KR20220090395A - 컴퓨터를 이용해 디자인된 SARS-CoV-2 수용체결합 도메인 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편 - Google Patents

컴퓨터를 이용해 디자인된 SARS-CoV-2 수용체결합 도메인 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다. 본 발명의 항-SARS-CoV-2 S 단백질 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2의 숙주세포 내 침투에 중요한 역할을 수행하는 S 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하여 SARS-CoV-2의 감염을 억제할 수 있으므로, COVID-19의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

컴퓨터를 이용해 디자인된 SARS-CoV-2 수용체결합 도메인 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편{Computationally designed SARS-CoV-2 RBD specific antibody}
본 발명은 컴퓨터를 이용해 디자인된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
SARS-CoV-1 중화 항체 중 하나로 알려진 단일클론항체 m396은 SARS-CoV-1 스파이크 단백질(Spike protein)의 수용체결합 도메인(receptor binding domain, RBD)에 결합하며, 이를 통해 viral entry 가 저해되는 양상을 in vitro, 및 in vivo 실험을 통해 검증된 바 있다(Zhu et al., 2007). 그러나 단일클론항체 m396은 SARS-CoV-1 RBD에는 강하게 결합하지만 (KD=4.6 pM), 코로나바이러스 감염증-19 (COVID-19)을 일으키는 SARS-CoV-2의 RBD에는 결합하지 못한다 (Prabakaran et al., 2006; Lan et al., 2020). SARS-CoV-1 RBD와 SARS-CoV-2 RBD 사이에는 50개 아미노산 잔기의 차이가 있으며, 그 중 m396의 에피토프(epitope)는 SARS-CoV-2 RBD와 21개의 아미노산 잔기 중 7개의 잔기에 차이가 있다(Lan et al., 2020).
Prabakaran et al., J Biol Chem.;281(23):15829-36. 2006; Zhu et al., Proc Natl Acad Sci USA.;104(29):12123-8. 2007; Lan et al., Nature volume 581, pages215-220(2020)
본 발명자들은 COVID-19의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, SARS-CoV-2 spike RBD와 항체의 복합체의 결정구조로부터 우수한 결합력을 나타낼 것으로 예측되는 항체의 아미노산 서열을 도출하고 이를 단백질로 발현, 정제한 후 결합력(KD)을 측정한 결과, 우수한 결합친화도를 나타내는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 COVID-19의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 항-SARS-CoV-2 S 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 SARS-CoV-2 S 단백질의 수용체 결합도메인(receptor binding domain, RBD)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "항체(antibody)"는 상기 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 대한 특이 항체로서, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(kappa) 및 람다(lambda) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).
본 명세서에서, 용어 "항원 결합 단편"은 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, 화학적으로 연결된 F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 다이설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 또는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서 항체는 바람직하게는 scFv 형태이거나 완전한 항체 형태이다. 또한, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 또는 엡실론(ε) 중의 어느 한 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 불변영역은 감마1(IgG1), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이고, 가장 바람직하게는 감마 1(IgG1) 이소타입이다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 형일 수 있으며, 바람직하게는 카파형이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 항체는 카파(kappa) 경쇄와 감마1(γ1) 중쇄를 가지는 scFv 형태 또는 IgG1 형태이다.
본 명세서에서, 용어 "중쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3를 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한 본 명세서에서 용어 "경쇄"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL(Vk) 및 불변 영역 도메인 CL(Ck)을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)). 중쇄(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3) 및 경쇄(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)에는 각각 3개의 CDRs이 포함되어 있다. CDR은 항체가 항원 또는 에피토프(epitope)에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공한다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다중특이적 항체(예컨대 이중 항체), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab' )단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 그리고 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "프레임 워크(Framework)" 또는 "FR"은 초가변 영역 (hypervariable region, HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 나타낸다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4 개의 FR 도메인 FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL/Vk)에서 다음의 순서로 나타난다:
(a) FRH1(Framework region 1 of Heavy chain)-CDRH1 (complementarity determining region 1 of Heavy chain)-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4; 및
(b) FRL1(Framework region 1 of Light chain)-CDRL1(complementarity determining region 1 of Light chain)-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4.
용어 "가변 영역(variable region)" 또는 "가변 도메인(variable domain)"은 항체를 항원에 결합시키는 것과 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 의미한다. Native 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4 개의 보존된 프레임워크 영역 (framework regions, FR) 및 3 개의 초가변 영역 (hypervariable regions, HVR)을 포함한다. (Kindt et al., Kuby Immunology, 제 6 판, W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정 항원에 결합하는 항체는, 항원과 결합하여 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하는 항체로부터, VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질 RBD 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 Fab 또는 scFv이다. 본 발명의 구체적인 구현예에서, 상기 항체의 항원 결합 단편이 scFv인 경우, 상기 scFv에 포함되는 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 (Gly-Ser)n, (Gly2-Ser)n, (Gly3-Ser)n 또는 (Gly4-Ser)n 등의 링커에 의해 연결된다. 여기서 n은 1 내지 6의 정수이고, 구체적으로는 3 내지 4이나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 scFv의 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역은 예를 들어 다음의 배향으로 존재할 수 있다: 경쇄가변영역-링커-중쇄가변영역 또는 중쇄가변영역-링커-경쇄가변영역.
본 명세서에서, 용어 "특이적으로 결합한다" 또는 이와 같은 것은, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 scFv와 같은 다른 구성물이 생리적 조건 하에서 비교적 안정한 항원과 복합체를 형성한다는 것을 의미한다. 특이적 결합은 적어도 약 1 x 10-6 M 이하, 바람직하게는 1 x 10-7 M 이하, 보다 바람직하게는 1 x 10-8 M 이하의 평형 해리 상수 (예를 들어, 이보다 작은 KD는 보다 단단한 결합을 나타냄)로 특성화될 수 있다. 2 개의 분자가 특이적으로 결합하는지 여부를 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "친화도(Affinity)"는 분자(예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호 작용의 총합의 강도를 의미한다. 달리 명시하지 않는 한, 본원에 사용된 바와 같이, "결합 친화력(binding affinity)"은 결합 쌍 (예를 들어, 항체 및 항원)의 구성원 간의 1:1 상호 작용을 반영하는 내인성(intrinsic) 결합 친화력을 나타낸다. 분자 Y와 그의 파트너 Y의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기술된 것들을 포함하여 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
또한 본 명세서에서 용어, "인간 항체(human antibody)"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성된 항체, 또는 인간 항체 레퍼토리(repertoires) 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 이용하는 비인간 근원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화(humanized) 항체를 배제한다.
본 명세서에서 용어, "키메라(chimeric)" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 근원(source) 또는 종(species)으로부터 유래되고, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 상이한 근원 또는 종에서 유래한 항체를 의미한다.
본 명세서에서 용어 "인간화 항체"란, 비-인간(예를 들어, 마우스) 항체의 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 그의 면역글로불린 쇄 또는 단편(예를 들어 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 상보성-결정 영역(CDR)의 잔기가, 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비-인간 종(공여자 항체), 예를 들어 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR의 잔기에 의해 대체된 인간 면역글로불린(수용자 항체)이다. 일부의 경우에, 상기 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(framework region, FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에서도 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 추가로 개선 및 최적화하기 위해 이루어진다. 일반적으로, 상기 인간화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 실질적으로 모든 가변 도메인을 포함할 것이며, 상기 도메인에서 상기 CDR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 비-인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 상기 FR 영역의 전부 또는 실질적 전부는 인간 면역글로불린의 FR 영역의 서열을 가진다. 상기 인간화 항체는 면역글로불린 불변 영역(Fc region)의 적어도 일부 내지 실질적인 인간 면역글로불린의 불변 영역(Fc region)서열을 포함한다.
본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편은, 통상의 기술자가 인지하는 바와 같이, SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD를 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다.
상기 변이체는 "실질적 유사성"을 가지는 것으로, 2개의 펩타이드 서열이 디폴트 갭 가중치를 사용하는 프로그램 GAP 또는 BESTFIT에 의해서와 같이 최적으로 정렬되는 경우에 적어도 약 90%의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R 기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환에 의해 서로 상이한 경우에, 유사성의 퍼센트 또는 정도는 치환의 보존적 성질을 보정하기 위해 상향 조절될 수 있다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 해리 상수 KD 값이 10-6 M 이하이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 약물과 접합체를 이루는 항체 약물 접합체(antibody drug conjugate, ADC)로 제조될 수 있다. 상기 약물은 세포독성제 또는 화학치료제이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 세포독성제 또는 화학치료제는 5-플루오로우라실, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 9-아미노 캄포테신, 액티노마이신 D, 아마니틴, 아미노프테린, 안트라사이클린, 안트라마이신(AMC), 오리스타틴(모노메틸 오리스타틴 E 또는 모노메틸 오리스타틴 F), 블레오마이신, 부설판, 부티르산, 칼리케아미신, 캄포테신, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 독소루비신, 이리노테칸, 미톡산트론, 탁솔, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 이들의 유도체로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편이 항체-약물 접합체로 제조되는 경우, 상기 약물(payload)은 화학적 링커를 통한 공유결합에 의하여 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편에 접합될 수 있다. 상기 "링커"는 결합제(예컨대, 항체 또는 이의 항원-결합 단편)를 본원에 기술된 약물과 연쇄, 연결, 또는 결합시키는 임의의 모이어티를 지칭한다. 일반적으로, 상기 항체 접합체에 적합한 결합제 링커는, 항체의 순환 반감기를 이용하기에 충분히 안정적이며 동시에 그의 약물을 접합체의 항원-매개 내재화 후에 방출시킬 수 있는 것이다. 상기 링커는 절단가능하거나 절단불가능할 수 있다. 절단가능한 링커는 세포내 대사 예컨대 가수분해, 환원, 또는 효소 반응을 통한 절단에 의해 절단된 다음 내재화되는 링커이다. 절단불가능한 링커는 항체의 리소좀 분해를 통해 부착된 약물을 방출시킨 후 내재화되는 링커이다. 적절한 링커는 산-분해성 링커, 효소적으로 절단가능한 링커, 환원 분해성 링커, 자기-희생적 링커, 및 비-절단가능한 링커를 비제한적으로 포함한다. 적절한 링커는 또한 펩타이드, 글루코로니드, 숙신이미드-티오에터, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 단위, 히드라존, 말-카프로일 단위, 디펩타이드 단위, 발린-시트룰린 단위, 및 파라-아미노벤질(PAB) 단위이거나 이들을 포함하는 것들을 비제한적으로 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 상술한 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편; 및 폴리펩타이드가 연결된 복합체로 제공될 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 제한되지 않으며, 예를 들어 다른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 타겟 결합 폴리펩타이드(target binding polypeptide)일 수 있다. 상기 복합체는 서로 공유결합으로 연결되며, 본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 복합체는 융합 단백질(fused protein) 또는 컨쥬게이트의 형태로 구현될 수 있고, 항체 또는 그의 항원 결합단편과 폴리펩타이드가 직접적으로 연결되거나, 또는 링커(예컨대 아미노산 링커)를 통해 간접적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 S 단백질의 수용체 결합도메인(receptor binding domain, RBD)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 다음을 포함한다:
(a) 서열번호 1의 HCDR1, 서열번호 2의 HCDR2, 및 서열번호 3의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 4의 LCDR1, 서열번호 5의 LCDR2, 및 서열번호 6의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역;
(b) 서열번호 13의 HCDR1, 서열번호 14의 HCDR2, 및 서열번호 15의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 16의 LCDR1, 서열번호 17의 LCDR2, 및 서열번호 18의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역; 또는
(c) 서열번호 23의 HCDR1, 서열번호 24의 HCDR2, 및 서열번호 25의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 26의 LCDR1, 서열번호 27의 LCDR2, 및 서열번호 28의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (a)의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 각각 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (b)의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 각각 서열번호 19 및 20의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (c)의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 각각 서열번호 29 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합단편은, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; (b) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는 (c) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2는 SARS-CoV-2 wuhan strain, SARS-CoV-2 Alpha variant (B.1.1.7), SARS-CoV-2 Beta variant (B.1.351), SARS-CoV-2 Gamma variant (P.1), SARS-CoV-2 Delta variant (B.1.617.2), SARS-CoV-2 DeltaPlus variant (AY.1), SARS-CoV-2 Kappa variant (B.1.617.1), 및 SARS-CoV-2 Lambda variant (C37)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스주이나, 이에 한정되는 것은 아니다. .
본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명은 상술한 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "핵산 분자"는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 구성하는 아미노산 서열을 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60% 이상의 상동성, 보다 구체적으로는 70% 이상의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80% 이상의 상동성, 보다 더욱더 구체적으로는 90% 이상의 상동성, 가장 구체적으로는 95% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트(alignment) 방법은 당업계에 공지되어있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)에 개시되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 21 및/또는 22의 염기서열을 포함하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 31 및/또는 32의 염기서열을 포함하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 39, 40, 41, 42, 43, 44, 또는 이들의 조합의 염기서열을 포함하는 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 경쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자 및 중쇄 가변영역을 코딩하는 핵산 분자는 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.
본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
본 발명의 재조합 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, beta-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터 엡스타인 바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 항체의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6x His(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터에 의해 발현되는 단백질이 항체이기 때문에, 정제를 위한 추가적인 서열 없이도, 발현된 항체는 단백질 A 컬럼 등을 통하여 용이하게 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.
상기 숙주세포는 상술한 재조합 벡터에 의하여 형질전환 된 것이다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵 세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포, 효모 세포(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 HEK-293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 용어 "형질전환된", "형질도입된" 또는 "형질감염된”은 외인성 핵산이 숙주세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 지칭한다. "형질전환된”, "형질도입된" 또는 "형질감염된" 세포는 외인성 핵산으로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 세포이며, 상기 세포는 당해 세포 및 그의 계대 배양으로 인한 자손 세포를 포함한다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상술한 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2 바이러스이 S 단백질의 RBD에 결합하여 바이러스를 중화시킴으로써 바이러스의 세포 내 감염을 방어한다. 따라서, 본 발명의 항-SARS-CoV-2 S 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용도로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 투여는 정맥(intravenous) 투여, 유리체내(intravitreal) 투여, 척추강내(intrathecal) 투여, 비경구(parenteral) 투여, 피하(subcutaneous) 투여, 경피(transdermal) 투여 또는 주입(infusion)에 의한 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 SARS-CoV-2 감염증을 치료하거나 예방하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 발명의 진단 키트는 상술한 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하며, 본 발명의 약제학적 조성물과 동일한 질환을 진단하는 바, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
상술한 키트는 항체를 포함하기 때문에, 기본적으로 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)에 적합하게 제작될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C14, I125, P32 및 S35)로 레이블링된 항체가 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD 단백질을 검출하는 데 이용될 수 있다. 본 발명이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 시료를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 일차 항체로서의 본 발명의 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체와 상기 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 구체적으로는 마이크로타이터 플레이트이다.
상기 이차 항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
본 발명이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 포획항체(capturing antibody)로서 SARS-CoV-2 S 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ii) 포획항체와 시료를 반응시키는 단계; (iii) 상기 단계 (ii)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이블이 결합되어 있는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (iv) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, beta-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450), 방사능물질(예컨대, C14, I125, P32 및 S35), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질(chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.
상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.
본 발명의 키트에 적용될 수 있는 시료는 세포, 조직 또는 조직-유래 추출물, 파쇄물(lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프 또는 복수를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항체는 인 비보 또는 인 비트로 이미징에 이용될 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 항체 및 상기 항체에 결합된 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블이 결합된 결합체를 포함하는 이미지용 조성물을 제공한다.
상기 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe3O4,γ-Fe2O3, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, 11C, 15O, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198Tl, 200Tl, 205Bi 및 206Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 컴퓨터를 이용해 디자인된 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 이를포함하는 약제학적 조성물 등을 제공한다.
본 발명의 SARS-CoV-2 수용체결합 도메인 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 SARS-CoV-2의 숙주세포 내 침투에 중요한 역할을 수행하는 S 단백질의 RBD에 특이적으로 결합하여 SARS-CoV-2의 감염을 억제할 수 있으므로, COVID-19의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 종래 기술인 단일클론항체 m396이 SARS-CoV-1 RBD에는 결합하나, SARS-CoV-2의 RBD에는 결합하지 못함을 나타내는 도이다.
도 2는 본 발명의 컴퓨터를 이용한 항체 디자인을 위한 도킹 모델을 나타낸 도이다. 핑크색 아미노산 잔기는 변경이 가능한 CDR 영역을 나타내고, 시안색 아미노산 잔기는 변경이 불가한 CDR 영역을 나타낸다.
도 3은 본 발명에서 디자인된 항체의 발현 및 정제 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 디자인된 항체 중 SARS-CoV-2 RBD에 높은 친화성을 나타내는 항체를 선별하기 위하여 BLI 실험을 통하여 결합 친화도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 디자인된 항체 Fab와 SARS-CoV-2 RBD와의 복합체의 결정구조가 컴퓨터를 이용하여 디자인한 복합체 구조와 일치한다는 것을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 디자인된 항체 D27의 SARS-CoV-2 RBD에 대한 파라토프와 상기 항체가 SARS-CoV-2 RBD에 결합되는 에피토프를 동정한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 디자인된 항체 D27의 CDRL-3 및 CDRH-3의 루프를 연장시키면 SARS-CoV-2 RBD에 대한 결합친화도를 개선시킬 여지가 있음을 나타낸 도이다.
도 8은 볼 발명의 Yeast clone의 선별 전후의 결합과 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 9는 도출된 D27LE 항체의 아미노산 변경 결과 및 BLI 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 본 실시예의 돌연변이에 따른 서열디자인 및 디자인 된 모델을 나타낸 도이다.
도 11은 본 실시예의 돌연변이에 따른 BLI 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 D27LEY의 아미노산 변경 결과 및 BLI 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 SARS-CoV-2 variant beta (B.1.351), gamma (P.1), delta (B.1.617.2), delta-plus (B.1.617.2.1), Epsilon (B.1.427)의 RBD의 아미노산 돌연변이 위치 및 아미노산 변화를 나타낸 도이다.
도 14 내지 도 16은 SARS-CoV-2 variant beta (B.1.351), gamma (P.1), delta (B.1.617.2), delta-plus (B.1.617.2.1), Epsilon (B.1.427), Kappa (B.1.617.1), 및 Lambda (C37)의 RBD에 대한 D27LE, D27LEY의 결합력을 BLI 실험을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다. 도 14 내지 도 16의 그래프는 위에서부터 125 nM, 62.5 nM, 31.3 nM, 15.6 nM 농도의 항체에 대한 반응을 나타낸다.
도 17은 본 발명의 항체 D27LEY의 SARS-CoV-2 WT, SARS-CoV-2 Alpha, SARS-CoV-2 Delta virus에 대한 Focus reduction neutralization test (FRNT) 결과를 나타낸 도이다.
도 18 및 도 19는 다양한 Sarbecovirus RBD의 아미노산 서열 변이와, 본 발명의 항체 D27LEY 및 종래 알려진 항체 S2X259 와의 Epitope mapping을 하여 결합 부위를 비교하여 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 항체 D27LEY의 SARS-CoV-1 RBD 및 PCoV-GD1 RBD에 대한 결합력을 각각 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
실시예 1. 컴퓨터를 이용한 항체의 디자인
1.1 컴퓨터를 이용한 항체 디자인을 위한 도킹 모델의 준비(Preparation of docked models for computational design of antibodies)
키메릭 SARS-CoV-1/SARS-CoV-2 RBD (PDB: 6VW1) (Shang et al., 2020)의 고-해상도 결정 구조 및 SARS-CoV-2 RBD (Yan et al., 2020) (PDB: 6M17)의 저-해상도 cryo-EM 구조를 얼라인하여 고해상도 버전의 SARS-CoV-2 RBD를 모델링하였다. 이 RBD 모델을 SARS-CoV-1의 RBD에 특이적으로 결합하는 항체인 m396의 Fab의 결정 구조를 겹치고, 상기 도킹 모델에서 SARS-CoV-1 RBD를 SARS-CoV-2 RBD로 치환하여 타겟 모델을 수득하였다. 유사하게, SARS-CoV-1 RBD에는 결합하나 SARS-CoV-2 RBD에는 결합하지 않는 항체 3가지를 추가로 사용하여 타겟 모델을 수득하였다 (PDB entry: 2DD8, 2GHW, 3BGF, 6NB8). 이 네 가지 도킹 모델을 Rosetta FastRelax protocol 로 정제하여 에너지의 최적화를 수행하였으며, Fab의 CDR의 서열을 디자인하는데 사용하였다.
1.2. CDR 영역 서열의 디자인
Fab들의 CDR 영역(Complementarity-determining region)은 카밧 넘버링(Kabat numbering) 방식에 기초하여 정의되었다 (Kabat et al., 1992). 보다 더 정교한 디자인을 위해 위해 RCBS PDB에 보고된 2990가지 고해상도 항체 단백질 구조들의 CDR을 분석하여 Framework region (FR)에 가까운 CDR의 각 위치에서 선호되는 아미노산 정보를 확인하여 항체 디자인에 반영하였다. 각 위치에서 1% 미만으로 사용되는 아미노산 들을 후보 아미노산에서 제외하였고, CDR에 속한 아미노산 잔기의 Cα-Cβ 벡터의 방향이 FR을 향하거나, Glycine 혹은 Proline인 경우에는 해당 위치의 아미노산 잔기는 디자인하지 않고 packing 만을 진행하였다. 디자인된 단백질들 중 solvent accessible surface area, pack score, shape complementarity에 대한 점수가 기준치 이상인 것들을 일차적으로 선별하였다. 이후 수소결합력이 있을 것으로 기대되는 아미노산의 잔기의 원자들이 정전기적으로 안정된 항체 디자인을 최종 선별하였다(도 2).
실시예 2. 항체의 생산, 정제 및 결합친화도 측정
2.1 선별된 항체의 생산 및 정제(Production and purification of designed antibodies)
먼저, kappa 형 경쇄의 CL 또는 감마 중쇄의 CH1-CH2-CH3을 인코딩하는 DNA 단편을 pCEP4 벡터 (Invitrogen)에 각각 넣고 생성된 벡터를 pCEP4 (k-light) 및 pCEP4 (heavy)로 명명하였다.
디자인된 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 가변 영역 (VH)을 인코딩하는 DNA 단편을 합성(IDT)하고 각각 pCEP4 (k-light) 및 pCEP4 (heavy) 벡터로 클로닝하고 생성 된 벡터를 NucleoBond Xtra Midi 키트 (Macherey-Nagel)를 사용하여 증폭하였다. 전장 항체 발현을 위한 55 쌍의 벡터 각각을 ExpiFectamine (Gibco)을 사용하여 ml 당 600 만 세포의 밀도로 CHO-S 세포 (Gibco)에 도입하였다. 형질감염된 세포를 ExpiCHO 발현 배지(Gibco)에서 배양하였다. 형질 감염 후 12 일에 상청액을 수집하고, 4 ℃에서 30 분 동안 4,000g에서 원심 분리한 후 0.45 μm 필터 (Millipore)를 통해 여과하고, 단백질 A 결합 완충액 (150mM NaCl, 20mM Na2HPO4, pH 7.0)을 1:1 비율로 첨가하여 희석하였다. Protein A 수지 (Sino Biological)를 포함하는 개방형 컬럼에 로딩하고 단백질 A 용출 버퍼 (0.1 M 글리신, pH 3.0)로 용리하였다. 용리액은 즉시 단백질 A 중화 완충액 (1M Tris-HCl, pH 8.5)에 의해 중화되었으며, 항체는 완충액 A (20mM Tris- HCl, 150mM NaCl, pH 7.5)로 평형화 된 HiLoad 26/60 Superdex 200 겔-여과 컬럼 (Cytiva)을 사용하여 추가로 정제되었다(도 3).
2.2 Biolayer interferometry (BLI)
Octet QKe384 시스템 (ForteBio)을 사용하여 총 55 개의 디자인된 항체에 대해 BLI 실험을 수행하여, SARS-CoV-2 RBD와의 결합 상호 작용을 추정하였다. Biotinylated SARS-CoV-2 RBD (Acrobio 시스템)를 먼저 40 초 동안 Kinetics Buffer (ForteBio)의 Streptavidin 바이오 센서 팁 (ForteBio)에 로딩한 다음 120 초 동안 결합 단계, 120 초 동안 해리 단계를 수행하였다. 결합 신호(KD)를 가장 우수하게 나타낸 항체를 D27로 명명하였다. 그 후, 4 μL의 Kinetics 버퍼에 들어있는 D27 항체(0.5, 1, 2 또는 4 μM)를 BLItz 기기 (ForteBio)를 사용하여 BLI 실행하여 SARS-CoV-2 RBD에 대한 겉보기 결합 친화도 (apparent binding affinity, KD)를 측정하였다. 결합 동역학은 BLItz pro 소프트웨어 (ForteBio)를 사용하여 분석되었다. 결과는 도 4에 나타내었다. D27 항체의 결합친화도(KD)는 175 nM 이었다.
실시예 3. RBD-항체 복합체의 3차원 구조 확인
3.1. D27 항체의 Fab의 생산 및 정제(Production and purification of the Fab of D27)
중쇄의 VH 및 CH1 (8xHis 태그 포함) 또는 경쇄의 VL 및 CL을 인코딩하는 DNA 단편을 pCEP4 벡터에 개별적으로 클로닝하였다. 발현 및 정제 절차는 단백질 A 수지 대신 HisPur 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 수지를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 2-1에서 전장 항체를 생산 및 정제하는 경우와 실질적으로 동일하였다.
3.2 결정화, 구조결정 및 구조 개선(Crystallization, structure determination and refinement)
정제된 글리코실화 RBD (319-541) (9.8 mg/ml) 및 D27 Fab (12.3 mg/ml)를 1:1.1의 몰비로 혼합하였다. 결정은 20 % (vol/vol) PEG 3350 및 200mM NH4Cl을 포함하는 용액에서 20 ℃에서 행잉-드롭 증기 확산 방법(hanging-drop vapour diffusion method)에 의해 수득되었다. 동결보호를 위해, 결정을 추가적으로 7.5%(v/v) 글리세롤을 포함하는 모액(mother liquor)에 잠시 침지하였다. 포항 가속기 연구소 빔라인 11C에서 100K에서 X 선 회절 데이터를 수집하여 HKL2000으로 처리하였다 (Otwinowski & Minor, 1997).
상(phases)들은 카파 경쇄 (PDB ID: 4MIK) 및 SARS-CoV-2 RBD (PDB ID: 7JMO)의 구조와, 검색 모델로서 중쇄 (VH, CH1)의 컴퓨터 설계 모델을 사용하여 PHENIX (Adams et al., 2009)의 분자 치환 프로토콜에 의해 결정되었다. 모델 구축 및 구조 개선은 COOT 및 PHENIX를 사용하여 수행되었다 (Adams et al., 2009; Emsley et al., 2010).
X-선 결정학 기법으로 규명한 실제 단백질 복합체의 고해상도 (2.2Å) 구조는 Rosetta suite software로 디자인된 computational model과 RBD에 대한 Cα-alignment를 통해 Root Mean Square Deviation (RMSD)를 계산하였을 때, RMSD=0.548으로 정확한 디자인이 이루어진 것을 확인하였다(도 5).
3.3. SARS-CoV-2의 RBD 상의 결합 에피토프(epitope)와 D27 항체의 CDR 상의 결합 파라토프(paratope)의 동정
또한, 상기 구조 결정 분석으로부터 SARS-CoV-2의 RBD 상의 결합 에피토프(epitope)와 D27 항체의 CDR 상의 결합 파라토프(paratope)를 동정하였다(도 6)
실시예 4. D27 항체의 결합력 향상 - CDR-H3 및 CDR-L3 상의 아미노산 삽입
상기 실시예에서 규명된 구조로부터 항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR3 상의 아미노산 치환 또는 아미노산 삽입으로 결합력을 올릴 수 있을 것으로 예측되었다(도 8).
이에, 효모 표면 디스플레이 실험을 통하여, 효모의 Aga2 단백질에 scFv 형태의 D27의 CDR-H3 및 CDR-L3 루프(loop)를 연장시키는 변이체를 도입시켜 발현한 후, FACS를 이용하여 Bio-panning을 진행하였다. 구체적으로, CDR-H3 루프의 길이 연장을 위하여
X-ray crystallography를 통해 규명한 D27-RBD의 구조를 바탕으로 D27의 heavy chain CDR3 상의 E101H -Q102H 사이에 2개 아미노산을 무작위로 삽입하고 light chain CDR3 상의 F93L-S94L 사이에 1개 아미노산을 무작위 삽입함으로써 결합력을 증대시키는 affinity maturation 전략을 이용하였다. 구체적으로는 E101H, Q102H, F93L 의 아미노산 종류를 추가로 무작위로 변경하여 총 6개의 무작위 서열을 도입하였다.
이를 위한 실험적 방법으로는 D27의 VH 와 VL 을 (Gly4Ser)4 linker로 연결하고 5'-MNN-3' random primer를 이용하여 overlapping PCR을 통해 D27-scFv-H2L1 library insert fragment를 만들었다. Overlapping PCR을 위한 프라이머 서열은 표 1에 나타내었다.
명칭 서열(Reverse primer 5' to 3') SEQ ID NO:
DAS27_LE_H2_210324_R 5'-CCCCAAACATCCATCCCGCCMNNMNNMNNMNNAGTCTCCCTCGCACAGTAATATACAGC-3' 11
DAS27_LE_L1_210324_R 5'-TACGGTCACTTTCGTTCCTGTTCCAAATACGTAATCGGAMNNMNNCAGATCGTAGACCTGGCAATAATAGTCAGC-3' 12
(단, N = 4 in all, M = A, C)효모 표면에서 발현된 scFv와 RBD와의 결합여부를 MACS 또는 FACS를 통해 선별하며 결합친화도를 측정하면 RBD와의 결합친화도가 개선된 항체를 도출할 수 있다.
이를 선형화된 pCTCON2 vector와 함께 yeast EBY100 strain에 형질전환하여 206 (~6.4 x 107)의 다양성을 갖는 yeast library를 만들었다. 해당 yeast library를 SGCAA medium에서 20시간 배양하여 yeast 표면에 scFv를 전시시키고 표적 항원인 SARS-CoV-2 RBD를 섞어주고, 강하게 결합하는 scFv 발현 yeast clone을 선별하는 과정을 진행하였다. 선별 과정은 표적 항원인 SARS-CoV-2 RBD의 농도를 낮춰가며, 2회의 magnetic-activated cell sorting (MACS) 그리고 3회의 Fluorescence-activated cell sorting (FACS)를 거쳤으며 최종적으로는 9가지 yeast clone을 확보하였고, sequencing을 통해 각 yeast clone이 전시하는 scFv의 서열을 확인하였다. 서열이 확인된 scFv 후보군을 E.coli에서 발현 및 정제하여 Biolayer interferometry (BLI) 실험을 통해 가장 높은 결합력을 가진 scFv를 선별하고 이를 D27LE로 명명하였다. 최종적으로 D27LE를 IgG1 형태로 CHO cell에서 발현 및 정제하여 SARS-CoV-2 RBD에 결합력 (K D = 7.1 nM)을 측정하였다.
Yeast clone의 선별 전후의 결합과 발현 정도를 도 8에 나타내었다.
또한, 도출된 D27LE 항체의 아미노산 변경 결과 및 BLI 결과를 도 9에 나타내었다.
실시예 5. D27LE 항체의 결합력 향상 - CDR-H3 및 CDR-L3 상의 아미노산 삽입
SARS-CoV-2 wuhan strain에 비해 전염력이 더욱 강한 SARS-CoV-2 Alpha variant (B.1.1.7)의 등장하였다. SARS-CoV-2 Alpha variant의 RBD는 D27-RBD의 epitope 중 하나인 RBD의 Asn501이 Tyr로 돌연변이화 되어있다. D27-RBD 구조를 바탕으로 N501Y mutant RBD를 모델링하고 RBD Tyr501 주변의 paratope residues (S33H, D52H, S54H, R55H)를 Ala로 치환한 후 Rosetta software를 이용하여 디자인하였다. 100개의 계산적 모델이 만들어졌으며, 이 중 RBD의 Tyr501과 상호작용이 좋아보이는 10개의 모델을 선택하였다.
RBD Tyr501 주변의 D27 paratope residues는 CDRH1, CDRH2에 속해 있기 때문에 10개의 돌연변이는 CDR3 loop의 길이를 늘려 affinity maturation을 진행한 D27LE에 도입하여 E.coli에서 scFv 형태로 발현 및 정제하였다. RBD(N501Y)에 대하여 BLI 실험을 통해 가장 강력하게 결합하는 scFv를 선별하고 이를 D27LEY로 명명하였다. 최종적으로 D27LEY를 IgG1 형태로 CHO cell에서 발현 및 정제하여 SARS-CoV-2 alpha variant의 RBD (B.1.1.7-RBD)에 대한 결합력 (K D < 0.001 nM)을 측정하였다(도 10 내지 도 12).
실시예 6. 다양한 SARS-CoV-2 variants BRB에 대한 결합력 측정
SARS-CoV-2 viral evolution에 따라 RBD에 돌연변이가 생긴 다양한 variants가 나타났으며, 그 중 beta (B.1.351), gamma (P.1), delta (B.1.617.2), delta-plus (B.1.617.2.1), Epsilon (B.1.427)의 돌연변이화된 RBD를 생산하여 D27LE 와 D27LEY의 이들에 대한 결합력을 BLI 실험을 통해 측정하였다. 그 결과는 하기 도 14 내지 도 16에 나타내었다.
실시예 7. D27LEY의 SARS-CoV-2 virus 에 대한 중화능 검증 (FRNT)
본 발명의 최종적으로 개선된 항체 D27LEY의 실제 biological function을 확인하고자, 해당 항체가 SARS-CoV-2 RBD에 결합하여 바이러스 중화능을 갖는지 확인하였다. 구체적으로, SARS-CoV-2 WT, SARS-CoV-2 Alpha, SARS-CoV-2 Delta virus에 대하여 Focus reduction neutralization test (FRNT)를 진행하였다.
결과는 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, D27LEY의 FNRT50 값은 SARS-CoV-2 WT에 대하여 8.3 nM, SARS-CoV-2 Alpha에 대하여 0.104 nM, SARS-CoV-2 Delta에 대하여 12.2 nM로 측정되었다. 측정된 중화능은 각 변이 RBD에 대한 D27LEY의 결합력에 상응하는 결과이다. 따라서 중화능을 측정하지 못한 SARS-CoV-2 변이에 대해서도 D27LEY가 변이 RBD에 강하게 결합하는 경우, 해당 변이 바이러스에 대해 중화능을 가질 것으로 기대한다. D27LEY는 SARS-CoV-2 변이 중 Beta, Gamma, DeltaPlus, epsilon, kappa, lambda의 RBD에 대해 강한 결합력을 가지는 것으로 측정되었기 때문에, 치료용 중화항체로써 다양한 변이 바이러스 치료에 사용될 수 있을 것이다.
실시예 8. D27LEY의 SARS-CoV-1 RBD, PCoV-GD1 RBD에 대한 결합력 검증
본 발명의 D27LEY의 중화항체로써 특징을 확인하기 위해 다양한 Sarbecovirus RBD에 결합하며 폭넓은 중화능을 갖는 것으로 보고된 중화항체 S2X259 (Tortorici, M. A. et al., Nature volume 597, pages 103-108 (2021))와의 비교 분석을 진행하였다. 결과는 도 18 및 도 19에 나타내었다.
도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이, 구조를 바탕으로 SARS-CoV-2 RBD Epitope mapping을 진행하였을 때, D27LEY가 S2X259와 SARS-CoV-2 RBD에 대하여 유사한 결합부위를 갖는 것을 확인하였다. 이를 통해 두 항체 모두 현재 유행하는 SARS-CoV-2 변이 바이러스의 RBD에서 나타나는 대부분의 돌연변이 부위를 피해 결합함을 확인할 수 있었다. 이는 두 항체의 변이 SARS-CoV-2 RBD에 큰 결합력 저하 없이 결합하는 내용을 뒷받침한다.
추가적으로, S2X259가 다른 sarbecovirus에 대한 cross reactivity를 갖는다는 사실에 기초하여 D27LEY의 cross reactivity를 확인하고자 SARS-CoV-1 RBD와 천산갑의 코로나 바이러스인 PCoV-GD1 RBD에 대한 D27LEY의 결합력을 측정하였다. 결과는 도 20에 나타내었다.
도 20에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항체 D27LEY의 SARS-CoV-1 RBD에 대한 결합력(K D < 1 pM)과 PCoV-GD1 RBD에 대한 결합력(K D = 0.66 nM)을 고려해 본다면, 본 발명의 항체 D27LEY는 다른 sarbecovirus에 대해서도 폭넓게 중화항체로 기능할 수 있을 것으로 기대된다.
<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Computationally designed SARS-CoV-2 RBD specific antibody <130> PN200387P <160> 44 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of D27 <400> 1 Gly Gly Thr Phe Gly Asn Trp Ser Ile Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of D27 <400> 2 Gly Ile Asp Pro Ser Arg Gly Glu Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of D27 <400> 3 Glu Thr Glu Gln Gly Gly Met Asp Val 1 5 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of D27 <400> 4 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val His 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of D27 <400> 5 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL3 of D27 <400> 6 Gln Val Tyr Asp Leu Phe Ser Asp Tyr Val 1 5 10 <210> 7 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH of D27 <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Asn Trp 20 25 30 Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Asp Pro Ser Arg Gly Glu Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Glu Gln Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 165 170 175 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 180 185 190 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 195 200 205 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 210 215 220 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 225 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 245 250 255 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 260 265 270 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 275 280 285 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 290 295 300 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 305 310 315 320 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 325 330 335 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 340 345 350 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 355 360 365 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 370 375 380 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 385 390 395 400 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 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gtaacaatat aggtcgcaag tcagttcact ggtatcagca aaagcccggc 120 caagcacctg tccttgttgt atatgatgac tcagataggc cctccgggat accagagcga 180 ttctccgggt ccaattcagg caataccgca acattgacta tttctcgcgt cgaagcgggg 240 gatgaagctg actattattg ccaggtctac gatctgtgga gttccgatta cgtatttgga 300 acaggaacga aagtgaccgt actgggtcaa ccgaag 336 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH1 of D27LEY <400> 23 Gly Gly Thr Phe Gly Asn Trp Ser Ile Ser 1 5 10 <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH2 of D27LEY <400> 24 Gly Ile Asp Pro Ser Arg Gly Glu Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRH3 of D27LEY <400> 25 Glu Thr Trp Tyr Thr Ser Gly Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL1 of D27LEY <400> 26 Gly Gly Asn Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val His 1 5 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDRL2 of D27LEY <400> 27 Asp 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240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 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180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 37 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of D27LEY <400> 37 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Gly Asn Trp 20 25 30 Ser Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ala Pro Gly Arg Gly Glu Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Trp Tyr Thr Ser Gly Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 38 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of D27LEY <400> 38 Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Arg Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Tyr Asp Leu Trp Ser Ser Asp 85 90 95 Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 39 <211> 1701 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain nucleotide of D27 <400> 39 caggtccagc ttcaacaaag tggcgccgag gtgaaaaagc cagggtcaag cgtcaaggtc 60 tcttgtaagg catccggggg gacattcggt aattggtcta tatcttgggt taggcaagcc 120 cctgggcagg gtctggagtg gatgggaggc atagaccctt caaggggaga agctacatac 180 gcgcaaaaat tccaaggaag agtcaccata acgacggatg agtccacgag cactgcttac 240 atggagcttt ccagcttgag aagtgaagac accgctgtat attactgtgc gagggagact 300 gagcaaggcg ggatggatgt ttggggacag ggaacaacgg tcacagtctc atcccaggtc 360 cagcttcaac aaagtggcgc cgaggtgaaa aagccagggt caagcgtcaa ggtctcttgt 420 aaggcatccg gggggacatt cggtaattgg tctatatctt gggttaggca agcccctggg 480 cagggtctgg agtggatggg aggcatagac ccttcaaggg gagaagctac atacgcgcaa 540 aaattccaag gaagagtcac cataacgacg gatgagtcca cgagcactgc ttacatggag 600 ctttccagct tgagaagtga agacaccgct gtatattact gtgcgaggga gactgagcaa 660 ggcgggatgg atgtttgggg acagggaaca acggtcacag tctcatccgc cagcaccaag 720 ggccccagcg tgttccccct ggcccccagc agcaagagca ccagcggcgg caccgccgcc 780 ctgggctgcc tggtgaagga ctacttcccc gagcccgtga ccgtgagctg gaacagcggc 840 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gccgtgctgc agagcagcgg cctgtacagc 900 ctgagcagcg tggtgaccgt gcccagcagc agcctgggca cccagaccta catctgcaac 960 gtgaaccaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagaagg tggagcccaa gagctgcgac 1020 aagacccaca cctgcccccc ctgccccgcc cctgagctgc tgggaggccc ttccgtgttt 1080 ctgttccccc caaagcccaa ggataccctg atgatcagcc ggacccccga agtgacctgc 1140 gtggtggtgg acgtgtccca cgaggaccct gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 1200 gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagccc agagaggaac agtacaacag cacctaccgg 1260 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaaaga gtacaagtgc 1320 aaggtctcca acaaggccct gcctgccccc atcgagaaaa ccatcagcaa ggccaagggc 1380 cagccccgcg agcctcaggt gtacacactg ccccccagcc gggacgagct gaccaagaac 1440 caggtgtccc tgacctgcct ggtcaagggc ttctacccca gcgatatcgc cgtggaatgg 1500 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggacagcgac 1560 ggctcattct tcctgtactc caagctgacc gtggacaaga gccggtggca gcagggcaac 1620 gtgttcagct gcagcgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1680 agcctgagcc ccggcaaatg a 1701 <210> 40 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain nucleotide of D27 <400> 40 tcctacgaac tcactcaacc cccttcagtt tctgttgcac ccggtaagac tgcacgcatc 60 acctgtggcg gtaacaatat aggtcgcaag tcagttcact ggtatcagca aaagcccggc 120 caagcacctg tccttgttgt atatgatgac tcagataggc cctccgggat accagagcga 180 ttctccgggt ccaattcagg caataccgca acattgacta tttctcgcgt cgaagcgggg 240 gatgaagctg actattattg ccaggtctac gatctgtttt ccgattacgt atttggaaca 300 ggaacgaaag tggaaattaa acgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgagcagcc ccgtgaccaa gagcttcaac agaggcgagt gc 642 <210> 41 <211> 1707 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain nucleotide of D27LE <400> 41 caggtccagc ttcaacaaag tggcgccgag gtgaaaaagc cagggtcaag cgtcaaggtc 60 tcttgtaagg catccggggg gacattcggt aattggtcta tatcttgggt taggcaagcc 120 cctgggcagg gtctggagtg gatgggaggc atagaccctt caaggggaga agctacatac 180 gcgcaaaaat tccaaggaag agtcaccata acgacggatg agtccacgag cactgcttac 240 atggagcttt ccagcttgag aagtgaagac accgctgtat attactgtgc gagggagact 300 tggtatactt ctggcgggat ggatgtttgg ggacagggaa caacggtcac agtctcatcc 360 caggtccagc ttcaacaaag tggcgccgag gtgaaaaagc cagggtcaag cgtcaaggtc 420 tcttgtaagg catccggggg gacattcggt aattggtcta tatcttgggt taggcaagcc 480 cctgggcagg gtctggagtg gatgggaggc atagaccctt caaggggaga agctacatac 540 gcgcaaaaat tccaaggaag agtcaccata acgacggatg agtccacgag cactgcttac 600 atggagcttt ccagcttgag aagtgaagac accgctgtat attactgtgc gagggagact 660 gagcaaggcg ggatggatgt ttggggacag ggaacaacgg tcacagtctc atccgccagc 720 accaagggcc ccagcgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcacc 780 gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gagctggaac 840 agcggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg 900 tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgccc agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 960 tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc 1020 tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc cccgcccctg agctgctggg aggcccttcc 1080 gtgtttctgt tccccccaaa gcccaaggat accctgatga tcagccggac ccccgaagtg 1140 acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 1200 gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcccagag aggaacagta caacagcacc 1260 taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagagtac 1320 aagtgcaagg tctccaacaa ggccctgcct gcccccatcg agaaaaccat cagcaaggcc 1380 aagggccagc cccgcgagcc tcaggtgtac acactgcccc ccagccggga cgagctgacc 1440 aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc aagggcttct accccagcga tatcgccgtg 1500 gaatgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccacccctcc cgtgctggac 1560 agcgacggct cattcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagagccg gtggcagcag 1620 ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1680 tccctgagcc tgagccccgg caaatga 1707 <210> 42 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain nucleotide of D27LE <400> 42 tcctacgaac tcactcaacc cccttcagtt tctgttgcac ccggtaagac tgcacgcatc 60 acctgtggcg gtaacaatat aggtcgcaag tcagttcact ggtatcagca aaagcccggc 120 caagcacctg tccttgttgt atatgatgac tcagataggc cctccgggat accagagcga 180 ttctccgggt ccaattcagg caataccgca acattgacta tttctcgcgt cgaagcgggg 240 gatgaagctg actattattg ccaggtctac gatctgtgga gttccgatta cgtatttgga 300 acaggaacga aagtggaaat taaacgtacg gtggccgccc ccagcgtgtt catcttcccc 360 cccagcgacg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttc 420 taccccagag aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag cggcaacagc 480 caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgag cagcaccctg 540 accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 600 ggcctgagca gccccgtgac caagagcttc aacagaggcg agtgc 645 <210> 43 <211> 1707 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain nucleotide of D27LEY <400> 43 caggtccagc ttcaacaaag tggcgccgag gtgaaaaagc cagggtcaag cgtcaaggtc 60 tcttgtaagg catccggggg gacattcggt aattggtcta tatcttgggt taggcaagcc 120 cctgggcagg gtctggagtg gatgggaggc atagcccctg gcaggggaga agctacatac 180 gcgcaaaaat tccaaggaag agtcaccata acgacggatg agtccacgag cactgcttac 240 atggagcttt ccagcttgag aagtgaagac accgctgtat attactgtgc gagggagact 300 tggtatactt ctggcgggat ggatgtttgg ggacagggaa caacggtcac agtctcatcc 360 caggtccagc ttcaacaaag tggcgccgag gtgaaaaagc cagggtcaag cgtcaaggtc 420 tcttgtaagg catccggggg gacattcggt aattggtcta tatcttgggt taggcaagcc 480 cctgggcagg gtctggagtg gatgggaggc atagaccctt caaggggaga agctacatac 540 gcgcaaaaat tccaaggaag agtcaccata acgacggatg agtccacgag cactgcttac 600 atggagcttt ccagcttgag aagtgaagac accgctgtat attactgtgc gagggagact 660 gagcaaggcg ggatggatgt ttggggacag ggaacaacgg tcacagtctc atccgccagc 720 accaagggcc ccagcgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcacc 780 gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gagctggaac 840 agcggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg 900 tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgccc agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 960 tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaggtgga gcccaagagc 1020 tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc cccgcccctg agctgctggg aggcccttcc 1080 gtgtttctgt tccccccaaa gcccaaggat accctgatga tcagccggac ccccgaagtg 1140 acctgcgtgg tggtggacgt gtcccacgag gaccctgaag tgaagttcaa ttggtacgtg 1200 gacggcgtgg aagtgcacaa cgccaagacc aagcccagag aggaacagta caacagcacc 1260 taccgggtgg tgtccgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaagagtac 1320 aagtgcaagg tctccaacaa ggccctgcct gcccccatcg agaaaaccat cagcaaggcc 1380 aagggccagc cccgcgagcc tcaggtgtac acactgcccc ccagccggga cgagctgacc 1440 aagaaccagg tgtccctgac ctgcctggtc aagggcttct accccagcga tatcgccgtg 1500 gaatgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccacccctcc cgtgctggac 1560 agcgacggct cattcttcct gtactccaag ctgaccgtgg acaagagccg gtggcagcag 1620 ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1680 tccctgagcc tgagccccgg caaatga 1707 <210> 44 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain nucleotide of D27LEY <400> 44 tcctacgaac tcactcaacc cccttcagtt tctgttgcac ccggtaagac tgcacgcatc 60 acctgtggcg gtaacaatat aggtcgcaag tcagttcact ggtatcagca aaagcccggc 120 caagcacctg tccttgttgt atatgatgac tcagataggc cctccgggat accagagcga 180 ttctccgggt ccaattcagg caataccgca acattgacta tttctcgcgt cgaagcgggg 240 gatgaagctg actattattg ccaggtctac gatctgtgga gttccgatta cgtatttgga 300 acaggaacga aagtggaaat taaacgtacg gtggccgccc ccagcgtgtt catcttcccc 360 cccagcgacg agcagctgaa gagcggcacc gccagcgtgg tgtgcctgct gaacaacttc 420 taccccagag aggccaaggt gcagtggaag gtggacaacg ccctgcagag cggcaacagc 480 caggagagcg tgaccgagca ggacagcaag gacagcacct acagcctgag cagcaccctg 540 accctgagca aggccgacta cgagaagcac aaggtgtacg cctgcgaggt gacccaccag 600 ggcctgagca gccccgtgac caagagcttc aacagaggcg agtgc 645

Claims (12)

  1. 다음을 포함하는 SARS-CoV-2 S 단백질의 수용체 결합도메인(receptor binding domain, RBD)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편:
    (a) 서열번호 1의 HCDR1, 서열번호 2의 HCDR2, 및 서열번호 3의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 4의 LCDR1, 서열번호 5의 LCDR2, 및 서열번호 6의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역;
    (b) 서열번호 13의 HCDR1, 서열번호 14의 HCDR2, 및 서열번호 15의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 16의 LCDR1, 서열번호 17의 LCDR2, 및 서열번호 18의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역; 또는
    (c) 서열번호 23의 HCDR1, 서열번호 24의 HCDR2, 및 서열번호 25의 HCDR3를 포함하는 중쇄가변영역; 및 서열번호 26의 LCDR1, 서열번호 27의 LCDR2, 및 서열번호 28의 LCDR3를 포함하는 경쇄가변영역.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a)의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 각각 서열번호 7 및 8의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (b)의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 각각 서열번호 19 및 20의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (c)의 중쇄가변영역 및 경쇄가변영역은 각각 서열번호 29 및 30의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합단편은, (a) 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; (b) 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄; 또는 (c) 서열번호 37의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2는 SARS-CoV-2 wuhan strain, SARS-CoV-2 Alpha variant (B.1.1.7), SARS-CoV-2 Beta variant (B.1.351), SARS-CoV-2 Gamma variant (P.1), SARS-CoV-2 Delta variant (B.1.617.2), SARS-CoV-2 DeltaPlus variant (AY.1), SARS-CoV-2 Kappa variant (B.1.617.1), 및 SARS-CoV-2 Lambda variant (C37)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스주인, 항체 또는 그의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자.
  8. 제7항의 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  9. 제8항의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 감염증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2의 검출용 조성물.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2의 검출용 키트.
KR1020210141420A 2020-12-22 2021-10-21 컴퓨터를 이용해 디자인된 SARS-CoV-2 수용체결합 도메인 특이적 항체 또는 그의 항원 결합 단편 KR20220090395A (ko)

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Lan et al., Nature volume 581, pages215-220(2020)
Prabakaran et al., J Biol Chem.;281(23):15829-36. 2006;
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