KR20210152859A

KR20210152859A - Grp94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이들의 용도

Info

Publication number: KR20210152859A
Application number: KR1020200069859A
Authority: KR
Inventors: 이석묵; 김지웅; 조예빈
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2020-06-09
Filing date: 2020-06-09
Publication date: 2021-12-16

Abstract

본 발명은 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GRP94 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 GRP94에 대한 특이성과 친화성이 매우 높고, 직결장암 세포주에 대한 성장 억제효과, 침윤 억제효과, 및 혈관 신생을 억제하는 효과가 매우 뛰어난 바, 암의 치료, 암 전이의 억제, 및 혈관 신생 억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이들의 용도{GRP94 specific antibody or antigen-binding fragment thereof and uses thereof}

본 발명은 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편 및 이들의 용도에 관한 것이다.

직결장암(Colorectal cancer, CRC)은 전세계적으로 세 번째로 가장 흔한 암이고, 암과 관련된 사망 중 네 번째 원인에 해당한다. 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU), 이리노테칸(irinotecan), 옥살리플라틴(oxaliplatin) 뿐만 아니라 FOLFOX (leucovorin, 5-FU, and oxaliplatin), FOLFIRI (leucovorin, 5-FU, and irinotecan)와 같은 이들의 병용 요법을 비롯한 많은 수의 화학요법 제제들이 직결장암의 표준 치료법으로 사용되어왔다. 그러나, 이들의 임상적 효능에도 불구하고, 이러한 화학요법 제제들은 DNA 합성을 억제하고 및/또는 미세소관(microtubule)의 구조를 파괴한다. 이에 의해, 탈모, 설사, 혈소판 감소증, 감각 이상 등의 다양한 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다.

치료적 항체는 가장 효과적인 표적 암 치료법이다. 마우스 항-CD3 단일클론 항체(OKT3)가 미국 FDA에 의해 허가받은 이후, DNA 재조합 기술의 괄목할만한 발전은 다양한 인간화 항체와 인간항체를 생산해왔다.

최근, Imclone Systems Inc.는 EGFR(epidermal growth factor receptor)을 표적화하는 재조합 마우스/인간 키메라 단일클론 항체인 세툭시맙(Cetuximab)을 처음으로 개발하여, EGFR- 및 야생형 KRAS(ki-ras2 kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)-를 발현하는 직장암 환자를 치료하고 있다. 세툭시맙은 임상 현장에서 널리 사용되고 있지만, 단일 제제로는 효과적이지 않아 FOLFIRI 또는 FOLFOX 요법으로 병용 투여되는 것이 권고된다.

Heinemann et al. 은 FOLFIRI plus cetuximab 요법은 전이성 직결장암 환자에서 1차 요법으로 선호된다고 보고하였다. 또한, 세툭시맙을 이용한 암 치료법에 있어 또 하나의 미충족 의료수요는 직결장암 환자의 일부에만 효과가 있다는 점이다. 세툭시맙은 직결장암 환자의 약 10~20%에만 효과가 있고, 나머지 환자들은 KRAS, PI3KCA (phosphoinositide-3-kinase catalytic subunit alpha), PTEN (phosphatase and tensin homolog), 및 BRAF를 포함한, EGFR 다운스트림 유전자 변이로 인해 세툭시맙 저항성을 나타낸다. 따라서, 직결장암에 있어 새로운 치료적 타겟을 발굴하고 직결장암 치료의 임상적 결과를 개선하기 위하여 새로운 치료요법을 개발하는 것은 매우 중요하다.

PCT 공개특허공보 제WO2015/023976호 (2015.02.19. 공개)

본 발명자들은 파지 디스플레이 기술을 이용하여, 인간 합성 항체 라이브러리에서 rhGRP94에 강하게 결합하는 항체들을 분리, 생산, 및 정제하여 GRP94를 표적화하는 항체 4종을 발굴하였다. 본 발명의 항-GRP94 항체들은 세포 표면의 GRP94 항원을 특이적으로 표적화하며, 세툭시맙-저항성 직결장암에서 종양의 감소, 종양 침윤, 및 혈관신생을 감소시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 GRP94 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1), 하기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 하기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1), 하기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 하기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것이다.

일반식 1

GFTFSX₆YX₈MS

일반식 2

X₁IX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉YYADSVKG

일반식 3

X₁GSX₄SNIGX₉NX

₁₁VX₁₃

일반식 4

ADX₃X₄RPS

일반식 5

X₁X₂WDX₅SLNX₉

i) 상기 일반식 1의 X₆X₈는 NY이고, 상기 일반식 2의 X₁X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉는 GYPNSGST이고, 및 상기 HCDR3는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 일반식 3의 X₁X₄X₉X₁₁X₁₃는 TSNAS이고, 상기 일반식 4의 X₃X₄는 SH이고, 상기 일반식 5의 X₁X₂X₅X₉는 GAAA임;

ii) 상기 일반식 1의 X₆X₈는 NA이고, 상기 일반식 2의 X₁X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉는 GSSSSGST이고, 및 상기 HCDR3는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 일반식 3의 X₁X₄X₉X₁₁X₁₃는 SPSTT이고, 상기 일반식 4의 X₃X₄는 SH이고, 상기 일반식 5의 X₁X₂X₅X₉는 ASDG임; 또는

iii) 상기 일반식 1의 X₆X₈는 GA이고, 상기 일반식 2의 X₁X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉는 ASHGGSSK이고, 및 상기 HCDR3는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 일반식 3의 X₁X₄X₉X₁₁X₁₃는 SSSTS이고, 상기 일반식 4의 X₃X₄는 NN이고, 상기 일반식 5의 X₁X₂X₅X₉는 ASDA임.

본 명세서에서 사용된 "X_n" 및 "X_m"은 상기 정의된 서열 i) 내지 iii)에서 위치 n 및 m의 아미노산을 표시하기 위해 사용한 것이며, 여기에서 n 및 m은 상기 서열의 N-말단으로부터 계산되는 상기 서열 내의 아미노산 위치를 표시 하는 정수이다. 예를 들어, X₃ 및 X₇은 서열의 N-말단으로부터 각각 3번째 및 7번째 위치의 아미노산을 표시한다.

본 발명의 일 양태에 따르는 구현예의 경우, 서열 i) 내의 X_n이 각각 정의된 치환가능한 아미노산 잔기들의 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 통상의 기술자라면, X_n이 치환가능한 잔기로서 나열된 아미노산 잔기들 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다는 것과, 이러한 선택이 X_m의 아미노산의 선택과는 독립적으로 이루어지며, 여기서 n과 m은 다르다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 X_n 위치에서의 나열된 가능한 잔기들 중 어떤 것이라도 다른 다양한 위치에서의 나열된 가능한 잔기들 중 다른 것과 독립적으로 조합될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "GRP94 (glucose-regulated protein 94)"는 HSP90B1 유전자에 의해 인코딩되는 샤페론 단백질로서, GP96, ERp99, 또는 엔도플라스민으로 알려져 있는 단백질이다. GRP94는 Toll-유사 수용체 및 인테그린과 같은 분비 경로에서 단백질의 폴딩에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으며, 선천성 면역과 후천성 면역을 모두 조절하는 필수적인 면역 샤페론으로 알려져 있다. GRP94는 녹내장, 다발성 골수종 및 전이성 암과 같은 질병에 있어서 치료적 타겟으로도 알려져 있다.

본 명세서에서, 용어 "항체(antibody)"는 상기 GRP94에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(kappa) 및 람다(lambda) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

본 명세서에서, 용어 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, 화학적으로 연결된 F(ab')₂ 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

본 발명에서 항체는 바람직하게는 scFv 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이고, 가장 바람직하게는 감마 1(IgG1) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파형이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 항체는 카파(kappa) 경쇄와 감마1(gamma1) 중쇄를 가지는 scFv 형태 또는 IgG1 형태이다.

본 명세서에서, 용어 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL(Vk) 및 불변 영역 도메인 CL(Ck)을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)에는 각각 3개의 CDRs이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프(epitope)에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.

본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대 이중 항체), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab' )단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL/Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:

(a) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4; 및

(b) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.

용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 항원과 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터, VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10^-6 M 이하, 바람직하게는 1 x 10^-7 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10^-8 M 이하의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 K_D는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 그러나, 인간 GRP94에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종(species)의 GRP94 분자와 같은 다른 항원에 대한 교차 반응성을 나타낼 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.

또한 본 명세서에서 용어, "인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.

본 명세서에서 용어, "키메라(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "인간화 항체"란, 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체의 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부의 경우에, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 상기 도메인에서 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린의 FR 영역의 서열을 가진다. 상기 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc region)의 적어도 일부 내지 실질적인 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc region)서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나를 포함하는 것이다:

i) 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, 및 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;

ii) 서열번호 9 내지 11의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, 및 서열번호 12 내지 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3; 또는

iii) 서열번호 17 내지 19의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, 및 서열번호 20 내지 22의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나를 포함하는 것이다:

i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;

ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는

iii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역.

본 발명의 항-GRP94 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, GRP94를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.

상기 변이체는 "실질적 유사성"을 가지는 것으로, 2개의 펩타이드 서열이 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 유사성의 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).

단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 해리 상수 K_D 값이 10^-8 M 이하이다.

본 발명의 다른 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 HCT-8, HT-29, LoVo, HCT-116, 및 Caco-2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 종양세포주를 in vitro 및 in vivo에서 증식을 억제시키는 효능을 갖는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약물과 접합체를 이루는 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate, ADC)로 제조될 수 있다. 상기 약물은 세포독성제 또는 화학치료제이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 세포독성제 또는 화학치료제는 5-플루오로우라실, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 9-아미노 캄포테신, 액티노마이신 D, 아마니틴, 아미노프테린, 안트라사이클린, 안트라마이신(AMC), 오리스타틴(모노메틸 오리스타틴 E 또는 모노메틸 오리스타틴 F), 블레오마이신, 부설판, 부티르산, 칼리케아미신, 캄포테신, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 독소루비신, 이리노테칸, 미톡산트론, 탁솔, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 이들의 유도체로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 항체-약물 접합체로 제조되는 경우, 상기 약물(payload)은 화학적 링커를 통한 공유결합에 의하여 본 발명의 GRP94 항체 또는 항원 결합 단편에 접합될 수 있다. 상기 "링커"는 결합제(예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 본원에 기술된 약물과 연쇄, 연결, 또는 결합시키는 임의의 모이어티를 지칭한다. 일반적으로, 상기 항체 접합체에 적합한 결합제 링커는, 항체의 순환 반감기를 이용하기에 충분히 안정적이며 동시에 그의 약물을 접합체의 항원-매개 내재화 후에 방출시킬 수 있는 것이다. 상기 링커는 절단가능하거나 절단불가능할 수 있다. 절단가능한 링커는 세포내 대사 예컨대 가수분해, 환원, 또는 효소 반응을 통한 절단에 의해 절단된 다음 내재화되는 링커이다. 절단불가능한 링커는 항체의 리소좀 분해를 통해 부착된 약물을 방출시킨 후 내재화되는 링커이다. 적절한 링커는 산-분해성 링커, 효소적으로 절단가능한 링커, 환원 분해성 링커, 자기-희생적 링커, 및 비-절단가능한 링커를 비제한적으로 포함한다. 적절한 링커는 또한 펩타이드, 글루코로니드, 숙신이미드-티오에터, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 단위, 히드라존, 말-카프로일 단위, 디펩타이드 단위, 발린-시트룰린 단위, 및 파라-아미노벤질(PAB) 단위이거나 이들을 포함하는 것들을 비제한적으로 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 폴리펩타이드가 연결된 복합체로 제공될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 제한되지 않으며, 예를 들어 다른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 타겟 결합 폴리펩타이드(target binding polypeptide)일 수 있다. 상기 복합체는 서로 공유결합으로 연결되며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 복합체는 융합 단백질(fused protein) 또는 컨쥬게이트의 형태로 구현될 수 있고, 항체 또는 그의 항원 결합단편과 폴리펩타이드가 직접적으로 연결되거나, 또는 링커(예컨대 아미노산 링커)를 통해 간접적으로 연결될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)의 세포외 도메인(extracellular domain)으로서 기능할 수 있다. 상기 본 발명의 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 키메라 항원 수용체의 세포외 도메인으로 사용되는 경우, 상기 키메라 항원 수용체는 (a) GRP94 항체 또는 항원 결합 단편; (b) 막관통 도메인(transmembrane domain); 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 막관통 도메인은 T-세포 수용체, CD27, CD28, CD3, 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8(CD8α), CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154의 알파, 베타 또는 제타 사슬로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질의 막관통 도메인이다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ(CD3 제타) 사슬로부터 유래된 도메인이고, 상기 세포내 신호전달 도메인은 OX40 (CD134), CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18) 및 4-1BB (CD137)로 이루어진 군으로부터 선택된 공동자극 분자(costimulatory molecule)를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 키메라 항원 수용체는 수지상 세포, 킬러 수지상 세포, 비만세포, 자연살해 세포, B 림프구, T 림프구, 대식세포 및 이들의 전구세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 효과기 세포에서 발현될 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트(alignment) 방법은 당업계에 공지되어있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 33 내지 56의 염기서열, 그의 단편 또는 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.

본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.

또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된”은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된”, "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 본 발명의 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편; 및 ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 암 치료용, 암 전이 억제용, 또는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 "혈관신생(angiogenesis)"이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정으로서, 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아 발생(embryonic development), 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며 이러한 경우에도 엄격히 조절되어 진행된다(Folkman J et al., Int. Rev . Exp . Pathol ., 16, pp207-248, 1976). 성인의 경우 혈관내피세포는 매우 느리게 자라며, 다른 종류의 세포에 비하여 상대적으로 잘 분열하지 않는다. 혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 혈관신생 촉진인자의 자극에 의하여 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다. 그러나 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있다.

병리학적 상태에서 나타나는 혈관신생에 관련된 질환으로는 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형 및 심혈관 질환인 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증이 있고, 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 황반 변성, 후수정체 섬유 증식증, 과립성 결막염 등이 있다.

관절염과 같은 만성 염증성 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환, 알츠하이머 및 비만도 혈관신생과 관련이 있으며, 암의 성장과 전이는 반드시 혈관신생에 의존한다(D'Amato RJ et al., Ophthalmology, 102(9), pp1261-1262, 1995; Arbiser JL, J. Am . Acad . Dermatol., 34(3), pp486-497, 1996; O'Brien KD et al. Circulation , 93(4), pp672-682, 1996; Hanahan D et al., Cell , 86, pp353-364, 1996).

특히 암의 경우 혈관신생은 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다. 종양은 신생혈관을 통하여 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급받으며, 또한 종양까지 침투한 신생 혈관들은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어가는 기회를 줌으로써 암세포가 전이되도록 한다(Folkman and Tyler, Cancer Invasion and metastasis, Biologic mechanisms and Therapy(S.B. Day ed.) Raven press, New York, pp94-103, 1977; Polverini PJ, Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 6(3), pp230-247, 1995). 암 환자가 사망하는 주원인은 전이이며, 현재 임상에서 사용되는 화학요법이 나 면역요법들이 암 환자의 생존율을 높이는데 기여하지 못하고 있는 것은 바로 암의 전이 때문이다.

염증성 질환의 대표적인 질환인 관절염은 자가면역 이상이 원인이지만, 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증이 혈관신생을 유도하여 연골이 파괴된다. 즉, 염증을 유도하는 사이토카인의 도움으로 활액세포와 혈관내피세포가 활액강에서 증식을 하여 혈관신생이 진행되면서 연골부에 발생하는 결합조직층인 관절 판누스를 형성하여 쿠션 역할을 하는 연골이 파괴된다(Koch AE et al., Arthritis. Rheum., 29, pp471-479, 1986; Stupack DG et al., Braz J. Med. Biol. Rcs., 32(5), pp578-581, 1999; Koch AE, Atrhritis. Rheum., 41(6), pp951-962, 1998).

해마다 전 세계적으로 수백만 명이 실명하게 되는 많은 안과질환도 혈관신생이 원인이 되고 있다(Jeffrey MI et al., J. Clin. Invest., 103, pp1231-1236, 1999). 그 대표적인 예로 노인에게 일어나는 퇴화반(macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장과 신생혈관에 의한 각막 질환과 같은 질병은 혈관신생이 원인이 되는 질병들이다(Adamis AP et al., Angiogenesis, 3, pp9-14, 1999). 그 중 당뇨병성 망막증은 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게 되는 질병이다.

붉은 반점과 인설의 피부가 특징인 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데 치유되지 않으며 고통과 기형을 수반한다. 정상인 경우 각질세포가 한달에 한번 증식하는데 비해 건선 환자는 적어도 일주일에 한번 증식한다. 이런 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어날 수밖에 없다(Folkman J, J. Invest. Dermatol., 59, pp40-48, 1972).

본 발명에서 용어 "암 전이(cancer metastasis)"는 종양 세포가 한 기관이나 부분으로부터 거리상으로 분리되어 있는 다른 곳으로 옮겨가는 것을 의미한다. 암의 전이는 in situ 종양이 기저막으로 침윤되는 단계(invasion), 기저막을 통과한 암세포가 혈관이나 림프관을 통화 순환계로 들어가는 단계(intravasation), 및 guffb 순환 후 다른 장기에서 포획되어 살아남은 암세포가 휴면 상태의 단일 세포 혹은 잠재성의 미소 전이 기간을 거쳐 혈관 형성과 함께 궁극적으로 전이군락(metastatic colonization)을 형성하는 단계에 의하여 이루어진다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 암은 고형암 또는 혈액암을 포함한다.

본 명세서 상의 용어 "고형암"은 혈액암과는 구별되는 특징을 지니고, 방광, 유방, 장, 신장, 폐, 간, 뇌, 식도, 쓸개, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선 및 피부 등의 여러 고형 장기(solid organ)에서 비정상적으로 세포가 성장하여 발생한 덩어리로 이루어진 암이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 고형암은 위암, 직장암, 결장암, 직결장암, 염증-관련 결장암, 간암, 폐암(비소세포폐암, 폐선암), 난소암, 흑색종, 췌장암, 자궁암, 고환암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 암이나, 이에 한정되는 것은 아니다(Wu et al., Adv Cancer Res . 2016;129:165-90.; Ansa-Addo et al., Curr Top Med Chem. 2016; 16(25): 2765-2778.).

본 명세서 상의 용어 "혈액암"은 혈액을 구성하는 성분에 생긴 암을 지칭하는 것으로, 혈액, 조혈기관, 림프절, 림프기관 등에 발생한 악성 종양을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 혈액암은 급성골수성 백혈병, 급성림프구성 백혈병, 만성골수성백혈병, 만성림프구성백혈병, 급성단핵구성백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 혈액암이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 투여는 정맥(intravenous) 투여, 유리체내(intravitreal) 투여, 척추강내(intrathecal) 투여, 비경구(parenteral) 투여, 피하(subcutaneous) 투여, 경피(transdermal) 투여 또는 주입(infusion)에 의한 투여이다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 암, 암의 전이, 또는 혈관신생을 치료하거나 억제하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복적 기재에 의한 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 GRP94 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.

본 발명의 진단 키트는 상술한 본 발명의 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 본 발명의 약제학적 조성물과 동일한 질환을 진단하는 바, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

상술한 키트는 항체를 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 GRP94 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다. 본 발명이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차 항체로서의 본 발명의 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 구체적으로는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차 항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 GRP94에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³²및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

본 발명의 키트에 적용될 수 있는 시료는 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 항체는 인 비보 또는 인 비트로 이미징에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블이 결합된 결합체를 포함하는 이미지용 조성물을 제공한다.

상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe₃O₄,γ-Fe₂O₃, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, ¹¹C, ¹⁵O, ¹³N, P³², S³⁵, ⁴⁴Sc, ⁴⁵Ti, ¹¹⁸I, ¹³⁶La, ¹⁹⁸Tl, ²⁰⁰Tl, ²⁰⁵Bi 및 ²⁰⁶Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 GRP94 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 GRP94에 대한 특이성과 친화성이 매우 높고, 직결장암 세포주에 대한 성장 억제효과, 침윤 억제효과, 및 혈관 신생을 억제하는 효과가 매우 뛰어난 바, 암의 치료, 암 전이의 억제, 및 혈관 신생 억제용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명자들이 Expi293 세포를 이용하여 생산한 재조합 인간 GRP94 단백질을 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명자들이 Expi293 세포에서 발현시킨 GRP94 IgG 항체를 SDS-PAGE 및 쿠마시 염색한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 GRP94 특이적 IgG를 Expi293 세포에서 발현 및 정제 후의 생산량을 나노드롭을 이용하여 측정한 도이다.
도 4는 본 발명의 GRP94 항체의 내독소 수준을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 GRP94 항체의 단백질 응집 지수를 나타낸 도이다.
도 6 및 도 7은 본 발명의 4종의 GRP94 IgG(B5, E5, 2H5, 3G7)의 평형 해리상수 (K_D) 값을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 4종의 GRP94 IgG(B5, E5, 2H5, 3G7)의 재조합 인간 GRP94, 재조합 랫트 GRP94, 재조합 몽키의 GRP94에 대한 항원에 대한 특이성을 확인한 도이다.
도 9 및 도 10은 본 발명의 4종 항체의 HUVEC 세포를 이용한 인 비트로 관 형성 시험의 결과를 세툭시맙과 비교하여 나타낸 도이다.
도 11 및 도 12는 본 발명의 4종 항체(E5, B5, 2H5, 및 3G7)의 직결장암 세포주인 HCT-8에 대한 트랜스웰 인베이전 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 13 및 도 14는 본 발명의 4종 항체(E5, B5, 2H5, 및 3G7)의 직결장암 세포주인 HCT-116에 대한 트랜스웰 인베이전 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 15 및 도 16는 본 발명의 4종 항체(E5, B5, 2H5, 및 3G7)의 직결장암 세포주인 LoVo에 대한 트랜스웰 인베이전 어세이 결과를 나타낸 도이다.
도 17 내지 도 19는 본 발명의 4종 항체(E5, B5, 2H5, 및 3G7)의 직결장암 세포주인 HCT-8, HT-29, HCT-116, LoVo의 세포 성장에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

재료 및 방법

세포 배양

인간 CRC 세포주 (HCT116, HT-29, LoVo, HCT-8, 및 Caco-2)는 한국 세포주 은행(서울, 대한민국)에서 구입하였다. HCT116, HT-29, LoVo, 및 HCT-8 세포는 10% (v/v) 우태아 혈청 (Gibco) 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco)을 첨가한 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 유지하였다. Caco-2 세포는 RPMI 1640과 동일한 첨가물로 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco)에서 유지하였다. HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells; Lonza, Allendale, NJ, USA) 세포는 endothelial growth medium-2 (EGM-2; Lonza)에서 배양하였다. 모든 세포는 가습 및 37 ℃, 5% CO₂ 대기 하에서 배양하였다. Expi293 세포는 가습 CO₂ 진탕 배양기(N-BIOTEK, S. Korea)에서 Expi293 expression medium (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 37℃ 8% CO₂ 대기 하에서 배양하였다.

형질감염 ( Transfection )

항체와 rhGRP94를 과생산하기 위하여, ExpiFectamine transfection kit (Invitrogen)를 이용하여 제조사의 지시에 따라, Expi293 세포에 GRP94 항체와 rhGRP94를 인코딩하는 pcDNA 3.1 및 pcDNA 3.4 (Invitrogen) 발현 벡터를 형질감염시켰다.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

96-웰 플레이트의 각 웰을 0.1 μg의 재조합 인간 GRP94 (recombinant human GRP94, rhGRP94)로 코팅하고, 3% (w/v) 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)을 첨가한 PBS로 37 ℃에서 2시간 동안 블로킹하고, 100 μL의 20 μg/mL 농도의 GRP94 표적 IgG를 첨가하고 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% PBS-T로 3회 세척하고, 이차 항체로 100 μL 의 5000:1로 희석한 항-인간 Fc Ab (sigma-aldrich)를 첨가하였다. 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후, 0.05% PBS-T로 3회 세척하고 100 μL의 3,30 ,5,50 -tetramethylbenzidine (1-step ultra TMB) substrate solution을 각 웰에 첨가하였다. 마지막으로 450 nm에서 마이크로플레이트 리더기(Synergy H1, BioTek)를 이용하여 광학 밀도를 측정하였다.

실시예 1: 파지 디스플레이를 이용한 rhGRP94에 결합하는 고친화성 항체의 선별(Selection of a High-Affinity Binder to rhGRP94 Using Phage Display Technology)

본 발명자들은 rhGRP94에 특이적으로 결합하는 scFv를 생산하기에 앞서, rhGRP94 단백질을 Expi293 세포에서 발현시키고 Ni-NTA 세파로즈를 이용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제된 단백질의 순도는 SDS-PAGE 및 Coomassie Brilliant Blue 염색을 통하여 예측하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들이 생산 및 정제한 rhGRP94 단백질의 순도는 상업적으로 판매되는 것과 동등하거나 더 우수한 것을 확인할 수 있었다.

이어서 본 발명자들은 인간 합성 scFv 라이브러리를 재증폭하였다. 네 번의 바이오패닝을 통하여, 높은 친화성을 가지고 rhGRP94에 결합하는 scFv를 rhGRP94가 컨쥬게이션 된 Epoxy-270 dynabead (Invitrogen)를 이용하여 선별하였다.

IgG 항체를 생산하기 위하여, 상기 선별된 scFv의 DNA 염기서열을 시퀀싱하고, 각 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 바이시스트로닉 포유류 발현 벡터인 pcDNA3.1(bicistronic mammalian expression vector pcDNA3.1)에 클로닝하였다. expi293 expression system (invirogen)을 통하여 IgG 항체(GRP94 IgG)를 발현하고 정제하였다.

Expi293 세포에서 발현시킨 GRP94 IgG 항체를 단백질 A 세파로즈를 이용한 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 정제된 항체의 순도는 SDS-PAGE 및 Coomassie Brilliant Blue 염색을 통하여 예측하였다. 또한, 나노드롭을 이용하여 항체의 최종 생산량을 확인하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들이 생산 및 정제한 GRP94 특이적 IgG 항체는 순도가 높음을 확인할 수 있었으며, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체(B5, E5, 2H5, 및 3G7)는 모두 100 mg/L 이상의 높은 생산 효율을 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 2: PTS ^TM 를 이용한 내독소 수준의 측정 ( Measurement of endotoxin levels using a PTS ^TM )

분광광도계, 리더기, 및 LAL 시약 카트리지로 구성된 Endosafe PTS^TM 를 이용하여 생산된 항체의 내독소 수준을 측정하였다. 먼저 생산된 GRP94 항체를 LAL 시약 카트리지에 넣고 (Charles River) 제조사의 지시에 따라 내독소 수준을 측정하였다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 GRP94 항체는 모두 FDA의 안전 한계 인 0.005 EU/ug 미만의 내독소 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 3: 단백질 응집 지수 (Protein Aaggregation index)

본 발명자들은 본 발명의 항체(B5, E5, 2H5, 3G7)의 생산 및 정제 후의 항체 응집성을 평가하기 위하여, 각 항체를 PBS에 첨가하고 280 nm 및 340 nm에서의 흡광도를 Nano Drop 2000 (Thermoscientific)으로 측정하였다. 단백질 응집 지수는 하기 식1에 의해 UV 흡광도로부터 계산되었다. 대조군으로는 HCl을 처리하여 응집을 유도한 GRP94 항원을 사용하였다.

식1

단백질 응집 지수(Protein aggregation index) = 100 x (Abs340/[Abs280-Abs340])

항체의 응집은 항체를 구성하는 일부 도메인의 부분적 언폴딩(unfolding) 등에 의해 발생하고, 응집핵 형성(nucleation) 및 응집핵의 성장으로 이어질 수 있어 항체 개발성(developability)에 매우 중요한 요소이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체(B5, E5, 2H5, 3G7)들은 단백질 응집 지수가 낮아 개발에 적합함을 확인하였다.

실시예 4: 항체 및 항원 상호작용의 K _D 값 측정 (K _D Value Measurement of Antibody and Antigen Interactions (ELISA))

본 발명의 4종의 GRP94 IgG(B5, E5, 2H5, 3G7)의 평형 해리상수 (K_D) 값을 측정하기 위하여, 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 ng의 rhGRP94를 코팅하고, 3% (w/v) bovine serum albumin (BSA)를 포함하는 PBS로 37 ℃에서 2시간 동안 블로킹하였다. 다음으로 본 발명의 GRP94 IgG를 각 클론 별로 0 nM 내지 500 nM의 농도 구배로 37 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이차 항체의 사용 및 광학 밀도의 측정은 상기 ELISA 방법과 동일한 방법으로 측정하였다.

96-웰 플레이트에 각각 BSA, 재조합 인간 GRP94, 재조합 랫트 GRP94, 재조합 몽키의 GRP94를 코팅하고, 이들의 각 항체(B5, E5, 2H5, 및 3G7)와의 결합 정도를 ELISA를 통해 확인하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 각 항체(B5, E5, 2H5, 및 3G7)는 인간, 랫트, 및 몽키의 재조합 GRP94 항원에 특이적으로 결합하였으며, 특히 인간과 랫트의 재조합 GRP94 항원에 매우 높은 특이성을 가지는 것을 확인하였다.

실시예 5: 인 비트로 관 형성 시험 (In Vitro Tube formation assays)

48-웰 플레이트를 150 μL의 Matrigel (Corning)로 코팅하고 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. 본 발명의 4종의 GRP94 IgG이 관형성(tube formation)에 미치는 영향을 조사하기 위하여, EGM-2에서 배양한 1x10⁵ HUVEC 세포를 마트리겔로 코팅된 플레이트에 시딩하고, 항-GRP94 IgG 유/무, 또는 세툭시맙 20 μg/mL 처리 조건에서 배양하였다. IncuCyte FLR live content imaging system (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI, USA)을 이용하여 이미지를 얻었고, 관의 가지(tube branches) 개수를 계수하여 관형성을 정량화하였다. 결과는 도 9 및 도 10에 나타내었다. 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 4종 항체는 관 형성을 억제하는 효과가 매우 우수하였다. 따라서 본 발명의 4종 항체는 혈관신생 억제제로서 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 6: 트랜스웰 인베이전 어세이 ( Transwell invasion assays)

Matrigel (0.1 mg/ml) (Corning)로 코팅한 두 개의 트랜스웰 인베이전 챔버를 HCT-8, HCT-116 또는 LoVo 세포의 인 비트로 트랜스웰 인베이전 어세이에 사용되었다. 먼저 상단 챔버에 웰 당 1x10⁵의 세포를 포함하는 200 μl의 무혈청 배지를 첨가하고, 하단 챔버에는 10% FBS를 포함하는 0.8 ml의 배지를 첨가하였다. 다음으로 37 ℃에서 24 시간 내지 48 시간 동안 인큐베이션 한 후, 상단의 멤브레인 상의 비-침윤 세포를 면봉으로 제거하였다. 이동 또는 침윤 세포는 고정한 뒤 diff quick staining Kit (sysmex)로 염색을 하였다. 세포 수는 ImageJ software로 계수하였고, 각 웰마다 4군데의 랜덤 필드를 선택하여 도립 현미경으로 촬영하였다. 각 실험은 독립적으로 2회 반복 실시하였다.

도 11 내지 도 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 4종 항체는 HCT-8, HCT-116, LoVo 와 같은 직결장암 세포주의 침윤 작용을 억제하는 효과가 있으며, 세툭시맙과 비교하여 우월한 침윤 억제 효과가 있음을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 4종 항체는 암 전이 억제제로서 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 7: 인 비트로에서 CRC 세포 성장에 미치는 영향 (In Vitro Measurement of CRC Cell Growth)

본 발명의 GRP94 IgG 가 인 비트로에서 CRC 세포의 성장에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 100 μg/Ml의 세툭시맙 또는 GRP94 IgG 포함/미포함 웰에 5x10³ 개의 HCT116, HT29, LoVo, HCT-8, 또는 Caco-2 CRC 세포를 시딩하였다. IncuCyte FLR live content imaging system (Essen Bioscience, Ann Arbor, MI, USA)을 이용하여 60 시간 동안 세포 성장을 관찰하였다.

결과는 도 17 내지 도 19에 나타내었다.

HCT-8 세포주의 경우, 3G7>세툭시맙>E5>B5>2H5의 순으로 세포성장 억제 효과를 나타내었다. HT-29 세포주의 경우, 3G7>E5>2H5>B5>세툭시맙의 순으로 세포성장 억제효과를 나타내었다. HCT-116 세포주의 경우, 3G7>E5>세툭시맙>2H5>B5의 순으로 세포성장 억제효과를 나타내었다. LoVo 세포주의 경우, 3G7>E5>2H5>B5>세툭시맙의 순으로 세포성장 억제효과를 나타내었다.

<110> Kookmin University Industry Academy Cooperation Foundation <120> GRP94 specific antibody or antigen-binding fragment thereof and uses thereof <130> PN200136 <160> 64 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR1 of GRP94 B5 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR2 of GRP94 B5 <400> 2 Gly Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR3 of GRP94 B5 <400> 3 Asp Pro Leu His Pro Ala Arg Phe Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR1 of GRP94 B5 <400> 4 Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ala Val Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR2 of GRP94 B5 <400> 5 Ala Asp Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR3 of GRP94 B5 <400> 6 Gly Ala Trp Asp Ala Ser Leu Asn Ala 1 5 <210> 7 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable of GRP94 B5 <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Leu His Pro Ala Arg Phe Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 8 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable of GRP94 B5 <400> 8 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ala Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR1 of GRP94 E5 <400> 9 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR2 of GRP94 E5 <400> 10 Gly Ile Ser Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR3 of GRP94 E5 <400> 11 Asp Arg His Pro Phe Ser Pro Asn Trp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 12 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR1 of GRP94 E5 <400> 12 Ser Gly Ser Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Thr 1 5 10 <210> 13 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR2 of GRP94 E5 <400> 13 Ala Asp Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR3 of GRP94 E5 <400> 14 Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 15 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable of GRP94 E5 <400> 15 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg His Pro Phe Ser Pro Asn Trp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable of GRP94 E5 <400> 16 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Pro Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR1 of GRP94 2H5 <400> 17 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR2 of GRP94 2H5 <400> 18 Ala Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR3 of GRP94 2H5 <400> 19 Asp Leu Leu Ser Pro Leu Gln Ser Ile Gly Ser Tyr Asp Asp Ala Met 1 5 10 15 Asp Val <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR1 of GRP94 2H5 <400> 20 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR2 of GRP94 2H5 <400> 21 Ala Asp Asn Asn Arg Pro Ser 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR3 of GRP94 2H5 <400> 22 Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Asn Ala 1 5 <210> 23 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable of GRP94 2H5 <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser His Gly Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Leu Leu Ser Pro Leu Gln Ser Ile Gly Ser Tyr Asp Asp 100 105 110 Ala Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 24 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable of GRP94 2H5 <400> 24 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asp Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR1 of GRP94 3G7 <400> 25 Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ser Met Ser 1 5 10 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR2 of GRP94 3G7 <400> 26 Gly Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of HCDR3 of GRP94 3G7 <400> 27 Asn Leu Ala Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR1 of GRP94 3G7 <400> 28 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Ser Val Asn 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR2 of GRP94 3G7 <400> 29 Ser Asn Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of LCDR3 of GRP94 3G7 <400> 30 Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu Ser Gly 1 5 <210> 31 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of heavy chain variable of GRP94 3G7 <400> 31 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Leu Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of light chain variable of GRP94 3G7 <400> 32 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Ser Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR1 of GRP94 B5 <400> 33 ggattcacct ttagcaatta ttatatgagc 30 <210> 34 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR2 of GRP94 B5 <400> 34 gggatctatc ctaatagtgg tagtacatat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR3 of GRP94 B5 <400> 35 gatcctcttc atccggcgcg ttttccgttc gactac 36 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR1 of GRP94 B5 <400> 36 actggctctt catctaatat tggcaataat gctgtctcc 39 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR2 of GRP94 B5 <400> 37 gctgatagtc atcggccaag c 21 <210> 38 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR3 of GRP94 B5 <400> 38 ggtgcttggg atgctagcct gaatgct 27 <210> 39 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of heavy chain variable of GRP94 B5 <400> 39 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattattata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctatccta atagtggtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcct 300 cttcatccgg cgcgttttcc gttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tca 363 <210> 40 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of light chain variable of GRP94 B5 <400> 40 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc aataatgctg tctcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagtc atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatg ctagcctgaa tgcttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR1 of GRP94 E5 <400> 41 ggattcacct ttagcaatta tgctatgagc 30 <210> 42 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR2 of GRP94 E5 <400> 42 gggatctctt ctagtagtgg tagtacatat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 43 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR3 of GRP94 E5 <400> 43 gatcgtcatc cgttttcgcc taattggttc gactac 36 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR1 of GRP94 E5 <400> 44 agtggctctc catctaatat tggcagtaat actgtcacc 39 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR2 of GRP94 E5 <400> 45 gctgatagtc atcggccaag c 21 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR3 of GRP94 E5 <400> 46 gcttcttggg atgatagcct gaatggt 27 <210> 47 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of heavy chain variable of GRP94 E5 <400> 47 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcgg cctctggatt cacctttagc aattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctcttcta gtagtggtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccacc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcgt 300 catccgtttt cgcctaattg gttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tca 363 <210> 48 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of light chain variable of GRP94 E5 <400> 48 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctctccatc taatattggc agtaatactg tcacctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgatagtc atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct tcttgggatg atagcctgaa tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 49 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR1 of GRP94 2H5 <400> 49 ggattcacct ttagcggtta tgctatgagc 30 <210> 50 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR2 of GRP94 2H5 <400> 50 gcgatctctc atggtggtag tagtaaatat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 51 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR3 of GRP94 2H5 <400> 51 gatcttctta gtcctctgca gagtattggg tcttatgatg atgctatgga cgtc 54 <210> 52 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR1 of GRP94 2H5 <400> 52 agtggctctt catctaatat tggcagtaat actgtctcc 39 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR2 of GRP94 2H5 <400> 53 gctgataata atcggccaag c 21 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR3 of GRP94 2H5 <400> 54 gcttcttggg atgatagcct gaatgct 27 <210> 55 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of heavy chain variable of GRP94 2H5 <400> 55 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc ggttatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctctcatg gtggtagtag taaatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatctt 300 cttagtcctc tgcagagtat tgggtcttat gatgatgcta tggacgtctg gggccagggt 360 acactggtca ccgtgagctc a 381 <210> 56 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of light chain variable of GRP94 2H5 <400> 56 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc agtaatactg tctcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctgataata atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct tcttgggatg atagcctgaa tgcttatgtc 300 ttcggcgggg gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR1 of GRP94 3G7 <400> 57 ggattcacct ttagcaatta ttctatgagc 30 <210> 58 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR2 of GRP94 3G7 <400> 58 gggatctatt atggtagtgg taataaatat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of HCDR3 of GRP94 3G7 <400> 59 aatctggctt cgttcgacta c 21 <210> 60 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR1 of GRP94 3G7 <400> 60 agtggctctt catctaatat tggcagtaat tctgtcaac 39 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR2 of GRP94 3G7 <400> 61 tctaatagtc atcggccaag c 21 <210> 62 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of LCDR3 of GRP94 3G7 <400> 62 ggtacttggg attctagcct gagtggt 27 <210> 63 <211> 348 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of heavy chain variable of GRP94 3G7 <400> 63 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aattattcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctattatg gtagtggtaa taaatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaaatctg 300 gcttcgttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctca 348 <210> 64 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid sequence of light chain variable of GRP94 3G7 <400> 64 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc agtaattctg tcaactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tctaatagtc atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggacg aggctgatta ttactgtggt acttgggatt ctagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330

Claims

하기 일반식 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1), 하기 일반식 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2, 및 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및 하기 일반식 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1), 하기 일반식 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2, 및 하기 일반식 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 Glucose-Regulated Protein 94 (GRP94)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 있어서, 다음을 특징으로 하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
일반식 1
GFTFSX₆YX₈MS
일반식 2
X₁IX₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉YYADSVKG
일반식 3
X₁GSX₄SNIGX₉NX₁₁VX₁₃
일반식 4
ADX₃X₄RPS
일반식 5
X₁X₂WDX₅SLNX₉
i) 상기 일반식 1의 X₆X₈는 NY이고, 상기 일반식 2의 X₁X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉는 GYPNSGST이고, 및 상기 HCDR3는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 일반식 3의 X₁X₄X₉X₁₁X₁₃는 TSNAS이고, 상기 일반식 4의 X₃X₄는 SH이고, 상기 일반식 5의 X₁X₂X₅X₉는 GAAA임;
ii) 상기 일반식 1의 X₆X₈는 NA이고, 상기 일반식 2의 X₁X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉는 GSSSSGST이고, 및 상기 HCDR3는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 일반식 3의 X₁X₄X₉X₁₁X₁₃는 SPSTT이고, 상기 일반식 4의 X₃X₄는 SH이고, 상기 일반식 5의 X₁X₂X₅X₉는 ASDG임; 또는
iii) 상기 일반식 1의 X₆X₈는 GA이고, 상기 일반식 2의 X₁X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉는 ASHGGSSK이고, 및 상기 HCDR3는 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 일반식 3의 X₁X₄X₉X₁₁X₁₃는 SSSTS이고, 상기 일반식 4의 X₃X₄는 NN이고, 상기 일반식 5의 X₁X₂X₅X₉는 ASDA임.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 i) 내지 iii) 중 어느 하나를 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편:
i) 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, 및 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
ii) 서열번호 9 내지 11의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, 및 서열번호 12 내지 14의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3; 또는
iii) 서열번호 17 내지 19의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, 및 서열번호 20 내지 22의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 하기 i) 내지 iii) 중어느 하나를 포함하는 것인, 항체 또는 항원 결합 단편:
i) 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역;
ii) 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역; 또는
iii) 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역 및 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 해리 상수 K_D 값이 10^-8 M 이하인, 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 HCT-8, HT-29, LoVo, HCT-116, 및 Caco-2 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 종양세포주를 in vitro 및 in vivo에서 증식억제시키는 효능을 갖는, 항체 또는 항원 결합 단편.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 인코딩하는 핵산 분자.
제6항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
제7항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편; 및 ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편; 및 ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 암 전이 억제용 약제학적 조성물.
i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편; 및 ii) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 혈관신생 억제용 약제학적 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 GRP94 검출용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 GRP94 검출용 키트.