CN114933636B

CN114933636B - 靶向l1cam的多肽及其应用

Info

Publication number: CN114933636B
Application number: CN202210729189.2A
Authority: CN
Inventors: 郑小春; 陈凌峰; 潘若浪; 林敬阳; 尹丽娜; 邵燕飞; 杨秀丽; 黄萍
Original assignee: Zhejiang Provincial Peoples Hospital
Current assignee: Zhejiang Provincial Peoples Hospital
Priority date: 2022-06-24
Filing date: 2022-06-24
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2042-06-24
Also published as: CN114933636A

Abstract

本发明公开了一种靶向L1CAM的多肽及其应用，以L1CAM为靶点，所述多肽的氨基酸序列包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3中至少一种。本发明通过特异性靶向结合肿瘤细胞上的L1CAM，明显抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，具有较好的临床应用价值。

Description

靶向L1CAM的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种靶向L1CAM的多肽及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是当今全世界导致死亡率最高的疾病，严重危害人们的生命健康。随着医学水平的发展，目前恶性肿瘤的治疗方法越来越多，包括手术，放化疗、靶向治疗，以及最新的免疫治疗。尽管如此，治疗效果仍然很不理想，肿瘤患者的生存率依然很低。浸润和转移是恶性肿瘤的主要表现特征，也是肿瘤患者术后死亡的主要原因，包括细胞黏附、基质降解以及细胞运动三个主要步骤。细胞黏附破裂是肿瘤转移复杂过程中的首要步骤，在肿瘤的侵袭和转移中起主导作用。L1CAM(L1细胞黏附分子，L1 Cell Adhesion Molecule)是一种由六个免疫球蛋白样结构域、一个跨膜区和一个短的细胞质尾组成的跨膜糖蛋白，属于细胞黏附分子免疫球蛋白超家族。L1作为Wnt/β-catenin(β-cat)/LEF/TCF信号通路的靶基因，在肿瘤细胞侵袭和转移中发挥重要作用。L1CAM通常在正常人类组织中表达缺失，但在多种人类恶性肿瘤组织中存在过表达，如结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌、肾癌、胃癌、胰腺癌等，参与肿瘤发生及发展，调控肿瘤细胞的侵袭、转移及耐药等过程，对恶性肿瘤的预后具有预测价值。在结直肠癌中，L1CAM的表达不仅促进了肿瘤细胞的增殖，而且增强了肿瘤侵袭相关基因产物的表达，与肿瘤的浸润和转移密切相关，目前大量临床研究结果已证实L1CAM的表达与结直肠癌恶性程度、组织学分级、转移和患者预后不良等密切相关，是强有力的预后因子和改善肿瘤转移的明确治疗靶点。目前临床上尚缺乏L1CAM的有效靶向药物。有少量临床前研究在探索开发靶向L1CAM的单克隆抗体。但治疗性抗体药物开发难度大、生产成本很高，同时抗体疗法本身存在一些固有缺陷，如器官或肿瘤渗透性差、易引发不适当的免疫反应等，在肿瘤疾病治疗中受到了一定限制。多肽药物拥有高特异性、较好的肿瘤微环境渗透作用、低毒性、易改造、易合成、研发成本更低等优点，可以作为单克隆抗体的替代分子，解决抗体的高成本和高免疫原性等不利于其广泛应用的因素。因此，开发靶向于L1CAM的多肽抑制剂具有良好的临床应用前景，是目前肿瘤治疗领域的一个发展新方向。

噬菌体展示技术是一种筛选结合特异性抗原或靶分子的多肽、蛋白或抗体的实验技术，最初由美国Missouri大学的Smith所创建，并于2018年获得了诺贝尔化学奖。该技术是利用基因工程的方法将外源肽或蛋白基因插入噬菌体特定的蛋白基因，外源基因编码的多肽或蛋白以融合蛋白的形式呈现在噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白能够保持相对独立的空间构象和生物活性。噬菌体库经过生物淘选，即噬菌体库与靶分子培养，洗去未与靶分子结合的克隆株，收集、扩增、富集结合的克隆株，经过3～5轮富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得与靶分子特异性结合的噬菌体克隆株，对获得的克隆株进行基因测序即可确定其所编码的蛋白序列。该技术由于信息容量大、筛选通量高、操作方便等特点，已经成为肽类新药开发的重要工具，目前广泛应用于抗肿瘤多肽的筛选研究。基于该技术筛选到的多种靶向肽有望代替传统治疗起到更好的治疗效果，并且目前已有多个该技术来源的多肽进入商业化或临床试验。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向L1CAM的多肽及其应用，通过特异性靶向结合肿瘤细胞上的L1CAM，明显抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，具有较好的临床应用价值。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种靶向L1CAM的多肽，以L1CAM为靶点，所述多肽的氨基酸序列包括SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3中至少一种。

一种核酸分子，所述核酸分子编码所述的靶向L1CAM的多肽。

一种药物组合物，其包括所述的靶向L1CAM的多肽。进一步地，还包括所述的靶向L1CAM的多肽药学上可接受的载体。

一种靶向L1CAM的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

所述的肿瘤包括结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌、肾癌、胃癌、胰腺癌。优选为结直肠癌。

所述的多肽具有抗肿瘤细胞增殖的作用。

所述的多肽具有抗肿瘤细胞转移的作用。

本发明的有益效果是：

本发明应用噬菌体展示技术，一次性筛选出多条靶向L1CAM的多肽化合物，其特点为高通量，高效，文库种类较多，且合成简单，易纯化，价格低廉，利于大规模生产；

本发明的多肽后续可做成口服、注射等多种剂型，使用方便；

本发明的多肽能明显抑制肿瘤细胞的增殖，从而发挥抗肿瘤作用，具有较好的临床应用价值；本发明的多肽能明显抑制肿瘤细胞的迁移，从而发挥抗肿瘤作用，具有较好的临床应用价值。

附图说明

图1为化合物1(多肽，SEQ ID No.1)的ESI-MS鉴定谱图。

图2为化合物2(多肽，SEQ ID No.2)的ESI-MS鉴定谱图。

图3为化合物3(多肽，SEQ ID No.3)的ESI-MS鉴定谱图。

图4为化合物1、2、3对结肠癌SW620细胞的增殖抑制率示意图。

图5为化合物1、2、3对结肠癌SW620细胞的迁移抑制情况示意图。

图6为化合物1、2、3对结肠癌SW620细胞的迁移抑制计数示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明利用噬菌体十二肽库对L1CAM靶分子进行筛选，通过提取DNA并测序，最终获得了靶向结合L1CAM的十二肽序列。采用固相合成法合成筛选出的多肽，并进一步通过体外实验筛选和验证，最终获得了具有明显抗肿瘤作用的L1CAM多肽化合物。

本发明首次通过噬菌体展示技术获得一类L1CAM靶向多肽。实验结果显示该类多肽对结肠癌SW620细胞有明显的的增殖和迁移作用，因此该类多肽可用于抗肿瘤药物的研发。也可与药学领域内可接受的药物、功能性生物分子、显影剂、小分子物质或者高分子载体组成组合物，用于抗肿瘤药物的制备。

SEQ ID NO.1-3分别为：

SEQ ID NO.1：Leu Glu Phe Lys Thr Ala Ser Val Ser Arg Thr Ala

SEQ ID NO.2：Asp His Leu Leu Asn Arg Ile His His Glu His Val

SEQ ID NO.3：Phe Lys Gln Asp Ala Trp Glu Ala Val Asp Ile Arg。

预制十二肽噬菌体展示文库，卡梅德生物科技(天津)有限公司；人L1CAM重组蛋白(SDS-PAGE纯度>90％)，Abcam。

实施例1：多肽化合物的筛选和合成

(1)噬菌体随机十二肽库的筛选

将重组人L1CAM蛋白(蛋白纯度>90％)作为靶分子包被于96孔微量板中，然后将噬菌体肽库覆盖在已包被的靶分子表面，经过洗脱、扩增的3次淘选过程，使用预制十二肽噬菌体展示文库进行筛选。每次将洗脱的噬菌体在宿主菌ER2738进行扩增，并将上一轮扩增的噬菌体用于下一轮筛选。将第3轮淘选物铺板，随机挑选分隔良好的阳性克隆并在宿主菌ER2738中进行扩增。在筛选过程中，检测每轮洗脱液中重组噬菌体的滴度来评估特异性多肽重组噬菌体的富集效果。各轮筛选得到的回收噬菌体及扩增液均铺制LB/IPTG/X-gal平板并利用蓝斑形成实验测定滴度，并计算每轮的回收率。经过第3轮筛选后，将回收得到的结合及内化的噬菌体稀释至合适的滴度后铺制LB/IPTG/X-gal平板，37℃培养过夜，随机挑取分隔良好的蓝斑，扩增纯化，加入50％甘油保存于-20℃，用于后续测序和相关鉴定。

(2)噬菌体克隆DNA的提取和测序

按噬菌体单链DNA提取试剂盒操作说明扩增噬菌体克隆及提取纯化DNA，用-96gⅢ测序引物5'-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3'进行全自动测序分析，根据DNA序列推导相应的氨基酸序列并进行同源性分析。

(3)多肽化合物的合成和纯化

根据获得的多肽序列，采用经典的Fmoc/tBu固相合成法逐步合成L1CAM多肽(委托卡梅德生物科技(天津)有限公司)，经反相高效液相色谱(HPLC)系统纯化后，电喷雾-质谱(ESI-MS)系统测定多肽的分子量，合成纯度均＞90％。

本发明中的多肽化合物1，化合物2和化合物3的序列、纯度和分子量见表1；本发明的氨基酸缩写如表2所示；ESI-MS鉴定结果见图1、图2和图3。

表1多肽化合物序列和分子量

编号	序列	纯度	分子量
				化合物1	LEFKTASVSRTA	95％	1309.46
化合物2	DHLLNRIHHEHV	94％	1519.66
				化合物3	FKQDAWEAVDIR	94％	1477.61

。

表2氨基酸缩写

简写	英文缩写	中文全称
			L	Leu	亮氨酸
E	Glu	谷氨酸
			F	Phe	苯丙氨酸
K	Lys	赖氨酸
			T	Thr	苏氨酸
A	Ala	丙氨酸
			S	Ser	丝氨酸
V	Val	缬氨酸
			R	Arg	精氨酸
Q	Gln	谷氨酰胺
			D	Asp	天冬氨酸
W	Trp	色氨酸
			I	Ile	异亮氨酸
H	His	组氨酸
			N	Asn	天冬酰胺

。

实施例2：采用生物膜干涉技术测定多肽化合物与L1CAM蛋白的亲和力生物膜干涉实验在Octet RED96E系统中完成。实验采用与仪器匹配的96孔板，反应体积为200μL，反应温度为25℃。实验具体方法如下：将Streptavidin标记的探针置入超纯水中浸湿5min，转移至A Buffer(20mmol/L Tris-HCl pH 8.0，200mmol/L NaCl，1mmol/L MgCl2，1mmol/L DTT，0.5mmol/L EDTA)中进行第一次基线步骤，时间100s；探针转移至含有600nmol/L biotin标记的L1CAM蛋白的A Buffer中进行固定,时间300s；将固定有L1CAM蛋白的探针重新转移至BBuffer中进行第二次基线步骤(B Buffer为含有6mg/mL BSA、1.2％Tween20、8μg/mL L1CAM蛋白的A Buffer)，时间300s；将探针转移至C buffer中进行多肽和蛋白的结合步骤(Cbuffer为含有8μmol/L多肽的B Buffer),时间300s；最后将探针转移至B Buffer中进行解离,时间300s。利用Fortebio Data Analysis 10.0软件实时收集分子相互作用和结合动力学数据。KD值根据结合和解离曲线,利用nonlinear global fitting model模拟计算，反映了分子亲和力的大小。计算KD值的实验设置多肽浓度梯度为10、5、2.5、1.25和0.625μmol/L。最终KD值计算取3次独立实验的平均值。

本发明中的多肽化合物1，化合物2和化合物3与L1CAM蛋白的亲和力测定结果见表3。

表3多肽化合物亲和力测定结果

编号	KD(M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)	<![CDATA[Full R<sup>2</sup>]]>
					化合物1	1.17E-05	5.58E+02	6.54E-03	0.9577
化合物2	1.13E-06	7.30E+03	8.28E-03	0.9798
					化合物3	4.68E-05	2.22E+02	1.04E-02	0.9593

。

实施例3：多肽化合物抑制结肠癌SW620细胞增殖能力

采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测多肽对肿瘤细胞的抗增殖活性。将SW620细胞接种于96孔板中，每组5个复孔，待细胞长到一定密度加入L1CAM多肽化合物溶液(10μg/ml)刺激24h、48h、72h，刺激结束后，每孔加入10μL CCK-8溶液，在培养箱中孵育约2h(根据颜色变化决定孵育时间)，用紫外分光光度仪测定450nm吸光值。细胞增殖率＝(各组细胞OD值-空白OD值)/(对照组细胞OD值-空白OD值)。

结果如图4所示，与空白溶液对照组(Control)相比，多肽化合物1，化合物2和化合物3均能明显抑制肿瘤细胞的增殖。

实施例4：多肽化合物抑制结肠癌SW620细胞迁移能力

采用Transwell实验观察多肽对肿瘤细胞的迁移抑制情况并计算穿膜细胞数。分别将经L1CAM多肽化合物溶液(10μg/ml)处理前后收集待用的SW620细胞常规制备细胞悬液，定量取1×10⁴个细胞接种至含有2％FBS的Transwell装置上室，下室加入2ml 10％DMEM完全培养基，置于5％CO2细胞培养箱。37℃培养18h，取下Transwell膜，弃去培养液后用PBS清洗2遍，4％多聚甲醛固定30min，风干，0.1％g/mL PBS结晶紫染液染色20分钟，光镜下观察细胞的迁移情况并计数。

结果如图5所示，与空白溶液对照组(Control)相比，多肽化合物1，化合物2和化合物3均能明显抑制肿瘤细胞的迁移；具体迁移量比较见图6。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省人民医院

<120> 靶向L1CAM的多肽及其应用

<130> 2022.6

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

Leu Glu Phe Lys Thr Ala Ser Val Ser Arg Thr Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

Asp His Leu Leu Asn Arg Ile His His Glu His Val

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

Phe Lys Gln Asp Ala Trp Glu Ala Val Asp Ile Arg

1 5 10

Claims

1.一种靶向L1CAM的多肽，其特征在于，以L1CAM为靶点，所述多肽的氨基酸序列为SEQID No.1或SEQ ID No.2。

2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的靶向L1CAM的多肽。

3.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1所述的靶向L1CAM的多肽。

4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，还包括所述的靶向L1CAM的多肽药学上可接受的载体。

5.一种如权利要求1所述的靶向L1CAM的多肽在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤包括结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌、肾癌、胃癌、胰腺癌。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的多肽具有抗肿瘤细胞增殖的作用。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的多肽具有抗肿瘤细胞转移的作用。