CN112912401A - 抗-l1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段及包含其的嵌合抗原受体 - Google Patents

抗-l1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段及包含其的嵌合抗原受体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及与L1细胞粘附分子(L1CAM)抗原特异性结合的抗‑L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段、包含其的嵌合抗原受体以及它们的用途。本发明的抗‑L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段对于L1细胞粘附分子的特异性及亲和性优秀，因此，可用于与L1细胞粘附分子的高表达相关的多种癌症及与炎症性疾病相关的疾病的治疗及诊断。尤其，在将包含本发明的抗‑L1细胞粘附分子抗体的嵌合抗原受体表达在T淋巴细胞等效应细胞的情况下，可有用地用作与L1细胞粘附分子相关的多种癌症及炎症性疾病的免疫治疗方法。

Description

抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段及包含其的嵌合 抗原受体
技术领域
本发明在韩国未来创造科学部的支持下由项目编号2016M3A9D3021340完成，上述项目的研究管理专门机构为韩国研究基金会，研究事业名称为“生物医疗技术研发项目(新一代生物)免疫机制控制技术研发”，研究项目名称为“利用嵌合抗原受体及B细胞的多功能融合T细胞治疗法研究”，主管机构为韩国首尔大学产学协力团，研究时间为2016年05月01日～2021年01月31日。
本申请要求于2018年10月19日提交且申请号为第10-2018-0125538号的韩国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
本发明涉及与L1细胞粘附分子(L1CAM)抗原特异性结合的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段、包含其的嵌合抗原受体以及它们的用途。
背景技术
卵巢癌为最致命的妇科恶性肿瘤，是导致妇科肿瘤死亡的主要原因。尽管在手术方法及细胞毒性治疗剂的联合疗法取得了重大进展，在诊断时癌症进展的挺严重的大部分患者终将复发。因此，迫切需要治疗卵巢癌的新型方法。随着发现卵巢癌的发生与免疫原因相关且卵巢癌可被免疫系统识别并攻击，正在积极研究以免疫疗法为基础的多种治疗方法。实际上，大量的肽疫苗、树突状细胞疫苗及过继性细胞疗法用于临床实验中。
尤其，近来，以血液癌为对象的利用表达嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)的T细胞(CAR-T)的过继性治疗(adoptive therapy)的治疗可能性被证实，且已上市。并且，新发表的研究结果表明，表达嵌合抗原受体的T细胞还可在实体癌中具有相似的效果。嵌合抗原受体的独特之处在于，能够以人类白细胞抗原(HLA)-非限制性方式向T细胞赋予细胞毒性效应子功能，尤其重要的是，卵巢癌的进展与人类白细胞抗原的下调相关。实际上，已经尝试了利用对于以与卵巢癌相关的因子而周知的间皮素(mesothelin)、MUC16、叶酸受体(folate receptor)特异性的表达嵌合抗原受体的T细胞的卵巢癌治疗，但是，目前为止，治疗效果不充分。
另一方面，L1细胞粘附分子(L1-cell adhesion molecule，L1-CAM，L1CAM)在包括卵巢癌在内的各种癌症中高表达而周知，这种L1细胞粘附分子的高表达与消极的临床治疗结果相关。根据之前的研究，在体外直接在作为人卵巢癌细胞的SKOV3细胞株及移植其的动物模型(human xenograft model)处理与L1细胞粘附分子特异性结合的单克隆抗体的结果，可导出抑制肿瘤细胞的生长的结果。本发明人着眼这种L1细胞粘附分子对于各种癌症的相关性及对于卵巢癌等的治疗可能性来完成了本发明。
现有技术文献
非专利文献
Hao Hong.L1 Cell Adhesion Molecule-Specific Chimeric AntigenReceptor-Redirected Human T Cells Exhibit Specific and Efficient AntitumorActivity against Human Ovarian Cancer in Mice.(2016).PLoS ONE 11(1):e0146885
发明内容
技术问题
本发明人为了研发与L1细胞粘附分子结合的抗体或其抗原结合片段以及包含其的嵌合抗原受体而进行深入研究。结果，所研发的抗-L1细胞粘附分子抗体与人及小鼠L1细胞粘附分子抗原分子非常特异性结合，究明了包含其的嵌合抗原受体及表达嵌合抗原受体的T细胞对于SKOV3卵巢癌细胞株、SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞株及Hela宫颈癌细胞株示出高抗癌活性，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的在于，提供与L1细胞粘附分子抗原特异性结合的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段。
本发明的再一目的在于，提供包含抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段的嵌合抗原受体及表达其的效应细胞。
本发明的另一目的在于，提供包含上述抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段或表达上述嵌合抗原受体的效应细胞的药剂学组合物。
本发明的还有一目的在于，提供向对象体给药表达上述嵌合抗原受体的效应细胞的与L1细胞粘附分子的高表达相关的疾病的治疗方法。
技术方案
在本说明书中，本发明一实施方式的抗体为与L1细胞粘附分子特异性结合的抗体及经过亲和力成熟的它们的修饰抗体。
与现有的抗-L1细胞粘附分子抗体相同地，本发明的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段具有对于L1细胞粘附分子抗原的特异性结合能力。
在本说明书中，术语“抗体(antibody)”为对于L1细胞粘附分子抗原的特异性抗体，不仅包含完整的抗体形态，还包含抗体分子的抗原结合片段(antigen bindingfragment)。
完整的抗体为具有两个全长轻链(light chain)及两个全长重链(heavy chain)的结构，各个轻链通过二硫键(disulfided bond)与重链相连接。术语“重链”是指以其天然发生立体形态存在于抗体分子且通常确定抗体所属类别的两种多肽链的较大的链。上述“重链”是指包括抗体的重链可变区(variable region of heavy chain，VH)及3个重链恒定区(constant region of heavy chain)CH1、CH2及CH3在内的全长重链及其片段，上述抗体的重链可变区及3个重链恒定区CH1、CH2及CH3包含具有向抗原赋予特异性的足够的可变区序列的氨基酸序列。重链恒定区具有γ、μ、α、δ及ε类型，具有γ1、γ2、γ3、γ4、α1及α2作为子类。
术语“轻链”是指一其天然发生立体形态存在于抗体分子的两种多肽链的较小的链。上述“轻链”是指包括抗体的轻链可变区(variable region of light chain，VL)及轻链恒定区(constant region of light chain，CL)在内的全长轻链及其片段，上述抗体的轻链可变区及轻链恒定区包含具有向抗原赋予特异性的足够的可变区序列的氨基酸序列。轻链恒定区具有κ及λ类型(Cellular and Molecular Immunology,Wonsiewicz,M.J.,Ed.,Chapter 45,pp.41-50,W.B.Saunders Co.Philadelphia,PA(1991)；Nisonoff,A.,Introduction to Molecular Immunology,2nd Ed.,Chapter 4,pp.45-65,sinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA(1984))。
术语“抗原(antigen或Ag)”是指诱发免疫反应的分子。上述免疫反应可伴随抗体的产生或特异性免疫活性细胞的活化，或者两者兼而有之。
在本说明书中，术语“互补决定区(CDR，complementarity determining region)”是指免疫球蛋白重链及轻链的高变区(hypervariable region)的氨基酸序列(Kabat etal.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,4th Ed.,U.S.Department ofHealth and Human Services,National Institutes of Health(1987))。重链(重链的互补决定区1(CDRH1)、重链的互补决定区2(CDRH2)及重链的互补决定区3(CDRH3))及轻链(轻链的互补决定区1(CDRL1)、轻链的互补决定区2(CDRL2)及轻链的互补决定区3(CDRL3))分别包含3个互补决定区(CDRs)。互补决定区提供当抗体与抗原或表位结合时关键的接触残基。
在本说明书中，术语“抗原结合片段(antigen binding fragment)”是指具有抗原结合功能的片段，包含Fab、F(ab’)、F(ab’)2及Fv等。在抗体片段中，Fab(fragment antigenbinding)为具有轻链可变区及重链可变区和轻链恒定区及重链恒定区1(CH1)的结构，具有1个抗原结合部位。Fab’与Fab的不同之处在于，Fab’具有在重链恒定区1的C-末端包含一个以上的胱胺酸残基的铰链区(hinge region)。F(ab’)2抗体通过Fab’铰链区的胱胺酸残基形成二硫键来生成。Fv为仅具有重链可变部位及轻链可变部位的最小抗体片段，生成Fv片段的重组技术是本领域的公知技术。在双链Fv(two-chain Fv)中，重链可变部位与轻链可变部位以非共价键相连接，在单链Fv(single-chain variable fragment，scFv)中，通常通过连接肽，重链可变区与单链可变区以共价键相连接或者在C-末端直接连接，由此，可入双链Fv形成如二聚体的结构。可利用蛋白水解酶获取上述抗体片段(例如，若利用木瓜蛋白酶限制性切割整个抗体，则可获取Fab，若利用胃蛋白酶切割整个抗体，则可获取F(ab’)2)，或者可通过基因重组技术制备上述抗体片段。
并且，本发明的抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人源抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fvs(scFV)、单链抗体、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键Fvs(sdFV)及抗独特型(抗-Id)抗体以及上述抗体的表位-结合片段等，但并不限定于此。
在本说明书中，术语“构架(Framework)”或“骨架区(FR)”表示高变区(hypervariable region，HVR)残基之外的可变域残基。通常，可变域的构架由如骨架区1(FR1)、骨架区2(FR2)、骨架区3(FR3)及骨架区4(FR4)的4个构架域。因此，通常，高变区及构架序列在重链可变区(VH)(或轻链可变区(VL)/Vk)中以下述顺序示出：(a)重链的骨架区1(FRH1，Framework region 1of Heavy chain)－重链的互补决定区1(CDRH1，complementarity determining region 1of Heavy chain)－重链的骨架区2(FRH2)－重链的互补决定区2－重链的骨架区3(FRH3)－重链的互补决定区3－重链的骨架区4(FRH4)；以及(b)轻链的骨架区1(FRL1，Framework region 1of Light chain)－轻链的互补决定区1(CDRL1，complementarity determining region 1of Light chain)－轻链的骨架区2(FRL2)－轻链的互补决定区2－轻链的骨架区3(FRL3)－轻链的互补决定区3－轻链的骨架区4(FRL4)。
在本说明书中，术语“特异性结合”等是指如抗体或其抗原结合片段或scFv的其他构建体在生理条件下形成较稳定的抗原和复合物。特异性结合可特性化为至少约1×10-6M以下的平衡解离常数(例如，小于其的KD示出更坚固的结合)。确定两个分子是否特异性结合的方法在本领域众所周知，例如，包括平衡透析、表面等离子共振等。
在本说明书中，术语“亲和力(Affinity)”是指分子(例如，抗体)的单一结合部位与其结合伴侣(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非明确表示，则“结合亲和力(binding affinity)”表示反映结合对(例如，抗体及抗原)的成员之间的1∶1相互作用的内在(intrinsic)结合亲和力。通常，可由解离常数(Kd)表示分子Y与其伴侣Y的亲和力。可通过包括本申请中记述的内容在内的本领域公知的方法测定亲和力。
并且，在本说明书中，术语“人源抗体(human antibody)”具有与从人或人包生成的抗体或利用人源抗体库(repertoires)或其他人源抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列相应的氨基酸序列。人源抗体的这种定义排除包含非人源抗原结合残基的人源化(humanized)抗体。
在本说明书中，术语“亲和(chimeric)抗体”是指重链和/或轻链的一部分源自特定源(source)或种(species)且重链和/或轻链的剩余部分源自不同的源或种的抗体。
在本说明书中，术语“人源化抗体”是指包含源自非人(例如，小鼠)抗体的非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、其免疫球蛋白链或片段(例如，Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其他抗原-结合子序列)。在大部分的情况下，人源化抗体为受体的互补决定区的残基被具有所需的特异性、亲和性及能力的非人种(供体抗体)，例如小鼠、大鼠或兔的互补决定区的残基取代的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一部分情况下，上述人免疫球蛋白的Fv骨架区(framework region，FR)残基被相应的非人残基取代。并且，人源化抗体可包含在受体抗体或在导入的互补决定区或构架序列中也未被发现的残基。这种修饰为了追加改善抗体性能及使抗体性能最优化而进行。通常，上述人源化抗体将包含至少一个可变域，及通常两个实质上的所有可变域，在上述结构域中，上述互补决定区的全部或实质上的全部与非人免疫球蛋白的互补决定区相应，上述骨架区的全部或实质上的全部具有人免疫球蛋白的骨架区的序列。上述人源化抗体包含免疫球蛋白恒定区域(Fc region)的至少一部分或实质上的人免疫球蛋白的恒定区域(Fc region)序列。
如普通技术人员所周知，本发明的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段可在特异性识别L1细胞粘附分子的范围内包含氨基酸序列的变异体。例如，为了改善抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性，可以改变抗体的氨基酸序列。这种修饰包括如抗体的氨基酸序列残基的缺失、插入和/或取代。
这种氨基酸变异以氨基酸侧链取代物的如疏水性、亲水性、电荷、大小等相对相似性为基础进行。通过分析氨基酸侧链取代物的大小、形状及种类可知，精氨酸、赖氨酸及组氨酸均为带正电荷的残基，丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸具有相似的大小，苯基丙氨酸、色氨酸及酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸及组氨酸；丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸；以及苯基丙氨酸、色氨酸及酪氨酸为生物学功能等同物。
当引入变异时，可考虑氨基酸的疏水性指数(hydropathic index)。各个氨基酸根据疏水性和电荷被赋予疏水性指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯基丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天门冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。
当赋予蛋白质的相互作用的生物学功能(interactive biological function)时，疏水性氨基酸指数非常重要。只有通过具有相似的疏水性指数的氨基酸取代，才能保留相似的生物学活性，这是公知的事实。当参照疏水性指数来引入变异时，在示出以下疏水性指数差异的氨基酸之间取代，即，优选为±2以内，更优选为±1以内，更加优选为±0.5以内。
另一方面，具有相似的亲水性值(hydrophilicity value)的氨基酸之间的取代导致具有相等的生物学活性的蛋白质，这也是公知事项。如在美国专利第4554101号所公开，向各个氨基酸残基赋予如下的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天门冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯基丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
当参照亲水性值来引入变异时，在示出以下的亲水性值差异的氨基酸之间取代，即，优选为±2以内，更优选为±1以内，更加优选为±0.5以内。
部完全变更分子的活性的蛋白质中的氨基酸交换已在本领域公知(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最为常见的交换为氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly之间的交换。
根据本发明的一实施方式，本发明提供抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(heavy chain variable region，VH)以及轻链可变区(light chainvariable region，VL)，上述重链可变区包含下述i)、ii)以及iii)，上述轻链可变区包含下述vi)、v)及vi)。
i)包含下述氨基酸序列的重链的互补决定区1(CDRH1，complementaritydetermining region 1of heavy chain)：X1YAMX5，其中，各自独立地，X1为D、S或N，X5为N、H或S；ii)包含序列12、序列13或下述氨基酸序列的重链的互补决定区2(CDRH2，complementarity determining region 2ofheavy chain)：AISSX5GX7X8X9YYADSVKG，其中，各自独立地，X5为S或T，X7为S或G，X8为S或T，X9为I、T或K；iii)包含选自序列15至序列23中的一种氨基酸序列的重链的互补决定区3(CDRH3，complementarity determining region3of heavy chain)；iv)包含下述氨基酸序列的轻链的互补决定区1(CDRL1，complementarity determining region 1of light chain)：RASQSIX7X8X9LN，其中，各自独立地，X7为S或G，X8为R、N或S，X9为D或Y；v)包含下述氨基酸序列的轻链的互补决定区2(CDRL2，complementarity determining region 2of light chain)：AX2SX4LQS，其中，各自独立地，X2为A或T，X4为S、N、R或T；vi)包含下述氨基酸序列的轻链的互补决定区3(CDRL3，complementarity determining region 3of light chain)：QQSX4SX6PX8T，其中，各自独立地，X4为Y或E，X6为T、F或Y，X8为Y、W、L或F。
在本说明书中使用的“Xn”及“Xm”等的标记用于在所定义的上述通式中表示位置n及m的氨基酸。其中，n及m为表示从上述序列的N-末端计算的上述序列中的氨基酸位置的整数。例如，X1及X5分别表示距上述序列的N-末端的第1位及第5位的氨基酸。
在本发明一实例的情况下，上述通式中的Xn或Xm尽可能独立选自氨基酸残基的组中。普通技术人员可理解的是，Xn可选自可能的多个残基所罗列的多个组中的一个，这种选择独立于Xm的氨基酸的选择而进行，其中，n与m不同。因此，在上述通式中，在Xn位置中罗列的可能的多个氨基酸残基中的任意一个可独立于在其他各种位置(Xm位置)罗列的可能的多个氨基酸残基中的其他来组合。
如在下述实施例中的详细记载，与本发明的L1细胞粘附分子特异性结合的抗-L1细胞粘附分子抗体、其修饰抗体或它们的抗原结合片段的重链的互补决定区1、重链的互补决定区2、轻链的互补决定区1、轻链的互补决定区2及轻链的互补决定区3分别由上述i)、ii)、iv)、v)及vi)表示，以对诸多随机修饰抗体进行统计学分析的结果为基础制作上述通式。通过反复的筛选试验确认与L1细胞粘附分子的相互作用而选择了与上述L1细胞粘附分子特异性结合的抗-L1细胞粘附分子抗体或抗原结合片段和它们的修饰抗体。
在本发明的一实例中，各自独立地，上述重链的互补决定区1的X1为D或S，上述X5为N、H或S。
在本发明的实施例中，由上述通式表示的重链的互补决定区1的氨基酸序列与选自序列1至序列7中的一种氨基酸序列相应。
根据本发明的具体实施例，由上述通式表示的重链的互补决定区1的氨基酸序列与选自序列1至序列3及序列7中的一种氨基酸序列相应，它们与在本发明中最终筛选的4种抗体的重链的互补决定区1相应。
在本发明的再一实例中，各自独立地，上述重链的互补决定区2的X5为T或S，上述重链的互补决定区2的X7为S或G，上述重链的互补决定区2的X8为S或T，以及上述重链的互补决定区2的X9为I或T。
在本发明的实施例中，由上述通式表示的重链的互补决定区2的氨基酸序列与选自序列8至序列14中的一种氨基酸序列相应。
根据本发明的具体实施例，由上述通式表示的重链的互补决定区2的氨基酸序列与选自序列8至序列10中的一种氨基酸序列相应，它们与在本发明中最终筛选的4种抗体的重链的互补决定区2相应。
并且，根据本发明的具体实例，上述重链的互补决定区3的氨基酸序列与选自序列15至序列17及序列22中的一种氨基酸序列相应，它们与在本发明中最终筛选的4种抗体的重链的互补决定区3相应。
在本发明的一实例中，上述轻链的互补决定区1的氨基酸序列与选自序列32至序列36中的一种氨基酸序列相应。
根据本发明的具体实例，上述轻链的互补决定区1的氨基酸序列与选自序列32至序列34及序列36中的一种氨基酸序列相应，它们与在本发明中最终筛选的4种抗体的轻链的互补决定区1相应。
在本发明的另一实例中，各自独立地，上述轻链的互补决定区2的X2为A或T且X4为S或N。
在本发明的实施例中，由上述通式表示的轻链的互补决定区2的氨基酸序列与选自序列37至序列42中的一种氨基酸序列相应。
并且，根据本发明的具体实施例，由上述通式表示的轻链的互补决定区2的氨基酸序列与选自序列37、序列38及序列42中的一种氨基酸序列相应，它们与在本发明中最终筛选的4种抗体的轻链的互补决定区2相应。
在本发明的还有一实例中，各自独立地，上述轻链的互补决定区3的X4为Y，上述轻链的互补决定区3的X6为T或F，以及上述轻链的互补决定区3的X8为Y或W。
在本发明的一实施例中，由上述通式表示的轻链的互补决定区3的氨基酸序列与选自序列43至序列47中的一种氨基酸序列相应。
根据本发明的具体实施例，由上述通式表示的轻链的互补决定区3的氨基酸序列与序列43或序列44的氨基酸序列相应，它们与在本发明中最终筛选的4种抗体的轻链的互补决定区3相应。
根据本发明的还有一实例，在本发明的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段中，上述重链可变区包含重链的骨架区1(FRH1，Framework region 1of Heavy chain)，上述重链的骨架区1包含选自序列24至序列26中的一种氨基酸序列。
根据本发明的具体实例，上述上述重链可变区包含重链的骨架区1，上述重链的骨架区1包含序列24的氨基酸序列。
并且，上述重链可变区包含重链的骨架区2(FRH2，Framework region 2of Heavychain)，上述重链的骨架区2包含序列27的氨基酸序列。
并且，上述重链可变区包含重链的骨架区3(FRH3，Framework region 3of Heavychain)，上述重链的骨架区3包含序列28或序列29的氨基酸序列。
并且，上述重链可变区包含重链的骨架区4(FRH4，Framework region 4of Heavychain)，上述重链的骨架区4包含序列30的氨基酸序列。
在本发明的又一实例中，上述重链可变区包含下述vii)的氨基酸序列。
vii)EVQLVESGGGLXaQPGGSLRLSCAASGFTFS[CDRH1]WVRQAPGKGLEWVS[CDRH2]RFTISRDNSKNTLYLQXbNSLRAEDTAVYYCAK[CDRH3]WGQGTLVTVSS
其中，各自独立地，上述[CDRH1]、[CDRH2]及[CDRH3]为在上文中定义的重链的互补决定区1、重链的互补决定区2及重链的互补决定区3的氨基酸序列，上述Xa为V、L或A，以及上述Xb为M或I。
在本发明的具体实例中，在vii)中，上述Xa为V，上述Xb为M。
根据本发明的一实施例，上述重链可变区的氨基酸序列与选自序列52至序列55中的一种氨基酸序列相应。
根据本发明的具体实例，上述轻链可变区包含轻链的骨架区1(FRL1，Frameworkregion 1of Light chain)，上述轻链的骨架区1包含序列48的氨基酸序列。
并且，上述轻链可变区包含轻链的骨架区2(FRL2，Framework region 2of Lightchain)，上述轻链的骨架区2包含序列49的氨基酸序列。
并且，上述轻链可变区包含轻链的骨架区3(FRL3，Framework region 3of Lightchain)，上述轻链的骨架区3包含序列50的氨基酸序列。
并且，上述轻链可变区包含轻链的骨架区4(FRL4，Framework region 4of Lightchain)，上述轻链的骨架区4包含序列51的氨基酸序列。
在本发明的又一实例中，上述轻链可变区包含下述viii)的氨基酸序列。
viii)DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC[CDRL1]WYQQKPGKAPKLLIY[CDRL2]GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC[CDRL3]FGQGTKVEIK
其中，各自独立地，上述[CDRL1]、[CDRL2]及[CDRL3]为在上文中定义的轻链的互补决定区1、轻链的互补决定区2及轻链的互补决定区3的氨基酸序列。
根据本发明的一实施例，上述轻链可变区的氨基酸序列与选自序列56至序列59中的一种氨基酸序列相应。
另一方面，本发明的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段包含抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，上述抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段包含对于如上所述的氨基酸序列的小幅变化，即，几乎不影响其三级结构及抗体的功能的修饰。因此，在一些实例的情况下，即使与如上所述的序列不一致，也可具有至少90％、93％、95％或98％以上的相似性。
并且，在本发明中，上述抗体或其抗原结合片段中所包含的重链可变区与轻链可变区可通过由通式(GnSm)p或(SmGn)p表示的氨基酸序列组成的连接肽相连接。
其中，在上述n、m及p中，各自独立地，n为1至7的整数，m为0至7的整数，n与m之和为8以下的整数，p为1至7的整数。
根据本发明的具体实例，在上述连接肽中，n＝1至5，m＝0至5。在更具体的实例的情况下，n＝4，m＝1。在更加具体的实例的情况下，上述连接肽为(G4S)3或(S4G)3。
在再一实例的情况下，上述连接肽为VDGS，在另一实例的情况下，上述连接肽为ASGS。
并且，本发明的抗体或抗原结合片段的轻链可变区及重链可变区能够以如下的方向存在：轻链可变区－连接肽－重链可变区；或重链可变区－连接肽－轻链可变区。
根据本发明的最具体实例，本发明的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段包含选自序列64至序列67中的氨基酸序列，但并不限定于此。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段的融合蛋白。
在本发明中，为了本发明的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段的生产率、纯化效率、生物学活性的提高、融合蛋白的稳定性增加、折叠(folding)的提高和/或与具有追加功能性的功能组成部位(moiety)的结合而制备上述融合蛋白。上述融合蛋白通过两个以上的多肽链表达为重组融合蛋白(recombinant fused protein)而借助共价键相连接，或者上述融合蛋白能够以通过化学接合(conjugation)连接两个以上的多肽链的缀合物(conjugate)的形态体现。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供嵌合抗原受体多肽，其包含：(a)L1细胞粘附分子结合域(L1CAM binding domain)；(b)跨膜结构域(transmembrane domain，TM)；(c)共刺激结构域(costimulatory domain)；以及(d)细胞内信号转导结构域(intracellular signaling domain，ICD)。
在本说明书中，术语“嵌合抗原受体”为包含与效应细胞信号转导或效应细胞活化域(例如(e.g.)，T-细胞信号转导或T-细胞活化域)相连接的靶结合域(例如，单链可变片段(scFv))的人为制备的杂合蛋白(融合蛋白)或多肽。嵌合抗原受体通常具有利用单克隆抗体的抗原-结合特性以非-MHC-限制方式重新诱导对于所选择的靶的T-细胞特异性及反应性的能力。非-MHC-限制的抗原识别向表达嵌合抗原受体的T-细胞提供与抗原处理无关地识别抗原的能力，由此，规避了肿瘤逃逸的主要机制。并且，当嵌合抗原受体在T-细胞表达时，有利地，不与内源性T-细胞受体(TCR)α及β链二聚体化。
本发明的嵌合抗原受体包含如上所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段作为细胞外抗原结合域。因此，本发明的嵌合抗原受体以抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体(anti-L1CAM CAR)、抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体等表达。
在本发明的实施例中使用的“L1-嵌合抗原受体(L1-CAR)”、“L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体(L1CAM-CAR)”、“L1-H8-嵌合抗原受体(L1-H8-CAR)”等的术语为本发明人发明的抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体的代码名称，指代包含与如上所述的L1细胞粘附分子特异性结合的细胞外抗原结合域的嵌合抗原受体。
根据本发明的一实例，本发明的嵌合抗原受体包含L1细胞粘附分子结合域，上述L1细胞粘附分子结合域包含在本发明中详述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，因此，识别L1细胞粘附分子抗原并在细胞的表面表达。
本发明的嵌合抗原受体在细胞的表面表达，因此，包含跨膜结构域。上述跨膜结构域可以为选自由T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154组成的组中的蛋白质的跨膜结构域或它们的全部序列或一部分序列的组合，但并不限定于此。
根据本发明的具体实例，上述跨膜结构域为CD8或CD28的跨膜结构域，最具体为被序列78的核甘酸序列编码的CD28的跨膜结构域或被序列119的核甘酸序列编码的CD8α的跨膜结构域。
本发明的嵌合抗原受体的上述共刺激结构域为从选自与MHC I类分子、肿瘤坏死因子(TNF)受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号转导淋巴细胞活化分子(signaling lymphocytic activation molecule，SLAM)、活化NK细胞受体、B淋巴细胞和T淋巴细胞弱化因子(B an T lymphocyte attenuator)、Toll样配体受体(Toll-likeligand receptor)、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244，2B4)、CD84、CD96(触觉(Tactile))、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A，Ly108)、SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a及CD83特异性结合的配体组成的组中的蛋白质获取的功能信号转导结构域，但并不限定于此。
根据本发明的具体实例，上述共刺激结构域可以为选自由CD28、OX40、4-1BB(CD137)及ICOS(CD278)组成的组中的蛋白质获取的功能信号转导结构域，更具体地，为被序列79的核甘酸序列编码的CD28的功能信号转导结构域、被序列80的核甘酸序列编码的OX40的功能信号转导结构域、被序列101或序列120的核甘酸序列编码的4-1BB的功能信号转导结构域、被序列102的核甘酸序列编码的ICOS的功能信号转导结构域或它们的全部或一部分序列的组合。
根据本发明的再一实例，上述细胞内信号转导结构域为4-1BB、CD28、OX40、CD3ζ的功能信号转导结构域或它们的组合。最为具体地，上述细胞内信号转导结构域为CD3ζ的功能信号转导结构域。
根据本发明的一实施例，上述细胞内信号转导结构域为被序列81的核甘酸序列编码的CD3ζ的功能信号转导结构域、被序列121的核甘酸序列编码的CD3ζ-iso2M、被序列126的核甘酸序列编码的CD3ζ-iso2，但并不限定于此。
在本发明的一实例中，上述嵌合抗原受体选择性地还包含前导序列(leadersequence，LS)。上述前导序列位于构成嵌合抗原受体的重组多肽的氨基-末端(N-terminal)。上述前导序列在嵌合抗原受体的细胞内处理及向细胞膜局部化(localization)，且任意地从抗原结合域传递。
在本发明的具体实例中，上述前导序列可以为hCD8α的前导序列、hGM-CSF受体α链(hGM-CSF receptor alpha-chain)的前导序列或3E8抗体的前导序列。
在本发明的更具体的实例中，上述前导序列为包含被序列128至序列130的碱基序列编码的氨基酸序列的前导序列。
本发明的嵌合抗原受体的上述L1细胞粘附分子结合域通过铰链结构域(或间隔区)与上述跨膜结构域相连接。
根据本发明的另一实例，上述铰链结构域为源自IgG1、IgG2、IgG4或IgD的铰链、源自CD8或CD28的铰链、源自CD28的胞外域(ECD)或它们的组合。
根据本发明的一实施例，上述铰链结构域可以为被序列77的核甘酸序列编码的IgD铰链、被序列85的核甘酸序列编码的IgG1铰链、被序列86的核甘酸序列编码的IgG1 CH3铰链、被序列118的核甘酸序列编码的hCD8α铰链、被序列124的核甘酸序列编码的铰链、被序列125的核甘酸序列编码的hCD28胞外域或其全部或一部分序列的组合，但并不限定于此。
根据本发明的一实施方式，本发明提供包含核甘酸序列的核酸分子，上述核甘酸序列对如上所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段进行编码。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含核甘酸序列的核酸分子，上述核甘酸序列对包含如上所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段的融合蛋白进行编码。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供包含核甘酸序列的核酸分子，上述核甘酸序列对如上所述的嵌合抗原受体多肽进行编码。
在本说明书中，术语“核酸(nucleic acids)”具有包括脱氧核糖核酸(DNA)(基因组脱氧核糖核酸(gDNA)及互补脱氧核糖核酸(cDNA))及核糖核酸(RNA)分子的含义，在核酸分子中，作为基本组成单位的核甘酸不仅包括天然核甘酸，还包括修饰糖或碱基部位的类似物(analogue)(Scheit,Nucleotide Analogs,John Wiley,New York(1980)；Uhlman及Peyman,Chemical Reviews,90:543-584(1990))。
在本发明的一实例中，本发明的对上述嵌合抗原受体多肽进行编码的核甘酸序列为对组成上述嵌合抗原受体分子的氨基酸序列进行编码的核甘酸序列即可，并不限定于任何特定核甘酸序列，这对普通技术人员而言是显而易见的。
这是因为，即使发生核苷酸序列的变异，也具有下述情况，即，若将变异的核甘酸序列表达为蛋白质，则不会导致蛋白质序列的改变。将其称为密码子的简并性。因此，上述核甘酸序列包含功能上等同的密码子或对相同的氨基酸进行编码的密码子(例如，由于密码子的简并性，对于精氨酸或丝氨酸的密码子为六个)或对生物学上等同的氨基酸进行编码的密码子。
但是，根据本发明的具体实例，对上述嵌合抗原受体的L1细胞粘附分子结合域多肽进行编码的上述核酸分子包含选自序列60至序列63中的一个核甘酸序列。
若考虑如上所述的具有生物学上等同活性的变异，则本发明的对嵌合抗原受体多肽进行编码的核酸分子还包含与在序列表记载的序列具有实质同一性(substantialidentity)的序列。上述实质同一性指如下的序列，即，在校准上述本发明的序列和任意其他序列来使其尽可能相对应且利用本领域通常利用的算法分析校准的序列的情况下，示出至少61％的同源性，更优选地，示出70％的同源性，更加优选地，示出80％的同源性，最优选地，示出90％的同源性。用于比较序列的校准方法已在本领域公知。与校准有关的各种方法及算法公开在Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman andWunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970)；Pearson and Lipman,Methods in Mol.Biol.24:307-31(1988)；Higgins and Sharp,Gene 73:237-44(1988)；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)；Corpet et al.,Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)；Huang et al.,Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)and Pearson et al.,Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)。生物大分子序列比对搜索工具(NCBI Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-10(1990))可在美国国家生物技术信息中心(NBCI，National Center for Biological Information)等访问，可在互联网上与如blastp、blastn、blastx、tblastn及tblastx的序列分析程序联动来利用。生物大分子序列比对搜索工具可通过美国国家生物技术信息中心网页的生物大分子序列比对搜索工具页面联接。可在美国国家生物技术信息中心网页的生物大分子序列比对搜索工具帮助(help)页面确认利用上述程序的序列同源性比较方法。
根据本发明的还有一实施方式，本发明提供重组载体，其包含：如上所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段；或者对如上所述的嵌合抗原受体多肽进行编码的核酸分子。
在本说明书中，术语“载体”包括转移载体和表达载体。
在本说明书中，术语“转移载体”是指包含离析的核酸且用于将离析的核酸转移至细胞内部的物质的组成。包含线性多核苷酸、与离子化合物或两亲化合物相连接的多核苷酸、质粒及病毒，但并不限定于此。更具体地，上述转移载体包含自复制质粒或病毒。上述术语应解释为，还可包含促进核酸向细胞内转移的的非-质粒及非-病毒性化合物，如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒性转移载体包含腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体，但并不限定于此。
在本发明的一实例中，上述载体为慢病毒载体。在本发明的具体一实例中，上述载体还包含启动子。例如，上述启动子可以为EF-1启动子，但并不限定于此。
在本发明的又一实例中，上述载体可以为逆转录病毒载体。逆转录病毒提供用于基因传递系统的便利的平台。为了基因传递而选择的基因向逆转录病毒载体中插入并可封装在逆转录病毒粒子中。接着，重组的逆转录病毒可在体内或体外传递至所目标的宿主细胞。在相关技术领域周知许多逆转录病毒载体，在本发明的具体实例中，上述逆转录病毒载体为基于MLV的逆转录病毒载体的pMT逆转录病毒载体，但并不限定于此。
在本说明书中国，术语“表达载体”是指包含重组核苷酸的载体，上述重组核苷酸包含以能够操作的方式与所要表达的核苷酸序列相连接的表达控制序列，由此，在宿主细胞表达目标基因目标基因。表达载体包含足以用于表达的顺式作用要素(cis-actingelement)，可通过宿主细胞或试验管中的表达系统提供用于表达的其他要素。上述表达载体包含：包含重组多核苷酸的质粒载体；粘粒载体；以及病毒载体，如噬菌体载体、腺病毒载体、慢病毒、逆转录病毒载体及腺相关病毒载体。根据本发明的具体实例，在本发明的载体中，对上述分子开关进行编码的核酸分子与上述载体的启动子可操作地结合(operativelylinked)。在本说明书中，术语“可操作地结合”是指核酸表达调节序列(例：启动子、信号序列或转录调节因子结合位点的阵列)与其他核酸序列之间的功能性结合，由此，上述调节序列可调节上述其他核酸序列的转录和/或翻译。
本发明的重组载体系统可通过本领域公知的各种方法构建，与之有关的具体方法公开在Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press(2001)，其全部内容通过引用结合在本说明书中。
本发明的载体可作为用于基因克隆的载体、用于表达蛋白质的载体或用于传递基因的载体构建。并且，本发明的载体可将原核细胞或真核细胞作为宿主来构建。
例如，在本发明的载体为表达载体且将真核细胞用作宿主的情况下，可利用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例：金属硫蛋白启动子、β-肌动蛋白启动子、人血红蛋白启动子及人肌肌酸激启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例：腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子、单纯疱疹病毒(HSV)的tk启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)的长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒的启动子、EB病毒(EBV)的启动子及呼吸道合胞病毒(RSV)的启动子)，其通常具有多腺苷酸化序列作为转录终止序列。
本发明的载体还可与其他序列融合，使得从其表达的多肽或蛋白质容易纯化。例如，融合的序列可以为谷胱甘肽s-转移酶(Pharmacia，USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)、FLAG(IBI，USA)及六组氨酸(6x His，hexahistidine；Quiagen，USA)等。另一方面，本发明的表达载体可包含选择标记基因和/或报告基因作为用于评价本发明的抗体或其抗原结合片段以及包含其的嵌合抗原受体多肽的表达的选择标记。作为选择标记基因包括本领域通常利用的抗生素抗性基因，例如，具有对于氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素及四环素的抗性基因。作为报告基因包含荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶或绿色荧光蛋白基因。
将本发明的重组载体引入至细胞中并表达的方法已在相关技术领域周知。载体可通过本领域公知的方法容易引入至宿主细胞，如哺乳动物、病毒、酵母或昆虫细胞中。例如，载体可通过物理、化学或生物化学手段引入至宿主细胞中。上述物理手段包含磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击(particle bombardment)、微细注入、电穿孔等。上述化学手段包括胶体分散系统，例如，包含巨分子复合物、纳米胶囊、微球、珠及水包油乳业、胶束(micelle)、混合的胶束及脂质体的基于脂质的系统。并且，上述生物学手段包括如上所述的慢病毒、逆转录病毒等、脱氧核糖核酸或核糖核酸载体的使用。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供表达上述嵌合抗原受体多肽的效应细胞。
在本发明的一实例中，上述效应细胞选自由树突状细胞、杀伤树突状细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞及它们的前体细胞组成的组中，但并不限定于此。其中，上述T淋巴细胞选自由炎症性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞组成的组中。
在本发明中，上述效应细胞包含自体细胞或同种异体细胞的群。即，上述效应细胞包含表达本发明的抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体多肽的自体细胞或同种异体细胞的群。
在本说明书中，术语“自体”是指源自所要再引入至个体的相同个体的任意物质。在本说明书中，术语“同种”是指源自与引入物质的个体相同种的不同动物的任意物质。
并且，根据本发明的一实例，上述效应细胞包含转染或转导为包含核酸分子的载体的细胞的群，上述核酸分子对抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体多肽进行编码。上述转染或转导可通过如上所述的本领域周知的各种手段无限制地进行。
因此，根据本发明的具体实例，例如，本发明的效应细胞向T淋巴细胞或自然杀伤细胞传递，抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体编码核酸分子向信使核糖核酸(mRNA)转录，从上述信使核糖核酸翻译抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体多肽并表达在效应细胞的表面。
如在本发明的实施例中所例示，表达本发明的抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体的效应细胞有效杀灭作为在表面表达L1细胞粘附分子的癌症细胞株的SKOV3(卵巢癌细胞株)、SH-SY5Y(神经母细胞瘤细胞株)、HeLa(宫颈癌细胞株)。因此，表达本发明的抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体的效应细胞可有用地用作用于治疗各种癌症的有效成分。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供包含如上所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段的用于治疗或诊断癌症或炎症性疾病的药剂学组合物。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供用于治疗癌症或炎症性疾病的药剂学组合物，其包含表达如上所述的嵌合抗原受体多肽的效应细胞。
上述药剂学组合物为用于免疫治疗的药剂学组合物，其包含如上所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段或表达嵌合抗原受体多肽的效应细胞。
在本说明书中，“免疫治疗(immunotherapy)”为帮助免疫体系去除癌的癌症的治疗方法。免疫治疗分为主动免疫治疗和被动免疫治疗。主动免疫治疗包括：i)癌症疫苗治疗(cancer vaccine therapy)，向人体注入癌细胞或通过癌细胞生成的物质，由此，活化免疫体系；ii)免疫调节治疗，通过给药细胞因子(干扰素、白细胞介素等)、生长因子等免疫调节剂(immune-modulating agents)来活化特定白细胞。被动免疫治疗包括与特定癌细胞结合的治疗性抗体(therapeutic antibody)和免疫细胞治疗(immune cell therapy)。具体地，免疫细胞治疗包括树突状细胞疫苗治疗(dendritic cell vaccine therapy)和表达嵌合抗原受体的T细胞(chimeric antigen receptor T cell)治疗、自然杀伤(NK)细胞治疗(natural killer cell therapy)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)治疗(cytotoxic Tlymphocyte therapy)、继细胞转移(adoptive cell transfer)等，但并不限定于此。在本发明中，免疫治疗主要指如上所述的免疫细胞治疗。
本发明的药剂学组合物包含与靶细胞的L1细胞粘附分子抗原结合的抗体或抗原结合片段、或者包含其的表达嵌合抗原受体的效应细胞，因此，可有效诊断或治疗与L1细胞粘附分子的高表达相关的疾病。与上述L1细胞粘附分子的高表达相关的疾病具有癌症和炎症性疾病。
尤其，与上述L1细胞粘附分子的高表达相关的癌症为实体癌，上述实体癌选自由胃癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌(endometrial carcinoma)、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumer)、卵巢癌、黑色素瘤、胆囊癌、肝细胞癌(hepatocelluloar carcinoma)、胆管癌(cholangiocarcinoma)、胰管腺癌(pancreaticductal adenocarcinoma)、食道癌、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、直肠癌、结肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、神经胶质瘤(glioma)、胶质母细胞瘤(glioblastoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)及星形细胞瘤(astrocytoma)组成的组中。
并且，与上述L1细胞粘附分子的高表达相关的炎症性疾病为炎症性肠病(inflammatory bowel disease)，但并不限定于此。
本发明的药剂学组合物可将如上所述的嵌合抗原受体-表达效应细胞，如多个嵌合抗原受体-表达效应细胞与一种以上的制药上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂结合来包含。上述药剂学组合物可包含：缓冲剂，如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；防腐剂。在本发明的一实例中，上述药剂学组合物为了静脉给药而制剂化。
本发明的药剂学组合物可口服给药或非口服给药，例如，可通过静脉内给药、皮下给药、皮内给药、肌肉内给药、腹腔内给药、肿瘤内给药、脑内给药、炉内给药、肺内给药及直肠内给药等给药，但并不限定于此。
本发明的包含效应细胞的药剂学组合物可通过皮肤内注射或皮下注射向患者给药。在一实例中，本发明的药剂学组合物可通过静脉内注射给药。在另一实例中，本发明的药剂学组合物可向肿瘤、淋巴结或感染部位内直接给药。
需要本发明的对象体在移植外周血干细胞后，可接受利用高容量化学疗法的标准治疗。在本发明的一实例中，需要本发明的对象体在移植上述外周血干细胞后或与之同时接受本发明的扩增的嵌合抗原受体T细胞。在另一实例中，扩增的细胞在手术前或手术后给药。
本发明的药剂学组合物的适合“免疫学有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”的剂量可根据如制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、重症程度、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏度的因素确定，通常，熟练的医生可容易确认及处方有效的治疗或预防剂量，可通过临床试验确定适当的剂量。在本说明书中，术语“治疗”是指疾病状态的减少、抑制、镇定或根除。在本说明书中，术语“抗肿瘤”包括肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数量的减少、期待寿命的增加、肿瘤细胞增殖的减少、肿瘤细胞存活率的减少或与癌症相关的各种生理症状，但并不局限于此。
通常，在本申请中记载的包含T细胞的药剂学组合物能够以104细胞/kg体重至109细胞/kg体重的剂量给药，在某些情况下，能够以105细胞/kg体重至106细胞/kg体重(包括上述范围内的所有整数值)的剂量给药。T细胞组合物也能够以上述剂量多次给药。细胞可利用在免疫疗法周知的注入技术给药(例如，参照[Rosenberg et al.,New Eng.J.ofMed.319:1676,1988])。
并且，除如上所述的有效成分之外，本发明的药剂学组合物可与其他药剂学活性药剂及疗法组合来使用。上述“组合”可通过同时给药或结合给药表达。在本申请中记载的嵌合抗原受体-表达效应细胞及至少一个追加治疗剂可同时向相同组合物中或单独的组合物中或者依次给药。为了依次给药，可先给药在本申请中记载的嵌合抗原受体-表达细胞，之后，可给药追加的作用剂，或者，可互换给药顺序。
可与上述本发明的药剂学组合物组合使用的治疗剂具有本领域公知的一种以上的化学治疗剂(例如，天冬酰胺酶、二甲磺酸丁酯、顺羧酸铂、顺氯氨铂、道诺霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等)、一种以上的靶治疗剂(例如，贝伐单抗(bevacizumab)、奥拉帕尼(olaparib)等)、PD-1/PD-L1特异性免疫检查点抑制剂(例如，纳武单抗、派姆单抗)，但并不限定于此。
根据本发明的还有一实施方式，本发明提供癌症或炎症性疾病的治疗方法，其包括向需要治疗的对象体给药表达上述嵌合抗原受体的效应细胞的步骤。
作为本发明的治疗方法的对象疾病的上述癌症及炎症性疾病如与药学组合物的治疗对象疾病相关来定义。
在本发明的一实例中，上述对象体为哺乳动物或人类。
本发明的癌症或炎症性疾病的治疗方法将表达如上所述的嵌合抗原受体的效应细胞作为有效成分共同使用的方法，因此，为了避免本说明书过于复杂，将省略重复内容的记载。
发明的效果
本发明提供与L1细胞粘附分子抗原特异性结合的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段、包含其的嵌合抗原受体以及它们的用途。本发明的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段对于L1细胞粘附分子的特异性及亲和性优秀，因此，可用于治疗及诊断与L1细胞粘附分子的高表达相关的各种癌症及与炎症性疾病相关的疾病。尤其，在将包含本发明的抗-L1细胞粘附分子抗体的嵌合抗原受体表达在T淋巴细胞等效应细胞的情况下，可有用地用作与L1细胞粘附分子相关的各种癌症及炎症性疾病的免疫治疗方法。
附图说明
图1为噬菌体显示文库淘选过程的图。
图2为示出根据噬菌体淘选轮的抗原mL1细胞粘附分子的噬菌体的扩增(enrichiment)程度的图表(上侧图：噬菌体输出效价(phage output titer)，下侧图：洗脱效价比(Elution titer ratio))。
图3a至图3c示出为了筛选与每个噬菌体淘选轮的抗原mL1细胞粘附分子特异性结合的噬菌体克隆而执行单克隆噬菌体酶联免疫吸附试验(monoclonal phage ELISA)的结果。
图4为示出本发明的所筛选的9种scFv克隆的筛选频率的图。
图5为示出以与在本发明中筛选的小鼠L1细胞粘附分子结合的9种独特的(unique)抗-mL1细胞粘附分子scFv克隆为对象对hL1细胞粘附分子执行单克隆噬菌体酶联免疫吸附试验，由此，发现与人L1细胞粘附分子和小鼠L1细胞粘附分子交叉结合的抗体的图。
图6为示出纯化的抗-mL1细胞粘附分子scFv克隆的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果的图。
图7a至图7c为示出根据图5的可溶性(soluble)酶联免疫吸附试验结果的本发明的4种抗-L1细胞粘附分子scFv抗体对于mL1细胞粘附分子及hL1细胞粘附分子抗原的亲和性的图。
图7d至图7e为示出根据八位位组系统(octet system)结果的本发明的4种抗-L1细胞粘附分子scFv抗体对于mL1细胞粘附分子及hL1细胞粘附分子抗原的亲和性的图。
图8为示出为了制备包含本发明的筛选的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体而使用的pMT-嵌合抗原受体质粒的载体图的图。
图9为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应(PCR)扩增过程的示意图。
图10a至图10b为示出在本发明的实施例制备的包含抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-嵌合抗原受体-001、L1-嵌合抗原受体-002、L1-嵌合抗原受体-003及L1-嵌合抗原受体-004)的结构的图。
图11a及图11b为示出引入包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的4种嵌合抗原受体-构建体(L1-嵌合抗原受体-001、L1-嵌合抗原受体-002、L1-嵌合抗原受体-003及L1-嵌合抗原受体-004)的逆转录病毒载体的图。
图12为确认SKOV3细胞和293T细胞中的L1细胞粘附分子表达率的图。
图13a及图13b为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于SKOV3细胞(L1细胞粘附分子高表达，图13a)及293T细胞(L1细胞粘附分子低表达，图13b)的抗癌活性的图。
图14为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体(抗-L1-嵌合抗原受体)表达T细胞的生物体内抗癌活性能力的图。
图15为示出为了制备包含本发明的筛选的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体而使用的pMT-嵌合抗原受体-002质粒的载体图的图。
图16为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图17为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-002)的结构的图。
图18为示出为了制备包含本发明的筛选的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体而使用的pMT-嵌合抗原受体-003质粒的载体图的图。
图19为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图20为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-003)的结构的图。
图21为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图22为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-004)的结构的图。
图23a至图23d为引入包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的4种嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-001、L1-H8-嵌合抗原受体-002、L1-H8-嵌合抗原受体-003及L1-H8-嵌合抗原受体-004)的逆转录病毒载体的图。
图24a至图24g为确认SKOV3细胞、Hela细胞、SH-SY5Y细胞及293T细胞中的L1细胞粘附分子表达率的图。
图25为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于SKOV3细胞(L1细胞粘附分子高表达)的抗癌活性的图。
图26为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于293T细胞(L1细胞粘附分子低表达)的抗癌活性的图。
图27a至图27b为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于SH-SY5Y细胞(L1细胞粘附分子高表达)的抗癌活性的图。
图28a至图28b为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于Hela细胞(L1细胞粘附分子高表达)的抗癌活性的图。
图29为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体(抗-L1-嵌合抗原受体)表达T细胞的生物体内抗癌活性能力的图。
图30为示出为了制备包含本发明的筛选的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体而使用的pMT-嵌合抗原受体-004质粒的载体图的图。
图31为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图32为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-001-28BB)结构的图。
图33为示出为了制备包含本发明的筛选的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体而使用的pBHA-ICOS TM+ICD质粒的载体图的图。
图34为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图35为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-001-28ICOS)的结构的图。
图36为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图37为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-001-28)的结构的图。
图38为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图39为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-001-OX)的结构的图。
图40为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图41为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-001-BB)的结构的图。
图42为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图43为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-001-ICOS)的结构的图。
图44a至图44f为示出引入包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的6种嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-001-28BB、L1-H8-嵌合抗原受体-001-28ICOS、L1-H8-嵌合抗原受体-001-28、L1-H8-嵌合抗原受体-001-OX、L1-H8-嵌合抗原受体-001-BB及L1-H8-嵌合抗原受体-001-ICOS)的逆转录病毒载体的图。
图45a至图45i为确认SKOV3细胞、SH-SY5Y细胞、Hela细胞及293T细胞中的L1细胞粘附分子表达率的图。
图46为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于SKOV3细胞(L1细胞粘附分子高表达)的抗癌活性的图。
图47为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于293T细胞(L1细胞粘附分子低表达)的抗癌活性的图。
图48a至图48c为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于SH-SY5Y细胞(L1细胞粘附分子高表达)的抗癌活性的图。
图49a至图49c为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于Hela细胞(L1细胞粘附分子高表达)的抗癌活性的图。
图50为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子嵌合抗原受体(抗-L1-嵌合抗原受体)表达T细胞的生物体内抗癌活性能力的图。
图51为示出为了制备包含本发明的筛选的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体而使用的pBHA-3E8LS-H8Rev质粒的载体图的图。
图52为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图53为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-005)的结构的图。
图54为示出为了制备包含本发明的筛选的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体而使用的pMT-嵌合抗原受体-005质粒的载体图的图。
图55为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图56为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-006)的结构的图。
图57为示出为了制备本发明的筛选的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体而使用的pMT-嵌合抗原受体-006质粒的载体图的图。
图58为示出用于制备包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体的一系列聚合酶链式反应扩增过程的示意图。
图59为示出包含在本发明的实施例中制备的抗-L1细胞粘附分子scFv的嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-007)的结构的图。
图60a至图60c示出引入包含本发明的抗-L1细胞粘附分子scFv的3种嵌合抗原受体-构建体(L1-H8-嵌合抗原受体-005、L1-H8-嵌合抗原受体-006、L1-H8-嵌合抗原受体-007)的逆转录病毒载体的图。
图61a至图61f为确认SKOV3细胞、SH-SY5Y细胞、Hela细胞及293T细胞中的L1细胞粘附分子表达率的图。
图62为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于SKOV3细胞(L1细胞粘附分子高表达)的抗癌活性的图。
图63为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于SH-SY5Y细胞(L1细胞粘附分子高表达)的抗癌活性的图。
图64为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于Hela细胞(L1细胞粘附分子高表达)的抗癌活性的图。
图65为示出本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞对于293T细胞(L1细胞粘附分子低表达)的抗癌活性的图。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细地说明本发明。这些实施例仅用于更具体地说明本发明，根据本发明的主旨，本发明的范围并不局限于这些实施例，这对普通技术人员而言是显而易见的。
【实施例】
在本说明书全文中，在未额外提及的情况下，为了示出特定物质的浓度而使用的“％”如下：固体/固体为(重量/重量)％，固体/液体为(重量/体积)％，液体/液体为(体积/体积)％。
实施例1：筛选对于L1细胞粘附分子抗原的scFv抗体
1.1.人合成scFv噬菌体显示(phage display)抗体文库淘选
为了筛选与小鼠L1细胞粘附分子(mouse L1细胞粘附分子，mL1细胞粘附分子)抗原结合的抗-mL1细胞粘附分子scFv抗体，利用人合成scFv噬菌体显示文库(KscFv-1，KBIOHEALTH)将对于抗原mL1细胞粘附分子蛋白的噬菌体淘选进行4轮(图1)。将抗原mL1细胞粘附分子蛋白(R&D system，Cat No.5674-NC)添加于免疫管(immunotube)后，在4℃的温度下培养一夜，之后，利用5％的含脱脂乳(skim milk)的磷酸盐缓冲液(MPBS)在常温条件下反应1小时，并进行封闭过程。向KscFv-1添加含脱脂乳的磷酸盐缓冲液后，在常温条件下反应1小时，从而准备了封闭的噬菌体(blocked phage)。将封闭的噬菌体添加至涂敷抗原mL1细胞粘附分子蛋白的免疫管，在37℃的温度下反应90分钟。利用含0.05％的吐温20(tween20)的磷酸盐缓冲液清洗后，添加100mM的三甲胺(trimethylamine)，从而，获取(elution)了附着在免疫管的噬菌体(phage)。向获取的噬菌体添加1M的Tris-HCl并中和(neutralization)后，添加以对数生长中期(mid-log phase)(OD600＝0.5～1.0)状态培养的TG1大肠杆菌(E.coli)(Lucigen，Cat No.60502-2)，并在37℃的温度下培养1小时。培养后，收集细胞团块(cell pellet)并接种在含氨苄青霉素(ampicillin)和2％的葡萄糖(glucose)的TB培养基板。收集培养的菌落并添加50％的甘油(glycerol)，在-80℃的温度下保存。抗原mL1细胞粘附分子蛋白(R&D system，Cat No.5674-NC)与Fc结构域融合，因此，在淘选步骤中，同时进行Fc损耗(Fc depletion)的Fc对照(Fc control)淘选，在每个轮比较各个输出效价(output titer)，通过洗脱效价比(elution titer ratio)监测噬菌体的富集(enrichment)。上述洗脱效价比为噬菌体输出效价(抗原(antigen)mL1细胞粘附分子)值除以Fc对照输出效价(无抗原(no antigen)mL1细胞粘附分子)的值。如图2所示，噬菌体淘选从第二轮开始在Fc对照和输出效价示出大的差异，噬菌体淘选从第二轮开始富集，在噬菌体淘选第二轮中，相对于对照组，对于抗原mL1细胞粘附分子示出约23.9倍的差异，在噬菌体淘选第三轮中，示出66.1倍的差异，在噬菌体淘选第四轮中，示出141.4倍的差异。
1.2.噬菌体酶联免疫吸附试验筛查(Phage ELISA screening)
为了从在噬菌体淘选中获取的多个噬菌体中筛选与抗原mL1细胞粘附分子蛋白特异性附着的克隆，以在第二轮淘选、第三轮淘选、第四轮淘选中获取的各个95个克隆为对象执行了单克隆噬菌体酶联免疫吸附试验。
具体地，向96孔板添加抗原mL1细胞粘附分子蛋白并在4℃的温度下培养一夜后，利用2％的含脱脂乳的磷酸盐缓冲液在37℃的温度下封闭2小时。抗原mL1细胞粘附分子蛋白与Fc结构域融合，因此，作为Fc对照，将Fc也添加至96孔板并在4℃的温度下培养一夜后，利用2％的含脱脂乳的磷酸盐缓冲液在37℃的温度下封闭2小时。之后，向上述96孔板添加噬菌体(～1011cfu)。在常温条件下反应90分钟后，以1∶5000的比例将HRP-抗-M13(SinoBiological，Cat No.11973-MM05)稀释在磷酸盐缓冲液并添加至96孔板。在常温条件下反应1小时后，依次添加TMB底物(TMB substrate)(Sigma，Cat No.T0440)和2N浓度的H2SO4(Merck，Cat No.100731)，并在450nm中测定吸光度(absorbance)(OD)。结果，经确认，当对于抗原mL1细胞粘附分子，将吸光度(A450 nm)截止值(cut-off)分别设置为0.4以上来进行筛选时，第二轮中1个、第三轮中共26个、第四轮中共9个克隆在酶联免疫吸附试验中与抗原mL1细胞粘附分子特异性结合(阳性)(图3)。
1.3.对于本发明的mL1细胞粘附分子抗原的独特的scFv克隆的序列分析
对在单克隆噬菌体酶联免疫吸附试验中示出阳性反应的与抗原mL1细胞粘附分子有关的36种scFv克隆进行序列分析(sequencing)，之后，通过下述卡巴特编号(Kabatnumbering)整列(alignment)序列并分组(grouping)，结果，获取了共9种独特的抗-mL1细胞粘附分子scFv克隆(表1及表2)。从对于抗原mL1细胞粘附分子获取的scFv克隆地筛选频率(frequency)可知，第三轮克隆(mL1细胞粘附分子-3R-H8、mL1细胞粘附分子-3R-E1、mL1细胞粘附分子-3R-C9)分别为33％、26％、16％，被筛选为多数克隆，剩余克隆在3～10％的范围内，被筛选为少数克隆(图4)。
表1
本发明的所筛选的9种抗-mL1细胞粘附分子scFv克隆的重链可变区及连接肽的氨基酸序列(Kabat)
Figure BDA0003026018450000201
Figure BDA0003026018450000211
-1：mL1细胞粘附分子-3R-H8_：mL1细胞粘附分子-3R-E6_：mL1细胞粘附分子-3R-G10_：mL1细胞粘附分子-3R-B5_：mL1细胞粘附分子-3R-H3_：mL1细胞粘附分子-3R-G5_：mL1细胞粘附分子-3R-C12_：mL1细胞粘附分子-3R-G8_：mL1细胞粘附分子-3R-G4_：mL1细胞粘附分子-4R-D5_
-2：mL1细胞粘附分子-3R-C9_：mL1细胞粘附分子-3R-B8_：mL1细胞粘附分子-3R-B4_：mL1细胞粘附分子-3R-B6_：mL1细胞粘附分子-3R-D6_
-3：mL1细胞粘附分子-3R-E1_：mL1细胞粘附分子-3R-C6_：mL1细胞粘附分子-3R-C11_：mL1细胞粘附分子-3R-H6_：mL1细胞粘附分子-3R-F3_：mL1细胞粘附分子-4R-E11_：mL1细胞粘附分子-4R-F4_：mL1细胞粘附分子-4R-H6_
-4：mL1细胞粘附分子-3R-F6_：mL1细胞粘附分子-3R-G2_：mL1细胞粘附分子-3R-E7_
-5：mL1细胞粘附分子-3R-F1_
-6：mL1细胞粘附分子-3R-G6_
-7：mL1细胞粘附分子-3R-A2_
-8：mL1细胞粘附分子-3R-E9_
-9：mL1细胞粘附分子-2R-F8_
其中，上述以粗体标记的克隆ID是指代表各个组的克隆ID。
表2
本发明的所筛选的9种抗-mL1细胞粘附分子scFv克隆的轻链可变区的氨基酸序列(Kabat)
Figure BDA0003026018450000221
Figure BDA0003026018450000231
-1：mL1细胞粘附分子-3R-H8_：mL1细胞粘附分子-3R-E6_：mL1细胞粘附分子-3R-G10_：mL1细胞粘附分子-3R-B5_：mL1细胞粘附分子-3R-H3_：mL1细胞粘附分子-3R-G5_：mL1细胞粘附分子-3R-C12_：mL1细胞粘附分子-3R-G8_：mL1细胞粘附分子-3R-G4_：mL1细胞粘附分子-4R-D5_
-2：mL1细胞粘附分子-3R-C9_：mL1细胞粘附分子-3R-B8_：mL1细胞粘附分子-3R-B4_：mL1细胞粘附分子-3R-B6_：mL1细胞粘附分子-3R-D6_
-3：mL1细胞粘附分子-3R-E1_：mL1细胞粘附分子-3R-C6_：mL1细胞粘附分子-3R-C11_：mL1细胞粘附分子-3R-H6_：mL1细胞粘附分子-3R-F3_：mL1细胞粘附分子-4R-E11_：mL1细胞粘附分子-4R-F4_：mL1细胞粘附分子-4R-H6_
-4：mL1细胞粘附分子-3R-F6_：mL1细胞粘附分子-3R-G2_：mL1细胞粘附分子-3R-E7_
-5：mL1细胞粘附分子-3R-F1_
-6：mL1细胞粘附分子-3R-G6_
-7：mL1细胞粘附分子-3R-A2_
-8：mL1细胞粘附分子-3R-E9_
-9：mL1细胞粘附分子-2R-F8_
其中，上述以粗体标记的克隆ID是指代表各个组的克隆ID。
1.4.发现与人L1细胞粘附分子(hL1CAM)及小鼠L1细胞粘附分子(mL1CAM)交叉结合的scFv抗体
为了发现与人L1细胞粘附分子(hL1CAM，R&D system，Cat No.777-NC)和小鼠L1细胞粘附分子交叉结合的抗体，以共9种对于抗原hL1细胞粘附分子的独特的抗-mL1细胞粘附分子scFv克隆为对象执行单克隆噬菌体酶联免疫吸附试验。结果，当对于抗原hL1细胞粘附分子，将吸光度(A450 nm)截止值分别设置为0.4以上来进行筛选时，确认了共4个克隆(mL1细胞粘附分子-3R-H8、mL1细胞粘附分子-3R-C9、mL1细胞粘附分子-3R-E1、mL1细胞粘附分子-3R-E9)与hL1细胞粘附分子交叉结合(图5)(表3及表4)。
表3
本发明的最终筛选的4种抗-L1细胞粘附分子scFv克隆的重链可变区及连接肽的氨基酸序列(Kabat)
Figure BDA0003026018450000232
Figure BDA0003026018450000241
-1：mL1细胞粘附分子-3R-H8_：mL1细胞粘附分子-3R-E6_：mL1细胞粘附分子-3R-G10_：mL1细胞粘附分子-3R-B5_：mL1细胞粘附分子-3R-H3_：mL1细胞粘附分子-3R-G5_：mL1细胞粘附分子-3R-C12_：mL1细胞粘附分子-3R-G8_：mL1细胞粘附分子-3R-G4_：mL1细胞粘附分子-4R-D5_-2：mL1细胞粘附分子-3R-C9_：mL1细胞粘附分子-3R-B8_：mL1细胞粘附分子-3R-B4_：mL1细胞粘附分子-3R-B6_：mL1细胞粘附分子-3R-D6_
-3：mL1细胞粘附分子-3R-E1_：mL1细胞粘附分子-3R-C6_：mL1细胞粘附分子-3R-C11_：mL1细胞粘附分子-3R-H6_：mL1细胞粘附分子-3R-F3_：mL1细胞粘附分子-4R-E11_：mL1细胞粘附分子-4R-F4_：mL1细胞粘附分子-4R-H6_
-8：mL1细胞粘附分子-3R-E9_
其中，上述以粗体标记的克隆ID是指代表各个组的克隆ID。
表4
本发明的最终筛选的4种抗-L1细胞粘附分子scFv克隆的轻链可变区的氨基酸序列(Kabat)
Figure BDA0003026018450000242
Figure BDA0003026018450000251
-1：mL1细胞粘附分子-3R-H8_：mL1细胞粘附分子-3R-E6_：mL1细胞粘附分子-3R-G10_：mL1细胞粘附分子-3R-B5_：mL1细胞粘附分子-3R-H3_：mL1细胞粘附分子-3R-G5_：mL1细胞粘附分子-3R-C12_：mL1细胞粘附分子-3R-G8_：mL1细胞粘附分子-3R-G4_：mL1细胞粘附分子-4R-D5_
-2:mL1细胞粘附分子-3R-C9_：mL1细胞粘附分子-3R-B8_：mL1细胞粘附分子-3R-B4_：mL1细胞粘附分子-3R-B6_：mL1细胞粘附分子-3R-D6_
-3:mL1细胞粘附分子-3R-E1_：mL1细胞粘附分子-3R-C6_：mL1细胞粘附分子-3R-C11_：mL1细胞粘附分子-3R-H6_：mL1细胞粘附分子-3R-F3_：mL1细胞粘附分子-4R-E11_：mL1细胞粘附分子-4R-F4_：mL1细胞粘附分子-4R-H6_
-8：mL1细胞粘附分子-3R-E9_
其中，上述以粗体标记的克隆ID是指代表各个组的克隆ID。
1.5.与本发明的人L1细胞粘附分子及小鼠L1细胞粘附分子交叉结合的4种独特的scFv克隆的大肠杆菌表达及纯化
在将通过交叉结合性评价及单克隆噬菌体酶联免疫吸附试验获取的共4种独特的抗-mL1细胞粘附分子scFv克隆克隆在大肠杆菌(E.coli)表达载体(pKFAB,KBIOHEALTH)后，在200mL的TB培养基通过0.5μM的IPTG诱导表达，在30℃的温度下培养一夜后，通过周质蛋白提取(periplasmic protein extraction)获取可溶性蛋白后，通过利用strep tag II柱的亲和色谱法(affinity chromatography)进行纯化。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析确认了所纯化的各个克隆的表达(图6)。
1.6.亲和性(Affinity)分析
通过利用在本发明中筛选及纯化的抗-L1细胞粘附分子scFv(4种)抗体蛋白的可溶性酶联免疫吸附试验比较分析与L1细胞粘附分子蛋白结合的各个克隆的亲和性。
具体地，向96孔板添加抗原mL1细胞粘附分子蛋白或抗原hL1细胞粘附分子蛋白，在4℃的温度下培养一夜后，利用2％的含脱脂乳的磷酸盐缓冲液在常温条件下封闭1小时。之后，添加所纯化的抗-L1细胞粘附分子scFv抗体蛋白。在常温条件下反应90分钟后，以1∶5000的比例将HRP-抗-StrepMAB(IBA，Cat No.2-1509-001)稀释在2％的含脱脂乳的磷酸盐缓冲液中并添加。在常温条件下反应1小时后，依次添加TMB底物(Sigma，Cat No.T0440)及2N的H2SO4(Merck，Cat No.100731)，并在450nm中测定吸光度(OD)。结果，经确认，本发明的各个克隆以5nM(mL1细胞粘附分子-3R-C9)～50nM(mL1细胞粘附分子-3R-E1)范围的亲和性与抗原mL1细胞粘附分子结合。并且，比较分析对于hL1细胞粘附分子蛋白的亲和性的结果，本发明的各个克隆以2nM(mL1细胞粘附分子-3R-H8)～20.87μM(mL1细胞粘附分子-3R-E9)范围的亲和性与抗原hL1细胞粘附分子结合(图7a～图7c)。当本发明的4种交叉结合克隆的结合力针对各个L1细胞粘附分子综合比较时，发现以H8＞E1＞C9＞E9的顺序高。
对于4种抗-L1细胞粘附分子scFv中示出最高结合力的3R-H8克隆，进行转化(conversion)过程来确保了完整(whole)IgG1抗体。通过利用所纯化的完整IgG1抗体的八位位组系统(Forte Bio，Model No.QK384)分析了与抗原hL1细胞粘附分子(Sinobiological，Cat No.10140-H08H)蛋白或mL1细胞粘附分子(R&D，Cat No.5674-NC)蛋白的抗原-抗体亲和力。结果，经确认，与抗原hL1细胞粘附分子蛋白具有4.14E-09KD(M)的结合力，与抗原mL1细胞粘附分子蛋白具有2.05E-08KD(M)的结合力(图7d～图7e)。
实施例2.抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体基因表达T细胞制备及功效确认
2.1.抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体基因确保
2.1.1.抗-mL1细胞粘附分子scFv抗体基因的确保
通过利用Lac启动子-正向引物(Lac promoter-forward primer)的序列分析从包含在本发明中筛选的抗-L1细胞粘附分子scFv的克隆的噬菌粒(phagemid)确保了抗-L1细胞粘附分子scFv克隆的碱基序列(表5)。以所分析的碱基序列为基础制备了正向引物(forward primer)和反向引物(reverse primer)，以上述噬菌粒为模板通过聚合酶链式反应方法扩增来确保了聚合酶链式反应生成物。以所确保的抗-L1细胞粘附分子scFv抗体的聚合酶链式反应生成物为模板利用序列68(表6)的引物和序列69(表6)的引物且通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与抗-L1细胞粘附分子scFv抗体可变重链(variable heavy chain；VH)的5’部位结合的引物具有作为小鼠的单克隆IgG的3E8抗体的前导序列的12个碱基序列，与抗-L1细胞粘附分子scFv抗体可变轻链(variable lightchain；VL)的3’部位结合的引物具有IgD铰链的12个碱基序列。因此，通过上述引物扩增的聚合酶链式反应生成物具有3E8 LS-scFv-IgD铰链碱基序列。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
表5
对本发明的最终筛选的4种抗-L1细胞粘附分子scFv克隆进行编码的核甘酸序列(Kabat)
Figure BDA0003026018450000261
Figure BDA0003026018450000271
Figure BDA0003026018450000281
表6
Figure BDA0003026018450000282
2.1.2. 3E8抗体的前导序列基因确保
以包含3E8抗体的前导序列的pMT-嵌合抗原受体质粒(图8)为模板，利用序列70(表6)的引物和序列71(表6)的引物并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与3E8前导序列的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列，与3E8前导序列的3’部位结合的引物具有抗-L1细胞粘附分子scFv抗体可变重链的12个碱基序列。因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8LS-scFv的碱基序列。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
2.1.3.人IgD的铰链区、跨膜结构域、细胞内信号转导结构域、共刺激结构域及CD3ζ的基因确保
为了制备本发明的嵌合抗原受体-构建体，通过如下的方法确保了作为人IgD的铰链区、CD28的跨膜结构域(transmembrane domain，TM)、细胞内信号转导结构域(intracellular signaling domain，ICD)、共刺激结构域的OX40及CD3ζ基因。
首先，以pMT-嵌合抗原受体质粒(图8)为模板，利用序列72(表6)的引物和序列73(表6)的引物并通过聚合酶链式反应方法扩增。在此情况下，与人IgD铰链区的5’部位结合的引物包含抗-L1细胞粘附分子scFv抗体可变轻链的12个碱基序列，与CD3ζ的3’部位结合的引物包含XhoI限制酶碱基序列。因此，通过上述引物扩增的聚合酶链式反应生成物具有scFv-IgD hinge-CD28TM-ICD-OX40-CD3ζ-Xho I碱基序列(表7)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
表7
用于构建本发明的嵌合抗原受体构建体的前导序列、铰链、跨膜结构域、细胞内信号转导结构域、共刺激结构域及CD3ζ基因序列
Figure BDA0003026018450000291
2.1.4.pGemT-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体载体制备
以在上述2.1.2中扩增的作为聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-scFv和在上述2.1.1中扩增的作为聚合酶链式反应生成物的3E8 LS-scFv-IgD hinge为模板，利用序列70(表6)的引物和序列69(表6)的引物并通过重叠延伸聚合酶链式反应(OE-PCR，overlapextension PCR)方法扩增。
结果，以所扩增的作为聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-scFv-IgD hinge和在上述2.1.3中扩增的作为聚合酶链式反应生成物的scFv-IgD hinge-CD28 TM-ICD-OX40-CD3ζ-XhoI为模板，利用序列70(表6)的引物和序列73(表6)的引物并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图9)。结果，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有MluI-3E8 LS-scFv-IgD hinge-CD28 TM-ICD-OX40-CD3ζ-XhoI的碱基序列。将所扩增的聚合酶链式反应生成物与在直线形脱氧核糖核酸(DNA)的两端具有多重T序列的pGemT EASY载体(Promega，WI，USA)连接，由此，获取了嵌合抗原受体构建体pGemT-L1-嵌合抗原受体-001、pGemT-L1-嵌合抗原受体-002、pGemT-L1-嵌合抗原受体-003及pGemT-L1-嵌合抗原受体-004。通过分析所获取的嵌合抗原受体构建体序列分析，确认了与原始序列相同(图10a～图10b)。上述序列分析中使用序列74及序列75(表6)的引物对。
2.1.5.pMT-L1-嵌合抗原受体逆转录病毒载体制备
对4种pGemT-L1-嵌合抗原受体载体处理Mlu I和Xho I限制酶来获取了脱氧核糖核酸片段。将所获取的脱氧核糖核酸片段与事先利用Mlu I和Xho I限制酶处理的pMT逆转录病毒载体(美国授权专利第US7049143号)连接，由此，制备了4种pMT-L1-嵌合抗原受体逆转录病毒载体(图11)。通过上述方式制备的pMT-L1-嵌合抗原受体逆转录病毒载体包含在MLV长末端重复序列启动子的调解下对抗-L1-嵌合抗原受体进行编码的序列。
2.2.抗-L1-嵌合抗原受体基因表达T细胞制备
2.2.1.抗-L1-嵌合抗原受体基因表达逆转录病毒(抗-L1-嵌合抗原受体逆转录病毒)制备
利用质粒脱氧核糖核酸转化法制备了用于传递抗-L1-嵌合抗原受体基因的逆转录病毒(Soneoka Y et al.,1995)。利用了TransIT 293转化系统(Mirus Bio LLC，WI，USA)，根据制造商的协议执行。向前一天以1×106个接种在60mm培养皿的293T细胞株转化在上述2.1中制备的各个pMT-L1-嵌合抗原受体逆转录病毒载体(pMT-L1-嵌合抗原受体-001、pMT-L1-嵌合抗原受体-002、pMT-L1-嵌合抗原受体-003及pMT-L1-嵌合抗原受体-004)、gag-pol表达载体及RD114 env表达载体后，将细胞培养约48小时。培养结束后，获取所有细胞培养液并利用0.45μm过滤器进行过滤。利用逆转录病毒效价测定试剂盒(retrovirus titer set)(TaKaRa，JAPAN)并通过实时聚合酶链式反应测定效价后，到使用之前为止，在-80℃的温度下冷冻保存所生产的4种抗-L1-嵌合抗原受体逆转录病毒。
2.2.2.抗-L1-嵌合抗原受体基因表达T细胞制备
利用SepMateTM-50(STEMCELL)和Ficoll-Paque PLUS(GE healthcare，Sweden)从捐赠的人血获取了单核细胞。单核细胞将包含5％的人血清的AIMV培养基(Invitrogen)用作培养液，以1×107个接种在100mm的培养皿后，每毫升(mL)添加50ng的抗-CD3(OKT3，eBioscience)抗体，由此，活化T细胞。为了T细胞的生长，向培养液每毫升添加300U的人IL-2(R&D)并培养。培养48小时后，获取活化的T细胞并用于传递4种抗-L1-嵌合抗原受体逆转录病毒。
向6孔板以每孔2mL的量添加以10μg/mL的浓度准备的重组人纤维连接蛋白(retronectin，TaKaRa，Japan)后，在常温条件下反应2小时并涂敷在板。反应后，去除残留重组人纤维连接蛋白，以每孔2mL的量添加包含2.5％的牛血清白蛋白(BSA，bovine serumalbumin)的磷酸盐缓冲液(PBS，phosphate-buffered saline)，在常温条件下反应30分钟来封闭。反应后，去除在进行封闭时使用的溶液，以每孔3mL的量添加包含2.5％的1M HEPES的HBSS并清洗。利用以每孔3×1010的份数(copies)包含5％的人血清的AIMV培养基稀释抗-L1-嵌合抗原受体逆转录病毒并添加4mL，之后，在2000xg、32℃的条件进行2小时的离心分离，由此，将逆转录病毒固定在重组人纤维连接蛋白。向所要用作对照组的孔添加等量的用于稀释逆转录病毒的培养基。反应后，去除残留逆转录病毒，以每孔2×106的数量添加活化的T细胞后，在1000xg的条件下进行15分钟内的离心分离，由此，向T细胞传递抗-L1-嵌合抗原受体逆转录病毒。为了提高传递效率，第二天反复一次传递过程，共进行两次。传递24小时后，获取所有T细胞来利用包含5％的人血清和300U/mL的人IL-2的AIMV培养基以每毫升5×105个在T烧瓶传代培养。每隔3天～4天以每毫升5×105个进行传代培养，并保持每毫升不大于2×106个。
所要确认抗-L1-嵌合抗原受体是否在传递抗-L1-嵌合抗原受体逆转录病毒的活化T细胞(抗-L1-嵌合抗原受体表达T)表达。在培养第8天和第20天，准备1×106个的细胞，并在4℃的温度下与附着有生物素(biotin)的重组蛋白L(protein L)(Genescript，CatNo.M00097)反应45分钟。反应后，在4℃的温度下与附着有藻红蛋白(phycoerythrin)的链霉抗生素蛋白(streptavidin)(BD，Cat No.554061)反应30分钟，并利用流式细胞术(flowcytometry)确认抗-L1-嵌合抗原受体表达率。结果，虽根据供体具有差异，在培养第8天，确认了约19.9％～67.2％的抗-L1-嵌合抗原受体表达率，在培养第20天，确认了约34.5％～94.9％的抗-L1-嵌合抗原受体表达率(表8)。
表8
确认抗-L1-嵌合抗原受体表达T细胞表面中的抗-L1-嵌合抗原受体表达率
Figure BDA0003026018450000311
2.3.抗-L1-嵌合抗原受体基因表达T细胞的抗癌活性能力确认
2.3.1.靶细胞中的L1细胞粘附分子表达率确认
作为人卵巢腺癌细胞株的SKOV3以高表达作为本发明的抗原的L1细胞粘附分子而周知，是适合确认本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力的细胞株。为确认其，在100μL的磷酸盐缓冲液以5×105个准备SKOV3细胞株，添加0.25μg的抗-hCD171-PE(5G3 clone)(eBioscience，Cat No.12-1719-42)抗体后，在4℃的温度下反应30分钟。反应后，利用磷酸盐缓冲液清洗两次细胞，并利用流式细胞术确认L1细胞粘附分子表达。结果，在SKOV3癌细胞中，确认了约74％的L1细胞粘附分子表达率。相反，利用相同的方法在作为人胚肾细胞的293T中确认L1细胞粘附分子的表达的结果，确认了约3％的表达率(图12)。
2.3.2.对于靶细胞的L1细胞粘附分子表达T细胞的抗癌活性能力确认
为了确认对于靶细胞(target细胞，T)的本发明的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体(抗-L1-嵌合抗原受体)表达T细胞(effector细胞，E)的抗癌活性能力，使用xCELLigence实时细胞分析(xCELLigence Real-Time Cell Analysis，RTCA)法。在xCELLigence实时细胞分析法中，在涂敷有黄金微电极生物传感器(gold microelectrodebiosensor)的板包含导电性溶液(例：培养基)的情况下，以指数(index)值数值化电子流动来示出，在靶细胞附着在板的情况下，指数值因妨碍电子流动而发生变化。当添加嵌合抗原受体表达T细胞(CAR-T)时，由于细胞杀伤能力，所附着的靶细胞从板掉落，可通过分析指数值的变化来确认抗癌活性能力(细胞毒性(cytotoxicity))。在50μL的培养基以1×104个准备靶细胞，并添加至分析用板。21小时后，在50μL的包含人血清和和人IL-2的AIMV培养基以1×104个、5×104个、1×105个(E∶T比例＝1、5、10)准备抗-L1-嵌合抗原受体表达T细胞，并添加至包含靶细胞的孔，实时确认细胞指数值50小时。并且，准备仅包含靶细胞的孔，通过下述式计算抗-L1-嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力。
式
细胞毒性(％)＝{(靶细胞孔的指数值)－(靶细胞与T细胞反应孔的指数值)}/(靶细胞孔的指数值)×100
结果，相比于不表达嵌合抗原受体的T细胞(对照组)，本发明的4种抗-L1-嵌合抗原受体表达T细胞中的L1-嵌合抗原受体-004在SKOV3细胞中示出高的细胞杀伤能力。L1-嵌合抗原受体-001具有根据供体的差异，但是，相比于对照组，在SKOV3细胞中示出细胞杀伤能力(图13a)。并且，在示出低的L1细胞粘附分子表达率的293T细胞中，4种均示出低于对照组的细胞杀伤能力(图13b)。因此，本发明的抗-L1-嵌合抗原受体表达T细胞对于以高水平表达L1细胞粘附分子抗原的靶癌细胞示出抗癌活性，因此，可有用地用作抗癌用途的细胞治疗剂。
实施例3.生物体内的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体基因表达T细胞的功效(体内)确认
为了确认生物体内的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体基因表达T细胞的抗癌活性能力，利用诱发癌症的动物模型。在缺乏T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)的NOD/SCID小鼠(7周龄，雌性)的右侧肋下的皮下(subcutaneous，SC)给药3×106个的以1∶1的比例与基质胶(Matrigel)混合的SKOV3癌细胞(Target，T)来诱发癌症。在癌细胞给药3天后，向各个NOD/SCID小鼠一天给药一次两种在体体外确认功效的作为抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞的L1-嵌合抗原受体-002和L1-嵌合抗原受体-004及对照组T细胞，共给药3次。当每次给药时，尾静脉(intravenous，IV)给药2×107个的T细胞，直至第25天测定癌症的大小。结果，相比于对照组T细胞给药组，在两种抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞均确认癌症生长速度受到抑制(图14)。尤其，相比于L1-嵌合抗原受体-002，通过L1-嵌合抗原受体-004中的癌症生长速度被显著抑制来确认了生物体内的L1-嵌合抗原受体-004的功效更优秀。
实施例4.各种间隔域(spacer domain)结构的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体基因表达T细胞制备及功效确认
4.1.各种间隔域结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因确保
4.1.1.抗-mL1细胞粘附分子scFv抗体基因选择
通过在实施例3中进行的抗癌活性能力确认实验，确认了L1-嵌合抗原受体-004的癌症生长抑制效果最优秀。通过确保对L1-嵌合抗原受体-004(图10b)的L1细胞粘附分子特异性抗体的重链可变区和轻链可变区进行编码的多核苷酸的碱基序列来用于确保下一个基因，之后，以pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001标记pMT-L1-嵌合抗原受体-004。
4.1.2.L1-H8-嵌合抗原受体-002基因确保
4.1.2.1. 3E8抗体的前导序列、抗-mL1细胞粘附分子scFv抗体基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列70(表9)和序列69(表9)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与3E8前导序列的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列和3E8前导序列的18个碱基序列，与L1-H8 scFv的3’部位结合的引物具有hIgD铰链的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8LS-L1-H8 scFv-hIgD铰链的碱基序列(表10)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
表9
所使用的引物的碱基序列信息
Figure BDA0003026018450000331
表10
前导序列、L1-H8 scFv、铰链、CH3、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因序列
Figure BDA0003026018450000332
Figure BDA0003026018450000341
Figure BDA0003026018450000351
4.1.2.2.铰链、CH3、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将包含人IgD的铰链和IgG1的铰链、CH3、CD28的TM和ICD、作为共刺激结构域的OX40及CD3ζ-iso1的pMT-嵌合抗原受体-002质粒(图15)作为模板，利用引物序列72(表9)和序列73(表9)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与hIgD铰链的5’部位结合的引物具有L1-H8 scFv抗体可变轻链的12个碱基序列，与CD3ζ-iso1的3’部位结合的引物具有Xho I限制酶碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有L1-H8 scFv-IgDhinge-IgG1hinge-CH3-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表10)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
4.1.2.3. 3E8前导序列、L1-H8 scFv、铰链、CH3、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-IgD铰链和L1-H8-scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CH3-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物序列70(表9)和序列73(表9)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图16)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8-L1-H8scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CH3-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-002的结构(图17)。
4.1.3.L1-H8-嵌合抗原受体-003基因确保
4.1.3.1. 3E8抗体的前导序列、抗-mL1细胞粘附分子scFv抗体基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列70(表9)和序列69(表9)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与3E8前导序列的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列和3E8前导序列的18个碱基序列，与L1-H8 scFv的3’部位结合的引物具有hIgD铰链的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8LS-L1-H8 scFv-hIgD铰链的碱基序列(表100)。扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
4.1.3.2.铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将包含人IgD的铰链和IgG1的铰链、CD28的TM和ICD、作为共刺激结构域的OX40及CD3ζ-iso1的pMT-嵌合抗原受体-003质粒(图18)作为模板，利用引物序列72(表9)和序列73(表9)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与hIgD铰链的5’部位结合的引物具有L1-H8 scFv抗体可变轻链的12个碱基序列，与CD3ζ-iso1的3’部位结合的引物具有Xho I限制酶碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有L1-H8 scFv-IgDhinge-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表10)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
4.1.3.3. 3E8前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-IgD铰链和L1-H8-scFv-IgD hinge-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物序列70(表9)和序列73(表9)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图19)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8-L1-H8 scFv-IgD hinge-IgG1hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-003的结构(图20)。
4.1.4.L1-H8-嵌合抗原受体-004基因确保
4.1.4.1. 3E8抗体的前导序列、抗-mL1细胞粘附分子scFv抗体基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列70(表9)和序列83(表9)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与3E8前导序列的5’包围结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列和3E8前导序列的18个碱基序列，与L1-H8 scFv的3’部位结合的引物具有hIgG1铰链的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgG1铰链的碱基序列(表10)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
4.1.4.2.铰链、CH3、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将包含IgG1的铰链、CH3、CD28的TM和ICD、作为共刺激结构域的OX40及CD3ζ-iso1的pMT-嵌合抗原受体-002质粒(图15)作为模板，利用引物序列84(表9)和序列73(表9)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与hIgG1铰链的5’部位结合的引物具有L1-H8 scFv抗体可变轻链的12个碱基序列，与CD3ζ-iso1的3’部位结合的引物具有Xho I限制酶碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有L1-H8 scFv-IgG1 hinge-CD28TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表10)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
4.1.4.3. 3E8前导序列、L1-H8 scFv、铰链、CH3、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-IgG1铰链和L1-H8 scFv-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物序列70(表9)和序列73(表9)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图21)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8-L1-H8 scFv-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-004的结构(图22)。
4.1.5.pMT-L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒载体制备
利用Mlu I和Xho I限制酶对3种扩增的聚合酶链式反应生成物进行处理来获取了脱氧核糖核酸片段。将所获取的脱氧核糖核酸片段与事先利用Mlu I和Xho I限制酶处理的pMT逆转录病毒载体(美国授权专利第US6451595号)连接，由此，制备了3种pMT-L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒载体(图23)。通过上述方式制备的pMT-L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒载体在MLV LTR启动子的调节下包含对L1-H8-嵌合抗原受体进行编码的序列。
4.2.各种间隔域结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因表达逆转录病毒(L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒)制备
通过质粒脱氧核糖核酸转化法制备用于传递L1-H8-嵌合抗原受体基因的逆转录病毒(Soneoka Y et al.，1995)。利用了TransIT 293转化系统(Mirus Bio LLC，WI，USA)，根据制造商的协议执行。前一天以1×106个向60mm培养皿接种的293T细胞株转化4种pMT-L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒载体、gag-pol表达载体及RD114 env表达载体，将细胞培养约48小时。培养结束后，获取所有细胞培养液并利用0.45μm过滤器进行过滤。利用逆转录病毒滴度测定试剂盒(retrovirus titer set kit)(TaKaRa，JAPAN)通过实时聚合酶链式反应测定效价后，到使用之前为止，在-80℃的温度下冷冻保存所生产的4种L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒。
4.3.各种间隔域结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因表达T细胞制备
利用SepMateTM-50(STEMCELL)和Ficoll-Paque PLUS(GE healthcare，Sweden)从捐赠的人血获取了单核细胞。单核细胞将包含5％的人血清的AIMV培养基(Invitrogen)用作培养液，以1×107个接种在100mm培养皿后，每毫升添加50ng的抗-CD3(OKT3，eBioscience)抗体，由此，活化T细胞。为了T细胞的生长，向培养液每毫升添加300U的人IL-2(R&D)并培养。培养48小时后，获取活化的T细胞并用于传递4种L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒。
向6孔板以每孔2mL的量添加以10ug/mL的浓度准备的重组人纤维连接蛋白(TaKaRa，Japan)后，在常温条件下反应2小时并涂敷在板。反应后，去除重组人纤维连接蛋白，以每孔2mL的量添加包含2.5％的人白蛋白的磷酸盐缓冲液，在常温条件下反应30分钟来封闭。反应后，去除在进行封闭时使用的溶液，以每孔3mL的量添加包含2.5％的1M HEPES的HBSS并清洗。利用以每孔3×1010的分数包含5％的人血清的AIMV培养基稀释L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒并添加4mL，之后，在2000xg、32℃的条件进行2小时的离心分离，由此，将逆转录病毒固定在重组人纤维连接蛋白。向所要用作对照组的孔添加等量的用于稀释逆转录病毒的培养基。反应后，去除逆转录病毒，以每孔2×106的数量添加活化的T细胞后，在1000xg的条件下进行15分钟的离心分离，由此，向T细胞传递L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒。为了提高传递效率，第二天反复一次传递过程，共进行两次。传递24小时后，获取所有T细胞来利用包含5％的人血清和300U/mL的人IL-2的AIMV培养基以美好生活5×105个在T烧瓶传代培养。每隔3天～4天以每毫升5×105个进行传代培养，并保持每毫升不大于2×106个。
所要确认L1-H8-嵌合抗原受体是否在传递L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒的活化T细胞(L1-H8-嵌合抗原受体表达T)表达。在培养第1周和第2周，准备1×106个细胞，并在4℃的温度下与附着有异硫氰酸荧光素(FITC)的重组蛋白L(ACROBiosystems，Cat No.RPL-PF141)反应30分钟，并利用流式细胞术确认L1-H8-嵌合抗原受体表达率。结果，虽根据供体具有差异，在培养第8天，确认了签约16.4％～52.4％的L1-H8-嵌合抗原受体表达率，在培养第15天或第18天，确认了约29.6％～69.2％的L1-H8-嵌合抗原受体表达率(表11)。
表11
L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞表面中的L1-H8-嵌合抗原受体表达率确认
Figure BDA0003026018450000381
4.4.各种间隔域结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因表达T细胞的抗癌活性能力确认(体外)
4.4.1.靶细胞中的L1细胞粘附分子表达率确认
作为人卵巢腺癌细胞株的SKOV3以高表达L1细胞粘附分子而周知，是适合确认抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力的细胞株。为确认其，在100uL的磷酸盐缓冲液以5×105个准备SKOV3细胞株，添加0.25ug的抗-hCD171-PE(5G3 clone)(eBioscience，Cat No.12-1719-42)抗体后，在4℃的温度下反应30分钟。反应后，利用磷酸盐缓冲液清洗两次细胞，并利用流式细胞术确认L1细胞粘附分子表达。结果，在SKOV3癌细胞中，确认了约93.4～99.2％的L1细胞粘附分子表达率(图24a～图24c)。利用相同的方法在作为人宫颈癌细胞株的HeLa和作为人神经母细胞瘤细胞株的SH-SY5Y、作为人胚肾细胞的293T中确认L1细胞粘附分子的表达的结果，在HeLa中确认了约99.9％(图24f)的表达率，在SH-SY5Y中确认了约89.6％(图24g)的表达率，在293T中确认了约0.57％～0.61％(图24d～图24e)的表达率。
4.4.2.对于靶细胞的L1细胞粘附分子表达T细胞的抗癌活性能力去人(体外)
4.4.2.1.利用xCelligence assay的抗癌活性能力确认
为了确认对于靶细胞(target细胞，T)的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体(L1-H8-嵌合抗原受体)表达T细胞(effector细胞，E)的抗癌活性能力，使用xCELLigence实时细胞分析法。在xCELLigence实时细胞分析法中，在涂敷有黄金微电极生物传感器的板包含导电性溶液(例：培养基)的情况下，以指数值数值化电子流动来示出，在靶细胞附着在板的情况下，指数值因妨碍电子流动而发生变化。当添加嵌合抗原受体表达T细胞时，由于细胞杀伤能力，所附着的靶细胞从板掉落，可通过分析指数值的变化来确认抗癌活性能力(细胞毒性)。在50uL的培养基以1×104个准备靶细胞，并添加至分析用板。约21小时后，在50uL的包含人血清和人IL-2的AIMV培养基以1×104个、5×104个、1×105个(E∶T比例＝1、5、10)准备L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞，并添加至包含靶细胞的孔，实时确认细胞指数值约30小时。并且，准备仅包含靶细胞的孔，通过下述式计算L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力。
式
细胞毒性(％)＝{(靶细胞孔的指数值)－(靶细胞与T细胞反应孔的指数值)}/(靶细胞孔的指数值)×100
结果，相比于不表达L1-H8-嵌合抗原受体的T细胞(对照组)，4种L1-H8-嵌合抗原受体-001、L1-H8-嵌合抗原受体-002、L1-H8-嵌合抗原受体-003、L1-H8-嵌合抗原受体-004表达T细胞对于SKOV3细胞示出高的细胞杀伤能力(图25)。
利用相同的实验方法确认了对于293T细胞的杀伤能力。在50uL的培养基添加以2.5×104个添加靶细胞，约21小时后，在50uL的包含人血清和人IL-2的AIMV培养基以2.5×104个、1.25×105个、2.5×105个(E∶T比例＝1、5、10)准备L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞，并现价值包含靶细胞的孔，实时确认细胞指数值约30小时。并且，准备仅包含靶细胞的孔，通过与上述实验相同的方式计算L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力。结果，在示出低L1细胞粘附分子表达率的293T细胞中，4种均示出与对照组相似的细胞杀伤能力(图26)。
4.4.2.2.利用CellToxTM Green dye的抗癌活性能力确认
为了确认对于靶细胞(target细胞，T)的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体(L1-H8-嵌合抗原受体)表达T细胞(effector细胞，E)的抗癌活性能力，使用CellToxTM Greendye。CellToxTM Green dye用于利用附着在从死亡细胞释放的脱氧核糖核酸并显示荧光的染料确认抗癌活性能力(细胞毒性)。在50uL的培养基以1×104个准备靶细胞，并添加0.2uL的CellToxTM Green dye来添加至黑色96孔板。在50uL的包含人血清和人IL-2的AIMV培养基以5×103个、1×104个、5×104个、1×105个(E∶T比例＝0.5、1、5、10)准备L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞，并添加至包含靶细胞的孔，在37℃的温度、CO2培养基中反应24小时。准备在包含CellToxTM Green dye和靶细胞的培养基的孔仅添加L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞的组，排除附着在在反应期间从死亡L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞释放的脱氧核糖核酸而产生的染料的反应值。并且，准备仅包含靶细胞的空来校正低对照(low control)(自发脱氧核糖核酸释放(spontaneous DNA release))值，向仅包含靶细胞的孔添加裂解液(lysissolution)来校正高对照(high control)(最大脱氧核糖核酸释放(maximum DNArelease))值。通过下述方法计算对于靶细胞的杀伤能力。
式2
细胞毒性(％)＝{(靶细胞和效应细胞的反应值)－(效应细胞的反应值)}－(低对照)/(高对照－低对照)×100
结果，相比于不表达L1-H8-嵌合抗原受体的T细胞(对照组)，4种L1-H8-嵌合抗原受体-001、L1-H8-嵌合抗原受体-002、L1-H8-嵌合抗原受体-003、L1-H8-嵌合抗原受体-004表达T细胞对于SH-SY5Y细胞示出高的细胞杀伤能力(图27a～图27b)。
利用相同的实验方法确认了对于HeLa癌细胞的杀伤能力。向50uL的培养基以3.5×103个准备靶细胞，添加0.2uL的CellToxTM Green dye并添加至黑色96孔板。向50uL的包含人血清和人IL-2的AIMV培养基以1.75×103个、3.5×103个、1.75×104个、3.5×104个(E∶T比例＝0.5、1、5、10)准备L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞，并添加至包含靶细胞的孔，在37℃的温度、CO2培养基中反应24小时。通过相同方法校正并计算对于靶细胞的杀伤能力。结果，相比于不表达L1-H8-嵌合抗原受体的T细胞(对照组)，4种L1-H8-嵌合抗原受体-001、L1-H8-嵌合抗原受体-002、L1-H8-嵌合抗原受体-003、L1-H8-嵌合抗原受体-004表达T细胞对于HeLa细胞示出高细胞杀伤能力(图28a～图28b)。
4.5.各种间隔域结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因表达T细胞的抗癌活性能力确认(体内)
为了确认生物体内的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体(L1-H8-嵌合抗原受体)基因表达T细胞的抗癌活性能力，利用诱发癌症的动物模型。在缺乏T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)的NOD/SCID小(7周龄，雌性)小鼠的右侧肋下的皮下给药3×106个的以1∶1的比例与基质胶混合的SKOV3癌细胞(Target，T)来诱发癌症。在癌细胞给药3天后和5天后，向各个NOD/SCID小鼠一天给药一次4种在体外确认功效的L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞和对照组T细胞，共给药2次。当每次给药时，尾静脉给药2×107个的T细胞，直至第25天测定癌症的大小。结果，相比于对照组T细胞给药组，在两种抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体基因表达T细胞给药组均确认癌症生长速度受到抑制。尤其，经确认，L1-H8-嵌合抗原受体-003的癌症生长抑制功效最为优秀(图29)。
实施例5.各种共刺激结构域结构的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞制备及功效确认
5.1.各种共刺激结构域结构的L1CMA-嵌合抗原受体基因确保
5.1.1.L1-H8-嵌合抗原受体-001-28BB基因确保
5.1.1.1. 3E8抗体的前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板利用引物序列70(表12)和序列87(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与3E8前导序列的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列和3E8前导序列的18个碱基序列，与CD28 ICD的3’部位结合的引物具有4-1BB的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28TM-CD28 ICD-4-1BB的碱基序列(表13)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
表12
所使用的引物的碱基序列信息
Figure BDA0003026018450000401
Figure BDA0003026018450000411
表13
前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因序列
Figure BDA0003026018450000412
Figure BDA0003026018450000421
5.1.1.2.共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将包含作为共刺激结构域的4-1BB和CD3ζ-iso1的pMT-嵌合抗原受体-004质粒(图30)作为模板，利用引物序列88(表12)和序列73(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与4-1BB的5’部位结合的引物具有CD28 ICD的12个碱基序列，与CD3ζ-iso1的3’部位结合的引物Xho I限制酶碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有CD28 ICD-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表13)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.1.3. 3E8前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-4-1BB和CD28 ICD-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物序列70(表12)和序列73(表12)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图31)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-001-28BB的结构(图32)。
5.1.2.L1-H8-嵌合抗原受体-001-28ICOS基因确保
5.1.2.1. 3E8抗体的前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列70(表12)和序列89(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与3E8前导序列的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列和3E8前导序列的18个碱基序列，与CD28 ICD的3’部位结合的引物具有ICOS的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-ICOS ICD的碱基序列(表13)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.2.2.共刺激结构域ICOS基因确保
合成作为共刺激结构域的ICOS的TM和ICD结构。经通过基因合成确保的pBHA-ICOSTM+ICD(图33)作为模板，利用引物序列90(表12)和序列91(表12)扩增聚合酶链式反应方法来使用。在此情况下，与ICOS ICD的5’部位结合的引物具有CD28 ICD的12个碱基序列，具有与ICOS ICD的3’部位结合的引物CD3ζ-iso1碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有CD28 ICD-ICOS ICD-CD3ζ-iso1碱基序列(表13)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.2.3.CD3ζ基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列92(表12)和序列73(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与CD3ζ-iso1的5’部位结合的引物具有ICOS ICD的12个碱基序列，与CD3ζ-iso1的3’部位结合的引物具有Xho I限制酶碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表13)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.2.4. 3E8前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD、共刺激结构域基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-ICOS ICD和CD28 ICD-ICOS ICD-CD3ζ-iso1作为模板，利用引物序列70(表12)和序列91(表12)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图34)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-ICOSICD-CD3ζ-iso1碱基序列(表13)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.2.5. 3E8前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-ICOS ICD-CD3ζ-iso1和ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物序列70(表12)和序列73(表12)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图34)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28ICD-ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-001-28ICOS的结构(图35)。
5.1.3.L1-H8-嵌合抗原受体-001-28基因确保
5.1.3.1. 3E8抗体的前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列70(表12)和序列93(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与3E8前导序列的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列和3E8前导序列的18个碱基序列，与CD28 ICD的3’部位结合的引物具有CD3ζ-iso1的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-CD3ζ-iso1的碱基序列(表13)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.3.2.CD3ζ基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列94(表12)和序列73(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与CD3ζ-iso1的5’部位结合的引物具有CD28 ICD的12个碱基序列，具有与CD3ζ-iso1的3’部位结合的引物Xho I限制酶碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有CD28 ICD-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表13)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.3.3. 3E8前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-CD3ζ-iso1和CD28 ICD-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物序列70(表12)和序列73(表12)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图36)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-CD28 ICD-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-001-28的结构(图37)。
5.1.4.L1-H8-嵌合抗原受体-001-OX基因确保
5.1.4.1. 3E8抗体的前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列70(表12)和序列95(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与3E8前导序列的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列和3E8前导序列的18个碱基序列，与CD28 TM的3’部位结合的引物具有OX40的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-OX40的碱基序列(表13)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.4.2.共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列96(表12)和序列73(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与OX40的5’部位结合的引物具有CD28 TM的12个碱基序列，与CD3ζ-iso1的3’部位结合的引物具有Xho I限制酶碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有CD28 TM-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表13)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.4.3. 3E8前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-OX40和CD28 TM-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物序列70(表12)和序列73(表12)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图38)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-001-OX的结构(图39)。
5.1.5.L1-H8-嵌合抗原受体-001-BB基因确保
5.1.5.1. 3E8抗体的前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列70(表12)和序列97(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与3E8前导序列的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列和3E8前导序列的18个碱基序列，与CD28 TM的3’部位结合的引物具有4-1BB的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-4-1BB的碱基序列(表13)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.5.2.共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-004(图30)作为模板，利用引物序列98(表12)和序列73(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与4-1BB的5’部位结合的引物具有CD28 TM的12个碱基序列，与CD3ζ-iso1的3’部位结合的引物具有Xho I限制酶碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有CD28 TM-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表13)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.5.3. 3E8前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-4-1BB和CD28 TM-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物序列70(表12)和序列73(表12)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图40)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-4-1BB-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-001-BB的结构(图41)。
5.1.6.L1-H8-嵌合抗原受体-001-ICOS基因确保
5.1.6.1. 3E8抗体的前导序列、L1-H8 scFv、Hinge、TM基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列70(表12)和序列99(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与3E8前导序列的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列和3E8前导序列的18个碱基序列，与CD28 TM的3’部位结合的引物具有ICOS-ICD的13个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-ICOS ICD的碱基序列(表13)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.6.2.共刺激结构域ICOS基因确保
将pBHA-ICOS TM+ICD(图33)作为模板，利用引物序列100(表12)和序列91(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与ICOS ICD的5’部位结合的引物具有CD28 TM的12个碱基序列，与ICOS ICD的3’部位结合的引物具有CD3ζ-iso1碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有CD28 TM-ICOS ICD-CD3ζ-iso1碱基序列(表13)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.6.3.CD3ζ基因确保
将pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001作为模板，利用引物序列92(表12)和序列73(表12)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与CD3ζ-iso1的5’部位结合的引物具有ICOS ICD的12个碱基序列，与CD3ζ-iso1的3’部位结合的引物具有Xho I限制酶碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表13)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.6.4. 3E8前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、共刺激结构域基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-ICOS ICD和CD28 TM-ICOS ICD-CD3ζ-iso1作为模板，利用引物序列70(表12)和序列91(表12)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图42)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-ICOS ICD-CD3ζ-iso1碱基序列(表13)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
5.1.6.5. 3E8前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-ICOS ICD-CD3ζ-iso1和ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物序列70(表12)和序列73(表12)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图42)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-hIgD hinge-CD28 TM-ICOS ICD-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-001-ICOS的结构(图43)。
5.1.7.pMT-L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒载体制备
利用Mlu I和Xho I限制酶对6种所扩增的聚合酶链式反应生成物进行处理来获取脱氧核糖核酸片段。将所获取的脱氧核糖核酸片段与事先利用Mlu I和Xho I限制酶处理的pMT逆转录病毒载体(美国授权专利第US6451595号)连接，由此，制备了6种pMT-L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒载体(图44)。通过上述方式制备的pMT-L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒载体在MLV LTR启动子的调节下包含对L1-H8-嵌合抗原受体进行编码的序列。
5.2.各种共刺激结构域结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因表达逆转录病毒(L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒)制备
通过与实施例4.2相同的方法制备了7种L1-H8-嵌合抗原受体-001和L1-H8-嵌合抗原受体-001-28BB、L1-H8-嵌合抗原受体-001-28ICOS、L1-H8-嵌合抗原受体-001-28、L1-H8-嵌合抗原受体-001-OX、L1-H8-嵌合抗原受体-001-BB、L1-H8-嵌合抗原受体-001-ICOS基因表达逆转录病毒。
5.3.各种共刺激结构域结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因表达T细胞制备
通过与实施例4.3.相同的方法制备了7种L1-H8-表达嵌合抗原受体的T细胞。结果，虽根据供体具有差异，在培养第7天或第8天，确认了约7.7％～88.4％的L1-H8-嵌合抗原受体表达率，在培养第11天，确认了约9.0％～82.4％的L1-H8-嵌合抗原受体表达率，在第15天或第17天，确认了约6.7％～89.8％的L1-H8-嵌合抗原受体表达率(表14)。
表14
L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞表面中的L1-H8-嵌合抗原受体表达率确认
Figure BDA0003026018450000471
Figure BDA0003026018450000481
5.4.各种间隔域结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因表达T细胞的抗癌活性能力确认(体外)
5.4.1.靶细胞中的L1细胞粘附分子表达率确认
通过与实施例4.4.1.相同的方法确认了靶细胞中的L1细胞粘附分子表达率。结果，在SKOV3癌细胞中确认了约80.4％～98.5％的L1细胞粘附分子表达率(图45a～图45c)。利用相同的方法在作为人宫颈癌细胞株的HeLa和作为人神经母细胞瘤细胞株的SH-SY5Y、作为人胚肾细胞的293T中确认L1细胞粘附分子的表达的情况下，在HeLa细胞中确认了约99.6％～99.9％的表达率(图45f～图45g)，在SH-SY5Y细胞中确认了约52.1％～98.1％的表达率(图45h～图45i)，在293T细胞中确认了约0.023％～4.72％的表达率(图45d～图45e)。
5.4.2.对于靶细胞的L1细胞粘附分子表达T细胞的抗癌活性能力确认(体外)
5.4.2.1.利用xCelligence assay的抗癌活性能力确认
通过与实施例4.4.2.1相同内的方法确认了对于SKOV3细胞的7种L1-H8-嵌合抗原受体的功效。结果，相比于不表达L1-H8-嵌合抗原受体的T细胞(对照组)，7种L1-H8-嵌合抗原受体-001和L1-H8-嵌合抗原受体-001-28BB、L1-H8-嵌合抗原受体-001-28ICOS、L1-H8-嵌合抗原受体-001-28、L1-H8-嵌合抗原受体-001-OX、L1-H8-嵌合抗原受体-001-BB、L1-H8-嵌合抗原受体-001-ICOS表达T细胞对于SKOV3细胞示出高的细胞杀伤能力(图46)。
利用与实施例4.4.2.1相同的方法确认了对于293T细胞的杀伤能力。结果，在示出低的L1细胞粘附分子表达率的293T细胞中，7种均示出与对照组相似的细胞杀伤能力(图47)。
5.4.2.2.利用CellToxTM Green dye的抗癌活性能力确认
利用与实施例4.4.2.2相同的实验方法确认了对于SH-SY5Y细胞的杀伤能力。结果，相比于不表达L1-H8-嵌合抗原受体的T细胞(对照组)，7种L1-H8-嵌合抗原受体-001和L1-H8-嵌合抗原受体-001-28BB、L1-H8-嵌合抗原受体-001-28ICOS、L1-H8-嵌合抗原受体-001-28、L1-H8-嵌合抗原受体-001-OX、L1-H8-嵌合抗原受体-001-BB、L1-H8-嵌合抗原受体-001-ICOS表达T细胞对于SH-SY5Y细胞示出高的细胞杀伤能力(图48a～图48c)。
利用与实施例4.4.2.2相同的方法确认了对于HeLa细胞的杀伤能力。结果，相比于不表达L1-H8-嵌合抗原受体的T细胞(对照组)，7种L1-H8-嵌合抗原受体-001和L1-H8-嵌合抗原受体-001-28BB、L1-H8-嵌合抗原受体-001-28ICOS、L1-H8-嵌合抗原受体-001-28、L1-H8-嵌合抗原受体-001-OX、L1-H8-嵌合抗原受体-001-BB、L1-H8-嵌合抗原受体-001-ICOS表达T细胞对于HeLa细胞示出高的细胞杀伤能力(图49a～图49c)。
5.5.各种共刺激结构域结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因表达T细胞的抗癌活性能力确认(体内)
为了确认生物体中的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体(L1-H8-嵌合抗原受体)基因表达T细胞的抗癌活性能力，利用诱发癌症的动物模型。在缺乏T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)的NOD/SCID小鼠(7周龄，雌性)的右侧肋下的皮下给药3×106个的以1∶1的比例与基质胶混合的SKOV3癌细胞(Target，T)来诱发癌症。在癌细胞给药3天后和5天后，向各个NOD/SCID小鼠一天给药一次7种在体外确认功效的L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞和对照组T细胞，共给药2次。当每次给药时，尾静脉给药2×107个的T细胞，直至第25天测定癌症的大小。结果，相比于对照组T细胞给药组，7种抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体基因表达T细胞给药组中均确认癌症生长速度受到抑制。尤其，经确认，L1-H8-嵌合抗原受体-001-28ICOS的癌症生长抑制功效最为优秀(图50)。
实施例6.各种结构的抗-L1细胞粘附分子-嵌合抗原受体表达T细胞制备及功效确认
6.1.各种结构的L1CMA-嵌合抗原受体基因确保
6.1.1.L1-H8-嵌合抗原受体-005基因确保
6.1.1.1. 3E8抗体的前导序列、L1-H8 scFv_反向(reverse)基因确保
合成了3E8前导序列与L1-H8 scFv的抗体可变轻链、连接肽(Linker)、L1-H8 scFv的抗体可变重链的结构。将通过基因合成确保的pBHA-3E8 LS-H8Rev(图51)作为模板，利用引物序列70(表15)和序列103(表15)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与3E8前导序列的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列和3E8前导序列的18个碱基序列，与L1-H8 scFv-反向的3’部位结合的引物具有hIgD铰链的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-Rev-IgD hinge的碱基序列(表16)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
表15
所使用的引物的碱基序列信息
Figure BDA0003026018450000491
Figure BDA0003026018450000501
表16
前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因序列
Figure BDA0003026018450000502
Figure BDA0003026018450000511
6.1.1.2.铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将包含人IgD的铰链和IgG1的铰链、CD28的TM和ICD、作为共刺激结构域的OX40及CD3ζ-iso1的pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-003(图23)质粒作为模板，利用引物序列104(表15)和序列73(表15)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与hIgD铰链的5’部位结合的引物具有L1-H8 scFv抗体可变重链的12个碱基序列，具有与CD3ζ-iso1的3’部位结合的引物Xho I限制酶碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有L1-H8scFv-Rev-IgD hinge-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列(表16)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
6.1.1.3.3E8前导序列、L1-H8 scFv-Rev、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-3E8 LS-L1-H8 scFv-Rev-IgD铰链和L1-H8 scFv-Rev-IgD hinge-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I作为模板，利用引物序列70(表15)和序列73(表15)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图52)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-3E8-L1-H8 scFv-Rev-IgD hinge-IgG1 hinge-CD28 TM-CD28 ICD-OX40-CD3ζ-iso1-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-005的结构(图53)。
6.1.2.L1-H8-嵌合抗原受体-006基因确保
6.1.2.1.CD8α的前导序列基因确保
将包含CD8α的前导序列的pMT-嵌合抗原受体-005(图54)质粒作为模板，利用引物序列105(表15)和序列106(表15)并通过聚合酶链式反应方法扩增。在此情况下，与CD8α前导序列的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列和CD8α前导序列的18个碱基序列，与CD8α前导序列的3’部位结合的引物具有L1-H8 scFv抗体可变重链的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-hCD8αLS-L1-H8 scFv的碱基序列(表17)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
表17
前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因序列
Figure BDA0003026018450000521
6.1.2.2.L1-H8 scFv基因确保
将包含L1-H8 scFv的pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001(图23)质粒作为模板，利用引物序列107(表15)和序列108(表15)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与L1-H8 scFv的5’部位结合的引物具有CD8α前导序列的12个碱基序列，与L1-H8 scFv 3’部位结合的引物具有hCD8α铰链的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有hCD8αLS-L1-H8 scFv-hCD8α铰链碱基序列(表17)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
6.1.2.3.铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将包含人CD8α的铰链和TM、作为共刺激结构域的4-1BB及CD3ζ-iso2M的pMT-嵌合抗原受体-005(图54)质粒作为模板，利用引物序列109(表15)和序列110(表5)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与hCD8α铰链的5’部位结合的引物具有L1-H8scFv抗体可变轻链的12个碱基序列，具有与CD3ζ-iso2M的3’部位结合的引物Xho I限制酶碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有L1-H8 scFv-hCD8αhinge-hCD8αTM-4-1BB-CD3ζ-iso2M-Xho I碱基序列(表17)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
6.1.2.4.CD8α前导序列、L1-H8 scFv基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-hCD8αLS-L1-H8 scFv和hCD8αLS-L1-H8 scFv-hCD8α铰链作为模板，利用引物序列105(表15)和序列108(表15)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图55)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-hCD8αLS-L1-H8 scFv-CD28铰链碱基序列。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
6.1.2.5.CD8α前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-hCD8αLS-L1-H8 scFv-hCD8α铰链和L1-H8 scFv-hCD8αhinge-hCD8αTM-4-1BB-CD3ζ-iso2M-Xho I作为模板，利用引物序列105(表15)和序列110(表15)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图55)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-hCD8αLS-L1-H8 scFv-hCD8αhinge-hCD8αTM-4-1BB-CD3ζ-iso2M-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-006的结构(图56)。
6.1.3.L1-H8-嵌合抗原受体-007基因确保
6.1.3.1.hGM-CSF受体α-链的信号序列基因确保
将包含hGM-CSF rec.α的信号序列的pMT-嵌合抗原受体-006质粒(图57)作为模板，利用引物序列111(表15)和序列112(表15)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与hGM-CSF rec.α的5’部位结合的引物具有Mlu I限制酶碱基序列，与hGM-CSFrec.α的3’部位结合的引物具有L1-H8 scFv可变重链的12个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-hGM-CSF rec.α-L1-H8 scFv的碱基序列(表18)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
表18
前导序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD、共刺激结构域及CD3ζ基因序列
Figure BDA0003026018450000541
Figure BDA0003026018450000551
6.1.3.2.L1-H8 scFv基因确保
将包含L1-H8 scFv的pMT-L1-H8-嵌合抗原受体-001(图23)质粒作为模板，利用引物序列113(表15)和序列114(表15)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与L1-H8 scFv的5’部位结合的引物具有hGM-CSF rec.αLS的12个碱基序列，与L1-H8 scFv3’部位结合的引物具有铰链的9个碱基序列和hCD28 pECD的3个碱基序列，因此，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有hGM-CSF rec.αLS-L1-H8 scFv-hinge-hCD28 pECD碱基序列(表18)。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
6.1.3.3.铰链、TM、ICD共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将包含铰链、hCD28的pECD和TM、ICD及hCD3ζ-iso2的pMT-嵌合抗原受体-006质粒(图57)作为模板，利用引物序列115(表13)和序列116(表13)并通过聚合酶链式反应方法扩增来使用。在此情况下，与铰链的5’部位结合的引物具有L1-H8 scFv可变轻链的12个碱基序列，与CD3ζ-iso2的3’部位结合的引物具有Xho I限制酶碱基序列，所扩增的聚合酶链式反应生成物具有L1-H8 scFv-Hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28 ICD-CD3ζ-iso2-Xho I碱基序列(表16)。所扩增的生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
6.1.3.4.hGM-CSF受体α-链的信号序列、L1-H8 scFv基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-hGM-CSF rec.α-L1-H8 scFv和hGM-CSF rec.αLS-L1-H8 scFv-hinge-hCD28 pECD作为模板，利用引物序列111(表15)和序列114(表15)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图58)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-hGM-CSF rec.α-L1-H8 scFv-hinge-hCD28 pECD碱基序列。所扩增的聚合酶链式反应生成物用于以下聚合酶链式反应扩增过程。
6.1.3.5.hGM-CSF受体α-链的信号序列、L1-H8 scFv、铰链、TM、ICD共刺激结构域及CD3ζ基因确保
将作为扩增的聚合酶链式反应生成物的Mlu I-hGM-CSF rec.α-L1-H8 scFv-hinge-hCD28 pECD和L1-H8 scFv-Hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28 ICD-CD3ζ-iso2-Xho I作为模板，利用引物序列111(表15)和序列116(表15)并通过重叠延伸聚合酶链式反应方法扩增(图58)。所扩增的聚合酶链式反应生成物具有Mlu I-hGM-CSF rec.α-L1-H8scFv-hinge-hCD28 pECD-hCD28 TM-hCD28 ICD-CD3ζ-iso2-Xho I碱基序列，具有L1-H8-嵌合抗原受体-007的结构(图59)。
6.1.4.pMT-L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒载体制备
利用Mlu I和Xho I限制酶对3种扩增的聚合酶链式反应生成物进行处理来获取了脱氧核糖核酸片段。将所获取的脱氧核糖核酸片段与事先利用Mlu I和Xho I限制酶处理的pMT逆转录病毒载体(美国授权专利第US6451595号)连接，由此，制备了3种pMT-L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒载体(图60)。通过上述方式制备的pMT-L1-H8-嵌合抗原受体逆转录病毒载体在MLV LTR启动子的调节下包含对L1-H8-嵌合抗原受体进行编码的序列。
6.2.各种结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因表达逆转录病毒(L1-H8-嵌合抗原受体转录病毒)制备
通过与实施例4.2.相同的方法制备了4种L1-H8-嵌合抗原受体-003、L1-H8-嵌合抗原受体-005、L1-H8-嵌合抗原受体-006、L1-H8-嵌合抗原受体-007基因表达逆转录病毒。
6.3.各种结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因表达T细胞制备
通过与实施例4.3.相同的方法制备了4种L1-H8-嵌合抗原受体-T。结果，虽根据供体具有差异，在培养第8天确认了约22.1％～74.1％的L1-H8-嵌合抗原受体表达率，在培养第11天确认了约27.1％～77.1％的L1-H8-嵌合抗原受体表达率，在培养第14天确认了约24.6％～76.6％的L1-H8-嵌合抗原受体表达率，在培养第16天确认了约29.8％～81.9％的L1-H8-嵌合抗原受体表达率(表19)。
表19
L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞表面中的L1-H8-嵌合抗原受体表达率确认
Figure BDA0003026018450000561
6.4.各种结构的L1-H8-嵌合抗原受体基因表达T细胞的抗癌活性能力确认(体外)
6.4.1.靶细胞中的L1细胞粘附分子表达率确认
通过与实施例4.4.1.相同的方法确认了靶细胞中的L1细胞粘附分子表达率。结果，在SKOV3癌细胞中确认了约67.1％～87.0％的L1细胞粘附分子表达率。利用相同的方法确认作为人宫颈癌细胞株的HeLa细胞和作为人神经母细胞瘤细胞株的SH-SY5Y细胞、作为人胚肾细胞的293T细胞中的L1细胞粘附分子的表达的结果，在HeLa细胞中确认了约98.4％的表达率，在SH-SY5Y细胞中确认了约65.0％～70.9％的表达率，在293T细胞中确认了约0.082％的表达率(图61a～图61f)。
6.4.2.对于靶细胞的L1细胞粘附分子表达T细胞的抗癌活性能力确认(体外)
6.4.2.1.利用xCelligence assay确认抗癌活性能力
通过与实施例4.4.2.1相同的方法确认了对于SKOV3细胞的4种L1-H8-嵌合抗原受体的功效。结果，相比于不表达L1-H8-嵌合抗原受体的T细胞(对照组)，4种L1-H8-嵌合抗原受体-003和L1-H8-嵌合抗原受体-005、L1-H8-嵌合抗原受体-006、L1-H8-嵌合抗原受体-007表达T细胞对于SKOV3细胞示出高的细胞杀伤能力(图62)。
利用与实施例4.4.2.1.相同的实验方法确认了对于SH-SY5Y细胞的杀伤能力。在50uL的培养基以1×105个添加靶细胞，在约21小时后，向50uL的包含人血清和人IL-2的AIMV培养基以5.0×104个、1.0×105个、5.0×105个(E∶T比例＝0.5、1、5)准备L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞，并添加至包含靶细胞的孔，实时确认细胞指数值约30小时。并且，准备仅包含靶细胞的孔，通过与上述实验相同的方法计算L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞的抗癌活性能力。结果，相比于不表达L1-H8-嵌合抗原受体的T细胞(对照组)，4种L1-H8-嵌合抗原受体-003和L1-H8-嵌合抗原受体-005、L1-H8-嵌合抗原受体-006、L1-H8-嵌合抗原受体-007表达T细胞对于SH-SY5Y细胞示出高的细胞杀伤能力(图63)。
6.4.2.2.利用CellToxTM Green dye确认抗癌活性能力
通过与实施例4.4.2.2.相同的方法确认了对于HeLa细胞的4种L1-H8-嵌合抗原受体的功效。结果，相比于不表达L1-H8-嵌合抗原受体的T细胞(对照组)，4种L1-H8-嵌合抗原受体-003和L1-H8-嵌合抗原受体-005、L1-H8-嵌合抗原受体-006、L1-H8-嵌合抗原受体-007表达T细胞对于HeLa细胞示出高的细胞杀伤能力(图64)。
利用与实施例4.4.2.2.相同的实验方法确认了对于293T癌细胞的杀伤能力。向50uL的培养基以1×104个准备靶细胞，添加0.2uL的CellToxTM Green dye并添加至黑色96孔板。向50uL包含人血清和人IL-2的AIMV培养基以5.0×103个、1.0×104个、5.0×104个、1.0×105个(E∶T比例＝0.5、1、5、10)准备L1-H8-嵌合抗原受体表达T细胞，并添加至包含靶细胞的孔，在37℃的温度、CO2培养基中反应24小时。通过相同的方法校正并计算对于靶细胞的杀伤能力。
结果，在示出低的L1细胞粘附分子表达率的293T细胞中，4种均示出与对照组相似的细胞杀伤能力，或者低于对照组的细胞杀伤能力(图65)。
序列表
<110> Helixmith Co., Ltd
<120> 抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段及包含其的嵌合抗原受体
<130> PP190039
<150> KR 10-2018-0125538
<151> 2018-10-19
<160> 130
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8的CDRH1
<400> 1
Asp Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-C9的CDRH1
<400> 2
Ser Tyr Ala Met His
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E1、mL1CAM-3R-F1及mL1CAM-2R-F8的CDRH1
<400> 3
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-F6的CDRH1
<400> 4
Ser Tyr Ala Met His
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-G6的CDRH1
<400> 5
Asn Tyr Ala Met His
1 5
<210> 6
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-A2的CDRH1
<400> 6
Ser Tyr Ala Met Asn
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E9的CDRH1
<400> 7
Asp Tyr Ala Met His
1 5
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8的CDRH2
<400> 8
Ala Ile Ser Ser Thr Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-C9、mL1CAM-3R-F1及mL1CAM-3R-E9的CDRH2
<400> 9
Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E1的CDRH2
<400> 10
Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-F6的CDRH2
<400> 11
Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-G6的CDRH2
<400> 12
Ala Ile Tyr Gln Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-A2的CDRH2
<400> 13
Arg Ile Ser Ser Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-2R-F8的CDRH2
<400> 14
Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8的CDRH3
<400> 15
Gln Ser Thr Tyr Phe Tyr Ser Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-C9的CDRH3
<400> 16
Asp Glu Gly Ser Gly Leu Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E1的CDRH3
<400> 17
Asp Glu Ser Thr Gly Leu Gly Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-F6的CDRH3
<400> 18
Asp Glu Ser Tyr Gly Trp Leu Tyr Ala Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-F1的CDRH3
<400> 19
Val Leu Glu Leu Trp Glu Gly Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-G6的CDRH3
<400> 20
Val Arg Gly Thr Tyr Tyr Gly Ser Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-A2的CDRH3
<400> 21
Val Glu Glu Gly Arg Tyr Val Gln Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E9的CDRH3
<400> 22
His Gly Gly Thr Trp Trp Gly Arg Ala Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-2R-F8的CDRH3
<400> 23
His Gly Ser Tyr Ala Phe Val Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 24
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8、mL1CAM-3R-C9、mL1CAM-3R-E1、mL1CAM-3R-F6、mL1CAM-3R-F1、mL1CAM-3R-A2及mL1CAM-3R-E9的FRH1
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-G6的FRH1
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Leu Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 26
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-2R-F8的FRH1
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 27
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8、mL1CAM-3R-C9、mL1CAM-3R-E1、mL1CAM-3R-F6、mL1CAM-3R-F1、mL1CAM-3R-G6、mL1CAM-3R-A2、mL1CAM-3R-E9及mL1CAM-2R-F8的FRH2
<400> 27
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8、mL1CAM-3R-C9、mL1CAM-3R-E1、mL1CAM-3R-F1、mL1CAM-3R-G6、mL1CAM-3R-A2、mL1CAM-3R-E9及mL1CAM-2R-F8的FRH3
<400> 28
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 29
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-F6的FRH3
<400> 29
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Ile Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys
20 25 30
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8、mL1CAM-3R-C9、mL1CAM-3R-E1、mL1CAM-3R-F6、mL1CAM-3R-F1、mL1CAM-3R-G6、mL1CAM-3R-A2、mL1CAM-3R-E9及mL1CAM-2R-F8的FRH4
<400> 30
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (G4S1)3 接头
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8的CDRL1
<400> 32
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Asp Leu Asn
1 5 10
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-C9及mL1CAM-3R-G6的CDRL1
<400> 33
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E1、mL1CAM-3R-F6、mL1CAM-3R-A2及mL1CAM-2R-F8的CDRL1
<400> 34
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-F1的CDRL1
<400> 35
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E9的CDRL1
<400> 36
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8及mL1CAM-2R-F8的CDRL2
<400> 37
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-C9及mL1CAM-3R-E1的CDRL2
<400> 38
Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser
1 5
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-F6及mL1CAM-3R-F1的CDRL2
<400> 39
Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser
1 5
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-G6的CDRL2
<400> 40
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-A2的CDRL2
<400> 41
Ala Thr Ser Arg Leu Gln Ser
1 5
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E9的CDRL2
<400> 42
Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8及mL1CAM-3R-E9的CDRL3
<400> 43
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-C9、mL1CAM-3R-E1、mL1CAM-3R-A2及mL1CAM-2R-F8的CDRL3
<400> 44
Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-F6的CDRL3
<400> 45
Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-F1的CDRL3
<400> 46
Gln Gln Ser Glu Ser Phe Pro Tyr Thr
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-G6的CDRL3
<400> 47
Gln Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 48
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8、mL1CAM-3R-C9、mL1CAM-3R-E1、mL1CAM-3R-F6、mL1CAM-3R-F1、mL1CAM-3R-G6、mL1CAM-3R-A2、mL1CAM-3R-E9及mL1CAM-2R-F8的FRL1
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8、mL1CAM-3R-C9、mL1CAM-3R-E1、mL1CAM-3R-F6、mL1CAM-3R-F1、mL1CAM-3R-G6、mL1CAM-3R-A2、mL1CAM-3R-E9及mL1CAM-2R-F8的FRL2
<400> 49
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8、mL1CAM-3R-C9、mL1CAM-3R-E1、mL1CAM-3R-F6、mL1CAM-3R-F1、mL1CAM-3R-G6、mL1CAM-3R-A2、mL1CAM-3R-E9及mL1CAM-2R-F8的FRL3
<400> 50
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8、mL1CAM-3R-C9、mL1CAM-3R-E1、mL1CAM-3R-F6、mL1CAM-3R-F1、mL1CAM-3R-G6、mL1CAM-3R-A2、mL1CAM-3R-E9及mL1CAM-2R-F8的FRL4
<400> 51
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 52
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8的重链可变区
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Thr Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ser Thr Tyr Phe Tyr Ser Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-C9的重链可变区
<400> 53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Glu Gly Ser Gly Leu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 54
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E1的重链可变区
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Glu Ser Thr Gly Leu Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 55
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E9的重链可变区
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Gly Gly Thr Trp Trp Gly Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8的轻链可变区
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Asp
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-C9的轻链可变区
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E1的轻链可变区
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E9的轻链可变区
<400> 59
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 60
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8的scFv的核苷酸序列
<400> 60
gaagtacagt tggtcgaaag tggcggtggc ctcgtgcaac cgggtggttc actgcgtctg 60
agctgcgccg cctcgggttt tactttctct gattatgcaa tgaattgggt tcgtcaggcg 120
ccgggcaagg gtctcgaatg ggtttcagca atctcttcta ctggttctac tatctactat 180
gccgattcag tgaagggtcg ctttaccatt tcccgtgaca actctaagaa tactctgtat 240
ctgcagatga actcgctgcg tgccgaagac acggccgtct attattgcgc caaacagtct 300
acttactttt actcttactt tgatgtttgg ggtcagggca ctttagtgac cgtctcatcg 360
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggatcc ggcggtggcg gatcggacat tcaaatgacg 420
cagagtccct cctcactgag tgctagcgtg ggcgatcgtg tgacaattac ttgtcgcgct 480
agccagtcta tctctcgtga tctgaactgg tatcagcaga aaccgggcaa ggcgccaaaa 540
ttgctgattt acgcagcatc ctctctgcag tctggtgtac cgtcccgttt ctctggcagc 600
ggttctggta cggattttac cctgaccatc tcaagcctcc agcctgaaga ttttgccacc 660
tattattgtc agcaatctta ctctactccg tacacgttcg ggcagggaac taaagtggaa 720
attaaa 726
<210> 61
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-C9的scFv的核苷酸序列
<400> 61
gaagtacagt tggtcgaaag tggcggtggc ctcgtgcaac cgggtggttc actgcgtctg 60
agctgcgccg cctcgggttt tactttctct tcttatgcaa tgcactgggt tcgtcaggcg 120
ccgggcaagg gtctcgaatg ggtttcagca atctcttctt ctggtggttc tacttactat 180
gccgattcag tgaagggtcg ctttaccatt tcccgtgaca actctaagaa tactctgtat 240
ctgcagatga actcgctgcg tgccgaagac acggccgtct attattgcgc caaagatgaa 300
ggttctggtc tgggtgcatt tgatatctgg ggtcagggca ctttagtgac cgtctcatcg 360
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggatcc ggcggtggcg gatcggacat tcaaatgacg 420
cagagtccct cctcactgag tgctagcgtg ggcgatcgtg tgacaattac ttgtcgcgct 480
agccagtcta tctctcgtta cctgaactgg tatcagcaga aaccgggcaa ggcgccaaaa 540
ttgctgattt acgcagcatc caatctgcag tctggtgtac cgtcccgttt ctctggcagc 600
ggttctggta cggattttac cctgaccatc tcaagcctcc agcctgaaga ttttgccacc 660
tattattgtc agcaatctta ctcttttccg tggacgttcg ggcagggaac taaagtggaa 720
attaaa 726
<210> 62
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E1的scFv的核苷酸序列
<400> 62
gaagtacagt tggtcgaaag tggcggtggc ctcgtgcaac cgggtggttc actgcgtctg 60
agctgcgccg cctcgggttt tactttctct tcttatgcaa tgtcttgggt tcgtcaggcg 120
ccgggcaagg gtctcgaatg ggtttcagca atctcttctt ctggttcttc tacttactat 180
gccgattcag tgaagggtcg ctttaccatt tcccgtgaca actctaagaa tactctgtat 240
ctgcagatga actcgctgcg tgccgaagac acggccgtct attattgcgc caaagatgaa 300
tctactggtc tgggtgcatt tgattactgg ggtcagggca ctttagtgac cgtctcatcg 360
ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggatcc ggcggtggcg gatcggacat tcaaatgacg 420
cagagtccct cctcactgag tgctagcgtg ggcgatcgtg tgacaattac ttgtcgcgct 480
agccagtcta tctctaatta cctgaactgg tatcagcaga aaccgggcaa ggcgccaaaa 540
ttgctgattt acgcagcatc caatctgcag tctggtgtac cgtcccgttt ctctggcagc 600
ggttctggta cggattttac cctgaccatc tcaagcctcc agcctgaaga ttttgccacc 660
tattattgtc agcaatctta ctcttttccg tggacgttcg ggcagggaac taaagtggaa 720
attaaa 726
<210> 63
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E9的scFv的核苷酸序列
<400> 63
gaagtacagt tggtcgaaag tggcggtggc ctcgtgcaac cgggtggttc actgcgtctg 60
agctgcgccg cctcgggttt tactttctct gattatgcaa tgcactgggt tcgtcaggcg 120
ccgggcaagg gtctcgaatg ggtttcagca atctcttctt ctggtggttc tacttactat 180
gccgattcag tgaagggtcg ctttaccatt tcccgtgaca actctaagaa tactctgtat 240
ctgcagatga actcgctgcg tgccgaagac acggccgtct attattgcgc caaacatggt 300
ggtacttggt ggggtcgtgc attcgattac tggggtcagg gcactttagt gaccgtctca 360
tcgggtggag gcggttcagg cggaggtgga tccggcggtg gcggatcgga cattcaaatg 420
acgcagagtc cctcctcact gagtgctagc gtgggcgatc gtgtgacaat tacttgtcgc 480
gctagccagt ctatcggttc ttacctgaac tggtatcagc agaaaccggg caaggcgcca 540
aaattgctga tttacgcaac ttcctctctg cagtctggtg taccgtcccg tttctctggc 600
agcggttctg gtacggattt taccctgacc atctcaagcc tccagcctga agattttgcc 660
acctattatt gtcagcaatc ttactctact ccgtacacgt tcgggcaggg aactaaagtg 720
gaaattaaa 729
<210> 64
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-H8的scFv的氨基酸序列
<400> 64
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Thr Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gln Ser Thr Tyr Phe Tyr Ser Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Ser Ile Ser Arg Asp Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 65
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-C9的scFv的氨基酸序列
<400> 65
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Glu Gly Ser Gly Leu Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 66
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E1的scFv的氨基酸序列
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Glu Ser Thr Gly Leu Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Gln Ser Tyr Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 67
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mL1CAM-3R-E9的scFv的氨基酸序列
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys His Gly Gly Thr Trp Trp Gly Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145 150 155 160
Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Gln Ser
180 185 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3E8 VH_LS+ L1 ScFv(F)的引物
<400> 68
ggtgtccact ccgaagtaca gttggtc 27
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1 ScFv+ hIgD 铰链(R)的引物
<400> 69
acctggccag cgtttaattt ccacttt 27
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mlu 1+3E8 VH(F)的引物
<400> 70
acgcgtatgg aatggagctg ggtc 24
<210> 71
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3E8 VH+L1 ScFv(R)的引物
<400> 71
caactgtact tcggagtgga cacctgt 27
<210> 72
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1 ScFv+ hIgD 铰链(F)的引物
<400> 72
gtggaaatta aacgctggcc aggttct 27
<210> 73
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> XhoI+CD3ζ(R)的引物
<400> 73
ccgctcgagt tagcgagggg gcagggc 27
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> T7(F)的引物
<400> 74
tatacgactc actataggg 19
<210> 75
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SP6(R)的引物
<400> 75
atttaggtga cactatag 18
<210> 76
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mlu I-起始密码子-3E8 LS
<400> 76
acgcgtatgg aatggagctg ggtctttctc ttcttcctgt cagtaactac aggtgtccac 60
tcc 63
<210> 77
<211> 192
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgD 铰链
<400> 77
cgctggccag gttctccaaa ggcacaggcc tcctccgtgc ccactgcaca accccaagca 60
gagggcagcc tcgccaaggc aaccacagcc ccagccacca cccgtaacac aggtagagga 120
ggagaagaga agaagaagga gaaggagaaa gaggaacaag aagagagaga gacaaagaca 180
ccaggttgtc cg 192
<210> 78
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 TM
<400> 78
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 79
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 ICD
<400> 79
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 80
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OX40
<400> 80
gccctgtacc tgctccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 60
ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc 120
aagatc 126
<210> 81
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ
<400> 81
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 339
<210> 82
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ-终止密码子-Xho I
<400> 82
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aactcgag 348
<210> 83
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1-H8 scFv+ IgG1 铰链(R)的引物
<400> 83
agatttgggc tctttaattt ccacttt 27
<210> 84
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1-H8 scFv+ IgG1 铰链(F)的引物
<400> 84
gtggaaatta aagagcccaa atcttgt 27
<210> 85
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 铰链
<400> 85
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gccca 45
<210> 86
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 CH3
<400> 86
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 60
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 120
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 180
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 240
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 300
ctctccctgt ctccgggtaa a 321
<210> 87
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 ICD+41BB(R)的引物
<400> 87
tctgccccgt ttggagcgat aggctgc 27
<210> 88
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 ICD+41BB(F)的引物
<400> 88
gcctatcgct ccaaacgggg cagaaag 27
<210> 89
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 ICD+ICOS ICD (R)的引物
<400> 89
ggatgaatac ttggagcgat aggctgc 27
<210> 90
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 ICD+ICOS ICD (F)的引物
<400> 90
gcctatcgct ccaagtattc atccagt 27
<210> 91
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS ICD+CD3ζ(R)的引物
<400> 91
gaacttcact ctggtcacat ctgtgag 27
<210> 92
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS ICD+CD3ζ(F)的引物
<400> 92
acagatgtga ccagagtgaa gttcagc 27
<210> 93
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 ICD+CD3ζ(R)的引物
<400> 93
gaacttcact ctggagcgat aggctgc 27
<210> 94
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 ICD+CD3ζ(F)的引物
<400> 94
gcctatcgct ccagagtgaa gttcagc 27
<210> 95
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 TM+OX40(R)的引物
<400> 95
caggtacagg gccacccaga aaataat 27
<210> 96
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 TM+OX40(F)的引物
<400> 96
attttctggg tggccctgta cctgctc 27
<210> 97
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 TM+41BB(R)的引物
<400> 97
tctgccccgt ttcacccaga aaataat 27
<210> 98
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28 TM+41BB(F)的引物
<400> 98
attttctggg tgaaacgggg cagaaag 27
<210> 99
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28TM+ICOS ICD(R)的引物
<400> 99
tggatgaata cttcacccag aaaataata 29
<210> 100
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD28TM+ICOS ICD(F)的引物
<400> 100
attttctggg tgaagtattc atccagt 27
<210> 101
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB
<400> 101
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 102
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ICOS
<400> 102
aagtattcat ccagtgtgca cgaccctaac ggtgaataca tgttcatgag agcagtgaac 60
acagccaaaa aatctagact cacagatgtg acc 93
<210> 103
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1-H8 HC+IgD 铰链(R)的引物
<400> 103
acctggccag cgcgatgaga cggtcac 27
<210> 104
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1-H8 HC+IgD 铰链(F)的引物
<400> 104
accgtctcat cgcgctggcc aggttct 27
<210> 105
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AS+MluI+2173-CD8a_LS(F)的引物
<400> 105
cgacgcgtat ggccctccct gtcaccg 27
<210> 106
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2173-CD8a_LS+C9 ScFv(R)的引物
<400> 106
caactgtact tcgggccgag cggcgtg 27
<210> 107
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2173-CD8a_LS+C9 ScFv(F)的引物
<400> 107
gccgctcggc ccgaagtaca gttggtc 27
<210> 108
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C9 ScFv+hCD8a_铰链(R)的引物
<400> 108
tggggtagtg gttttaattt ccacttt 27
<210> 109
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C9 ScFv+hCD8a_铰链(F)的引物
<400> 109
gtggaaatta aaaccactac cccagca 27
<210> 110
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AS+Xho1+2173-CD3 ζ(R)的引物
<400> 110
ccgctcgagt taccgaggcg gcagggc 27
<210> 111
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AS+MluI+GMCSF rec.a LS(F)的引物
<400> 111
cgacgcgtat gcttctcctg gtgacaa 27
<210> 112
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSF rec.a LS+L1-H8 scFv(R)的引物
<400> 112
caactgtact tctgggatca ggaggaa 27
<210> 113
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSF rec.a LS+L1-H8 scFv(F)的引物
<400> 113
ctcctgatcc cagaagtaca gttggtc 27
<210> 114
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1-H8 scFv+铰链+hCD28(R)的引物
<400> 114
aattgcggcc gctttaattt ccacttt 27
<210> 115
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L1-H8 scFv+铰链+hCD28(F)的引物
<400> 115
gtggaaatta aagcggccgc aattgaa 27
<210> 116
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AS+Xho1+CD3-ζ (R)的引物
<400> 116
ccgctcgagt tagcgagggg gcagg 25
<210> 117
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mlu I-起始密码子-hCD8a LS
<400> 117
acgcgtatgg ccctccctgt caccgccctg ctgcttccgc tggctcttct gctccacgcc 60
gctcggccc 69
<210> 118
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD8a 铰链
<400> 118
accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60
tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120
gacttcgcct gcgat 135
<210> 119
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD8a TM
<400> 119
atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60
actctttact gt 72
<210> 120
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 4-1BB
<400> 120
aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag 60
actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc cggttcccag aggaggagga aggcggctgc 120
gaactg 126
<210> 121
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ-iso2M
<400> 121
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcgg 336
<210> 122
<211> 345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ-iso2M-终止密码子-Xho I
<400> 122
cgcgtgaaat tcagccgcag cgcagatgct ccagcctaca agcaggggca gaaccagctc 60
tacaacgaac tcaatcttgg tcggagagag gagtacgacg tgctggacaa gcggagagga 120
cgggacccag aaatgggcgg gaagccgcgc agaaagaatc cccaagaggg cctgtacaac 180
gagctccaaa aggataagat ggcagaagcc tatagcgaga ttggtatgaa aggggaacgc 240
agaagaggca aaggccacga cggactgtac cagggactca gcaccgccac caaggacacc 300
tatgacgctc ttcacatgca ggccctgccg cctcggtaac tcgag 345
<210> 123
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Mlu I-起始密码子-hGM-CSF rec.a LS
<400> 123
acgcgtatgc ttctcctggt gacaagcctt ctgctctgtg agttaccaca cccagcattc 60
ctcctgatcc ca 72
<210> 124
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 铰链
<400> 124
gcggccgca 9
<210> 125
<211> 117
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD28 pECD
<400> 125
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagccc 117
<210> 126
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ-iso2
<400> 126
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339
<210> 127
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD3ζ-iso2-终止密码子-Xho I
<400> 127
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaat aactcgag 348
<210> 128
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3E8 前导序列
<400> 128
gagctgggtc tttctcttct tcctgtcagt aactacaggt gtccactcc 49
<210> 129
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCD8 α前导序列
<400> 129
gccctccctg tcaccgccct gctgcttccg ctggctcttc tgctccacgc cgctcggccc 60
60
<210> 130
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hGM-CSF受体α-链前导序列
<400> 130
cttctcctgg tgacaagcct tctgctctgt gagttaccac acccagcatt cctcctgatc 60
cca 63

Claims (35)

1.一种抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，
包含重链可变区以及轻链可变区，上述重链可变区包含下述i)、ii)以及iii)，上述轻链可变区包含下述vi)、v)以及vi)，
i)包含下述氨基酸序列的重链的互补决定区1：
X1YAMX5，
其中，各自独立地，
X1为D、S或N，
X5为N、H或S，
ii)包含序列12、序列13或下述氨基酸序列的重链的互补决定区2：
AISSX5GX7X8X9YYADSVKG，
其中，各自独立地，
X5为S或T，
X7为S或G，
X8为S或T，
X9为I、T或K，
iii)包含选自序列15至序列23中的一种氨基酸序列的重链的互补决定区3，
iv)包含下述氨基酸序列的轻链的互补决定区1：
RASQSIX7X8X9LN，
其中，各自独立地，
X7为S或G，
X8为R、N或S，
X9为D或Y，
v)包含下述氨基酸序列的轻链的互补决定区2：
AX2SX4LQS，
其中，各自独立地，
X2为A或T，
X4为S、N、R或T，
vi)包含下述氨基酸序列的轻链的互补决定区3：
QQSX4SX6PX8T，
其中，各自独立地，
X4为Y或E，
X6为T、F或Y，
X8为Y、W，L或F。
2.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链的互补决定区1包含选自序列1至序列7中的一种氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链的互补决定区2包含选自序列8至序列14中的一种氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链的互补决定区1包含选自序列32至序列36中的一种氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链的互补决定区2包含选自序列37至序列42中的一种氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链的互补决定区3包含选自序列43至序列47中的一种氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区包含重链的骨架区1，上述重链的骨架区1包含选自序列24至序列26中的一种氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区包含重链的骨架区2，上述重链的骨架区2包含序列27的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区包含重链的骨架区3，上述重链的骨架区3包含序列28或序列29的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述重链可变区包含重链的骨架区4，上述重链的骨架区4包含序列30的氨基酸序列。
11.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区包含轻链的骨架区1，上述轻链的骨架区1包含序列48的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区包含轻链的骨架区2，上述轻链的骨架区2包含序列49的氨基酸序列。
13.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区包含轻链的骨架区3，上述轻链的骨架区3包含序列50的氨基酸序列。
14.根据权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段，其特征在于，上述轻链可变区包含轻链的骨架区4，上述轻链的骨架区4包含序列51的氨基酸序列。
15.一种融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段。
16.一种嵌合抗原受体多肽，其特征在于，包含：
(a)L1细胞粘附分子结合域；
(b)跨膜结构域；
(c)共刺激结构域；以及
(d)细胞内信号转导结构域。
17.根据权利要求16所述的嵌合抗原受体多肽，其特征在于，上述L1细胞粘附分子结合域包含权利要求1至14中任一项所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段。
18.根据权利要求16所述的嵌合抗原受体多肽，其特征在于，上述跨膜结构域包含选自由T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137以及CD154组成的组中的蛋白质的跨膜结构域。
19.根据权利要求16所述的嵌合抗原受体多肽，其特征在于，上述共刺激结构域为从选自与MHC I类分子、肿瘤坏死因子受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号转导淋巴细胞活化分子、活化NK细胞受体、B淋巴细胞和T淋巴细胞弱化因子、Toll样配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244，2B4)、CD84、CD96(触觉)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A，Ly108)、SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a以及CD83特异性结合的配体组成的组中的蛋白质获取的功能信号转导结构域。
20.根据权利要求16所述的嵌合抗原受体多肽，其特征在于，上述细胞内信号转导结构域包含4-1BB、CD28、OX40、CD3ζ的功能信号转导结构域或它们的组合。
21.一种核酸分子，其特征在于，对权利要求16至20中任一项所述的嵌合抗原受体多肽进行编码。
22.根据权利要求21所述的核酸分子，其特征在于，上述核酸分子包含选自序列60至序列63中的一种核甘酸序列。
23.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求21所述的核酸分子。
24.一种效应细胞，其特征在于，表达权利要求16至20中任一项所述的嵌合抗原受体多肽。
25.根据权利要求24所述的效应细胞，其特征在于，上述效应细胞选自由树突状细胞、杀伤树突状细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞及它们的前体细胞组成的组中。
26.根据权利要求25所述的效应细胞，其特征在于，上述T淋巴细胞选自由炎症性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞组成的组中。
27.一种药剂学组合物，其用于治疗或诊断癌症或炎症性疾病，其特征在于，包含权利要求1所述的抗-L1细胞粘附分子抗体或其抗原结合片段。
28.一种药剂学组合物，其用于治疗癌症或炎症性疾病，其特征在于，包含表达权利要求16所述的嵌合抗原受体多肽的效应细胞。
29.根据权利要求27或28所述的药剂学组合物，其特征在于，上述癌症为实体癌。
30.根据权利要求29所述的药剂学组合物，其特征在于，上述实体癌选自由胃癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胆囊癌，肝细胞癌、胆管癌、胰管腺癌、食道癌、肾细胞癌、直肠癌、结肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤以及星形细胞瘤组成的组中。
31.根据权利要求27或28所述的药剂学组合物，其特征在于，上述炎症性疾病为炎症性肠病。
32.一种癌症或炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，包括向需要治疗的对象体给药表达权利要求16所述的嵌合抗原受体的效应细胞的步骤。
33.根据权利要求32所述的癌症或炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，上述癌症为实体癌。
34.根据权利要求33所述的癌症或炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，上述实体癌选自由胃癌、乳腺癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、胃肠道间质瘤、卵巢癌、黑色素瘤、胆囊癌、肝细胞癌、胆管癌、胰管腺癌、食道癌、肾细胞癌、直肠癌、结肠癌、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤以及星形细胞瘤组成的组中。
35.根据权利要求32所述的癌症或炎症性疾病的治疗方法，其特征在于，上述炎症性疾病为炎症性肠病。
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WO (1) WO2020080908A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113831411A (zh) * 2021-09-18 2021-12-24 南京融捷康生物科技有限公司 针对l1cam的单域抗体及其衍生蛋白和应用
CN114213536A (zh) * 2021-12-24 2022-03-22 北京市神经外科研究所 Cd133抗体、嵌合抗原受体及其应用
CN114933636A (zh) * 2022-06-24 2022-08-23 浙江省人民医院 靶向l1cam的多肽及其应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11884729B2 (en) 2018-06-29 2024-01-30 ApitBio, Inc Anti-L1CAM antibodies and uses thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150038684A1 (en) * 2012-02-13 2015-02-05 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
CN107523549A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 上海细胞治疗研究院 一种高效稳定表达激活型抗体的car‑t细胞及其用途
CN107709356A (zh) * 2015-06-26 2018-02-16 南加利福尼亚大学 用于肿瘤特异性活化的掩蔽嵌合抗原受体t细胞

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
KR20000006334A (ko) 1998-06-26 2000-01-25 이선경 바이러스코딩염기서열이전혀없는고효율레트로바이러스벡터
KR100373821B1 (ko) 2000-09-08 2003-02-26 주식회사 바이로메드 세포에서 유래한 변형된 비코딩 서열을 갖는 개선된고효율 레트로바이러스 벡터
KR101501736B1 (ko) * 2008-12-05 2015-03-12 한국생명공학연구원 인간 및 마우스에서 발현하는 ｌ1ｃａｍ에 특이적으로 결합하는 재조합 단일클론항체 및 그 이용
KR101504039B1 (ko) * 2012-11-16 2015-03-19 강원대학교산학협력단 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
JP6498146B2 (ja) 2016-04-19 2019-04-10 富士フイルム株式会社 積層フィルムおよびその製造方法、偏光板、液晶パネル、液晶表示装置ならびにタッチパネル

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150038684A1 (en) * 2012-02-13 2015-02-05 Seattle Children's Hospital (dba Seattle Children's Research Institute) Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
CN107709356A (zh) * 2015-06-26 2018-02-16 南加利福尼亚大学 用于肿瘤特异性活化的掩蔽嵌合抗原受体t细胞
CN107523549A (zh) * 2016-06-20 2017-12-29 上海细胞治疗研究院 一种高效稳定表达激活型抗体的car‑t细胞及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAO HONG ET AL.: ""Diverse Solid Tumors Expressing a Restricted Epitope of L1-CAM Can Be Targeted by Chimeric Antigen Receptor Redirected T Lymphocytes"", 《J IMMUNOTHER》, vol. 37, no. 2, pages 93 - 104, XP009195500, DOI: 10.1097/CJI.0000000000000018 *
HAO HONG ET AL.: ""L1 Cell Adhesion Molecule-Specific Chimeric Antigen Receptor-Redirected Human T Cells Exhibit Specific and Efficient Antitumor Activity against Human Ovarian Cancer in Mice"", 《PLOS ONE》, vol. 11, no. 1, pages 1 - 18, XP055703051, DOI: 10.1371/journal.pone.0146885 *
蔡慧等: ""嵌合抗原受体基因修饰 T 淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中的研究"", 《现代肿瘤医学》, vol. 22, no. 11, pages 2730 - 2734 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113831411A (zh) * 2021-09-18 2021-12-24 南京融捷康生物科技有限公司 针对l1cam的单域抗体及其衍生蛋白和应用
CN114213536A (zh) * 2021-12-24 2022-03-22 北京市神经外科研究所 Cd133抗体、嵌合抗原受体及其应用
CN114933636A (zh) * 2022-06-24 2022-08-23 浙江省人民医院 靶向l1cam的多肽及其应用

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Publication number Publication date
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