KR20220167207A

KR20220167207A - Cadm1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR20220167207A
Application number: KR1020220051708A
Authority: KR
Inventors: 이석묵; 황규상; 윤진환; 이지현; 이송재; 전영하; 주안나; 이나림
Original assignee: 주식회사 셀랩메드
Priority date: 2021-06-10
Filing date: 2022-04-26
Publication date: 2022-12-20

Abstract

본 발명은 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다양한 암에서 고발현되는 마커인 CADM1에 특이적으로 결합하므로, CADM1의 고발현과 관련된 암의 예방 또는 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있으며, CADM1의 고발현과 관련된 암의 진단키트로서도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도 {Antibody or antigen binding fragment thereof specifically binding to CADM1 peptide and Uses thereof}

본 발명은 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들을 이용한 암의 진단 또는 치료용도에 관한 것이다.

폐암은 암세포의 크기에 따라 소세포폐암(SCLC)과 비소세포폐암(NSCLC)로 구분된다. 소세포폐암은 폐암에서 10~15% 정도의 비중을 차지하지만, 암세포의 크기가 작아 조기진단이 어렵고, 수술로 제거하기 힘든 암종으로 알려져 있다. 소세포폐암은 화학요법을 제외하고 치료 옵션이 없어 지난 20년간 신약개발의 불모지로 남아있던 암 종이다. 소세포폐암 환자의 5년 생존율은 비소세포폐암 환자의 5년 생존율의 1/4 수준인 6.5%에 불과해 예후가 나쁜 것으로 알려져 있다. Roche의 PD-L1 표적 항체 의약품인 Tecentriq(atezolizumab)과 화학제재와의 병용요법은 소세포폐암 환자의 전체 생존율을 10.3개월에서 12.3개월로 늘리는 등 치료 개선 효과를 보여 미 식약처(FDA)와 유럽의약품청의 승인을 받은 유일한 치료법임. 하지만, 머크(MSD)의 Keytruda+화학요법 및 BMS의 Opdivo 및 Opdivo+Yervoy 병용요법은 소세포암 임상 3상에서 실패하는 등 소세포암 치료 예후를 개선할 수 있는 새로운 치료제 개발이 시급히 필요한 실정이다.

Funaki et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol 534, 2021, 172-178

본 발명자들은 CADM1 펩타이드를 타겟으로 하는 암의 예방 또는 치료를 위한 항체 및 이를 이용한 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 신규한 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개발하고, 이들 항체 또는 항원 결합 단편이 다양한 CADM1 펩타이드 항원에 대해 높은 친화도를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 Cell Adhesion Molecule 1 (CADM1) 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 효과기 세포를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 Cell Adhesion Molecule 1 (CADM1) 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 또는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 효과기 세포를 포함하는 암 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 Cell Adhesion Molecule 1 (CADM1) 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물 또는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 효과기 세포, 또는 상기 암 치료용 약제학적 조성물을 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에서, 용어 "Cell Adhesion Molecule 1 (CADM1)"은 인간에서 CADM1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질로, 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 멤버이다. CADM1 유전자는 비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)에서 종양억제자 유전자(tumor suppressor gene)로 분리되었고, 상피 세포의 세포-세포간 부착 기능에 작용하는 것으로 알려져 있다.

소세포폐암(small cell lung cancer, SCLC)의 신규 종양 마커인 CADM1은 종양에서 과발현되며, 비부착의존성(anchorage-independent)을 촉진한다고 알려져 있다(Funaki et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol 534, 2021, 172-178). 도 1은 CADM1 단백질의 단백질 일차 구조 및 shedding mechanism을 나타낸 도이다. CADM1은 스플라이싱에 의해 여러가지 변이 이형체(variant isoform)가 존재하고, CADM1 Variant 9 (V9)이 존재하는 경우, CADM1의 exon9 끝부분에서 cleavage가 일어나고, 세포막과 연결된 15개의 아미노산 (DSRAGEEGSIRAVDH)가 노출되는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 Cell Adhesion Molecule 1 (CADM1) 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 1) 내지 17)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다:

1) a) 서열번호 1로 표시되는 HCDR1, 서열번호 2로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 3으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 4로 표시되는 LCDR1, 서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 6으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

2) a) 서열번호 10로 표시되는 HCDR1, 서열번호 11로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 12로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 13로 표시되는 LCDR1, 서열번호 14로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 15로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

3) a) 서열번호 19로 표시되는 HCDR1, 서열번호 20으로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 21로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 22로 표시되는 LCDR1, 서열번호 23으로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 24로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

4) a) 서열번호 28로 표시되는 HCDR1, 서열번호 29로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 30으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 31로 표시되는 LCDR1, 서열번호 32로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 33으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

5) a) 서열번호 37로 표시되는 HCDR1, 서열번호 38로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 39로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 40으로 표시되는 LCDR1, 서열번호 41로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 42로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

6) a) 서열번호 46으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 47로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 48로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 49로 표시되는 LCDR1, 서열번호 50으로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 51로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

7) a) 서열번호 55로 표시되는 HCDR1, 서열번호 56으로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 57로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 58로 표시되는 LCDR1, 서열번호 59로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 60으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

8) a) 서열번호 64로 표시되는 HCDR1, 서열번호 65로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 66으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 67로 표시되는 LCDR1, 서열번호 68로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 69로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

9) a) 서열번호 73으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 74로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 75로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 76으로 표시되는 LCDR1, 서열번호 77로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 78로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

10) a) 서열번호 82로 표시되는 HCDR1, 서열번호 83으로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 84로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 85로 표시되는 LCDR1, 서열번호 86으로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 87로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

11) a) 서열번호 91로 표시되는 HCDR1, 서열번호 92로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 93으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 94로 표시되는 LCDR1, 서열번호 85로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 96으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

12) a) 서열번호 100으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 101로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 102로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 103으로 표시되는 LCDR1, 서열번호 104로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 105로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

13) a) 서열번호 109로 표시되는 HCDR1, 서열번호 110으로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 111로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 112로 표시되는 LCDR1, 서열번호 113으로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 114로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

14) a) 서열번호 118로 표시되는 HCDR1, 서열번호 119로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 120으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 121로 표시되는 LCDR1, 서열번호 122로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 123으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

15) a) 서열번호 127로 표시되는 HCDR1, 서열번호 128로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 129로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 130으로 표시되는 LCDR1, 서열번호 131로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 132로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

16) a) 서열번호 136으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 137로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 138로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 139로 표시되는 LCDR1, 서열번호 140으로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 141로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및

17) a) 서열번호 145로 표시되는 HCDR1, 서열번호 146으로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 147로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 148로 표시되는 LCDR1, 서열번호 149로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 150으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 1) 내지 17)의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 각각 본 발명의 실시예에서 선별한 인간 항체 라이브러리에서 도출한 클론 5RA5, 5RA7, 5RA8, 5RG9, 5RH12, 6RC7, 및 5RB6과, 닭 면역 항체 라이브러리에서 도출한 클론 4A2, 4A8, 4C8, 4H7, RB11, RH6, 3C5, 3G10, 5A2, 및 5A5로부터 유래한 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 1) 내지 17)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다:

1) 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

2) 서열번호 16로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 17로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

3) 서열번호 25로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 26로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

4) 서열번호 34로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 35로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

5) 서열번호 43로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 44로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

6) 서열번호 52로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 53로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

7) 서열번호 61로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 62로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

8) 서열번호 70로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 71로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

9) 서열번호 79로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 80로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

10) 서열번호 88로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 89로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

11) 서열번호 97로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 98로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

12) 서열번호 106로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 107로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

13) 서열번호 115로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 116로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

14) 서열번호 124로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 125로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

15) 서열번호 133로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 134로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;

16) 서열번호 142로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 143로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및

17) 서열번호 151로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 152로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 1) 내지 17)로 이루어진 군으로부터 선택되는 scFv이나, 이에 한정되는 것은 아니다:

1) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

2) 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

3) 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

4) 서열번호 36의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

5) 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

6) 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

7) 서열번호 63의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

8) 서열번호 72의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

9) 서열번호 81의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

10) 서열번호 90의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

11) 서열번호 99의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

12) 서열번호 108의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

13) 서열번호 117의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

14) 서열번호 126으의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

15) 서열번호 135의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;

16) 서열번호 144의 아미노산 서열로 표시되는 scFv; 및

17) 서열번호 153의 아미노산 서열로 표시되는 scFv.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 CADM1 펩타이드는 인간 유래 CADM1 펩타이드 또는 마우스 유래 CADM1 펩타이드이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 307 또는 308의 아미노산 서열로 표시되는 CADM1 펩타이드에 결합하는 것이다.

상기 서열번호 307의 아미노산 서열은 인간 유래 CADM1 펩타이드를 표시하고, 상기 서열번호 308의 아미노산 서열은 마우스 유래 CADM1 펩타이드를 표시한다.

상기 서열번호 309의 아미노산 서열은 재조합 인간 CADM1 세포외 도메인(recombinant human CADM1 extracellular domain (rhCADM1 ECD))을 표시하고, 상기 서열번호 310의 아미노산 서열은 재조합 인간 CADM1 isoform 5 (recombinant human CADM1 isoform 5 (rhCADM1 isoform 5))를 표시한다. 상기 서열번호 311의 아미노산 서열은 C말단 결손 재조합 인간 CADM1 isoform 5 (C-terminal truncated recombinant human CADM1 isoform 5 (rhCADM1 isoform 5 β를 표시한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 가변영역의 프레임워크서열은 인간 유래 프레임워크 서열 또는 닭 유래 프레임워크 서열로부터 유래하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체는 당 업계에 알려져 있는 다양한 파지 디스플레이(phage display)방법을 사용하여 생성될 수 있고, [Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50]; [Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184, 177-186]; [Kettleborough et al. 1994, Eur. J. Immunol, 24, 952-958]; [Persic et al., 1997, Gene, 187, 9-18]; 및 [Burton et al., 1994, Adv. Immunol., 57, 191-280]; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 및 WO 95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 및 5,969,108 에 게시된 것을 포함한다.

본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 CADM1 펩타이드에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(kappa) 및 람다(lambda) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

본 명세서에서, 용어 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, 화학적으로 연결된 F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 항체는 구체적으로 scFv 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 구체적으로는, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 2(IgG2), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 구체적으로는 카파형이다.

본 명세서에서, 용어 “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 및 경쇄(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.

본 명세서에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 또는 원래 그대로의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이의 항원 결합 단편들(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fab3, Fv 및 이의 변이체들), 하나 또는 그 이상의 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 체인 항체(scFv), scFv-Fc, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 다른 변형된 배열형태로서 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합으로 변형된 항체를 포함한다. 변형된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 구체적인 예에는 나노바디, AlbudAbs, DARTs(dual affinity re-targeting), BiTEs(bispecific T-cell engager), TandAbs(tandem diabodies), DAFs(dual acting Fab), two-in-one antibodies, SMIPs(small modular immunopharmaceuticals), FynomAbs(fynomers fused to antibodies), DVD-Igs(dual variable domain immunoglobulin), CovX-bodies(peptide modified antibodies), 듀오바디 및 triomAbs이 포함된다. 이와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편들의 목록은 상기에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH 및 VL/Vk에서 다음의 순서로 나타난다:

(a) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4; 및

(b) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 다음과 같은 순서로 나타날 수 있다:

(a) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4; 및

(b) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4.

본 명세서에서, 용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 항원과 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터, VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10^-6 M 이하(예컨대, 9 x 10^-7 M, 8 x 10^-7 M, 7 x 10^-7 M, 6 x 10^-7 M, 5 x 10^-7 M, 4 x 10^-7 M, 3 x 10^-7 M, 2 x 10^-7 M, 또는 1 x 10^-7 M), 바람직하게는 1 x 10^-7 M 이하(예컨대, 9 x 10^-8 M, 8 x 10^-8 M, 7 x 10^-8 M, 6 x 10^-8 M, 5 x 10^-8 M, 4 x 10^-8 M, 3 x 10^-8 M, 2 x 10^-8 M, 또는 1 x 10^-8 M), 보다 바람직하게는 1 x 10^-8 M 이하(예컨대, 9 x 10^-9 M, 8 x 10^-9 M, 7 x 10^-9 M, 6 x 10^-9 M, 5 x 10^-9 M, 4 x 10^-9 M, 3 x 10^-9 M, 2 x 10^-9 M, 또는 1 x 10^-9 M)의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 K_D는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명, 및 효소결합면역흡착검사(Enzyme linked Immunosorbent assay, ELISA) 등을 포함한다.

본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.

또한 본 명세서에서 용어, "인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.

본 명세서에서 용어, "키메라(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "인간화 항체"란, 비-인간(예를 들어, 마우스, 닭) 항체의 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 닭, 랫트 또는 토끼의 CDR의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다.

또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로는 2개의 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 상기 도메인에서 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린의 FR 영역의 서열을 가진다. 상기 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc region)에, 적어도 일부 또는 실질적인 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc region)서열을 포함한다.

상기 항체 또는 항원 결합 단편의 변이체는 "실질적 유사성"을 가지는 것으로, 2개의 펩타이드 서열이 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 유사성의 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능적 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 아미노산 서열에 대하여 소폭의 변화, 즉, 3차 구조 및 항체의 기능에 거의 영향을 미치지 않는 변형을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서 어떤 구현예의 경우 상술한 서열과 일치하지 않더라도 적어도 100%, 93%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 이상의 유사성을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 서열의 CDR을 포함하는 중쇄 가변영역 및 경쇄가 변영역을 포함하는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 체인 항체(scFv), Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다른 구현예에서 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 scFv이다.

본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 (Gly-Ser)n, (Gly₂-Ser)n, (Gly₃-Ser)n 또는 (Gly₄-Ser)n 등의 링커에 의해 연결된다. 여기서 n은 1 내지 6의 정수이고, 구체적으로는 3 내지 4이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 scFv의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역은 예를 들어 다음의 배향으로 존재할 수 있다: 경쇄가변영역-링커-중쇄가변영역 또는 중쇄가변영역-링커-경쇄가변영역.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 제공한다:

(a) 상기 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, CADM1 펩타이드 결합 도메인(CADM1 peptide binding domain);

(b) 막횡단 도메인(transmembrane domain, TM); 및

(c) 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain, ICD).

본 명세서에서, 용어 “키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)”는 효과기 세포의 신호전달 도메인 또는 효과기 세포의 활성화 도메인(e.g. T-세포 신호전달 도메인 또는 T-세포 활성화 도메인)에 연결된 타겟 결합 도메인(e.g. scFv)을 포함하는 인공적으로 제작된 하이브리드 단백질(융합 단백질) 또는 폴리펩타이드이다. 키메라 항원 수용체(CAR)는 일반적으로 단일클론항체의 항원-결합 성질을 이용하여 비-MHC-제한 방식으로, 선택된 표적에 대한 효과기 세포 특이성 및 반응성을 재유도하는 능력을 갖는다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 CAR을 발현하는 효과기 세포(예컨대, T-세포)에게 항원 처리와 무관하게 항원을 인식하는 능력을 제공하여, 종양 도피의 주요 메커니즘을 회피시킨다. 또한, CAR은 T-세포에서 발현될 때, 내재성 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬과 이량체화되지 않는다.

본 발명의 상기 키메라 항원 수용체는 상술한 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 세포외 항원 결합 도메인(extracellular antigen binding domain)으로서 포함한다. 따라서, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 항-CADM1 키메라 항원 수용체(anti-CADM1 CAR), 항-CADM1 CAR, CADM1 CAR, 또는 CADM1 특이적 CAR 등으로 표현된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키메라 항원 수용체는 본 발명에서 상술한 항-CADM1 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 CADM1 결합 도메인을 포함하므로 CADM1 항원을 인식하며 세포의 표면에서 발현된다.

본 발명의 키메라 항원 수용체는 세포의 표면에서 발현되므로, 막횡단 도메인을 포함한다. 상기 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인, 또는 이들의 전부 또는 일부 서열의 조합일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 막횡단 도메인은 CD8, CD8 알파의 막횡단 도메인, 또는 CD28의 막횡단 도메인이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드는 공동자극 도메인(costimulatory domain)을 추가적으로 포함한다.

상기 공동자극 도메인은 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 싸이토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (signaling lymphocytic activation molecule, SLAM), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA(B an T lymphocyte attenuator), 톨-유사 리간드 수용체(Toll-like ligand receptor), OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 공동자극 도메인은 CD28, OX40, 4-1BB (CD137), 및 ICOS (CD278)로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인일 수 있고, 보다 구체적으로는 서열번호 79의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 CD28의 기능적 신호전달 도메인, 서열번호 80의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 OX40의 기능적 신호전달 도메인, 서열번호 101 또는 서열번호 120의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 4-1BB의 기능적 신호전달 도메인, 서열번호 102의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되는 ICOS의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이들의 전부 또는 일부 서열의 조합이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이들의 조합이다. 상기 세포내 신호전달 도메인은 가장 구체적으로는 CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인이다.

본 발명의 키메라 항원 수용체의 상기 CADM1 결합 도메인은 힌지 도메인(또는 스페이서)에 의해 상기 막횡단 도메인에 연결된다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 힌지 도메인은 IgG1, IgG2, IgG4, 또는 IgD에서 유래한 힌지, CD8 또는 CD28에서 유래한 힌지, CD28에서 유래한 세포외 도메인(ECD) 또는 이들의 조합이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자(nucleic acid molecule)”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.

이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 인코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성(예컨대 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성(예컨대 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성(예컨대 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성(예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성(예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 60% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이에 존재하는 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.

서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 CADM1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 중쇄, 및/또는 경쇄를 이루는 폴리펩티드와 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 첨부된 서열목록에 수록되어 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "벡터"는 전달 벡터와 발현 벡터를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연결된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로 상기 전달 벡터는 자가 복제성 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 세포 내로의 핵산의 전이를 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물, 예컨대 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 추가적으로 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다. 바이러스성 전달 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 본발명의 구체적인 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 프로모터를 추가로 포함한다. 상기 프로모터는 예컨대 EF-1 프로모터일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 유전자 전달을 위해 선택된 유전자는 레트로바이러스 벡터 내에 삽입되고, 레트로바이러스 입자 내에 패키징될 수 있다. 이어서 재조합된 레트로바이러스는 인 비보, 또는 인 비트로에서 목적하는 숙주 세포로 전달될 수 있다. 많은 레트로바이러스 벡터가 관련 기술분야에 알려져 있다.

본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위하여, 발현시킬 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 인자(cis-acting element)를 포함하고, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에 의해 제공될 수 있다. 상기 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 스위치 분자를 코딩하는 핵산 분자는 상기 벡터의 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다. 본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 유전자 클로닝을 위한 벡터, 단백질의 발현을 위한 벡터, 또는 유전자의 전달을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체인 경우, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를 포함하는 CAR 폴리펩타이드의 발현을 평가하기 위한 선택표지로서 선택가능 마커 유전자 및/또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다.

선택가능 마커 유전자로는 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린 등에 대한 내성 유전자가 있다. 리포터 유전자로는 루시페라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 또는 녹색형광 단백질 등의 유전자를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 벡터는 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들면, 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 물리적 수단은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 폭격(particle bombardment), 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 상기 화학적 수단은 콜로이드 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노 캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀 (micelle), 혼합된 마이셀, 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 또한, 상기 생물학적 수단은 상술한 렌티바이러스, 레트로바이러스 등, DNA 또는 RNA 벡터의 사용을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 재조합 벡터를 포함하는 분리된 숙주세포를 제공한다. 상기 숙주세포는 재조합 벡터에 의해 형질전환 되었다고 표현될 수 있다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된”은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된”, "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명에서 숙주세포 내에 포함된 재조합 벡터는 숙주 세포 내에서 재조합된 상기의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 융합단백질을 발현할 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 융합단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.

상기 배양은 통상적으로 진탕 배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 효과기 세포를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 효과기 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, 자연살해 세포, B 림프구, T 림프구, 대식세포 및 이들의 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 T 림프구는 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 또는 헬퍼 T 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 융합단백질을 제공한다.

본 발명에서 상기 융합단백질은 상기 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 생산성, 정제 효율, 생물학적 활성의 향상, 융합단백질의 안정성 증가, 폴딩(folding)의 향상 및/또는 추가적인 기능성을 가진 기능적 모이어티(moiety)와의 결합을 위하여 제조된다. 상기 융합단백질은 2 이상의 폴리펩타이드 체인이 재조합 융합단백질(recombinant fused protein)로 발현되는 것을 통해 공유결합에 의해 연결되거나, 또는 화학적 컨쥬게이션(conjugation)에 의해 2 이상의 폴리펩타이드 체인이 연결된 컨쥬게이트(conjugate)의 형태로 구현될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 i) CADM1 펩타이드 에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 ii) 추가적인 폴리펩타이드가 연결된 폴리펩타이드 복합체를 제공한다.

상기 ii) 추가적인 폴리펩타이드는 상술한 항체 또는 항원 결합 단편이거나, 항체 또는 항원 결합 단편이 아닌 "타겟 결합 폴리펩타이드"이다.

본 발명의 폴리펩타이드 복합체를 구성하는 ii) 추가적인 폴리펩타이드로서의 항체 또는 항원 결합 단편, 및 상기 타겟 결합 폴리펩타이드 혹은 타겟의 폴리펩타이드는 상기 i) CADM1 펩타이드-특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 동일 또는 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 i) CADM1 펩타이드-특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 ii)의 추가적인 폴리펩타이드와 동일한 항원을 타겟하는 경우 서로 상이한 에피토프(epitope)를 갖는 것이 바람직하다.

본 명세서에서, 용어 "타겟 결합 폴리펩타이드(target binding polypeptide)"는 항체와 같이 타겟 항원 또는 합텐에 대한 결합 친화성을 가지나, 항체와는 구조적으로 관련성이 없는 비면역글로불린 폴리펩타이드 분자를 말한다. 상기 타겟 결합 폴리펩타이드는 항체 유사 분자(antibody-like molecule) 또는 항체유사체(antibody mimetics)라고도 불리며, 약 150 kDa의 분자량을 가지는 항체와는 달리 일반적으로는 3-20 kDa의 분자량을 가진다. 상기 타겟 결합 폴리펩타이드는 상기한 단백질 A(protein A)의 Z-도메인에서 유래한 어피바디, 감마-B 크리스탈린 또는 유비퀴틴에서 유래한 어필린(Affilin), 시스타틴(cystatin)에서 유래한 어피머(Affimer), Sulfolobus acidocaldarius의 Sac7d로부터 유래한 어피틴(Affitin), 트리플 헬릭스 코일드 코일로부터 유래한 알파바디(Alphabody), 리포칼린(lipocalin)으로부터 유래한 안티칼린(Anticalin), 세포막 수용체의 도메인으로부터 유래한 아비머(Avimer), 안키린 반복 모티프(ankyrin repeat motif)로부터 유래한 DARPin, Fyn의 SH3 도메인으로부터 유래한 피노머(Fynomer), 프로테아제 억제제(protease inhibitor)의 쿠니츠 도메인으로부터 유래한 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunits domain peptide), 피브로넥틴의 10번째 타입 3 도메인(10th type III domain of fibronectin)으로부터 유래한 모노바디(Monobody), Clostridium perfringens의 NagH의 탄수화물 결합 모듈 32-2(carbohydrate binding module 32-2)로부터 유래한 나노클램프(nanoCLAMP) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기한 타겟 결합 폴리펩타이드는 파아지 디스플레이, 리보솜 디스플레이 등 당업계에 알려진 다양한 스크리닝 방법을 통하여 임의의 타겟 항원 또는 합텐에 대한 결합친화성을 갖도록 엔지니어링 될 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따른 상기 폴리펩타이드 복합체는 각각의 항체 또는 항원 결합 단편 및 폴리펩타이드의 단량체가 연결된 다량체 형태이다. 상기 본 발명의 폴리펩타이드 복합체는 서로 공유결합으로 연결되며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 폴리펩타이드 복합체는 융합 단백질(fused protein) 또는 컨쥬게이트의 형태로 구현될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드 복합체는 융합 단백질(fused protein) 또는 컨쥬게이트의 형태로 구현될 수 있다. 따라서 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 화학적 컨쥬게이션(유기 화학 방법으로 알려진) 또는 다른 수단(예를 들어, 복합체를 융합 단백질로서 발현하거나, 직접적으로 또는 링커(예컨대, 아미노산 링커))을 통하여 간접적으로 연결될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리펩타이드 복합체를 이루는 각 폴리펩타이드 단량체는 적어도 하나의 링커로 연결된다. 이 경우 상기 링커는 일반식 (GnSm)p 또는 (SmGn)p로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다:

여기에서 상기 n, m 및 p는 독립적으로,

n은 1 내지 7의 정수이고;

m은 0 내지 7의 정수이며;

n과 m의 합은 8이하의 정수이고; 및

p는 1 내지 7의 정수이다.

본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 링커는 n = 1 내지 5이고, m = 0 내지 5이다. 보다 구체적인 구현예의 경우, n = 4이고, m = 1이다. 보다 더 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 (GGGGS)₃ 이다. 또 다른 구현예의 경우, 상기 링커는 GGGGS이다. 또 다른 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 VDGS이다. 또 다른 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 ASGS이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드 복합체는 타겟이 2 이상인 이중 항체, 또는 타겟이 3 이상인 다중 항체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 융합단백질 또는 폴리펩타이드 복합체를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 일 양태에 따른 상기 핵산 분자는 상술한 본 발명의 일 양태에 따른 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자와 관련하여 공통된 내용이 모두 동일하게 적용되며, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, CADM1의 고발현과 관련된 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 CADM1의 고발현과 관련된 암은 갑상선암, 고환암, 간암, 자궁내막암, 췌장암, 전립선암, 유방암, 폐암, 위암, 대장암, 성인 T 세포 백혈병, 및 성인 T 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폐암은 소세포폐암이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여, 근육 투여, 복강 내 투여, 척수강 내 투여, 뇌내 투여, 흉골내 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 mg/kg이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 명세서에서 용어 “예방”은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암의 진단용 조성물을 제공한다.

상술한 본 발명의 CADM1 펩타이드-특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 소세포 폐암 등의 환자에서 과발현되는 CADM1에 특이적으로 결합하는 바, 암의 진단용도로도 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 암 진단용 조성물은 상술한 본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 구성성분으로 포함하는 바, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

상술한 암 진단용 조성물 또는 키트는 본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 CADM1 펩타이드를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차 항체로서의 본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 구체적으로는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차 항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

상기 포획항체 및 검출항체로는 본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편의 클론 중 서로 다른 에피토프에 결합하는 2종의 항체 또는 항원 결합 단편을 이용할 수 있다.

본 발명의 키트에 적용될 수 있는 시료는 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항체는 인 비보 또는 인 비트로 이미징에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블이 결합된 결합체를 포함하는 이미지용 조성물을 제공한다.

상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe₃O₄,γ-Fe₂O₃, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, ¹¹C, ¹⁵O, ¹³N, P³², S³⁵, ⁴⁴Sc, ⁴⁵Ti, ¹¹⁸I, ¹³⁶La, ¹⁹⁸Tl, ²⁰⁰Tl, ²⁰⁵Bi 및 ²⁰⁶Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 효과기 세포를 포함하는, 암의 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 상술한 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 효과기 세포를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

상기 약제학적 조성물은 상기한 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 효과기 세포를 포함하는 면역치료용 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 "면역치료(immunotherapy)"란, 면역체계가 암을 제거하도록 돕는 암의 치료방법이다. 면역치료는 능동적 면역치료와 수동적 면역치료로 구분된다. 능동적 면역치료는 i) 암세포 또는 암세포에 의해 생성된 물질을 인체에 주입하여 면역체계를 활성화시키는 암 백신 치료(cancer vaccine therapy), ii) 사이토카인(인터페론, 인터류킨 등), 성장인자 등 면역조절제(immune-modulating agents)를 투여하여 특정 백혈구를 활성화시키는 면역조절 치료를 포함한다. 수동적 면역치료는 특정 암세포에 결합하는 치료적 항체(therapeutic antibody)와 면역세포치료(immune cell therapy)를 포함한다. 면역세포치료는 구체적으로 수지상세포 백신 치료(dendritic cell vaccine therapy)와 CAR-T(chimeric antigen receptor T cell) 치료, NK 세포 치료(natural killer cell therapy), CTL 치료(cytotoxic T lymphocyte therapy), 입양 세포 전이(adoptive cell transfer) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 면역치료는 주로 상술한 면역세포치료를 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 표적세포의 CADM1 펩타이드 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 포함하므로, CADM1의 고발현과 관련된 질환의 진단 또는 치료에 효과적이다.

상기 CADM1의 고발현과 관련된 질환으로는 암이 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 CAR-발현 효과기 세포, 예를 들어 복수의 CAR-발현 효과기 세포를 하나 이상의 제약상 또는 생리학상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합으로 포함할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 완충제, 예컨대 중성 완충 염수, 포스페이트 완충 염수 등; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 어주번트 (예를 들어, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 투여를 위해 제제화된다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 종양 내 투여, 뇌내 투여, 두개골 내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 피부내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 일 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 주사에 의해 투여된다. 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위 내로 직접 투여될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 "면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양-억제 유효량", 또는 "치료량"에 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 결정되며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있으며, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 것이다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "항종양"은 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 종양 세포 증식의 감소, 종양 세포 생존의 감소, 또는 암적 병태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본원에 기재된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 10⁴ 내지 10⁹세포/kg 체중, 몇몇 경우에 10⁵내지 10⁶세포/kg 체중 (상기 범위 내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있는 것으로 일반적으로 언급될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 투여량으로 다수의 횟수로 투여할 수 있다. 세포는 면역요법에서 일반적으로 알려진 주입 기술을 이용하여 투여할 수 있다 (예를 들어 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조).

본 발명의 약제학적 조성물은 또한 상술한 유효성분 이외에 다른 약제학적 활성 약제 및 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 상기 "조합"은 동시 또는 병용투여로 표현될 수 있다. 본원에 기재된 CAR-발현 효과기 세포 및 적어도 하나의 추가의 치료제는 동시에, 동일한 조성물 내에 또는 별개의 조성물 내에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적인 투여를 위해, 본원에 기재된 CAR-발현 세포가 먼저 투여될 수 있고 추가의 작용제는 두 번째로 투여될 수 있거나, 투여 순서가 역전될 수 있다.

상기 본 발명의 약제학적 조성물과 조합하여 사용될 수 있는 치료제로는 당업계에 공지된 1 이상의 화학치료제(예컨대 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등), 1 이상의 표적치료제(예컨대 베바시주맙(bevacizumab), 올라파립(olaparib) 등), PD-1/PD-L1 특이적인 면역관문 억제제(예컨대 옵디보, 키트루다)가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물, 키메라 항원 수용체를 발현하는 효과기 세포를 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 치료가 필요한 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.

본 발명의 치료방법의 대상 질병인 상기 암은 약학적 조성물의 치료 대상 질병과 관련하여 정의한 것과 같다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물 또는 인간이다.

본 발명의 암의 치료방법은 상술한 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 방법이므로, 중복되는 내용에 대해서는 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다양한 암에서 고발현되는 마커인 CADM1에 특이적으로 결합하므로, CADM1의 고발현과 관련된 암의 예방 또는 치료용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있으며, CADM1의 고발현과 관련된 암의 진단키트로서도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 CADM1 단백질의 단백질 일차 구조 및 shedding mechanism을 나타낸 도이다.
도 2는 SDS-PAGE를 이용한 BSA-conjugated human & mouse CADM1 peptide 생성 여부를 나타낸 도이다. (carrier protein-conjugated human CADM1 peptide(Hu), carrier protein-conjugated mouse CADM1 peptide (Mo))
도 3 및 도 4는 항원 특이적 항체선별을 위한 온도 조건(4℃ 및 RT)별로 차수에 따른 Input 대비 output titer 분석 결과를 나타낸 도이다(도 3: 4℃, 도 4: RT).
도 5는 5차 output titer plate에서 확보한 phage를 이용한 phage ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 6차 output titer plate에서 확보한 phage를 이용한 phage ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 7종 scFv 항체의 human CADM1 peptide에 대한 결합도 분석결과를 나타낸 도이다.
도 8은 7종 scFv 항체의 mouse CADM1 peptide에 대한 결합도 분석결과를 나타낸 도이다.
도 9는 7종 scFv별 human & mouse CADM1 peptide 항원에 대한 종간 교차 반응성을 log scale로 전환한 결과를 나타낸 도이다. 빨간색은 human peptide, 파란색은 mouse peptide, 회색은 BSA에 대한 결합능을 보여준다.
도 10은 ELISA를 이용하여 100 nM의 7종 scFv들과 100 ng/well의 3종 항원 및 rhCADM1 peptide 항원간의 반응성을 나타내는 도이다.
도 11 내지 도 13은 항원 접종 차수별로 각 닭의 혈청에 CADM1 펩타이드에 대한 항체가 형성되었는지 여부를 ELISA 결과를 통하여 나타낸 도이다.
도 14 및 도 15는 닭의 장기와 혈액으로부터 추출한 RNA의 확인을 위하여 겔 전기영동을 수행한 결과를 나타낸 도이다. (# Bone marrow(BM), Bursa fabricius(BF), Spleen(SP), peripheral blood mononuclear cells(PBMC))
도 16은 장기별로 First round PCR을 통해 얻어낸 VL과 VH를 나타낸 도이다.
도 17은 상기 VL 및 VH를 template로 하여 overlap PCR을 진행하여 scFv fragment의 DNA를 수득한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 Chicken1 (CH1)의 면역라이브러리를 사용한 항원 특이적 항체선별을 위한 조건과 각 차수별 Input 대비 output titer를 나타낸 도이다.
도 19 및 도 20은 Chicken2 (CH2)의 면역라이브러리를 사용한 항원 특이적 항체선별을 위한 조건과 각 차수별 Input 대비 output titer를 나타낸 도이다.
도 21 내지 도 24는 Chicken 1 output titer plate에서 확보한 phage를 이용한 phage ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 25 내지 도 28은 Chicken 2 output titer plate에서 확보한 phage를 이용한 phage ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 29는 10종 scFv 항체의 human CADM1 peptide에 대한 결합도 분석결과를 나타낸 도이다.
도 30은 10종 scFv 항체의 mouse CADM1 peptide에 대한 결합도 분석결과를 나타낸 도이다.
도 31 및 도 32는 10종 scFv별 human & mouse CADM1 peptide 항원에 대한 종간 교차 반응성을 log scale로 전환한 결과를 나타낸 도이다. 빨간색은 human peptide, 파란색은 mouse peptide, 회색은 BSA에 대한 결합능을 보여준다.
도 33은 CADM1 펩타이드를 발현시키기 위한 컨스트럭트 구조 및, SBC-5 소세포폐암 세포주에 CADM1 펩타이드를 발현시키고 본 발명의 8종 항체(4A2, 4A8, 4C8, 4H7, RB11, 3C5, 5A2, 및 RH6)와의 결합력을 확인하기 위하여 유세포분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 34는 CADM1 펩타이드를 발현시키기 위한 컨스트럭트 구조와 대조군 컨스트럭트 구조, 및 SBC-5 소세포폐암 세포주에 CADM1 펩타이드를 발현시키고 본 발명의 4종 항체(4A2, 4A8, RB11, 및 RH6)와의 결합력을 확인하기 위하여 유세포분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 35는 CADM1 펩타이드를 발현하는 소세포폐암 세포주(H146, H69)에 본 발명의 4종 항체(4A2, 4A8, RB11, 및 RH6)와의 결합력을 확인하기 위하여 유세포분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 36은 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 본 발명의 4종 항체(4A2, 4A8, RB11, 및 RH6)가 활성 T 세포에는 결합하지 않음을 확인하기 위하여, 유세포분석을 통하여 활성 T 세포와의 결합력을 확인한 결과를 나타낸다.
도 37은 본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 2세대 키메라 항원 수용체의 컨스트럭트를 나타낸 도이다.
도 38은 유세포 분석을 통하여 본 발명의 항-CADM1 CAR-T 세포의 발현률을 확인한 도이다.
도 39는 본 발명의 항-CADM1 CAR-T 세포의 표적세포 사멸능을 확인하기 위하여 항-CADM1 CAR-T 세포 (effector 세포) 와 CAMD1 펩타이드를 포함하는 SBC-5 세포 (target 세포)를 5:1 또는 10:1 (effector:target)의 세포수 비율로 넣고 24시간 동안 반응시킨 결과를 나타낸 도이다.
도 40은 본 발명의 항-CADM1 CAR-T 세포의 CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포에 대한 항암 활성능을 확인하기 위해서 표적세포(CADM1을 발현하는 SBC-5)만 염색 후, 항-CADM1 CAR-T 세포와의 공배양에 따른 표적세포의 사멸 비율을 나타낸 도이다.
도 41은 CADM1 펩타이드 발현 SBC-5 세포에 대한 본 발명의 항-CADM1 CAR-T 세포의 항암 활성능을 확인하기 위해서 표적세포와 공배양 후 살아 있는 표적세포에만 염색되는 crystal violet 용액 (Sigma, Cat No. V5265)을 처리하여 항-CADM1 CAR-T 세포의 표적세포의 사멸현상을 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

<실시예 1: 인간 합성 라이브러리를 이용한 항체의 제작>

Phage display 기법은 phage를 이용하여 타겟 단백질 혹은 펩타이드에 특이적으로 붙는 Fab 또는 scFv를 선별하는 최신 항체선별 기법이다. 본 과제에서 사용한 인간합성 항체라이브러리는 overlap extension polymerase chain reaction(PCR)을 이용하여 complementarity-determining region (CDR)에 돌연변이를 주어, 1X10⁹ 이상의 diversity를 가진 library를 합성한 라이브러리이다. pComb3X phagemid를 F-pilus가 있는 대장균에 transformation 후, VCSM13 phage를 이용하여 pⅢ에 scFv가 발현된 phage를 얻어내고, 항체선별을 위해 항원이 고정화된 tube, plate 혹은 bead에 부착시킨 뒤, 낮은 pH의 용액으로 항원에 특이적으로 부착된 phage를 동정하였다. 이러한 항체선별 과정에서 stringency 변화(detergent/salt 농도 및 항원 양 변화 등)를 주며 이 과정을 4-5 cycle 반복하여 최종적으로 항원 특이적인 항체 pool을 확보하였다. 선별한 phage를 phage ELISA를 통해 항원 반응성을 최종 검증하고 mini-prep을 통해 DNA 서열 분석을 진행하였다.

실험방법

1) Human & mouse CADM1 peptide 합성 및 BSA conjugate 준비

㈜펩트론에 의뢰하여 human과 mouse CADM1 peptide의 C-말단 부위에 BSA와 conjugation할 부분인 cysteine을 추가하여 purity 90% 이상의 10 mg peptide(16 amino acid; human (DSRAGEEGSIRAVDHC, SEQ ID NO: 1), mouse (DSRAGEEGTIGAVDHC, SEQ ID NO: 2)) 합성과 BSA conjugate를 각각 확보하였다.

2) Phage Display를 이용한 CADM1 peptide에 특이적으로 결합하는 scFv 선별

Human & mouse CADM1 peptide에 종간 교차 반응성(cross-species reactivity)이 있는 scFv를 선별하기 위해, 우선 human CADM1 peptide에 결합하는 항체 clone들을 일차적으로 선별한 후, mouse CADM1 peptide와 결합성을 phage ELISA로 확인하였다. 세부적인 항체 선별과정은 아래와 같았다.

5X10⁶ Dynabeads^TM M-270 Epoxy (Invitrogen, USA)당 3 μg의 BSA-conjugated human CADM1 peptide를 room temperature (RT)에서 overnight(O/N) conjugation한 뒤, 3%(w/v) bovine serum albumin (BSA) (BOVOGEN, Australia)을 포함하는 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂PO₄, 41.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4)로 RT에서 2시간 동안 블로킹을 진행하였다. Phage 형태의 인간항체 라이브러리(input titer: 약 1X10¹² CFU/ml)를 각각 RT와 4℃에서 peptide conjugation이 완료된 Dynabead와 O/N 반응시켰다. 0.05 %(v/v) tween 20 PBS (PBST)를 이용해 세척 후 glycine-HCl (pH 2.2)를 사용해 용출액을 받고, 동시에 Tris-HCl (pH 9.0)로 중화시켜 항원에 결합력이 있는 scFv를 발현하는 phage를 얻었다. 또한, 선별된 phage를 재증폭 (re-amplification)하기 위해, 선별 phage를 ER2738(NEB, USA)에 RT에서 15분간 infection한 뒤, carbenicillin(Gold Bio, USA)를 2차례에 걸쳐서 나누어 넣어 selection을 거친 뒤, super broth(SB) (10 g/L MOPS (Acros organics,nBelgium), 20 g/L Yeast extract (Becton Dickinson, USA), 30 g/L Tryptone (Becton Dickinson, USA)) 배양액에 VCSM13 helper phage(Agilent, USA)(1X10¹¹ pfu/ml 이상)를 넣어주었다. 이때, 최종농도가 70 μg/ml이 되도록 kanamycin(Gold Bio, USA)을 넣고 37℃에서 O/N으로 shaking incubation하였다. 다음 날 4℃에서 5000xg로 30분간 원심분리하여 상층액을 획득 후, 4%(w/v) PEG8000(Sigma-Aldrich, USA)과 3%(w/v) NaCl을 넣고 전부 녹인 뒤, 30분간 얼음에 방치하였다. 마지막으로, 4℃에서 11305xg로 40분간 원심분리하여 상층액을 버린 뒤, 1% BSA in PBS로 pellet을 resuspension하였다. Resuspension한 샘플은 10,000xg로 5분간 원심분리하여 상층액을 확보 후, 0.2 μm syringe filter(Pall, USA)로 여과하여 phage만을 최종적으로 얻었다. 위의 작업을 여러 번 반복하여 항체를 선별하였다.

3) Phage ELISA

96 deep well plate(Axygen, USA)에 SB와 50 μg/ml carbenicillin을 분주한 뒤, panning을 통해 얻은 output titer plate에서 96개의 phage infected ER2738의 single colony들을 배양하였다. 그 뒤, VCSM13 helper phage와 최종농도가 70 μg/ml이 되도록 kanamycin를 넣어주어 pⅢ에 scFv를 발현하고 있는 phage를 얻었다. 96 well microtiter plate(Corning, USA)에 BSA-conjugated human CADM1 peptide, BSA-conjugated mouse CADM1 peptide , 및 BSA를 각각 well당 100 ng씩 4℃에서 O/N으로 coating을 하였다. Coating을 완료한 후. 37℃에서 2시간, 3%(w/v) BSA in PBS로 blocking 후, 37℃에서 2시간 동안 deep well plate에 있는 phage를 순차적으로 반응시켰다. 그 뒤, 0.05%(v/v) PBST로 3회 세척 후, horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-HA antibody(Bethyl, USA)를 3%(w/v) BSA in PBS에 1:3000으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 수차례 0.05%(v/v) PBST로 세척 후, tetramethylbenzidine(TMB)를 넣고 10-15분간 반응 후 2N H₂SO₄로 발색반응을 ??칭하였다. 마지막으로 microtiter plate reader를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4) scFv 발현

Phage ELISA를 통해서 흡광도가 높았던 clone들의 DNA를 mini-prep kit(Cosmogenetech, Korea)를 이용해 phagemid를 얻어낸 뒤 phagemid를 BL21 (DE3)에 transformation하여, colony를 얻었다. Transformation이 완료된 colony를 50 μg/ml carbenicillin이 첨가된 10 ml SB에서 37℃, O/N으로 shaking incubation하였다. 다음날 1 L Flask에 50 μg/ml carbenicillin이 첨가된 200 ml SB와 전배양한 대장균을 2 ml을 넣고 optical density 600 nm (OD₆₀₀)=0.4~0.6이 되도록 37°C, 200 rpm으로 shaking incubation하였다. OD₆₀₀ = 0.4~0.6에 도달하면 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)(Biobasic, canada)를 200 μl를 넣어 최종농도 1 mM IPTG를 만들고 30℃에서 O/N으로 shaking incubation하였다. 500 ml centrifuge bottle에 옮긴 뒤, 4000xg, 4 ℃, 15 min 간 침전시키고, 상층액을 버린 뒤 osmotic shock을 통하여 scFv를 얻어냈다.

5) Osmotic shock

침전된 cell에 1XTES(50 mM Tris(MERK Millipore Corp, Germany), 1 mM ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)(Affymetrix, USA), 20%(w/v) sucrose(Affymetrix, USA)), pH 8.0)를 10 ml 넣은 뒤 resuspension하고, 0.2XTES를 15 ml 넣은 뒤 30분 동안 얼음에 넣어두었다. 4000xg, 4℃, 15 min 간 원심분리를 통해 다시 침전시킨 뒤, 상층액을 얻었다.

6) scFv 정제

scFv에 있는 His-tag을 이용하여 nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin (HisPur^TM Ni-NTA Resin) (Thermofisher scientific, USA)으로 정제하였다. 0.5 ml의 Ni-NTA를 1XPBS로 평형상태를 만들었다. osmotic shock으로 얻어낸 상층액에 평형상태가 이루어지면, 0.5 ml Ni-NTA를 넣어주고 4℃에서, O/N으로 반응시켰다. 5 ml의 column에 넣어주고 10 ml의 5 mM imidazole in PBS(1 M Imidazole solution, pH 8.0)(Biosesang, Korea)로 세척하였다. 1.5 ml의 500 mM imidazole in PBS로 scFv를 용출시켰다. sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)(NuPAGE^TM 4-12% Bis-Tris Gel(Invitrogen, USA))를 이용하여 scFv의 발현을 확인하였다. Slide-ALyzer® dialysis cassette (Thermofisher, USA)을 이용하여 imidazole을 제거한 후 nanodrop으로 정확한 농도를 측정하였다.

7) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

96 well microtiter plate에 well 당 100 ng씩 BSA-conjugated human & mouse CADM1 peptide 및 BSA를 4℃에서 O/N으로 부착시킨 뒤, 3% BSA in PBS 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 blocking을 하였다. 정제된 scFv를 1000 nM부터 0.064 nM까지 5분의 1씩 희석하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.05%(v/v) PBST로 plate에 있는 항원과 붙지 않은 scFv를 제거하였다. HRP-conjugated anti-HA antibody를 1:3000으로 3%(w/v) BSA in PBS에 희석한 뒤, 37°C에서 1시간 반응시킨 뒤, 0.05% PBST로 남은 antibody를 세척하였다. TMB를 넣고서 충분히 발색이 될 때까지 기다린 후 2N H₂SO₄를 넣어 반응을 종결한 후 450 nm에서 microtiter plate reader로 흡광도를 측정하였다.

실험결과

1) Carrier protein-conjugated human & mouse CADM1 peptide 생성 여부 분석

BSA-conjugated human & mouse CADM1 peptide 생성 여부를 확인하기 위해, ㈜펩트론에서 공급받은 2 μg의 conjugate들과 BSA를 3-(n-morpholino) propanesulfonic acid(MOPS) buffer와 NuPAGE^TM 4-12% Bis-Tris gel를 이용해 크기와 질을 확인하였다.

도 2의 lane 1과 lane 2의 BSA-conjugated human과 mouse peptide 와 lane 5~7의 BSA를 비교하면 broad한 패턴으로 mobility shift가 일어남을 확인할 수 있었다. 특히, BSA의 경우, major band로 monomeric BSA가 관찰되고, 일부 minor band가 관찰되었다. BSA-conjugated CADM1 peptide 는 이들보다 큰 사이즈로 broad한 패턴으로 나타났다. 따라서, CADM1 peptide가 BSA에 conjugation이 되었다는 것을 유추할 수 있었다. 또한, keyhole limpet hemocyanin (KLH)에 conjugation 시킨 CADM1 peptide는 immune library의 항원으로써 사용하기 위해 제작하였다. KLH-conjugated human & mouse CADM1 peptide도 BSA-conjugated human & mouse CADM1 peptide와 유사하게 크기의 증가 및 broad한 패턴을 확인할 수 있었다.

2) Phage display 기법을 이용한 항원 특이적인 scFv-displayed phage 농축(enrichment)

항원 특이적인 scFv 선별을 위해, 항원과 phage와의 반응은 4℃ 및 RT 두 가지 온도 조건에서 진행하였다. 또한, 1차에는 0.05% PBS로 1회, 2차는 2회, 3~6차는 3회 세척을 진행하였고 각각의 차수마다 input 및 output titer를 각각 측정하였다. 특히, 세척 횟수가 3회로 늘어난 3차에서는 input 대비 output titer가 줄어드는 것을 확인할 수 있었으나, 그 이후 차수에서는 4℃ 및 RT 조건에서 모두 차수가 증가되면서 항원 특이적 phage들이 농축되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 4℃ 조건이 RT 조건보다 더 빠르게 농축이 되는 결과를 나타냈다 (도 3 및 도 4).

3) Phage ELISA를 이용한 후보항체 스크리닝

Bio-panning을 통해 확보된 5차와 6차의 individual phage를 이용한 phage ELISA를 수행하였다. 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다. 도 5 및 6에서 빨간색은 BSA-conjugated human CADM1 peptide, 파란색은 BSA-conjugated mouse CADM1 peptide, 회색은 negative control인 BSA에 대한 scFv의 반응성을 나타낸다.

도 5는 5차 output titer plate에서 확보한 phage를 이용한 phage ELISA 결과를 나타낸 도이다. 도 6은 6차 output titer plate에서 확보한 phage를 이용한 phage ELISA 결과를 나타낸 도이다.

5차의 phage ELISA의 결과를 보면, 대부분이 human과 mouse 펩타이드 항원에 대한 교차 반응성이 우수한 것을 확인할 수 있으며, BSA에 대한 반응성은 없는 것으로 확인되었다. 또한, 일부 클론의 경우, mouse peptide에는 결합력이 없고 human peptide에만 결합력이 있는 clone도 관찰되었다. 6차의 phage ELISA 결과에서는 거의 모든 clone들이 human과 mouse peptide 항원에 종간 교차 반응성이 있는 것을 확인할 수 있었다.

4) 선별항체에 대한 염기서열 분석

5차와 6차 panning에서 항원 반응성이 우수한 clone들에 대한 염기서열 분석을 진행하였다. 이 과정에서 중복되는 clone들을 모두 제거하고 CDR 서열이 다른 7개의 클론을 확보하였다. 그 결과, 종간 교차 반응성이 있는 6개의 항체 clone들과 human peptide 항원에만 반응성이 있는 1종의 clone을 확인하였다(표 1 및 표 2).

선별된 7종 항체의 중쇄 염기서열 분석결과

Clone name	HFR1	HCDR1	HFR2	HCDR2	HFR3	HCDR3	HFR4
5RA5	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS	NYAMS	WVRQAPGKGLEWVS	WIYHGGGDT	YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA	RAAVYCKRTNCYSYDAMDV	WGQGTLVTVSS
5RA7	EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFS	DYAMS	WVRQAPGRGLEWVS	AIYPGNSSI	YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA	RVPVQCMLTRCYSYDAMDV	WGQGTLVTVSS
5RA8	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS	SYGMS	WVRQAPGKGLEWVS	GISYSGGST	YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA	RPISRLGAYMWSSSYAMDV	WGQGTLVTVSS
5RG9	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS	SYGMS	WVRQAPGKGLEWVS	WISYSGGNT	YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA	RPISHFGAYMWSSSYAMDV	WGQGTLVTVSS
5RH12	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS	NYAMS	WVRQAPGKGLEWVS	WIYHGGGDT	YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCA	RARVHCQQRRCSSYDAMDV	WGQGTLVTVSS
6RC7	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS	NYAMS	WVRQAPGKGLEWVS	GIYPNSGSNT	YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA	RAIGPCLRYPCYSADAMDV	WGQGTLVTVSS
5RB6 # Human specific	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS	DYAMS	WVRQAPGKGLEWVS	WIYYDSGSK	YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRAEDTAVYYCA	KHGRNTKNWPWYSANGMDV	WGQGTLVTVSS

선별된 7종 항체의 경쇄 염기서열 분석결과

Clone name	LFR1	LCDR1	LFR2	LCDR2	LFR3	LCDR3	LFR4
5RA5	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC	SGSSSNIGNNSVT	WYQQLPGTAPKLLIY	SNNN	RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC	GAWDDSLNA	YVFGGGTKLTAL
5RA7	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC	TGSSSNIGNNSVT	WYQQLPGTAPKLLIY	ADSH	RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC	GAWDSSLNA	YVFGGGTKLTVL
5RA8	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC	SGSSSNIGSNYVT	WYQQLPGTAPKLLIY	ANSN	RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC	GSWDASLNG	YVFGGGTKLTVL
5RG9	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC	SGSSSNIGSNYVT	WYQQLPGTAPKLLIY	ANSN	RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC	GAWDASLNG	YVFGGGTKLTVL
5RH12	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC	SGSSSNIGSNSVS	WYQQLPGTAPKLLIY	ADSH	RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC	GAWDDSLSA	YVFGGGTKLTVL
6RC7	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC	TGSSSNIGSNYVN	WYQQLPGTAPKLLIY	ANSN	PPSGVPDRFSGSKSGTSASLGISGLRSEDEADYYC	GAWDDNLNA	YVFVGGTKLTVL
5RB6# Human specific	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC	TGSSSNIGSNSVS	WYQQLPGTAPKLLIY	SDSK	RPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC	GAWDSSLSA	YVFGGGTKLTVL

# Human Specific : human peptide에만 특이적으로 결합하며 mouse peptide에는 결합력을 보이지 않는 clone.

5) 후보 scFv 항체 생산 및 정제

상기와 같이 확보한 7종의 후보 항체를 Ni-NTA를 이용하여 정제 후, nanodrop으로 정량하였다. 2 μg을 polyacrylamide gel에 각각 loading 한 후, SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris)로 확인하였다.

6) ELISA를 이용한 후보 scFv 항체의 특성 분석

7종의 후보 scFv 항체의 농도 1 μM부터 0.064 nM까지 5분의 1씩 serial dilution 한 7개의 포인트와, 0 nM 를 포함한 총 8개의 포인트에서 ELISA를 이용해 Kd value를 분석하였다.

BSA-conjugated human CADM1 peptide 및 BSA-conjugated mouse CADM1 peptide를 각각 well 당 100 ng씩 항원을 분주하여 코팅한 plate에서, HRP conjugated anti-HA antibody (2차 항체)를 1:3000으로 결합하였다. TMB로 발색시키고, 황산을 처리하여 반응을 종결시킨 후, 450 nm에서의 흡광도를 측정하여 7종의 항체의 항원 결합력을 구하였다. 결과는 도 7 및 8과 표 3 및 4에 나타내었다.

human CADM1 peptide 항원에 대한 결합력은 5RA8, 6RC7, 5RG9, 5RA5, 5RB6(H), 5RA7, 5RH12 순으로 낮은 Kd value를 보이는 것을 확인하였다. 특히, 5RA8, 6RC7, 5RG9는 1~10 nM 정도로 낮은 Kd 값을 확인할 수 있었고, 5RA5, 5RB6(H), 5RA7는 10~50 nM 정도의 Kd 값을 가지고 있으며, 5RH12는 271 nM로 제일 높은 Kd 값을 가짐을 확인하였다.

mouse CADM1 peptide 항원에 대한 결합력은 5RB6(H)을 제외하고, 5RA8, 6RC7, 5RG9, 5RA5, 5RA7, 5RH12 순으로 낮은 Kd 값을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 5RA8, 6RC7, 5RG9는 1~10 nM로 낮은 Kd 값을 보였고, 5RA7, 5RH12는 114 nM, 666 nM로 상대적으로 높은 Kd 값을 나타냈다.

7종 scFv 항체의 human CADM1 peptide에 대한 결합력 분석 결과

-	5RA5	5RA7	5RA8	5RG9	5RH12	6RC7	5RB6(H)
Bmax	4.287	4.421	4.12	3.515	5.07	4.188	4.255
Kd (nM)	10.36	43.73	1.9	8.049	271.2	4.229	11.92

7종 scFv 항체의 mouse CADM1 peptide 대한 결합력 분석 결과

-	5RA5	5RA7	5RA8	5RG9	5RH12	6RC7
Bmax	4.388	4.545	4.113	3.639	6.13	4.188
Kd (nM)	39.49	114.3	1.995	6.969	666.5	4.802

도 7은 7종 scFv 항체의 human CADM1 peptide에 대한 결합도 분석결과를 나타낸 도이다.

도 8은 7종 scFv 항체의 mouse CADM1 peptide에 대한 결합도 분석결과를 나타낸 도이다.

도 9는 7종 scFv별 human & mouse CADM1 peptide 항원에 대한 종간 교차 반응성을 log scale로 전환한 결과를 나타낸 도이다. 빨간색은 human peptide, 파란색은 mouse peptide, 연두색은 BSA에 대한 결합능을 보여주며, 총 6개의 clone이 human과 mouse의 항원에 대한 종간 교차 반응성을 보이는 것을 확인할 수 있다. 또한, BSA에 대한 결합능력은 scFv의 농도가 높아지더라도 꾸준히 낮은 것을 확인할 수 있다. 반면, 5RB6은 human CADM1 peptide에만 결합하는 것을 확인할 수 있었으며, mouse CADM1 항원과 BSA에 대한 결합능력은 없는 것을 확인할 수 있었다.

선별항체의 항원 반응성을 추가적으로 확인하기 위해, 3종 항원과 CADM1 peptide를 사용하여 ELISA를 진행하였다. 구체적으로, 사용한 3종의 항원으로는 i) rhCADM1 ECD (Sino Biological, 11168-H08H, China), ii) exon8 부분이 결손되어 있고 일부의 세포내 도메인이 포함되어 있는 rhCADM1 isoform 5 (Creative BioMart, CADM1-2183H, USA) 및 iii) rhCADM1 isoform 5에서 C-terminal의 서열(AGEEGSIRAVDHAVIGGVVAVVVFAMLCLLIILGRYFARH)이 결손된 rhCADM1 isoform 5 △C-term (Creative BioMart, CADM1-10650H, USA)를 각각 사용하였다. 또한, positive control로 BSA-conjugated human & mouse CADM1 peptide 을 사용하였다.

결과는 도 10에 나타내었다. 도 10은 ELISA를 이용하여 100 nM의 7종 scFv들과 100 ng/well의 3종 항원 및 peptide 항원간의 반응성을 나타내는 도이다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 6종의 scFv(5RA5, 5RA7, 5RA8, 6RC7, 5RG9, 5RH12)의 경우, human & mouse CADM1 peptide 항원에는 결합력을 나타내었으나, 나머지 3종의 rhCADM1 protein (rhCADM1 ECD; rhCADM1 isoform 5; 및 rhCADM1 isoform 5 △C-term에는 결합력을 나타내지 않았다. 또한, 5RB6의 경우 human CADM1 peptide에만 특이적인 결합력을 보이므로 mouse CADM1 peptide뿐만 아니라 3종의 rhCADM1 protein (rhCADM1 ECD; rhCADM1 isoform 5; 및 rhCADM1 isoform 5 △C-term 에도 결합하지 않음을 확인하였다.

<실시예 2: 닭 면역항체 라이브러리를 이용한 항체의 제작>

Phage display 기법은 phage를 이용하여 타겟 단백질 혹은 펩타이드에 특이적으로 붙는 Fab 또는 scFv를 선별하는 최신 항체선별 기법임이다. 닭 면역항체라이브러리는 항원을 면역한 뒤, 확보한 chicken의 면역기관(spleen, bursa of fabricius, bone marrow)와 혈액 (말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cells; PBMC))으로부터 분리한 total RNA를 cDNA로 전환 후, overlap polymerase chain reaction(PCR)을 이용하여 scFv fragment를 확보하고, phage display를 위해 gIII 가 포함된 pComb3X phagemid vector에 cloning하였다. 이 재조합 DNA vector를 F-pilus가 있는 대장균(ER2738)에 transformation 후, VCSM13 helper phage 감염을 통해 pⅢ에 scFv가 발현된 phage를 얻어내고, 항체선별을 위해 항원이 고정화된 tube, plate 혹은 bead에 부착시킨 뒤, 낮은 pH의 용액으로 항원에 특이적으로 부착된 phage를 동정하였다. 이러한 항체선별 과정에서 stringency 변화 (detergent/salt 농도 및 항원 양 변화 등)를 주며 이 과정을 5회 반복하여 최종적으로 항원 특이적인 항체 pool을 확보하였다. 선별한 phage를 phage ELISA를 통해 항원 반응성을 최종 검증하고 mini-prep을 통해 DNA 서열 분석을 진행하였다.

1) Human & mouse CADM1 peptide 합성 및 KLH conjugate 준비

㈜펩트론에 의뢰하여 human과 mouse CADM1 peptide의 C-말단 부위에 keyhole limpet hemocyanin (KLH)과 bovine serum albumin (BSA)와 conjugation 할 부분인 cysteine을 추가하여 (16 amino acid; human (DSRAGEEGSIRAVDHC), mouse (DSRAGEEGTIGAVDHC)) 합성과 BSA & KLH conjugate를 각각 확보함.

2) Chicken Immunization

면역항체 라이브러리 제작을 위해, KLH에 conjugation 된 peptide 항원을 chicken 3마리에 면역(Biopoa, Korea)하였다. 항원의 chicken 면역은 최초 100 ㎍ KLH-conjugated human peptide를 complete adjuvant에 섞어서 최초 접종하고, 3주 후 100 μg KLH-conjugated mouse peptide를 complete adjuvant에 섞어 2차 접종을 하였으며, 그 후 2주 간격으로 50 ㎍의 KLH-conjugated human peptide 및 mouse peptide를 번갈아 각각 접종하며 boosting하였다. 총 4번의 항원 접종을 시행하였다. 그 후, 면역화 전 및 면역 단계별 혈액을 일차적으로 확보하고, 확보한 혈액은 혈청을 분리하여 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)를 통해 항체 titer를 확인하였다. ELISA를 통해 항체 생성이 확인된 chicken으로부터 library 제작에 필요한 whole blood, spleen, bone marrow, bursa of fabricius를 각각 확보하였다.

3) Chicken serum ELISA

96 well microtiter plate(Corning, USA)에 well 당 20 ng씩 BSA-conjugated human CADM1 peptide, BSA-conjugated mouse CADM1 peptide 및 BSA를 각각 4℃에서 O/N으로 부착시킨 뒤, 3% BSA in PBS 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 blocking을 하였다. 1번 및 3번 닭의 접종 전 serum, 접종 후 1차 접종 후부터 4차 접종 후까지의 serum과, 2번 닭의 접종 전 serum, 1차, 2차 접종 후의 serum을 1:500부터 1:62,500까지 3% BSA를 포함하는 PBS를 사용하여 5분의 1씩 serial dilution을 한 뒤, 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.05%(v/v) tween 20 포함 PBS (PBST)로 plate에 있는 항원과 붙지 않은 scFv를 제거하였다. HRP-conjugated anti-chicken IgY antibody(Jackson Immuno Research, USA)를 1:5,000으로 3%(w/v) BSA 포함 PBS에 희석한 뒤, 37°C에서 1시간 반응시킨 뒤, 0.05% PBST로 남은 antibody를 세척하였다. ABTS를 넣고서 충분히 발색이 될 때까지 기다린 후 405 nm에서 microtiter plate reader로 흡광도를 측정하였다.

4) 면역항체라이브러리 제작

4-1) 혈구세포 및 장기에서 RNA 추출 및 cDNA 합성

항원에 대한 항체 생성이 확인된 chicken에서 whole blood, spleen, bone marrow, bursa of fabricius를 확보하였다.

Whole blood로부터의 PBMC 분리를 위해, SepMate^TM PBMC Isolation Tube(Stemcell, Canada)에 density gradient medium(Stemcell, Canada)을 넣어주었다. 확보한 blood를 1X PBS(Biosesang, Korea)로 1:1 잘 섞은 뒤, SepMate^TM tube가 기울어지지 않은 상태에서 희석된 샘플을 tube의 벽으로 흘려 넣었다. SepMate^TM tube를 1,200xg, 10분간 상온에서 원심분리 후, 상층액만을 새로운 tube로 옮겼다. 위의 과정을 한 번 더 반복하여 순수한 PBMC를 최종 확보하였다.

또한, PBMC로부터 total RNA 분리를 위해, PBMC에 RBC lysis buffer((8.26 g NH₄Cl (ammonium chloride), 1g KHCO₃ (potassium bicarbonate), 0.037 g EDTA to 1 L Ultrapure water))를 넣고 상온에서 10분간 incubation 한 뒤, 1,200xg로 5분간 원심분리하였다. 이후, 상층액을 버리고 pellet에 1X PBS를 넣어 세척하는 과정을 두 번 진행하였다. 상층액을 버리고, 남은 pellet에 TRIzol(invitrogen, USA)을 넣은 후, 추가적으로 BCP(1-bromo-3-chloro propane)(merck, USA)을 넣은 후, 상온에서 10분간 incubation 하였다. 그 후, 12,000xg로 15분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 위의 무색투명한 층만을 얻어 isopropanol을 넣고 상온에서 10분간 incubation 함. 마지막으로, 원심분리 후, 확보한 pellet은 75% 에탄올로 세척 후, pellet을 nuclease-free water(Invitrogen, USA)로 녹여 total RNA를 얻었다.

Chicken organ의 경우, 얻어낸 organ 조직들을 미리 TRIzol을 넣어둔 gentleMACS^TM M-tube(Miltnyi Biotec, Germany)에 넣어 homogenization 한 후, 4,000xg로 10분간 원심분리하였다. 상층액을 확보한 뒤, BCP를 넣고 상온에서 15분간 incubation하고, 12,000xg로 15분간 원심분리하였다. 상층액 중, 무색투명한 부분만을 얻어 isopropanol을 넣고 상온에서 incubation 한 후, 12,000xg으로 15분 간 원심분리하였다. 상층액을 버리고 남은 pellet에 75% 에탄올을 넣고 원심분리하여 wash한 뒤, RNase-free water로 녹여 total RNA를 얻었다.

확보한 total RNA로부터 cDNA 합성을 위해, SuperScript^TM III First-Strand Synthesis System kit(invitrogen, USA)를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다. 5 μg의 RNA와 1 μl primer (oligo(dT)20), 1 μl annealing buffer를 넣은 mixture를 65℃에서 5분 동안 incubation 한 뒤, 얼음에서 1분 정도 incubation 하였다. 그 후, 10 μl 2X First-Strand reaction mix와 2 μl SuperScript^TMIII/RNaseOUT Enzyme mix를 추가로 넣고 50℃에서 50분 간 incubation하고 85℃에서 5분 간 incubation하여 반응을 종료시켰다. 이렇게 수득한 cDNA는 -20℃에서 보관하였다.

4-2) Overlap extension PCR을 이용한 면역항체 라이브러리 증폭

cDNA 1 μl를 template로 사용하여 first round PCR을 진행하였다. 각각 variable heavy chain과 light chain을 KAPA HiFi HotStart PCR kit(Kapa Biosystems, USA)로, annealing temperature는 60℃로 하여 first round PCR을 진행하였다. 2% agarose gel electrophoresis를 통해 DNA 분리 후, 해당 DNA를 Qiagen gel extraction kit(QIAGEN, Germany)를 통해 VL과 VH 각각을 확보하였다. 이후 VL, VH을 각각 50 ng을 template로 하여 KAPA HiFi HotStart PCR kit(Kapa Biosystems, USA)로, annealing temperature 65℃로 하여 overlap PCR을 진행하였다. overlap extension PCR을 통해 scFv 형태로 연결하였다.

4-3) Library cloning 및 library DNA 다량 확보

Overlap extension PCR을 진행한 scFv fragment와 phage display를 위한 gIII 가 포함된 vector (pComb3X vector)를 Sfi I restriction enzyme(ROCHE, Swiss)으로 restriction enzyme digestion을 진행하였다. 2% Agarose gel에 loading 후, 전기영동하고, gel extraction(QIAGEN, Germany)을 진행하여 enzyme digestion된 Insert와 backbone을 각각 얻었다. 이렇게 얻은 Insert와 backbone을 T4 ligase(invitrogen, USA)를 통해 상온에서 overnight으로 DNA ligation을 진행 후, electroporation을 통해 ER2738 E.coli 내로 transformation 하였다. 이때, titration을 진행하여 electro-competent cell의 competency와 library의 size를 최종 확인하였다.

5) Phage Display를 이용한 CADM1 peptide에 특이적으로 결합하는 scFv 선별

Human & mouse CADM1 peptide에 종간 교차 반응성(cross-species reactivity)이 있는 scFv를 선별하기 위해, 우선 human CADM1 peptide에 결합하는 항체 clone들을 일차적으로 선별한 후, mouse peptide와 결합성을 phage ELISA로 확인하였다. 세부적인 항체 선별과정은 아래와 같았다.

5X10⁶ Dynabeads^TM M-270 Epoxy(Invitrogen, USA) 당 3 μg의 BSA-conjugated human CADM1 peptide를 room temperature(RT)에서 overnight(O/N) conjugation한 뒤, 3%(w/v) bovine serum albumin(BSA) (BOVOGEN, Australia)를 포함하는 PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na₂PO₄, 41.8 mM KH₂PO₄, pH 7.4)로 RT에서 2시간 동안 blocking을 진행하였다. Phage 형태의 chicken 면역항체 라이브러리(input titer: 약 1X10¹² cfu/ml)를 각각 RT와 4℃에서 peptide conjugation이 완료된 Dynabead와 O/N으로 반응시켰다. 0.05%(v/v) tween 20 in PBS(PBST)를 이용해 세척 후, 0.1 M glycine-HCl(pH2.2)를 사용해 용출액을 획득하고, 동시에 1 M Tris-HCl(pH 9.0)로 중화시켜 항원에 결합력이 있는 scFv를 발현하는 phage를 수득하였다. 또한, 선별된 phage를 재 증폭(re-amplification)하기 위해, 선별 phage를 ER2738(NEB, USA)에 RT에서 15분간 infection한 뒤, carbenicillin(Gold Bio, USA)을 20 μg/ml, 30 μg/ml씩 2차례에 걸쳐서 나누어 넣어 selection을 거친 뒤, super broth(SB)(10 g/L MOPS(Acros organics, Belgium), 20 g/L yeast extract(Becton Dickinson, USA), 30 g/L tryptone(Becton Dickinson, USA)) 배양액에 1X10¹¹ pfu/ml 이상의 VCSM13 helper phage(Agilent, USA)를 넣었다. 이때, 최종농도가 70 μg/ml이 되도록 kanamycin(Gold Bio, USA)을 넣고 37℃에서 O/N으로 shaking incubation하였다. 다음 날 4℃에서 5000xg로 30분간 원심분리하여 상층액을 획득 후, 4%(w/v) PEG8000(Sigma-Aldrich, USA)과 3%(w/v) NaCl을 넣고 전부 녹인 뒤, 30분간 얼음에 방치하였다. 마지막으로, 4℃에서 11305xg로 40분간 원심분리하여 상층액을 버린 뒤, 1% BSA in PBS로 pellet을 resuspension하였다. Resuspension한 샘플은 10,000xg로 5분간 원심분리하여 상층액을 확보 후, 2 μm syringe filter로 여과하여 phage만을 최종적으로 수득하였다. 위의 작업을 여러 번 반복하여 항체를 선별하였다.

6) Phage ELISA

96 deep well plate(Axygen, USA)에 SB와 50 μg/ml carbenicillin을 분주한 뒤, panning을 통해 얻은 ouput titer plate에서 96개의 phage infected ER2738의 single colony들을 배양하였다. 그 뒤, VCSM13 helper phage와 최종농도가 70 μg/ml이 되도록 kanamycin를 넣어주어 p²에 scFv를 발현하고 있는 phage를 수득하였다. 96 well microtiter plate(Corning, USA)에 BSA-conjugated human CADM1 peptide, BSA-conjugated mouse CADM1 peptide , 및 BSA를 각각 well당 100 ng씩 4℃에서 O/N으로 coating하였다. Coating을 완료한 후, 37℃에서 2시간 동안, 3%(w/v) BSA 를 포함하는 PBS로 blocking 후, 37℃에서 2시간 동안 deep well plate에 있는 phage를 순차적으로 반응시켰다. 그 뒤, 0.05%(v/v) PBST로 3회 세척 후, horseradish peroxidase (HRP)-conjugated anti-HA antibody(Bethyl, USA)를 3%(w/v) BSA in PBS에 1:3,000으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 수차례 0.05%(v/v) PBST로 세척 후, tetramethylbenzidine(TMB)를 넣고 10-15분간 반응 후 2N H₂SO₄로 발색반응을 ??칭하였다. 마지막으로 microtiter plate reader를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

7) scFv 발현

Phage ELISA를 통해서 흡광도가 높았던 clone들의 DNA를 mini-prep kit(Cosmogenetech, Korea)를 이용해 phagemid를 얻은 뒤, phagemid를 BL21(DE3)에 transformation하여, colony를 수득하였다. Transformation이 완료된 colony를 50 μg/ml carbenicillin이 첨가된 10 ml SB에서 37℃에서, O/N으로 shaking incubation하였다. 다음날 2 L Flask에 50 μg/ml carbenicillin이 첨가된 400 ml SB와 전배양한 대장균을 4 ml을 넣고 optical density 600 nm (OD₆₀₀)=0.4~0.6이 되도록 37℃, 200 rpm으로 shaking incubation하였다. OD₆₀₀=0.4~0.6에 도달하면 1 M isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)(Biobasic, Canada)를 200 μl를 넣어 최종농도 1 mM IPTG를 만들고 30℃에서 O/N으로 shaking incubation하였다. 500 ml centrifuge bottle에 옮긴 뒤, 4,000xg, 4℃에서, 15분간 원심분리 후, 상층액을 버린 뒤 pellet을 osmotic shock을 이용하여 scFv를 얻었다.

8) Osmotic shock

침전된 cell에 1XTES(50 mM Tris(MERK Millipore Corp, Germany), 1 mM ethylenediamine tetraacetic acid(EDTA)(Affymetrix, USA), 20%(w/v) sucrose (Affymetrix, USA)), pH 8.0)를 10 ml 넣은 뒤 resuspension하였다. 0.2X TES를 15 ml 넣은 뒤 30분 동안 얼음에 넣어두었다. 4000xg, 4℃에서, 15 min으로 원심분리를 통해 다시 침전시킨 뒤, 상층액을 얻었다.

9) scFv 정제

scFv에 있는 His-tag을 이용하여 nickel-nitrilotriacetic acid(Ni-NTA) resin(HisPur^TM Ni-NTA Resin(Thermofisher scientific, USA)으로 정제하였다. 0.5 ml의 Ni-NTA를 1X PBS로 평형상태를 만들었다. osmotic shock으로 얻은 상층액을 0.5 ml Ni-NTA를 loading하고 4℃에서 O/N으로 반응시켰다. Unbound fraction을 제거 후, 10 ml의 5 mM imidazole in PBS(1 M Imidazole solution, pH 8.0)(Biosesang, Korea)로 닦았다. 1.5 ml의 500 mM imidazole 포함 PBS로 scFv를 최종 용출시켰다. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)(NuPAGE^TM 4-12% Bis-Tris Gel(Invitrogen, USA))를 이용하여 scFv의 발현을 확인함. 그 후, slide-ALyzer® dialysis cassette(Thermofisher, USA)을 이용하여 imidazole을 제거한 후 nanodrop으로 정확한 농도를 측정하였다.

10) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

96 well microtiter plate에 well 당 100 ng이 되도록 BSA-conjugated human CADM1 peptide, BSA-conjugated mouse CADM1 peptide 및 BSA를 4℃에서 O/N으로 부착시킨 뒤, 3% BSA in PBS 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 blocking을 하였다. 정제된 scFv를 1,000 nM부터 0.064 nM까지 5분의 1씩 희석하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.05%(v/v) PBST로 plate에 있는 항원과 붙지 않은 scFv를 제거하였다. HRP-conjugated anti-HA antibody를 1:3,000으로 3%(w/v) BSA in PBS에 희석한 뒤, 379) scFv 정제

10) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

96 well microtiter plate에 well 당 100 ng이 되도록 BSA-conjugated human CADM1 peptide, BSA-conjugated mouse CADM1 peptide 및 BSA를 4℃에서 O/N으로 부착시킨 뒤, 3% BSA in PBS 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 blocking을 하였다. 정제된 scFv를 1,000 nM부터 0.064 nM까지 5분의 1씩 희석하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 0.05%(v/v) PBST로 plate에 있는 항원과 붙지 않은 scFv를 제거하였다. HRP-conjugated anti-HA antibody를 1:3,000으로 3%(w/v) BSA in PBS에 희석한 뒤, 37℃에서 1시간 반응시킨 뒤, 0.05% PBST로 남은 unbound antibody를 세척하였다. TMB를 넣고서 충분히 발색이 될 때까지 기다린 후 2N H₂SO₄를 넣어 반응을 종결한 후, 450 nm에서 microtiter plate reader로 흡광도를 측정하였다.

실험결과

상기 인간 합성 라이브러리에서 항체를 제작하기 위하여 합성한 것과 동일한 항원을 사용하였다(도 2).

2) ELISA를 이용한 항체 생성 확인

KLH에 conjugation 된 CADM1을 닭에게 접종한 뒤, 원하는 항체가 생성되고 있는 것을 확인하기 위하여, 접종 후 1~2주가 지난 닭에게서 혈청을 얻은 뒤, KLH가 아닌 CADM1 peptide에만 특이적으로 붙는 항체를 확인하기 위하여 BSA에 conjugation 된 CADM1 peptide를 사용하여 ELISA를 진행하였다. 결과는 도 11 내지 도 13에 나타내었다.

도 11 내지 도 13은 항원 접종 차수별로 각 닭의 혈청에 CADM1 펩타이드 항원에 대한 항체가 형성되었는지 여부를 ELISA 결과를 통하여 나타낸 도이다. 붉은색으로 표시된 그래프가 human CADM1 peptide, 파란색으로 표시된 그래프가 mouse CADM1 peptide에 대한 혈청의 반응성을 본 결과이며, 동그라미, 네모, 세모, 다이아몬드 순서대로 접종 차수에 따른 혈청의 CADM1에 대한 반응성을 나타내었다.

Chicken 1의 경우 접종 전에는 반응성이 전혀 없었으나, 접종이 진행될 때마다 CADM1 peptide에 대한 항체가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. chicken 2도 마찬가지로 접종 전에는 반응성이 전혀 없으나 2차 접종 만에 빠르게 항체의 수가 증가하여 다른 닭보다 빠르게 sacrifice 후 library construction을 진행하였다. Chicken 3의 경우 1차 접종 때 항체의 수가 증가했으나, 접종이 진행될 때마다 오히려 항체의 수가 감소하였다. 따라서 chicken 1, 2는 성공적으로 항체가 만들어진 것을 확인할 수 있었다.

3) 혈구세포 및 장기로부터 RNA 추출

모든 닭의 장기와 혈액으로부터 RNA를 추출하고 겔 전기영동을 통해 RNA 추출 여부를 확인하였다.

결과는 도 14 및 도 15에 나타내었다.

도 14 및 도 15는 닭의 장기와 혈액으로부터 추출한 RNA의 확인을 위하여 겔 전기영동을 수행한 결과를 나타낸 도이다. (# Bone marrow(BM), Bursa of fabricius(BF), Spleen(SP), peripheral blood mononuclear cells(PBMC))

도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, 추출된 RNA의 경우, 28S와 18S의 두 개의 RNA band가 major 하게 보이는 것을 확인함으로써 RNA가 잘 추출된 것을 확인하였다. 이후 library construction 과정은 immunization이 잘 된 것이 확인된 chicken 1과 chicken 2에서만 진행하였다.

4) Overlap PCR을 이용한 면역항체라이브러리 증폭

350 bp 정도 크기의 VL과 400 bp 정도 크기의 VH를 gel-extraction을 통해 확보하였다. VL과 VH 각각 100 ng을 template로 하여 overlap PCR을 진행하였으며, overlap PCR 결과 750 bp 정도 크기의 scFv fragment를 성공적으로 gel-extraction을 통해 확보하였다(도 16 및 도 17).

도 16은 장기별로 First round PCR을 통해 얻어낸 VL과 VH를 나타낸 도이다.

도 17은 상기 VL 및 VH를 template로 하여 overlap PCR을 진행하여 scFv fragment의 DNA를 수득한 결과를 나타낸 도이다.

에서 1시간 반응시킨 뒤, 0.05% PBST로 남은 unbound antibody를 세척하였다. TMB를 넣고서 충분히 발색이 될 때까지 기다린 후 2N H₂SO₄를 넣어 반응을 종결한 후, 450 nm에서 microtiter plate reader로 흡광도를 측정하였다.

실험결과

2) ELISA를 이용한 항체 생성 확인

3) 혈구세포 및 장기로부터 RNA 추출

결과는 도 14 및 도 15에 나타내었다.

4) Overlap PCR을 이용한 면역항체라이브러리 증폭

5) Phage display 기법을 이용한 항원 특이적인 scFv-displayed phage 선별

이어서 항원에 특이적인 scFv 선별을 위해, CH1과 CH2의 면역항체 라이브러리를 각각 항원과 phage와의 반응을 4℃ 와 RT 두 조건에서 진행하였다. 또한, 0.05% PBST로 1차에는 1회, 2차는 2회 세척을 동일하게 진행하였다.

CH1 면역라이브러리의 경우 3차 이후는 3회 세척으로 고정하여 진행하였다(CH1 strategy 1(4℃, 3회 세척), CH1 strategy 2(RT, 3회 세척)). 결과는 도 18에 나타내었다.

도 18은 Chicken1 (CH1)의 면역라이브러리를 사용한 항원 특이적 항체선별을 위한 조건과 각 차수별 Input 대비 output titer를 나타낸 도이다.

CH2 면역 라이브러리는 1차에서 1회, 2차에서 2회, 3차에서 3회 세척 후 5차까지 3회 세척으로 고정하는 2가지 전략(CH2 strategy 1(4℃, 3회 세척), CH2 strategy 2(RT, 3회 세척))과 5회 세척으로 늘려서 5차까지 진행하는 2가지 전략(CH2 strategy 3(4℃, 5회 세척), CH2 strategy 4(RT, 5회 세척)) 총 4가지 전략으로 panning을 진행하였다. 결과는 도 19 및 도 20 에 나타내었다.

도 19 및 도 20은 Chicken2 (CH2)의 면역라이브러리를 사용한 항원 특이적 항체선별을 위한 조건과 각 차수별 Input 대비 output titer를 나타낸 도이다.

세척 횟수가 3회로 stringency가 증가한 3차 panning에서는 input 대비 output titer가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 그 후 CH2 RT을 제외한 5종류의 strategy에서 input 대비 output이 증가하면서 항원 특이적 clone들이 enrichment 되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 4℃ 조건이 RT 조건보다 더 빠르게 enrich가 되는 결과를 나타냈다 (도 18 내지 도 20).

6) Phage ELISA를 이용한 후보항체 스크리닝

Bio-panning을 통해 확보된 5차의 individual phage를 이용한 phage ELISA를 수행하였다. 결과는 도 21 내지 도 27에 나타내었다. 도 21 내지 도 27에서 빨간색은 BSA-conjugated human CADM1 peptide, 파란색은 BSA-conjugated mouse CADM1 peptide, 회색은 negative control인 BSA에 대한 scFv의 반응성을 나타낸다.

Chicken 1에서의 phage ELISA 결과를 보면 대부분이 human peptide와 mouse peptide 항원에 대한 교차 반응성이 우수한 것을 확인할 수 있으며, BSA에 대한 반응성은 없는 것으로 확인되었다. 또한, 일부 클론의 경우, mouse peptide에는 결합력이 낮고, human peptide에 높은 결합력이 있는 clone도 관찰되었다.

도 21 내지 도 24는 Chicken 1 output titer plate에서 확보한 phage를 이용한 phage ELISA 결과를 나타낸 도이다.

도 25 내지 도 28은 Chicken 2 output titer plate에서 확보한 phage를 이용한 phage ELISA 결과를 나타낸 도이다.

7) 선별항체에 대한 염기서열 분석

5차 panning에서 항원 반응성이 우수한 항체 clone에 대한 염기서열 분석을 진행하였다. 이 과정에서 중복되는 clone들을 모두 제거하고 CDR 서열이 다른 10개의 클론을 확보하였다. 그 결과, 10개의 종간 교차 반응성이 있는 항체 clone들을 확인하였다(표 5 및 표 6).

클론별 VL의 아미노산 서열

Clone	LFR1	LCDR1	LFR2	LCDR2	LFR3	LCDR3	LFR4
4A2	LTQPSSVSANPGETVKITC	SGGYNRYG	WYQQKSPGSAPVTVIY	SNNQRPS	NIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQAEDEAVYYC	GSYDSSDGYAGI	FGAGTTLTVL
4A8	LTQPSSVSANLGGTVKITC	SGGSGSNHYG	WYQQKSPGSAPVTVIY	SNNKRPS	NIPSRFSGSKFGSTATLTITGVQADDEAVYYC	GGYDSSAGYIGP	FGAGTTLTVL
4C8	LTQPSSVSANPGETVKITC	SGGSGSYYG	WYQQKSPGSAPVTVIY	QNKQRPS	NIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYFC	GNYESSAGI	FGAGTTLTVL
4H7	LTQPSSVSANPGETVKITC	SGSSGSYG	WYQQKSPGSAPVTVIY	DNTNRPS	DIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQAEDEAVYFC	GSRDSSYVGI	FGAGTTLTVL
RB11	LTQPSSVSANPGGTVKITC	SGGSGSYG	WFQQKAPGSAPVTLIY	ANTNRPS	DIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQVEDEAVYYC	GSTDSSYVSI	FGAGTTLTVL
RH6	VTQPSSVSANPGESVKITC	SGGSYSYG	WYQQKSPGSAPVTVIY	SNNQRPS	NIPSRFSGSTSGSTSTLTITGVQADDEAVYFC	GTFDSSTNAA	FGAGTTLTVL
3C5	LTQPSSVSANPGETVKITC	SGGYNYYG	WYQQKAPGSAPVTLIY	ANTDRPS	DIPSRFSGSKFGSTATLTITGVQAEDEAVYFC	GSRDSSYVGV	FGAGTTLTVL
3G10	LTQPSSVSANPGETVKITC	SGSTGSYG	WFQQKSPGSALVTLIY	NGNNRPS	DIPSRFSGSKSGSTGTLTITGVQADDEAVYFC	GGRESRSNPGI	FGAGTTLTVL
5A2	LTQPSSVSANPGETVKITC	SGGSSYYG	WYQQKSPGSAPVTVIY	YNDKRPS	DIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQAEDEAVYYC	GSADSSYVGI	FGAGTTLTVL
5A5	LTQPSSVSANLGGTVKITC	SGSSGYGYG	WYQQKSPGSAPVTVIY	YNNKRPS	DIPSRFSGSKSGSTATLTITGVQVEDEAVYYC	GSADSSAGYVGI	FGAGTTLTVL

클론별 VH의 아미노산 서열

Clone	HFR1	HCDR1	HFR2	HCDR2	HFR3	HCDR3	HFR4
4A2	AVTLDESGGGLQTPGRALSLACKGS	GFTFSSYAMN	WVRQAPGKGLEFVA	QITSSGRYTYYGTAVKG	RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDSGTYYC	AKDAAAGYYDGATAGDIDA	WGHGTEVIVSSTS
4A8	AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKAS	GFTFSSYAMN	WVRQAPGKGLEFVA	QITSSGRYTYYGTAVKG	RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDSGTYYC	AKDAAAGYYDGATAGDIDA	WGHGTEVIVSSTS
4C8	AVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKAS	GFSFSSYSMY	WVRQAPGKGLEYVA	EITSSGRYTYYGSAVKG	RATISRDNGQSTVRLQLNNFRAEDTATYFC	AKGSGTGYSDSGAGGEIDA	WGHGTEVIVSSTS
4H7	AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKAS	GFDFSSYEMA	WVRQAPGKGLEYVA	GIDNTGSATNYGAAVKG	RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFC	AKDAYGYSGSDSWYAANPAYIDA	WGHGTEVIVSSTS
RB11	AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKGS	GFTFSSYAMN	WVRQAPGKGLEFVA	QITSSGRYTYYGTAVKG	RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDSGTYYC	AKDAAAGYYDGATAGDIDA	WGHGTEVIVSSTS
RH6	AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKGS	GFTFSSYAMN	WVRQAPGKGLEFVA	QITSSGRYTYYGTAVKG	RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDSGTYYC	AKDAAAGYYDGATAGDIDA	WGHGTEVIVSSTS
3C5	AVTLDESGGGLQTPGRALSLVCKGS	GFTFSSVNMF	WVRQAPGKGLEYVA	GIRKDGGGPLYGAAVKG	RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYC	AKAAGSCWAGCTGFIDA	WGHGTEVIVSSTS
3G10	AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKGS	GFTFSSVNMF	WVRQAPGKGLEYVA	GIRKDGGGPLYGAAVKG	RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYC	AKAAGSCWAGCTGFIDA	WGHGTEVIVSSTS
5A2	AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKGS	GFDFSSVNMF	WVRQAPGKGLEYVA	GIRKDGGGPLYGAAVKG	RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYFC	AKAAGSCWAGCTGFIDA	WGHGTEVIVSSTS
5A5	AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKGS	GFTFSSVNMF	WVRQAPGKGLEYVA	GIRKDGGGPLYGAAVKG	RATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYC	AKAAGSCWAGCTGFIDA	WGHGTEVIVSSTS

8) 후보 scFv 항체 생산 및 정제

10종의 후보 scFv 항체를 Ni-NTA를 이용하여 정제 후, nanodrop으로 정량하였다. 1 μg을 SDS-PAGE에 각각 loading 한 후, SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris)으로 확인한 결과 scFv가 정제된 것을 확인하였다.

9) ELISA를 이용한 후보 scFv 항체의 특성 분석

ELISA를 이용하여 10종 항체의 항원 결합도를 측정하였으며, Human 및 mouse CADM1 peptide 항원에 대한 결합력을 각각 관찰하였다. 결과는 도 29 및 도 30에 나타내었다.

Human CADM1 peptide 항원에 대한 결합력은 RB11, 3G10 clone이 각각 0.6, 2.7 nM로 가장 낮은 Kd 값을 가지는 것을 확인하였고, 4A2, RH6의 2개의 clone은 4.2 nM, 5.6 nM로 낮은 Kd 값을 나타냈다. 4A8, 5A2, 3C5, 4H7, 4C8의 순으로 16~66 nM의 Kd 값을 확인했으며, 5A5가 122.6 nM로 가장 높은 Kd 값을 나타냈다.

Mouse CADM1 peptide 항원에 대한 결합력은 3G10, RB11이 각각 0.9 nM, 2.7 nM 정도의 가장 낮은 Kd 값을 가지는 것을 확인하였다. 그 뒤로 3C5, 5A2, 4A8, 4A2 순으로 40~80 nM의 Kd 값을 확인했으며, RH6, 5A5, 4H7, 4C8의 clone은 100 nM이상의 비교적 높은 Kd를 나타냈다.

10종 scFv 항체의 human CADM1 peptide에 대한 결합력 분석 결과

Clone	4A2	4A8	4C8	4H7	3C5	3G10	5A2	5A5	RB11	RH6
Bmax	4.141	4.22	4.473	4.477	4.406	1.908	4.379	4.517	4.012	4.16
Kd (nM)	4.187	16.4	66.47	52.66	49.73	2.765	47.87	122.6	0.6489	5.585

10종 scFv 항체의 mouse CADM1 peptide 대한 결합력 분석 결과

Clone	4A2	4A8	4C8	4H7	3C5	3G10	5A2	5A5	RB11	RH6
Bmax	4.491	4.431	2.056	5.567	4.047	1.618	4.324	4.544	3.997	2.397
Kd (nM)	79.17	70.23	476.1	393.8	41.71	0.9261	59.22	136.3	2.724	123.7

도 29는 10종 scFv 항체의 human CADM1 peptide에 대한 결합도 분석결과를 나타낸 도이다.

도 30은 10종 scFv 항체의 mouse CADM1 peptide에 대한 결합도 분석결과를 나타낸 도이다.

도 31 및 도 32는 10종 scFv별 human & mouse CADM1 peptide 항원에 대한 종간 교차 반응성을 log scale로 전환한 결과를 나타낸 도이다. 빨간색은 human peptide, 파란색은 mouse peptide, 회색은 BSA에 대한 결합능을 보여준다.

도 31 및 도 32에 나타낸 바와 같이, 10종의 클론 중 총 8개의 clone이 human과 mouse의 항원에 대한 종간 교차 반응성을 나타내었다. 또한, BSA에 대한 결합능력은 scFv의 농도가 높아지더라도 꾸준히 낮았다. 반면, 4C8과 RH6는 human peptide에 더욱 강하게 결합하고, mouse 항원에는 약한 결합력을 가지며, BSA에 대한 결합능력은 없는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3: CADM1 CAR-T의 제작>

1) CADM1 펩타이드를 발현시킨 소세포폐암 세포주(CADM1-SBC-5) 제작 및 본 발명 항체와의 결합 확인

실험 방법

본 발명자들은 CADM1 펩타이드에 결합하는 항체와, 세포표면에 발현하는 CADM1 펩타이드와의 결합력을 확인하기 위해서 소세포폐암 세포주 중에서 CADM1이 발현하지 않는 SBC-5 세포주 (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank)에 인위적으로 CADM1 펩타이드(DSRAGEEGSIRAVDH)를 도입하였다. CADM1 펩타이드의 발현을 확인하기 위해서 막횡단영역 (transmembrane domain, TM)에 이어서 녹색 형광 단백질 (Green fluorescent protein, GFP)을 삽입하였다 (도 33 참조).

이어서, CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포와 8종 항체 (4A2, 4A8, 4C8, 4H7, RB11, 3C5, 5A2, 및 RH6)와의 결합력을 확인하기 위해서 유세포분석 (flow cytometry)을 진행하였다.

CADM1 펩타이드를 발현하는 5 x 10⁵세포와 1 μg의 8 종의 항체 (4A2, 4A8, 4C8, 4H7, RB11, 3C5, 5A2, 및 RH6)를 4℃ 조건에서 30분간 반응 후에 원심분리를 통해 상층액을 제거하였다. CADM1 펩타이드와 결합하지 않는 항체를 제거하기 위해서 PBS를 이용하여 2회 세척하였다. 원심분리후 PE(phycorythrin)-conjugated HA(hemagglutinin) 항체 (16B12 clone, Biolegend, Cat No. 901518)을 넣고 4℃ 조건에서 30분간 반응 후 원심분리를 통해 상층액을 제거하였다. CADM1 펩타이드를 포함하는 SBC-5 세포를 PBS를 통해 2회 세척 후 유세포분석을 진행하였다. 유세포 분석 결과에 대한 대조군으로 염색을 진행하지 않은 시료 (Unstained)와 HA 항체 시료만 처리한 군 (HA 항체)을 포함시켰다.

실험 결과

CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포와의 결합력은 3C5-1.1%, 4C8-2.3%, 4H7-3.3%, 5A2-1.2%로 4종의 후보항체는 CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포와 결합하지 않거나 매우 약한 결합을 보여주었다.

나머지 선별 항체와 CADM1 펩타이드의 결합력은 4A2-18.5%, 4A8-10.1%, RB11-38.4% 및 RH6-10%로 나타났으며, RB11 항체가 CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포에 대한 결합력이 8종의 선별 항체 중 가장 높은 것으로 확인되었다. 대조군으로 사용한 염색을 진행하지 않은 시료와 HA 항체만 처리한 군에서는 0.3% 결합 결과를 얻었다 (도 33).

후보항체	Unstained	HA	3C5	4C8	4H7	5A2	4A2	4A8	RB11	RH6
결합력 (%)	0.3 %	0.3 %	1.1%	2.3%	3.3%	1.2%	18.5%	10.1%	38.4%	10.0%

2) CADM1펩타이드 구조를 세포표면에 발현시킨 세포주(CADM1-SBC-5)에 본 발명 항체와의 결합 확인

실험 방법

본 발명자들은 선별된 CADM1 펩타이드에 결합하는 항체와, 세포표면에 발현하는 CADM1 펩타이드와의 결합력을 확인하기 위하여 CADM1 펩타이드를 포함하는 구조를 세포에 도입하였다. 세포표면에 발현되는 CADM1 펩타이드를 확인하기 위해서 표지단백질 (protein tag)인 Myc을 포함하였으며, 힌지 (hinge)를 추가 포함하여 유연한 구조를 만들었다. 또한, 막횡단영역 (transmembrane domain, TM)에 이어서 녹색 형광 단백질 (Green fluorescent protein, GFP)을 삽입하였다 (도 34 참조). CADM1 펩타이드를 포함하는 SBC-5 세포 (도 33)와 결합력을 보이는 선별항체 4종 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)에 대한 결합력을 확인하기 위해서 유세포분석을 진행하였다.

CADM1 펩타이드를 포함하는 구조를 발현하는 5 x 10⁵ cells의 세포와 1 μg의 4 종 항체 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)를 30분간 4 ℃에서 반응후에 원심분리를 통해 상층액을 제거하였다. CADM1 펩타이드와 결합하지 않는 항체를 제거하기 위해서 PBS를 통해 세척하였다. 원심분리후 PE-conjugated HA 항체 (16B12 clone, Biolegend Cat No. 901518)을 넣고 4℃ 조건에서 30분간 반응 후 원심분리를 통해 상층액을 제거하였다. CADM1 펩타이드의 구조를 포함하는 세포를 PBS를 통해 2회 세척 후 유세포분석을 진행하였다.

유세포 분석 결과에 대한 대조군으로 염색을 진행하지 않은 시료 (Unstained)와 HA 항체 시료만 처리한 군 (HA 항체)을 포함시켰다. 또한 비교군으로 동일한 구조에 CADM1 펩타이드를 포함하지 않는 세포를 사용함으로 비정상적인 결합인지를 확인하였다.

실험 결과

CADM1 펩타이드를 포함하는 구조 및 미 포함 구조에서 GFP을 통해서 발현을 확인하였으며 (도 34 우측, GFP, Q4-4), CADM1 펩타이드를 포함하는 구조와 4종의 항체 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)와의 결합력은 4A2-16.3%, 4A8-14.7%, RB11-16% 및 RH6-15.3%로 결합이 강하게 이루어지는 현상을 확인하였다. 반면, 비교군으로 사용하였던 동일한 구조에 CADM1 펩타이드를 포함하지 않는 세포의 GFP을 통한 발현을 확인하였지만 (도 34 좌측, GFP, Q4-4), 4종의 항체 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)에 대한 결합이 이루어지지 않음을 확인하였다.

상기 결과로부터, 본 발명의 4종의 후보항체 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)는 특이적으로 CAMD1 펩타이드에 결합하는 것을 확인할 수 있었다 (도 34).

후보항체	Unstained	HA	4A2	4A8	RB11	RH6
비교군 구조 (결합력 %)	0.0%	0.1%	0.7%	0.9%	1.2%	0.7%
CAMD1 펩타이드 구조 (결합력 %)	0.0%	0.0%	16.3%	14.7%	16%	15.3%

3) 소세포폐암 세포주(H146과 H69)와의 선별항체와의 결합확인

실험 방법

본 발명의 CAMD1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 4종 항체 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)에 대한 소세포폐암 세포주와의 결합력을 확인하기 위해서 두 종의 소세포폐암 세포주인 H146 (한국세포주은행)과 H69 (한국세포주은행)을 이용하여 유세포분석을 진행하였다.

H146과 H69 세포를 각각 5 x 10⁵cells의 세포와 1 μg의 4 종의 항체 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)를 30분간 4 ℃에서 반응후에 원심분리를 통해 상층액을 제거하였다. 상층액 제거 후 H146과 H69 세포를 PBS를 이용하여 2회 세척하였다. 세척이 완료된 H146과 H69 세포를 원심분리후 PE-conjugated HA 항체 (16B12 clone, Biolegend Cat No. 901518)을 넣고 4℃ 조건에서 30분간 반응 후 원심분리를 통해 상층액을 제거하였다. 상층액 제거 후 H146과 H69 세포를 PBS를 이용하여 2회 세척 후 유세포분석을 진행하였다. 유세포 분석 결과에 대한 대조군으로는 염색을 진행하지 않은 시료 (Unstained)와 HA 항체 시료만 처리한 군 (HA 항체)을 포함시켰다.

실험 결과

H146 소세포폐암 세포주에 대한 4종의 항체 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)와의 결합력은 4A2-10.2%, 4A8-9.7%, RB11-33.6% 및 RH6-4.5%로 보였으며, 대조군으로HA 항체만 처리한 군에서는 2.4% 결과를 얻었다.

H69 소세포폐암 세포주에 대한 4종의 항체 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)와의 결합력은 4A2-29.1%, 4A8-61.1%, RB11-61.8% 및 RH6-12%로 보였으며, 대조군으로HA 항체만 처리한 군에서는 2.2% 결과를 얻었다.

따라서, 두 종의 소세포폐암 세포주에 대한 4 종의 항체와의 유세포분석 결과 RB11 항체가 가장 높은 결합력이 높은 것을 확인하였다 (도 35). 상기 세포주의 종류에 따른 항체의 결합력 차이는 세포주별로 CADM1의 발현량의 차이가 나기 때문이다.

후보항체	Unstained	HA	4A2	4A8	RB11	RH6
H146 소세포폐암 세포주 (결합력 %)	2.2%	2.1%	10.2%	9.7%	33.6%	4.5%
H69 소세포폐암 세포주 (결합력 %)	0.6%	2.2%	29.1%	61.1%	61.8%	12%

4) 활성 T 세포와의 선별항체와의 결합 여부 확인

실험방법

본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체가 활성 T 세포와 결합하지 않음을 확인하기 위해서, 말초 혈액 단핵세포 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC)에서 T 세포를 활성화하였다. 본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 4종의 항체 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)와 활성 T 세포와의 결합을 확인하기 위해서 5 x 10⁵의 활성 T세포와 4종의 후보항체 (4A2, 4A8, RB11 또는 RH6) 1 μg를30분간 4 ℃에서 반응후에 원심분리를 통해 상층액을 제거하였다. 원심분리후 PE-conjugated HA 항체 (16B12 clone, Biolegend Cat No. 901518)을 넣고 4℃ 조건에서 30분간 반응 후 원심분리를 통해 상층액을 제거하였다. 유세포 분석 결과에 대한 대조군으로 HA 항체 시료만 처리한 군을 포함시켰다.

실험결과

결과는 도 36에 나타내었다. 도 36에 나타낸 바와 같이, 활성 T 세포에 대한 4종의 항체 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)와의 결합력은 4종의 항체 모두 1.0% 미만의 결합력을 보였으며, 대조군으로 HA 항체만 처리한 군에서도 1.0% 미만의 결합 결과를 얻었다. 결과적으로 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 4종의 항체 (4A2, 4A8, RB11 및 RH6)는 활성 T세포에는 결합이 약하거나 결합하지 않으며 CADM1 펩타이드에 강한 결합을 보여주었다.

상기 결과로부터, 소세포폐암 세포에는 가장 높은 결합능을 보이며, 활성 T 세포에는 결합능이 가장 낮은 후보항체는 RB11 항체임을 확인하였다. 따라서, 본 발명자들은 RB11 항체를 이용하여 CADM1펩타이드를 발현하는 세포에 대한 세포사멸능력을 확인하기 위해서2 세대 키메라 항원 수용체를 제작하기로 하였다.

5): CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 2세대 키메라 항원 수용체, CADM1(RB11) CAR를 갖는 벡터의 구축

본 발명의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 RB11 항체 단편 (Single-chain variable fragment, scFv)을 이용하여 CAR-콘스트럭트를 제작하기 위하여 CD8 α 힌지 (hinge) 영역 CD8 막횡단 도메인 (Transmembrane, TM)을 사용하였으며 T 세포 활성화를 위한 세포질 신호전달 도메인으로 CD137 및 CD3 ζ를 사용하였다. CD137은 tumor necrosis factor superfamily member 9 활성 신호 전달 도메인 (coactivation signaling domain)을, CD3ζ는 CD3 제타 살해 (killing) 신호 도메인을 나타낸다. 또한 CAR-콘스트럭트의 발현을 확인하기 위해서 GFP를 삽입하였다(도 37 참조).

6) 항-CADM1 CAR 유전자 발현 T 세포의 발현률 체크

실험방법

상기 5)의 항-CADM1 CAR-T 세포를 발현하기 위한 컨스트럭트를 제작하고, T 세포에 렌티바이러스 벡터를 이용하여 형질전환하였다. T 세포 배양 배지에 배양 중 (배양일, 10일)인 항-CADM1 CAR-T 세포 1 x 10⁶ 세포를 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거한 후, 2% BSA (bovine serum albumin)를 함유한 PBS를 이용하여 항-CADM1 CAR-T 세포를 2회 세척하였다. 세척이 완료된 후 형질 도입된 T 세포의 발현은 GFP을 통해서 항-CADM1 CAR-T의 발현을 유세포 분석을 통해 체크하였다. 유세포 분석 결과에 대한 대조군으로 항-CADM1 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 (untransduced T 세포) 시료를 포함시켰다.

실험결과

항-CADM1 CAR-T 세포의 발현을 확인하기 위해서 실험방법에 따라 유세포 분석을 진행하였다. 분석 결과 항-CADM1 CAR-T의 발현률은 37.6% 이었다(도 38). 유세포 분석 결과에 대한 대조군으로 사용한 untransduced T 세포의 GFP 는 0.9% 였다.

7) 항-CADM1 CAR-T 세포 표적세포 사멸능 확인 (In vitro)

실험방법

본 발명의 항-CADM1 CAR-T 세포의 암세포 용해 활성을 측정하기 위해 LDH (Promega, Cat No.: G1780) 키트를 사용하여 세포독성 분석 (cytotoxicity assay)을 진행하였다. 구체적으로는 항-CADM1 CAR-T 세포 (effector 세포) 와 CAMD1 펩타이드를 포함하는 SBC-5 세포 (target 세포)를 5:1 또는 10:1 (effector:target)의 세포수 비율로 96웰 플레이트에 각각 세포를 넣고 37℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 대조군으로 항-CADM1 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 untransduced T 세포를 포함시켰다.

실험결과

항-CADM1 CAR-T 세포와 공배양에 따른 CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포의 사멸능력은 5:1의 비율에서 9.7% 였으며, 10:1 비율에서 22.8 %의 세포 사멸능을 보여주었다. 대조군으로 사용한 untransduced T 세포의 경우 5:1의 비율에서 4.6%, 10:1의 비율에서 13.3%로 항-CADM1 CAR-T 세포보다 약 2 배 낮은 세포 사멸능력을 보였다(도 39).

8) 항-CADM1 CAR-T 세포 표적세포 사멸능 확인 (In vitro)

실험방법

본 발명의 항-CADM1 CAR-T 세포의 CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포에 대한 항암 활성능을 확인하기 위해서 표적세포(CADM1을 발현하는 SBC-5)만 염색 후, 항-CADM1 CAR-T 세포와의 공배양에 따른 표적세포의 사멸을 유세포 분석 방법을 이용하여 확인하였다.

CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포와 항-CADM1 CAR-T 세포와 공배양시 표적세포주의 손상에 따라 DNA가 노출이 되며, 노출이 된 DNA와 높은 결합력을 지닌 7AAD (BD pharmingen Cat No. 51-6898-1E)의 염색 정도를 통해서 항암활성능 (cytotoxicity)을 평가할 수 있다.

CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포를 표적세포로 이용하였으며, CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포를 1x 10⁶/mL 기준으로 PBS에 준비하며, 1 μM FarRed (Invitrogen. Cat No. C34564)를 넣고 37℃ 에서 10분간 암흑상태로 반응시켰다. 반응이 완료되면, CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포를 PBS를 통해 세척을 진행하였다. 세척 완료 후 CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포 1 x 10⁵ 세포와 항-CADM1 CAR-T 세포 10 x 10⁵ 세포를 표적세포의 배양액인 RPMI (Gibco, 61870-036)을 이용하여 24웰 플레이트에 32℃ 6% CO₂조건에서 48 시간 공배양하였다. 공배양 완료 후, 세포를 tube에 옮긴 후 원심분리를 통해 상층액을 제거하고 PBS를 통해 세포를 세척하였다. 세척이 완료된 후 7AAD을 넣고 반응시킨 후, 유세포분석기를 통해서 FarRed가 염색된 암세포주에 7AAD가 염색된 집단을 비교하여 세포사멸능력을 확인하였다. 대조군으로 항-CADM1 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 untransduced T 세포를 포함시켰다.

실험결과

결과는 도 40에 나타내었다.

도 40에 나타낸 바와 같이, CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포주 자체의 7AAD염색된 세포는 4.3 %이고, untransduced T 세포와 공배양에 따른 CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포의 7AAD 염색된 세포는 9.0 %이며, 항-CADM1 CAR-T 세포와 공배양에 따른 CADM1 펩타이드를 발현하는 SBC-5 세포의 7AAD 염색된 세포는 40.5%로 약 10 배 높은 세포사멸능력을 나타내었다.

9) 항-CADM1 CAR-T세포의 CADM1 펩타이드 발현 SBC-5 세포 사멸현상 확인

실험방법

CADM1 펩타이드 발현 SBC-5 세포에 대한 본 발명의 항-CADM1 CAR-T 세포의 항암 활성능을 다른 방법을 통해 확인하기 위해서 표적세포와 공배양 후 살아 있는 표적세포에만 염색되는 crystal violet 용액 (Sigma, Cat No. V5265)을 처리하여 항-CADM1 CAR-T 세포의 표적세포의 사멸현상을 확인하고자 하였다.

CADM1 펩타이드 발현 SBC-5 세포주 5 x 10⁴ 세포와 항-CAM1 CAR-T 세포 2.5 x 10⁵ 세포를 12웰 플레이트에 96시간 공배양을 진행하였다. 공배양 후 PBS를 이용하여 죽은 세포를 완벽하게 제거해 준 후 0.1 % crystal violet 용액을 이용하여 살아 있는 표적세포를 염색하였다. 살아 있는 표적세포의 crystal violet 염색이 완료된 후, PBS를 이용하여 2회 세척한 후 항-CADM1 CAR-T 세포의 CADM1 펩타이드 발현 SBC-5 세포의 사멸현상을 확인하였다. 대조군으로 항-CADM1 CAR 바이러스에 형질도입 되지 않은 transduced T 세포를 포함시켰다.

실험결과

결과는 도 41에 나타내었다.

도 41에 나타낸 바와 같이, CADM1 펩타이드 발현 SBC-5 세포의 경우 항-CADM1 CAR-T와 공배양에 따른 crystal violet 용액에 대한 염색이 untransduced T 세포에 비해서 적게 염색이 되었다. 결과적으로 항-CADM1 CAR-T 세포의 CADM1을 발현하는 표적 세포주에 대한 세포 사멸능을 확인할 수 있었다.

<110> CellabMED Inc. <120> Antibody or antigen binding fragment thereof specifically binding to CADM1 peptide and Uses thereof <130> PN210220P <150> KR 10-2021-0075748 <151> 2021-06-10 <160> 324 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5RA5 HCDR1 <400> 1 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5RA5 HCDR2 <400> 2 Trp Ile Tyr His Gly Gly Gly Asp Thr 1 5 <210> 3 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5RA5 HCDR3 <400> 3 Arg Ala Ala Val Tyr Cys Lys Arg Thr Asn Cys Tyr Ser Tyr Asp Ala 1 5 10 15 Met Asp Val <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5RA5 LCDR1 <400> 4 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ser Val Thr 1 5 10 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5RA5 LCDR2 <400> 5 Ser Asn Asn Asn 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5RA5 LCDR3 <400> 6 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala 1 5 <210> 7 <211> 127 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Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Ala Leu 100 105 110 <210> 9 <211> 252 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 5RA5 scFv <400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Tyr His Gly Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ala Val Tyr Cys Lys Arg Thr Asn Cys Tyr Ser Tyr Asp 100 105 110 Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser 130 135 140 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Lys Gly Arg Ala Thr 195 200 205 Ile Ser Arg Asp Asn Gly Gln Ser Thr Val Arg Leu Gln Leu Asn Asn 210 215 220 Leu Arg Ala Glu Asp Ser Gly Thr Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Ala Ala 225 230 235 240 Ala Gly Tyr Tyr Asp Gly Ala Thr Ala Gly Asp Ile Asp Ala Trp Gly 245 250 255 His Gly Thr Glu Val Ile Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Pro Arg 260 265 270 Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr 275 280 285 Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala 290 295 300 Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile 305 310 315 320 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 325 330 335 Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 340 345 350 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 355 360 365 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val 370 375 380 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 385 390 395 400 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 405 410 415 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln 420 425 430 Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp 435 440 445 Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg 450 455 460 Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr 465 470 475 480 Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu 485 490 495 Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 500 505 510 Pro Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile 515 520 525 Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser 530 535 540 Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe 545 550 555 560 Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr 565 570 575 Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met 580 585 590 Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln 595 600 605 Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala 610 615 620 Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys 625 630 635 640 Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu 645 650 655 Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys 660 665 670 Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly 675 680 685 Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp 690 695 700 Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala 705 710 715 720 Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu 725 730 735 Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 740 745 750 <210> 316 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Leader <400> 316 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 317 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCADM1 TM <400> 317 Ala Val Ile Gly Gly Val Val Ala Val Val Val Phe Ala Met Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Ile Ile Leu 20 <210> 318 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP <400> 318 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu 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Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 323 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hCD3z <400> 323 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg <210> 324 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 324 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro

Claims

Cell Adhesion Molecule 1 (CADM1) 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 1) 내지 17)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
1) a) 서열번호 1로 표시되는 HCDR1, 서열번호 2로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 3으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 4로 표시되는 LCDR1, 서열번호 5로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 6으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
2) a) 서열번호 10로 표시되는 HCDR1, 서열번호 11로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 12로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 13로 표시되는 LCDR1, 서열번호 14로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 15로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
3) a) 서열번호 19로 표시되는 HCDR1, 서열번호 20으로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 21로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 22로 표시되는 LCDR1, 서열번호 23으로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 24로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
4) a) 서열번호 28로 표시되는 HCDR1, 서열번호 29로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 30으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 31로 표시되는 LCDR1, 서열번호 32로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 33으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
5) a) 서열번호 37로 표시되는 HCDR1, 서열번호 38로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 39로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 40으로 표시되는 LCDR1, 서열번호 41로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 42로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
6) a) 서열번호 46으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 47로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 48로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 49로 표시되는 LCDR1, 서열번호 50으로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 51로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
7) a) 서열번호 55로 표시되는 HCDR1, 서열번호 56으로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 57로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 58로 표시되는 LCDR1, 서열번호 59로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 60으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
8) a) 서열번호 64로 표시되는 HCDR1, 서열번호 65로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 66으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 67로 표시되는 LCDR1, 서열번호 68로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 69로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
9) a) 서열번호 73으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 74로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 75로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 76으로 표시되는 LCDR1, 서열번호 77로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 78로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
10) a) 서열번호 82로 표시되는 HCDR1, 서열번호 83으로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 84로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 85로 표시되는 LCDR1, 서열번호 86으로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 87로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
11) a) 서열번호 91로 표시되는 HCDR1, 서열번호 92로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 93으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 94로 표시되는 LCDR1, 서열번호 85로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 96으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
12) a) 서열번호 100으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 101로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 102로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 103으로 표시되는 LCDR1, 서열번호 104로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 105로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
13) a) 서열번호 109로 표시되는 HCDR1, 서열번호 110으로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 111로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 112로 표시되는 LCDR1, 서열번호 113으로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 114로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
14) a) 서열번호 118로 표시되는 HCDR1, 서열번호 119로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 120으로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 121로 표시되는 LCDR1, 서열번호 122로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 123으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
15) a) 서열번호 127로 표시되는 HCDR1, 서열번호 128로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 129로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 130으로 표시되는 LCDR1, 서열번호 131로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 132로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
16) a) 서열번호 136으로 표시되는 HCDR1, 서열번호 137로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 138로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 139로 표시되는 LCDR1, 서열번호 140으로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 141로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및
17) a) 서열번호 145로 표시되는 HCDR1, 서열번호 146으로 표시되는 HCDR2, 및 서열번호 147로 표시되는 HCDR3를 포함하는 중쇄 가변영역; 및 b) 서열번호 148로 표시되는 LCDR1, 서열번호 149로 표시되는 LCDR2, 및 서열번호 150으로 표시되는 LCDR3를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 1) 내지 17)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
1) 서열번호 7로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 8로 표시되는 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
2) 서열번호 16로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 17로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
3) 서열번호 25로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 26로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
4) 서열번호 34로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 35로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
5) 서열번호 43로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 44로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
6) 서열번호 52로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 53로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
7) 서열번호 61로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 62로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
8) 서열번호 70로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 71로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
9) 서열번호 79로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 80로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
10) 서열번호 88로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 89로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
11) 서열번호 97로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 98로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
12) 서열번호 106로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 107로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
13) 서열번호 115로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 116로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
14) 서열번호 124로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 125로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
15) 서열번호 133로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 134로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
16) 서열번호 142로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 143로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및
17) 서열번호 151로 표시되는 중쇄 가변영역 및 서열번호 152로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기 1) 내지 17)로 이루어진 군으로부터 선택되는 scFv인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
1) 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
2) 서열번호 18의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
3) 서열번호 27의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
4) 서열번호 36의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
5) 서열번호 45의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
6) 서열번호 54의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
7) 서열번호 63의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
8) 서열번호 72의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
9) 서열번호 81의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
10) 서열번호 90의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
11) 서열번호 99의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
12) 서열번호 108의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
13) 서열번호 117의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
14) 서열번호 126으의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
15) 서열번호 135의 아미노산 서열로 표시되는 scFv;
16) 서열번호 144의 아미노산 서열로 표시되는 scFv; 및
17) 서열번호 153의 아미노산 서열로 표시되는 scFv.
제1항에 있어서, 상기 CADM1 펩타이드는 인간 유래 CADM1 펩타이드 또는 마우스 유래 CADM1 펩타이드인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 서열번호 307 또는 308의 아미노산 서열로 표시되는 CADM1 펩타이드에 결합하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 가변영역의 프레임워크서열은 인간 유래 프레임워크 서열 또는 닭 유래 프레임워크 서열로부터 유래하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중항체, 다중특이적 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 항원 결합 단편인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
다음을 포함하는 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드:
(a) 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는, CADM1 펩타이드 결합 도메인(CADM1 peptide binding domain);
(b) 막횡단 도메인(transmembrane domain, TM); 및
(c) 세포내 신호전달 도메인(intracellular signaling domain, ICD).
제9항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드는 공동자극 도메인(costimulatory domain)을 추가적으로 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드.
제9항에 있어서, 상기 막횡단 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막횡단 도메인을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드.
제9항에 있어서, 상기 공동자극 도메인은 MHC 클래스 I 분자, TNF 수용체 단백질, 이뮤노글로불린-유사 단백질, 시토카인 수용체, 인테그린, 신호전달 림프구성 활성화 분자 (signaling lymphocytic activation molecule, SLAM), 활성화 NK 세포 수용체, BTLA(B an T lymphocyte attenuator), 톨-유사 리간드 수용체(Toll-like ligand receptor), OX40, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BB (CD137), B7-H3, CDS, ICAM-1, ICOS (CD278), GITR, BAFFR, LIGHT, HVEM (LIGHTR), KIRDS2, SLAMF7, NKp80 (KLRF1), NKp44, NKp30, NKp46, CD19, CD4, CD8알파, CD8베타, IL2R 베타, IL2R 감마, IL7R 알파, ITGA4, VLA1, CD49a, ITGA4, IA4, CD49D, ITGA6, VLA-6, CD49f, ITGAD, CD11d, ITGAE, CD103, ITGAL, CD11a, LFA-1, ITGAM, CD11b, ITGAX, CD11c, ITGB1, CD29, ITGB2, CD18, LFA-1, ITGB7, NKG2D, NKG2C, TNFR2, TRANCE/RANKL, DNAM1 (CD226), SLAMF4 (CD244, 2B4), CD84, CD96 (Tactile), CEACAM1, CRTAM, Ly9 (CD229), CD160 (BY55), PSGL1, CD100 (SEMA4D), CD69, SLAMF6 (NTB-A, Ly108), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), BLAME (SLAMF8), SELPLG (CD162), LTBR, LAT, GADS, SLP-76, PAG/Cbp, CD19a, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질로부터 수득된 기능적 신호전달 도메인인, 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드.
제9항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, CD3 제타의 기능적 신호전달 도메인, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
제14항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
제15항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
제16항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 효과기 세포.
제19항에 있어서, 상기 효과기 세포는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, 자연살해 세포, B 림프구, T 림프구, 대식세포 및 이들의 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 효과기 세포.
제20항에 있어서, 상기 T 림프구는 염증성 T 림프구, 세포독성 T 림프구, 조절 T 림프구 또는 헬퍼 T 림프구로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 효과기 세포.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 CADM1 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 암 진단용 조성물.
제23항의 조성물을 포함하는 암 진단용 키트.
제19항의 키메라 항원 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 효과기 세포를 포함하는 암의 치료용 약제학적 조성물.
제25항에 있어서, 상기 암은 갑상선암, 고환암, 간암, 자궁내막암, 췌장암, 전립선암, 유방암, 폐암, 위암, 대장암, 성인 T 세포 백혈병, 및 성인 T 세포 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 암인, 약제학적 조성물.