schaefer AW, Kamei Y, Kamiguchi H, Wong EV, Rapoport I, Kirchhausen T, Beach CM, Landreth G, Lemmon SK, Lemmon V: L1 endocytosis is controlled by a phosphorylation-dephosphorylation cycle stimulated by outside-in signaling by L1. The Journal of cell biology 2002, 157(7):1223-1232.

数報の文献が、Ｌ１ＣＡＭが抗体誘導されて内在化することを報告しているが（ほとんどがポリクローナル抗体を使用）、ｍＡｂを用いた系統的研究は行われていない。従って、Ｌ１ＣＡＭ分子の異なるエピトープ類が関与する場合、内在化速度が異なる結果を与えるか否かについて、今のところ知られていない。現在、本発明者らはＦＮＩＩＩ−４−５に結合する、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４（またはＯＶ５２．２４）と呼ばれるＬ１ＣＡＭ特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製している。このｍＡｂは、先に同定されたｍＡｂＬ１−９．３よりもはるかに優れた内在化速度をもつという驚くべきことを本発明者らは見出した。また、本発明者らは、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４が、抗Ｌ１ＣＡＭモノクローナル抗体５Ｇ３及びＵＪ１２７．１１よりも、それぞれ、はるかに優れた内在化速度をもつという驚くべきことも見出した。Ｌ１−ＯＶ５２．２４のユニークな機能により、癌細胞への薬物輸送の向上及び加速化を実現することが可能となる。

本発明の抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４が有する幾つかの機能が一部既に開示されているとしても（例えば［非特許文献６］）、抗体自身、又は、本発明の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列は、非公表であり公開されてはいない。
多くの治療用活性薬剤は、細胞内でのみ効果を発揮する。よって、治療用活性薬剤が未修飾の形態で細胞内に入ることができない場合に、腫瘍細胞内に効率的に移行し、結合性試薬と連結した薬剤を腫瘍細胞に導入できるモノクローナル抗体類、或いは、これら抗体類の抗原結合性断片類などの結合性試薬が求められている。
本発明者らは、驚くべきことに、モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４が、Ｌ１−保有哺乳類細胞内に、迅速且つ効率的に内在化することを見出した。この発見は、実施例に示すように、それぞれ４０、６０、７０又は９０分間、Ｌ１−ＯＶ５２．２４と培養した細胞を、顕微鏡的に分析、並びにイメージングフローサイトメトリーで同定したものである。

従って、Ｌ１と結合し、Ｌ１−ＯＶ５２．２４によって認識される同じＬ１エピトープと結合するこれらモノクローナル抗体類、又は、抗体などのその他結合性分子類は、生物工学的研究、診断又は治療の分野において、驚くべき利点を有する。特に、内在化によって細胞内に取り込まれる本発明の結合性分子と、活性薬剤とを連結させてもよい。こうすることで、これら活性薬剤は、細胞毒性効果又は細胞増殖抑制効果などの所望の効果を細胞内で発揮できる。
ある実施形態中、本発明は、モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４により認識される同じＬ１エピトープと結合できる、Ｌ１と結合する結合性分子に係る。Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部分は、好適にはＳＥＱＩＤＮｏ．１の配列をもつか、又は、前記軽鎖はＳＥＱＩＤＮｏ．３によってコードされることを特徴とする。また、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部分は、好適にはＳＥＱＩＤＮｏ．２の配列をもつか、又は、前記重鎖はＳＥＱＩＤＮｏ．４によってコードされることを特徴とする。

ＳＥＱＩＤＮｏ．１はＶＪドメイン、つまり、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部分に係る。前記軽鎖の定常ドメインは当技術分野で公知であり、そのマウスｃＤＮＡ配列を以下に記載する。
また、ＳＥＱＩＤＮｏ．２はＶＪＤドメイン、つまり、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部分に係る。前記重鎖の定常ドメインは当技術分野で公知であり、そのマウスｃＤＮＡ配列を以下に記載する。
Ｌ１或いはＬ１ＣＡＭとして知られるものは、膜貫通タンパク質であり、神経細胞接着分子であり、Ｌ１タンパク質ファミリーの一員であり、２００−２２０ｋＤａを有し、治療抵抗性癌と密接に関係する軸索誘導や細胞移動に関与する。本発明によれば、Ｌ１は哺乳類Ｌ１タンパク質として理解されることが好ましく、ヒト又はマウスＬ１タンパク質として理解されることがより好ましい。ヒトＬ１タンパク質のジェンバンク登録は、ＮＰ＿０００４１６であり、マウスＬ１タンパク質のジェンバンク登録は、ＮＰ＿０３２５０４である。Ｌ１ＣＡＭは、ＣＤ１７１とも称される。

また、エピトープとは、抗体又は関連する結合性分子によって認識される抗原の一部のことである。例えば、エピトープは、抗体が結合する、抗原の特定部分である。また、エピトープ類は、構造エピトープ又は線型エピトープに分けられる。構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続部分から構成される。このようなエピトープ類は、抗原の三次元的表面構造及び形状、又は、三次構造に基づいてパラトープと相互作用する。なお、エピトープ類において、構造エピトープが占める割合は知られていない。

Ｌ１−ＯＶ５２．２４が、Ｌ１のフィブロネクチンＩＩＩ４−５ドメイン内部のエピトープと結合して認識することを、実施例において示した。結合性分子がエピトープと結合して認識することを測定する方法は、先行技術（Ｗｏｌｔｅｒｉｎｋ等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．（２０１０），７０，２５０４−２５１５）及び実施例に記載される。実施例で示したように、認識されたエピトープは、各々異なるＩｇドメインを輸送する、一連のＬ１−Ｆｃタンパク質を構成することを通して好適に測定できる。実施例の精密マッピング用に、例えば、Ｇｏｕｖｅｉａ等（ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐr.Ｐｕｒｉｆ．（２００７），５２，１８２−１９３）に記載されるように、組換Ｖ５で標識したＬ１断片を使用することができる。この組換タンパク質を、エピトープマッピング用に、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット分析において使用できる。ｍＡｂ類Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、Ｌ１の４−５ＦＮＩＩＩドメインと反応する。通常、目的とする抗体のエピトープを測定する方法は当技術分野で知られており、目的とする領域の合成線型ペプチドを調製し、続いて、このペプチドに抗体が結合するか否かを試験することを含む（エピトープマッピング、実用方法、オクスフォード大学出版社、２００１、ＯｌｗｙｎＷｅｓｔｗｏｏｄ及びＦｒａｎｋＨａｙ編集）。
或いは、目的の領域をカバーする様々な組換タンパク質を調製し、抗体との結合性を試験する（Ｏｌｅｓｚｅｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｐ．ｖｏｎｄｅｒＬｉｅｔｈ，Ｗ．Ｒａｕｃｈ，Ｕ．，Ａｌｔｅｖｏｇｔ，Ｐ．Ｌ１−ニューロカン結合部位の分析。Ｌ１−Ｌ１同種親和性結合の意味。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５；３４４７８−３４４８５（２０００））。

また、別の実施形態中、本発明はＬ１と結合するモノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４と拮抗する結合性分子に係る。Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部分は、好適にはＳＥＱＩＤＮｏ．１の配列をもつか、又は、前記軽鎖はＳＥＱＩＤＮｏ．３によりコードされる。一方、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部分は、好適にはＳＥＱＩＤＮｏ．２の配列をもつか、又は、前記重鎖はＳＥＱＩＤＮｏ．４によりコードされる。
なお、拮抗性は、結合拮抗試験など、当業者に周知の試験により測定できる。

Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖（定常ドメインを除くＶＪドメイン、つまり、可変部分）のタンパク質配列は以下の通りである。
1 DIVMTQSQKF MSTSVGDRVS VTCKASQNVG TNVAWYQQKP GHSPKALIYS
51 TSYRYSGVPD RFTGSGSGTD FTLTIRNVQS EDLAEYFCQQ YNTYPYTFGG
101 GTKLEIK (SEQ ID No: 1)
また、ＫａｂａｔａによるＬ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖（ＶＪドメイン）のＣＤＲ類の配列は以下の通りである。
CDR-L1 (or LCDR1): KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5)
CDR-L2 (or LCDR2): STSYRYS (SEQ ID No: 6)
CDR-L2 (or LCDR2): STSYRYS (SEQ ID No: 6)
さらに、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖（定常ドメインを除くＶＪＤドメイン、つまり、可変部分）のタンパク質配列は以下の通りである。
1 EVQLQQSGAE LVRPGALVKL SCKASGFNIK DYYMQWVKQR PEQGLEWIGW
51 IDPENGKTVF DPKFRGKASI SADTSSNTAY LQLSSLTSED TAVYYCARWN
101 PLAFWGQGTL VTVSS (SEQ ID No: 2)
なお、ＫａｂａｔａによるＣＤＲ類の配列を下線で示す。
次に、ＫａｂａｔａによるＬ１−ＯＶ５２．２４の重鎖（ＶＪＤドメイン）のタＣＤＲ類の配列は以下の通りである。
CDR-H1 (or HCDR1): FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8)
CDR-H2 (or HCDR2): WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No: 9)
CDR-H3 (or HCDR3: WNPLAF (SEQ ID No: 10)

Ｌ１−ＯＶ５２．２４モノクローナル抗体の免疫グロブリン遺伝子のｃＤＮＡ配列は以下の通りである。
コード：５’ＵＴＲ（一部、つまり配列している限り）、リーダー：IGKV/IGKJ or IGHV/IGHD/IGHJ, IGKC or IGHC
（重鎖）
CTGCCtCATGAATATGcAAACATGAGtCTGTGATTATAAATACAgagATATCCAtACCAAACAACtTATGAgCACTGTTTTCTCTACAGTCACTGAATCTCAAgGTCCTTACAATGcAATGCAGCTGGGTCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAAGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCAGTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTAAAACAGTTTTTGACCCGAAGTTCCGGGGCAAGGCCAGTATATCAGCGGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGATGGAACCCCCTTGCCTTCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA (SEQ ID No: 4)

（軽鎖）
TTTGATGACTGCTTTGCATAGATCCCTAGAGGCCAGCCCAGCTGCCCATGATTTATAAACCAGGTCTTTGCAGTGAGATCTGAAATACATCAGATCAGCATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGACTCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGATGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGTCACTCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCCGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTACTTCTGTCAGCAATATAACACCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG (SEQ ID No: 3)

好適な実施形態では、結合性分子は抗Ｌ１−モノクローナル抗体、又は前記抗体の抗原結合性断片である。
ここで、結合性分子とは、目的の標的と特異的に結合するポリペプチドであると理解できる。本発明によれば、標的はＬ１タンパク質である。従って、本発明の結合性分子類は、特異的にＬ１と結合する。好適には、結合性分子は、免疫グロブリン含有分子である。つまり、少なくとも１個のＩｇドメイン、又は抗Ｌ１抗体を有するものである。
なお、「特異的結合」とは、ウエスタンブロットやＥＬＩＳＡなどで測定したとき、Ｌ１と結合性分子との結合が、アルブミンなどの対照タンパク質との結合よりも、少なくとも５０倍、好適には少なくとも１００倍強いこととして理解できる。
また、本明細書中使用する「抗Ｌ１抗体」の用語は、天然に存在する抗体と類似な構造をもち、Ｌ１と結合可能な任意のポリペプチドを意味する。なお、結合特異性は、前記ポリペプチドのＣＤＲ類によって測定できる。この結果、「抗Ｌ１抗体」は、Ｌ１と結合する免疫グロブリン由来の構造から設計される。また、抗原結合性断片とは、完全長の抗体の少なくとも１個の抗原結合性断片を有するポリペプチドとして理解される。なお、抗原結合性断片は、重鎖の可変ドメイン及び軽鎖の可変ドメインとから少なくとも構成され、両ドメイン共に特定の抗原と結合できるように配置される。

モノクローナル抗体類は、一種類の免疫細胞から生産した、全てが単一親細胞のクローンであるため、全て同一の単一特異的抗体である。「モノクローナル抗体」及びモノクローナル抗体の生産は、最先端分野に属する。一般に、モノクローナル抗体は、例えば、公知のＷｉｎｔｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ法（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３−２９９）に従って生産できる。或いは、モノクローナル抗体分泌融合細胞を生産する代わりに、目的のポリペプチドを使用して組換コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージ表示ライブラリー）をスクリーニングすることで、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、同定又は単離することができる。ファージ表示ライブラリーの作製用及びスクリーニング用キットは市販されている（例えば、ＰｈａｒｍａｃｉａＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＰｈａｇｅＡｎｔｉｂｏｄｙＳｙｓｔｅｍ, カタログ番号２７−９４００−０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅＳｕｒｆＺＡＰＰｈａｇｅＤｉｓｐｌａｙＫｉｔ，カタログ番号２４０６１２）。さらに、抗体表示ライブラリーの作製用及びスクリーニング用に使用するに特に適した方法及び試薬の具体例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＷＯ９２/１８６１９：ＷＯ９１/１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２/１５６７９；ＷＯ９３/０１２８８；ＷＯ９２/０１０４７；ＷＯ９２/０９６９０；ＷＯ９０/０２８０９；Ｆｕｃｈｓ等、１９９１、Ｂｉｏ/Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ等、１９９２、Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ等、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ等、１９９３、ＥＭＢＯＪ．１２：７２５−７３４に見出すことができる。

「完全長」又は「完全」抗体とは、ジスルフィド結合で相互に結合した２個の重鎖（Ｈ）及び２個の軽鎖（Ｌ）を有するタンパク質を表す。前記タンパク質は、（１）重鎖については、可変領域、並びにＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３個のドメインを有する重鎖定常領域を有し、（２）軽鎖については、軽鎖可変領域、並びに、ＣＬの１領域を有する軽鎖定常領域を有する。また、「完全抗体」の用語については、変異、欠損又は挿入などの変化を各ドメインが有していたとしても、全体のドメイン構造は変化しておらず、天然型抗体（つまり、３又は４個の定常ドメインからなる重鎖と、１個の定常ドメインとともにそれぞれの可変ドメインとからなる軽鎖とを有する）の典型的な全ドメイン構造をもつ任意の抗体のことを意味する。例えば、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４は、完全長抗体である。

モノクローナル抗体の「抗原結合性断片」とは、前記断片が由来する完全モノクローナル抗体と同じ機能と特異性を本質的に示す、モノクローナル抗体の断片のことである。パパインを用いる限定的タンパク質分解によって、Ｉｇプロトタイプを３個の断片に切断する。同一アミノ酸末端をもつ２個の断片は、各々が１個の完全なＬ鎖と約半分のＨ鎖を有する抗原結合性断片である（Ｆａｂ）。一方、第３の断片は、同様の大きさをもつが、鎖間ジスルフィド結合によって結ばれる２個の重鎖の半分は、カルボン酸末端を有する結晶性断片（Ｆｃ）である。このＦｃは炭水化物、相補的結合部位及びＦｃＲ結合部位を含有する。ペプシンの限定的分解によって、Ｆａｂ断片及びヒンジ領域の両方を有し、Ｈ−Ｈ鎖間ジスルフィド結合をもつ単一のＦ（ａｂ’）_２断片を産生する。Ｆ（ａｂ’）_２は抗原結合を２価で行う。Ｆ（ａｂ’）_２のジスルフィド結合は、Ｆａｂ’を得るために開裂される。また、重鎖及び軽鎖の可変領域は共に結合し、一本鎖可変断片を形成する（ｓｃＦｖ）。

実物大の抗体である第一世代抗体には幾つかの問題点があったために、多くの第二世代抗体は抗体の断片だけを有している。可変領域（Ｆｖｓ）はＶＬ１個とＶＨ１個とからなる完全な抗体結合性ドメインをもつ最小の断片である。こうした断片は結合ドメインだけを有するが、酵素的手段を用い、又は、微生物細胞や真核性細胞で関連する遺伝子断片を発現させるなどして生産できる。様々な手段を使用できるが、例えば、ＦＶ断片単独、又は、ＦＶに加えて第１定常ドメインを有する“Ｙ”の上腕部分の１つをもつ‘Ｆａｂ’断片の何れか一方を使用できる。２つの鎖の間にポリペプチド連結を導入することで一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が生産され、このような断片は通常安定する。或いは、ジスルフィド連結したＦｖ（ｄｓＦｖ）断片を使用してもよい。完全長抗体類を生産するために、断片類の結合ドメイン類を、任意の定常ドメインと結合、又は、その他のタンパク質類及びポリペプチド類と融合してもよい。

組換抗体の断片は、一本鎖のＦｖ（ｓｃＦｖ）断片である。通常、前記断片は抗原に高い親和力をもち、多様なホストで発現できる。こうした特性及びその他の特性により、ｓｃＦＶ断片類は医薬に応用できるばかりか、生物工学的応用への発展性も有する。上記したように、ｓｃＦｖ断片中、ＶＨ及びＶＬドメインは親水的で柔軟なペプチド連結部と結合しており、これによって発現効率及び折りたたみ効率が向上する。通常、約１５個のアミノ酸からなる連結部が使用されるが、そのうち、（Ｇｌｙ_４Ｓｅｒ）_３連結部が最も頻繁に使用される。使用する連結部に応じて、ｓｃＦｖ分子類は容易にタンパク分解してしまう。遺伝子工学技術の発達によって、機能と安定性の改善に焦点を当てた研究から、このような制約は実際に克服できるかもしれない。例えば、ＶＨ−ＶＬ二量体が鎖間ジスルフィド結合によって安定化したジスルフィド安定化（つまりジスルフィド連結性）Ｆｖ断片類の生産例が挙げられる。ＶＬドメインとＶＨドメインとの間の界面に、システイン類を導入し、これら２個のドメインを一緒に固定するジスルフィド架橋を形成する。
ｓｃＦｖが解離すると、モノマーのｓｃＦｖ類となり、二量体（二機能性抗体類）、三量体（三機能性抗体類）、又は、タンダブ（ＴａｎｄＡｂ）やフレキシボディ（Ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）などのより大きな集合体と複合体を形成できる。

結合ドメインをもつ抗体類は、２個のｓｃＦｖと単純なポリペプチド連結（ｓｃＦｖ）２との結合、或いは２個の単量体の二量化（二機能性抗体化）の何れかにより生産できる。最も単純な設計物は、同一で、類似の（二価の二機能性抗体）、又は別個の抗原（二重特異的二機能性抗体）に特異的な、何れか一つである２個の機能的抗原結合性ドメインを有する二機能性抗体である。
他方、重鎖からなる４個の可変ドメインと、軽鎖からなる４個の可変ドメインとを有する抗体構成物の開発が行われてきた。こうした具体例には、四価の二重特異的抗体類が挙げられる（ＴａｎｄＡｂ及びＦｌｅｘｉｂｏｄｙ、ＡｆｆｉｒｍｅｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＡＧ、ハイデルベルグ、ドイツ）。二重特異的二機能性抗体とは異なり、二重特異的ＴａｎｄＡｂは、１個のポリペプチドだけで構成されたホモ二量体である。２個の異なる鎖があるために、二機能性抗体は３個の異なる二量体を構築できるが、この３個の内１個だけが機能する。従って、この同種産物を生産し、精製することが簡単かつ安価である。また通常、ＴａｎｄＡｂは、より良い結合特性（結合部位数を二倍所持）及びより良いインビボ安定性を示す。Ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ類は、ｓｃＦｖと二機能的抗体の多量体モチーフとの組み合わせなので、この結果、細胞表面上互いに非常に離れた場所に位置する２個の分子を結合させる高い柔軟性をもつ多価分子である。仮に、３個以上の機能性抗原結合性ドメイン類が存在し、これらドメイン類が別個の抗体に対して特異性を有する場合、このような抗体は多特異性である。

以上まとめると、特定の開示配列が挿入された、或いは、この配列がその必須部分を構成する特異的免疫グロブリン類には、限定するものではないが、本発明の具体的実施形態を構成する次のような結合性分子類が含まれる。つまり、Ｆａｂ（可変軽ドメイン（ＶＬ）、可変重ドメイン（ＶＨ）、定常軽ドメイン（ＣＬ）及び定常重１ドメイン（ＣＨ））を有する一価の断片）；Ｆ（ａｂ’）２（ジスルフィド架橋で又はヒンジ領域で連結された２個のＦａｂ断片を有する二価の断片）；Ｆｖ（ＶＬ及びＶＨドメイン）；ｓｃＦｖ（ＶＬとＶＨとが連結部、例えば、ペプチド連結部で結合した単一鎖Ｆｖ）；二重特的抗体分子（抗体又は受容体リガンドなどの別のペプチド又はタンパク質を含む、抗体とは異なる結合特異性をもつ第２機能性部位と連結した、本明細書に開示されるポリペプチドを含む抗体分子）；二重特異的一本鎖Ｆｖ二量体；二機能性抗体、三機能性抗体、四機能性抗体、ミニボディ性抗体（ＣＨ３に結合したｓｃＦｖ）等である。

限定されないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、二重特異的抗体分子、又はドメイン抗体（Ｄｏｍａｎｔｉｓ）を含む、モノクローナル抗体類の結合性分子類又は抗原結合性断片類は、ジスルフィド架橋を組み入れて、ＶＨ及びＶＬドメインを一直線に並べることで安定化される。なお、二重特異的抗体類は、従来技術、化学的又はハイブリッド融合細胞による特殊な方法、ＢｉＴＥ^ＴＭ技術（ペプチド連結部をもち異なる特異性の抗原結合性領域をもつ分子類）、及びノブ−イントゥ−ホール技術等その他技術を用いて生産できる。
以上より、モノクローナル抗体の結合性分子又は抗原結合性断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド連結のＦｖ、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）_２、二価抗体、二重特異的抗体、多重特異的抗体、二機能性抗体、三機能性抗体、四機能性抗体、又はミニボディ抗体である。

また、別の好適な実施形態では、結合性分子はヒト抗体、キメラ抗体、又はヒト化抗体である。キメラ抗体とは、その免疫原性を下げるために、一つの種の免疫グロブリンの少なくとも一領域が遺伝子工学によって、別の種の免疫グロブリンの別の領域と融合した抗体である。例えば、マウスＶＬ及びＶＨ領域を、ヒト免疫グロブリンの残りの部分と融合できる。キメラ抗体の特殊なタイプには、ヒト化抗体がある。ヒト化抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲをコードするＤＮＡとヒト抗体産生ＤＮＡとを結合して調製する。こうして調製したＤＮＡ構成体は、ＣＤＲだけが非ヒトＣＤＲであるので、非ヒト非経口抗体又はキメラ抗体と普通同じ免疫原性をもたない抗体類を発現及び生産するのに使用できる。なお、この抗体はヒト抗体であってもよい。
ヒト抗体又は少なくともヒト化抗体の利用は、ヒトへの用途、例えば、インビボでの予防、治療又は診断などの用途に好適である。
本発明の好適な一実施形態中、結合性分子、特にモノクローナル抗体は、ヒトＩｇＭ定常ドメイン、ヒトＩｇＧ１定常ドメイン、ヒトＩｇＧ２定常ドメイン、ヒトＩｇＧ３定常ドメイン、ヒトＩｇＧ４定常ドメイン、ヒトＩｇＥ定常ドメイン、及びヒトＩｇＡ定常ドメインからなる群から選ばれる、重鎖免疫グロブリン定常ドメインを有する。

結合性分子において、好適には本発明のモノクローナル抗体において上記したように、天然型抗体の各重鎖は２つの領域、つまり、定常領域及び可変領域を有する。哺乳類の免疫グロブリン重鎖には、γ、δ、α、μ、及びεの５つのタイプがあり、それぞれ、免疫グロブリンの分類であるＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを規定する。
なお、ヒトには４つのＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３及び４）が存在し、血清中の量の多さの順に命名されている（ＩｇＧ１が最も多い）。ＩｇＧサブタイプ類のＦｃ領域間では約９５％の相同性があるが、ヒンジ領域の構造は比較的相違している。Ｆａｂアーム（断片抗原結合部）と、２個のカルボキシル末端ドメインの共に重鎖であるＣＨ２及びＣＨ３との間にあるヒンジ領域によって、分子自体の柔軟性が決定される。上部ヒンジ領域（アミノ末端に向かう）によって、２つのＦａｂアーム間の角度可変性（Ｆａｂ−Ｆａｂ柔軟性）、並びに個々のＦａｂの回転柔軟性が可能となる。一方、下部ヒンジ領域（カルボキシル末端に向かう）の柔軟性によって、Ｆｃ領域からのＦａｂアームの位置（Ｆａｂ−Ｆｃ柔軟性）が直接決定される。ヒンジ依存的なＦａｂ−Ｆａｂ柔軟性、及びＦａｂ−Ｆｃ柔軟性は、相補的な活性化及びＦｃ受容体結合などの作動因子の機能を誘発する上で重要である。つまり、ヒンジ領域の構造によって、４個のＩｇＧサブクラスの各々にユニークな生物学的機能が与えられる。

ヒンジ領域の長さ及び柔軟性は、ＩｇＧサブクラス間で変化する。ＩｇＧのヒンジ領域はアミノ酸２１６−２３１を含有し、また、柔軟性を自由に有するので、Ｆａｂ断片類は対称軸の周りを回転し、２個の重鎖間ジスルフィド架橋の第１架橋を中心とした球体内で運動する。ＩｇＧ２は、ＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、このヒンジは１２アミノ酸残基と４個のジスルフィド架橋をもつ。ＩｇＧ２のヒンジ領域はグリシン残基を欠いており、その長さは比較的短い。また、前記ヒンジ領域は、柔軟性のないポリプロリン二重らせんを含有し、特別な重鎖間ジスルフィド架橋によって安定している。こうした特性により、ＩｇＧ２の柔軟性は制限される。また。ＩｇＧ３はそのユニークで長く伸びたヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）により、他のＩｇＧサブクラスとは異なっている。前記ヒンジ領域は、６２個のアミノ酸を含み（２１個のプロリンと１１個のシステインを含む）、柔軟性のないポリプロリン二重らせんを形成する。ＩｇＧ３中のＦａｂ断片はＦｃ断片から比較的遠く離れて位置し、分子に大きな柔軟性を与えている。また、ＩｇＧ３の長いヒンジにより、他のＩｇＧサブクラスに比べて、大きな分子量を有する。一方、ＩｇＧ４のヒンジ領域はＩｇＧ1のヒンジ領域よりも短く、ＩｇＧ１とＩｇＧ２との中間の柔軟性を有する。
従って、より好適な実施形態では、結合性分子は一本鎖の抗体から選ばれ、より好適には、二機能性抗体、三機能性抗体、又は四機能性抗体のようなｓｃＦｖ及びｓｃＦｖの多量体や、抗体断片から選ばれ、更により好適にはＦａｂ、Ｔａｎｄａｂ、Ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ、及び二特異的抗体から選ばれる。
更に好適な実施形態では、結合性分子はキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体であるか、或いは、これら抗体の抗原結合性断片である。

また、実施例から分かるように、抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４のエピトープは、Ｌ１のフィブリノーゲンドメインＩＩＩ４−５内に存在する。従って、結合性分子のエピトープは、特に本発明のモノクローナル抗体やこれら抗体の抗原結合性断片のエピトープは、Ｌ１のフィブリノーゲンドメインＩＩＩ４−５内に存在することが好ましい。
よって、好適な実施形態では、前記エピトープはＬ１のフィブリノーゲンドメインＩＩＩ４−５（ＦＮＩＩＩ４−５）内に存在する。
Ｌ１−ＯＶ５２．２４は以下のＣＤＲ配列を有する。つまり、KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID No: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (HCDR3; SEQ ID No: 10)である。
上記した配列は、当技術分野で周知のＫａｂatの方法に従って決定された、モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４のＣＤＲ類である。
従って、好適な実施形態中、結合性分子は、抗Ｌ１モノクローナル抗体、又は、前記抗体の抗原結合性断片である。ここで、前記の抗Ｌ１モノクローナル抗体、又は、前記抗体の抗原結合性断片の相補性決定領域類（ＣＤＲ類）の少なくとも１個は、
ａ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)から選ばれる配列の１つを有する。或いは、
ｂ）上記ａ）で記載した配列に比べて、保存アミノ酸を少なくとも１個変換した配列を有する。

本発明の、このようなモノクローナル抗体やこの抗体の抗体結合性断片は、例えば、ＣＤＲグラフト化、又は抗体組換産生により生産できる。このような方法は本技術分野で周知である（例えば、Ｑｕｅｅｎ等、米国特許第５，５８５，０８９号、Ｗｉｎｔｅｒ等、米国特許第５，２２５，５３９号、Ｃａｂｉｌｌｙ等、米国特許第４，８１６，５６７号参照）。
また、前記ＣＤＲ類の配列は変更してもよく、保存アミノ酸の変換による変更が好ましい。
一般に、変換操作により、ＦＲ及びＣＤＲ領域を変更可能であり、アミノ酸残基の変換、削除、及び挿入操作が含まれる。また、こうした変更には、ランダム変異誘発又は定方向変異誘発が含まれる。また、先に述べたように、抗体ファージディスプレーシステムを、所望の及び／又は改善した機能を有する変異体の選定に使用できる。
好適な実施形態中、本発明の結合性分子は、抗Ｌ１モノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合性断片であって、随意１以上の保存アミノ酸が変換されている、相補性決定領域類（ＣＤＲ類）QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7) 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)を有することを特徴とする。
なお、ＳＥＱＩＤＮｏ．７は、Ｌ１−ＯＶ５２．２４のＬＣＤＲ３配列を表し、ＳＥＱＩＤＮｏ．１０は、Ｌ１−ＯＶ５２．２４のＨＣＤＲ３配列を表す。ＬＣＤＲ３とＨＣＤＲ３は、抗体の結合機能に重要であることが知られている。

より好適な実施形態中、本発明の結合性分子は、抗Ｌ１モノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合性断片であって、以下の相補性決定領域類（ＣＤＲ類）を有し、随意、１以上の保存アミノ酸が変換されていることを特徴とする。つまり、KASQNVGTNVA(SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)である。
他方、ある好適な実施形態では、保存アミノ酸は変換されていないことが好ましい。
更に又より好適な実施形態では、前記の抗Ｌ１モノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合性断片は、ＩｇＧ１抗体又はＩｇＧ１抗体の抗原結合性断片である。

また、別の好適な実施形態では、本発明の結合性分子は、
ａ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10) から選ばれる配列の少なくとも１個を有するか、或いは
ｂ）上記ａ）で記載した配列に比べて、保存アミノ酸を少なくとも１個変換した配列を有する。
更に好適な実施形態では、本発明の結合性分子は、QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7) 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10) の配列を有し、随意、保存アミノ酸が少なくとも１個変換されていることを特徴とする。
更により好適な実施形態中、本発明の結合性分子は、KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10) の配列を有し、随意、保存アミノ酸が１個以上変換されていることを特徴とする。
他方、ある好適な実施形態では、保存アミノ酸が変換されていないことが好ましい。

また、ある好適な実施形態中、本発明の結合性分子は、KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)からなる相補性決定領域類（ＣＤＲ類）を有する抗Ｌ１モノクローナル抗体であるか、或いは、前記抗体の抗原結合性断片である。
また、ある好適な実施形態中、本発明の結合性分子は、KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID No: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (HCDR3; SEQ ID No: 10) からなる相補性決定領域類（ＣＤＲ類）を有する抗Ｌ１モノクローナル抗体であるか、或いは、前記抗体の抗原結合性断片である。

なお、本発明の結合性分子は、Ｌ１に対して強い親和力を示すことが好ましい。Ｌ１−ＯＶ５２．２４はＬ１に対して、ＫＤ（Ｍ）＝２．４１^＊１０^−９の親和力を示すことを見出した。
Ｌ１に対する親和力は、本技術分野で周知の方法、例えば、表面プラズモン共鳴法により測定できる。Ｌ１−ＯＶ５２．２４の結合性分析は、ＣＭ５センサチップを備えたＢＩＡｃｏｒｅ３０００を用いて行った。簡単に述べると、ＥＤＣ／ＮＨＳでＢＩＡｃｏｒｅＣＭ５を活性化し、様々なレベルのＬ１−Ｆｃを活性表面上で捕捉した。残りの活性部位は、エタノールアミン／ＨＣｌによってブロックした。Ｌ１−ＯＶ５２．２４はＬ１−Ｆｃ表面と結合し、時間とともに解離できるようにした。密度表面全体の注入毎の結合状態及び解離状態を、速度論的に解析した。
従って、更に又好適な実施形態中、本発明の結合性分子は、モノクローナル抗体又はこの抗体の抗原結合性断片であることが好ましく、少なくとも１０^−９の親和力（ＫＤ）、より好適には少なくとも１０^−１０又は１０^−１１の親和力（ＫＤ）で、Ｌ１に結合することが好ましい。

驚くべきことに、実施例及び図で示すように、４０、６０、７０又は９０分間の培養後、Ｌ１−ＯＶ５２．２４はＳＫＯＶ３ｉｐ細胞中に効率的に内在化するが、他方、対照とした抗Ｌ１モノクローナル抗体９．３は、少ししか内在化しないことを見出した。なお、内在化は、蛍光化合物などの好適な診断用化合物と連結させた結合性分子を用いて測定できる。例えば、蛍光色素としてＡｌｅｘａ４８８を使用した。実施例で述べたように、内在化の定量化は顕微鏡観察及び計数化、又はイメージングフローサイトメトリーの何れかにより行える。両方の方法を用い、９．３抗体よりもＬ１−ＯＶ５２．２４の方が、測定した各点において少なくとも４倍効率的に内在化することを見出した。また、驚くべきことに、市販の抗Ｌ１ＣＡＭモノクローナル抗体類５Ｇ３及びＵＪ１２７．１１に比べ、６０分及び９０分の測定時点において、Ｌ１−ＯＶ５２．２４はより効率的に内在化することを見出した（図６参照）。実施例で測定した、こうしたＬ１−ＯＶ５２．２４の優れた且つ驚くべき機能を、図７にまとめた。驚くべきことに、タイムポイント９０分でのＬ１−ＯＶ５２．２４の内在化は、従来技術の抗Ｌ１ＣＡＭモノクローナル抗体類９．３、５Ｇ３及びＵＪ１２７．１１よりも、それぞれｐ＜０．０１のとき有意に多いことを見出した。従って、Ｌ１−ＯＶ５２．２４又はその抗原結合性断片、つまり、Ｌ１−ＯＶ５２．２４と同じエピトープを認識する結合性分子は、治療用活性薬剤の輸送、或いは、画像化を目的とする診断薬の輸送に特に好適である。

また、更に好適な実施形態では、本発明の結合性分子は、Ｌ１を発現する哺乳類細胞で内在化するものであって、好適には前記細胞はＬ１発現哺乳類腫瘍細胞であり、より好適にはＳＫＯＶ３ｉｐ細胞であることを特徴とする。
好適な実施形態中、Ｌ１発現哺乳類細胞、好適にはＳＫＯＶ３ｉｐ細胞の内在化は、顕微鏡分析と定量化、或いは、イメ−ジングフローサイトメトリーによって測定する。こうした測定方法は、実施例で記載したように行うことが好ましい。また、更に好適な実施形態では、ＷＯ２００８/１５１８１９に記載するように、培養時間４０、６０、７０又は９０分後に、モノクローナル抗体９．３の内在化に比べて、少なくとも２倍、好適には少なくとも４倍、より好適には少なくとも７倍、最も好適には１０倍多く内在化することが好ましい。また、更に好適な実施形態では、培養時間６０又は９０分後に、モノクローナル抗体５Ｇ３の内在化に比べて、少なくとも２倍、より好適には少なくとも４倍多く内在化することが好ましい。更にまた好適な実施形態では、培養時間６０又は９０分後に、モノクローナル抗体ＵＪ１２７．１１の内在化に比べて、少なくとも２倍、より好適には少なくとも４倍多く内在化することが好ましい。

更にまた好適な実施形態では、本発明の結合性分子は、モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４である。ここで、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖可変部分が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の配列をもつか、又は、前記軽鎖がＳＥＱＩＤＮｏ．３でコードされ、他方、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖可変部分は、ＳＥＱＩＤＮｏ．２の配列をもつか、又は、前記重鎖がＳＥＱＩＤＮｏ．３でコードされることを特徴とする。或いは、本発明の結合性分子は、前記モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４の抗原結合性断片である。
また、ある好適な実施形態中、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖可変部分が、ＳＥＱＩＤＮｏ．１の配列をもち、且つ、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖可変部分がＳＥＱＩＤＮｏ．２の配列をもつことが好ましい。
なお、上記のように、ＳＥＱＩＤＮｏ．１及びＳＥＱＩＤＮｏ．２の配列は、ＶＪドメイン、つまり、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖可変部分と、ＶＤＪドメイン、つまりＬ１−ＯＶ５２．２４の重鎖可変部分に、それぞれに係る。
従って、ある実施形態中、本発明はモノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４、又は、前記抗体の抗原結合性断片に係る。モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、前記軽鎖及び重鎖の可変部分の各配列（それぞれ、ＳＥＱＩＤＮｏ．２及びＳＥＱＩＤＮｏ．１）によって開示され、及び／又は、前記重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ類によって開示される（それぞれ、ＳＥＱＩＤＮｏ．３及びＳＥＱＩＤＮｏ．４）。

特に好適な実施形態では、本発明の結合性分子は治療用活性物質と連結して、治療用活性分子の内在化を可能にする。
本発明の治療用活性物質は、動物、好適には哺乳類、より好適にはヒトにおける治療効果又は予防効果を有する化合物として理解される。
より好適な実施形態中、前記治療用活性物質は動物において治療効果又は予防効果を有し、腫瘍性疾患及び／又はＬ１発現に伴う疾患の治療又は予防に有用である。
ある好適な実施形態中、前記治療用活性物質は化学療法に有用な化合物、つまり、化学療法化合物である。また、ある好適な実施形態中、前記治療用活性物質は細胞毒性化合物又は細胞増殖抑制化合物である。
従って、一実施形態中、本発明は治療用活性物質と連結された、本発明の結合性化合物に係り、好適には、アルキル化剤、抗悪性腫瘍性抗生物質、代謝抵抗物質、及び天然物誘導体から選ばれる化学療法化合物や、細胞毒性化合物、細胞増殖抑制化合物、サイトカイン、微細粒子、或いは放射性核種に係る。
好適なサイトカイン類は、例えば、ＴＮＦアルファ、ＩＬ−２及びＩＬ−１２である。
また、好適な化学療法化合物は、本技術分野で周知である。こうした化合物は数種類に分類され、例えば、アルキル化剤、抗悪性腫瘍性抗生物質、代謝抵抗物質、及び天然物誘導体などに分類される。

本発明で使用できるアルキル化剤の例には、ブスルファン、カロプラチン、カルムスチン、クロランブシル、シスプラチン、シクロフォスファミド（つまりシトキサン）、ダカルバジン、イホスファミド、ロムスチン、メクロメタミン、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、及びチオテパが挙げられる。
抗悪性腫瘍性抗生物質の例には、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、マイトキサントロン、ペントスタチン、及びプリカマイシンが挙げられる。
また、代謝抵抗物質の例には、フルオロデオキシウリジン、クラドリビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルロウラシル、（例えば、５−フルロウラシル（５ＦＵ））、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メルカトプリン、メトトレキセート、及びチオグアニンが挙げられる。
天然物誘導体の例には、ドセタキセル、エトポシド、イリノテカン、タキサン（例えば、パクリタキセル）、テニポシド、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニソン、及びタモキシフェンが挙げられる。
また、本発明に使用できる化学療法剤の追加例には、アスパラギナーゼ及びミトタンが挙げられる。
更に又、Ｃ２セラミドも使用できる。

本発明において「連結した」の用語は、共有結合及び非共有結合で連結すること、好適には共有結合で連結することとして理解される。共有結合で連結する場合の実施形態中、本発明の結合性分子は、治療用活性薬又は診断薬と、好適な連結分子を介して直接連結される。本発明のより好適な実施形態では、結合性分子は治療用活性約又は診断薬と、連結部を介して連結する。好適な連結部（リンカー）は本技術分野で周知である。
従って、好適な実施形態では、結合性分子は治療用活性薬及び／又は診断薬と、随意連結部を介して共有結合で連結する
好適な放射性核種には、^{６７／６４}Ｃｕ、^１３１Ｉ、^１２４Ｉ又は^９０Ｙが含まれる。こうした放射性核種は錯体形成部分を介して本発明の結合性分子と、また、ヨウ素の場合には直接共有結合で、連結する。錯体形成部分は、好適には結合性分子と共有結合で、或いは、連結部を介して連結する。
このような抗体複合体は本技術分野で周知である（ＷｕＡＭ、ＳｅｎｔｅｒＰＤ．アーミング抗体：免疫複合体の展望と挑戦、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１３７−１１４６，２００５；ＰａｓｔａｎＩ，ＨａｓｓａｎＲ，ＦｉｔｓＧｅｒａｌｄＤＪ，ＫｒｅｉｔｍａｎＲＪ，癌の免疫毒素治療、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５８：２２１−２３７，２００７；ＷＯ９０/１２５９２，ＷＯ２００７/０３０６４２；ＷＯ２００４/０６７０３８；ＷＯ２００４/００３１８３；ＵＳ２００５/００７４４２６；ＷＯ９４/０４１８９）。
より好適な実施形態中、治療用活性物質は、ＤＮＡ損傷剤、特にアクチノマイシン−Ｄ、ミトマイシンＣ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン、５−ＦＵ、天然物誘導体、タキサン、好適にはパクリタキセル及びカルボプラチンから選ばれる、化学療法剤、細胞毒性化合物又は細胞増殖抑制化合物である。

また、本発明の結合性分子を診断薬と連結することは有利である。
診断薬は直接又は間接的検出によって、シグナルを発することができる化合物である。ある好適な実施形態中、診断薬は哺乳類などの動物、より好適にはヒトへの投与に適する。本実施形態では、連結した結合性分子はインビトロ及びインビボの両方で好適に使用できる。別の実施形態では、診断薬は哺乳類などの動物、或いはヒトへの投与に適さなず、この実施形態では、連結した結合性分子はインビトロで好適に使用できる。また、診断薬は直接又は間接的に検出される。直接検出する場合、本発明で好適に使用できる診断薬は、色素原類、蛍光群、化学発光群（例えば、アクリジニウムエステル又はジオキソエタン）、電気化学発光群、触媒、酵素、酵素基質、色素、蛍光色素、（例えば、フルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニン、及びこれらの誘導体）、コロイド状金属及び非金属粒子、有機ポリマーラテックス粒子などの、検出可能なマーカー群から選ぶことができる。診断薬の他の例として、ルテニウム又はユーロピウム錯体及び放射性同位体などの発光金属錯体が挙げられる。

また、間接的検出システムとしては、例えば、バイオアフィン結合対のパートナー同士が含まれる。好適な結合対の例としては、ハプテン又は抗原／抗体、ビオチン又はアミノビオチン、イミノビオチンやデスチオビオチン／アビジン、ストレプトアビジンなどのビオチン類縁体、糖／レクチン、核酸や核酸類縁体／相補的核酸、及び受容体／リガンド、例えば、ステロイ８ドホルモン受容体／ステロイドホルモンなどが挙げられる。
よって、更なる実施形態では、本発明は、放射性核種、化学発光化合物、蛍光化合物、色素又は酵素から選ばれることが好ましい診断薬と連結した、本発明の結合性分子に係る。
実施例に示したように、Ｌ１−ＯＶ５２．２４モノクローナル抗体は、蛍光化合物又は蛍光色素、つまりＡｌｅｘａ色素（Ａｌｅｘａ４８８）と良好に連結した
また、別の実施形態では、本発明の抗Ｌ１モノクローナル抗体を生産する融合細胞に本発明は係る。

別の実施形態中、本発明は核酸に係り、この核酸は、
（ｉ）本発明の結合性分子をコードする核酸、及び／又は
（ｉｉ）本発明の結合性分子の少なくとも１個の鎖をコードする核酸、及び／又は
（ｉｉｉ）ＳＥＤＩＤＮｏ．３の配列、及び／又は、ＳＥＤＩＤＮｏ．４の配列を有する核酸、及び／又は
（ｉｖ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)
から選ばれる少なくとも１個の配列をコードする配列（類）を有する核酸である。
更に好適な実施形態では、本発明の核酸はベクターの一部分である。このようなベクターは、大腸菌などのバクテリア、イースト菌細胞、昆虫細胞又は哺乳類細胞における発現用ベクターであることが好ましい。また、本発明の核酸は、好適にはベクター中のプロモーターやエンハンサーなどの好適な制御配列によって制御されるので、ホスト細胞で発現できる。これらベクターは、ホスト細胞中で複製できる配列をもつことが好ましい。

また、好適には、診断薬と連結した結合性分子は、インビトロの診断目的に使用可能であり、生物工学的研究用の重要なツールに係る。例えば、患者の生検又は一般的体標本を、本発明の結合性分子を使用して分析できる。よって、更なる実施形態では、本発明は、インビトロ診断薬又はインビトロ生物工学的試薬として、本発明の結合性分子を用いることに係る。更に又好適な実施形態では、本発明は、インビトロ診断薬又はインビトロ生物工学的試薬として、診断薬と連結させた本発明の結合性分子の利用方法に係る。また、別の実施形態では、治療用活性物質と連結した本発明の結合性分子を、インビトロ生物工学的試薬として利用する方法に係る。
更に別の実施形態中、本発明は、医薬又は診断薬として利用できる、本発明の結合性分子に係る。
特に好適な実施形態では、医薬として使用する結合性分子は、上記のように、治療用活性物質と連結した結合性分子である。前記結合性分子によって、治療用活性物質が腫瘍細胞内に輸送され、この腫瘍細胞中で、治療用活性物質と連結した結合性分子が治療効果を発揮できる
好適な実施形態中、治療有効量の前記治療用活性物質が投与される。
より好適な実施形態中、診断用に用いる結合性分子は、診断薬と結合させた結合性分子である。この結果、患者の画像化診断が可能となるので、本発明の結合性分子によって、治療の予後又はモニタリングなどの診断が可能となる。従って、診断薬と連結させた本発明の結合性分子は、本発明の治療用活性物質と連結させた結合性分子によるコンパニオン診断薬であることが好ましい。

また、本発明の結合性分子は、薬学的組成物に含まれることが好ましい。
ある化合物が、診断薬及び治療用活性物質の両者を兼ね備えることは可能である。例えば、^１３１Ｉなどの放射性核種は、インビボの画像化及び腫瘍治療の両方に好適に使用できる。
一般に、本発明の薬学的組成物は、本発明の結合性化合物を治療有効量有し、１個以上の薬学的に許容な担体を随意含有する。また、特定の実施形態中、「薬学的に許容」の用語は、合衆国連邦政府又は州政府の規制当局に承認されている、或いは、米国薬局方に記載された、又は、動物、より好適にはヒトへの使用が一般的に認められた他の薬局方に記載されたものであることを意味する。
また、「担体」の用語は、治療剤と一緒に投与される、希釈剤、補助剤、賦形剤、又は、ビークルを表す。こうした薬学的担体には水や油類などの無菌液があり、例えば、石油性、動物性、植物性、合成由来の油類がある。以下に限定されるものではないが、ピーナッツオイル、大豆オイル、鉱油、ごま油などがこれに含まれる。なお、薬学的組成物を経口投与する場合、水が好適な担体となる。一方、薬学的組成物を静注投与する場合、生理食塩水及びブドウ糖水溶液が好適な担体となる。また、生理食塩水、ブドウ糖水溶液及びグリセリン水溶液は、注射液用の液体担体として好適に使用される。好適な薬学的賦形剤としては、でんぷん、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセリンモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、ポリエチレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。

所望に応じ、前記組成物は、少量の湿潤剤、乳化剤、又はｐＨ調整剤も含有できる。こうした組成物は、溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、徐放性製剤などの剤形をとることができる。また、こうした組成物は、従来の結合剤やトリグリセリド類などの担体を用いた坐薬として製剤化できる。経口剤には、医薬品等級のマンニトール、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体が含有される。また、好適な薬学的担体の具体例は、Ｅ．Ｗ.Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ」に記載される。こうした組成物は治療に有効量の治療用剤形で、好適には精製済み剤形として、好適な量の担体と一緒に含有され、患者に好適に投与できる剤形として提供する。剤形は投与方法に適した形態であるべきである。

ある好適な実施形態では、ヒトへの静注投与に適した薬学的組成物として常法に従って組成物を製剤化する。通常、静注投与用の組成物は、無菌の等張水溶性バッファーの溶液である。必要に応じて、この組成物は、溶解剤と、注射部位の痛みを緩和するためにリドカインなどの局所麻酔剤とを含有してもよい。一般に、薬剤成分は個別に、或いは、単一投与形態中一緒に混合し、の何れかによって供給される。例えば、活性薬の量を示したアンプルや小袋などの密封容器に入れた凍結乾燥粉末や、水分を含まない濃縮液として提供される。また、組成物を点滴投与する場合、無菌の医薬品等級の水又は生理食塩水を含有する点滴用ボトルを用いて投与する。また、組成物を注射投与する場合、注射用無菌水又は生理食塩水のアンプルを用意し、投与前に薬剤成分を混合してもよい。
本発明の治療薬は、そのままの形態又は塩の形態として製剤化できる。薬学的に許容される塩類には、塩酸、リン酸や、酢酸、シュウ酸、酒石酸などの遊離カルボキシ基と形成される塩類；イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの遊離アミノ基と形成される塩類、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄などと形成される塩類がある。

本発明の治療薬の量は、特定の疾患や病状を治療するのに有効であって、前記疾患や病状の性質に応じて、標準的臨床技術によって決定される。また、最適な投与量の範囲を決める一助として、インビトロ試験を随意使用してもよい。処方に用いる正確な投与量は、投与経路や疾患又は病気の重さにも依存するが、医者の判断並びに個々の患者の状態に応じて決定されるべきものである。しかし、静注投与の好適な投与量の範囲は、ｋｇ体重当たり、活性成分約２０〜約５００μｇである。また、鼻腔内投与の好適な投与量の範囲は、一般に、体重当たり約０．０１ｐｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇである。なお、有効投与量は、インビトロ、或いは動物モデルの試験系による、投与―応答曲線から外挿できる。一般に、坐薬は０．５重量％〜１０重量％の範囲で活性成分を含有し、経口剤では１０％〜９５％の活性成分を含有するのが好ましい。

様々な薬物輸送システムが知られており、本発明の治療薬の投与に使用できる。例えば、リポソーム、微細粒子及びマイクロカプセルによる封入化；治療薬を発現する組換細胞の利用；受容体依存性エンドサイトーシスの利用（Ｗｕ及びＷｕ、１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２、４４２９−４４３２）；レトロウイルスの又は他のベクターの一部分として治療用核酸を構築することなどが挙げられる。以下に限定されるものではないが、投与方法としては、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、鼻腔内投与、硬膜内投与及び経口投与などが挙げられる。また、薬剤は手短な経路で投与可能であり、例えば、点滴、ボーラス注射、上皮内吸収又は皮膚粘膜内吸収（例えば、口腔、直腸、腸粘膜など）が挙げられ、他の生物活性薬剤と一緒に投与してもよい。また、全身投与又は局所投与もできる。更に、本発明の薬学的組成物を、任意の好適な経路で中枢神経系に輸送することが好ましく、脳室内及びくも膜下注入が挙げられる。脳室内注入は脳室内カテーテルで実施でき、例えば、オマヤレザーバーなどのレザーバーに装着して実施できる。また肺内投与も利用可能であり、例えば、吸入器やネブライザーを用いたり、エアゾール剤を用いた処方も利用できる。

具体的な実施形態では、本発明の薬学的組成物を、治療に必要な領域に局所的に投与することが好ましい。例えば、以下に限定されるものではないが、術間の局所的点滴、局所投与、例えば、術後の創傷被覆材と併せた局所投与、注射による投与、カテーテルによる投与、坐薬による投与、移植片によるものが挙げられる。ここで、移植片は、多孔性、非多孔性又はゼラチン状の材料からなり、シリコン剤の膜や繊維などの膜状物が含まれる。ある実施形態中、悪性腫瘍、新生物性又は非新生物性組織の部位（またはその病痕）に直接注入投与してもよい。
別の実施形態では、ベシクル、具体的にはリポソームに包んで治療薬を輸送可能であり（Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７−１５３３）、より具体的には陽イオン性リポソーム（ＷＯ９８/４００５２）が挙げられる。
更に又別の実施形態では、徐放性システムによって治療薬を輸送できる。ある実施形態では、ポンプを用いてもよい（Ｌａｎｇｅｒ、上記論文）。また、別の実施形態では、治療ターゲットの近傍に徐放性システムを設置してもよく、この場合、全身投与量の一部だけですむ。
本発明のこの態様において、本発明は、患者の腫瘍疾患を治療又は予防する方法も含んでいる。治療有効量の結合性分子、好適には、本発明のモノクローナル抗体又はこの抗体の抗原結合性断片を、この患者に投与することを含む。

本発明を通して、「有効量」の用語は、与えられた分子又は化合物が所望の治療効果を奏するのに十分量を投与されることを意味する。本発明を通して、２個の化合物が治療有効量で投与された場合、化合物の１個又は各々が、治療量以下の量で投与されることを含む。つまり、各化合物の量は単独で治療効果を発揮するのには十分な量ではないが、化合物を組み合わせることで所望の治療効果を得られることを含む。他方、本発明においては、単独の化合物の各々が治療有効量投与されることも含む。
本発明によれば、「腫瘍性疾患の治療」の用語は、腫瘍細胞を死滅させること、腫瘍細胞の増殖を減少させること（例えば、少なくとも３０％、少なくとも５０％又は少なくとも９０％まで）の両方を意味するのみならず、腫瘍性疾患を病む患者の腫瘍細胞の増殖を完全に阻害することも意味する。更に、前記用語は、腫瘍原性疾患の予防を意味し、例えば、将来腫瘍細胞になる、又はなり易い細胞を死滅させること、並びに腫瘍転移の予防も意味する。
また、本発明において適用される個々の治療が、患者の健康状態や疾患の重症度などに依存し、このために、ケースバイケースで調整せねばならないことを、当業者は理解するであろう。
また、本発明はモノクローナル抗体又はこの抗体の抗原結合性断片、或いは本発明の結合性分子からなる薬学的組成物に係る。前記薬学的組成物は、先に述べた実施形態全てに適用される。

また、ある実施形態では、本発明は本発明の結合性分子、好適にはモノクローナル抗体又はこの抗体の抗原結合性断片に係り、腫瘍性疾患の治療又は予防に利用する。好適には、腫瘍性疾患は、上皮腫瘍性疾患、及び／又は、星状細胞腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、脳室上衣腫、シュワン細胞腫、神経線維肉腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、頭頚部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、神経芽細胞腫、扁平上皮癌、髄芽細胞腫、肝癌、大腸癌、中皮腫、及び類表皮癌などであることを特徴とする。
更に、ある実施形態では、本発明は上記したように、本発明の結合性分子と、随意１個以上の薬学的に許容な担体と、を含有する薬学的組成物に係る。

別の実施形態では、本発明は、Ｌ１と結合する結合性分子に係り、前記結合性分子は抗Ｌ１モノクローナル抗体、又はその抗体の抗原結合性断片である。前記抗Ｌ１モノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合性断片の相補性決定領域類（ＣＤＲ類）の少なくとも１個は、
（ａ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)から選ばれる配列の少なくとも１個を有し、
（ｂ）上記（ａ）の配列と比較して、少なくとも１個の保存アミノ酸が変換されている配列を有することを特徴とする。
また、別の実施形態では、Ｌ１と結合する結合性分子に係り、前記結合性分子は、
（ａ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)から選ばれる配列の少なくとも１個を有し、
（ｂ）上記（ａ）の配列と比較して、少なくとも１個の保存アミノ酸が変換されている配列を有することを特徴とする。

このようなモノクローナル抗体、又はこの抗体の抗原結合性断片、或いは本発明の結合性分子類は、例えば、ＣＤＲグラフト化又は前記抗体を組換産生することで生産できる。このような方法は、本技術分野で周知である（Ｑｕｅｅｎ，米国特許第５，５８５，０８９号、及びＷｉｎｔｅｒ，米国特許第５，２２５，５３９号、Ｃａｂｉｌｌｙ，米国特許第４，８１６，５６７参照）。
ここに記載した本発明の好適な実施形態は、本発明の全ての結合性分子類、モノクローナル抗体類及びこれら抗体類の抗原結合性断片類に適用される。

Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、ｍＡｂＬ１ＣＡＭｍＡｂ９．３の細胞内取込測定結果を示す。Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞を、Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭｍＡｂＬ１−９．３と共に異なる時間培養した。試料を固定化し、細胞表面に結合した抗体を、Ａｌｅｘａ６４７と結合したヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。タイムポイント０分の細胞は、抗体内在化を防ぐために氷の上で培養した。ＡｍｎｉｓＩＳＸイメージングフローサイトメトリーで試料を測定し、３０００個の細胞を採取し、ＡｍｎｉｓＩＤＥＡＳソフトウエアを用いて分析した。（Ａ）はタイムポイント０分で採取した細胞の画像であり、（Ｂ）はタイムポイント６０分、（Ｃ）はタイムポイント９０分の画像である。直下のグラフは、試料定量化を示す。（Ｄ）はタイムポイント０分を示し、（Ｅ）は６タイムポイント０分、（Ｆ）はタイムポイント９０分を示す。ｙ軸は正規化度数を示し、ｘ軸は細胞の全蛍光強度に対するＡｌｅｘａ４８８複合Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ９．３の細胞内蛍光強度を示す。グラフの下にある表は、分析（計数）した細胞数と、グラフの平均値を示す。この実験は３回繰り返して行い、代表的結果を示した。Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、抗体Ｌ１ＣＡＭｍＡｂＯＶ５２．２４の細胞内取込測定結果を示す。Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞を、Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ｍＡｂＯＶ５２．２４と共に異なる時間培養した。試料を固定化し、細胞表面に結合した抗体を、Ａｌｅｘａ６４７と結合したヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。タイムポイント０分の細胞は、抗体内在化を防ぐために氷の上で培養した。ＡｍｎｉｓＩＳＸイメージングフローサイトメトリーで試料を測定し、３０００個の細胞を採取し、ＡｍｎｉｓＩＤＥＡＳソフトウエアを用いて分析した。（Ａ）はタイムポイント０分で採取した細胞の画像であり、（Ｂ）はタイムポイント６０分、（Ｃ）はタイムポイント９０分の画像である。直下のグラフは、試料定量化を示す。（Ｄ）はタイムポイント０分を示し、（Ｅ）はタイムポイント６０分、（Ｆ）はタイムポイント９０分を示す。ｙ軸は正規化度数を示し、ｘ軸は細胞の全蛍光強度に対するＡｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ｍＡｂＯＶ５２．２４の細胞内蛍光強度を示す。グラフの下にある表は、分析（計数）した細胞数と、グラフの平均値を示す。この実験は３回繰り返して行い、代表的結果を示した。Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ９．３及びｍＡｂＯＶ５２．２４の細胞内取込測定結果を示す。この図は、図１及び図２で得られた結果の概要を示す。上側のグラフはＬ１ＣＡＭｍＡｂ９．３の、下側のグラフはＬ１ＣＡＭｍＡｂＯＶ５２．２４の、タイムポイント０分、６０分、９０分のグラフを表す。共焦点レーザー走査顕微鏡を使用した、Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ９．３及びｍＡｂＯＶ５２．２４の細胞内取込測定結果を示す。Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞を、Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ９．３、又はｍＡｂＯＶ５２．２４と共に７０分間培養した。試料を固定化し、細胞表面に結合した抗体を、Ａｌｅｘａ６４７と結合したヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。次に、ＬｅｉｃａＳＰ５ＩＩ共焦点レーザー走査顕微鏡で、試料を視覚化した。Ｚ切片は同じｚ位置で得た。各抗体について、ｎ＝３０の細胞を採取して分析した。共焦点レーザー走査顕微鏡を使用した、Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ９．３及びｍＡｂＯＶ５２．２４の細胞内取込測定結果を示す。Ｆｉｊｉ（ＩｍａｇｅＪ）を使用して画像を分析し、細胞の全蛍光強度に対するＡｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ｍＡｂ９．３及びｍＡｂＯＶ５２．２４の細胞内蛍光強度を、棒グラフとして表した。この実験は３回繰り返して行い、代表的結果を示した。４０分及び７０分における左側のバーは、それぞれｍＡｂ９．３の結果を示す。一方、４０分及び７０分における右側のバーは、それぞれｍＡｂＯＶ５２．２４の結果を示す。共焦点レーザー走査顕微鏡を使用した、Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ５Ｇ３及びｍＡｂＵＪ１２７．１１の細胞内取込測定結果を示す。Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞を、Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ５Ｇ３又はｍＡｂＵＪ１２７．１１とともに７０分間培養した。試料を固定化し、細胞表面に結合した抗体を、Ａｌｅｘａ６４７と結合したヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。次に、ＬｅｉｃａＳＰ５ＩＩ共焦点レーザー走査顕微鏡で、試料を視覚化した。Ｚ切片は同じｚ位置で得た。各抗体について、ｎ＝３０の細胞を採取した。図は代表的結果を示す。Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ９．３、ｍＡｂＯＶ５２．２４、ｍＡｂ５Ｇ３及びｍＡｂＵＪ１２７．１１の細胞内取込測定結果を示す。Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞を、Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ類とともに異なる時間培養した。試料を固定化し、細胞表面に結合した抗体を、Ａｌｅｘａ６４７と結合したヤギ抗マウス二次抗体を用いて検出した。タイムポイント０分の細胞は、抗体内在化を防ぐために氷の上で培養した。ＡｍｎｉｓＩＳＸイメージングフローサイトメトリーで試料を測定し、５０００個の細胞を採取し、ＡｍｎｉｓＩＤＥＡＳソフトウエアを用いて分析した。左側のグラフはタイムポイント０分の画像を示し、中央のグラフはタイムポイント６０分、右側のグラフはタイムポイント９０分の画像である。ｙ軸は正規化度数を示し、ｘ軸は細胞の全蛍光強度に対するＡｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ｍＡｂ類の細胞内蛍光強度を示す。各条件における相対的な細胞内蛍光強度の平均値を、グラフに示した。この実験は３回繰り返して行い、代表的結果を示した。Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞における、Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ９．３、ｍＡｂＯＶ５２．２４、ｍＡｂ５Ｇ３及びｍＡｂＵＪ１２７．１１の細胞内取込測定結果の比較を示す。図７は図６の代表的分析結果をまとめたものである。３つの個別に異なる実験結果を、各Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ実験における相対的な平均細胞内蛍光強度に基づいてグラフに表した。強度の値は、平均±標準偏差として棒グラフで表示した。また、異なるＬ１ＣＡＭｍＡｂ類の内在化が、統計的に有意な確率で増加、或いは、減少するかを決定するために、両側検定、独立スチューデントｔ−検定により、３つの個別の実験結果を分析した。ｐ値＜０．０５のとき統計的に有意と考える。また、星印は以下を表す：^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。

以下に実施例を示す。

［材料及び方法］
（細胞株）
ヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３ｉｐを、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国、バージニア州、マナサス）から入手した。この細胞株はＧｅｒｍａｎＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｔｅｒｉａｌ（ブラウンシュウェイグ、ドイツ）により認証を受け、全培養を通して通常の細胞形態であることを評価した。マイコプラズマ非検出培養液であることを毎週試験して確認した。１０％の熱失活処理したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ、ベルリン、ドイツ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーヘ、ドイツ）及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ダイゼンホッフェン、ドイツ）で、細胞を培養した。３７℃及び５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下で、全細胞を保持した。
（モノクローナル抗体類）
ヒトＬ１ＣＡＭに対するｍＡｂＬ１−９．３は、先に説明した（非特許文献６、特許文献１）。
Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、Ｌ１の外部ドメインを有するヒトＬ１−Ｆｃタンパク質、又は免疫性を与えるＳＫＯＶ３ｉｐ細胞を使用し、マウスに免疫性を与えて生産した。
Ｌ１−ＯＶ５２．２４モノクローナル抗体の免疫グロブリン遺伝子のｃＤＮＡ配列を決定し、先に上記した（軽鎖：ＳＥＱＩＤＮｏ．３及び重鎖：ＳＥＱＩＤＮｏ．４）。

また、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖及び軽鎖（定常ドメインを除くＶＤＪ又はＶＪドメイン）のタンパク質配列を、それぞれ決定した（ＳＥＱＩＤＮｏ．２及びＳＥＱＩＤＮｏ．１）。更に、Ｋａｂａｔ命名法によりＬ１−ＯＶ５２．２４のＣＤＲ配列類を決定した。Ｌ１−ＯＶ５２．２４のＣＤＲ配列類は、KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID No: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (HCDR3; SEQ ID No: 10)である。
両方のｍＡｂ類はＩｇＧ１アイソタイプである。
アイソタイプ対照品となるｍＡｂは、ＢｉｏＸＣｅｌｌ（ＷｅｓｔＬｅｂａｎｏｎ、ニューハンプシャー州、米国）から入手した。Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ類は、メーカーの説明書に従い標識化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＡｌｅｘａ４８８と結合した。簡単にいえば、１００μｇの抗体を１バイアルビンの標識化試薬と混合し、１時間培養し、その後、カラムで精製した。同じ標識化効果をもつことを確かめるために、標識化の程度を測定した。

［結合定数］
（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）平衡分析）
結合分析は、ＣＭ５センサチップを備えたＢＩＡｃｏｒｅ３０００を用いて行った。簡単にいえば、ＢＩＡｃｏｒｅＣＭ５チップをＥＤＣ／ＮＨＳで活性化し、様々なレベルのＬ１−Ｆｃを、活性化した表面上に捕獲した。残りの活性化部位は、エタノールアミン／ＨＣｌでブロックした。Ｌ１−ｍＡｂはＬ１−Ｆｃ表面と結合し、経時的に脱離するにまかせた。各密度表面を覆う各注入間の結合状態及び脱離状態を、速度論的に解析した。
［エピトープ認識化］
エピトープ特異性を測定するために、異なるＩｇドメインを有する一連のＬ１−Ｆｃタンパク質を構築した（非特許文献６参照）。最近発表された細密マッピング組換Ｖ５タグ付Ｌ１断片類を使用した（ＧｏｕｖｅｉａＲＭ，ＭｏｒａｓＶＡ，ＰｅｉｘｏｔｏＣ．等、スポドプテラ・フルギペルダＳｆ９細胞由来の、ヒト組換Ｌ１細胞接着糖タンパクの機能性断片化可溶形態の産生と精製、ＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒＰｕｒｉｆ２００７、５２：１８２−９３参照）。エピトープマッピング用に、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット分析において組換タンパク質を使用した。

［抗体取込アッセイ］
（イメージングフローサイトメトリー用（画像時系列用））
Ｓｋｏｖ３ｉｐ細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで脱着し、培養培地中で再び懸濁化、計数し、等細胞数の試料に分配した（２００，０００個の細胞）。標識化抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、異なるタイムポイントにおいて３７℃で細胞を培養した。また、タイムポイント０分では氷の上で培養した。それぞれのタイムポイント毎に８００×ｇで細胞を沈降させ、氷冷ＰＢＳで一回洗浄し、４％ＰＦＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を用い、氷の上で１５分間固定した。固定した細胞はＰＢＳで二回洗浄し、２５μｇ/ｍＬのヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーヘ、ドイツ）と共に２０分間培養し、その後ＰＢＳにて二回洗浄した。
（共焦点レーザー走査顕微鏡用）
２５，０００個の細胞をまき、８ウェルμスライド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ミュンヘン、ドイツ）で２４時間生育した。標識化抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下、異なるタイムポイントにおいて３７℃で細胞を培養した。それぞれのタイムポイント毎に細胞を氷冷ＰＢＳで一回洗浄し、４％ＰＦＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を用い、氷の上で１５分間固定した。固定した細胞はＰＢＳで二回洗浄し、２５μｇ/ｍＬのヤギ抗マウスＡｌｅｘａ６４７二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーヘ、ドイツ）と共に２０分間培養し、その後ＰＢＳにて二回洗浄した。

［イメージングフローサイトメトリーと分析］
６０×対物と拡張被写界深度（ＥＤＦ）作動を選択し、１００％設定の４８８ｎｍレーザー及び８０％設定の５６１ｎｍレーザーを用い、ＡｍｎｉｓＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（ＩＳＸ）（ＡｍｎｉｓＣｏｒｐ．，シアトル、米国）にて、試料を測定した。チャンネル２及び５と共にチャンネル１の明視野画像を記録し、試料毎に４０００個の細胞を採取した。Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ類の補正対照群として、各抗体用に等分量の細胞を、固定化後と、抗マウスＡｌｅｘａ６４７を用いた染色計数を行う前とで取得した。結合抗体類と同濃度で、それぞれの非結合Ｌ１ｍＡｂ類を用いて、氷の上で細胞を染色した。更に、抗マウスＡｌｅｘａ６４７抗体で対比染色するための補正対照用に、同じ抗マウスＡｌｅｘａ６４７二次抗体を用いて前記細胞を対比染色した。補正対照はＩＳＸの補正設定を用いて取得した。

ＩＳＸデータの解析はＩＤＥＡＳソフトウエアを用いて行った（ＡｍｎｉｓＣｏｒｐ．，シアトル、米国）。生の画像ファイルを開き、それぞれの補正ファイルを使用して補正マトリックスを作製した。採取した細胞は、明視野画像を用いて焦点内の細胞についてゲーティングし、続いて単一細胞についてゲーティングを行い、ゲーティングを制御した。チャンネル５の画像を用いて、「細胞表面マスク」を作製した。このとき、バックグランドを除き、シグナルを最適化するために、強度の下限を２００に、上限を４０９５から変化させずに設定した。一方、チャンネル２では、強度の下限設定を１５０で切り捨て、上限を４０９５から変化させずにおいて「チャンネル２」と名付けた。両方の設定とも、Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ、又は二次抗体単独についてアイソタイプ対照群と共に染色した対照群を元にして行った。また、前記「細胞表面マスク」を１画素により広げて、チャンネル２の隣接画素群を含ませた。更に、「細胞内シグナル」と名付けた別のマスクを作製し、これを「チャンネル２及び非細胞表面マスク」と定義した。最後に、「相対的な細胞内強度」と名付けた機能を、以下の定義式：細胞内シグナル／（強度＿ＭＣ＿Ｃｈ０２^＊１００）を用いて作製した。個々のヒストグラムをプロットして平均値を決定した。同じ方法を測定した全試料に適用した。

［共焦点レーザー走査顕微鏡測定と解析］
ＨｙＤ検出器を備えたＬｅｉｃａＳＰ５ＩＩ（Ｌｅｉｃａｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウェルツラー、ドイツ）共焦点レーザー走査顕微鏡で試料を測定した。４８８ｎｍのアルゴンレーザーを使用してＡｌｅｘａ結合Ｌ１ｍＡｂ類を励起し、６３３ｎｍのＨｅＮeレーザーラインを使用してＡｌｅｘａ−６４７を励起した。Ｚ断片は、同じｚ位置で獲得した。全ての抗体について、ｎ＝３０の細胞を獲得して定量化した。Ｆｉｊi（ＩｍａｇｅＪ，ＮＩＨ，ベセスダ、米国）を使用して画像を解析した。マウスＡｌｅｘａ−６４７で対比染色した細胞表面のシグナルを用いて、単一細胞の境界を区分化して同定した。続いて、細胞内蛍光強度と全細胞蛍光強度とを測定した。結果を、Ａｌｅｘａ４８８結合ｍＡｂＬ１−９．３及びＬ１−ＯＶ５２．５４の細胞内蛍光強度を示す棒グラフとしてプロットした。なお、この細胞内蛍光強度は、Ｅｘｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、レッドモンド、米国）を用いて、細胞の全蛍光強度に対するものとしてグラフ化した。

［結果］
ｍＡｂＬ１−９．３及びｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４は、Ｌ１ＣＡＭ細胞表面分子の別々の細胞表面エピトープと結合した。ｍＡｂ９．３は、第１のＩｇドメイン（１．Ｉｇ−Ｌ１−Ｆｃ［特許文献１参照］）から構成される融合タンパク質と明らかに反応した。ウエスタンブロット解析で、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４はＬ１の４−５ＦＮＩＩＩドメインを認識することを確認した。ｍＡｂＬ１−９．３は、第１Ｉｇドメインに結合し、他方、Ｌ１−ＯＶ５２．２４は４−５ＦＮＩＩＩドメインのエピトープと結合した。ｍＡｂ９．３はＫＤ（Ｍ）＝８．５^＊１０^−１１［非特許文献６参照］のＬ１との親和力を有し、他方、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４はＫＤ（Ｍ）＝２．４１^＊１０^−９のＬ１との親和力を有した。Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、ウエスタンブロット及びＦＡＣＳ分析実験から、優れた機能を有し、免疫組織化学（ＩＣＨ）実験から良好な機能を有することを見出した。
本発明者らは、上記の材料及び方法の項目で概略したように、Ａｌｅｘａ−４８８結合ｍＡｂを用い、ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞への内在化評価を行った。内在化は、ＦＡＣＳと蛍光分析を組み合わせた、数千個の細胞を定量できるＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ^Ｘ分析（画像時系列分析）で測定した。データは、ＩＤＥＡＳソフトウエアで解析した。Ｌ１−９．３の分析から、タイムポイント０分、６０分及び９０分で、ゆっくりとした内在化を示し（図１のＡ−Ｆ）、最終タイムポイントでは平均値７．８％であった。これに対し、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４はずっと速く内在化し、最終タイムポイントでは平均値４０％にまで達した（図２のＡ−Ｆ）。これらデータを図３で直接比較した。

以上のデータが正しいことを確認するために、補足の細胞を使用して同様の分析を行った。ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞をカバーグラス上で生育し、Ａｌｅｘａ結合抗体類を用いて内在化させた。また、レーザー走査顕微鏡と細胞の目視計数によって、定量化を行った。染色例を図４Ａに示し、結果を図４Ｂにまとめた。これらの結果から、画像時系列分析で得られたデータが確認され、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４が１０倍近い高い内在化速度を生じることが示された。こうした結果は予想外であり、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４が抗体−薬物複合体の輸送に好適であることを示唆する。

［材料及び方法］
（細胞株）
ヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３ｉｐを、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナサス、バージニア州、米国）から入手した。この細胞株はＧｅｒｍａｎＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｔｅｒｉａｌ（ブラウンシュウェイグ、ドイツ）により認証を受け、全培養を通して通常の細胞形態であることを評価した。マイコプラズマ非検出培養液であることを毎週試験して確認した。１０％の熱失活処理したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ、ベルリンドイツ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスルーヘ、ドイツ）及び１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＤＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ダイゼンホッフェン、ドイツ）で、細胞を培養した。３７℃及び５％ＣＯ_２の加湿雰囲気下で、全細胞を保持した。
（モノクローナル抗体類）
ヒトＬ１ＣＡＭに対するｍＡｂＬ１−９．３及びｍＡｂＵＪ１２７．１１は、先に説明した通りである（非特許文献６）。
Ｌ１−ＯＶ５２．２４は、Ｌ１の外部ドメインを有するヒトＬ１−Ｆｃタンパク質、又は免疫性を与えるＳＫＯＶ３ｉｐ細胞を使用し、マウスに免疫性を与えて生産した。
Ｌ１−ＯＶ５２．２４モノクローナル抗体の免疫グロブリン遺伝子のｃＤＮＡ配列を決定し、上記した（軽鎖：ＳＥＱＩＤＮｏ．３及び重鎖：ＳＥＱＩＤＮｏ．４）。

また、Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖及び軽鎖（定常ドメインを除くＶＤＪ又はＶＪドメイン）のタンパク質配列を、それぞれ決定した（ＳＥＱＩＤＮｏ．２及びＳＥＱＩＤＮｏ．１）。更に、Ｋａｂａｔ命名法によりＬ１−ＯＶ５２．２４のＣＤＲ配列類を決定した。Ｌ１−ＯＶ５２．２４のＣＤＲ配列類は、KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID No: 5), STSYRYS (LCDR2; SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (HCDR3; SEQ ID No: 10)である。
また、ｍＡｂＬ１−９．３、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４、ｍＡｂＵＪ１２７．１１は、ＩｇＧ１のアイソタイプである。ｍＡｂ５Ｇ３はＩｇＧ２ａのアイソタイプである。また、対応するアイソタイプ対照品ｍＡｂは、ＢｉｏＸＣｅｌl（ウエストレバノン、ニューハンプシャー州）から入手した。Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ類は、メーカーの説明書に従い標識化キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＡｌｅｘａ４８８と結合した。簡単にいえば、１００μｇの抗体を１バイアルビンの標識化試薬と混合し、１時間培養し、その後、カラムで精製した。同じ標識化効果をもつことを確かめるために、標識化の程度を測定した。Ａｌｅｘａ４８８と結合したｍＡｂ５Ｇ３は、ＮｏｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（リットルトン、米国）から購入した。

［イメージングフローサイトメトリーと分析］
６０×対物と拡張被写界深度（ＥＤＦ）作動を選択し、１００％設定の４８８ｎｍレーザー及び８０％設定の５６１ｎｍレーザーを用い、ＡｍｎｉｓＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍＸ（ＩＳＸ）（ＡｍｎｉｓＣｏｒｐ．，シアトル、米国）にて、試料を測定した。チャンネル２及び５と共にチャンネル１の明視野画像を記録し、試料毎に１０，０００個の細胞を採取した。Ａｌｅｘａ４８８結合Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ類の補正対照群として、各抗体用に等分量の細胞を、固定化後と、抗マウスＡｌｅｘａ６４７を用いた染色計数を行う前とで取得した。結合抗体類と同濃度で、それぞれの非結合Ｌ１ｍＡｂ類を用いて、氷の上で細胞を染色した。更に、抗マウスＡｌｅｘａ６４７抗体で対比染色するための補正対照用に、同じ抗マウスＡｌｅｘａ６４７二次抗体を用いて前記細胞を対比染色した。補正対照はＩＳＸの補正設定を用いて取得した。

ＩＳＸデータの解析はＩＤＥＡＳソフトウエアを用いて行った（ＡｍｎｉｓＣｏｒｐ．，シアトル、米国）。生の画像ファイルを開き、それぞれの補正ファイルを使用して補正マトリックスを作製した。採取した細胞は、明視野画像を用いて焦点内の細胞についてゲーティングし、続いて単一細胞についてゲーティングを行い、ゲーティングを制御した。チャンネル５の画像を用いて、「細胞表面マスク」を作製した。このとき、バックグランドを除き、シグナルを最適化するために、強度の下限を２００に、上限を４０９５から変化させずに設定した。一方、チャンネル２では、強度の下限設定を１５０で切り捨て、上限を４０９５から変化させずにおいて「チャンエル２」と名付けた。両方の設定とも、Ｌ１ＣＡＭｍＡｂ、又は二次抗体単独についてアイソタイプ対照と共に染色した対照群を元にして行った。また、前記「細胞表面マスク」を１画素により広げて、チャンネル２の隣接画素群を含ませた。更に、「細胞内シグナル」と名付けた別のマスクを作製し、これを「チャンネル２及び非細胞表面マスク」と定義した。最後に、「相対的な細胞内強度」と名付けた機能を、以下の定義式：細胞内シグナル／（強度＿ＭＣ＿Ｃｈ０２^＊１００）を用いて作製した。個々のヒストグラムをプロットして平均値を決定した。同じ方法を測定した全試料に適用した。

［共焦点レーザー走査顕微鏡測定法］
ＨｙＤ検出器を備えたＬｅｉｃａＳＰ５ＩＩ（Ｌｅｉｃａｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ウェルツラー、ドイツ）共焦点レーザー走査顕微鏡で試料を測定した。４８８ｎｍのアルゴンレーザーを使用してＡｌｅｘａ結合Ｌ１ｍＡｂ類を励起し、６３３ｎｍのＨｅＮeレーザーラインを使用してＡｌｅｘａ−６４７を励起した。Ｚ断片は、同じｚ地点で獲得した。全ての抗体について、ｎ＝３０の細胞を獲得して定量化した。代表的な画像を示した。
［統計解析］
少なくとも３つの個別の実験条件間で、統計的に有意の確率で増大、又は減少するかについて、スチューデントのｔ−検定を用いて検討した。両側検定、独立ｔ−検定を行った。強度の値は、平均±標準偏差として棒グラフで表示した。ｐ値＜０．０５のとき統計的に有意であると考える。また、星印は以下を表す：^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１。
［結果］
実施例２の結果を図５から図７に示す。本発明者らは、上記の材料及び方法の項目で概略したように、Ａｌｅｘａ−４８８結合ｍＡｂを用い、ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞への内在化評価を行った。内在化は、ＦＡＣＳと蛍光分析とを組み合わせた数千個の細胞を定量できる、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ^Ｘ分析（画像時系列分析）で測定した。データは、ＩＤＥＡＳソフトウエアで解析した。解析結果は、従来技術のモノクローナル抗体類Ｌ１−９．３、５Ｇ３及びＵＪ１２７．１１が、タイムポイント０分、６０分及び９０分で、ゆっくりとした内在化を行うことを示した。（図６）。これに対し、本発明のｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４はずっと速く内在化し、最終タイムポイントでは平均値４１．７％にまで達した（図６）。これらのデータを図７にまとめた。驚くべきことに、９０分でのＬ１−ＯＶ５２．２４の内在化は、先行技術の抗Ｌ１モノクローナル抗体類９．３、５Ｇ３、ＵＪ１２７．１１の如何なる抗体よりも統計的に速いことを見出した。それぞれｐ値＜０．０１である。

以上のデータの正しさを確認するために、補足の細胞を使用して同様の分析を行った。ＳＫＯＶ３ｉｐ細胞をカバーグラス上で生育し、Ａｌｅｘａ結合抗体類を用いて内在化させた。また、レーザー走査顕微鏡と細胞の目視計数によって、定量化を行った。染色例を図５に示す。これらの結果から、画像時系列分析で得られたデータが確認され、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４がＬ１ＣＡＭ指向性である従来技術の抗体類と比較して、驚くほど速い内在化速度を有することが示された。こうした結果は予想外であり、ｍＡｂＬ１−ＯＶ５２．２４が抗体−薬物複合体の輸送に好適であることを示唆する。

Claims

Ｌ１と結合する結合性分子であって、
前記結合性分子は、
（ｉ）モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４により認識される同じＬ１エピトープと結合可能、及び／又は、
（ｉｉ）Ｌ１との結合において、前記モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４と拮抗し、
前記Ｌ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部分はＳＥＱＩＤＮｏ．1の配列を有するか、又は、前記軽鎖はＳＥＱＩＤＮｏ．３でコードされ、
前記Ｌ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部分はＳＥＱＩＤＮｏ．２の配列を有するか、又は、前記重鎖はＳＥＱＩＤＮｏ．４でコードされることを特徴とする、Ｌ１と結合する結合性分子。
抗Ｌ１モノクローナル抗体、又は、前記抗Ｌ１モノクローナル抗体の抗原結合性断片であることを特徴とする、請求項１に記載する結合性分子。
前記結合性分子は、一本鎖抗体及び抗体断片からなる群から選ばれ、前記一本鎖抗体が好適にはｓｃＦｖ、或いは、前記ｓｃＦｖの二量体、三量体又は四量体などの多量体であり、前記抗体断片が好適にはＦａｂ、タンダブ（ＴａｎｄＡｂ）、フレキシボデー（Ｆｌｅｘｉｂｏｄｙ）、又は二重特異性抗体であり、及び／又は、
前記結合性分子は、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体、或いは、前記したキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体の抗原結合性断片であることを特徴とする、請求項１に記載する結合性分子。
前記エピトープが、前記Ｌ１のフィブロネクチンドメインＩＩＩ４−５（ＦＮＩＩＩ４−５）内部にあることを特徴とする、請求項１から請求項３の何れか１項に記載する結合性分子。
前記抗Ｌ１モノクロ−ナル抗体の、又は前記抗Ｌ１モノクロ−ナル抗体の抗原結合性断片の、相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも１つが、
ａ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5), STSYRYS (SEQ ID No: 6), QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7), FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8), WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9), 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10) から選ばれる配列の１つを有し、又は、
ｂ）前記のａ）に記載した配列と比較して、少なくとも１個の保存アミノ酸が変換されている配列を有することを特徴とする、請求項２に記載する結合性分子。
前記抗モノクローナル抗体、又は前記抗モノクローナル抗体の抗原結合性断片は、１個以上の保存アミノ酸が随意変換されている、QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7) 又は WNPLAF (SEQ ID No: 10)である相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、
好適には、前記抗モノクローナル抗体又は前記抗体の結合性断片は、１個以上の保存アミノ酸が随意変換されている、KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5)、 STSYRYS (SEQ ID No: 6)、 QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7)、 FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8)、 WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9)、又はWNPLAF (SEQ ID No: 10)である相補性決定領域（ＣＤＲ）を有することを特徴とする、請求項５に記載する結合性分子。
前記結合性分子が、
ａ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5)、 STSYRYS (SEQ ID No: 6)、 QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7)、 FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8)、 WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9)、及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)から選ばれる配列のうち少なくとも１つを有し、又は
ｂ）前記のａ）に記載した配列と比較して、少なくとも１個の保存アミノ酸が変換されている配列を有することを特徴とする、請求項１から請求項４の何れか１項に記載する結合性分子。
前記結合性分子は、
１個以上の保存アミノ酸が随意変換されている、QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7) 及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)である配列を有し、
好適には、１個以上の保存アミノ酸が随意変換されている、KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5)、 STSYRYS (SEQ ID No: 6)、QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7)、 FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8)、WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9)、及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)である配列を有することを特徴とする、請求項７に記載する結合性分子。
前記結合性分子は抗Ｌ１モノクローナル抗体又は前記抗Ｌ１モノクローナル抗体の抗原結合性断片であって、前記抗Ｌ１モノクローナル抗体が、それぞれ相補性決定領域（ＣＤＲ）である、KASQNVGTNVA (LCDR1; SEQ ID No: 5)、 STSYRYS (LCDR2; SEQ ID No: 6)、 QQYNTYPYT (LCDR3; SEQ ID No: 7)、 FNIKDYYMQ (HCDR1; SEQ ID No: 8)、 WIDPENGKTVFDPKFRG (HCDR2; SEQ ID No: 9)、及び WNPLAF (HCDR3; SEQ ID No: 10)の相補性決定領域群（ＣＤＲ群）を有することを特徴とする、請求項１から請求項４の何れか１項に記載する結合性分子。
（ｉ）少なくとも１０^−９、好適には少なくとも１０^−１０の親和力（ＫＤ）でＬ１と結合し、及び／又は、
（ｉｉ）Ｌ１を発現する、好適にはＳＫＯＶ３ｉｐ細胞である哺乳類細胞に内在化することを特徴とする、請求項１から請求項９の何れか１項に記載する結合性分子。
前記結合性分子は前記モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４、又は前記モノクローナル抗体Ｌ１−ＯＶ５２．２４の抗原結合性断片であって、
前記したＬ１−ＯＶ５２．２４の軽鎖の可変部分がＳＥＱＩＤＮｏ．1の配列を有する、又は、前記軽鎖がＳＥＱＩＤＮｏ．３でコードされ、
前記したＬ１−ＯＶ５２．２４の重鎖の可変部分がＳＥＱＩＤＮｏ．２の配列を有する、又は、前記重鎖がＳＥＱＩＤＮｏ．４でコードされることを特徴とする、請求項１に記載する結合性分子。
（ａ）治療用活性物質と結合した、好適には、
アルキル化剤、抗悪性腫瘍抗生物質、代謝抵抗物質、及び天然物誘導体から選ばれる化学療法剤、
細胞毒性化合物、
細胞増殖抑制化合物、
サイトカイン、
微細粒子、又は
放射性核種と結合した、及び／又は、
（ｂ）診断用化合物と結合する、好適には、
放射性核種、化学発光化合物、蛍光化合物、色素、又は酵素から選ばれる診断用化合物と結合する結合性分子であって、
前記治療用活性物質は、化学療法剤、細胞毒性化合物、或いはアクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、シスプラチン、ドキソルビシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィルトキシン、５−ＦＵ、天然物誘導体、パクリタキセル及びカルボプラチンのタキサン類といったＤＮＡ損傷剤から選ばれる細胞増殖抑制化合物であり、或いは、
前記結合性分子は、前記した（ａ）の治療用活性物質と、及び／又は、前記した（ｂ）の診断用化合物と、随意連結部を介して共有結合することを特徴とする、請求項１から請求項１１の何れか１項に記載する結合性化合物。
請求項９又は請求項１１に記載する前記抗Ｌ１モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞。
（ｉ）請求項１から請求項１１の何れか１項に記載する結合性化合物をコードし、及び／又は、
（ｉｉ）請求項１から請求項１１の何れか１項に記載する結合性化合物の少なくとも１本の鎖をコードし、及び／又は、
（ｉｉｉ）ＳＥＱＩＤＮｏ．３及び／又はＳＥＱＩＤＮｏ．４の配列を有し、及び／又は、
（ｉｖ）KASQNVGTNVA (SEQ ID No: 5)、 STSYRYS (SEQ ID No: 6)、 QQYNTYPYT (SEQ ID No: 7)、 FNIKDYYMQ (SEQ ID No: 8)、 WIDPENGKTVFDPKFRG (SEQ ID No: 9)、及び WNPLAF (SEQ ID No: 10)からなる配列の少なくとも１つをコードする配列を有する核酸であって、
前記核酸はベクターの一部であることを特徴とする核酸。
請求項１から請求項１２の何れか１項に記載する結合性化合物を、インビトロ診断薬又はインビトロ生物工学的薬剤として使用する方法。
医薬又は診断薬として使用するための、請求項１から請求項１２の何れか１項に記載する結合性化合物。
腫瘍性疾患の治療又は予防に使用するための請求項１から請求項１２の何れか１項に記載する結合性化合物であって、前記腫瘍性疾患は、上皮腫瘍性疾患、及び／又は、星状細胞腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽腫、脳室上衣腫、シュワン細胞腫、神経線維肉腫、髄芽細胞腫、メラノーマ、膵臓癌、前立腺癌、頭頚部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎癌、神経芽細胞腫、扁平上皮癌、髄芽細胞腫、肝癌、大腸癌、中皮腫、及び類表皮癌からなる群から選ばれることを特徴とする結合性化合物。
請求項１から請求項１２の何れか１項に記載する結合性化合物と、随意１個以上の薬学的許容な担体と、を有する薬学的組成物。