CN112010980B - 重组抗cd171双特异抗体及神经来源外泌体的捕获方法 - Google Patents

重组抗cd171双特异抗体及神经来源外泌体的捕获方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种重组抗CD171双特异抗体及神经来源外泌体的捕获方法，其包括重组重链和重组轻链；所述重组重链包括第一抗体的重链可变区、第二抗体的重链可变区和重链恒定区，所述重组轻链包括第一抗体的轻链可变区、第二抗体的轻链可变区和轻链恒定区；所述第一抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示；所述第二抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:3所示，所述第二抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:4所示。利用该重组抗体捕获神经来源外泌体具有特异性高、快速、稳定等优势，可保证捕获外泌体的高丰度，并维持超强的神经组织特异性。

Description

重组抗CD171双特异抗体及神经来源外泌体的捕获方法
技术领域
本发明涉及生化分子技术领域，特别是涉及一种重组抗CD171双特异抗体及神经来源外泌体的捕获方法。
背景技术
以阿茨海默病（Alzheimer disease, AD）为代表的神经系统疾病是一种常见于老年人的神经退行性疾病，其主要病理变化是大脑皮质弥散性萎缩、神经原纤维缠结和神经细胞间大量老年斑形成等，以进行性认知障碍和记忆功能减退为其主要临床症状。痴呆症是人类的问题，也是一个全球性的问题。早期诊断、及时干预是目前唯一有效延缓疾病进展的措施。对于AD的早期诊断主要依赖于临床病史、影像方面的检测、量表的测评以及CSF（脑脊液）标志物的检测。PET等影像方面的检查，不仅价格昂贵，且对设备要求高，尚不能在一般医院大规模开展。心理量表的测评虽然检测方便，但受到的影响因素较多，如受试者的文化程度、测评者的主观判断或环境影响等。而CSF标志物Aβ、Tau等均已被验证具有极高的特异性和灵敏度，但由于腰椎穿刺有创，样品标本不易获得而限制了临床应用。血浆较脑脊液易获得，易于进行临床开展，然而对于外周血中Aβ1-42（人β淀粉样蛋白1-42）的研究结果存在差异，其原因可能与血浆中Aβ1-42不止来源于中枢神经系统有关。
血浆神经系统来源外泌体标志物的检测有助于AD的无创早期诊断。外泌体作为一种细胞间交流方式，在中枢神经系统参与形成神经元-胶质信号网络，脑胶质细胞通过分泌外泌体的方式穿过血脑屏障进入到血液中，同时外泌体携带了与AD发病相关的多种标志物蛋白，如Tau蛋白和Aβ等。但是，目前捕获外泌体的方法仍效果不佳，难以进行高效地富集。
发明内容
基于此，有必要提供一种可用于高效捕获神经来源外泌体的重组抗CD171双特异抗体。
一种重组抗CD171双特异抗体，包括重组重链和重组轻链；所述重组重链包括第一抗体的重链可变区、第二抗体的重链可变区和重链恒定区，所述重组轻链包括第一抗体的轻链可变区、第二抗体的轻链可变区和轻链恒定区；所述第一抗体的重链可变区序列如SEQID NO:1所示，所述第一抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示；所述第二抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:3所示，所述第二抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO:1：
EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYQFTQYNMNWVKQSNGKSLEWIGVINPNYGTTSYNQKFKGKATLTVDQSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARYYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO:2：
DIVMTQTPASLAVSLGQRATISYRASKSQSTSGQSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWKNGLMLHQLY
SEQ ID NO:3：
EVQLEESGPGLVQPSQSLSITCTVSGQSLTQYGVHWVRQSPGEGLEWLGVIWSGGSTDYDAVFISRLSISKDNSKSQVFFRMNSLQPNDTAIYYCARNWGDGPMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVY
SEQ ID NO:4：
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASQSVQTSSQSYMHWYQQKPGQPPKLLIKYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEVDTATYYCQHSWEIPWTFGGGTKLDIKRADAAPTVS
本发明的重组抗CD171双特异抗体既能与CD171蛋白上的Ig样C2型第1结构域（Ig-like C2-type 1）结合，又能与CD171蛋白上的纤连蛋白3型第5结构域（Fibronectin type-III 5结构域）结合，利用该重组抗体捕获神经来源外泌体具有特异性高、快速、稳定等优势，可保证捕获外泌体的高丰度，并维持超强的神经组织特异性。本发明的重组抗CD171双特异抗体为外泌体神经来源标志物的临床诊断的开展提供了更加有力的支持，可用于检测以神经来源外泌体的生物标记物的异常变化为表征的神经系统疾病早筛、进展监控或治疗效果评价等多方面的应用。
在其中一个实施例中，所述第一抗体的重链可变区与所述第二抗体的重链可变区通过第一接头肽连接，所述第一抗体的轻链可变区与所述第二抗体的轻链可变区通过第二接头肽连接。
在其中一个实施例中，所述第一接头肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5（AKTTPP）所示，所述第二接头肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6（ADAAP）所示。
本发明还提供了上述重组抗CD171双特异抗体在制备用于捕获神经来源外泌体的产品中的应用。
本发明还提供了一种非疾病诊断和治疗目的的神经来源外泌体的捕获方法，利用上述重组抗CD171双特异抗体与神经来源外泌体的特异性结合反应富集所述神经来源外泌体。
在其中一个实施例中，包括以下步骤：将上述重组抗CD171双特异抗体与固相载体偶联，然后与含有神经来源外泌体的样品混合孵育，使所述重组抗CD171双特异抗体与所述神经来源外泌体特异性结合，然后分离所述固相载体。
在其中一个实施例中，所述固相载体为磁珠或树脂，所述含有神经来源外泌体的样品选自血清、血浆、血液、尿液、唾液和脑脊液中的一种或多种。
本发明还提供了一种外泌体捕获试剂盒，包括上述重组抗CD171双特异抗体，以及缓冲液和固相载体。
本发明还提供了一种重组表达载体系统，其含有一个或多个重组表达载体，所述重组表达载体系统含有编码所述重组重链和所述重组轻链的基因序列。
本发明还提供了一种宿主细胞，其含有上述重组表达载体。
在其中一个实施例中，所述宿主细胞为COS细胞、CHO细胞、NS0细胞、sf9细胞、sf21细胞、DH5α细胞或BL21细胞。
本发明还提供了一种小鼠杂交瘤细胞，保藏号为CGMCC No.18893。
本发明还提供了一种小鼠杂交瘤细胞，保藏号为CGMCC No.18894。
附图说明
图1为本发明一实施例的重组抗CD171双特异抗体的结构示意图；
图2为实施例1中重组抗CD171双特异性抗体的SDS-PAGE图，其重链分子量为70KD左右，轻链分子量为35KD左右；
图3为实施例1中重组抗CD171双特异抗体表位验证Westernblot图，与CD171抗体1及CD171抗体2相比，能同时与CD171表位1（Ig-like C2-type 1结构域）及CD171表位2（Fibronectin type-III 5结构域）反应，表明其具有双表位；
图4为实施例3中利用重组抗CD171双特异抗体捕获外泌体后的NTA检测图，显示颗粒直径介于81nm~193nm之间；
图5为实施例3中在WB水平上不同捕获抗体对外泌体的捕获效果，表明相较于CD171抗体（5G3）及CD63抗体，利用重组抗CD171双特异抗体能捕获更多的外泌体；
图6为实施例4中配对脑脊液及血浆CD171双特异捕获外泌体中Aβ42检测浓度的相关性图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。
术语解释
“抗体”是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。抗体以一个或者多个Y字形单体存在，每个Y字形单体由4条多肽链组成，包含两条相同的重链和两条相同的轻链，轻链和重链是根据它们的分子量大小来命名的。Y字形结构的顶端是可变区，为抗原结合部位。每个重链有两个区即恒定区和可变区，所有同一型的抗体其恒定区都是相同的，不同型的抗体之间则存在差异。每条轻链也有两个前后相连的结构域，即一个恒定区和一个可变区。
“载体（vector）”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1来源的人工染色体（PAC）；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。
“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，CHO细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞，BHK细胞，HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。
“外泌体（exosome）”是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。
如图1所示，本发明一实施例的重组抗CD171双特异抗体，包括重组重链和重组轻链。重组重链包括第一抗体的重链可变区（VH1）、第二抗体的重链可变区（VH2）和重链恒定区（CH1-CH2-CH3），重组轻链包括第一抗体的轻链可变区（VL1）、第二抗体的轻链可变区（VL2）和轻链恒定区（CL）。第一抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示，第一抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示。第二抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:3所示，第二抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的重组抗CD171双特异抗体既能与CD171蛋白上的Ig样C2型第1结构域（Ig-like C2-type 1）结合，又能与CD171蛋白上的纤连蛋白3型第5结构域（Fibronectin type-III 5结构域）结合，利用该重组抗体捕获神经来源外泌体具有特异性高、快速、稳定等优势，可保证捕获外泌体的高丰度，并维持超强的神经组织特异性。本发明的重组抗CD171双特异抗体为外泌体神经来源标志物的临床诊断的开展提供了更加有力的支持，可用于检测以神经来源外泌体的生物标记物的异常变化为表征的神经系统疾病早筛、进展监控或治疗效果评价等多方面的应用。
在一个具体示例中，第一抗体的重链可变区与第二抗体的重链可变区通过第一接头肽连接，第一抗体的轻链可变区与第二抗体的轻链可变区通过第二接头肽连接。具体地，重组重链从N端到C端依次包括第一抗体的重链可变区、第一接头肽、第二抗体的重链可变区和重链恒定区，重组轻链从N端到C端依次包括第一抗体的轻链可变区、第二接头肽、第二抗体的轻链可变区和轻链恒定区。
在一个具体示例中，第一接头肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，第二接头肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。可以理解，第一接头肽和第二接头肽的具体氨基酸序列不限于此，可根据需要选择其他接头肽。
可选地，重链恒定区和轻链恒定区来源于人免疫球蛋白，人免疫球蛋白的类型为免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、免疫球蛋白M、免疫球蛋白D或免疫球蛋白E。
本发明一实施例的神经来源外泌体的捕获方法，利用上述重组抗CD171双特异抗体与神经来源外泌体的特异性结合反应富集神经来源外泌体。可以理解，该方法仅能捕获分离得到神经来源外泌体，不包括对神经来源外泌体上的标志物进行检测分析的步骤，若不对外泌体标志物进行检测分析，并不能确定患者是否是患有某种疾病或者健康状况，因此该方法不属于专利法意义上的“疾病诊断或治疗方法”。此外，捕获的外泌体还可用于其他目的，例如作为药物载体用于药物的制备等。
在一个具体示例中，神经来源外泌体的捕获方法具体包括以下步骤：将上述重组抗CD171双特异抗体与固相载体偶联，然后与含有神经来源外泌体的样品混合孵育，使重组抗CD171双特异抗体与神经来源外泌体特异性结合，然后分离固相载体。可以理解，其他利用抗原抗体特异性结合反应的方法也可根据需要选择，例如生物素-亲和素标记方法等。
在一个具体示例中，固相载体为磁珠或树脂，含有神经来源外泌体的样品选自血清、血浆、血液、尿液、唾液和脑脊液中的一种或多种，但不限于此。
本发明一实施例的外泌体捕获试剂盒，包括上述重组抗CD171双特异抗体，以及缓冲液和固相载体。可选地，缓冲液包括磷酸盐缓冲液和甘氨酸溶液，分别作为样品稀释缓冲液和洗脱缓冲液。
本发明一实施例的重组表达载体系统，其含有一个或多个重组表达载体，该重组表达载体系统含有编码上述重组重链和上述重组轻链的基因序列，编码上述重组重链和上述重组轻链的基因序列位于相同或不同重组表达载体上。可以理解，该重组表达载体可以是原核表达载体也可以是真核表达载体，但优选真核表达载体，更优选用于哺乳动物真核表达的重组表达载体。
本发明一实施例的宿主细胞，其含有上述重组表达载体，或其基因组整合有编码上述重组重链和上述重组轻链的基因序列。
在一个具体示例中，上述宿主细胞为COS细胞、CHO细胞、NS0细胞、sf9细胞、sf21细胞、DH5α细胞或BL21细胞。
以下为具体实施例。
实施例1 重组抗CD171双特异性抗体表达
分泌抗CD171蛋白Ig-like C2-type 1结构域的小鼠杂交瘤细胞株克隆号为2C1，于2019年11月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No. 18893。其分泌抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。分泌抗CD171蛋白Fibronectin type-III 5结构域的小鼠杂交瘤细胞株克隆号为9G12，于2019年11月15日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心（北京），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.18894。其分泌抗体的重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。以上两种结构域表位抗体的重链亚型均为IgG1。
重组抗CD171双特异性抗体中，Fibronectin type-III 5结构域表位抗体的VH（重链可变区）片段通过接头（AKTTPP）与Ig-like C2-type 1结构域表位抗体的重链N端融合；Fibronectin type-III 5结构域表位抗体的VL（轻链可变区）片段通过接头（ADAAP）与Ig-like C2-type 1结构域表位抗体的轻链N端融合。接头片段分别来源于鼠IgG1 CH1或Cκ的N端序列。
如图1所示，展示了重组抗CD171双特异性抗体的结构示意图，其中，VH1为原Fibronectin type-III 5结构域表位抗体的重链可变区序列，VH2为原Ig-like C2-type 1结构域表位抗体的重链可变区序列，CH1-CH2-CH3为原Ig-like C2-type 1结构域表位抗体的重链恒定区序列；VL1为原Fibronectin type-III 5结构域表位抗体的轻链可变区序列，VL2为原Ig-like C2-type 1结构域表位抗体的轻链可变区序列，CL为原Ig-like C2-type1结构域表位抗体的轻链恒定区序列。
将重组抗体的重链氨基酸序列，由N端至C端，其包含VH1、接头（AKTTPP）、VH2和CH1-CH2-CH3按照鼠源CHO密码子优化为重组重链核苷酸序列；将重组抗体的轻链氨基酸序列，由N端至C端，其包含VL1、接头（ADAAP）、VL2、CL按照鼠源CHO密码子优化为重组轻链核苷酸序列，优化后的上述核苷酸序列由金唯智生物科技有限公司合成并连接进入pVAX1载体。
将含有重组抗CD171双特异性抗体重、轻链核苷酸序列的表达载体同时并瞬时转染至CHO细胞，培养数天后，利用Protein G亲和纯化细胞培养上清，获得重组抗CD171双特异性抗体。纯化后的抗体经SDS-PAGE验证，纯度大于90%，图2展示了重组抗CD171双特异性抗体的SDS-PAGE图。同时以Ig-like C2-type 1和Fibronectin type-III 5两个片段蛋白通过WB验证重组抗体对这两段表位的识别能力，WB（图3）显示重组抗CD171双特异性抗体与Ig-like C2-type 1和Fibronectin type-III 5均特异反应。
实施例2 重组抗CD171双特异性抗体与CD171蛋白结合能力验证
抗CD171双特异性抗体与CD171蛋白的结合通过Biacore 3000进行检测。将CD171蛋白以不同浓度包被在Biacore 3000的芯片上后，检测其亲和力。抗CD171双特异抗体对CD171蛋白的亲和力显著高于母抗体，具体见表1。
表1 抗CD171双特异性抗体对CD171的亲和力
Figure 863013DEST_PATH_IMAGE001
实施例3 神经来源外泌体分离及表征
将10μg重组抗CD171双特异性抗体及市购抗人CD171单克隆抗体（克隆号5G3，Thermo，识别表位为Ig-like C2-type 1结构域）、抗人CD171单克隆抗体（克隆号UJ127，Thermo，Fibronectin type-III 5结构域）、抗人CD63抗体、正常小鼠IgG分别偶联到M-270磁珠上。0.5mL血浆样品于2000g下离心15min，接着于12000g下离心30min，然后用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释4倍，与一组抗体-磁珠复合物旋转孵育12小时，然后用pH 2.8的甘氨酸溶液洗脱获取外泌体。
NS500纳米颗粒分析仪定量检测外泌体：取5μL外泌体溶液按照1:200的比例加入到1mL的PBS溶液中，按照NS500仪器的操作说明进行操作。用NTA软件对纳米颗粒进行粒径分析，绘制颗粒分布曲线，结果显示颗粒直径介于81nm~193nm之间，如图4所示。
WB检测外泌体表面标志物蛋白：外泌体样品进行SDS-PAGE电泳后转膜，孵育CD171抗体和CD81抗体后，孵育羊抗鼠二抗检测蛋白标志物。同时使用CD81蛋白检测试剂盒和CD171蛋白检测试剂盒在ELISA水平上分别检测不同抗体对外泌体的捕获的效果。图5和表2分别显示了在WB水平上和ELISA水平上不同捕获抗体对外泌体的捕获效果，可以看出重组抗CD171双特异抗体对于神经来源外泌体具有更加高效的捕获效果。
表2 外泌体CD81和CD171蛋白含量
Figure 16914DEST_PATH_IMAGE002
实施例4 神经来源外泌体中Aβ含量的检测
收集AD患者血浆和CSF配对样本60例，正常人血浆和CSF配对样本20例，血浆神经来源外泌体采用实施例1的重组抗CD171双特异性抗体按照实施例3的方法进行捕获。使用Aβ42检测试剂盒分别检测血浆外泌体和CSF样本中标志物蛋白含量。统计外泌体标志物在各组样本中的含量分布，分析血浆外泌体检测结果与CSF检测结果的一致性。统计分析外泌体标志物在正常人与AD患者样本含量分布，获得cuf-off值，并对AD检测灵敏度、特异性及整体检测符合率进行分析。结果表明：血浆外泌体样本和脑脊液样本Aβ42的含量具有较好的相关性，R2大于0.99，如图6所示，血浆外泌体样本与脑脊液样本具有较高的一致性，AD患者血浆外泌体样本中的Aβ42含量高于正常人。AD检测灵敏度、特异性及整体检测符合率分析结果见表3。神经来源外泌体中Aβ42含量可反映脑损伤状态，可作为阿兹海默症疾病诊断和病情进展监控的标志物。
表3 神经来源外泌体中Aβ42含量的检测统计学指标
Figure 305944DEST_PATH_IMAGE003
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 上海良润生物医药科技有限公司
<120> 重组抗CD171双特异抗体及神经来源外泌体的捕获方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gln Phe Thr Gln Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Asn Tyr Gly Thr Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Gln Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Gln Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg
85 90 95
Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Asn Gly Leu Met
100 105 110
Leu His Gln Leu Tyr
115
<210> 3
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Val Gln Leu Glu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Gln Ser Leu Thr Gln Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ala Val Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Gln Pro Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Trp Gly Asp Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr
115 120 125
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gln Thr Ser
20 25 30
Ser Gln Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys Arg
100 105 110
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
115 120
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ala Lys Thr Thr Pro Pro
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Asp Ala Ala Pro
1 5

Claims (10)

1.一种重组抗CD171双特异抗体，其特征在于，包括重组重链和重组轻链；所述重组重链从N端到C端依次包括第一抗体的重链可变区、第二抗体的重链可变区和重链恒定区，所述重组轻链从N端到C端依次包括第一抗体的轻链可变区、第二抗体的轻链可变区和轻链恒定区；所述第一抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示，所述第一抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:2所示；所述第二抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:3所示，所述第二抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO:4所示；所述第一抗体的重链可变区与所述第二抗体的重链可变区通过第一接头肽连接，所述第一抗体的轻链可变区与所述第二抗体的轻链可变区通过第二接头肽连接；
所述第一接头肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述第二接头肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
2.权利要求1所述的重组抗CD171双特异抗体在制备用于捕获神经来源外泌体的产品中的应用。
3.一种非疾病诊断和治疗目的的神经来源外泌体的捕获方法，其特征在于，利用权利要求1所述的重组抗CD171双特异抗体与神经来源外泌体的特异性结合反应富集所述神经来源外泌体。
4.根据权利要求3所述的捕获方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的重组抗CD171双特异抗体与固相载体偶联，然后与含有神经来源外泌体的样品混合孵育，使所述重组抗CD171双特异抗体与所述神经来源外泌体特异性结合，然后分离所述固相载体。
5.根据权利要求4所述的捕获方法，其特征在于，所述固相载体为磁珠或树脂，所述含有神经来源外泌体的样品选自血清、血浆、血液、尿液、唾液和脑脊液中的一种或多种。
6.一种外泌体捕获试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的重组抗CD171双特异抗体，以及缓冲液和固相载体。
7.根据权利要求6所述的外泌体捕获试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液和甘氨酸溶液。
8.一种重组表达载体系统，其含有一个或多个重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体系统含有编码权利要求1中所述重组重链和所述重组轻链的基因序列。
9.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求8所述的重组表达载体。
10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为COS细胞、CHO细胞、NS0细胞、sf9细胞、sf21细胞、DH5α细胞或BL21细胞。
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