KR20150077887A

KR20150077887A - 항 nrs 모노클로날 항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20150077887A
Application number: KR1020130166816A
Authority: KR
Inventors: 김성훈; 최연식; 심현보; 이남주; 박민화
Original assignee: 재단법인 의약바이오컨버젼스연구단; 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-30
Filing date: 2013-12-30
Publication date: 2015-07-08

Abstract

본 발명은 NRS(asparaginyl-tRNA synthetase)에 선택적으로 결합하는 항 NRS 항체 및 이의 용도에 관한 것으로 보다 구체적으로는 인간 NRS에 결합하는 항체 또는 그 단편, 이의 생산방법 및 이를 포함하는 자가면역질환 및 염증성 질환 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 NRS에 특이적으로 결합하며, 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어 NRS 검출 및 억제가 가능하므로 NRS 검출 및 NRS가 관련된 질환인 자가면역질환 및 염증성질환의 진단 목적으로 사용될 수 있다.

Description

항 NRS 모노클로날 항체 및 이의 용도{Anti-NRS monoclonal antibody and uses thereof}

본 발명은 NRS(asparaginyl-tRNA synthetase)에 선택적으로 결합하는 항 NRS 항체 및 이의 용도에 관한 것으로 보다 구체적으로는 인간 NRS에 결합하는 항체 또는 그 단편, 이의 생산방법 및 이를 포함하는 자가면역질환 및 염증성 질환의 진단용 조성물에 관한 것이다.

Aminoacyl-tRNA synthetase(ARS)는 특정 아미노산을 그 해당하는 tRNA에 붙여주는 역할을 하는 효소이며. 고등생물의 경우 아미노산 종류에 따른 20 개의 효소외에 AIMP1(p43), (AIMP2)p38, (AIMP3)p18 등 multisynthetase complex 형성에 관여하는 3종류를 포함하여 23종의 효소로 구성되어 있으며 multisynthetase complex에 참여하는 효소외에 몇몇은 free form 형태로도 존재한다. 그러나 최근에 들어 기본적인 기능외에 특정 환경에서 다양한 다른 활성기능을 가지고 있음이 보고 되었는데 NRS (asparaginyl-tRNA synthetase)가 그중의 하나이다. NRS는 근염이나 제1형 당뇨와 같은 자가면역 질환에 있어 자가항체가 존재함이 보고 되었으며 염증성 싸이토카인의 활성을 보여 림프구(lymphocytes)의 이동, 단핵구(monocytes)및 미성숙 수지상세포 (immature dendritic cells)등을 활성화시킨다.(제1형당뇨 질환: 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0090003호, 근염질환: Howard, O.M., et al Histidyl-tRNA synthetase and asparaginyl-tRNA synthetase, autoantigens in myositis, activate chemokine receptors on T lymphocytes and immature dendritic cells. (2002) J. Exp. Med. 196, 781.791) 또한 NRS는 단백질의 당화에 관여하여 세포표면 단백질이나 분비단백질의 활성에 영향을 미칠 수 있는 가능성이 제시되고 있는데 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor-2)의한 골모세포(osteoblst)의 성장에 관련 있음이 보고되었다. (Park SJ et al Fibroblast growth factor 2-induced cytoplasmic asparaginyl-tRNA synthetasepromotes survival of osteoblasts by regulating anti-apoptotic PI3K/Akt signalin(2009) Bone 45, 9941003)

이와 같은 결과로 NRS는 자가면역질환을 비롯한 기타 면역관련 질환 및 염증성 질환 환자의 혈청내에 존재 할 수 있으며 중요한 진단 바이오마커로 사용될 수 있음을 보여준다.

하지만 NRS를 비롯한 ARS들에 대한 바이오마커로서의 중요성에도 불구하고 ARS들은 단백질 구조상 유사한 점이 많아 동물로부터 면역반응으로 얻어지는 항체는 다른 ARS에도 결합하는 교차 반응을 보이고 아예 고 감도의 항체가 생성되지 않은 경우가 많다. 본 발명의 항체는 우수한 감도와 ARS간 교차반응이 없는 점에서 연구용 뿐만 아니라 진단용 및 산업상 이용가능성이 높은 항체라 예상된다.

본 발명자들은 NRS에 특이적으로 결합하는 항체를 연구하던 중, 파지디스플레이 방법으로 만들어진 라이브러리에서 NRS에 특이적으로 결합하는 단편들을 찾아내고, 이의 서열 및 결합특이성을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 인간 NRS에 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 인간 NRS에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 NRS 특이적 검출 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 염증성질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체;

ii) 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3를 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3를 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체;

iii) 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2, 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2, 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체;

iv) 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2, 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2, 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체; 및

v) 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 58로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2, 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 60으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 61로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2, 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체;

로 이루어지는 군에서 선택된 인간 NRS에 결합하는 항체 또는 그 단편을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 NRS에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 NRS 특이적 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체;

ii) 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체;

아스파라지닐-tRNA 합성효소(NRS, asparaginyl-tRNA synthetase)는 아스파라진(Asn)과 tRNA의 결합을 촉진시키는 효소로 ARS(Aminoacyl-tRNA synthetase)의 일종이다. 본 발명의 NRS는 일반적으로 천연형 또는 재조합 인간 NRS, 및 인간 NRS의 비-인간 동족체를 나타낸다.

"항체", "항 NRS 항체", "인간화 항 NRS 항체" 및 "변형 인간화 항 NRS 항체", "anti-NRS antibody"라는 용어는 본 발명에서 가장 광의의 의미로 사용되며, 구체적으로 단일클론 항체(모노클로날 항체, 완전 길이 단일클론 항체 포함), 다클론 항체(폴리클로날 항체), 다중특이 항체(예를 들어 이중특이 항체), 및 항체 단편(예를 들어 가변 영역 및 목적하는 생물 활성(예를 들어 NRS와의 결합)을 나타내는 항체의 다른 부분)을 포함한다.

본 발명의 항체는 NRS와 선택적으로 결합할 수 있도록 특정 아미노산 서열이 경쇄 및 중쇄 CDR에 포함되어 있는 항체로 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 모두 포함하며, 바람직하게는 모노클로날 항체일 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간항체를 모두 포함하며 바람직하게는 인간항체 일 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체는 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내며, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 천연적으로 존재하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 에피토프에 매우 특이적으로 결합한다.

"모노클로날"이라는 말은 항체가 실질적인 상동성 집단으로부터 수득되는 것과 같이 항체의 특성을 나타내는 말이며, 반드시 항체를 특정 방법에 의해 생산해야 한다는 것은 아니다.

예를 들어, 본 발명의 모노클로날 항체는 문헌[참조: Kohler et al. (1975) Nature 256: 495]에 처음 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(참조: 미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다. 또한, 예를 들어, 문헌[참조: Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 및 Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 및 Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731]에 기술된 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.

본 발명의 항체는 구체적으로 키메라 항체를 포함하며, 이 경우 중쇄 및/또는 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 기원하거나 또는 특정 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 보이지만, 나머지 부분은 본 발명의 항체가 바람직한 생물학적 활성(예를 들어 NRS와의 선택적 결합)을 나타내는 한, 다른 종으로부터 기원하거나 또는 다른 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성을 나타내는 것이어도 무방하다[참조: 미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855].

인간화된 항체는 인간 및 비-인간(예: 쥐, 랫트) 항체의 서열을 모두 포함하는 항체로 일반적으로, 에피토프와 결합하는 부위(CDR)를 제외한 나머지 부분은 인간 항체의 것이며, 에피토프와 결합하는 부위(CDR)는 비-인간 유래의 서열을 포함할 수 있다.

완전한 인간항체는 사람 면역글로불린 단백질 서열만을 포함하는 항체를 말하며, 마우스, 마우스 세포, 또는 마우스 세포로부터 기원한 하이브리도마에서 생산하거나, 파지 디스플레이 방법으로 생산할 수 있다.

생체에서 생산되는 천연 항체는 통상적으로, 2개의 동일한 경쇄 (L)와 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 이종-사량체성 당단백질이다. 각 경쇄는 1개의 공유 디설파이드 결합에 의해 중쇄와 연결되지만, 디설파이드 연쇄수는 상이한 면역글로불린 이소형의 중쇄들 간에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 이격된 쇄내 디설파이드 브릿지를 또한 갖고 있다. 각 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(VH)에 이어 수 많은 불변 도메인을 갖는다. 각 경쇄는 한 말단에 가변 도메인(VL)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 갖는데; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특별한 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 간에 계면을 형성하는 것으로 여겨진다.

항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 영역은 "VH" 또는"V_H"로 기재하며, 경쇄의 가변 영역은 "VL" 또는 "V_L"로 기재한다. 이들 도메인은 일반적으로, 항체의 가장 가변 부분이고, 항원 결합 부위를 포함한다.

"초가변성 (hypervariable)"이란 용어는 상기 가변 영역 내의 몇몇 서열들이 항체들간 서열에 있어서 광범위하게 상이하며 그의 특이적인 항원 결정인자들에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 직접적으로 관련되는 잔기들을 포함한다는 사실을 지칭한다.

경쇄 및 중쇄 가변 영역 모두에 있어서 초가변성은 상보성 결정부위(CDR) 또는 초가변성 루프(HVL)로서 공지된 3 개의 분절들에 집중된다. CDR은 문헌 [Kabat 등, 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.]에서의 서열 비교에 의해 한정되는 반면, HVL은 문헌 [Chothia and Le나 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917]에 개시된 바와 같이, 상기 가변 영역의 3 차원 구조에 따라 구조적으로 한정된다. 카바트 (Kabat)에 의해 한정된 바와 같이, CDR-L1은 경쇄 가변 영역에서 대략 잔기 24-34에, CDR-L2는 대략 잔기 50-56에, CDRL3은 대략 잔기 89-97에 위치하며; CDR-H1은 중쇄 가변 영역에서 대략 잔기 31-35에, CDR-H2는 대략 잔기 50-65에, CDR-H3은 대략 잔기 95-102에 위치한다.

상기 중쇄 및 경쇄 각각 내의 3 개의 CDR들은 틀 부위 (FR)에 의해 분리되며, 상기 부위는 덜 가변적인 경향이 있는 서열들을 포함한다. 상기 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노 말단에서부터 카복시 말단까지, 상기 FR 및 CDR은 하기의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 상기 FR의 큰 β 시트 배치는 상기 각각의 쇄 내부의 CDR을 서로뿐만 아니라 다른 쇄로부터의 CDR에 가깝게 한다. 생성되는 형태는 항원 결합 부위에 기여하지만 (Kabat 등, 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 참조), 모든 CDR 잔기들이 항원 결합에 직접 관여할 필요는 없다.

본 발명의 항체는 경쇄 및 중쇄 가변영역에 속하는 각 CDR이 각각 특정 서열을 포함하여, NRS와 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하며, 구체적으로 본 발명의 항체는 i) 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2 및 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체;

로 이루어진 군에서 선택된 항체일 수 있다.

본 발명의 항체는 바람직하게는 특정 경쇄가변영역 및 중쇄가변영역을 포함할 수 있으며, 구체적으로

i) 경쇄가변영역으로 서열번호 13의 136 번째 내지 246 번째 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄가변영역으로 서열번호 13의 1 번째 내지 120 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체;

ii) 경쇄가변영역으로 서열번호 27의 135 번째 내지 244 번째 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄가변영역으로 서열번호 27의 1 번째 내지 119 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체;

iii) 경쇄가변영역으로 서열번호 41의 132 번째 내지 241 번째 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄가변영역으로 서열번호 41의 1 번째 내지 116 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체;

iv) 경쇄가변영역으로 서열번호 55의 135 번째 내지 244 번째 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄가변영역으로 서열번호 55의 1 번째 내지 119 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및

v) 경쇄가변영역으로 서열번호 69의 132 번째 내지 241 번째 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄가변영역으로 서열번호 69의 1 번째 내지 116 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체;

로 이루어진 군에서 선택된 항체일 수 있다.

본 발명의 항체는 서열번호 13, 서열번호 27, 서열번호 41, 서열번호 55 및 서열번호 69

로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체일 수 있다.

본 발명의 항체 단편, 단편 또는 “그 단편”은 모 항체의 결합 특이성의 적어도 일부를 보유하는, 전형적으로 적어도 모 항체의 항원 결합의 일부 또는 가변 영역(예를 들어, 하나 이상의 CDR)를 포함하는 항체의 단편 또는 유도체를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 일본쇄(single-chain) 항체 분자, 예를 들어, sc-Fv; 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전형적으로, 항체 단편 또는 유도체는 해당 활성이 몰 기준으로 표현되는 경우 이의 NRS 결합 활성의 10% 이상을 보유한다. 바람직하게는, 항체 단편 또는 유도체는 모 항체로서의 NRS 결합 친화도의 적어도 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 100% 또는 그 이상을 보유한다. 또한, NRS 항체 단편은 이의 생물학적 활성을 실질적으로 변경하지 않는 보존적 아미노산 치환(항체의 보존적 변이체라고 함)을 포함할 수 있다. 본 발명의 "결합 화합물"은 항체 및 그 단편 둘 다를 나타낸다.

Fab는 하나의 경쇄, 및 하나의 중쇄의 CH1(제1 불변 도메인) 및 가변 영역으로 이루어진다. Fab 분자의 중쇄는 다른 중쇄 분자와 디설파이드 결합을 형성할 수 없다.

Fc 영역은 항체의 CH1 및 CH2 도메인을 포함하는 두 개의 중쇄 단편을 함유한다. 두 개의 중쇄 단편은 두 개 이상의 디설파이드 결합에 의해 및 CH3 도메인의 소수성 상호작용에 의해 함께 유지된다.

Fab'은 하나의 경쇄, 및 VH 도메인과 CH1 도메인 및 CH1과 CH2 도메인 사이의 영역을 함유하여 쇄내디설파이드 결합이 두 개의 Fab' 단편의 두 개의 중쇄 사이에 형성되어 F(ab')₂ 분자를 형성하도록 하는 하나의 중쇄의 일부를 함유한다.

F(ab')₂는 두 개의 경쇄, 및 쇄내 디설파이드 결합이 두 개의 중쇄 사이에 형성되도록 CH1 및 CH2 도메인 사이의 고정 영역의 일부를 함유하는 두 개의 중쇄를 함유한다. 따라서, F(ab')₂ 단편은 두 개의 중쇄 사이의 디설파이드 결합에 의해 함께 유지되는 두 개의 Fab' 단편으로 이루어진다.

Fv는 중쇄와 경쇄 가변 영역을 모두 포함하지만, 고정 영역이 결여되어 있는 항체 단편이다.

일본쇄(single-chain) Fv 또는 scFv는 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 항체 단편을 나타내며, 여기서, 이들 도메인은 단일 폴리펩타이드 쇄내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위해 바람직한 구조를 형성하도록 하는, VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. scFv의 개요에 대해서는 문헌[참조: Pluckthun (1994) THE PHARMACOLOGY OF MONOCLONAL ANTIBODIES, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315]을 참조한다. 또한, 국제 특허 공개공보 제WO 88/01649호 및 미국 특허 제4,946,778호 및 제5,260,203호를 참조한다.

디아바디는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미하며, 여기서 단편은 동일한 폴리펩티드쇄에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH) (VH-VL)을 포함한다. 동일 쇄 상의 2개 도메인 사이에 페어링을 허용하지 않는 짧은 링커를 사용하여, 도메인을 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 페어링시켜 2개의 항원-결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는, 예를 들어 유럽 특허 제404,097호; WO 93/11161; 및 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 보다 상세히 기재되어 있다.

선형 항체는 한 쌍의 항원 결합 부위를 형성하는 한 쌍의 직렬 Fd 단편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 항체를 지칭한다. 선형 항체는 예를 들어 문헌 [Zapata 등 1995, Protein Eng. 8 (10):1057-1062]에 개시된 바와 같이 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

"도메인 항체"는 중쇄의 가변 영역 또는 경쇄의 가변 영역만을 함유하는 면역 기능성 면역글로불린 단편이다.

몇몇 예에서, 두 개 이상의 VH 영역은 펩타이드 링커와 공유결합하여 2가 도메인 항체를 생성한다. 2가 도메인 항체의 두 개의 VH 영역은 동일하거나 상이한 항원을 표적화할 수 있다.

2가 항체는 두 개의 항원 결합 영역을 포함한다. 몇몇 예에서, 두 개의 결합 영역은 동일한 항원 특이성을 갖는다. 그러나, 2가 항체는 이특이적(bispecific)일 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 당업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어, 파지 디스플레이 방법 또는 효모 세포 표면 발현 시스템을 사용하여 생성될 수 있다. scFv를 제조하는 방법으로는 미국특허 제 4,946,778호 및 제 5,258,498호에 기재된 방법이 사용될 수 있으며, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합적으로 생성하기 위한 방법으로는 WO 92/22324 등에 기재된 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물로부터 유래한 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간, 생쥐, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말 또는 닭의 항체일 수 있다.

인간 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체로서, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 형질 이식되고 내재적 면역글로불린은 발현하지 않는 동물로부터 분리된 항체가 포함된다(미국특허 제 5,939,598호 참조).

본 발명의 항체는 효소, 형광 물질, 방사선 물질 및 단백질 등과 접합된 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 항체에 상기 물질을 접합하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 발명은 또한 상기한 바와 같은 본 발명에 따른 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

폴리뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산으로 기재될 수도 있으며, DNA분자들(예를 들어, cDNA 또는 유전체(genomic DNA), RNA 분자들(예를 들어, mRNA), 뉴클레오티드 유사체들을 사용하여 생성된 상기 DNA 또는 RNA의 유사체들(예를 들어, 펩티드 핵산들 및 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 유사체들) 및 이들의 하이브리드들이 포함된다. 상기 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥(single-stranded) 또는 이중-가닥(double-stranded)이 될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 것이면, 그 서열이 특별히 제한되지 아니하나 바람직하게는

i) 서열번호 7 내지 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드;

ii) 서열번호 21 내지 26으로 표시되는 폴리뉴클레오티드;

iii) 서열번호 35 내지 40으로 표시되는 폴리뉴클레오티드;

iv) 서열번호 49 내지 54로 표시되는 폴리뉴클레오티드; 및

v) 서열번호 63 내지 68로 표시되는 폴리뉴클레오티드;

로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 당업계에 잘 알려진 방법에 의하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄의 일부분 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열 또는 해당 아미노산 서열에 근거하여, 당분야에 잘 알려진 올리고뉴클레오타이드 합성기법, 예를 들어 중합효소 연쇄 반응 (PCR)법 등을 사용하여 합성할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터는 본 발명의 항체 또는 그 단편의 재조합 생산을 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 복제 또는 발현의 목적으로 이용되며, 일반적으로 시그날 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함한다.

본 발명의 벡터는 바람직하게는 발현벡터일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조절시퀀스, 예를 들어 프로모터에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다.

벡터의 일종인 플라스미드(plasmid)는 외부의 폴리뉴클레오티드 단편들이 결합될 수 있는 선형 또는 원형의 이중 나선의 DNA 분자를 의미한다. 벡터의 다른 형태는 바이러스성 벡터(viral vector ; 예를 들어, 복제-결핍 레트로바이러스(replication defective retroviruses), 아데노바이러스들 및 아데노-연관 바이러스들(adenoassociated viruses))이며, 여기에서 부가의 DNA 단편들은 상기 바이러스성 게놈(viral genome) 내로 도입될 수 있다. 특정의 벡터들은 그 안으로 이들이 도입되는 숙주세포(예를 들어, 박테리아 유래(bacterial origin) 및 에피좀의 포유류 벡터(episomal mammalian vectors)를 포함하는 박테리아성 벡터들(bacterial vectors)) 내에서의 자가복제(autonomous replication)를 할 수 있다. 다른 벡터들(예를 들어, 비-에피좀의 포유동물 벡터들(non-episomal mammalian vectors))이 숙주세포 내로의 도입에 의한 숙주세포의 게놈 내로 통합(integrated)되고 그리고 그에 의하여 상기 숙주 게놈과 함께 복제된다.

발현벡터(expression vector)는 선택된 폴리뉴클레오티드의 발현할 수 있는 벡터의 한 형태이다. 하나의 폴리뉴클레오티드 시퀀스는, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드 시퀀스의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 경우, 상기 조절 시퀀스(regulatory sequence)에 "작동가능하게 연결"된다. 상기 조절 시퀀스는 그것이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현(예를 들어, 수준, 타이밍 또는 발현의 위치)에 영향을 주는 서열이다. 상기 조절 시퀀스는, 예를 들어, 조절된 핵산에 직접적으로 또는 하나 또는 그 이상의 다른 분자들(예를 들어, 상기 조절 시퀀스 및/또는 상기 핵산에 결합하는 폴리펩티드들)의 작용을 통하여 그의 영향이 미치도록 할 수 있다. 상기 조절 시퀀스에는 프로모터(promoters), 인핸서(enhancers) 및 다른 발현 조절 요소들이 포함된다. 본 발명의 벡터는 바람직하게는 SfiI site에 scFv Insert가 포함된 pCom3x (phagmid) vector일 수 있다.

한편 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.

본 발명의 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현하는데 사용될 수 있는 세포면 그 종류는 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 세포는 숙주세포는 원핵생물(예를 들어 대장균), 진핵생물(예를 들어 효모 또는 다른 균류), 식물 세포(예를 들어 담배 또는 토마토 식물 세포), 동물 세포(예를 들어 인간 세포, 원숭이 세포, 햄스터(hamster) 세포, 집쥐 세포(rat cell), 생쥐 세포(mouse cell) 또는 곤충 세포) 또는 하이브리도마가 될 수 있다.

본 목적에 적합한 원핵생물은 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아새 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 에스케리치아 (Escherichia), 예를 들어 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무륨 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella), 및 바실리 (Bacilli), 예를 들어, 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스 (B. licheniformis), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 피. 애루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 본 발명의 세포는 본 발명의 벡터를 발현가능 한 것이면, 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 이. 콜라이, 이에 한정되지 아니하나 예를 들어, 이. 콜라이 ER2537, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325) 또는 LacZ가 발현 가능한 이. 콜라이일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 이. 콜라이 ER2537일 수 있다.

본 발명의 세포로서 진핵생물은 사카로마이세스 세레비지아에 (Saccharomyces cerevisiae)가 가장 흔히 사용된다. 그러나, 많은 다른 속, 종 및 균주, 이에 한정되지 아니하나, 예를 들어 쉬조사카로마이세스폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 숙주, 예를 들어 케이. 락티스(K.lactis), 케이. 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위커라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테르모톨레란스 ((K. thermotolerans) 및 케이. 마르시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia (EP 244,234)); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 쉬바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 쉬바니오마이세스 옥시덴탈리스(occidentalis); 및 필라멘트성 진균, 예를 들어 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (nidulans) 및 에이. 니거 (niger)가 사용가능 하다.

한편 본 발명의 세포는 동물세포 특히 척추동물 세포일 수 있다. 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 방법이 되었고 기술들이 폭넓게 이용가능하다. 이에 제한되지 아니하나, 유용한 포유동물 숙주 세포의 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 라이 (현탁 배양으로부터 서브클로닝된 293 또는 293 세포[Graham 등, 1977, J Gen Virol. 36: 59]), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL10), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR" (CHO, Urlaub 등, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; 예를 들어, DG44), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), 원숭이 신장 세포 (CVl ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 경부 암세포 (HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 랫트 간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐세포 (W138,ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065), 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51), TRI 세포(Mather 등, 1982, Annals NY. Acad. Sci. 383: 44-68 ), MRC 5 세포, FS4 세포, 인간 간암 세포주 (Hep G2), HEK 293 cell(human embryonic kidney cell) 및 Expi293F^TM cell일 수 있으며, 바람직하게는 CHO cell, HEK 293 cell(human embryonic kidney cell) 또는 Expi293F^TM cell일 수 있다.

본 발명의 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염(transfected)될 수 있는 배양된 세포이고, 이는 계속해서 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있다. 재조합 세포는 발현되어야 할 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 말한다. 본 발명의 세포는 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하나, 조절 시퀀스가 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되도록 상기 세포 내로 도입되지 않는 한 이를 원하는 수준으로 발현하지 않는 세포가 될 수 있다.

본 발명의 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용가능한 배지, 예컨대 햄 (Ham's) F1O (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO), 최소 필수 배지(MEM, Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), 및 둘베코 (Dulbecco's) 개질 이글 (Eagle's) 배지 (DMEM, Sigma-Aldrich Co.)가 세포를 배양하기에 적합하다. 상기 배지는 필요하다면 호르몬 및/또는 다른 성장 인자, 염, 완충액, 뉴클레오티드, 항생제, 미량 원소 및 글루코스 또는 동등 에너지원이 추가될 수 있다.

본 발명의 배지는 바람직하게는 SB (Bactotrytone 30g, yeast extract 20g, MOPS buffer 10g/L) Medium, FreeStyle^TM 293 Medium 또는 Expi293^TM Medium일 수 있다.

한편 본 발명은 상기 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 NRS에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법을 제공한다.

본 발명 생산방법의 세포에 대하여는 상기 기술한 바와 같으며, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 있다.

본 발명 생산방법의 폴리펩타이드는 본 발명의 항체 또는 그 단편 그 자체일 수 있으며, 본 발명의 항체 또는 그 단편 외 다른 아미노산서열이 추가로 결합된 것일 수 있다. 이 경우 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 본 발명의 항체 또는 그 단편으로부터 제거할 수 있다.

상기 배양은 상기 세포의 종류에 따라 배지조성 및 배양 조건이 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 기술자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.

상기 항체 분자는 세포의 세포질 내에 축적되거나, 세포로부터 분비되거나, 적절한 신호 서열에 의하여 페리플라즘 또는 세포외 배지 (supernatant)로 표적화 (targeted)될 수 있으며, 페리플라즘 또는 세포외 배지로 표적화되는 것이 바람직하다. 또한, 생산된 항체 분자를 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 리폴딩 (refolding)시키고 기능적 형태 (conformation)를 갖도록 하는 것이 바람직하다.

상기 폴리펩타이드의 회수는 생산된 폴리펩타이드의 특성 및 세포의 특성에 따라 달라질 수 있으며, 이는 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자가 적절히 선택 및 조절할 수 있다.

상기 폴리펩타이드는 세포내, 주변 세포질 공간에 생산되거나 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 만약 폴리펩타이드가 세포 내에서 생산되면, 이 세포는 제1 단계로서 단백질을 방출하기 위하여 파괴될 수 있다. 입자형 파편, 숙주 세포 또는 용해된 단편은 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로 먼저 상업적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 Amicon 또는 Millipore Pellicon 한외여과 유닛을 사용하여 농축시킨다. 단백분해를 억제하기 위하여 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF가 임의의 선행 단계에 포함될 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 방지하기 위하여 항생제가 포함될 수 있다.

세포로부터 제조된 항체는 예를 들어 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제될 수 있고, 본 발명의 항체는 바람직하게는 친화도 크로마토그래피를 통하여 정제할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 NRS와 특이적으로 결합하므로 예를 들어, 특정 세포, 조직, 또는 혈청 내 NRS 발현을 검출하는, NRS 단백질을 검출하고 정량하기 위한 진단 분석에 유용하다.

따라서 본 발명은 제1항의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 NRS 특이적 검출 방법을 제공한다.

상기 항체 또는 그 단편을 '검출'하기 위하여, 항체 또는 그 단편은 일반적으로 검출가능 모이어티로 표지될 수 있다.

예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen 등, Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs]에 기술된 기술을 이용하여, 방사성 동위원소 또는 형광표지로 표지될 수 있다. 방사능은, 예를 들어, 신틸레이션 계수(scintillation counting)에 의해 측정될 수 있으며, 형광은 형광계를 이용하여 정량될 수 있다.

또는 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하며, 상기 효소적 표지의 예는 초파리 루시러파제 및 세균 루시퍼라제 (미국 특허 제4,737,456호)와 같은 루시퍼라제, 루시페린 (luciferin), 2,3-다이하이드로프탈라진디오네스, 말레이트 디하이드로게나제, 유라제 (urase), 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어 글루코스옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어 유리카제 및 잔틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 항체에 효소를 접합시키는 기술은 예를 들어, 문헌 [O'Sullivan 등, 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-항체 Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N. Y., 73: 147-166]에 기술되어 있다.

표지는 다양한 공지된 기술을 이용하여 항체에 간접적으로 접합될 수 있다. 예를 들어, 항체는 바이오틴에 접합될 수 있고 상기에 언급된 3종의 광범위한 카테고리에 속하는 임의의 표지들이 아비딘과, 또는 그 반대로 접합될 수 있다. 바이오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 이 표지는 이러한 간접적 방식으로 항체에 접합될 수 있다. 또는, 항체에 표지의 간접적 접합을 달성하기 위하여, 항체는 작은 합텐 (hapten) (예를 들어, 딕옥신 [digoxin])과 접합될 수 있고 상기에 언급된 서로 다른 유형의 표지들의 하나가 항-합텐 항체에 접합될 수 있다 (예컨대, 항-딕옥신 항체). 따라서, 항체에 대한 표지의 간접적 접합이 달성될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석과 같은 임의의 공지된 분석 방법에 사용될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 그 단편은 진단 킷트 즉, 진단 분석을 수행하기 위한 진단 킷트, 즉 사용설명서와 함께 미리 지정된 양으로 시약들의 포장된 조합에 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지된 경우에, 킷트는 기질 및 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체로서 효소에 의해 요구되는 보조인자 (cofactor)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충액 (예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제들이 포함될 수 있다. 다양한 시약들의 상대적인 양은 분석의 민감도를 충분히 최적화시키는 시약의 용액 내 농도를 제공하기 위해 폭넓게 변화될 수 있다. 시약은 용해 시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는, 일반적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.

본 발명의 항체에 의해 검출되는 NRS는 근염이나 제1형 당뇨와 같은 자가면역 질환에 있어 자가항체가 존재함이 보고되었으며 염증성 싸이토카인의 활성을 보여 림프구(lymphocytes)의 이동, 단핵구(monocytes)및 미성숙 수지상세포 (immature dendritic cells)등을 활성화시킨다.(제1형당뇨 질환: 대한민국 공개특허공보 제10-2010-0090003호, 근염질환: Howard, O.M., et al Histidyl-tRNA synthetase and asparaginyl-tRNA synthetase, autoantigens in myositis, activate chemokine receptors on T lymphocytes and immature dendritic cells. (2002) J. Exp. Med. 196, 781.791) 또한 NRS는 단백질의 당화에 관여하여 세포표면이나 분비단백질의 활성에 영향을 미칠 수 있는 가능성이 제시되고 있는데 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor-2)의한 골모세포(osteoblst)의 성장에 관련 있음이 보고되었다.(Park SJ et al Fibroblast growth factor 2-induced cytoplasmic asparaginyl-tRNA synthetasepromotes survival of osteoblasts by regulating anti-apoptotic PI3K/Akt signalin(2009) Bone 45, 9941003)

따라서, NRS는 검출을 통해 자가면역질환을 비롯한 각종 면역질환 및 염증성 질환의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 자가면역질환 및 염증성 질환의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중에서 NRS 단백질을 검출함으로써 수행될 수 있다.

따라서 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 면역질환 및 염증성 질환 진단용 조성물을 제공한다. 더 바람직하게는 본 발명의 항체를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 및 염증성 질환 진단용 조성물을 제공한다.

상기 생물학적 시료는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다.

상기 검출에 관하여는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 자가면역질환은 예를 들어 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루게릭병, 염증성 근육질환(예를들어, 다발성 근염(polymyositis), 피부근염(dermatomyositis)), 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증과 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 제1형당뇨, 다발성 근염 또는 피부근염일 수 있다.

상기 염증성 질환은 이에 제한되지는 않으나, 부종 등과 같은 일반적인 염증 증상을 포함하여 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게릭 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease; 또는 'charcot joint'이라고도 함), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열(familial Mediterranean fever), 베체트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia), 제2형 당뇨병, 동맥경화, 알츠하이머성 치매, 가족성 한랭 자가염증 증훈군(familial cold autoinflammatory syndrome), 머클-웰스 증후군(Muckle-Wells syndrome), 신생아발병다발염증성질환(neonatal mutisystem inflammatory disease), 만성유아신경피부관절증후군(chronic infantile neurologic cutaneous articular syndrome), 성인발증형 스틸병(adult-onset Still's disease), 접촉성 피부염, 포상기태(hydatidiform mole), PAPA 증후군(syndrome of pyogenic arthritis, pyoderma gangrenosum,and acne), 고면역글로불린 D 증후군(hyperimmunoglobulin d syndrome) 및 크리오피린 관련 주기적 증후군(cryopyrin-associated periodic syndromes)등을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 인간의 VH3-23/VL1g 유전자를 골격으로 하고 CDR에 무작위 서열을 삽입하는 라이브러리를 구축하고, NRS와 선택적으로 결합하는 파지를 선별하여 항체를 분리, 정제 하고 염기서열을 분석하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 정제한 항체가 NRS와 결합하는지 western blot 방법으로 확인하였다. 그 결과 본 발명의 항체는 NRS와 결합하는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 항 NRS scFv 항체와 NRS의 친화도를 표면공명분석방법으로 측정하였다. 그 결과 본 발명의 항체는 평형해리상수 100nM 값을 가져 비교적 높은 친화도를 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 항 NRS scFv 항체의 교차반응성을 측정하였다. Luminex bead를 이용하여 본 발명의 항체와 NRS를 포함한 8종의 유사 단백질과의 반응성을 측정한 결과 본 발명의 항체는 NRS를 제외한 다른 ARS 단백질에는 결합하지 않는 것을 확인하였다.

본 발명의 다른 일실시예에서는 본 발명의 항 NRS scFv 항체의 진단용 항체로의 유용성 여부를 실험하였다. 본 발명의 항체로 코팅된 plate를 제작한 후, NRS 표준물질을 농도별로 희석하여 반응시키고, 결합여부를 ELISA로 측정하였다. 그 결과 NRS 표준물질에 대하여 농도 의존적으로 항체 결합이 측정되는 것을 확인하여, 본 발명의 항체가 면역질환 및 염증성 질환 진단용으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 NRS에 특이적으로 결합하며, 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어 NRS 검출 및 억제가 가능하므로 NRS 검출 및 NRS가 관련된 질환인 자가면역질환 및 염증성 질환의 진단에 효과적이다.

도 1은 본 발명의 항체가 목적단백질인 NRS에 결합하는지를 확인한 western blot 실험 결과이다.
도 2는 본 발명의 항체인 anti-NRS scFv Biocon-N1의 결합친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정한 결과 그래프이다(Kd : 평형해리상수, 가로축 : 시간(초), 세로축 : response unit(RU)).
도 3은 본 발명의 항체인 anti-NRS scFv Biocon-N2의 결합친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정한 결과 그래프이다(Kd : 평형해리상수, 가로축 : 시간(초), 세로축 : response unit(RU)).
도 4는 본 발명의 항체인 anti-NRS scFv Biocon-N3의 결합친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정한 결과 그래프이다(Kd : 평형해리상수, 가로축 : 시간(초), 세로축 : response unit(RU)).
도 5는 본 발명의 항체인 anti-NRS scFv Biocon-N4의 결합친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정한 결과 그래프이다(Kd : 평형해리상수, 가로축 : 시간(초), 세로축 : response unit(RU)).
도 6은 본 발명의 항체인 anti-NRS scFv Biocon-N5의 결합친화도를 표면 플라즈몬 공명(SPR)으로 측정한 결과 그래프이다(Kd : 평형해리상수, 가로축 : 시간(초), 세로축 : response unit(RU)).
도 7은 본 발명의 항체인 anti-NRS scFv Biocon-N1의 교차반응성(cross activity)을 Luminex Multiplex Assay 방법으로 측정한 결과 그래프이다(세로축(FI) : 형광강도(fluorescent intensity), WRS : 트립토파닐-tRNA 합성효소(Tryptophanyl-tRNA synthetase), HRS : 히스티딜-tRNA 합성효소(Histidyl-tRNA synthetase), NRS : 아스파라기닐딜-tRNA 합성효소(Asparaginyl-tRNA synthetase), NRS : 리실-tRNA 합성효소(Lysyl-tRNA synthetase), SRS : 세릴-tRNA 합성효소(Seryl-tRNA synthetase), YRS : 타이로실-tRNA 합성효소(Tyrosyl-tRNA synthetase), GRS : 글리실-tRNA 합성효소(Glycyl-tRNA synthetase), AIMP1 : ARS 결합 다기능 단백질(Aminoacyl-tRNA-synthetase-interacting multifunctional protein 1)).
도 8은 본 발명의 항체인 anti-NRS scFv Biocon-N2의 교차반응성(cross activity)을 Luminex Multiplex Assay 방법으로 측정한 결과 그래프이다(세로축(FI) : 형광강도(fluorescent intensity), WRS : 트립토파닐-tRNA 합성효소(Tryptophanyl-tRNA synthetase), HRS : 히스티딜-tRNA 합성효소(Histidyl-tRNA synthetase), NRS : 아스파라기닐딜-tRNA 합성효소(Asparaginyl-tRNA synthetase), NRS : 리실-tRNA 합성효소(Lysyl-tRNA synthetase), SRS : 세릴-tRNA 합성효소(Seryl-tRNA synthetase), YRS : 타이로실-tRNA 합성효소(Tyrosyl-tRNA synthetase), GRS : 글리실-tRNA 합성효소(Glycyl-tRNA synthetase), AIMP1 : ARS 결합 다기능 단백질(Aminoacyl-tRNA-synthetase-interacting multifunctional protein 1)).
도 9는 본 발명의 항체인 anti-NRS scFv Biocon-N3의 교차반응성(cross activity)을 Luminex Multiplex Assay 방법으로 측정한 결과 그래프이다(세로축(FI) : 형광강도(fluorescent intensity), WRS : 트립토파닐-tRNA 합성효소(Tryptophanyl-tRNA synthetase), HRS : 히스티딜-tRNA 합성효소(Histidyl-tRNA synthetase), NRS : 아스파라기닐딜-tRNA 합성효소(Asparaginyl-tRNA synthetase), NRS : 리실-tRNA 합성효소(Lysyl-tRNA synthetase), SRS : 세릴-tRNA 합성효소(Seryl-tRNA synthetase), YRS : 타이로실-tRNA 합성효소(Tyrosyl-tRNA synthetase), GRS : 글리실-tRNA 합성효소(Glycyl-tRNA synthetase), AIMP1 : ARS 결합 다기능 단백질(Aminoacyl-tRNA-synthetase-interacting multifunctional protein 1)).
도 10은 본 발명의 항체인 anti-NRS scFv Biocon-N4의 교차반응성(cross activity)을 Luminex Multiplex Assay 방법으로 측정한 결과 그래프이다(세로축(FI) : 형광강도(fluorescent intensity), WRS : 트립토파닐-tRNA 합성효소(Tryptophanyl-tRNA synthetase), HRS : 히스티딜-tRNA 합성효소(Histidyl-tRNA synthetase), NRS : 아스파라기닐딜-tRNA 합성효소(Asparaginyl-tRNA synthetase), NRS : 리실-tRNA 합성효소(Lysyl-tRNA synthetase), SRS : 세릴-tRNA 합성효소(Seryl-tRNA synthetase), YRS : 타이로실-tRNA 합성효소(Tyrosyl-tRNA synthetase), GRS : 글리실-tRNA 합성효소(Glycyl-tRNA synthetase), AIMP1 : ARS 결합 다기능 단백질(Aminoacyl-tRNA-synthetase-interacting multifunctional protein 1)).
도 11은 본 발명의 항체인 anti-NRS scFv Biocon-N5의 교차반응성(cross activity)을 Luminex Multiplex Assay 방법으로 측정한 결과 그래프이다(세로축(FI) : 형광강도(fluorescent intensity), WRS : 트립토파닐-tRNA 합성효소(Tryptophanyl-tRNA synthetase), HRS : 히스티딜-tRNA 합성효소(Histidyl-tRNA synthetase), NRS : 아스파라기닐딜-tRNA 합성효소(Asparaginyl-tRNA synthetase), NRS : 리실-tRNA 합성효소(Lysyl-tRNA synthetase), SRS : 세릴-tRNA 합성효소(Seryl-tRNA synthetase), YRS : 타이로실-tRNA 합성효소(Tyrosyl-tRNA synthetase), GRS : 글리실-tRNA 합성효소(Glycyl-tRNA synthetase), AIMP1 : ARS 결합 다기능 단백질(Aminoacyl-tRNA-synthetase-interacting multifunctional protein 1)).
도 12는 본 발명의 항체가 NRS를 detection 할 수 있는지를 확인하기 위한 ELISA 실험 결과이다(세로축 : 450nm 흡광도, 가로축 : NRS 표준물질의 농도(ng/ml)).

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

scFv 라이브러리 구축 및 항 NRS scFv 선별

<1-1> scFv 라이브러리 구축

scFv 라이브러리는 대한민국특허 10-0961392호에 나온 방법에 따라 구축하였다.

인간의 VH3-23/VL1g 유전자를 골격으로 하고 상보성 결정부위(complementarity determining regions, CDR)에 무작위 서열을 삽입하는 것으로 라이브러리를 설계하고, 베타락타메이즈 유전자를 선택마커(selection marker)로 가지는 플라스미드 벡터에서 베타락타메이즈 유전자의 리더서열 직후에 제한효소 절단서열들을 도입하여 pFDV 플라스미드 벡터를 제조하고 scFv 유전자 라이브러리를 삽입한 후, 대장균에 형질감염 시킨 후 이를 배양하여 라이브러리를 구축하였다. 이 과정을 통하여 라이브러리 내에서 비정상적인 정지코돈 혹은 프레임시프트(frameshift)를 가지는 scFv 유전자 서열을 대부분 제거하여 라이브러리의 품질을 향상시키는 것이 가능하다. 배양된 라이브러리로부터 오류가 제거된 서열들을 중합효소 연쇄반응으로 증폭한 후 이로부터 scFv 유전자 라이브러리를 재조합하여 pComb3X 파아지미드 벡터에 삽입하고, 이.콜라이 ER2537 스트레인의 대장균을 형질감염하여 최종 라이브러리를 획득하였다. 라이브러리를 카르베니실린을 함유하는 SB(Super broth) 배지 400 mL에 배양하고, 600 나노미터에서의 흡광도가 0.5가 되었을 때 10¹³ CFU의 VCSM13 보조파아지를 가하여 80 rpm에서 교반하며 1시간동안 섭씨 37도에서 감염시켰다. 여기에 최종 70 ug/mL의 카나마이신 항생제를 넣고 섭씨 30도, 200 rpm에서 교반하며 밤새 배양하여 scFv가 표면제시된 파지를 생산하였다. 다음날 아침에 배양액을 원심분리하고, 배양액 속의 파지를 4%의 폴리에틸렌글리콜-8000과 3%의 염화소듐을 가하여 침전시켰다. 침전된 파지를 50 mL의 PBS 완충용액에 녹이고, 위와 같은 방식으로 재차 침전하여 최종적으로 2 mL의 PBS 완충용액에 녹였다. 이를 원심분리하여 이물질을 제거함으로써 파지 scFv 라이브러리를 얻었으며 일반적으로 최종 파지 라이브러리에는 10¹³ CFU/mL 이상의 파지 입자가 포함된다.

<1-2> 항 NRS scFv 선별

면역시험관(immunotube)에 10 ug/ml 농도의 NRS를 첨가하여 1시간동안 시험관 표면에 단백질을 흡착시킨 후 분말우유 3% 용액을 시험관에 첨가하여 NRS가 흡착되지 않은 표면을 보호하였다. 시험관을 비운 후 여기에 분말우유 3% 용액에 분산된 10¹² CFU의 항체파지 라이브러리를 넣어 항원과 결합시켰다. 비특이적으로 결합한 파지를 TBST (tris buffered saline - tween20) 용액으로 3회 씻어낸 후, 남아있는 항원특이적 파지 항체를 100 mM 트리에틸아민 용액을 이용하여 용리하였다.

용리된 파지를 1.0M 농도의 Tris-HCl 버퍼 (pH 7.8)로 중화시킨 후 ER2537 대장균에 37℃에서 1시간 감염시키고, 감염된 대장균을 카르베니실린을 함유하는 LB(Luria-Bertani) 한천배지에 도포하여 37℃에서 배양하였다. 다음날 배양된 대장균을 3 mL의 SB (super broth) - 카르베니실린 배양액에 현탁하고 15% 글리세롤을 첨가하여 일부는 -80℃에 보관하고, 나머지 중 50마이크로리터를 20 mL의 SB-카르베니실린-2% 포도당 용액에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 배양액의 600 나노미터 광선의 흡광도가 0.5가 되면 원심분리하여 박테리아만을 분리하고, 이를 다시 20 mL의 SB-카르베니실린 배양액에 현탁한 후 10¹²PFU (플라크 형성단위)의 VCSM13 보조파지를 넣고 서서히 교반하며 37℃에서 배양하였다.

1시간 후 카나마이신 70ug/ml을 첨가하고 30℃에서 빠르게 교반하며 (250 rpm) 밤새 배양하였다. 다음날 배양액을 원심분리한 후, 파지 입자를 포함하는 상층액 1 mL을 라이브러리로 사용하여 위의 패닝 과정을 반복함으로써 항원특이적 클론을 농축시켰다.

<실시예 2>

항 NRS scFv 항체 발현 및 정제

3-4회 정도의 반복적인 패닝 후 항체유전자를 포함하는 대장균을 카르베니실린을 함유하는 LB 한천배지에 도포, 배양하여 단일 콜로니들을 얻고, 이를 200 uL SB-카르베니실린 용액에 접종, 배양한 후 IPTG로 유도하여 scFv 단백질을 대장균의 페리플라즘(periplasm)에서 발현하였다. 대장균을 40 uL의 1X TES (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 20% Sucrose, pH 8.0) 용액에 현탁한 후 여기에 0.2X TES 용액 60 uL를 가하고 섞어서 섭씨 4도에서 30분 이상 처리하고 원심분리하여 상층액으로 페리플라즘을 추출하였다.

<2-1> NRS에 대해 선별된 scFv 항체 발현

선별된 NRS에 대한 scFv 양성 단일 콜로니 클론을 카르베니실린을 함유하는 SB 배지(Bactotrytone 30g, yeast extract 20g,MOPS buffer 10g/L)에 5 ml에 배양하여 seed culture를 시작하여 overnight 배양후 500ml 카네니실린함유 SB배지에 옮겨 OD 600 = 0.5 정도 되었을때 IPTG를 1mM되게 넣어 30도에서 overnight 배양하여 scFv 단백질을 대장균의 페리플라즘(periplasm)에서 발현하였다. 다음날 원심분리하여 수득한 대장균을 1X TES buffer에 (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 20% Sucrose, pH 8.0) 현탁한 후 0.2 X TES를 1.5배 첨가하여 섞어주고 원심분리하여 페리플라즘을 추출하였다.

<2-2> 선별된 scFv 항체 정제

페리플라즘에서 추출한 scFv 항체에 최종 5 mM MgSO₄를 가하고 이를 미리 PBS에 평형시킨 Ni-NTA bead 와 섞어 1시간 동안 냉장에서 교반하여 Ni- bead에 결합시킨후 친화도 크로마토그래피를 수행하여 결합하지 않은 단백질을 PBS로 충분히 씻어내었다. 5 mM Imidazole이 함유된 buffer로 더 충분히 씻어 준 다음 결합한 scFv 항체는 200 mM Imidazole buffer를 이용하여 용출하였다. 용출된 항체는 투석하여 전기이동을 통해 순도를 확인하고 BCA 방법으로 단백질 정량을 하여 정제된 항체양을 기록후 일정양을 분주하여 냉동 보관하였다.

<2-3> 면역블롯 및 sequencing

페리플라즘에서 추출한 scFv 항체는 면역블롯(western blot) 기법을 사용하여 human 세포에서 원래 발현된 NRS에 scFv 항체가 결합하는지 여부를 확인하는 데 사용하였다. 50ug의 Hela cell lysate를 SDS PAGE를 통해 전기이동한 후 Wet transfer 방법으로 Nitrocellulos membrane에 옮겨 3% skim milk로 blocking 한후 추출한 scFv 항체를 첨가하여 결합시켰다. 검출을 위해 결합한 scFv에 HRP(horseradish peroxidase)가 연결된 Anti-HA 이차항체를 반응시킨후 기질로 ECL reagent를 이용하여 암실에서 필름 감광하였다. 감광된 띠는 표준 분자 마커와 비교하여 NRS의 사이즈에 해당하는 띠를 확인하였다.

이로부터 확인된 항원특이적 항체 클론은 카베니실린이 함유된 SB 배지 10ml에 overnight 배양하여 plasmid miniprep kit를 사용하여 plasmid DNA를 추출하여 Capillary sequencing service (Macrogen Co) 를 통해 염기서열을 분석하고 Kabat protein seqeunce database와 IMGT(the international ImMunoGeneTics information system) 분석방법에 근거하여 CDR 서열을 분석하였다.

그 결과 NRS 항원과 결합한 scFv의 개수는 총 5 건이며, 이들의 염기서열은 서열번호 14, 28, 42, 56, 70인 것으로 확인되었다.

<실시예 3>

항 NRS scFv 항체의 친화도 측정

NRS 항원에 대한 본 발명 항체의 결합 친화도를 ProteOnTMXPR36 SPR (surface plasmon resonance) 바이오센서 (Bio-Rad 사)를 이용하여 측정하였다.

구체적으로, 약 10 ug/ml의 NRS 항원을 제조사의 설명서에 따라 GLC 칩(Bio-Rad 6 X 6 sensor chip, Compact capacity amine coupling for protein-protein interactions)에 약 2,000 내지 4,000 반응 단위 (response unit)로 고정화시킨 후, PBS를 이용하여 다양한 농도로 희석한 본 발명의 정제된 scFv 항체 (500-30nM) 30ul씩을 25℃에서 50 ul/min의 속도로 칩에 주입하여 항원과의 상호작용을 정량하였다. 칩의 표면은 0.85% phosphoric acid로 재생하였으며, ProteOn Manager 소프트웨어를 이용하여 연합 속도와 해리속도를 계산하였고, 평형 해리 상수 (KD)는 해리속도/연합속도 비로서 계산하였다.

그 결과 [도 2] 내지 [도 6]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 항체는 최대 KD 100nM 값을 가져 비교적 높은 NRS 친화도를 가지는 것을 확인하였다.

<실시예 4>

항 NRS scFv 항체 교차 반응성(cross activity) 측정

scFv 항체가 다른 항원과 반응성이 있는지 판단하기 위하여 Luminex bead를 이용하여 본 발명의 항체와 NRS 및 다른 ARS family protein과의 교차 반응성을 측정하였다.

<4-1> 각각의 protein이 결합된 Luminex bead 제조

Code No가 다른 각각의 bead에 protein의 amine 잔기를 결합시키기 위해 Bio-rad사의 Amine coupling kit의 실험과정에 따라 coupling을 수행하였다. 먼저 1 x10⁶ 에 해당하는 각각의 bead를 96well filter plate로 옮겨 activation buffer로 vacuum manifold를 이용하여 세척 후 50 mg/ml S-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide)와 50 mg/ml EDAC(1-ethy-3-[3- dimethylaminopropyl]carbodiimide)를 첨가하여 상온에서 20 분 활성화시켰다. 활성화된 각각의 bead는 PBS로 세척 후 순도 90%이상의 정제된 각각의 재조합 ARS 항원 즉 WRS,HRS, NRS, KRS, SRS, YRS, GRS, AIMP1(p43) 10 ug을 첨가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 각각의 ARS에 연결된 bead는 PBS로 2번 세척 후 Blocking buffer를 첨가하여 30분간 상온에서 반응시켜 결합하지 않은 잔기를 blocking 시킨후 PBS로 2번 세척 후 100ul PBS에 다시 현탁하고 빛이 차단된 tube에 보관하였다. 결합된 bead의 수는 hemocytometer로 측정하여 기록하였다.

<4-2> Multiplex Assay를 이용한 Cross activity 측정

페리플라즘에서 추출된 본 발명의 항체를 검체 희석액 (PBST + 2% BSA)에 1:400농도로 우선 희석한 다음 96 well filter 플레이트에 검체 희석액으로 순차적으로 2배씩 희석하여 50ul 씩 분주하였고 항체가 없는 Blank well에는 검체 희석액만을 첨가하였다. ARS가 결합된 각각의 bead는 well 당 2000 개 bead가 되도록 bead mix tube에 각각 넣고 검체 희석액을 각 well당 50 ul 씩 분주 할 수 있는 부피만큼 넣어주었다. bead mix용액을 잘 섞은 후 각 well에 분주하여 암실에서 1시간 동안 반응 시켰다. 반응이 끝난 후 vacuum manifold를 이용하여 PBS (200 ul/well)로 3번 세척 후 50 ul Anti-(HA)-biotin 이차 항체를 첨가하여 암실에서 1시간동안 추가로 반응시켰다. 이차 항체와 결합한 bead는 PBS로 3번 세척후 형광 표지를 위해 SA-PE (Streptavidin- Phycoerythrin)을 2 ug/ml 되게 첨가하여 암실에서 30분간 반응시킨 후 PBS 3번 세척과정을 거쳐 PBS 100ul에 다시 현탁하였다. 형광 표지된 bead는 Bio-Plex (Luminex) 200 장비와 Bio-Plex manager 프로그램을 이용하여 형광 세기를 측정한 결과 값을 분석하여 각각의 ARS에 대한 항체의 결합여부를 확인하였다.

그 결과 [도 7] 내지 [도 11]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 항체는 모든 농도에서 NRS를 제외한 다른 ARS family protein과 반응하지 않는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 항체는 다른 단백질과 교차 반응성이 없는 것을 확인하였다.

<실시예 5>

정제된 항-NRS scFv 항체를 이용한 sandwich ELISA pairing test

본 발명의 항체가 진단용 항체로의 유용성 여부를 알아보기 위해 NRS sandwich ELISA pairing test를 수행하였다. ELISA 구성중 capture 항체를 본 발명의 항체로 사용하고 detection 항체를 기존 제품의 rabbit 폴리클로날 항체로 pairing test를 해보아 NRS 표준물질에 대한 정량 곡선이 만들어지는 지를 확인하였다.

먼저 본 발명의 정제된 항체를 coating buffer (0.1M sodium carbonate pH 9.0)에 희석하여 well 당 100 - 400ng 되게 ELISA plate에 100ul 씩 분주한 후 상온에서 3시간 방치하였다. PBST로 3번 세척후 2% BSA를 함유한 PBST 350 ul를 첨가하여 상온에서 1시간 blocking한후 PBST로 3번 세척하였다. 항체를 coating한 plate well에 정제된 재조합 NRS 표준물질을 농도별로 검체 희석액에 2배씩 희석하여 100 ul씩 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응후 plate는 PBST로 3번 세척후 희석된 detection 항체 (4 ug/ml) 100 ul 첨가하여 추가로 상온에서 1시간 반응하였다. 검출을 위해 plate를 PBST 3번 세척후 HRP가 연결된 anti-rabbit IgG를 넣어 상온에서 1시간 반응시켜 결합시켰다. HRP에 의한 발색반응을 보고자 plate를 PBST로 3번 세척후 HRP 기질인 TMB solution 50 ul를 첨가하여 10분동안 발색반응을 보고 2N 황산 50 ul 첨가하여 발색반응을 멈춘후 ELISA reader를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 [도 12]에서 보는 바와 같이 재조합 NRS 표준물질에 대해 ng/ml 농도에 해당하는 표준 직선이 그려짐을 확인 할 수 있었다. 이로서 본 발명의 항체가 면역질환 및 염증성 질환의 진단용으로 사용 될 수 있는 것을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 항체 또는 그 단편은 인간 NRS에 특이적으로 결합하며, 동일한 ARS family를 포함한 다른 단백질과 교차반응성이 없어 NRS 검출 및 억제가 가능하므로 NRS 검출 및 NRS가 관련된 질환인 자가면역질환 및 염증성 질환의 진단 목적으로 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.

<110> Medicinal Bioconvergence Research Center <120> Anti-NRS monoclonal antibody and uses thereof <130> NP13-0074 <160> 70 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of Biocon N1 <400> 1 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 of Biocon N1 <400> 2 Asp Asp Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of Biocon N1 <400> 3 Gly Ala Trp Asp Tyr Ser Leu Ser Ala Tyr Val 1 5 10 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of Biocon N1 <400> 4 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of Biocon N1 <400> 5 Trp Ile Ser His Asp Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of Biocon N1 <400> 6 Gly Ala Asn Ala Pro Met Thr Ile His Tyr 1 5 10 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ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagtg atctctcctg gtagtggtag taaatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaacggct 300 actattttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagg tggaggcggt 360 tcaggcggag gtggatccgg cggtggcgga tcgcagtctg tgctgactca gccaccctca 420 gcgtctggga cccccgggca gagggtcacc atctcttgta ctggctcttc atctaatatt 480 ggcagtaatt atgtctcctg gtaccagcag ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc 540 tatgctgata gtcagcggcc aagcggggtc cctgaccgat tctctggctc caagtctggc 600 acctcagcct ccctggccat cagtgggctc cggtccgagg atgaggctga ttattactgt 660 ggtacttggg atgatagcct gagtgcttat gtcttcggcg gaggcaccaa gctgacggtc 720 cta 723 <210> 43 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of Biocon N4 <400> 43 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Ser Val Ser 1 5 10 <210> 44 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 of Biocon N4 <400> 44 Ala Asn Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 45 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ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaggtgct 300 aaggcgccta tgagtttcga ctactggggc cagggtacac tggtcaccgt gagctcaggt 360 ggaggcggtt caggcggagg tggacccggc ggtggcggat cgcagtctgt gctgactcag 420 ccaccctcag cgtctgggac ccccgggcgg agggtcacca tctcttgtag tggctcttca 480 tctaatattg gcaataattc tgtctcctgg taccagcagc tcccaggaac ggcccccaaa 540 ctcctcatct atgctaatag tcatcggcca agcggggtcc ctgaccgatt ctctggctcc 600 aagtctggca cctcagcctc cctggccatc agtgggctcc ggtccgagga tgaggctgat 660 tattactgtg ctgcttggga ttctagcctg agtgcttatg tcttcggcgg aggcaccaag 720 ctgacggtcc ta 732 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of Biocon N5 <400> 57 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asp Val Thr 1 5 10 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 of Biocon N5 <400> 58 Ser Asn Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of Biocon N5 <400> 59 Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val 1 5 10 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of Biocon N5 <400> 60 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of Biocon N5 <400> 61 Gly Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of Biocon N5 <400> 62 Asn Ser Arg His Phe Asp Tyr 1 5 <210> 63 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of Biocon N5 <400> 63 agtggctctt catctaatat tggcagtaat gatgtcacc 39 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 of Biocon N5 <400> 64 tctaatagtc atcggccaag c 21 <210> 65 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of Biocon N5 <400> 65 ggtgcttggg atgatagcct gaatggttat gtc 33 <210> 66 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of Biocon N5 <400> 66 gattatgcta tgagc 15 <210> 67 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of Biocon N5 <400> 67 gggatctctt atagtggtgg tagtacatat tacgctgatt ctgtaaaagg t 51 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of Biocon N5 <400> 68 aatagtcggc atttcgacta c 21 <210> 69 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv of Biocon N5 <400> 69 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Tyr Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Ser Arg His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr 130 135 140 Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile 145 150 155 160 Gly Ser Asn Asp Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro 165 170 175 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser 195 200 205 Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp 210 215 220 Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 225 230 235 240 Leu <210> 70 <211> 723 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv of Biocon N5 <400> 70 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacaga ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc gattatgcta tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggg atctcttata gtggtggtag tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaaatagt 300 cggcatttcg actactgggg ccagggtaca ctggtcaccg tgagctcagg tggaggcggt 360 tcaggcggag gtggatccgg cggtggcgga tcgcagtctg tgctgactca gccaccctca 420 gcgtctggga cccccgggca gagggtcacc atctcttgta gtggctcttc atctaatatt 480 ggcagtaatg atgtcacctg gtaccagcag ctcccaggaa cggcccccaa actcctcatc 540 tattctaata gtcatcggcc aagcggggtc cctgaccgat tctctggctc caagtctggc 600 acctcagcct ccctggccat cagtgggctc cggtccgagg atgaggctga ttattactgt 660 ggtgcttggg atgatagcct gaatggttat gtcttcggcg gaggcaccaa gctgacggtc 720 cta 723

Claims

i)서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체;
ii) 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2, 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2, 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체;
iii) 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2, 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2, 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체;
iv) 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2, 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2, 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체; 및
v) 서열번호 57로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L1, 서열번호 58로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L2, 서열번호 59로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)L3을 포함하는 항체 경쇄가변영역(VL) 및 서열번호 60으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H1, 서열번호 61로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H2, 서열번호 62로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상보성 결정부위(CDR)H3을 포함하는 항체 중쇄가변영역(VH)을 포함하는 항체;
로 이루어지는 군에서 선택된 인간 NRS에 결합하는 항체 또는 그 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체는
i) 경쇄가변영역으로 서열번호 13의 136 번째 내지 246 번째 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄가변영역으로 서열번호 13의 1 번째 내지 120 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체;
ii) 경쇄가변영역으로 서열번호 27의 135 번째 내지 244 번째 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄가변영역으로 서열번호 27의 1 번째 내지 119 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체;
iii) 경쇄가변영역으로 서열번호 41의 132 번째 내지 241 번째 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄가변영역으로 서열번호 41의 1 번째 내지 116 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체;
iv) 경쇄가변영역으로 서열번호 55의 135 번째 내지 244 번째 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄가변영역으로 서열번호 55의 1 번째 내지 119 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체; 및
v) 경쇄가변영역으로 서열번호 69의 132 번째 내지 241 번째 아미노산 서열을 포함하며, 중쇄가변영역으로 서열번호 69의 1 번째 내지 116 번째 아미노산 서열을 포함하는 항체;
로 이루어진 군에서 선택된 항체인 것을 특징으로 하는 인간 NRS에 결합하는 항체 또는 그 단편.
제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 13, 서열번호 27, 서열번호 41, 서열번호 55 및 서열번호 69
로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제1항에 있어서, 상기 단편은 디아바디, Fab, Fab', F(ab)₂, F(ab')₂, Fv 및 scFv로 이루어진 군에서 선택되는 단편인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 단편.
제1항의 항체 또는 그 단편을 암호화 하는 폴리뉴클레오티드.
제5항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는
i) 서열번호 7 내지 12로 표시되는 폴리뉴클레오티드;
ii) 서열번호 21 내지 26으로 표시되는 폴리뉴클레오티드;
iii) 서열번호 35 내지 40으로 표시되는 폴리뉴클레오티드;
iv) 서열번호 49 내지 54로 표시되는 폴리뉴클레오티드; 및
v) 서열번호 63 내지 68로 표시되는 폴리뉴클레오티드;
로 이루어진 군에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제7항의 벡터를 포함하는 세포.
제8항의 세포를 폴리뉴클레오티드가 발현되는 조건하에서 배양하여, 경쇄 및 중쇄가변영역을 포함하는 폴리펩타이드를 생산하는 단계 및 상기 세포 또는 이를 배양한 배양 배지로부터 상기 폴리펩타이드를 회수하는 단계를 포함하는 인간 NRS에 결합하는 항체 또는 그 단편의 생산방법.
제1항의 항체 또는 그 단편을 시료와 접촉시키는 단계 및 상기 항체 또는 그 단편을 검출하는 단계를 포함하는 NRS 특이적 검출 방법.
제1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환 진단용 조성물.
제1항의 항체 또는 그 단편을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 진단용 조성물.