CN107108741A - 与l1cam（cd171）结合的结合分子，特别是抗体 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及与L1结合的结合分子、编码所述结合分子的核酸、其用途以及包含所述结合分子的药物组合物，所述结合分子能够结合至被单克隆抗体L1‑OV52.24识别的相同的L1表位，和/或所述结合分子与单克隆抗体L1‑OV52.24竞争性地与L1结合，其中L1‑OV52.24的轻链可变部分包含如SEQ ID No:1所示的序列或其中轻链由SEQ ID No:3编码，且其中L1‑OV52.24的重链可变部分包含如SEQ ID No:2所示的序列或其中重链由SEQ ID No:4编码。

Description

与L1CAM(CD171)结合的结合分子，特别是抗体
本发明涉及与L1结合的结合分子、编码所述结合分子的核酸、其用途以及包含所述结合分子的药物组合物，所述结合分子能够结合至被单克隆抗体L1-OV52.24识别的相同的L1表位，和/或所述结合分子与单克隆抗体L1-OV52.24竞争性地与L1结合，其中L1-OV52.24的轻链可变部分包含如SEQ ID No:1所示的序列或其中轻链由SEQ ID No:3编码，以及其中L1-OV52.24的重链可变部分包含如SEQ ID No:2所示的序列或其中重链由SEQ IDNo:4编码。
单克隆抗体(mAb)已成为癌症治疗的新的重要支柱[1]。在过去二十年中，分子生物学提供了制备用于治疗主要恶性疾病的嵌合、人源化或全人抗体的方法[2]。迄今为止，多种抗体和抗体缀合物已批准作为癌症疗法在欧洲和美国上市销售[3,4]。其包括未经修饰的抗体、抗体药物缀合物、以及放射性核素的缀合物和双特异性抗体[5]。然而，众所周知针对给定癌症抗原的mAb在其靶向癌细胞的能力方面可能有所不同。
在最近的工作中，我们发现了L1CAM(也称为L1)可能是人类癌症的优异靶分子。L1CAM在多种人类癌症中过表达，带来癌症预后不良，以及增加细胞的运动、侵袭和转移。来自异种移植[6]和人L1CAM转基因小鼠[7]模型的结果表明，L1CAM mAb L1-9.3(也称为mAb9.3)可能会成为一种有前景的癌症治疗工具。这种mAb与L1CAM分子的1.Ig-样结构域结合并且具有良好的ADCC功能[6]。最近的结果表明这种mAb的IgG2a型非常适于激活免疫系统，并募集免疫效应细胞，导致癌细胞的消除[6,7]。因此，有充分的证据表明，这种mAb特别适于ADCC依赖性效应机制，其代表mAb依赖性肿瘤疗法的一种重要手段。
WO 2008/151819[12]公开了与L1的第一Ig结构域内的表位结合的抗-L1抗体9.3。
抗体-药物缀合物方面的最新进展需要具有迅速内化特征的mAb。众所周知，L1CAM特异性抗体的结合将导致L1CAM内化，随后导致靶分子的再循环或降解[8]。L1CAM分子的内化特征与多种其他细胞表面分子具有共同之处。事实上，已知L1CAM的内化是L1CAM介导的细胞粘附的信号转导和调控所需的[9-11]。
已在多个出版物中报道了抗体诱导的L1CAM内化(大多使用多克隆抗体)，但是还没有人使用mAb进行过系统研究。因此，目前尚不知晓，L1CAM分子上不同表位的参与是否将导致不同的内化速率。我们现已生成了一种与FNIII-4-5结合的L1CAM特异性mAb，并将其称为mAb L1-OV52.24(或OV52.24)。我们惊奇地发现这种mAb与此前表征的mAb L1-9.3相比，具有更好的内化速率。我们进一步惊奇地发现，mAb L1-OV52.24分别与抗-L1CAM单克隆抗体5G3和UJ127.11相比，具有更好的内化速率。L1-OV52.24这些独特的性质将使药物向癌细胞的递送得以改善和加速。
尽管本发明抗体L1-OV52.24的一些特征已经部分地有所描述(参见[6])，但是本发明抗体的抗体本身或互补性决定区(CDR)的序列从未公开或向公众开放。
许多治疗活性剂仅在细胞内有效。这样如果此类治疗活性剂不能以非修饰形式进入细胞，就会带来问题。因此，需要例如单克隆抗体或其抗原结合片段这样的结合剂，其可有效内化进入肿瘤细胞，并可因此将与结合剂连接的药剂靶向至肿瘤细胞。
如实施例中所示，通过对分别与L1-OV52.24孵育40、60、70或90分钟的哺乳动物细胞进行显微镜分析和成像流式细胞术测定，发现单克隆抗体L1-OV52.24令人惊奇地显示出迅速有效地内化进入携带L1的此类细胞。
因此，此类单克隆抗体或其他结合分子(如与L1结合的，以及与L1上L1-OV52.24所识别的同一表位结合的抗体)在生物技术研究、诊断或治疗领域具有令人惊奇的优势。特别地，可以将活性剂连接至本发明的结合分子，其通过内化摄取进入细胞。然后，此类活性剂可以在细胞内发挥所需的作用，如细胞毒性或细胞增殖抑制作用。
在一个实施方式中，本发明涉及一种与L1结合的结合分子，所述结合分子能够结合至L1上单克隆抗体L1-OV52.24所识别的同一表位，其中L1-OV52.24的轻链可变部分包含优选地具有如SEQ ID No:1所示的序列，或其中轻链由SEQ ID No:3编码，以及其中L1-OV52.24的重链可变部分包含优选地具有如SEQ ID No:2所示的序列，或其中重链由SEQ IDNo:4编码。
SEQ ID No:1涉及VJ结构域，即L1-OV52.24轻链的可变部分。轻链的恒定结构域是本领域公知的并且其鼠源性cDNA序列如下所示。
SEQ ID No:2涉及VDJ结构域，即L1-OV52.24重链的可变部分。重链的恒定结构域是本领域公知的并且其鼠源性cDNA序列如下所示。
L1(也称为L1CAM)是一种跨膜蛋白；其是一种200-220kDa的神经元细胞粘附分子(L1蛋白家族成员)，并且参与轴突导向(axon guidance)和细胞迁移，这在对治疗产生抗性的癌症中意义重大。本发明所述的L1优选地理解为哺乳动物L1蛋白，更有选地理解为人或小鼠L1蛋白。人L1蛋白的Genbank条目为NP_000416，小鼠的L1蛋白的Genbank条目为NP_032504。L1CAM也被称为CD171。
表位是被抗体或相关结合分子识别的抗原的一部分。例如，表位是与抗体结合的抗原的特异性片段。表位可以是构象表位或线形表位。构象表位由抗原氨基酸序列的不连续部分组成。这些表位基于抗原的3-D表面特征和形状或三级结构与互补位相互作用。构象表位的比例是未知的。
在实施例中显示了L1-OV52.24结合至并识别L1的纤连蛋白III 4-5结构域中的表位。在现有技术(Wolterink等，Cancer Res.(2010),70:2504-2515)中和实施例中描述了确定被结合分子结合和识别的表位的方法。如在实施例中所示，优选地通过构建一系列携带不同Ig结构域的L1-Fc蛋白确定被识别的表位。为了根据该实施例进行精细定位，可以使用重组的V5标记的L1片段，如Gouveia等(Protein Expr.Purif.(2007)52:182-193)中所述的范例。可以在用于表位定位的ELISA或Western印迹分析中使用重组蛋白。mAbs L1-OV52.24与L1的4-5FNIII结构域反应。在通常情况下，用于确定给定抗体的表位的方法是本领域公知的，并且包括制备目标给定区的合成线性肽，以及随后测试抗体是否与所述肽结合(参见Epitope Mapping,A practical approach,Oxford University Press 2001，编辑：OlwynWestwood和Frank Hay)。或者，可以制备覆盖目标区的不同的重组蛋白并测试其与抗体的结合(Oleszewski,M.,Gutwein,P.,von der Lieth,W.,Rauch,U.,Altevogt,P.Characterization of the L1-neurocan binding site.Implications for L1-L1homophilic binding.J.Biol.Chem.275:34478-34485(2000))。
在进一步的实施方式中，本发明涉及一种结合分子，所述结合分子与单克隆抗体L1-OV52.24竞争性地与L1的结合，其中L1-OV52.24的轻链可变部分优选地包含具有如SEQID No:1所示的序列，或其中轻链由SEQ ID No:3编码，以及其中L1-OV52.24的重链优选地包含具有SEQ ID No:2所示的序列，或其中重链由SEQ ID No:4编码。
可以通过本领域技术人员公知的实验确定竞争，如竞争结合实验。
L1-OV52.24的轻链(VJ结构域，无恒定结构域；即可变部分)蛋白序列如下所示：
根据Kabat确定的L1-OV52.24的轻链(VJ结构域)CDR序列如下所示：
CDR-L1(或LCDR1)：KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)
CDR-L2(或LCDR2)：STSYRYS(SEQ ID No:6)
CDR-L3(或LCDR3)：QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)
L1-OV52.24的重链(VDJ结构域，无恒定结构域；即可变部分)蛋白序列如下所示：
根据Kabat确定的CDR序列以下划线显示。
根据Kabat确定的L1-OV52.24的重链(VDJ结构域)CDR序列如下所示：
CDR-H1(或HCDR1)：FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)
CDR-H2(或HCDR2)：WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No:9)
CDR-H3(或HCDR3)：WNPLAF(SEQ ID No:10)
L1-OV52.24单克隆抗体的免疫球蛋白基因的cDNA序列如下所示：
编码：5’UTR(部分，即只有已测序部分)，前导序列，IGKV/IGKJ或IGHV/IGHD/IGHJ，IGKC或IGHC
重链
CTGCCtCATGAATATGcAAACATGAGtCTGTGATTATAAATACAgagATATCCAtACCAAACAACtTATGAgCACTGTTTTCTCTACAGTCACTGAATCTCAAgGTCCTTACAATGcAATGCAGCTGGGTCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGT TACAGGGGTCAATTCAGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAAGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCAGTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTAAAACAGTTTTTGACCCGAAGTTCCGGGGCAAGGCCAGTATATCAGCGGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGATGGAACCCCCTTGCCTTCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGGAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCCCTCGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGAACACGAATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA(SEQ ID No:4)
轻链
TTTGATGACTGCTTTGCATAGATCCCTAGAGGCCAGCCCAGCTGCCCATGATTTATAAACCAGGTCTTTGCAGTGAGATCTGAAATACATCAGATCAGCATGGGCATCAAGATGGAGTCACAGACTCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGT TGTCTGGTGTTGATGGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTGGCCTGGTATCAACAGAAACCAGGTCACTCTCCTAAAGCACTGATTTACTCGACATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCCGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTACTTCTGTCAGCAATATAACACCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG(SEQ ID No:3)
在一个优选的实施方式中，结合分子是抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
将结合分子理解为多肽，所述多肽显示出与指定靶点特异性结合。本发明中的靶点是蛋白L1。因此本发明的结合分子与L1特异性结合。优选地，结合分子是包含免疫球蛋白的分子，即包含至少一个Ig结构域或抗-L1抗体。
将“特异性结合”理解为通过例如Western印迹分析或ELISA检测，结合分子与L1的结合比与对照蛋白如白蛋白的结合强至少50倍，优选地至少100倍。
如在本申请中所使用的，术语“抗-L1抗体”指与天然存在的抗体具有结构相似性并且能够与L1结合的任意多肽，其中结合特异性由多肽的CDR决定。因此，“抗-L1抗体”旨在指与L1结合的来源于免疫球蛋白的结构。将抗原结合片段理解为包含全长抗体中的至少一个抗原结合片段的多肽。抗原结合片段至少由重链的可变结构域和轻链的可变结构域组成，以两个结构域在一起能够与特定抗原结合的方式排布。
单克隆抗体是相同的单特异性抗体，因为其由均为单一亲代细胞克隆的一种类型的免疫细胞产生。“单克隆抗体”和单克隆抗体的生产属于现有技术。在通常情况下，单克隆抗体能够例如根据Winter&Milstein(Winter,G.&Milstein,C.(1991)Nature,349,293-299)的公知方法制备。可以通过用目标多肽筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)鉴定和分离针对本发明多肽的单克隆抗体，代替制备分泌单克隆抗体的杂交瘤。用于产生和筛选噬菌体展示文库的试剂盒是市售的(例如Pharmacia RecombinantPhage Antibody System，目录号27-9400-01；以及Stratagene SurfZAP Phage DisplayKit，目录号240612)。此外，特别适于在产生和筛选抗体展示文库中使用的方法和试剂的实例可以参见例如美国专利号5,223,409；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；WO 90/02809；Fuchs等，1991,Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等，1992,Hum.Antibod.Hybridomas 3:81-85；Huse等，1989,Science 246:1275-1281；Griffiths等，1993,EMBO J.12:725-734。
“全长”或“完全”抗体指包含通过二硫键彼此连接的两条重链(H)和两条轻链(L)的蛋白，其包含(1)就重链而言，可变区和重链恒定区，所述重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3；以及(2)就轻链而言，轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区包含1个结构域CL。关于术语“完整抗体”，是指具有天然存在抗体的典型总体结构域结构(即包含具有3个或4个恒定结构域的重链和具有1个恒定结构域的轻链以及相应的可变结构域)的任何抗体，即使每个结构域可以包含进一步的修饰，如突变、缺失或插入，其不改变总体结构域结构。例如，mAb L1-OV52.24是全长抗体。
单克隆抗体的“抗原结合片段”是单克隆抗体的片段，其显示出与作为该片段来源的完整单克隆抗体基本相同的功能和特异性。使用木瓜蛋白酶进行限制性蛋白水解消化将Ig原型切割为3个片段。分别含有一条完整的L链和约半条H链的两个相同的氨基末端片段是抗原结合片段(Fab)。第三个片段在尺寸上相似，但含有具有链间二硫键的两条重链羧基末端的半段，为可结晶片段(Fc)。Fc含有碳水化合物、补体结合和FcR结合位点。限制性胃蛋白酶消化产生含有两个Fab片段的单一F(ab')2片段以及包括H-H链间二硫键的铰链区。可以切割F(ab')2的二硫键以获得Fab'。而且，可以将重链和轻链可变区融合在一起形成单链可变片段(scFv)。
由于第一代全尺寸抗体存在一些问题，因而很多第二代抗体仅包含抗体的片段。可变结构域(Fv)是具有由一个VL和一个VH组成的完整抗原结合结构域的最小片段。仅具有结合结构域的此类片段能够由酶促方法或者例如在细菌和真核细胞中表达相关基因片段来产生。可以使用不同方法，例如仅用Fv片段，或用'Fab'-片段，所述'Fab'-片段包含包括Fv和第一恒定结构域的“Y”的上臂之一。通常通过在两条链之间引入导致产生单链Fv(scFv)的多肽连接来稳定这些片段。或者可以使用二硫键连接的Fv(dsFv)片段。片段的结合结构域可以与任意恒定结构域组合以产生全长抗体或者可以与其他蛋白或多肽融合。
重组抗体片段是单链Fv(scFv)片段。在通常情况下，其针对其抗原具有较高亲和性并且能够在多种宿主中表达。这些和其他性质使得scFv片段不仅适用于医药，而且还具有在生物技术方面应用的潜力。如上文所详细描述的，在scFv片段中VH和VL结构域通过亲水性和柔性肽接头连接在一起，由此提高了表达和折叠效率。通常使用约15个氨基酸的接头，其中最经常使用(Gly4Ser)3接头。取决于所用的接头，scFv分子可能易于被蛋白水解降解。随着基因工程技术的发展，事实上这些局限性能够通过专注于对功能和稳定性的改进的研究来克服。一个实例是产生二硫键稳定的(或二硫键连接的)Fv片段，其中VH-VL二聚体通过链间二硫键稳定。在VL与VH结构域之间的界面引入半胱氨酸形成二硫键，其将两个结构域连接在一起。
scFv的解离导致产生单体scFv，可以将其复合成二聚体(二体)、三聚体(三体)或更大的聚集物如TandAb(串联双特异性抗体)和柔性体(Flexibody)。
可以通过用简单的多肽连接将两个scFv(scFv)2结合或通过将两个单体二聚化(二体)，形成具有两个结合结构域的抗体。最简单的设计是具有两个功能性抗原结合结构域的二体，所述两个结构域可以是相同的、相似的(二价二体)或具有针对不同抗原的特异性(双特异性二体)。
另外，已研发出了具有4个重链可变结构域和4个轻链可变结构域的抗体形式。该抗体形式的实例包括四价双特异性抗体(TandAb和柔性体，Affimed Therapeutics AG,德国海德堡)。与双特异性二体相反的是，双特异性TandAb是仅由一种多肽组成的同型二聚体。由于具有两个不同的链，因而二体能够形成三种不同的二聚体，其中仅一种是有功能的。因此，生产和纯化这种均质产品更加简单廉价。而且，在体内TandAb通常显示出更好的结合性质(具有两倍数量的结合位点)和更高的稳定性。柔性体是scFv与二体多聚体基序的组合，结果产生具有高度柔性的多价分子，用于将在细胞表面上彼此之间距离十分远的两个分子连接在一起。如果存在两个以上有功能的抗原结合结构域，且如果其对不同抗原具有特异性，则抗体是多特异性的。
综上所述，特异性免疫球蛋白(特定的公开序列可插入其中或者形成其主要部分)包括但不限于以下结合分子，其形成了本发明的特定实施方式：Fab(具有可变轻链(VL)、可变重链(VH)、恒定轻链(CL)和恒定重链1(CH1)结构域的单价片段)、F(ab')2(包含两个由二硫键桥连接的或在铰链区连接的Fab片段的二价片段)、Fv(VL和VH结构域)、scFv(单链Fv，其中VL和VH通过接头连接，例如肽接头)、双特异性抗体分子(与第二功能性部分连接的抗体分子，所述第二功能性部分具有与抗体不同的结合特异性，其包括但不限于另一种肽或蛋白，如抗体或受体配体，所述抗体分子包含本申请所公开的多肽)、双特异性单链Fv二聚体、二体、三体、四体、微抗体(与CH3连接的scFv)。
某些结合分子或单克隆抗体的抗原结合片段，包括但不限于Fv、scFv、二体分子或结构域抗体(Domantis)，可以通过引入二硫键桥以排列VH和VL结构域来提高稳定性。可以使用常规技术(其具体方法包括化学生产或由杂交的杂交瘤生产)以及其他技术生产双特异性抗体，其他技术包括但不限于BiTETM技术(具有不同特异性的抗原结合区以及肽接头的分子)和knobs-into-holes工程。
因此，单克隆抗体的抗原结合片段或结合分子可以是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、(scFv)2、二价抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、二体、三体、四体或微抗体。
在另一个优选的实施方式中，结合分子是人抗体、嵌合抗体或人源化的抗体。在嵌合抗体中，一个物种免疫球蛋白的至少一个区域通过基因工程与另一个物种免疫球蛋白的另一个区域融合，以降低其免疫源性。例如，可以将鼠VL和VH区与人免疫球蛋白的剩余部分融合。嵌合抗体的一个特定类型是人源化抗体。人源化抗体通过将编码非人抗体CDR的DNA与产生人抗体的DNA合并而产生。然后可以使用所得到的DNA构建体表达和产生抗体，产生的抗体通常不会具有像非人母体抗体或嵌合抗体一样强的免疫源性，因为仅CDR是非人的。而且，抗体可以是人的。
在人体的应用中，优先地使用人或至少为人源化的抗体，例如用于在体内的预防、治疗或诊断。
在本发明的一个优选实施方式中，结合分子(特别是单克隆抗体)包含选自下组的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域、人IgG1恒定结构域、人IgG2恒定结构域、人IgG3恒定结构域、人IgG4恒定结构域、人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。
如上文中关于本发明的结合分子(优选地为单克隆抗体)所详细描述的，天然形成的抗体的每条重链都有两个区：恒定区和可变区。有五种类型的哺乳动物免疫球蛋白重链：γ、δ、α、μ和ε，其分别定义免疫球蛋白IgM、IgD、IgG、IgA和IgE的类型。
人有四个IgG亚类(IgG1、2、3、4)，依次按照其在血清中的丰度命名(IgG1是丰度最高的)。尽管IgG亚类的各Fc区彼此之间约有95％的相似性，但是铰链区的结构相对不同。这一区域位于两条重链的Fab臂(抗原结合片段)和两个羧基末端结构域CH2和CH3之间，决定分子的柔性。上铰链(朝向氨基末端)区段允许Fab臂之间的角度改变(Fab-Fab柔性)以及每个单独Fab的旋转柔性。下铰链区(朝向羧基末端)的柔性直接决定Fab臂相对于Fc区的位置(Fab-Fc柔性)。铰链依赖性的Fab-Fab和Fab-Fc柔性在触发进一步的效应物功能(如补体活化和Fc受体结合)方面，可能很重要。因此，铰链区域的结构使四个IgG类型中的每一个都具有其独特的生物学特性。
铰链区的长度和柔性在IgG亚类之间各不相同。IgG1的铰链区包含氨基酸216-231，并且由于其是自由柔性的，因此Fab片段能够围绕其对称轴旋转并且在以两个重链间二硫键中的第一个为球心的球体内移动。IgG2的铰链短于IgG1，其具有12个氨基酸残基和4个二硫键。IgG2铰链区缺乏甘氨酸残基，相对较短并且含有通过额外的重链间二硫键稳定的刚性聚脯氨酸双螺旋。这些性质限制了IgG2分子的柔性。IgG3与其他亚类不同，其具有独特的延伸的铰链区(长度约为IgG1铰链的4倍)，其中含有62个氨基酸(包括21个脯氨酸和11个半胱氨酸)，形成非柔性的聚脯氨酸双螺旋。在IgG3中，Fab片段相对远离Fc片段，使分子具有更高的柔性。在IgG3中延长的铰链也使其与其他亚类相比具有更高的分子量。IgG4的铰链区短于IgG1并且其柔性介于IgG1和IgG2之间。
因此，在又一个进一步优选的实施方式中，结合分子选自下组：单链抗体，优选选自scFv和scFv的多聚体，如二体、三体或四体；抗体片段，优选为Fab、TandAb(串联双特异性抗体)、柔性体(flexibody)和双特异性抗体。
在又一个进一步优选的实施方式中，结合分子是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或者其抗原结合片段。
从实施例可以看出，抗体L1-OV52.24的表位在L1的纤连蛋白结构域III 4-5中。因此，本发明结合分子(特别是单克隆抗体或其抗原结合片段)的表位也优选在L1的纤连蛋白结构域III 4-5中。
因此，在一个优选的实施方式中，表位在L1的纤连蛋白结构域III 4-5(FN III 4-5)中。
L1-OV52.24具有下述CDR序列：KASQNVGTNVA(LCDR1；SEQ ID No:5)、STSYRYS(LCDR2；SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(LCDR3；SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(HCDR1；SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(HCDR2；SEQ ID No:9)和WNPLAF(HCDR3；SEQ ID No:10)。
上述序列显示了根据Kabat法确定的单克隆抗体L1-OV52.24的CDR，该方法通常是本领域公知的。
因此，在一个优选的实施方式中，结合分子是抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其中抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段的互补性决定区(CDR)中，至少有一个：
a)具有选自下述序列中的一个序列：KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)或者
b)具有与a)中提及的序列相比至少有一个保守性氨基酸替换的序列。
此类本发明的单克隆抗体或其抗体结合片段可以例如通过CDR移植或重组产生抗体来产生。此类方法是本领域公知的(参见例如Queen，美国专利号5,585,089和Winter，U.S:5,225,539，Cabilly U.S.4,816,567)。
也可以改变CDR的序列，优选通过导致保守性氨基酸替换的替换。
在通常情况下，可通过操纵导致在FR以及CDR区中的改变，并且包括残基的替换、缺失和插入。所述改变可以通过随机或定向诱变诱导。如前所述的抗体噬菌体展示系统可以用于选择具有所需的和/或改进的性质的突变。
在一个优选的实施方式中，本发明的结合分子的特征为结合分子是抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，并且其包含互补性决定区(CDR)QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)和WNPLAF(SEQ ID No:10)，其中任选地存在一个或多个保守性氨基酸替换。
SEQ ID No:7表示L1-OV52.24的LCDR3序列和SEQ ID No:10表示L1-OV52.24的HCDR3序列。LCDR3和HCDR3已知对于抗体的结合性质很重要。
在一个更优选的实施方式中，本发明的结合分子的特征为结合分子是抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，并且其中抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段包含互补性决定区(CDR)：KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)，其中任选地存在一个或多个保守性氨基酸替换。
在一个优选的实施方式中，不存在保守性氨基酸替换。
在一个更为优选的实施方式中，本发明的结合分子的特征为结合分子是抗-L1单克隆抗体或其抗原结合部分，并且其中所述抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段包含互补性决定区(CDR)：KASQNVGTNVA(LCDR1；SEQ ID No:5)、STSYRYS(LCDR2；SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(LCDR3；SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(HCDR1；SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(HCDR2；SEQ ID No:9)和WNPLAF(HCDR3；SEQ ID No:10)，其中任选地存在一个或多个保守性氨基酸替换。
在一个优选的实施方式中，不存在保守性氨基酸替换。
在进一步优选的实施方式中，抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段是IgG1抗体或其抗原结合片段。
在另一个优选的实施方式中，本发明的结合分子包含：
a)选自下述的序列中的至少一个序列：KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)，或
b)包含与a)中提及的序列相比具有至少一个保守性氨基酸替换的序列。
在进一步优选的实施方式中，本发明的结合分子包含序列QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)和WNPLAF(SEQ ID No:10)，其中任选地存在一个或多个保守性氨基酸替换。
在一个更为优选的实施方式中，本发明的结合分子包含序列KASQNVGTNVA(SEQ IDNo:5)、STSYRYS(SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)，其中任选地存在一个或多个保守性氨基酸替换。
在一个优选的实施方式中，不存在保守性氨基酸替换。
在一个优选的实施方式中，本发明的结合分子是抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗-L1单克隆抗体包含互补性决定区(CDR)：KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)。
在一个优选的实施方式中，本发明的结合分子是抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗-L1单克隆抗体包含互补性决定区(CDR)：KASQNVGTNVA(LCDR1；SEQ ID No:5)、STSYRYS(LCDR2；SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(LCDR3；SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(HCDR1；SEQID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(HCDR2；SEQ ID No:9)和WNPLAF(HCDR3；SEQ ID No:10)。
优选地本发明的结合分子显示出与L1具有较强的亲和性。发现L1-OV52.24显示出针对L1的亲和性KD(M)＝2,41*10-9。
与L1的亲和性可以采用本领域公知的方法确定，例如通过表面等离子体共振。使用配有CM5传感器芯片的BIAcore 3000对L1-OV52.24进行结合分析。简言之，使用EDC/NHS活化BIAcore CM5芯片并将不同水平的L1-Fc捕获于活化的表面上。使用乙醇胺/HCl封闭剩余的活性位点。将L1-OV52.24结合至L1-Fc表面并且允许其随着时间的推移解离。对在每个密度表面上的每次注射的结合和解离相进行动力学分析。
因此，在又一个进一步优选的实施方式中，本发明的结合分子(优选单克隆抗体或其抗原结合片段)以至少10-9(优选地至少10-10或10-11)的亲和性(KD)与L1结合。
令人惊奇的发现，如实施例和图中所示，L1-OV52.24在孵育40、60、70或90分钟后有效地内化进入SKOV3ip细胞，而相比较的抗-L1单克隆抗体9.3仅在很小程度上被内化。可以使用与适宜诊断化合物(如荧光化合物)连接的结合分子确定内化情况。在实施例中，使用Alexa488作为荧光染料。如在实施例中所述，可以通过显微镜分析和计数或者通过成像流式细胞术对内化情况进行定量。在这两种方法中都发现，在每个检测时间点L1-OV52.24的内化效率是9.3抗体的至少4倍。而且，令人惊奇的发现，在检测时间点60’和90’L1-OV52.24的内化比市售抗-L1CAM单克隆抗体5G3和UJ127.11更有效(图6)。在实施例中确定的L1-OV52.24令人惊奇的优异内化性质汇总于图7中。令人惊奇的发现，在90’时L1-OV52.24的内化显著高于现有技术中抗-L1CAM单克隆抗体9.3、5G3和UJ127.11中的任意一种的内化，其p-值均≤0.01。因此，L1-OV52.24或其抗原结合片段，或与L1-OV52.24识别相同表位的结合分子，特别适于递送治疗活性剂(药物递送)或递送诊断化合物(例如用于成像目的)。
在又一个进一步优选的实施方式中，本发明的结合分子被表达L1的哺乳动物细胞内化，优选地，其中所述细胞是表达L1的哺乳动物肿瘤细胞，更优选地是SKOV3ip细胞。
在一个优选的实施方式中，通过显微镜分析和定量或通过成像流式细胞术确定被表达L1的哺乳动物细胞的内化，优选地其中所述细胞是SKOV3ip细胞。该方法优选地根据实施例中的描述进行。在进一步优选的实施方式中，孵育40、60、70或90分钟后，内化是WO2008/151819中所述的单克隆抗体9.3内化的至少2倍、优选地至少4倍、更优选地至少7倍、最优选地至少10倍。在又一个进一步优选的实施方式中，孵育60或90分钟后，内化是单克隆抗体5G3内化的至少2倍、优选地至少4倍。在又一个进一步优选的实施方式中，孵育60或90分钟后，内化是单克隆抗体UJ127.11内化的至少2倍、优选地至少4倍。
在一个更为优选的实施方式中，本发明的结合分子是单克隆抗体L1-OV52.24或其抗原结合片段，其中L1-OV52.24的轻链可变部分包含优选地具有如SEQ ID No:1所示的序列，或其中轻链由SEQ ID No:3编码，且其中L1-OV52.24的重链可变部分包含优选地具有如SEQ ID No:2所示的序列或其中重链由SEQ ID No:3编码。
在一个优选的实施方式中，L1-OV52.24的轻链可变部分包含优选地具有如SEQ IDNo:1所示的序列，且L1-OV52.24的重链可变部分包含优选地具有如SEQ ID No:2所示的序列。
序列SEQ ID No:1和2涉及VJ结构域；即分别为如上所述的L1-OV52.24的轻链可变部分和VDJ结构域；L1-OV52.24的重链可变部分。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及单克隆抗体L1-OV52.24或其抗原结合片段。单克隆抗体L1-OV52.24通过其重链和轻链各可变部分的序列(分别为SEQ ID No:2和SEQID No:1)和/或编码重链和轻链的cDNA(分别为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4)在此公开。
在一个特别优选的实施方式中，本发明的结合分子与治疗活性物质连接，使治疗活性物质内化。
本发明所述的治疗活性物质应理解为在动物(优选为哺乳动物，更优选为人)中具有治疗或预防作用的化合物。
在一个更优选的实施方式中，所述治疗活性物质在动物中具有治疗或预防作用，，可用于治疗或预防肿瘤疾病和/或与L1表达相关的疾病。
在一个优选的实施方式中，所述治疗活性物质是可用于化疗的化合物，即化疗化合物。在一个优选的实施方式中，所述治疗活性物质是细胞毒性或细胞增殖抑制化合物。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及与治疗活性剂连接的本发明的结合分子，所述治疗活性剂优选
化疗化合物，优选地选自烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢药和天然来源的衍生物，
细胞毒性化合物，
细胞增殖抑制化合物，
细胞因子，纳米颗粒，或
放射性核素。
适宜的细胞因子为例如TNFα、IL-2和IL-12。
适宜的化疗化合物是本领域公知的。这些化合物分为几个不同的类别，包括例如烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢药和天然来源的衍生物。
可用于本发明的烷化剂的实例包括白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺(即细胞毒素)、达卡巴嗪、异环磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法仑、甲基苄肼、链脲菌素和噻替派。
抗肿瘤抗生素的实例包括博莱霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、丝裂霉素(例如丝裂霉素C)、米托蒽醌、喷司他丁和普卡霉素。
抗代谢药的实例包括氟脱氧尿苷、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶(例如5-氟尿嘧啶(5FU))、吉西他滨、羟基脲、巯嘌呤、甲氨蝶呤和硫鸟嘌呤。
天然来源的衍生物的实例包括多西他赛、依托泊苷、伊立替康、紫杉烷(例如紫杉醇)、替尼泊苷、托泊替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、泼尼松和他莫昔芬。
可用于本发明的化疗剂的其他实例包括天冬酰胺酶和米托坦。
而且，还可以使用C2神经酰胺。
本发明所述的“连接”理解为包括共价和非共价连接，优选共价连接。在共价连接的实施方式中，本发明的结合分子可以直接或通过适宜的接头分子连接至治疗活性剂或诊断化合物。在本发明更优选的实施方式中，结合分子通过接头连接至治疗活性剂或诊断化合物。适宜的接头是本领域公知的。
因此，在一个优选的实施方式中，结合分子是可通过接头连接至治疗活性物质和/或诊断化合物。
适宜的放射性核素包括67/64Cu、131I、124I或90Y。此类放射性核素可以通过形成配合物的部分连接，或者在该放射性核素为碘的情况下，直接共价连接至本发明的结合分子。形成配合物的部分优选地(可通过接头)共价连接至结合分子。
此类抗体缀合物是本领域公知的(Wu AM,Senter PD.Arming antibodies:prospects and challenges for immunoconjugates.Nature Biotechnol.23:1137-1146,2005，Pastan I,Hassan R,FitzGerald DJ,Kreitman RJ.Immunotoxin treatment ofcancer.Annu.Rev.Med.58:221-237,2007，WO 90/12592、WO 2007/030642、WO 2004/067038、WO 2004/003183、US 2005/0074426、WO 94/04189)。
在一个更优选的实施方式中，治疗活性物质是选自下述化疗化合物或细胞毒性化合物或细胞增殖抑制化合物：DNA损伤剂，特别是放线菌素D、丝裂霉素C、顺铂、多柔比星、依托泊苷、维拉帕米、鬼臼毒素、5-FU、天然来源的衍生物和紫杉烷，优选紫杉醇和卡铂。
而且，将本发明的结合分子连接至诊断化合物可能是有利的。
诊断化合物是能够通过直接或间接检测产生信号的化合物。在一个优选的实施方式中，化合物适于向动物施用，如哺乳动物，更优选地如人。在这个实施方式中，所连接的结合分子可适于体外和体内使用。在另一个优选的实施方式中，化合物不适于向动物施用，如哺乳动物，更优选地如人。在这个实施方式中，所连接的结合分子可能适于体外使用。因此，可以直接或间接检测诊断化合物。对于直接检测而言，适于在本发明中使用的诊断化合物可以选自任意公知的可检测标记物基团，如发色团、荧光基团、化学发光基团(例如吖啶酯或二氧杂环丁烷)、电化学发光化合物、催化剂、酶、酶底物、染料、荧光染料(例如荧光素、香豆素、罗丹明、恶嗪、试卤灵、花青及其衍生物)、胶态金属和非金属颗粒以及有机聚合物胶乳颗粒。诊断化合物的其他实例是发光金属配合物，如钌或铕的配合物和放射性同位素。
间接检测系统包括例如生物亲和(bioaffine)结合对的配偶体。适宜的结合对的实例是半抗原或抗原/抗体、生物素或生物素类似物如氨基生物素、亚氨基生物素或脱硫生物素/抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素、糖/凝集素、核酸或核酸类似物/互补的核酸以及受体/配体，例如类固醇激素受体/类固醇激素。
因此，在一个进一步的实施方式中，本发明涉及连接至诊断化合物的本发明的结合分子，所述诊断化合物优选地选自放射性核素、化学发光化合物、荧光化合物、染料或酶。
如在实施例中所示，L1-OV52.24单克隆抗体成功连接至荧光化合物或荧光染料，即Alexa染料(Alexa488)。
在另一个实施方式中，本发明涉及产生本发明的抗-L1单克隆抗体的杂交瘤细胞。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种核酸，所述核酸
(i)编码本发明所述的结合分子，和/或
(ii)编码本发明所述的结合分子的至少一条链，和/或
(iii)包含SEQ ID No:3所示的和/或SEQ ID No:4所示的序列，和/或
(iv)包含编码下述序列中的至少一个的序列：KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFR(SEQ ID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)。
在一个更优选的实施方式中，本发明的核酸是载体的一部分。此类载体是优选地用于在细菌(如大肠杆菌)、在酵母细胞、在昆虫细胞或哺乳动物细胞中表达的载体。优选地，本发明的核酸由载体中适宜的调控序列(如启动子或增强子)控制，从而实现在宿主细胞中的表达。载体优选地包含能够在宿主细胞中复制的序列。
优选地，连接至诊断化合物的结合分子可以在体外用于诊断目的并且从而涉及用于生物技术研究的重要工具。例如，在通常情况下可以使用本发明的结合分子对患者的组织活检或身体样品进行分析。因此，在一个进一步的实施方式中，本发明涉及本发明的结合分子作为体外诊断试剂，或作为体外生物技术试剂的用途。在一个更优选的实施方式中，本发明涉及连接至诊断化合物的本发明的结合分子作为体外诊断试剂或作为体外生物技术试剂的用途。在另一个优选的实施方式中，本发明涉及连接至治疗活性物质的本发明的结合分子作为体外生物技术试剂的用途。
在又一个进一步的实施方式中，本发明涉及本发明的结合分子用作药物或诊断试剂的用途。
在一个特别优选的实施方式中，用作药物的结合分子是连接至如上文所述的治疗活性物质的结合分子。结合分子递送治疗活性物质进入肿瘤细胞，在肿瘤细胞中与治疗活性物质连接的结合分子能够发挥其治疗作用。
在一个优选的实施方式中，治疗活性物质以治疗有效量施用。
在进一步优选的实施方式中，用于诊断的结合分子是连接至诊断化合物的结合分子。因此，可以对患者进行成像，从而能够使用本发明的结合分子进行诊断(如预后或监测治疗)。因此，连接至诊断化合物的本发明的结合分子优选地是伴随诊断剂，用于本发明中连接至治疗活性物质的结合分子。
本发明的结合分子优选地包括在药物组合物中。
化合物可能既为诊断化合物又为治疗活性物质。一个实例是某些放射性核素，例如131I，其可能既适用于体内成像，也适用于肿瘤治疗。
在通常情况下，本发明的药物组合物包含治疗有效量的本发明的结合分子，以及任选地一种或多种药学上可接受的运载体。在一个特定的实施方式中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准的，或在美国药典或其他普遍认可的药典中列为用于动物，特别是人的。术语“运载体”指用来施用治疗剂的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。此类药物运载体可以是无菌液体，如水和油，包括源于石油、动物、植物或合成来源的，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。口服施用药物组合物时，水是优选的运载体。静脉内施用药物组合物时，盐水和葡萄糖水溶液是优选的运载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油水溶液优选地用作可注射溶液的液体运载体。适宜的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，所述组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂，或者pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、混悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等形式。可以使用传统粘合剂和运载体如甘油三酯将组合物制成栓剂。口服制剂可以包括标准运载体如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中描述了适宜药物运载体的实例。此类组合物将含有治疗有效量的治疗剂(优选为纯化形式)以及适量的运载体以提供向患者施用的适宜形式。制剂应适于施用方式。
在一个优选的实施方式中，根据常规程序将组合物制成适于向人类静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是溶于无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)，以缓解注射部位的疼痛。在通常情况下，各成分单独提供，或在单位剂型中混合在一起提供，例如以在密封容器如显示活性剂的量的安瓿或小袋中以冻干粉末或无水浓缩物形式提供。通过输注施用组合物时，可以将其分配于含有药用级无菌水或盐水的输液瓶中。通过注射施用组合物时，可以提供用于注射的装有无菌水或盐水的安瓿，使各成分可在施用前混合。
可以将本发明的治疗剂制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括由游离羧基形成的盐，如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，由游离氨基形成的盐，如来源于异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐，以及来源于钠、钾、铵、钙和氢氧化铁等的盐。
本发明的治疗剂对特定病症或症状的有效治疗量，将取决于该病症或症状的性质，并且可以由标准临床技术确定。此外，可选用体外测定以辅助鉴定最佳剂量范围。制剂中采用的精确剂量还将取决于施用途径、疾病或病症的严重程度，并且应根据执业医师的判断和每个患者的情况决定。然而，静脉内施用的适宜剂量范围通常为约20-500毫克活性化合物每千克体重。鼻内施用的适宜剂量范围通常为约0.01pg/kg体重至1mg/kg体重。可以从来源于体外或动物模型检测系统的剂量-反应曲线，外推有效剂量。在通常情况下，栓剂可以含有0.5％至10％重量的活性成分；口服剂型优选地含有10％至95％的活性成分。
多种公知的递送系统可以用于施用本发明的治疗剂，例如在脂质体、微粒和微囊中包封；使用能够表达治疗剂的重组细胞，使用受体介导的内吞作用(例如Wu和Wu,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)；构建作为逆转录病毒或其他载体一部分的治疗性核酸等。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。可以通过任何方便的途径施用化合物，例如通过输注、通过快速推注、通过上皮或皮肤粘膜衬里(例如口、直肠和肠粘膜)吸收，以及可以与其他生物活性试剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。此外，可能理想的是，通过任意适宜的途径将本发明的药物组合物引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；可以通过例如与储库(如Ommaya储库)连接的脑室内导管，来辅助脑室内注射。还可以使用肺部施用，例如通过使用吸入器或喷雾器，以及具有雾化剂的制剂。
在一个特定的实施方式中，向需要治疗的区域局部施用本发明的药物组合物可能是理想的。这可以通过例如但不限于在手术期间局部输注、局部应用(例如与手术后的伤口敷料结合)、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物实现，所述植入物材料为多孔的、无孔的或凝胶状的，包括膜，如硅橡胶膜或纤维。在一个实施方式中，可以在恶性肿瘤或肿瘤或癌前组织位点(或原位点)直接注射施用。
在另一个实施方式中，治疗剂的递送可以在囊泡，特别是脂质体(Langer,1990,Science 249:1527-1533)，更特别地是阳离子脂质体(WO 98/40052)中。
在又一个实施方式中，可以通过控释系统递送治疗剂。在一个实施方式中，可以使用泵(Langer，见前文)。在又一个实施方式中，可以将控释系统置于治疗靶点附近，因而仅需要全身剂量的一部分。
在本发明这个方面的背景下，本发明还包括治疗或预防患者的肿瘤疾病的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的本发明的结合分子，优选单克隆抗体或其抗原结合片段。
在整个发明中，术语“有效量”意为，给定的分子或化合物以足以获得所需的治疗效果的量施用。在整个发明中，如果两种化合物以治疗有效量施用，这包括一种或每种化合物以亚治疗量施用的情况，即每种化合物的量不足以独立提供治疗效果，但是两种化合物联合产生所需的治疗效果。但是，本发明中也包括每种化合物都各自以治疗有效量施用。
根据本发明，术语“治疗肿瘤疾病”既包括在患有肿瘤疾病的患者中杀死肿瘤细胞、减少肿瘤细胞的增殖(例如减少至少30％、至少50％或至少90％)也包括完全抑制肿瘤细胞的增殖。此外，该术语包括预防致瘤性疾病，例如通过杀死可能或倾向于在将来成为肿瘤细胞的细胞，以及预防转移的形成。
根据本发明，本领域技术人员将理解，拟应用的各疗法将取决于例如患者的身体状况或疾病的严重程度，并且因此必须根据具体情况进行调整。
本发明还涉及包含本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段或结合分子的药物组合物。关于所述药物组合物，上述的所有实施方案也都适用。
在又一个进一步的实施方式中，本发明涉及本发明的结合分子(优选单克隆抗体或其抗原结合片段)在治疗或预防肿瘤疾病中的用途，优选地其中肿瘤疾病是上皮肿瘤疾病和/或选自下组：星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、神经母细胞瘤、鳞状细胞癌、成神经管细胞瘤、肝癌、结肠癌、间皮瘤和表皮样癌。
在又一个进一步的实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含如上文所述的本发明的结合分子和任选地一种或多种药学上可接受的运载体。
在另一个实施方式中，本发明涉及与L1结合的结合分子，其中结合分子是抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段的互补性决定区(CDR)中的至少一个
a)具有选自下组序列中的一个：KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQ IDNo:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ IDNo:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)或者
b)具有与a)中提及的序列相比具有至少一个保守性氨基酸替换的序列。
在另一个实施方式中，本发明涉及与L1结合的结合分子，其特征在于结合分子包含
a)选自下组序列中的一个：KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)或者
b)包含与a)中提及的序列相比具有至少一个保守性氨基酸替换的序列。
本发明的此类单克隆抗体或其抗体结合片段或结合分子可以例如通过CDR移植或抗体的重组产生。此类方法是本领域公知的(参见例如Queen，美国专利号5,585,089和Winter,U.S:5,225,539,Cabilly U.S.4,816,567)。
本申请描述的发明的优选实施方式适用于本发明的所有结合分子和单克隆抗体及其抗原结合片段。
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12.WO 2008/151819
附图
图1：在Skov3ip细胞上检测mAb L1CAM mAb 9.3的细胞摄取。
将Skov3ip细胞与Alexa488缀合的L1CAM mAb L1-9.3孵育不同长度的时间。随后固定样品并使用与Alexa647偶联的山羊抗小鼠二抗检测细胞表面结合的抗体。将0’时间点的细胞在冰上孵育以避免抗体内化。在Amnis ISX成像流式细胞仪上检测样品，收集3000个细胞并使用Amnis IDEAS软件分析。显示了在时间点0分钟(A)、60分钟(B)和90分钟(C)获取的细胞的典型图像。下面一列曲线图显示了对应样品的定量。对时间点0’(D)、60’(E)和90’(F)进行了描述。y轴给出了归一化的频率，x轴显示了Alexa488缀合的L1CAM mAb 9.3相对于细胞的总荧光强度的各细胞内荧光强度。曲线图下面的表格显示了分析中包括的细胞数(计数)和曲线图的平均值(均值)。实验重复三次，显示典型结果。
图2：在Skov3ip细胞上检测抗体L1CAM mAb OV52.24的细胞摄取。
将Skov3ip细胞与Alexa488缀合的L1mAb OV52.24孵育不同长度的时间。随后固定样品并使用与Alexa647偶联的山羊抗小鼠二抗检测细胞表面结合的抗体。将0’时间点的细胞在冰上孵育以避免抗体内化。在Amnis ISX成像流式细胞仪上检测样品，收集3000个细胞并使用Amnis IDEAS软件分析。显示了在时间点0分钟(A)、60分钟(B)和90分钟(C)获取的细胞的典型图像。下面的一列曲线图显示了对应的样品的定量。对时间点0’(D)、60’(E)和90’(F)进行了描述。y轴给出了归一化的频率，x轴显示了Alexa488缀合的L1mAb OV52.24相对于细胞的总荧光强度的各细胞内荧光强度。曲线图下面的表格显示了分析中包括的细胞数(计数)和曲线图的平均值(均值)。实验重复三次，显示典型结果。
图3：在Skov3ip细胞上检测L1CAM mAbs 9.3和OV52.24的细胞摄取。
该图给出了对图1和图2中结果的概述。上方图表和下方图表分别显示了在不同时间点0’、60’和90’分钟针对L1CAM mAb 9.3和L1CAM mAb OV52.24的曲线图。
图4：使用共聚焦激光扫描显微镜在Skov3ip细胞上检测L1CAM mAbs 9.3和OV52.24的细胞摄取。
使用与Alexa488缀合的L1CAM mAbs 9.3或OV52.24孵育Skov3ip细胞70分钟。随后固定样品并使用与Alexa647偶联的山羊抗小鼠二抗检测细胞表面结合的抗体。样品随后在Leica SP5II共聚焦激光扫描显微镜上成像。在相似的z-位置获得Z-切片。针对每种抗体采集n＝30个细胞并进行定量(A)。使用Fiji(ImageJ)对图像进行分析，并绘制显示与Alexa488缀合的L1mAb 9.3和L1-OV52.24相对于细胞的总荧光强度的细胞内荧光强度的柱状图(B)。实验重复三次，显示典型结果。对应的左侧条柱显示了mAb 9.3分别在40min和90min的结果。对应的右侧条柱显示了mAb OV52.24分别在40min和90min的结果。
图5：使用共聚焦激光扫描显微镜确认Skov3ip细胞上对L1CAM mAbs 5G3和UJ127.11的细胞摄取。
使用与Alexa488缀合的L1CAM mAbs 5G3和UJ127.11孵育Skov3ip细胞70分钟。随后固定样品并使用与Alexa647偶联的山羊抗小鼠二抗检测细胞表面结合的抗体。样品随后在Leica SP5II共聚焦激光扫描显微镜上成像。在相似的z-位置获得Z-切片。针对每种抗体采集n＝30个细胞。显示典型结果。
图6：在Skov3ip细胞上检测和比较抗体L1CAM mAbs 9.3、OV52.24、5G3和UJ127.11的细胞摄取。
将Skov3ip细胞与Alexa488缀合的L1mAb孵育不同长度的时间。随后固定样品并使用与Alexa647偶联的山羊抗小鼠二抗检测细胞表面结合的抗体。将0’时间点的细胞在冰上孵育以避免抗体内化。在Amnis ISX成像流式细胞仪上检测样品，收集5000个细胞并使用Amnis IDEAS软件分析。左列、中间和右列的曲线图分别显示了时间点0分钟、60分钟和90分钟。y轴给出了归一化的频率，x轴显示了Alexa488缀合的L1mab相对于细胞的总荧光强度的各细胞内荧光强度。曲线图中给出了各条件下相对细胞内荧光强度的平均值。实验重复三次，显示典型结果。
图7：在Skov3ip细胞上比较L1CAM mAbs 9.3、OV52.24、5G3和UJ127.11的细胞摄取。
该图给出了对图6中典型分析的总结。根据每次实验中各L1CAM mAb的平均相对细胞内强度，对三次不同的独立实验制图。柱状图的值以平均值±S.D表示。为了确定不同L1CAM mAb的内化增加或减少的统计学显著性概率，使用双尾、非配对的Student t检验对三次独立实验进行分析。p值<0.05被认为具有统计学显著性。星号分配如下：*p≤0.05；**p≤0.01；***P≤0.001。
实施例
实施例1
材料和方法
细胞系
人卵巢癌细胞SKOV3ip从美国模式培养物保藏中心(弗吉尼亚马纳萨斯)获得。该细胞系经德国生物材料资源中心(德国布伦瑞克)验证，并且研究者对整个培养过程中的典型形态进行了评估。每周进行检测以确保培养物为支原体阴性。在补充了10％热灭活胎牛血清(FCS)(Biochrom,德国柏林)、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen,德国卡尔斯鲁厄)和1mM丙酮酸钠(Invitrogen)的DMEM培养基(Sigma-Aldrich,德国Deisenhoffen)中对细胞进行培养。将所有细胞维持在37℃和5％CO2下的湿润环境中。
单克隆抗体
此前已对针对人L1CAM的mAb L1-9.3进行了描述[6,12]。
L1-OV52.24是使用包含L1胞外域的人L1-Fc蛋白，或使用SKOV3ip细胞免疫接种小鼠产生。
确定了L1-OV52.24单克隆抗体免疫球蛋白基因的cDNA序列并且示于上文(轻链：SEQ ID No:3，重链：SEQ ID No:4)。
另外，分别确定了L1-OV52.24重链和轻链(VDJ或VJ结构域，无恒定结构域)的蛋白序列(SEQ ID No:2和SEQ ID No:1)，并且根据Kabat命名法确定了L1-OV52.24的CDR序列。L1-OV52.24的CDR序列为：KASQNVGTNVA(LCDR1；SEQ ID No:5)、STSYRYS(LCDR2；SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(LCDR3；SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(HCDR1；SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(HCDR2；SEQ ID No:9)和WNPLAF(HCDR3；SEQ ID No:10)。
这两种mAb均是IgG1同种型。
同种型对照mAb由Bio X Cell(新罕布什尔，西黎巴嫩)获得。根据生产厂商的说明书使用标记试剂盒(Invitrogen)将L1CAM mAb与Alexa488缀合。简言之，将100μg抗体与1瓶标记试剂混合，孵育1小时并且随后在柱子上纯化。确定标记程度以确保相似的标记效能。
结合常数
表面等离子体共振(SPR)平衡分析
使用配有CM5传感器芯片的BIAcore 3000进行结合分析。简言之，使用EDC/NHS活化BIAcore CM5芯片并将不同水平的L1-Fc捕获在活化的表面上。使用乙醇胺/HCl封闭剩余的活性位点。将L1-mAb结合至L1-Fc表面并允许其随着时间的推移解离。对在每个密度表面上的每次注射的结合和解离相进行动力学分析。
识别的表位
为了确定表位特异性，我们构建了一系列携带不同Ig结构域的L1-Fc蛋白(如[6]中所述)。为了精细定位，使用了最近描述的重组V5-标记的L1片段(Gouveia RM,MoraisVA,Peixoto C等，Production and purification of functional truncated solubleforms of human recombinant L1cell adhesion glycoprotein from Spodopterafrugiperda Sf9cells.Protein Expr Purif 2007；52:182–93)。在ELISA或在Western印迹分析中使用重组蛋白用于表位定位。抗体摄取测定
对于成像流式细胞术(Imagestream)
使用胰酶/EDTA分离Skov3ip细胞，在培养基中重悬，计数并分成相等细胞数的等分样品(200 000个细胞)。在持续存在标记抗体(10μg/mL)的条件下，将细胞在37℃下孵育不同时间点，或将细胞在冰上孵育时间点0分钟。在各时间点，细胞以800x g沉淀，使用冰冷的PBS洗涤1次并使用4％PFA(Thermo Fischer)在冰上固定15min。固定的细胞用PBS洗涤两次，并使用25μg/mL山羊抗小鼠Alexa-647二抗(Invitrogen,德国卡尔斯鲁厄)孵育20分钟并且随后使用PBS洗涤两次。
对于共聚焦激光扫描显微镜法
在8孔μ-载玻片(Ibidi,德国慕尼黑)上接种25 000个细胞并生长24h。在持续存在标记抗体(10μg/mL)的条件下，将细胞在37℃下在不同时间点孵育。在各时间点，细胞用冰冷的PBS洗涤，并用4％PFA(Thermo Fischer)在冰上固定15min。固定的细胞用PBS洗涤两次，并使用25μg/mL山羊抗小鼠Alexa-647二抗(Invitrogen,德国卡尔斯鲁厄)孵育20分钟并且随后使用PBS洗涤两次。
成像流式细胞术和分析
在Amnis ImageStreamX(ISX)(Amnis公司，美国西雅图)上检测样品，488nm激光设为100％，561nm激光设为80％，使用60x物镜并将扩展景深(EDF)选项激活。记录通道2和5以及通道1中的亮场图像，每个样品收集4000个细胞。在固定之后、用抗小鼠Alexa647抗体复染之前，取等分细胞样品作为各抗体针对Alexa488偶联L1CAM mAb的补偿对照。使用与缀合的抗体相同浓度的相应的未缀合L1mAb，在冰上对细胞进行染色，并且用相同的抗小鼠Alexa647二抗进行复染，作为用抗小鼠Alexa647抗体复染的补偿对照。在ISX上用相应的补偿设置获取补偿对照。
使用IDEAS软件(Amnis公司，美国西雅图)对ISX数据进行分析。打开原始图像文件并使用相应的补偿文件生成补偿矩阵。将所采集的细胞进行门控以获得在焦点的细胞，并且随后使用亮场图像控制的门控以获得单个细胞。使用通道5的图像产生“细胞表面掩膜”，强度下限限制为200，上限保持4095不变以消除背景并优化信号。对于通道2，强度下限设定为150，上限保持4095不变并将其称为“通道2”。这两个设置均来源于L1CAM mAb同种型对照或仅二抗的对照染色。此外，将“细胞表面掩膜”扩大一个像素，以包括通道2上的相邻像素。生成称为“细胞内信号”的另一掩膜，将其定义为“通道2非细胞表面掩膜”。最后，生成称为“相对细胞内强度”的组合特征，其定义如下：“细胞内信号/(强度_MC_Ch02*100)”。绘制相应的直方图并确定平均值。对所有检测的样品应用相同程序。
共聚焦激光扫描显微镜法和分析
在配有HyD检测器的Leica SP5II(Leica微系统，德国韦茨拉尔)共聚焦激光扫描显微镜上检测样品。使用波长为488nm的氩激光激发与Alexa-488缀合的L1mAb，使用波长为633nm的HeNe激光线激发Alexa-647。在相似的z-位置获得Z-切片。针对每种抗体采集n＝30个细胞并进行定量。使用Fiji(ImageJ,NIH,美国Bethesda,)对图像进行分析，其中使用抗小鼠Alexa-647复染细胞表面的信号来分割和鉴定单细胞边界，然后确定细胞内荧光强度和总细胞强度。使用Excel(微软，美国Redmond)将结果绘制成条形图，其显示与Alexa488缀合的mAb L1-9.3和L1-OV52.24相对于细胞的总荧光强度的细胞内荧光强度。
结果
mAbs L1-9.3和L1-OV52-54与L1CAM细胞表面分子的不同细胞表面表位结合。mAb9.3明显与由第一Ig结构域(1.Ig-L1-Fc；[12])组成的融合蛋白反应。通过Western印迹分析，确证了mAb L1-OV52.24识别L1的4-5FNIII结构域。MAb L1-9.3与第一Ig结构域结合，而L1-OV52.24与4-5.FNIII结构域中的表位结合。mAb 9.3与L1的亲和性为KD(M)＝8,5*10-11(见[6])，而mAb L1-OV52.24与L1的亲和性为KD(M)＝2,41*10-9。发现L1-OV52.24在Western印迹分析和FACS分析实验中表现优异，并发现其在免疫组化(IHC)实验中表现良好。
我们使用上述材料和方法部分概述的与Alex-488缀合的mAb，在SKOV3ip细胞中进行内化测定。通过结合了FACS和荧光分析，且能够对数千个细胞进行定量的ImagestreamX分析，对内化进行测定。使用IDEAS软件对数据进行分析。对L1-9.3的分析表明其在时间点0min、60min和90min缓慢内化(图1A-F)，在最终时间点的平均值为7.8％。相比之下，mAbL1-OV52.24的内化迅速得多，并且在最终时间点的平均值达到40％(图2A-F)。在图3中直接对数据进行比较。
为了验证这些结果，使用所附着的细胞进行了类似的分析。在盖玻片上培养SKOV3ip细胞，并使其与Alexa缀合的抗体内化。通过激光扫描显微镜以及对细胞进行目测计数，来完成定量。染色实例如图4中所示并且结果汇总于图4B。这些结果确证了通过Imagestream分析获得的数据，并且显示mAb L1-OV52.24导致内化速率提高接近10倍。该结果是预料不到的并且表明mAb-L1-OV52.24适于递送抗体药物缀合物。
实施例2
材料和方法
细胞系
人卵巢癌细胞SKOV3ip从美国模式培养物保藏中心(弗吉尼亚马纳萨)获得。该细胞系经德国生物材料资源中心(德国布伦瑞克)验证，并且研究者对整个培养过程中的典型形态进行了评估。每周进行检测以确保培养物为支原体阴性。在补充了10％热灭活胎牛血清(FCS)(Biochrom,德国柏林)、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen,德国卡尔斯鲁厄)和1mM丙酮酸钠(Invitrogen)的DMEM培养基(Sigma-Aldrich,德国Deisenhoffen)中对细胞进行培养。将所有细胞保持在37℃和5％CO2下的湿润环境中。
单克隆抗体
此前已对针对人L1CAM的mAb L1-9.3、5G3和UJ127.11进行了描述[6]。
L1-OV52.24是使用包含L1胞外域的人L1-Fc蛋白，或使用SKOV3ip细胞免疫接种小鼠产生。
确定了L1-OV52.24单克隆抗体免疫球蛋白基因的cDNA序列并且示于上文(轻链：SEQ ID No:3和重链：SEQ ID No:4)。
另外，分别确定了L1-OV52.24重链和轻链(VDJ或VJ结构域，无恒定结构域)的蛋白序列(SEQ ID No:2和SEQ ID No:1)，并且根据Kabat命名法确定了L1-OV52.24的CDR序列。L1-OV52.24的CDR序列为：KASQNVGTNVA(LCDR1；SEQ ID No:5)、STSYRYS(LCDR2；SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(LCDR3；SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(HCDR1；SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(HCDR2；SEQ ID No:9)和WNPLAF(HCDR3；SEQ ID No:10)。
mAb L1-9.3、L1-OV52.24和UJ127.11是IgG1同种型。mAb 5G3是IgG2a同种型。相应的同种型对照mAb由Bio X Cell(新罕布什尔，西黎巴嫩)获得。根据生产厂商的说明书使用标记试剂盒(Invitrogen)将L1CAM mAb与Alexa488缀合。简言之，将100μg抗体与1瓶标记试剂混合，孵育1小时并且随后在柱子上纯化。确定标记程度以确保相似的标记效能。与Alexa488缀合的mAb 5G3购自Novus Biologicals(美国利特尔顿)。
抗体摄取测定
对于成像流式细胞术(Imagestream)
使用胰酶/EDTA分离Skov3ip细胞，在培养基中重悬，计数并分成相等细胞数的等分样品(200 000个细胞)。在持续存在标记抗体(10μg/mL)的条件下，将细胞在37℃下孵育不同时间点，或将细胞在冰上孵育时间点0分钟。在各时间点，细胞以800x g沉淀，使用冰冷的PBS洗涤1次并使用4％PFA(Thermo Fischer)在冰上固定15min。固定的细胞用PBS洗涤两次，并使用25μg/mL山羊抗小鼠Alexa-647二抗(Invitrogen,德国卡尔斯鲁厄)孵育20分钟并且随后使用PBS洗涤两次。
对于共聚焦激光扫描显微镜法
在8-孔μ-载玻片(Ibidi，德国慕尼黑)上接种25 000个细胞并生长24h。在持续存在标记抗体(10μg/mL)的条件下，将细胞在37℃下在不同时间点孵育。在各时间点，细胞用冰冷的PBS洗涤，并用4％PFA(Thermo Fischer)在冰上固定15min。固定的细胞用PBS洗涤两次，并使用25μg/mL山羊抗小鼠Alexa-647二抗(Invitrogen,德国卡尔斯鲁厄)孵育20分钟并且随后使用PBS洗涤两次。
成像流式细胞术和分析
在Amnis ImageStreamX(ISX)(Amnis公司，美国西雅图)上检测样品，488nm的激光设为100％，561nm的激光设为80％，使用60x物镜并将扩展景深(EDF)选项激活。记录通道2和5以及通道1中的亮场图像，每个样品收集10.000个细胞。在固定之后、用抗小鼠Alexa647抗体复染之前，取等分细胞样品作为各抗体针对Alexa488偶联L1mAb的补偿对照。在冰上使用浓度与缀合的抗体相同的各未缀合L1mAb分别对细胞进行染色，并且用相同的抗小鼠Alexa647二抗进行复染，作为用抗小鼠Alexa647抗体复染的补偿对照。在ISX上用相当的补偿设置获取补偿对照。使用IDEAS软件(Amnis公司，美国西雅图)对ISX数据进行分析。打开原始图像文件并使用相应的补偿文件生成补偿矩阵。对所采集的细胞进行门控以获得在焦点的细胞，并且随后使用亮场图像控制的门控以获得单个细胞。使用通道5的图像产生“细胞表面掩膜”，将强度下限限制为200，上限保持4095不变以消除背景并优化信号。对于通道2，将强度下限设定为150，上限保持4095不变并将其称为“通道2”。这两个设置均来源于L1mAb同种型对照或仅二抗的对照染色。此外，将“细胞表面掩膜”扩大一个像素，以包括通道2上的相邻像素。生成称为“细胞内信号”的另一掩膜，将其定义为“通道2非细胞表面掩膜”。最后，生成称为“相对细胞内强度”的组合特征，其定义如下：“细胞内信号/(强度_MC_Ch02*100)”。绘制相应的直方图并确定平均值。对所有检测的样品应用相同程序。
共聚焦激光扫描显微镜法
在配有HyD检测器的Leica SP5II(Leica微系统，德国韦茨拉尔)共聚焦激光扫描显微镜上检测样品。使用波长为488nm的氩激光激发与Alexa-488缀合的L1mAb，使用波长为633nm的HeNe激光线激发Alexa-647。在相似的z-位置获得Z-切片。针对每种抗体采集n＝30个细胞。显示典型图像。
统计学
使用Student t-检验确定至少三次独立实验的条件之间具有统计学显著性的增加或减少的概率。进行双尾、非配对的t-检验。以平均值±S.D.表示条形图中的值。p值<0.05被认为具有统计学显著性。以星号表示图中的显著性。星号分配如下：*p≤0.05；**p≤0.01；***p≤0.001。
结果
实施例2的结果如图5至7中所示。我们使用上述材料和方法部分概述的与Alex-488缀合的mAb，在SKOV3ip细胞中进行内化测定。通过结合了FACS和荧光分析，且能够对数千个细胞进行定量的ImagestreamX分析，对内化进行测定。使用IDEAS软件对数据进行分析。分析表明，现有技术的单克隆抗体L1-9.3、5G3和UJ127.11在时间点0min、60min和90min缓慢内化(图6)。而相反的是，本发明的mAb L1-OV52.24内化非常迅速并且在最终时间点的平均值达到41,7％(图6)。数据汇总于图7。令人惊奇地发现，L1-OV52.24在90’时的内化在统计学上高于现有技术中抗-L1单克隆抗体9.3、5G3和UJ127.11中任意一种的内化，其p-值均≤0.01。
为了验证这些结果，使用所附着的细胞进行了类似的分析。在盖玻片上培养SKOV3ip细胞，并使其与Alexa缀合的抗体内化。通过激光扫描显微镜以及对细胞进行目测计数，来完成定量。染色实例如图5中所示。这些结果确证了通过Imagestream分析获得的数据，并且显示与现有技术中直接针对L1CAM的抗体相比，mAb L1-OV52.24导致惊人的高内化速率。该结果是预料不到的并且表明mAb-L1-OV52.24适于递送抗体药物缀合物。

Claims (18)

1.一种与L1结合的结合分子，
(i)所述结合分子能够结合至被单克隆抗体L1-OV52.24识别的相同的L1表位，和/或
(ii)所述结合分子与单克隆抗体L1-OV52.24竞争性地与L1结合，
其中所述L1-OV52.24的轻链可变部分优选地包含具有如SEQ ID No:1所示的序列，或其中所述轻链由SEQ ID No:3编码，且其中所述L1-OV52.24的重链可变部分优选地包含具有如SEQ ID No:2所示的序列，或其中所述重链由SEQ ID No:4编码。
2.根据权利要求1所述的结合分子，其中所述结合分子是抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
3.根据权利要求1所述的结合分子，
其中所述结合分子选自下组：单链抗体，优选选自scFv和scFv的多聚体，如二体、三体或四体，抗体片段，优选Fab、TandAb(串联双特异性抗体)、柔性体(flexibody)和双特异性抗体，
和/或
其中所述结合分子是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体或者其抗原结合部分。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的结合分子，其中所述表位在L1的纤连蛋白结构域III 4-5(FN III 4-5)内。
5.根据权利要求2所述的结合分子，其特征在于所述抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段的互补性决定区(CDR)中的至少一个：
a)具有选自如下序列中的一个：KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)或者
b)具有与a)中提及的序列相比具有至少一个保守性氨基酸替换的序列。
6.根据权利要求5所述的结合分子，其特征在于所述抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段包含互补性决定区(CDR)QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)和WNPLAF(SEQ ID No:10)，其中任选地存在一个或多个保守性氨基酸替换，
优选地其中所述抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段包含互补性决定区(CDR)KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)，其中任选地存在一个或多个保守性氨基酸替换。
7.根据权利要求1至4所述的结合分子，其特征在于所述结合分子包含：
a)选自下述的至少一个序列：KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)或者
b)包含与a)中提及的序列相比具有至少一个保守性氨基酸替换的序列。
8.根据权利要求7所述的结合分子，其特征在于所述结合分子包含序列QQYNTYPYT(SEQID No:7)和WNPLAF(SEQ ID No:10)，其中任选地存在一个或多个保守性氨基酸替换，
优选地所述结合分子包含序列KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)，其中任选地存在一个或多个保守性氨基酸替换。
9.根据权利要求1至4中任意一项所述的结合分子，所述结合分子是包含互补性决定区(CDR)KASQNVGTNVA(LCDR1；SEQ ID No:5)、STSYRYS(LCDR2；SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(LCDR3；SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(HCDR1；SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(HCDR2；SEQID No:9)和WNPLAF(HCDR3；SEQ ID No:10)的抗-L1单克隆抗体或其抗原结合片段。
10.根据权利要求1至9中任意一项所述的结合分子，
(i)所述结合分子以至少10-9，优选地至少10-10的亲和性(KD)与L1结合，和/或
(ii)所述结合分子被表达L1的哺乳动物细胞内化，优选地其中所述细胞是SKOV3ip细胞。
11.根据权利要求1所述的结合分子，所述结合分子是单克隆抗体L1-OV52.24或其抗原结合片段，
其中所述L1-OV52.24的轻链可变部分包含，优选地具有如SEQ ID No:1所示的序列或其中所述轻链由SEQ ID No:3编码，以及所述L1-OV52.24的重链可变部分包含，优选地具有如SEQ ID No:2所示的序列或其中所述重链由SEQ ID No:3编码。
12.根据权利要求1至11中任意一项所述的结合分子，该结合分子
(a)连接至治疗活性物质，
优选地连接至
化疗化合物，优选地选自烷化剂、抗肿瘤抗生素、抗代谢药和天然来源的衍生物，
细胞毒性化合物，
细胞增殖抑制化合物，
细胞因子，
纳米颗粒，或
放射性核素，和/或
(b)连接至诊断性化合物，
优选地选自放射性核素、化学发光化合物、荧光化合物、染料或酶，
更优选地其中所述治疗活性物质是选自下述的化疗化合物或细胞毒性化合物或细胞增殖抑制化合物：DNA损伤剂，特别是放线菌素D、丝裂霉素C、顺铂、多柔比星、依托泊苷、维拉帕米、鬼臼毒素、5-FU、天然来源的衍生物和紫杉烷，优选紫杉醇和卡铂，或
或更优选地其中所述结合分子是任选地通过接头共价连接至(a)中的治疗活性物质和/或(b)中所述的诊断性化合物。
13.一种杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞产生权利要求9或11所述的抗-L1单克隆抗体。
14.一种核酸，
(i)编码根据权利要求1至11中任意一项所述的结合分子，和/或
(ii)编码根据权利要求1至11中任意一项所述的结合分子的至少一条链，和/或
(iii)包含如SEQ ID No:3所示的序列和/或如SEQ ID No:4所示的序列，和/或
(iv)包含编码序列KASQNVGTNVA(SEQ ID No:5)、STSYRYS(SEQ ID No:6)、QQYNTYPYT(SEQ ID No:7)、FNIKDYYMQ(SEQ ID No:8)、WIDPENGKTVFDPKFRG(SEQ ID No:9)和WNPLAF(SEQ ID No:10)中的至少一个的序列，
优选地其中所述核酸是载体的一部分。
15.根据权利要求1至12中任意一项所述的结合分子作为体外诊断试剂或作为体外生物技术试剂的用途。
16.根据权利要求1至12中任意一项所述的结合分子作为药物或诊断试剂的用途。
17.根据权利要求1至12中任意一项所述的结合分子在治疗或预防肿瘤疾病中的用途，优选地其中所述肿瘤疾病是上皮肿瘤疾病和/或选自下组：星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、许旺氏细胞瘤、神经纤维肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、头颈癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、神经母细胞瘤、鳞状细胞癌、成神经管细胞瘤、肝癌、结肠癌、间皮瘤和表皮样癌。
18.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至12中任意一项所述的结合分子和任选地一种或多种药学上可接受的运载体。
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