KR20210010236A

KR20210010236A - 트립토파닐-티알엔에이 합성효소 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210010236A
Application number: KR1020190087903A
Authority: KR
Inventors: 김성훈; 서우영
Original assignee: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2021-01-27

Abstract

본 발명은 트립토파닐-티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase, WRS) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명 특유의 항체 또는 그 단편은 WRS에 특이적으로 결합하는 능력이 매우 우수하며, 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어, WRS 검출 및 억제 능력이 우수하므로 WRS 검출 및 WRS가 관련된 질환인 암, 감염 질환 또는 감염 합병증의 진단과 항염증 목적으로 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

트립토파닐-티알엔에이 합성효소 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도{Antibody specifically binding to tryptophanyl-tRNA synthetase protein and uses thereof}

본 발명은 트립토파닐-티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase, WRS) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 명세서에서 기재하는 특정 CDR(상보성 결정부위) 서열을 가지며 인간 트립토파닐-tRNA 합성효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편과, 상기 항체 또는 단편의 암, 감염 질환 또는 감염 합병증 진단 용도와 항염증 용도에 대한 것이다.

Aminoacyl-tRNA synthetase(ARS)는 특정 아미노산을 그 해당하는 tRNA에 붙여주는 역할을 하는 효소이며. 고등생물의 경우 아미노산 종류에 따른 20 개의 효소외에 AIMP1(p43), (AIMP2)p38, (AIMP3)p18 등 multisynthetase complex 형성에 관여하는 3종류를 포함하여 23종의 효소로 구성되어 있으며 multisynthetase complex에 참여하는 효소 외에 몇몇은 free form 형태로도 존재한다. 그러나 최근에 들어 기본적인 기능 외에 특정 환경에서 다양한 다른 활성기능을 가지고 있음이 보고되었는데 WRS (tryptophanyl-tRNA synthetase)가 그중의 하나이다.

WRS는 세포 밖으로 분비되어 cytokine 활성을 나타내는 ARS중에 가장 먼저 보고가 되었으며 WRS는 최근까지도 대장암을 비롯한 여러 암에서 중요한 biomarker로서의 가능성에 많은 논문이 발표되고 있다 (Ghanipour, A et al The prognostic significance of tryptophanyl-tRNA synthetase in clorectal cancer(2009) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 18(11), 2949-2955). 또한, WRS는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이(fungi)의 감염에 의한 감염질환 발생시 체내 WRS 수준이 감염 초기부터 빠르게 증가하며, 특히 감염성 염증 질환을 수반하는 경우 WRS의 수준이 정상인에 비하여 크게 증가하고, 비감염성 염증 질환의 경우 WRS 수준과 관련이 없는 등 WRS의 수준은 감염 질환과 이들의 합병증을 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 마커로서 사용될 수 있음이 보고된 바 있다(한국공개특허 제10-2017-0027313호).

이와 같은 결과로 WRS는 암 및 감염성질환 환자의 혈청 내에 존재할 수 있으며, WRS가 이들 질환의 중요한 진단 바이오마커로 사용될 수 있음을 보여준다.

하지만 WRS를 비롯한 ARS들에 대한 바이오마커로서의 중요성에도 불구하고 ARS들은 단백질 구조상 유사한 점이 많아 동물로부터 면역반응으로 얻어지는 항체는 다른 ARS에도 결합하는 교차 반응을 보이고 아예 고 감도의 항체가 생성되지 않은 경우가 많다.

이에, 본 발명자들은 WRS에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명 특유의 CDR(상보성 결정부위) 서열 구성을 갖는 항체가 WRS에 매우 높은 결합특이성(specificity) 및 결합친화력(affinity)를 나타내어 그 활용도가 매우 높음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 중쇄가변영역(VH) 및

서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역(VL)

을 포함하는, 트립토파닐-tRNA 합성효소(WRS, tryptophanyl-tRNA synthetase)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 WRS에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 암, 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 항염증용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 중쇄가변영역(VH) 및

을 포함하는, 트립토파닐-tRNA 합성효소(WRS, tryptophanyl-tRNA synthetase)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 WRS에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 암 또는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 포함하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에서 'WRS'는 트립토파닐 티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase)를 의미하며, 트립토판티알엔에이 연결효소(tryptophan-tRNA ligase), TrpRS, WARS 등으로도 알려져 있다. WRS는 아미노산 트립토판과 tRNA의 아미노아실레이션(aminoacylation) 반응을 매개하는 효소이다. WRS는 인간에서는 WARS 유전자에 의해 암호화되며, 단백질의 아미노산 서열과 mRNA 염기 서열은 Genbank accession number NP_004175.2(단백질, 서열번호 21), Genbank accession number NM_004184.3(mRNA 염기서열, 서열번호 22) 등으로 공지되어 있다. WRS는 cytoplasmic form(WARS 또는 tryptophanyl-tRNA synthetase, cytoplasmic)과 mitochondrial form(WARS2 또는 tryptophanyl-tRNA synthetase, mitochondrial)의 두 가지 아형(isoform)이 있다. 하나의 실시 양태에서, 본 발명에서의 WRS는 바람직하게는 cytoplasmic form이다.

본 발명에서 ‘항체(antibody)’는 면역글로불린(immunoglobulin, Ig)이라고도 불리며, 항원에 선택적으로 작용하여 생체 면역에 관여하는 단백질의 총칭이다. 자연에서 발견되는 전체 항체(whole antibody)는 일반적으로 여러 도메인으로 이루어진 폴리펩티드인 경쇄(light chain, LC) 및 중쇄(heavy chain, HC)의 2개 쌍으로 이루어지거나, 이들 HC/LC의 2개의 쌍으로 된 구조를 기본 단위로 구성된다. 포유류의 항체를 구성하는 중쇄의 종류는 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ로 표시되는 5가지 유형이 있으며, 중쇄의 종류에 따라 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 등 다른 종류의 항체를 구성하게 된다. 포유류의 항체를 구성하는 경쇄의 종류는 λ 및 κ로 표시되는 2가지 종류가 존재한다.

항체의 중쇄와 경쇄는 구조적으로 아미노산 서열의 가변성에 따라 가변영역과 불변영역으로 구분된다. 중쇄의 불변영역은 항체의 종류에 따라 CH1, CH2 및 CH3(IgA, IgD 및 IgG 항체) 및 CH4(IgE 및 IgM 항체) 등 3 또는 4개의 중쇄불변영역으로 구성되어 있으며, 경쇄는 1개의 불변영역인 CL으로 구성되어 있다. 중쇄와 경쇄의 가변영역은 각각 중쇄가변영역(VH) 또는 경쇄가변영역(VL)의 하나의 도메인으로 이루어져 있다. 경쇄와 중쇄는 각각의 가변영역과 불변영역이 나란히 정렬되어 1개의 공유 이황결합(disulfide bond)에 의해 연결되고, 경쇄와 결합한 두 분자의 중쇄는 2개의 공유 이황결합을 통해 연결되어 전체 항체의 형태를 형성한다. 전체 항체는 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 통해 항원에 특이적으로 결합하며, 전체 항체는 2개의 중쇄 및 경쇄의 쌍(HC/LC)으로 구성되어 있으므로, 한 분자의 전체 항체는 두 개의 가변영역을 통해 동일한 두 개의 항원에 결합하는 2가의 단일 특이성을 갖게 된다. 항원에 결합하는 항체 가변영역을 항체의 항원결합부위(antigen-binding site)라고 하고, 항원의 표면에서 항체에 의해 인식되는 부분을 항원결정부(epitope)라고 한다.

항원결합부위(antigen-binding site)를 포함하고 있는 항체의 가변영역은 서열 가변성이 적은 골격 부위(framework region, FR)와 서열 가변성이 높은 과가변성 부위(hypervariable region)인 상보성 결정부위(complementary determining region, CDR)로 세분된다. VH와 VL은 각각 3개의 CDR 및 4개의 FR이 N-말단부터 C-말단의 방향으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4의 순서로 배열되어 있다. 항체의 가변영역 안에서도 서열 가변성이 가장 높은 CDR이 항원과 직접 결합하는 부위로, 항체의 항원 특이성에 가장 중요하다.

본 발명에서 제공하는 WRS에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편은,

서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역(VL)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 CDR 서열로 구성된 항체(이의 기능적 단편 포함)들은 WRS에 특이적으로 결합하는 능력이 뛰어나며, ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없는 것이 특징이다.

바람직하게 본 발명에 따른 상기 항체 또는 그 단편은, 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(3C6 VH) 및 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변영역(3C6 VL)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른‘WRS에 특이적으로 결합하는 항체’는 상기한 CDR 조합이나, VH 및 VL 조합을 갖는 것이라면 그 종류가 제한되지 않는다. 구체적 일례로 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 IgG 항체일 수 있다.

본 발명의 항체는 ‘항 WRS 항체’, ‘인간화 항 WRS 항체’ 및 ‘변형 인간화 항 WRS 항체’, ‘anti-WRS antibody’로도 표현될 수 있으며, 본 발명에서 가장 광의의 의미로 사용된다. 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어. 가변 영역 및 목적하는 생물 활성(예를 들어 WRS와의 결합)을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함한다.

하나의 실시 양태에서 본 발명의 항체는 WRS에 특이적으로 결합하는 상기한 CDR 조합이나, VH 및 VL 조합을 갖는 것이라면 단일클론(monoclonal) 항체일 수도 있고, 다클론(polyclonal) 항체일 수도 있지만, 항체의 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열이 실질적으로 동일한 항체의 집단인 단일클론 항체인 것이 바람직하다.

본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이거나, 인간에서 유래한 항체의 부분과 다른 종의 동물에서 유래한 항체의 부분을 포함하는 키메릭(chimeric) 항체일 수 있다. 즉, 본 발명은 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함하며 바람직하게는 인간항체 일 수 있다.

본 발명에서 상기 항체의 단편은 전체 항체의 항원(WRS 단백질) 특이적 결합력을 유지하고 있는 항체의 기능적 단편을 의미하며, 바람직하게 상기 단편은 모항체의 WRS 단백질 친화도(결합력)의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 구체적으로는 Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fv, 디아바디(diabody), scFv 등의 형태일 수 있다

Fab(fragment antigen-binding)는 항체의 항원 결합 단편으로, 중쇄와 경쇄 각각의 하나의 가변 도메인과 불변 도메인으로 구성되어 있다. F(ab')2는 항체를 펩신으로 가수분해시켜서 생성되는 단편으로, 두 개의 Fab가 중쇄 경첩(hinge)에서 이황결합(disulfide bond)으로 연결된 형태를 하고 있다. F(ab')는 F(ab')2 단편의 이황결합을 환원하여 분리시킨 Fab에 중쇄 경첩이 부가된 형태의 단량체 항체 단편이다. Fv(variable fragment)는 중쇄와 경쇄 각각의 가변영역으로만 구성된 항체 단편이다. scFv(single chain variable fragment)는 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)이 유연한 펩티드 링커로 연결되어 있는 재조합 항체 단편이다. 디아바디(diabody)는 scFv의 VH와 VL가 매우 짧은 링커로 연결되어 서로 결합하지 못하고, 동일한 형태의 다른 scFv의 VL와 VH와 각각 결합하여 이량체를 형성하고 있는 형태의 단편을 의미한다.

본 발명의 목적상 항체의 단편은 WRS에 대한 결합특이성을 유지하고 있는 것이라면 구조나 형태의 제한을 받지 않지만, 바람직하게 scFv일 수 있다. 본 발명에 따른 scFv는 상기한 WRS 단백질 결합에 특이적인 CDR 구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 것으로서 VH의 C-말단과 VL의 N-말단이 링커를 통해 연결된 것이라면 그 서열이 특별히 제한되지 않는다. 상기 링커는 당업계에 scFv에 적용되는 링커로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나 바람직하게 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 일 수 있다. 이에 따라 본 발명의 scFv는 구체적으로 서열번호 19(3C6 scFv)로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것 일 수 있다. 하나의 실시 양태에서, 본 발명의 scFv는 서열번호 19(3C6 scFv)로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환(항체의 보존적 변이체라고 함)을 포함할 수 있다.

본 발명에서 단일클론 항체는 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원 에피토프에 매우 특이적으로 결합한다.

본 발명에서 ‘단일클론’ 또는 ‘모노클로날’이라는 말은 항체가 실질적인 상동성 집단으로부터 수득되는 것과 항체의 특성을 나타내는 말이며, 반드시 항체를 특정 방법에 의해 생산해야 한다는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 단일 항체는 문헌(Kohler et al.(1975) Nature 256: 495)에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조: 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어, 문헌(참조: Clackson et al.(1991) Nature 352: 624-628 및 Marks et al.(1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 및 Presta(2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731)에 기술된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.

본 발명의 항체는 구체적으로 키메라 항체를 포함하며, 이 경우 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 기원하거나 또는 특정 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 보이지만, 나머지 부분은 본 발명의 항체가 바람직한 생물학적 활성(예를 들어 NRS와의 선택적 결합)을 나타내는 한, 다른 종으로부터 기원하거나 또는 다른 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 나타내는 것이어도 무방하다(미국 특허 제4,816,567호;및 Morrison et al.,(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

인간화된 항체는 인간 및 비-인간(예: 쥐, 랫트) 항체의 서열을 모두 포함하는 항체로 일반적으로, 에피토프와 결합하는 부위(CDR)를 제외한 나머지 부분은 인간 항체의 것이며, 에피토프와 결합하는 부위(CDR)는 비-인간 유래의 서열을 포함할 수 있다. 완전한 인간항체는 사람 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 말하며, 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 기원한 하이브리도마에서 생산하거나, 파지 디스플레이 방법으로 생산할 수 있다.

상기 하이브리도마 세포는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 하이브리도마 세포는 면역원 폴리펩티드를 동물에 면역시키고, 상기 피면역 동물로부터 유래된 항체 생산세포인 B 세포를 골수종세포와 융합시켜서 하이브리도마를 제조한 다음, 그 중에서 당업자가 목적하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 방법으로 제조할 수 있다. 상기 피면역 동물은 마우스뿐만 아니라 염소, 양, 모르모트, 래트 또는 토끼와 같은 동물을 사용할 수 있다.

상기 피면역 동물을 면역시키는 방법으로서는 당업계에 이미 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 마우스를 면역시키는 경우 1회에 1 내지 100 ㎍의 면역원을 동량의 생리 식염수 및/또는 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant) 등의 항원 보조제로 유화시켜, 상기 피면역원 동물의 복부의 피하 또는 복강 내에 2-5주마다 2-6회 접종시키는 방법으로 수행될 수 있다. 피면역 동물을 면역시킨 후에는 최종 면역 3-5일 후 비장 또는 림프절을 적출하여 당업계에서 이미 공지되어 있는 세포 융합법에 따라서, 융합 촉진제의 존재 하에 이들의 조직에 포함되어 있는 B 세포를 골수종세포와 융합시키게 된다. 상기 융합 촉진제는 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 물질을 사용할 수 있다. 상기 골수종세포는 예를 들어, P3U1, NS-1, P3x63. Ag 8.653, Sp2/0-Ag14와 같은 마우스 유래 세포, AG1, AG2와 같은 래트 유래 세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 당업계에 공지된 세포 융합법은 예를 들어, B 세포와 골수종세포를 1:1-10:1의 비율로 혼합시켜, 이에 분자량 1,000-6,000의 PEG를 10-80%의 농도로 첨가하여, 30-37℃에서 1-10분 동안 배양하는 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 당업자가 목적하는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 예를 들어, 하이브리도마만이 생존 가능한 HAT 배지 등의 선택 배지에서 배양하고, 하이브리도마 배양 상층액 중의 항체 활성을 ELISA 등의 방법을 이용하여 측정하여 선택할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명이 제공하는 단일클론 항체 또는 이의 단편은 파지 디스플레이 기술 [McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 사용하여 비면역화 공여자로부터의 면역글로불린 가변 영역 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체와 항체 단편을 생성할 수 있다. 이러한 기술에 따라서, 항체 가변 영역 유전자를 필라멘트상 박테리오파지, 예를 들면 M13 또는 fd의 메이져 또는 마이너 외피 단백질 내로 프레임내 클로닝시키고, 파지 입자 표면 상에 기능성 항체 단편을 디스플레이 한다. 필라멘트상 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 복사물을 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 근거로 한 선택으로 인해, 이들 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자가 선별된다. 따라서, 상기 파지는 B-세포의 몇몇 특성을 모사한다. 파지 디스플레이는 각종 포맷으로 수행할 수 있다. 이에 대한 고찰은 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조할 수 있다. 가변 영역-유전자 세그먼트의 몇몇 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 가변 영역 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 항-옥사졸론 항체의 다양한 배열을 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터의 가변 영역 유전자의 레퍼토리를 작제할 수 있고, 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술을 필수적으로 수행하여 다양한 배열의 항원 (자가 항원 포함)에 대한 항체를 단리할 수 있다 [미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호 참조].

본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간, 생쥐, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭의 항체일 수 있으며, 가장 바람직하게는 인간 또는 생쥐일 수 있다.

또한 전술한 본 발명의 항체 또는 그 단편은 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 항체 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 ‘폴리뉴클레오티드’는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(doublestranded)이 될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드는, 본원 발명의 상기한 WRS 단백질 결합에 특이적인 CDR 구성, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 염기서열을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이면 그 서열이 특별히 제한되지 아니하는 것으로서, 앞서 설명한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 각각의 CDR 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게 각각 서열번호 2(중쇄 CDR1), 서열번호 4(중쇄 CDR2), 서열번호 6(중쇄 CDR3), 서열번호 8(경쇄 CDR1), 서열번호 10(경쇄 CDR2), 서열번호 12(경쇄 CDR3)로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 항체에서 전술한 VH와 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 그 서열이 특별히 제한되지 않으나, 바람직한 일례로 상기 VH를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 14로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 VL을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 16으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한 상기 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 하나의 실시 양태로서, 상기 본 발명에 따른 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20으로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당 업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당 분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응(PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(재조합 발현 벡터)를 제공한다.

본 발명의 ‘벡터(vector)’는 본 발명의 항체 또는 그 단편의 재조합 생산을 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 발현의 목적으로 이용되며, 일반적으로 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조절시퀀스, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다.

벡터의 일종인 플라스미드(plasmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스성 벡터(viral vector; 예를 들어, 복제-결핍 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스들 및 아데노-연관 바이러스들 (adenoassociated viruses))이며, 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러스성 게놈(viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 벡터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포(예를 들어, 박테리아 유래(bacterial origin) 및 에피좀의 포유류 벡터(episomal mammalian vectors)를 포함하는 박테리아성 벡터들(bacterialvectors)) 내에서의 자가복제(autonomous replication)를 할 수 있다. 다른 벡터들(예를 들어, 비-에피좀의 포유동물 벡터들(non-episomal mammalian vectors))이 숙주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈내로 통합(integrated)되고 그리고 그에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다.

본 발명에서 상기 ‘벡터’는 ‘발현벡터(expression vector)’와 동일한 의미로 이해될 수 있으며, 이는 상기 폴리뉴클레오티드의 발현할 수 있는 벡터의 한 형태이다. 하나의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 경우, 상기 조절 시퀀스(regulatory sequence)에 "작동가능하게 연결"된다. 상기 조절 시퀀스는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 서열이다. 상기 조절 시퀀스는, 예를 들어, 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들(예를 들어, 상기 조절 시퀀스 및/또는 상기 핵산에 결합하는 폴리펩티드들)의 작용을 통하여 그의 영향이 미치도록 할 수 있다. 상기 조절 시퀀스에는 프로모터(promoters), 인핸서(enhancers) 및 다른 발현 조절 요소들이 포함된다. 하나의 실시 양태에서, 벡터는 pOptiVEC™-TOPO 및 pcDNA™3.3-TOPO 등을 사용할 수 있으나, 이제 제한되지 않는다.

본 발명에서 '재조합(recombinant)'은 '유전자 조작(genetic manipulation)'과 호환하여 사용될 수 있으며, 유전자에 변형을 가하고 자르고 연결하는 등 분자적 클로닝(molecular cloning) 실험 기법을 이용하여 자연의 상태에는 존재하지 않는 형태의 유전자를 제조하는 것을 의미한다.

본 발명에서 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다.

본 발명에서 '재조합 발현 벡터'란 적합한 숙주세포(host cell)에서 목적하는 단백질 또는 핵산(RNA)을 발현할 수 있는 벡터로서, 폴리뉴클레오티드(유전자) 삽입물이 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. '작동가능하게 연결된(operably linked)'이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로, 발현조절서열에 의해 유전자가 발현될 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 상기 '발현조절서열(expression control sequence)'이란 특정한 숙주세포에서 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 개시 코돈, 종결 코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 등을 포함한다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 클로닝 분야에서 통상적으로 사용되는 벡터라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 그 예로는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 플라스미드에는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로 바이러스와 같은 곤충 바이러스 등이 사용될 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 (재조합)발현벡터는 WRS 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 전술한 CDR, 또는 VH와 VL의 구성을 갖는 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 숙주세포에서 발현될 수 있도록 작동가능하게 연결된 유전자 작제물을 의미한다.

본 발명에 따른 항체의 중쇄와 경쇄를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 각각 별개의 재조합 발현 벡터에 포함되어 있을 수도 있고, 하나의 재조합 발현 벡터에 포함되어 있을 수도 있다.

본 발명은 또한 상기 벡터로 형질 전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 세포는 본 발명의 발현 벡터에 포함된 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포라면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다. 본 발명에 따른 발현 벡터로 형질 전환된 세포(숙주세포)는 원핵생물(예를 들어, 대장균), 진핵생물(예를 들어, 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어, 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어, 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 랫 세포(rat cell), 마우스 세포(mouse cell), 곤충 세포 또는 이들에서 유래한 하이브리도마일 수도 있다. 바람직하게는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 세포일 수 있다.

본 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새(Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아(Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이(E.coli), 엔테로박터(Enterobacter), 에르위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans) 및 시겔라(Shigella), 및 바실리(Bacilli), 예를 들어, 비. 섭틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어 피.애루기노사(P.aeruginosa) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 벡터를 발현가능 한 것이면, 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이. 콜라이(E. coli)일 수 있다.

본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 쉬조사카로마이세스폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K.lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 위커라미(K.wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 왈티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K.drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스(K.marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)(EP 183,070); 칸디다(Candida); 트리코데르마 레에시아(Trichoderma reesia(EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa);쉬바니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(occidentalis); 및 필라멘트성진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 니거(A. niger)가 사용가능하다.

상기 용어 '형질전환(transformation)'은 외래성 폴리뉴클레오티드가 도입됨에 의한 숙주 세포의 유전자형의 변형을 의미하며, 그 형질전환에 사용된 방법과 상관없이 외래성 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 내로 도입된 것을 의미한다. 숙주 세포 내로 도입된 외래성 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 유지되거나 통합되지 않고 유지될 수 있는데, 본 발명은 양자 모두 포함한다.

본 발명에 따른 WRS 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터는 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 공지의 방법에 의해 항체 또는 그 단편을 생산하기 위한 세포 내부로 도입하여 형질 전환할 수 있다

또한, 본 발명의 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염(transfected)될 수 있는 배양된 세포이고, 이는 계속해서 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 재조합 세포는 발현되어야 할 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 말한다. 본 발명의 세포는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하나, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되도록 상기 세포 내로 도입되지 않는 한 이를 원하는 수준으로 발현하지 않는 세포가 될 수 있다.

본 발명의 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄(Ham's) F1O(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 최소 필수 배지(MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640(Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코(Dulbecco's) 개질 이글(Eagle's) 배지(DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포를 배양하기에 적합하다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 염, 완충액, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다.

본 발명은 상기 세포(형질 전환된 세포)를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 WRS에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.

본 발명에서 생산방법의 세포에 대하여는 상기 기술한 바와 같으며, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다. 상기 생산방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 이의 단편(기능적 단편) 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다. 이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다.

상기 배양은 상기 세포의 종류에 따라 배지 조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.

상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지(supernatant)로 표적화(targeted)될 수 있으며, 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직하다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩(refolding)시키고 기능적 형태(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 폴리펩타이드의 특성 및 세포의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.

상기 폴리펩타이드는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 만약 폴리펩타이드가 세포 내에서 생산되면, 이 세포는 제1단계로서 단백질을 방출하기 위하여 파괴될 수 있다. 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다. 세포로부터 제조된 항체는 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 본 발명의 항체는 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다.

하나의 실시 양태에서, 본 발명은

(a) 상기 발현 벡터(재조합 발현 벡터)로 숙주 세포를 형질전환하는 단계;

(b) 형질전환된 숙주 세포를 배양하여 항체 또는 그 단편을 생산하는 단계; 및

(c) 숙주 세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계를 포함하는, WRS에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 제조하는 방법을 제공한다.

(a) 단계는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 생산하기 위하여 숙주세포를 상기 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터로 형질전환하는 단계이다.

통상의 기술자는 선택된 숙주세포와 재조합 발현 벡터에 따라 앞서 서술한 바와 같이 적절한 형질전환 방법을 선택하여 본 단계를 실시할 수 있다. 중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 동일한 숙주세포에 공동형질전환하여 중쇄와 경쇄가 하나의 세포에서 발현되도록 할 수도 있고, 중쇄와 경쇄의 염기서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 각각 별개의 숙주세포에 형질전환하여 중쇄와 경쇄가 따로 발현되도록 할 수도 있다.

(b) 단계는 상기 형질전환된 숙주세포를 배양하여 숙주세포에 도입된 재조합 발현 벡터로부터 본 발명에 따른 항체의 중쇄, 경쇄 또는 항체 단편의 폴리펩티드가 생산되도록 하는 단계이다.

상기 숙주세포를 배양하기 위한 배지 조성과 배양 조건, 배양 시간 등은 당업계에서 통상 사용되는 방법에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 숙주세포에서 생산되는 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 세포 외부 또는 배양 배지로 분비되거나, 페리플라즘 등으로 표적화(targeted)되도록 할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 항체가 WRS에 대한 결합특이성을 유지하도록 당업계에 공지되어 있는 방법을 이용하여 단백질 리폴딩(refolding)시키고 기능성 구조(conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다. 또한 IgG 형태의 항체를 생산하는 경우, 중쇄와 경쇄는 별개의 세포에서 발현시키고 별도의 단계에서 중쇄와 경쇄를 접촉시켜 완전한 항체를 구성하도록 제조할 수도 있고, 중쇄와 경쇄를 동일한 세포에서 발현되도록 하여 세포 내부에서 완전한 항체를 형성하도록 할 수도 있다.

(c) 단계는 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편을 수득하는 단계이다. 숙주세포에서 생산된 항체 또는 그 단편 폴리펩타이드의 특성, 숙주세포의 특성, 발현 방식 또는 폴리펩티드의 표적화 여부 등을 고려하여 통상의 기술자는 수득 방법을 적절히 선택 및 조절할 수 있다. 예를 들어, 배양 배지로 분비된 항체 또는 그 단편은 숙주세포를 배양한 배지를 수득하고, 원심분리하여 불순물을 제거하는 등의 방법으로 항체를 회수할 수 있다. 필요에 따라 세포 내 특정 소기관이나 세포질에 존재하는 항체를 세포 외부로 방출하여 회수하기 위하여 항체 또는 그 단편의 기능적 구조에 영향을 미치지 않는 범위에서 세포를 용해시킬 수도 있다. 또한 수득한 항체는 크로마토그래피, 필터 등에 의한 여과, 투석 등의 방법을 통해 불순물을 더욱 제거하고 농축하는 과정을 추가로 거칠 수 있다.

이때, 본 발명 제조(생산) 방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다. 이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 WRS와 특이적으로 결합하므로 예를 들어, 특정 세포, 조직, 또는 혈청 내 WRS 단백질 발현을 검출하고 정량하기 위한 진단 분석에 유용하다.

따라서 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계; 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, WRS 특이적 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 검출 방법은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키기 전에, 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 이용하여 WRS의 유무와 농도를 측정하기 위한 시료를 준비하는 단계((1) 단계)를 포함할 수 있다.

통상의 기술자는 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 공지의 방법을 적절하게 선택하고, 선택된 방법에 적합하게 시료를 준비할 수 있다. 또한 시료는 암(특히 유방암 또는 폐암), 감염 질환 또는 감염 합병증 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 등일 수도 있다. 상기 항체를 이용하여 단백질을 검출하는 방법이란 여기 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 웨스턴 블랏, 면역 블랏, 닷 블랏, 면역조직화학염색(immunohistochemistry), 효소면역분석(ELISA), 방사능면역검정법(radioimmunoassay), 경쟁적 결합 분석, 면역침전 등이 있다. 예를 들어 웨스턴 블랏을 실시하기 위하여서는 시료 또는 세포의 용해물에 전기영동에 적합한 버퍼를 첨가하여 끓이는 등의 방법으로 준비할 수 있으며, 면역조직화학염색을 위해서는 세포나 조직의 절편을 고정하고 블락킹(blocking)하는 등의 전처리를 할 수 있다.

다음으로 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 전술한 단계에서 준비한 시료와 접촉시키는 단계((2) 단계)를 수행한다.

본 발명에 따른 항체는 앞서 서술한 CDR, 또는 VH와 VL의 구성을 가지며 WRS에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편으로서, 그 구체적 종류와 서열 구성에 대해서는 전술한바와 같다.

상기 항체 또는 그 단편은 이의 '검출'을 위하여, 일반적으로 검출가능 모이어티(moiety)로 표지될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen 등, Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs]에 기술된 기술을 이용하여, 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 방사능은, 예를 들어, 신틸레이션 계수(scintillation counting)에 의해 측정될 수 있으며, 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다.

또는 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하며, 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시러파제 및 세균 루시퍼라제(미국 특허 제4,737,456호)와 같은 루시퍼라제, 루시페린 (luciferin), 2,3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디하이드로게나제, 유라제 (urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 예를 들어, 문헌 [O'Sullivan 등, 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N. Y., 73: 147-166]에 기술되어 있다.

표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 바이오틴(biotin)에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과, 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘(avidin)에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또는, 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체는 작은 합텐 (hapten) (예를 들어, 딕옥신 [digoxin])과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항-합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨대, 항-딕옥신 항체). 따라서, 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다.

본 발명에서 "접촉(contacting)"이라 함은 이의 일반적인 의미로 사용되는 것으로서, 2개 이상의 물질을 혼합, 결합, 또는 서로 맞닿게 하는 것을 의미한다. 상기 접촉은 시험관 내(in vitro) 또는 다른 컨테이너(container) 상에서 수행될 수 있고, 또한 인 시투(in situ), 생체 내, 개체 내, 조직 내, 세포 내에서 수행 될 수 있다.

다음으로는 상기(2) 단계 수행 후의 시료에서 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계((3) 단계)를 수행한다.

상기‘검출’은 시료 내에서 형성된 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편과 항원의 복합체를 대상으로 하는 것으로서, WRS의 존재 유무의 감지 또는 상기 펩타이드의 수준을 측정(정성적 또는 정량적 측정을 모두 포함)하는 것을 의미한다. 따라서 상기 (2) 단계 수행 후 후술하는 검출 단계((3) 단계) 전에, WRS 단백질과 복합체를 형성하지 않은 여분의 항체 또는 그 단편들을 제거하는 단계가 추가로 포함될 수 있다.

전술한 (2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 형광, 방사성 동위원소, 효소 등으로 직접 표지되는 등의 검출가능한 모이어티를 포함하는 경우에는 해당 모이어티를 검출하는 당업계에 공지된 방법에 따라 검출을 수행할 수 있다. 일례로 방사능은, 예를 들어, 신틸레이션 계수(scintillation counting)에 의해 측정될 수 있으며, 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다.

또한 전술한 (2) 단계에서 사용된 항체 또는 그 단편이 자체로서 전술한 검출 모이어티를 포함하지 않는 경우에는, 당업계에 알려진 바와 같이 형광, 방사능, 효소 등으로 표지된 2차 항체를 이용하여 간접적으로 감지할 수 있다. 상기 2차 항체는 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편(1차 항체)에 결합한다.

본 발명의 항체에 의해 검출되는 WRS는 세포 밖으로 분비되어 cytokine 활성을 나타내는 ARS중에 가장 먼저 보고가 되었으며 최근까지도 대장암을 비롯한 여러 암에서 중요한 biomarker로서의 가능성에 많은 논문이 발표되고 있다 (Ghanipour, A et al The prognostic significance of tryptophanyl-tRNA synthetase in clorectal cancer(2009) Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 18(11), 2949-2955).

따라서, WRS의 검출을 통해 특정 암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료 전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 암의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중에서 WRS 단백질을 검출함으로써 수행될 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 암은 그 종류가 특별히 제한되지 아니하며, 예를 들어 유방암, 대장암, 폐암, 소세포폐암, 위암, 간암, 혈액암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암, 질암, 음문암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종 일 수 있으며, 바람직하게는 예를 들어 대장암이나 췌장암 일 수 있다.

한편, WRS는 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이(fungi)에 의한 감염에 의하여 발현 수준이 감염 초기부터 급속하게 증가하며, 감염 합병증으로 폐렴이나 패혈증 같은 증상이 나타나게 되는 경우 정상인 대조군보다 현저하게 증가한다는 것이 보고된 바 있다. 나아가 패혈증 환자의 경우 WRS 발현 수준은 패혈증의 중증도 및 예후와 높은 상관관계를 가지고 있으며, WRS는 감염성 염증에서만 증가하기 때문에 감염성 염증 질환과 비감염성 염증 질환을 신속하고 정확하게 구분할 수 있어, 새로운 감염 질환 및 감염 합병증에서의 진단 마커로서의 가치가 매우 높다. 특히, 박테리아 또는 곰팡이(fungi) 감염으로 인한 패혈증 또는 패혈증 쇼크 환자의 혈청에서 WRS의 양이 건강한 정상인 대조군의 혈청에 비하여 현저하게 증가하며, 그람-음성균 박테리아, 그람-양성균 박테리아 및 곰팡이 감염에 의한 패혈증 환자 각각에서 WRS의 증가 경향에 통계학적으로 유의성 있는 차이가 없어, 그람-음성균 박테리아, 그람-양성균 박테리아 또는 곰팡이 감염에 의한 패혈증 진단에 WRS가 모두 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammation reactive symptom, SIRS), 비감염성 만성 염증 질환인 천식과 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군 등 자가면역질환 환자의 혈청에서는 WRS의 양이 정상인 대조군과 비교하여 통계적으로 유의한 차이가 없다고 알려져 있으며, 따라서 WRS의 발현 수준은 모든 염증 반응에서 증가하는 것이 아니라, 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이(fungi) 감염으로 유발된 염증 반응에서만 특이적으로 증가한다. 또한 WRS의 수준은 패혈증 환자에서 보다 패혈성 쇼크 환자에서 더욱 증가하여, WRS의 발현 수준이 패혈증 중증도와도 관련이 있다. 즉, WRS의 발현 수준이 높을수록 패혈증 증상이 심한 것으로 판단할 수 있다(한국공개특허 제10-2017-0027313). 즉, 생물학적 시료 중에서 WRS의 발현 정도를 검출함으로써 감염 질환 또는 감염 합병증을 진단하고 그 예후를 예측할 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물을 제공한다.

상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.

상기 검출에 관하여는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 감염은 하나 또는 두 종류이상의 외인성 박테리아(세균, 그람 음성균 또는 그람 양성균을 모두 포함한다), 바이러스, 곰팡이 (균)가 몸속에 침입하여 정착, 증식, 기생상태가 되는 것을 의미하며, 감염 질환은 병원체의 감염의 결과로 생체에서 반응을 일으켜서 발생하는 모든 질환일 수 있다. 감염 질환의 결과로 나타나는 반응은 염증, 통증, 발열, 피로감, 부종, 혈압 강하 등이 있을 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 감염 질환은 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 장티푸스, 파라티푸스, 폐렴, 폐결핵, 결핵, 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 요로감염, 방광염, 신우신염, 요도염, 전립선염, 상기도감염, 중이염일 수 있으며, 더 바람직하게는 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 폐렴, 패혈증, 패혈성 쇼크일 수 있으며, 가장 바람직하게는 패혈증 또는 패혈성 쇼크일 수 있다.

본 발명에서 상기 패혈증은 감염 질환의 합병증으로 나타나는 전신성 염증 반응 증후군으로 원인을 조기에 신속하고 정확하게 진단하지 못할 경우에는 중증 패혈증(severe sepsis)이나 패혈성 쇼크(septic shock), 폐, 신장, 간, 순환기 등의 기능 장애까지 초래되는 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 파종성 혈관내 응고 증후군 (DIC), 급성 호흡 촉박 증후군 (ARDS) 또는 급성 신부전(AKI)으로 진행되어 사망할 수 있는 치명적인 질환이다.

본 명세서에서 사용되는 패혈증은, 패혈증의 최종 단계와 관련된 패혈증, 중증 패혈증, 패혈증성 쇼크 및 패혈증에 수반하는 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 파종성 혈관내 응고 증후군 (DIC), 급성 호흡 촉박 증후군 (ARDS) 또는 급성 신부전 (AKI)의 발병을 포함하나, 이에 제한되지 않으며 패혈증의 모든 단계를 포함한다.

본 발명에서 용어‘진단’은, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 바람직하게 본 발명에서 상기 진단은 전술한 질환의 발병 여부, 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.

본 발명에 따른 항체 또는 그 단편은 분석 키트(kit) 또는 진단 키트로서 제공될 수 있으며, 상기 키트는 당업계에 항체 또는 특정 결합 도메인을 갖는 펩타이드를 구성품으로 제공하는 분석 키트로서 알려진 것이라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 웨스턴 블랏, ELISA, 방사성면역분석법, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케이트 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩용 키트 등을 포함한다.

하나의 실시 양태에서, 이에 제한되지 않으나 본 발명의 항체 또는 그 단편은 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에 사용될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 상기 키트(kit) 즉, 진단 분석을 수행하기 위한 진단 키트에서 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 시약들의 포장된 조합에 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에, 키트는 기질 및 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자 (cofactor)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액 (예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민감도를 충분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.

또한 본 발명은, 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편을 포함하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다. 특히, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 과도한 염증성 물질의 생산에 의한 질환을 개선/치료하는 효과가 있으며, 이에 제한되지 않으나 초염증 증후군(hyper-inflammatory syndrome) 또는 만성 염증을 개선/치료할 수 있다.

따라서 하나의 실시양태에서, 본 발명은 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편을 포함하는, 초염증 증구훈 또는 만성염증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

하나의 실시 양태에서, 상기 초염증 증후군 또는 만성염증은 바람직하게 WRS에 의한(WRS 수준 증가에 의한 또는 WRS 수준 증가를 동반하는) 초염증 증후군 또는 만성염증일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 그 단편을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 “약학적으로 허용되는” 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 활성성분의 작용을 저해하지 않으며 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 비독성의 조성물을 말한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환자, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 본 발명의 상기 화학식 1의 아릴 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들어, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 본 발명의 치료용 조성물을 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, l9th Edition, Alfonso, R., ed, Mack Publishing Co.(Easton, PA: 1995))와 바람직한 순도를 갖는 항체를 혼합하여 저장하기 위해 동결건조된 케이크 또는 수용액의 형태로 제조할 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충용액, 예를 들어 인산, 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다.

본 발명의 항체는 투병 중인 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 상기에서“약학적으로 유효한 양”이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반응을 나타내는 양을 말한다. 본 발명의 항체 또는 그 단편의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 그 단편의 인체에 대한 투여량은 일반적으로 0.01 - 100 mg/kg/week이며, 바람직하게는 0.1 - 20 mg/kg/week이며, 더욱 바람직하게는 5 - 10 mg/kg/week일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 항체 또는 그 단편을 본 발명의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 공지된 항체 투여 방법, 예를 들어 정맥내, 복강내, 뇌내, 피하, 근육내, 안내, 동맥내, 뇌척수내, 또는 병변내 경로에 의한 주사 또는 주입, 또는 하기 기재된 서방성 (sustained release) 시스템에 의한 주사 또는 주입일 수 있으며 이에 제한되지 않는다. 일례로 본 발명의 항체는 전신으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.

본 발명 특유의 항체 또는 그 단편은 WRS에 특이적으로 결합하는 능력이 매우 우수하며, 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어, WRS 검출 및 억제 능력이 우수하므로 WRS 검출 및 WRS가 관련된 질환인 암, 감염 질환 또는 감염 합병증의 진단과 항염증 목적으로 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 대표적인 몇 개의 주요 scFv phage clone 후보들의 WRS 결합능력을 웨스턴 블롯(WB)을 통하여 비교한 결과를 나타낸다.
도 2는 대표적인 몇 개의 주요 IgG 후보들의 WRS 결합능력을 Indirect ELISA를 통하여 비교한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명 3C6 IgG 단일클론 항체가 WRS 이외에 ARS family의 다른 단백질과의 교차반응성이 없는 것을 indirect ELISA 방법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 대식세포(분화된 THP-1 세포)에서 Human WRS 처리에 의해 증가된 TNF-α(종양 괴사 인자 알파) 수준이, 본 발명 3C6 IgG 단일클론 항체 처리에 의해 현저히 억제됨을 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 대식세포(분화된 THP-1 세포)에서 Human WRS 처리에 의해 증가된 TNF-α(종양 괴사 인자 알파) 수준이 본 발명 3C6 IgG 단일클론 항체 처리에 의해 억제될 때, 본 발명 항체의 EC(Effective concentration)₅₀을 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 고감도의 WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) 특이적 결합 항체의 제작

1-1. scFv phage 선별_ 1차

Full-length(FL)-WRS 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 scFv를 선별하기 위하여 HA tag으로 표지된 인간의 B 세포에서 유래한 scFv phage library를 이용한 phage display panning 실험을 실시하였다. 본 실험에 사용한 scFv display phage library(Library size: app. 8 x 10⁸, Library produced by prof. Hyunbo Shim)에 대해서는 대한민국 출원번호 1020180075824 (2018.06.29)에 기재되어 있다. 패닝과정은 구체적으로 다음과 같다.

1ml의 1X PBS 용액을 포함하는 Immuno-튜브에 1~10μg의 항원(FL-WRS, NP_004175.2) 단백질을 첨가하고 37℃, 200rpm으로 1시간 동안 반응시켜 튜브 안쪽 표면에 항원을 코팅하였다. 항원 용액을 따라내고 수돗물로 1회 세척하여 코팅되지 않은 항원을 제거하였다. 항원 단백질과 phage간 비특이적 결합을 막기 위하여 immuno-튜브와 scFv library를 각각 3% 탈지유가 포함된 1X PBST(0.05% tween20을 포함하는 PBS)로 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. Immuno-튜브에서 탈지유를 제거한 후, scFv library를 첨가하여 37℃, 150rpm으로 1시간 동안 반응시켜 항원(FL-WRS)에 scFv phage가 결합하도록 하였다. scFv phage를 튜브에서 반응시킨 후, 1X PBST로 2~5번 세척하여 결합하지 않은 scFv phage를 제거하였다. FL-WRS 항원에 특이적으로 결합한 scFv phage는 상온에서 triethylamine(100mM) 1ml을 첨가하여 10분 이내에 분리해내고, Tris(1M, pH 7.4)로 중화시켰다. 여과한 phage scFv를 OD<1으로 배양한 ER2537 E. coli에 첨가하여 37℃, 120rpm으로 1시간 30분 동안 배양하면서 감염시켰다. phage에 감염된 E. coli는 원심분리하여 배양 상층액을 일부 제거한 후 재분산하여 암피실린과 포도당(2%)을 포함하는 지름 15cm의 아가로즈 플레이트에 도포하였다. 다음날 5ml SB 배지를 도포하여 플레이트에서 자란 세포들을 모두 수득하고, glycerol(50%)을 전체 부피의 0.5배가 되도록 첨가하여 혼합하고 1ml씩 분주하여 -80℃에 보관하였다(scFv panning stock). 상기 제조한 stock 20μl를 20ml SB 배지 용액에 접종하여 배양하고, helper phage를 이용하여 다음 단계의 phage panning을 위한 scFv phage library(1ml)로 제작하였다. FL-WRS 항원에 특이적인 scFv를 발현하는 phage를 분리하기 위한 상기 과정을 2~3회 반복하였다.

1-2. ELISA를 통한 결합특이적 scFv 항체 선별_2차 선별

실시예 1-1에서 선별된 phage가 발현하는 scFv가 FL-WRS 항원 단백질에 특이적으로 결합하는지 indirect ELISA를 실시하여 조사하였다.

Panning을 3회 반복하여 수득한 scFv 결과물을 희석하여 지름 10cm의 아가로즈 플레이트에 도포하고, 다음날 각각의 콜로니(colony)를 선별하여 200μl의 SB 배지가 포함된 96 well 플레이트에서 각각 배양하였다. 전체적으로 증식이 잘된 것을 확인하고, IPTG(1mM)를 첨가하고 30℃로 16시간 동안 배양하여 scFv의 생산을 유도하였다. 다음날 96 well 플레이트를 원심분리하여 세포만 분리한 뒤, TES 용액을 이용하여 세포를 용해시키고, 다시 원심분리하여 상층액만 분리하였다. 수득한 상층액으로 indirect ELISA를 실시하여 FL-WRS 항원에 특이적으로 결합하는 scFv를 선별하였다. FL-WRS로 플레이트를 코팅하고, scFv를 포함하는 배양 상층액을 반응시킨 후, 2차 항체로 항-HA-HRP 항체(Roche Applied Science)와 반응시켰다. Tetramethylbenzimidine(TMB, Thermo scientific)을 이용하여 발색 반응한 후, H₂SO₄(1M)을 이용하여 발색 반응을 중지시키고 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. control(blank)과 전술한 항원(Ag)에 대하여 동시에 ELISA를 수행하여 positive값을 얻은 colony만 선별하는 작업을 수행하였다. 즉, FL-WRS 항원을 이용한 실험에서 측정된 흡광도를 대조군(control)의 실험에서 측정된 흡광도에 대한 비율(FL-WRS/control)로 계산하고, scFv를 선별하는 지표로 하였다.

1-3. 서열분석

상기 실시예 <1-2>에서 ELISA screening을 통하여 선별된 다수개의 colony중에서 중복된 CDR 서열을 가진 동일 Ab를 걸러내기 위하여 sequence를 분석하였다. 구체적으로 서열분석은 다음과 같은 방법으로 수행되었다: scFv clone을 보유하고 있는 E. coli를 배양한 다음, miniprep으로 phagemid를 확보하였다. 이를 Omp primer(Hye young Yang, et. al., 2009, Mol. Cells 27, 225-235)를 사용하여 sequence를 확인하였다. 이와 같이 확보된 sequence를 Bioedit 프로그램을 사용하여 phagemid의 CDR region의 서열을 확인하였다. 이 중 중복된 CDR 서열을 가진 clone을 제거하여, 각각 독립된 CDR 서열의 scFv clone을 확인하였다.

1-4. western blot을 통한 결합특이적 scFv 항체 선별_3차 선별

상기 실시예들을 통해 선별되어 서열이 규명된 다수의 scFv clone을 대상으로, 이들이 WRS와 특이적으로 결합하는지 확인하기 위해 Hela cell과 HCT116 cell을 이용하여 western blot으로 확인하였다.

먼저 scFv 클론 정제는 다음과 같은 방법으로 수행되었다. 각각의 scFv 양성 단일 콜로니 클론을 ampicillin을 함유하는 SB 배지(Bactotrytone 30g, yeast extract 20g,MOPS buffer 10g/L)에 5 ml에 배양하여 seed culture를 시작하여 overnight 배양 후, ampicillin이 함유된 SB배지 500ml에 옮겨 배양하면서 OD600 = 0.3~1.0 사이가 되었을 때 IPTG(최종 농도 1mM)를 넣어 30℃에서 overnight 배양하여 scFv 단백질을 대장균의 페리플라즘(periplasm)에서 발현하였다. 다음날 원심분리하여 수득한 대장균 펠렛(pellet)을 1X TES buffer(50 mM Tris, 1 mM EDTA, 20% Sucrose, pH 8.0)에 현탁한 후, 0.2 X TES를 1.5배 첨가하여 섞어주고 원심분리하여 상등액을 취함으로서 페리플라즘을 추줄하였다. 페리플라즘 상등액에 최종 5 mM MgCl₂를 가하고 0.45um syringe filte를 통과시켜 미세부유물을 제거한 후 protease inhibitor를 첨가하여 scFv extract를 준비하였다. 이를 미리 PBS에 평형시킨 Ni-NTA bead 와 섞어 1시간 동안 냉장에서 교반하여 Ni-NTA bead에 결합시킨 후, 친화도 크로마토그래피를 수행하여 결합하지 않은 성분들을 PBS로 충분히 씻어내었다. 5 mM Imidazole이 함유된 buffer로 더 충분히 씻어 준 다음, 결합한 scFv 항체는 200 mM Imidazole buffer를 이용하여 용출하였다. 용출된 항체는 투석하여 SDS-PAGE를 통해 순도를 확인하고 BCA 방법으로 단백질 정량을 하여 정제된 항체양을 기록후 일정양을 분주하여 냉동 보관하였다.

정제된 scFv 항체는 웨스턴블롯(western blot) 방법을 사용하여, FL(full length)-WRS에 각각의 scFv 항체가 결합하는지 여부를 확인하는 데 사용하였다. 12% Acrylamid gel을 만들어서 30ug의 Hela cell lysate 또는 HCT116 cell lysate를 loading하여 SDS PAGE 전기영동한 후, PVDF membrane에 옮겨 5% skim milk buffer로 blocking하였다. 상기 정제된 scFv 항체를 1.0㎍/㎕씩 첨가하여 1시간동안 결합시켰다. 결합하지 않은 scFv 항체를 제거하고, 검출을 위해서 항원과 결합한 scFv에 HRP(horseradish peroxidase)가 연결된 Anti-HA 이차 항체를 반응시킨 후, 기질로 ECL reagent를 이용하여 암실에서 X-ray 필름에 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 WRS 전장 단백질 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였다.

상기 Western blot을 수행하여서 너무 약한 band(faint band), non-specific band(double band) 등의 결과를 얻은 scFv clone을 제거하였다. 다수의 실험 대상 scFv 클론 중에서도, 도 1은 대표적인 몇 개의 주요 후보군 scFv 클론들의 결합특이성 비교 결과를 보여준다.

전술한 다양한 단계 및 반복실험을 통해, 3C6 scFv clone이 최종 선발되었다. 도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명의 3C6 scFv는 모든 암세포의 종류에 관계없이 WRS 단백질에 매우 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.

서열분석결과 3C6 scFv는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, 상기 서열은 중간에 서열번호 17의 링커서열을 포함하고 있었다. 이에 따라 3C6의 VH는 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었으며, 3C6의 VL은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어져 있었다. 상기 3C6의 VH 및 VL에 포함된 각각의 CDR 서열을 분석한 결과, 상기 3C6의 VH는 서열번호 1로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 3으로 표시되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 5로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하며, 상기 3C6의 VL은 서열번호 7로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 9로 표시되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 11로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하고 있었다.

실시예 2 : scFv 항체의 IgG로의 전환 및 특이적 결합력 평가

2-1. scFv 항체의 IgG로의 전환

선별된 scFv 항체는 heavy chain vector와 light chain vector에 insertion 하여 plasmid DNA vector 를 cloning 하였다. 먼저 클론(3C6) phage의 유전체에서 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 PCR로 증폭하였다. 상기 scFv의 VH 영역의 유전자를 증폭하는데 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다: Forward(CAG TGT ACA CTC CGA GGT GCA GCT GTT, 서열번호 23), Reverse(GCC GGG CCC TTG GTG GAG GCC ACG GTG ACC AGT, 서열번호 24). scFv의 VL 영역의 유전자를 증폭하는데 사용한 프라이머의 염기서열은 다음과 같다:Forward(AAG CGG CCG CCA CCA TGG GAT GGA GCT GTA TCA TCC TCT TCT TGG TAG CAA CAG CTA CAG GTG TAC ACT CCC AGT CTG TGC TGA CTC AG, 서열번호 25), Reverse(GAG CGT ACG TAG GAC CGT CAG CTT GGT, 서열번호 26)

각각의 phage DNA(50ng)를 주형으로 하여 상기 프라이머(각각 10pmol)를 이용하여 95℃/3min; 95℃/30sec, 60℃/30sec, 72℃/30sec, 30 cycles; 72℃/5min의 조건으로 PCR을 수행하여 3C6 scFv의 VH 또는 VL 유전자를 증폭하였다. PCR 산물은 제한효소를 이용하여 IgG 생산에 사용되는 벡터인 pcDNA3.4 벡터에 삽입하였다. IgG의 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)의 단백질은 별개의 플라스미드에서 개별적으로 발현되도록 하였다.

상기에서 제조된, scFv의 가변영역을 포함하는 IgG의 경쇄와 중쇄를 암호화하는 DNA를 포함하는 벡터는 HEK293F 세포에 공동형질전환시켜 경쇄와 중쇄가 세포 안에서 함께 발현되도록 하였다. 형질전환된 HEK293F 세포를 37℃, 8% CO₂조건에서 7일 동안 배양하고, 상층액을 수득하였다. 상층액은 cellulose acetate membrane filter(pore size 0.22μm, Corning)로 여과하고 CaptivA™ PriMAB protein A column(Repligen, USA)을 사용하여 정제하였다. 정제 colume에 protein A agarose beads를 넣어, binding buffer (1X PBS)로 beads를 활성화 한 후, 상층액을 넣어서 발현된 IgG 항체를 beads에 결합시켰다. 수득한 항체 농도는 BCA kit (Pierce, 23225)를 이용하여 측정하였고, Bioanalyzer(Agilent 2100 Bioanalyzer)를 이용하여 환원과 비환원 조건에서 생산된 IgG 항체 단백질을 분석하였다.

2-2. 전환된 IgG의 WRS 결합력 비교 평가-Indirect ELISA

FL-WRS 단백질과 후부군 IgG 항체들(3C6를 포함하여 주요 후보군 IgG)의 결합력을 확인하고자 indirect ELISA 실험을 수행하였다. 실험방법은 간략히 다음과 같다. 1X PBS에 FL-WRS 단백질을 1ug/ml로 넣고, 96well plate에 100ul 씩 coating하였다. 비특이적 결합을 방지하기 위해 2% BSA를 포함하는 1X PBST buffer로 blocking을 하였다. 1X PBST buffer에 각각의 IgG 항체를 1000~62.5 ng/ml 로 희석하여 100ul씩 넣어 반응시켰다. 1X PBST로 washing 후, 1X PBST에 goat anti-rabbit HRP(roche) 혹은 goat anti-human HRP(roche) 항체를 1/10,000으로 100ul 넣어서 반응시켰다. 3번의 washing 후, Tetramethylbenzimidine(TMB, Thermo scientific)을 이용하여 발색 반응한 후, H₂SO₄(1M)을 이용하여 발색 반응을 중지시키고 ELISA reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 2는 대표적인 후보군들에 대한 결합력 비교 실험 결과를 보여준다. 다른 후보군 항체와 비교하여 본원 발명의 3C6 IgG 항체는 FL-WRS 단백질과 결합력이 현저히 높은 것을 확인하였다.

2-3. 전환된 IgG의 WRS 결합력 검증 _ 웨스턴 블롯 및 면역침전

상기 최종 선발된 3C6 IgG의 WRS에 대한 결합력을 웨스턴블롯(WB) 및 면역침전 실험 방식으로 검증하였다. 상기 실시예 1-4에 기재된 것과 같은 방식으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 면역침전(immunoprecipitation) 실험은 간략히 다음과 같은 방법으로 수행되었다. HEK293F cell lysate 1mg에 anti-WRS(3C6) IgG 5ug와 normal IgG를 각각 tube에 넣어서 결합시켰다. Tube에 Protein A agarose beads를 넣어서 항체와 결합하도록 하였다. Precipitation을 한 후, 1X PBS로 3번 washing을 하였다. 2X sample buffer를 넣고 boiling을 하였다. 8%의 acrylamide gel에 input (HEK293 cell lysate 30ug), normal IgG, ani-WRS(3C6) IgG 순으로 loading 하였다. PVDF membrane에 transfer를 진행한 후, 5% skim milk를 포함하는 1X PBST buffer로 1시간 동안 blocking을 진행하였다. Rabbit Poly-WRS 항체 1ug을 1X PBST(+5% skim milk) buffer에 첨가하여, 4℃에서 O/N으로 반응시켰다. 다음날 3번의 1X PBST buffer로 washing 후, secondary 항체 goat anti-rabbit HRP(roche) 항체를 1X PBST(+5% skim milk)에 1/1,000으로 첨가하여, 상온에서 1시간 반응시켰다. 3번의 washing 후, ECL solution 처리 후, X-ray film에 현상하였다.

웨스턴 블롯 및 면역침전 실험 결과 본 발명의 3C6 IgG 항체는, 다른 항체와 비교하여도 endogenous FL-WRS에 대한 높은 결합량을 나타냈다. 또한 FL-WRS 단백질의 unique한 특정 peptide 서열이 확인되어, WRS(3C6) 항체는 FL-WRS(데이터 미도시). 또한 ARS family의 다른 단백질과의 교차반응성이 indirect ELISA 통하여 없는 것을 확인하였다(도 3 참조).

2-4. 전환된 IgG의 WRS 특이적 결합력 검증 _ SPR

정제한 3C6 IgG 항체와 FL-WRS 항원에 대한 정량적인 결합력을 Biacore2000 SPR(Surface Plasmon Resonance)(GE healthcare, 미국) 바이오센서를 이용하여 측정하였다. FL-WRS를 센서칩 (sensor chip CM5)(GE healthcare,미국)에 고정시킨 후, PBS buffer에 순차적으로 희석한 항체 단백질(6.25 ~ 100 nM)을 3분 동안 30 ㎕/min 속도로 흘려주고, 30mM NaOH를 3분 동안 30 ㎕/min 속도로 흘려줌으로써 항원에 결합된 단백질 해리를 유도하였다. 대조군으로서 mock IgG를 사용하였다. 구체적인 실험 조건은 다음과 같다;

Immobilized Antigen : WRS

Immobilized level : 48 RU

Antibody : 3C6 IgG

Running buffer : PBS buffer

Regeneration : 30mM NaOH (flow 30 ul / min 10 sec)

	ka (1/Ms)	kd (1/s)	KD (M)
3C6 IgG	6.41E+04	0.001104	1.72E-08

K_D(Equilibrium dissociation rate constant), k_a (association rate constant), k_d(dissociation rate constant)

상기 표 1은 Biacore 2000 SPR을 이용하여 측정한 3C6 IgG의 운동속도 상수와 평형 해리상수를 나타낸 것이다. BIA evaluation ver.3.2 소프트웨어를 이용하여 친화도를 운동속도 상수 (ka 및 kd)와 평형해리상수(KD)로 얻었다( K_D[M] = k_d[M^-1s^-1] / K_a [s^-1], ka값이 클수록, Kd값은 작을수록, KD값은 단위가 작을수록 강한 Affinity이다.). 상기 표 1에서 보는 바와 같이 본 발명의 3C6 IgG는 WRS 에 특이적으로 높은 결합력을 가짐을 확인하였다. 대조군인 mock IgG에서는 binding signal이 없었다.

실시예 3 : WRS에 의해 유도되는 세포 내 염증 억제 효과 확인

3C6 IgG 항체가 세포 내에서 실질적으로 FL-WRS를 비활성화(neutralizing) 할 수 있는 알아보고자, 분화된 THP-1 세포를 이용하여 neutralizing effect 실험을 수행하였다. THP-1 세포를 5x10⁵ 개수로 24 well plate seeding 하고, PMA 를 5 ng/ml 농도로 처리하였다. Human monocyte에서 macrophage 세포로 분화시키기 위해 48 시간 동안 incubation 을 하였다. 48 시간 후에 serum free media로 washing 후 complete media를 넣어 주었다. 세포의 60% confluence 확인 후, 분화된 macrophage cell 을 24 시간동안 incubation 하였다.

Human WRS 단백질(서열번호 21)과 3C6 IgG 를 준비하고, serum free media로 washing 후, 분화된 THP-1 세포에 처리하였다. 대조군으로서 LPS 그룹, human WRS 그룹과 실험군으로서 human WRS + 3C6 IgG 그룹을 나누어 실험하였으며, 각 첨가 물질은 3시간동안 처리하였다. Human WRS protein은 100nM로 처리 되었으며, LPS(lipopolysaccharide/ Sigma, cat#: 297-473-0)는 100ng/ml로 처리 되었고, 3C6 항체는 1ng/ml부터 점차 농도를 증가시키며 처리되었다. 3시간 후, 상층액을 수집하여 1800 rpm으로 15 분 동안 원심분리를 한 후, Human TNF-a ELISA set (RUO/ BDoptEIATM)을 이용하여 TNF-a 양을 분석하였다(도 4 및 도 5 참조).

TNF-α(종양 괴사 인자 알파)는 pro-inflammatory cytokine 으로 염증반응에 포함되는 사이토카인이다. TNF-α는 주로 활성화된 대식세포(macrophage)에 의해 분비된다고 알려져 있다. TNF-α는 체내 발열원으로써, 열이 나게 유도하거나, 세포 자살을 유도하거나, IL(interlukin)-1과 IL-6의 생산을 통해 패혈증을 유발하는 능력이 있다고 알려져 있다. 도 4에서 보는 바와 같이 대식세포에 LPS 또는 human WRS 단백질을 처리하자 TNF-α 분비가 유도되었다. human WRS 처리에 의한 TNF-α 수준은 LPS 처리군과 유사하였다. 여기에 본 발명의 3C6 IgG 항체를 첨가한 결과, 다른 후보군과는 달리 본 발명의 항체에 의해서 특이적으로 TNF-α의 분비가 현저히 줄어들었으며, 이는 본 발명의 항체가 human WRS 단백질을 비활성(neutralizing)시키는 효과가 현저함을 의미한다. 또한 도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 항체는 EC₅₀이 35pM 로 우수한 것을 확인하였다. 종합하여 본 발명의 3C6 IgG 항체는 human WRS 단백질과 특이적으로 결합하는 효과가 현저하며, 특이적으로 대식세포에서의 inflammation 역할을 억제한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 트립토파닐-티알엔에이 합성효소(tryptophanyl-tRNA synthetase, WRS) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 명세서에서 기재하는 특정 CDR(상보성 결정부위) 서열을 가지며 인간 트립토파닐-tRNA 합성효소에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편과 이의 용도에 대한 것이다.

본 발명 특유의 항체 또는 그 단편은 WRS에 특이적으로 결합하는 능력이 매우 우수하며, 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어, WRS 검출 및 억제 능력이 우수하므로 WRS 검출 및 WRS가 관련된 질환인 암, 감염 질환 또는 감염 합병증의 진단과 항염증 목적으로 효과적으로 사용될 수 있으므로, 산업상 이용가능성이 높다.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Antibody specifically binding to tryptophanyl-tRNA synthetase protein and uses thereof <130> NP19-0078 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VH CDR1 <400> 1 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VH CDR1 <400> 2 agttatgata tgagc 15 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VH CDR2 <400> 3 Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 4 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VH CDR2 <400> 4 gcgatctctt ctggtggtag tagtatatat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VH CDR3 <400> 5 Asp Val Ala Trp Asp Met Leu Gly Asp Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VH CDR3 <400> 6 gatgttgctt gggatatgct tggggatttc gactac 36 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VL CDR1 <400> 7 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr 1 5 10 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VL CDR1 <400> 8 tcttcatcta atattggcag taattatgtc tac 33 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VL CDR2 <400> 9 Ala Asn Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VL CDR2 <400> 10 gctaatagtc atcggccaag c 21 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VL CDR3 <400> 11 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala 1 5 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VL CDR3 <400> 12 ggtgcttggg atgatagcct gagtgct 27 <210> 13 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VH <400> 13 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val Ala Trp Asp Met Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VH <400> 14 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttctg gtggtagtag tatatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatgtt 300 gcttgggata tgcttgggga tttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tca 363 <210> 15 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VL <400> 15 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 <210> 16 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 VL <400> 16 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaattatg tctactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gctaatagtc atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatg atagcctgag tgcttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtc 327 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker for scFv <400> 17 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 18 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker for scFv <400> 18 ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggatcc ggcggtggcg gatcg 45 <210> 19 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 scFv (VH+linker+VL) <400> 19 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val Ala Trp Asp Met Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro 130 135 140 Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu 165 170 175 Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Asn Ser His Arg Pro 180 185 190 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Thr Val 245 <210> 20 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3C6 scFv (VH+linker+VL) <400> 20 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atctcttctg gtggtagtag tatatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatgtt 300 gcttgggata tgcttgggga tttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tcaggtggag gcggttcagg cggaggtgga tccggcggtg gcggatcgca gtctgtgctg 420 actcagccac cctcagcgtc tgggaccccc gggcagaggg tcaccatctc ttgtactggc 480 tcttcatcta atattggcag taattatgtc tactggtacc agcagctccc aggaacggcc 540 cccaaactcc tcatctatgc taatagtcat cggccaagcg gggtccctga ccgattctct 600 ggctccaagt ctggcacctc agcctccctg gccatcagtg ggctccggtc cgaggatgag 660 gctgattatt actgtggtgc ttgggatgat agcctgagtg cttatgtctt cggcggaggc 720 accaagctga cggtc 735 <210> 21 <211> 471 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) full length(NCBI Reference Sequence: NP_004175.2) <400> 21 Met Pro Asn Ser Glu Pro Ala Ser Leu Leu Glu Leu Phe Asn Ser Ile 1 5 10 15 Ala Thr Gln Gly Glu Leu Val Arg Ser Leu Lys Ala Gly Asn Ala Ser 20 25 30 Lys Asp Glu Ile Asp Ser Ala Val Lys Met Leu Val Ser Leu Lys Met 35 40 45 Ser Tyr Lys Ala Ala Ala Gly Glu Asp Tyr Lys Ala Asp Cys Pro Pro 50 55 60 Gly Asn Pro Ala Pro Thr Ser Asn His Gly Pro Asp Ala Thr Glu Ala 65 70 75 80 Glu Glu Asp Phe Val Asp Pro Trp Thr Val Gln Thr Ser Ser Ala Lys 85 90 95 Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly Ser Ser Lys Ile 100 105 110 Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr Gly Gln Arg Pro 115 120 125 His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His Arg Asp Met Asn 130 135 140 Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe Tyr Leu Tyr Thr 145 150 155 160 Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly His Leu Ile Pro 165 170 175 Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn Val Pro Leu Val 180 185 190 Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys Asp Leu Thr Leu 195 200 205 Asp Gln Ala Tyr Ser Tyr Ala Val Glu Asn Ala Lys Asp Ile Ile Ala 210 215 220 Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser Asp Leu Asp Tyr 225 230 235 240 Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val Lys Ile Gln Lys 245 250 255 His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly Phe Thr Asp Ser 260 265 270 Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln Ala Ala Pro Ser 275 280 285 Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg Thr Asp Ile Gln 290 295 300 Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr Phe Arg Met Thr 305 310 315 320 Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro Ala Leu Leu His 325 330 335 Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr Lys Met Ser Ala 340 345 350 Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr Ala Lys Gln Ile 355 360 365 Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly Arg Asp Thr Ile 370 375 380 Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val Asp Val Ser Phe 385 390 395 400 Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys Leu Glu Gln Ile 405 410 415 Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly Glu Leu Lys Lys 420 425 430 Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu His Gln Ala Arg 435 440 445 Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe Met Thr Pro Arg 450 455 460 Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln 465 470 <210> 22 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WRS(tryptophanyl-tRNA synthetase) full length(NCBI Reference Sequence: NM_004184.3) <400> 22 atgcccaaca gtgagcccgc atctctgctg gagctgttca acagcatcgc cacacaaggg 60 gagctcgtaa ggtccctcaa agcgggaaat gcgtcaaagg atgaaattga ttctgcagta 120 aagatgttgg tgtcattaaa aatgagctac aaagctgccg cgggggagga ttacaaggct 180 gactgtcctc cagggaaccc agcacctacc agtaatcatg gcccagatgc cacagaagct 240 gaagaggatt ttgtggaccc atggacagta cagacaagca gtgcaaaagg catagactac 300 gataagctca ttgttcggtt tggaagtagt aaaattgaca aagagctaat aaaccgaata 360 gagagagcca ccggccaaag accacaccac ttcctgcgca gaggcatctt cttctcacac 420 agagatatga atcaggttct tgatgcctat gaaaataaga agccatttta tctgtacacg 480 ggccggggcc cctcttctga agcaatgcat gtaggtcacc tcattccatt tattttcaca 540 aagtggctcc aggatgtatt taacgtgccc ttggtcatcc agatgacgga tgacgagaag 600 tatctgtgga aggacctgac cctggaccag gcctatagct atgctgtgga gaatgccaag 660 gacatcatcg cctgtggctt tgacatcaac aagactttca tattctctga cctggactac 720 atggggatga gctcaggttt ctacaaaaat gtggtgaaga ttcaaaagca tgttaccttc 780 aaccaagtga aaggcatttt cggcttcact gacagcgact gcattgggaa gatcagtttt 840 cctgccatcc aggctgctcc ctccttcagc aactcattcc cacagatctt ccgagacagg 900 acggatatcc agtgccttat cccatgtgcc attgaccagg atccttactt tagaatgaca 960 agggacgtcg cccccaggat cggctatcct aaaccagccc tgctgcactc caccttcttc 1020 ccagccctgc agggcgccca gaccaaaatg agtgccagcg accccaactc ctccatcttc 1080 ctcaccgaca cggccaagca gatcaaaacc aaggtcaata agcatgcgtt ttctggaggg 1140 agagacacca tcgaggagca caggcagttt gggggcaact gtgatgtgga cgtgtctttc 1200 atgtacctga ccttcttcct cgaggacgac gacaagctcg agcagatcag gaaggattac 1260 accagcggag ccatgctcac cggtgagctc aagaaggcac tcatagaggt tctgcagccc 1320 ttgatcgcag agcaccaggc ccggcgcaag gaggtcacgg atgagatagt gaaagagttc 1380 atgactcccc ggaagctgtc cttcgacttt cag 1413 <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VH of scFv <400> 23 cagtgtacac tccgaggtgc agctgtt 27 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VH of scFv <400> 24 gccgggccct tggtggaggc cacggtgacc agt 33 <210> 25 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for VL of scFv <400> 25 aagcggccgc caccatggga tggagctgta tcatcctctt cttggtagca acagctacag 60 gtgtacactc ccagtctgtg ctgactcag 89 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for VL of scFv <400> 26 gagcgtacgt aggaccgtca gcttggt 27

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 중쇄가변영역(VH) 및
서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 1(CDR1); 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 2(CDR2); 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 상보성 결정부위 3(CDR3)을 포함하는 경쇄가변영역(VL)
을 포함하는, 트립토파닐-tRNA 합성효소(WRS, tryptophanyl-tRNA synthetase)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편.
제1항에 있어서, 상기 중쇄가변영역은 서열번호 13으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가변영역은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE 및 IgD로 이루어진 군에서 선택되며, 상기 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제3항에 있어서, 상기 scFv는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드.
제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제6항의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
제7항의 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계; 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 WRS에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법.
제1항의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는, 트립토파닐-tRNA 합성효소의 특이적 검출 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그 단편을 포함하는 암 진단용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그 단편을 포함하는 감염 질환 또는 감염 합병증 진단용 조성물.
제11항에 있어서, 상기 감염 질환은 감염성 염증 질환인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
제12항에 있어서, 상기 감염성 염증 질환은 패혈증 또는 패혈성 쇼크인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 항체 또는 그 단편을 포함하는 항염증용 약학적 조성물.