KR20220147765A - SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도 - Google Patents

SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 치료적 및 진단적 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2의 숙주세포 내 침투에 중요한 역할을 수행하는 S 단백질에 특이적으로 결합하여 SARS-CoV-2의 감염을 억제할 수 있으므로, COVID-19의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있으며, COVID-19의 진단제제 및 진단키트로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도 {Antibody or antigen binding fragment thereof specifically binding to S protein of SARS-CoV-2 and Uses thereof}
본 발명은 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이들을 이용한 SARS-CoV-2 감염증 진단 또는 치료용도에 관한 것이다.
SARS-CoV-2 바이러스에 의한 코로나-19 감염병은 2020년 1월부터 유행하여 1년 만에 전세계 인구 중 1억 명을 감염시키고 2백여만 명을 사망에 이르게 한 무서운 감염병이다. 스파이크 단백질(spike protein, S protein)은 SARS-CoV-2 표면에 위치하여 숙주 세포 표면에 있는 수용체인 angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2)와 결합하여 감염을 유발하는 핵심 표지분자이다. 따라서 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain of spike protein, 이하 S-RBD)은 SARS-CoV-2에 의한 감염을 막는 치료제 개발에서 핵심 타겟이다. 항체 치료제는 타겟에 대한 높은 친화도와 특이성으로 인해 그 효능을 인정받고 있다.
본 발명자들은 코로나-19 감염병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 신규한 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 개발하고, 이들 항체 또는 항원 결합 단편이 S 단백질에 대해 높은 친화도를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 검출용 조성물 또는 키트; 또는 COVID-19 감염증 진단용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음으로부터 선택된, SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다:
(i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3의 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
(ii) 서열번호 10의 CDR-H1, 서열번호 11의 CDR-H2, 및 서열번호 12의 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 13의 CDR-L1, 서열번호 14의 CDR-L2, 및 서열번호 15의 CDR-L3의 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
(iii) 서열번호 19의 CDR-H1, 서열번호 20의 CDR-H2, 및 서열번호 21의 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 22의 CDR-L1, 서열번호 23의 CDR-L2, 및 서열번호 24의 CDR-L3의 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
(iv) 서열번호 28의 CDR-H1, 서열번호 29의 CDR-H2, 및 서열번호 30의 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 31의 CDR-L1, 서열번호 32의 CDR-L2, 및 서열번호 33의 CDR-L3의 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및
(v) 서열번호 37의 CDR-H1, 서열번호 38의 CDR-H2, 및 서열번호 39의 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 40의 CDR-L1, 서열번호 41의 CDR-L2, 및 서열번호 42의 CDR-L3의 경쇄가변영역을 포함하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (i) 내지 (v)의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 각각 본 발명의 실시예에서 선별한 클론 RG6, RB4, RB6, RD3, 및 RD10 로부터 유래한 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (i)은 서열번호 7의 중쇄가변영역 및 서열번호 8의 경쇄가변영역을 포함하고; 상기 (ii)는 서열번호 16의 중쇄가변영역 및 서열번호 17의 경쇄가변영역을 포함하고; 상기 (iii)은 서열번호 25의 중쇄가변영역 및 서열번호 26의 경쇄가변영역을 포함하고; 상기 (iv)는 서열번호 34의 중쇄가변영역 및 서열번호 35의 경쇄가변영역을 포함하고; 상기 (v)는 서열번호 43의 중쇄가변영역 및 서열번호 44의 경쇄가변영역을 포함하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (i)은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 (ii)는 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 (iii)은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 (iv)는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 (v)는 서열번호 45의 아미노산 서열을 포함하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2 S 단백질(spike protein)의 RBD(receptor binding domain)에 결합한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD는 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD와 인간 ACE2 (angiotensin converting enzyme 2)와의 결합을 저해한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 도메인에 결합한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질의 S1 도메인은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, SARS-CoV-2 S 단백질의 S2 도메인은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2 S 단백질의 전장 스파이크 단백질(full-length spike protein)에 결합한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2의 전장 스파이크 단백질은 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2의 S 단백질에 돌연변이가 발생한 변이 바이러스에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2의 S 단백질의 RBD 영역에 돌연변이가 발생한 변이 바이러스에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 항원 결합 단편이 특이적으로 결합하는 SARS-CoV-2의 S 단백질의 RBD 영역에 돌연변이가 발생한 변이 바이러스는, RBD의 431번째 아미노산 위치에서 V431A 변이, 342번째 아미노산 위치에서 F342L 변이, 367번째 아미노산 위치에서 V367F 변이, 408번째 아미노산 위치에서 R408I 변이, 435번째 아미노산 위치에서 A435S 변이, 436번째 아미노산 위치에서 W436R 변이, 476번째 아미노산 위치에서 G476S 변이, 483번째 아미노산 위치에서 V483A 변이, 354번째 및 364번째 아미노산 위치에서 N354D/D364Y 변이가 발생한 변이 바이러스이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2의 S 단백질 이외의 부위에 돌연변이가 발생한 변이 바이러스에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV의 S 단백질에 특이적으로 결합하는 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 항원 결합 단편은 SARS-CoV의 S 단백질의 RBD 영역에 특이적으로 결합한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 S 단백질의 RBD 영역은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체는 당 업계에 알려져 있는 다양한 파지 디스플레이(phage display)방법을 사용하여 생성될 수 있고, [Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41-50]; [Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184, 177-186]; [Kettleborough et al. 1994, Eur. J. Immunol, 24, 952-958]; [Persic et al., 1997, Gene, 187, 9-18]; 및 [Burton et al., 1994, Adv. Immunol., 57, 191-280]; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; 및 WO 95/20401; 및 US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743; 및 5,969,108 에 게시된 것을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 “항체(antibody)”는 SARS-CoV S 단백질에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편(antigen binding fragment)을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(kappa) 및 람다(lambda) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
본 명세서에서, 용어 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, 화학적으로 연결된 F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 구체적으로 scFv 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 2(IgG2), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이고, 가장 구체적으로는 감마 4(IgG4) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파형이다. 따라서, 본 발명의 구체적인 항체는 카파(kappa) 경쇄와 감마4(gamma 4) 중쇄를 가지는 scFv 형태 또는 IgG4 형태이다.
본 명세서에서, 용어 “중쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어“경쇄”는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 “CDR(complementarity determining region)”은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3) 및 경쇄(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)에는 각각 3개의 CDR이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 명세서에서 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 전장 또는 원래 그대로의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, 이의 항원 결합 단편들(예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fab3, Fv 및 이의 변이체들), 하나 또는 그 이상의 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 체인 항체(scFv), scFv-Fc, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 면역 글로불린 분자의 다른 변형된 배열형태로서 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체 및 공유결합으로 변형된 항체를 포함한다. 변형된 항체 및 이의 항원 결합 단편의 구체적인 예에는 나노바디, AlbudAbs, DARTs(dual affinity re-targeting), BiTEs(bispecific T-cell engager), TandAbs(tandem diabodies), DAFs(dual acting Fab), two-in-one antibodies, SMIPs(small modular immunopharmaceuticals), FynomAbs(fynomers fused to antibodies), DVD-Igs(dual variable domain immunoglobulin), CovX-bodies(peptide modified antibodies), 듀오바디 및 triomAbs이 포함된다. 이와 같은 항체 및 이의 항원 결합 단편들의 목록은 상기에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL/Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:
(a) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4; 및
(b) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
본 명세서에서, 용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 항원과 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터, VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하(예컨대, 9 x 10-7 M, 8 x 10-7 M, 7 x 10-7 M, 6 x 10-7 M, 5 x 10-7 M, 4 x 10-7 M, 3 x 10-7 M, 2 x 10-7 M, 또는 1 x 10-7 M), 바람직하게는 1 x 10-7 M 이하(예컨대, 9 x 10-8 M, 8 x 10-8 M, 7 x 10-8 M, 6 x 10-8 M, 5 x 10-8 M, 4 x 10-8 M, 3 x 10-8 M, 2 x 10-8 M, 또는 1 x 10-8 M), 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하(예컨대, 9 x 10-9 M, 8 x 10-9 M, 7 x 10-9 M, 6 x 10-9 M, 5 x 10-9 M, 4 x 10-9 M, 3 x 10-9 M, 2 x 10-9 M, 또는 1 x 10-9 M)의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한 본 명세서에서 용어, "인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.
본 명세서에서 용어, "키메라(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "인간화 항체"란, 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체의 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부의 경우에, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 상기 도메인에서 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린의 FR 영역의 서열을 가진다. 상기 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc region)의 적어도 일부 내지 실질적인 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc region)서열을 포함한다.
상기 변이체는 "실질적 유사성"을 가지는 것으로, 2개의 펩타이드 서열이 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 유사성의 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 RG6, RB4, RB6, RD3, RD10으로 표현된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 S 단백질의 RBD에 대한 해리 상수 KD 값이 7.2x10-10 M 이하이다.
또한, 본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 S 단백질의 S1 항원에 대한 해리 상수 KD 값이 3.2x10-9 M 이하이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편 RG6, RB4, RB6, RD3, RD10는 상술한 SARS-CoV-2의 S 단백질의 RBD 항원 뿐만 아니라, SARS-CoV의 S 단백질의 RBD에도 특이적으로 결합한다.
본 발명의 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 아미노산 서열에 대하여 소폭의 변화, 즉, 3차 구조 및 항체의 기능에 거의 영향을 미치지 않는 변형을 포함하는 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함한다. 따라서 어떤 구현예의 경우 상술한 서열과 일치하지 않더라도 적어도 100%, 93%, 95%, 96%, 97%, 또는 98% 이상의 유사성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 항-SARS-CoV-2 S 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 서열의 CDR을 포함하는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역을 포함하는 단일클론 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일 체인 항체(scFv), Fab 단편, F(ab')단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.본 발명의 다른 구현예에서 본 발명의 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항-SARS-CoV-2 S 단백질 scFv이다.
본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 포함되는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 (Gly-Ser)n, (Gly2-Ser)n, (Gly3-Ser)n 또는 (Gly4-Ser)n 등의 링커에 의해 연결된다. 여기서 n은 1 내지 6의 정수이고, 구체적으로는 3 내지 4이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 scFv의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역은 예를 들어 다음의 배향으로 존재할 수 있다: 경쇄가변영역-링커-중쇄가변영역 또는 중쇄가변영역-링커-경쇄가변영역.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열인 것으로 족하며, 어느 특정 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다.
이는 뉴클레오티드 서열의 변이가 발생하더라도 변이된 뉴클레오타이드 서열을 단백질로 발현하면 단백질 서열에서 변화를 가져오지 않는 경우도 있기 때문이다. 이를 코돈의 축퇴성이라고 한다. 따라서 상기 뉴클레오타이드 서열은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성(예컨대 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 또는 69%), 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성(예컨대 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 또는 79%), 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성(예컨대 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 또는 89%), 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성(예컨대 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%), 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성(예컨대 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%)을 나타내는 서열을 의미한다. 상기 60% 이상 100% 이하의 모든 정수 및 이 사이에 존재하는 소수는 % 상동성과 관련하여 본 발명의 범위 내에 포함된다.
서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLAST는 ncbi 웹사이트의 BLAST 페이지를 통하여 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 ncbi 웹사이트의 BLAST help 페이지에서 확인할 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질에 대한 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR, 경쇄 CDR, 중쇄 가변영역, 경쇄 가변영역, 중쇄, 또는 경쇄를 이루는 폴리펩티드와 이를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서의 첨부된 서열목록에 수록되어 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
선택적으로, 상기 벡터는 리포터 분자(예: 루시퍼라아제 및 -글루쿠로니다아제)를 코딩하는 유전자를 추가적으로 운반할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 발현 벡터는 상기 항-SARS-CoV-2 S 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자가 삽입된 벡터로서, 상기 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있고 숙주세포에서 RNA 분자를 형성시키는 프로모터 및 숙주세포에서 작용하여 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 폴리 A 시그널 서열을 포함하는 숙주세포 발현용 재조합 벡터이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 재조합 벡터로 형질전환 된, 분리된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 이스트(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된”은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된”, "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명에서 숙주세포 내로 주입된 재조합 벡터는 숙주 세포 내에서 재조합된 상기의 항체 또는 폴리펩타이드 복합체를 발현할 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 항체 또는 폴리펩타이드 복합체를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
상기 배양은 통상적으로 진탕 배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 10 내지 40℃의 범위에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 재조합 벡터의 유지 및 발현을 위해 암피실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜, 카나마이신 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다. 유도(induction) 가능한 프로모터를 갖는 재조합 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 경우 필요하다면 배지에 적합한 유도제(inducer)를 첨가할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터가 lac 프로모터를 함유하는 경우 IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하고, trp 프로모터를 포함하는 경우 인돌아크릴산(indoleacrylic acid)을 배지에 첨가할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 i) 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 ii) 추가적인 폴리펩타이드가 연결된 폴리펩타이드 복합체를 제공한다.
상기 ii) 추가적인 폴리펩타이드는 상술한 항체 또는 항원 결합 단편이거나, 항체 또는 항원 결합 단편이 아닌 "타겟 결합 폴리펩타이드"혹은 "타겟의 폴리펩타이드"이다.
본 발명의 폴리펩타이드 복합체를 구성하는 ii) 추가적인 폴리펩타이드로서의 항체 또는 항원 결합 단편, 및 상기 타겟 결합 폴리펩타이드 혹은 타겟의 폴리펩타이드는 상기 i) 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 동일 또는 상이한 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 i) 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 ii)의 추가적인 폴리펩타이드와 동일한 항원을 타겟하는 경우 서로 상이한 에피토프(epitope)를 갖는 것이 바람직하다.
본 명세서에서, 용어 "타겟 결합 폴리펩타이드(target binding polypeptide)"는 항체와 같이 타겟 항원 또는 합텐에 대한 결합 친화성을 가지나, 항체와는 구조적으로 관련성이 없는 비면역글로불린 폴리펩타이드 분자를 말한다. 상기 타겟 결합 폴리펩타이드는 항체 유사 분자(antibody-like molecule) 또는 항체유사체(antibody mimetics)라고도 불리며, 약 150 kDa의 분자량을 가지는 항체와는 달리 일반적으로는 3-20 kDa의 분자량을 가진다. 상기 타겟 결합 폴리펩타이드는 상기한 단백질 A(protein A)의 Z-도메인에서 유래한 어피바디, 감마-B 크리스탈린 또는 유비퀴틴에서 유래한 어필린(Affilin), 시스타틴(cystatin)에서 유래한 어피머(Affimer), Sulfolobus acidocaldarius의 Sac7d로부터 유래한 어피틴(Affitin), 트리플 헬릭스 코일드 코일로부터 유래한 알파바디(Alphabody), 리포칼린(lipocalin)으로부터 유래한 안티칼린(Anticalin), 세포막 수용체의 도메인으로부터 유래한 아비머(Avimer), 안키린 반복 모티프(ankyrin repeat motif)로부터 유래한 DARPin, Fyn의 SH3 도메인으로부터 유래한 피노머(Fynomer), 프로테아제 억제제(protease inhibitor)의 쿠니츠 도메인으로부터 유래한 쿠니츠 도메인 펩타이드(Kunits domain peptide), 피브로넥틴의 10번째 타입 3 도메인(10th type III domain of fibronectin)으로부터 유래한 모노바디(Monobody), Clostridium perfringens의 NagH의 탄수화물 결합 모듈 32-2(carbohydrate binding module 32-2)로부터 유래한 나노클램프(nanoCLAMP) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기한 타겟 결합 폴리펩타이드는 파아지 디스플레이, 리보솜 디스플레이 등 당업계에 알려진 다양한 스크리닝 방법을 통하여 임의의 타겟 항원 또는 합텐에 대한 결합친화성을 갖도록 엔지니어링 될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 타겟 결합 폴리펩타이드는 본 발명의 타겟에 해당하는 SARS-CoV-2와 결합하는 숙주세포에서 유래한 폴리펩타이드일 수 있다. 예컨대 상기 타겟 결합 폴리펩타이드가 숙주세포의 ACE2 수용체인 경우, 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 연결된 ACE2 수용체가 SARS-CoV-2와 결합하고 이를 통해 SARS-CoV-2를 중화시킴으로써, SARS-CoV-2의 숙주세포 내 침입(entry)를 예방할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "타겟의 폴리펩타이드"는 본 발명의 타겟에 해당하는 SARS-CoV-2에서 유래한 폴리펩타이드로서 SARS-CoV-2를 구성하는 다른 폴리펩타이드와 결합하는 폴리펩타이드를 의미한다. 이러한 타겟의 폴리펩타이드는 SARS-CoV-2를 구성하는 다른 폴리펩타이드와 결합하고, 이를 통해 SARS-CoV-2의 숙주세포 내 침입을 예방할 수 있다. 상기 타겟의 폴리펩타이드는 SARS-CoV-2가 숙주세포 내 침입시 사용하는 폴리펩타이드일 수 있고, 구체적으로는 Spike 단백질을 구성하는 폴리펩타이드일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 양태에 따른 상기 폴리펩타이드 복합체는 각각의 항체 또는 항원 결합 단편 및 폴리펩타이드의 단량체가 연결된 다량체 형태이다. 상기 본 발명의 폴리펩타이드 복합체는 서로 공유결합으로 연결되며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 폴리펩타이드 복합체는 융합 단백질(fused protein) 또는 컨쥬게이트의 형태로 구현될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드 복합체는 융합 단백질(fused protein) 또는 컨쥬게이트의 형태로 구현될 수 있다. 따라서 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 화학적 컨쥬게이션(유기 화학 방법으로 알려진) 또는 다른 수단(예를 들어, 복합체를 융합 단백질로서 발현하거나, 직접적으로 또는 링커(예컨대, 아미노산 링커))을 통하여 간접적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 폴리펩타이드 복합체를 이루는 각 폴리펩타이드 단량체는 적어도 하나의 링커로 연결된다. 이 경우 상기 링커는 일반식 (GnSm)p 또는 (SmGn)p로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다:
여기에서 상기 n, m 및 p는 독립적으로,
n은 1 내지 7의 정수이고;
m은 0 내지 7의 정수이며;
n과 m의 합은 8이하의 정수이고; 및
p는 1 내지 7의 정수이다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 따르면, 상기 링커는 n = 1 내지 5이고, m = 0 내지 5이다. 보다 구체적인 구현예의 경우, n = 4이고, m = 1이다. 보다 더 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 (GGGGS)3 이다. 또 다른 구현예의 경우, 상기 링커는 GGGGS이다. 또 다른 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 VDGS이다. 또 다른 구체적인 구현예의 경우, 상기 링커는 ASGS이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리펩타이드 복합체는 타겟이 2 이상인, 다중 항체일 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 폴리펩타이드 복합체는 하기 (i) 내지 (v) 중 선택되는 2 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다:
(i) 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3의 경쇄가변영역을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
(ii) 서열번호 10의 CDR-H1, 서열번호 11의 CDR-H2, 및 서열번호 12의 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 13의 CDR-L1, 서열번호 14의 CDR-L2, 및 서열번호 15의 CDR-L3의 경쇄가변영역을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
(iii) 서열번호 19의 CDR-H1, 서열번호 20의 CDR-H2, 및 서열번호 21의 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 22의 CDR-L1, 서열번호 23의 CDR-L2, 및 서열번호 24의 CDR-L3의 경쇄가변영역을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편;
(iv) 서열번호 28의 CDR-H1, 서열번호 29의 CDR-H2, 및 서열번호 30의 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 31의 CDR-L1, 서열번호 32의 CDR-L2, 및 서열번호 33의 CDR-L3의 경쇄가변영역을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및
(v) 서열번호 37의 CDR-H1, 서열번호 38의 CDR-H2, 및 서열번호 39의 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 40의 CDR-L1, 서열번호 41의 CDR-L2, 및 서열번호 42의 CDR-L3의 경쇄가변영역을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 (i) 내지 (v) 중 선택되는 2 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 폴리펩타이드 복합체는 (i) 내지 (v) 중 선택되는 2 이상의 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 아미노산 링커에 의해 융합단백질로 제조되거나, 화학적 컨쥬게이션에 의해 컨쥬게이트 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 폴리펩타이드 복합체를 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 일 양태에 따른 상기 핵산 분자는 상술한 본 발명의 일 양태에 따른 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자와 관련하여 공통된 내용은 모두 동일하게 적용되며, 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 감염증을 일으키는 SARS-CoV-2는 이의 S 단백질에 돌연변이가 발생한 변이바이러스이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 변이바이러스는 S 단백질의 RBD 영역에 돌연변이가 발생한 변이 바이러스이다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 S 단백질의 RBD 영역에 돌연변이가 발생한 변이 바이러스는 RBD의 431번째 아미노산 위치에서 V431A 변이, 342번째 아미노산 위치에서 F342L 변이, 367번째 아미노산 위치에서 V367F 변이, 408번째 아미노산 위치에서 R408I 변이, 435번째 아미노산 위치에서 A435S 변이, 436번째 아미노산 위치에서 W436R 변이, 476번째 아미노산 위치에서 G476S 변이, 483번째 아미노산 위치에서 V483A 변이, 354번째 및 364번째 아미노산 위치에서 N354D/D364Y 변이가 발생한 변이 바이러스이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV 감염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 상술한 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2 뿐만 아니라 SARS-CoV의 S 단백질에도 특이적으로 결합하는 바, SARS-CoV 감염증의 예방 또는 치료용도로도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 흉골내 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 질환을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 명세서에서 용어 “예방”은 질환 또는 질환 상태의 방지 또는 보호적인 치료를 의미한다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 질환상태의 감소, 억제, 진정 또는 근절을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 i) 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 ii) 추가적인 폴리펩타이드가 연결된 폴리펩타이드 복합체; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 폴리펩타이드 복합체를 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 검출용 조성물, 또는 SARS-CoV-2 감염증(COVID-19) 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 검출용 조성물, 또는 SARS-CoV-2 감염증(COVID-19) 진단용 조성물을 제공한다. 상술한 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2 뿐만 아니라 SARS-CoV의 S 단백질에도 특이적으로 결합하는 바, SARS-CoV 감염증의 예방 또는 치료용도로도 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 검출용 조성물 또는 진단용 조성물은 상술한 본 발명의 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 구성성분으로 포함하고, 본 발명의 약제학적 조성물과 동일한 바이러스를 검출하거나, 동일한 질병을 진단하는 바, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 SARS-CoV-2 바이러스 검출용 조성물, 또는 SARS-CoV-2 감염증(COVID-19) 진단용 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 검출용 키트, 또는 SARS-CoV-2 감염증(COVID-19) 감염증 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 SARS-CoV 바이러스 검출용 조성물, 또는 SARS-CoV 감염증 진단용 조성물을 포함하는 SARS-CoV 바이러스 검출용 키트, 또는 SARS-CoV 감염증 진단용 키트를 제공한다.
상술한 조성물 또는 키트는 본 발명의 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 SARS-CoV-2 S 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다.
본 발명이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차 항체로서의 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 구체적으로는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차 항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 SARS-CoV-2 S에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
상기 포획항체 및 검출항체로는 본 발명의 항-SARS-CoV-2 단백질 S 항체 또는 항원 결합 단편의 클론 중 서로 다른 에피토프에 결합하는 2종의 항체 또는 항원 결합 단편을 이용할 수 있다.
본 발명의 키트에 적용될 수 있는 시료는 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 인 비보 또는 인 비트로 이미징에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블이 결합된 결합체를 포함하는 이미지용 조성물을 제공한다.
상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe3O4,γ-Fe2O3, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, 11C, 15O, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198Tl, 200Tl, 205Bi 및 206Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2의 숙주세포 내 침투에 중요한 역할을 수행하는 S 단백질에 특이적으로 결합하여 SARS-CoV-2의 감염을 억제할 수 있으므로, COVID-19의 치료제로서 유용하게 사용될 수 있으며, COVID-19의 진단제제 및 진단키트로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2의 스파이크를 구성하는 단백질인 S1, S2, RBD 단백질의 구성을 나타낸 도이다.
도 2는 구입한 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 S1, S2, 및 RBD 단백질 항원의 SDS-PAGE 분석 결과이다.
도 3은 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 항원 특이적 인간항체 선별을 위하여 RBD에 결합하는 scFv와 phage ELISA 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 SARS-CoV-2 RBD 특이적 IgG 항체의 대량 생산 및 최종 정제 후 수율을 비교 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 선별된 SARS-CoV-2 RBD 특이적 IgG항체 5종의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 ELISA를 이용한 5종 SARS-CoV-2 RBD 특이적 IgG선별항체의 SARS-CoV-2 3종 항원 (RBD, Spike, S1)에 대한 반응성 분석결과를 나타낸 도이다.
도 7은 ELISA를 이용한 SARS-CoV-2 와 SARS-CoV 바이러스의 RBD 항원에 대한 5종 SARS-CoV-2 RBD 특이적 IgG 선별항체의 교차 반응성 분석결과를 나타낸 도이다.
도 8은 SARS-CoV-2 S1항원에 대한 5종의 SARS-CoV-2 RBD 특이적 IgG선별항체의 친화도 분석결과를 나타낸 도이다.
도 9은 SARS-CoV-2 RBD항원에 대한 5종의 SARS-CoV-2 RBD 특이적 IgG 선별항체의 친화도 분석결과를 나타낸 도이다.
도 10는 구입한 SARS-CoV-2의 9종 RBD 변이체 항원들의 분자량 및 순도 확인을 위한 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸 도이다.
도 11은 SARS-CoV-2의 9종 RBD 변이체와 5종 SARS-CoV-2 RBD 특이적 선별항체의 반응성 분석결과를 나타낸 도이다.
도 12은 hACE2와 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 직접결합(direct interaction) 분석법의 모식도를 나타낸 것이다.
도 13는 hACE2의 농도에 따른 SARS-CoV-2 RBD 단백질과의 직접결합 (direct interaction) 측정값 변화를 나타낸 도이다.
도 14은 항체에 의한 hACE2 와 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 직접결합(direct interaction) 억제능 분석 모식도를 나타낸 것이다.
도 15는 5종의 IgG 선별항체에 의한 hACE2 와 SARS-CoV-2 RBD 단백질 간의 직접결합 (direct interaction) 억제능 및 IC50 측정 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1. 항체선별을 위한 SARS-CoV-2 단백질 항원 준비
본 발명자들은 SARS-CoV-2에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하기 위하여 SARS-CoV-2의 스파이크 전장단백질 및 이를 구성하는 단백질인 S1, RBD 단백질 항원을 Sino Biological 사에서 구입하였다. 스파이크 단백질의 S1 및 RBD 단백질의 구성은 도 1에 나타내었다. 구입한 단백질의 순도 및 분자량을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다(도 2).
도 2에 나타낸 바와 같이, 구입한 스파이크 단백질의 S1, S2, 및 RBD 단백질 항원은 순도가 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 파지디스플레이 기법을 활용한 SARS-CoV-2 바이러스의 RBD 항원 특이적 인간항체 선별
확보한 일정량의 SARS-CoV-2 RBD 항원을 epoxy-conjugated Dynabead (Invitrogen, USA)에 conjugation 후, phage display 기법을 이용하여 RBD에 특이적인 인간항체 선별을 진행하였다. 5차에 걸친 bio-panning을 진행한 뒤, titration을 통하여 결합 항체 clone들의 차수 별 titer 및 enrichment 정도를 확인하였다. 이후, individual phage ELISA를 통해 RBD 항원에 반응성이 우수하고 해당 항원 특이적인 인간항체 clone을 선별하고, miniprep을 통해 DNA를 확보 후 염기서열분석을 통해 CDR 서열이 다른 10종의 RBD 특이적 인간항체를 확보하였다. phage ELISA 결과는 도 3에 나타내었다.
실시예 3: 선별 항체의 IgG 전환, 생산 및 정제
3-1. SARS-CoV-2 RBD 항원 특이적 scFv 항체의 IgG(IgG 4 type)로의 전환
선별된 RBD 도메인 특이적 10종 scFv 항체의 heavy chain과 light chain을 각각 PCR을 통해 insert DNA를 확보한 후, IgG 항체 생산용 bicistronic full-IgG (IgG4 type) 제작 vector로 subcloning을 진행하였다. 각각의 10종 scFv의 재조합 DNA는 Maxi-prep kit를 이용하여 Expi293 cell에서 IgG 항체 생산을 위한 고순도의 DNA를 다량 확보하였다. DNA의 순도는 nanodrop을 이용하여 확인하였다.
3-2. RBD 특이적 IgG (IgG4) 항체 대량 생산
Expi293 system (Invitrogen)을 이용한 임시 발현법을 이용하여 1 L 이상의 Expi293 cell에 10종의 IgG 항체를 Expifectamine을 이용하여 transfection 한 후, 7일간 배양을 진행하였다. 항체의 정제를 위해 배양액을 원심분리 후, 침전된 세포 펠렛을 제거하고 배양액(media)를 최종 획득하였다.
3-3. 항체의 정제 및 생산성 분석
선별항체의 정제는 protein A sepharose bead를 이용한 affinity column chromatography를 이용하여 정제하였다. 또한, 본 발명의 RBD 특이적 IgG 항체의 대량 생산 및 최종 정제 후 수율을 비교 분석한 결과를 도 4에 나타내었다.
본 발명의 RBD 특이적인 10종 항체의 생산성을 분석한 결과, 5종의 항체 RB4, RB6, RD3, RD10, RG6 가 50 mg/L 이상의 높은 수율을 보였으며, 특히 RD3, RD10, RG6 클론의 경우는 150 mg/L 이상의 높은 생산성을 보이는 클론임을 최종 확인하였다(도 4).
실시예 4: 선별항체의 물리/화학적 특성 분석
4-1. 선별항체의 순도 및 분자량 분석
본 발명자들은 선별된 SARS-CoV-2 RBD 특이적 5종 항체를 동량으로 polyacrylamide gel에 로딩 후, SDS-PAGE를 진행하고 Coomassie Brilliant Blue staining을 통해 5종 항체 모두 최종적으로 95% 이상의 순도를 갖는 것을 확인하였으며, 분자량 크기 또한 항체의 heavy chain과 light chain을 각각 50 kDa, 25 kDa임을 확인하였다(도 5).
4-2. 선별항체의 SARS-CoV-2 RBD, S1 도메인 및 full-length spike 항원에 대한 반응성 확인
본 발명자들은 선별된 5종 SARS-CoV-2 RBD 특이적 선별항체의 SARS-CoV-2의 RBD, S1 도메인 및 full-length spike 단백질 항원에 대한 반응성을 확인하기 위하여 각각의 0.1 μg의 항원을 96-well high binding plate (Corning, USA)에 코팅을 한 후, 각 항체에 대한 ELISA를 진행하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 선별된 5종 항체 모두 SARS-CoV-2 Spike, S1, 및 RBD 항원에 대한 반응성이 우수함을 확인하였다.
4-3. 선별항체의 SARS-CoV-2 및 SARS-CoV RBD 항원에 대한 교차반응성 확인
본 발명자들은 선별된 5종 SARS-CoV-2 특이적 선별항체의 SARS-CoV-2 RBD 뿐 아니라 SARS-CoV RBD 항원에 대한 반응성을 확인하기 위하여 구입한 SARS-CoV-2 와 SARS-CoV RBD 항원 0.1 μg을96-well high binding plate (Corning, USA)에 코팅을 한 후, 각 항체에 대한 ELISA를 진행하였다. 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 선별된 5종항체 모두 SARS-CoV RBD 항원에 대해서도 반응성이 있음을 확인하였다.
4-4. 선별항체의 RBD 및 S1 항원에 대한 친화도(Kd value) 측정
본 발명자들은 상기 5종 선별항체의 SARS-CoV-2 RBD와 S1에 대한 Kd 값을 측정하기 위해, 구입한 SARS-CoV-2 RBD와 S1을 각각 96-well high binding plate (Corning, USA)에 결합시킨 뒤, 선별항체의 농도를 증가시키면서 흡광도 (450 nm)를 측정함으로써 친화도 (Kd값)을 계산하였다. 결과는 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8은 SARS-CoV-2 S1항원에 대한 5종의 RBD 특이적 선별항체의 친화도 분석결과를 나타낸 도이다. 도 9는 SARS-CoV-2 RBD항원에 대한 5종의 RBD 특이적 선별항체의 친화도 분석결과를 나타낸 도이다.
도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, S1 항원에 대한 Kd값은 RB4, RG6, RD3, RD10, RB6 순으로 낮은 Kd값을 확인하였고, RBD 항원에 대한 Kd값은 RB4, RD3, RG6, RD10, RB6 순으로 낮은 Kd값을 확인하였다. 5종 선별항체 중에서 S1항원에 대해 RB4, RD3, RD10, RG6 4종의 항체가 10-10 M농도의 Kd value 값으로, RBD 항원에 대해 모든 5종항체가10-10 M농도의 Kd value 값으로 확인하였고, 선별 항체가 각 항원에 대한 높은 친화도를 가지는 것을 최종적으로 확인하였다.
4-5. 선별항체의 9종 RBD mutants에 대한 반응성 분석
또한, 본 발명자들은 SARS-CoV-2 와 관련하여, 전 세계적으로 국가별로 분류된 대표적 RBD 변이체 9종 (V431A, F342L, V367F, R408I, A435S, W436R, G476S, V483A, N354D/D364Y)에 대한 항원을 Sino Biological 사에서 구입하여 확보하였다. 그 후, 각 항원의 순도 및 분자량 크기를 SDS-PAGE를 통해 확인하였고, 그 결과, 약 30 kDa 정도의 RBD 변이체의 크기 확인 및 90% 이상의 순도를 최종 확인하였다 (도 10).
또한, 각 5종 선별항체의 SARS-CoV-2 RBD 변이체 9종 항원에 대한 반응성을 확인하기 위해 ELISA를 진행하였다. 그 결과, 5종의 모든 RBD 특이적 선별항체가 9종의 RBD 변이체 단백질 항원에도 결합하는 것을 확인할 수 있었다 (도 11).
실시예 5: hACE2와 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 직접결합(direct interaction) 억제능 평가 (선도 물질 도출을 위한 기능분석)
5-1. Direct interaction assay 기반기술 확립
본 발명자들은 hACE2 수용체와 SARS-CoV-2 spike 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용을 억제하는 항체의 중화능 분석을 위해, 정제된 단백질을 이용한 ELISA를 수행하였다. 이를 위해 BPS Bioscience에서 공급하는 Spike RBD(SARS-CoV-2):ACE2 inhibitor screening assay kit 분석법(Cat. No. 79931)을 활용하여 중화능을 분석하였다.
간략히 설명하면, SARS-CoV-2 RBD 단백질 (Fc-tagged)을 assay kit에 제공된 96-웰 플레이트에 코팅하고 리간드인 human ACE2 (His-tagged; hACE2-His) 와 함께 인큐베이션 하였다. 그 후, anti-His-HRP 및 HRP substrate를 넣어주고 ELISA reader를 이용하여 chemiluminescence을 측정함으로써 RBD domian-ACE2 간의 결합능을 측정하였다. hACE2-His와 SARS-CoV-2 RBD 단백질의 직접결합(direct interaction) 분석법의 모식도를 도 12에 나타내었다. 상기 시험법의 결과는 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, hACE2-His 양이 증가함에 따라 chemiluminescence 값이 증가함을 확인함으로써, hACE2와 SARS-CoV-2 RBD의 결합이 hACE2의 농도에 따라 증가하는 것을 확인하였다. Standard curve 결과에서 maximum의 중간값인 10 nM을 향후 억제능 평가에 사용하는 hACE2-His의 농도로 결정하였다.
5-2. RBD 중화항체에 의한 ACE2-spike RBD 결합 저해 평가
확립된 direct interaction assay 방법으로 선별 항체에 의한 SARS-CoV-2 RBD와 hACE2 간의 결합 억제능을 측정하였다.
대략적인 방법을 설명하면, SARS-CoV-2 RBD 단백질(Fc-tagged)을 assay kit에 제공된 96-웰 플레이트에 코팅하고 리간드인 hACE2-His를 단독 혹은 선별항체(0.016, 0.08, 0.4, 2, 10, 50 nM)를 함께 인큐베이션 하였다. 그 후, anti-His-HRP 및 HRP substrate를 넣어주고 ELISA reader를 이용하여 chemiluminescence을 측정함으로써 항체 유무에 의한 SARS-CoV-2 RBD과 hACE2 간의 결합 억제능을 측정하였다. 본 시험법의 모식도를 도 14에 나타내었다. 결과는 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 RB4, RB6, RD3, RD10, RG6를 농도별로 넣어주었을 때, spike RBD domain-hACE2 간의 결합이 효과적으로 저해되는 것을 확인할 수 있었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, IC50의 값을 측정하였을 때, RB4는 0.8412 nM, RB6는 1.950 nM, RD3는 1.315 nM, RD10은 1.965 nM, RG6는 84.02 nM로 측정되었다. 그 중 4종의 항체 RB4, RB6, RD3, RD10이 매우 낮은 농도에서도 SARS-CoV-2 RBD 과 hACE2 간의 결합을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였다.
<110> Kookmin University Industry Academy Cooperation Foundation <120> Antibody or antigen binding fragment thereof specifically binding to S protein of SARS-CoV-2 and Uses thereof <130> PN210163 <160> 55 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RG6 HCDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Ser Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RG6 HCDR2 <400> 2 Gly Ile Tyr His Ser Asp Gly Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RG6 HCDR3 <400> 3 Phe Asp Pro Val Phe Asp Tyr 1 5 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RG6 LCDR1 <400> 4 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ala Val Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RG6 LCDR2 <400> 5 Ala Asp Ser Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RG6 LCDR3 <400> 6 Gly Ala Trp Asp Ala Ser Leu Ser 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ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatttgat 300 cctgttttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagg tggaggcggt 360 tcaggcggag gtggatccgg cggtggcgga tcgcagtctg tgctgactca gccaccctca 420 gcgtctggga cccccgggca gagggtcacc atctcttgta ctggctcttc atctaatatt 480 ggcagtaatg ctgtcaactg gtaccagcag ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc 540 tatgctgata gtaatcggcc aagcggggtc cctgaccgat tctctggctc caagtctggc 600 acctcagcct ccctggccat cagtgggctc cggtccgagg atgaggctga ttattactgt 660 ggtgcttggg atgctagcct gagtgcttat gtcttcggcg gaggcaccaa gctgacggtc 720 cta 723 <210> 47 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of RB4scFv <400> 47 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattattcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctatcata gtgatggtag taaatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagatttgat 300 cctgttttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagg tggaggcggt 360 tcaggcggag gtggatccgg cggtggcgga tcgcagtctg tgctgactca gccaccctca 420 gcgtctggga cccccgggca gagggtcacc atctcttgta gtggctcttc atctaatatt 480 ggcagtaatg ctgtctcctg gtaccagcag ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc 540 tatgataata atcatcggcc aagcggggtc cctgaccgat tctctggctc caagtctggc 600 acctcagcct ccctggccat cagtgggctc cggtccgagg atgaggctga ttattactgt 660 ggttcttggg atgatagcct gaatgcttat gtcttcggcg gaggcaccaa gctgacggtc 720 cta 723 <210> 48 <211> 738 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence of RB6 scFv <400> 48 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctcttata gtggtggtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatgtt 300 aattttgttc 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Ser Asn Lys Arg Asp Ser Thr Tyr Ala Gly 305 310 315 320 Ser Thr Cys Asn Gly Val Gly Asn Cys Tyr Ser Tyr Gly Thr Asn Gly 325 330 335 Val Gly Tyr Tyr Arg Val Val Val Ser His Ala Ala Thr Val Cys Gly 340 345 350 Lys Lys Ser Thr Asn Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Asn Asn Gly Thr 355 360 365 Gly Thr Gly Val Thr Ser Asn Lys Lys Gly Arg Asp Ala Asp Thr Thr 370 375 380 Asp Ala Val Arg Asp Thr Asp Thr Cys Ser Gly Gly Val Ser Val Thr 385 390 395 400 Gly Thr Asn Thr Ser Asn Val Ala Val Tyr Asp Val Asn Cys Thr Val 405 410 415 Val Ala His Ala Asp Thr Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn 420 425 430 Val Thr Arg Ala Gly Cys Gly Ala His Val Asn Asn Ser Tyr Cys Asp 435 440 445 Gly Ala Gly Cys Ala Ser Tyr Thr Thr Asn Ser Arg Arg Ala Arg Ser 450 455 460 Val Ala Ser Ser Ala Tyr Thr Met Ser Gly Ala Asn Ser Val Ala Tyr 465 470 475 480 Ser Asn Asn Ser Ala Thr Asn Thr Ser Val Thr Thr Val Ser Met Thr 485 490 495 Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Cys Gly Asp Ser Thr Cys Ser 500 505 510 Asn Tyr Gly Ser Cys Thr Asn Arg Ala Thr Gly Ala Val Asp Lys Asn 515 520 525 Thr Val Ala Val Lys Tyr Lys Thr Lys Asp Gly Gly Asn Ser Asp Ser 530 535 540 Lys Ser Lys Arg Ser Asp Asn Lys Val Thr Ala Asp Ala Gly Lys Tyr 545 550 555 560 Gly Asp Cys Gly Asp Ala Ala Arg Asp Cys Ala Lys Asn Gly Thr Val 565 570 575 Thr Asp Met Ala Tyr Thr Ser Ala Ala Gly Thr Thr Ser Gly Trp Thr 580 585 590 Gly Ala Gly Ala Ala Ala Met Met Ala Tyr Arg Asn Gly Gly Val Thr 595 600 605 Asn Val Tyr Asn Lys Ala Asn Asn Ser Ala Gly Lys Asp Ser Ser Ser 610 615 620 Thr Ala Ser Ala Gly Lys Asp Val Val Asn Asn Ala Ala Asn Thr Val 625 630 635 640 Lys Ser Ser Asn Gly Ala Ser Ser Val Asn Asp Ser Arg Asp Lys Val 645 650 655 Ala Val Asp Arg Thr Gly Arg Ser Thr Tyr Val Thr Arg Ala Ala Arg 660 665 670 Ala Ser Ala Asn Ala Ala Thr Lys Met Ser Cys Val Gly Ser Lys Arg 675 680 685 Val Asp Cys Gly Lys Gly Tyr His Met Ser Ser Ala His Gly Val Val 690 695 700 His Val Thr Tyr Val Ala Lys Asn Thr Thr Ala Ala Cys His Asp Gly 705 710 715 720 Lys Ala His Arg Gly Val Val Ser Asn Gly Thr His Trp Val Thr Arg 725 730 735 Asn Tyr Thr Thr Asp Asn Thr Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Gly 740 745 750 Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Asp Ser Lys Asp Lys Tyr Lys Asn His 755 760 765 Thr Ser Asp Val Asp Gly Asp Ser Gly Asn Ala Ser Val Val Asn Lys 770 775 780 Asp Arg Asn Val Ala Lys Asn Asn Ser Asp Gly Lys Tyr Tyr Lys Trp 785 790 795 800 Trp Tyr Trp Gly Ala Gly Ala Val Met Val Thr Met Cys Cys Met Thr 805 810 815 Ser Cys Cys Ser Cys Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys 820 825 830 Asp Asp Asp Ser Val Lys Gly Val Lys His Tyr Thr 835 840 <210> 55 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV S-RBD sequence <400> 55 Arg Val Val Pro Ser Gly Asp Val Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn 1 5 10 15 Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Lys Phe Pro Ser Val 20 25 30 Tyr Ala Trp Glu Arg Lys Lys Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser 35 40 45 Val Leu Tyr Asn Ser Thr Phe Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val 50 55 60 Ser Ala Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Ser Asn Val Tyr Ala Asp 65 70 75 80 Ser Phe Val Val Lys Gly Asp Asp Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln 85 90 95 Thr Gly Val Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Met 100 105 110 Gly Cys Val Leu Ala Trp Asn Thr Arg Asn Ile Asp Ala Thr Ser Thr 115 120 125 Gly Asn Tyr Asn Tyr Lys Tyr Arg Tyr Leu Arg His Gly Lys Leu Arg 130 135 140 Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Asn Val Pro Phe Ser Pro Asp Gly Lys 145 150 155 160 Pro Cys Thr Pro Pro Ala Leu Asn Cys Tyr Trp Pro Leu Asn Asp Tyr 165 170 175 Gly Phe Tyr Thr Thr Thr Gly Ile Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val 180 185 190 Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu Asn Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro 195 200 205 Lys Leu Ser Thr Asp Leu Ile Lys Asn Gln Cys Val Asn Phe 210 215 220

Claims (20)

  1. 서열번호 1의 CDR-H1, 서열번호 2의 CDR-H2, 및 서열번호 3의 CDR-H3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 4의 CDR-L1, 서열번호 5의 CDR-L2, 및 서열번호 6의 CDR-L3의 경쇄가변영역을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    서열번호 7의 중쇄가변영역 및 서열번호 8의 경쇄가변영역을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    서열번호 9의 서열을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질은 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, RBD), S1 도메인, 또는 전장 스파이크 단백질(full-length spike protein)인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 상기 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, scFv, Fab, F(ab), F(ab)2, scFv-Fc, 미니바디, 다이아바디, 트리아바디, 테트라바디, 이중항체, 다중특이적 항체, 인간항체, 인간화 항체, 키메라 항체 또는 이들의 항원 결합 단편인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2의 S 단백질의 RBD 영역에 돌연변이가 발생한 변이 바이러스에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 상기 S 단백질의 RBD 영역에 돌연변이가 발생한 변이 바이러스는 RBD의 431번째 아미노산 위치에서 V431A 변이, 342번째 아미노산 위치에서 F342L 변이, 367번째 아미노산 위치에서 V367F 변이, 408번째 아미노산 위치에서 R408I 변이, 435번째 아미노산 위치에서 A435S 변이, 436번째 아미노산 위치에서 W436R 변이, 476번째 아미노산 위치에서 G476S 변이, 483번째 아미노산 위치에서 V483A 변이, 354번째 및 364번째 아미노산 위치에서 N354D/D364Y 변이가 발생한 변이 바이러스인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2의 S 단백질 이외의 부위에 돌연변이가 발생한 변이 바이러스에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV의 S 단백질에 특이적으로 결합하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  11. 제10항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  12. 제11항의 재조합 벡터로 형질전환 된, 분리된 숙주세포.
  13. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2는 S 단백질의 RBD 영역에 돌연변이가 발생한 변이 바이러스인, SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 S 단백질의 RBD 영역에 돌연변이가 발생한 변이 바이러스는 RBD의 431번째 아미노산 위치에서 V431A 변이, 342번째 아미노산 위치에서 F342L 변이, 367번째 아미노산 위치에서 V367F 변이, 408번째 아미노산 위치에서 R408I 변이, 435번째 아미노산 위치에서 A435S 변이, 436번째 아미노산 위치에서 W436R 변이, 476번째 아미노산 위치에서 G476S 변이, 483번째 아미노산 위치에서 V483A 변이, 354번째 및 364번째 아미노산 위치에서 N354D/D364Y 변이가 발생한 변이 바이러스인, SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  16. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, SARS-CoV 감염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  17. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 검출용 조성물.
  18. 제17항의 조성물을 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 검출용 키트.
  19. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 SARS-CoV-2 S 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV 바이러스 검출용 조성물.
  20. 제19항의 조성물을 포함하는, SARS-CoV 바이러스 검출용 키트.


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