CN118063606A - 一种抗thsd7a单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种抗thsd7a单克隆抗体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118063606A CN118063606A CN202410494182.6A CN202410494182A CN118063606A CN 118063606 A CN118063606 A CN 118063606A CN 202410494182 A CN202410494182 A CN 202410494182A CN 118063606 A CN118063606 A CN 118063606A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- monoclonal antibody
- thsd
- seq
- antigen
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 37
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 2
- 101000654935 Homo sapiens Thrombospondin type-1 domain-containing protein 7A Proteins 0.000 abstract description 32
- 102100032612 Thrombospondin type-1 domain-containing protein 7A Human genes 0.000 abstract description 18
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 21
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 16
- 102000047969 human THSD7A Human genes 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 208000033709 Primary membranous glomerulonephritis Diseases 0.000 description 10
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 201000008350 membranous glomerulonephritis Diseases 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 101710117290 Aldo-keto reductase family 1 member C4 Proteins 0.000 description 3
- 102100035360 Cerebellar degeneration-related antigen 1 Human genes 0.000 description 3
- 206010018372 Glomerulonephritis membranous Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 102100029392 Secretory phospholipase A2 receptor Human genes 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 231100000855 membranous nephropathy Toxicity 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 2
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 2
- 101710122046 Secretory phospholipase A2 receptor Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101100313737 Danio rerio thsd7aa gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001126009 Homo sapiens Secretory phospholipase A2 receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000003623 Hypoalbuminemia Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001477931 Mythimna unipuncta Species 0.000 description 1
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010043045 Phospholipase A2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000004050 Phospholipase A2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 description 1
- 102000002938 Thrombospondin Human genes 0.000 description 1
- 108060008245 Thrombospondin Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000585 glomerular basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000011862 kidney biopsy Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种抗THSD7A单克隆抗体及其制备方法和应用，属于抗体技术领域。本发明的抗THSD7A单克隆抗体为嵌合抗体，制备方法简单、来源可靠且批间稳定性好；利用本发明的抗THSD7A单克隆抗体作为检测THSD7A自身抗体的标准品，特异性好、灵敏度高、亲和力强，能够对pMN进行更加全面地诊断和预防，具有重大的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及单克隆抗体制备及免疫学检测技术领域，具体地，涉及一种抗THSD7A单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
膜性肾病（Membranous Nephropathy，MN）是一种肾脏特有的自身免疫性疾病，其特点是肾小球的炎症，而肾小球通常有助于过滤液体和废物。MN是肾病综合征的主要原因，主要影响40岁以上的非糖尿病人。在MN中，肾小球基底膜增厚，导致蛋白尿增加和肾脏功能的逐渐丧失。除蛋白尿外，MN还可表现为脂尿、高脂血症、低蛋白血症和水肿。MN有两种形式：原发性膜性肾病（pMN）和继发性膜性肾病（sMN）。
肾脏活检是诊断pMN的标准。阳性结果通常显示肾脏中的沉积物。针对磷脂酶A2受体（the phospholipase A2 receptor 1，PLA2R）的肾脏自身抗体和人Ⅰ型血小板域蛋白7A（thrombospondin type1 domain-containing 7A，THSD7A）的自身抗体是提供pMN可靠诊断的重大突破。目前针对pMN的研究更倾向于PLA2R的研究。但是已有研究证明，部分pMN患者循环自身抗体是THSD7A而非PLA2R，这表明抗THSD7A抗体阳性患者代表了pMN的独特亚群。因此了解THSD7A不仅加深了对MN基础的病理生理学理解，还可以通过血清检测来识别和检测抗THSD7A抗体阳性患者。在现有的相关试剂盒中，同时检测抗THSD7A抗体和抗PLA2R抗体为pMN的检测提供了一种全面的方法。
然而，目前缺乏对抗THSD7A抗体检测用标准品的研究，本领域亟需制备简单、来源可靠、灵敏度高、特异性强和稳定性好的抗THSD7A抗体标准品。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供一种抗THSD7A单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分包含：
重链可变区，其CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 4~SEQID No. 6所示；
轻链可变区，其CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 9~SEQID No. 11所示。
在本发明的一些实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合部分包含：
重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；
轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示。
在本发明的一些实施方案中，所述单克隆抗体为嵌合抗体。进一步地，所述单克隆抗体或其抗原结合部分包含：
重链，其氨基酸序列如SEQ ID No. 14所示；
轻链，其氨基酸序列如SEQ ID No. 17所示。
在本发明的一些实施方案中，所述抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和scFv中的任一种。
在本发明中，所述抗原结合部分是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。抗体的片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。在本发明的一些实施方案中，所述抗原结合部分选自Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段和scFv抗体中的任一种。其中，
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。
“Fab'片段”含有一条轻链和一条包含VH结构域、CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链的部分，两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab')2片段。
“F(ab')2片段”含有两条轻链和两条包含VH结构域、CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链的部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab')2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab'片段组成。
“Fv片段”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链Fv抗体（scFv抗体）”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗原结合片段，这些结构域包含于单个多肽链中。
本发明第二方面提供编码本发明第一方面任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分的基因。
在本发明的一些实施方案中，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，编码所述重链可变区的基因包括SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列；编码所述轻链可变区的基因包括SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，所述单克隆抗体为嵌合抗体，包括重链和轻链，编码所述重链的基因包括SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列；编码所述轻链的基因包括SEQ IDNo. 18所示的核苷酸序列。
本发明第三方面提供一种重组载体，包括本发明第二方面所述的基因。
重组载体可以指克隆载体，也可以指表达载体，可以通过将编码核酸与商购的载体（如质粒或病毒载体）连接而获得，本发明中的重组载体不受特别限制，常用的质粒均可使用，如pSeTag2、PEE14、pMH3、pcDNA3.1、pcDNA3.4等。
在本发明的一些具体实施方案中，将所述单克隆抗体的重链可变区（VH）及小鼠重链恒定区1（CH1）与人IgG4的Fc连接，形成杂合重链，再将所述抗THSD7A单克隆抗体的轻链可变区（VL）及小鼠κ链恒定区（CL）连接形成杂合轻链，将杂合重链和杂合轻链组合形成嵌合抗体。
在本发明的一些优选实施方案中，所述小鼠重链恒定区1的氨基酸序列如SEQ IDNo. 12所示；所述人IgG4的Fc的氨基酸序列如SEQ ID No. 13所示。在本发明的一些具体实施方案中，所述杂合重链的氨基酸序列如SEQ ID No. 14所示，其核苷酸序列如SEQ ID No.15所示。
在本发明的一些优选实施方案中，所述小鼠κ链恒定区氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。在本发明的一些具体实施方案中，所述杂合轻链的氨基酸序列如SEQ ID No. 17所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示。
本发明第四方面提供一种重组细胞，包括本发明第三方面所述的重组载体。
所述重组细胞携带前面所述的基因、重组载体或转化子、或抗THSD7A单克隆抗体或抗原结合部分。所述重组细胞是通过转染或者转化所述重组载体获得的。
根据本发明的实施例，所述重组细胞在适合条件下可高效表达上述抗THSD7A单克隆抗体。
需要注意的是，本发明所述重组细胞不受特别限制，可以为原核细胞、真核细胞或噬菌体。所述原核细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核细胞可以为包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，草地粘虫等昆虫细胞，烟草等植物细胞，BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施例中，本发明所述重组细胞优选为哺乳动物细胞，包括BHK细胞、CHO细胞、NS0细胞或COS细胞，且不包括动物生殖细胞、受精卵或胚胎干细胞。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本申请所述抗THSD7A单克隆抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合抗THSD7A单克隆抗体表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗THSD7A单克隆抗体表达的条件。
本发明第五方面在提供一种抗THSD7A单克隆抗体或其抗原结合部分的制备方法，包括以下步骤：
将本发明第二方面所述的基因克隆至表达载体上，得到重组载体，再将所述重组载体转染或转化至宿主细胞中，得到重组细胞，诱导所述重组细胞表达。
在本发明的一些实施方案中，所述单克隆抗体为嵌合抗体，包括重链和轻链，所述基因包括编码所述重链的核苷酸序列和编码所述轻链的核苷酸序列。由此，所述基因包括两条核苷酸序列，分别克隆至表达载体上得到两个重组载体并转化至同一宿主细胞中进行表达即可获得所述嵌合抗体。
在本发明的一些实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
将本发明第三方面所述的重组载体转染或转化至宿主细胞中，得到重组细胞，诱导所述重组细胞表达。
在本发明的一些实施方案中，所述制备方法包括诱导本发明第四方面所述的重组细胞表达的步骤。
本发明第六方面提供本发明第一方面任一所述的单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于检测生物样本中抗THSD7A抗体的标准品的应用。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明利用噬菌体展示技术获得了特异性强、亲和力高的抗THSD7A单克隆抗体，其为嵌合抗体，制备方法简单、来源可靠且批间稳定性好。
利用本发明的单克隆抗体作为检测THSD7A自身抗体的标准品，特异性好、灵敏度高、亲和力强，能够对pMN进行更加全面地诊断和预防，具有重大的临床应用价值。
附图说明
图1示出了本发明嵌合单抗rhA3的电泳检测结果。
图2示出了本发明嵌合单抗rhA3结合人源THSD7A的亲和性曲线，其中，横线代表检出限。
图3示出了抗THSD7A人血清标准品的标准曲线。
图4示出了嵌合单抗rhA3作为标准品的标准曲线。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中未作具体说明的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例 1 重组人THSD7A蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体
1. 重组人THSD7A蛋白
免疫原：重组人THSD7A蛋白，瞬时转染293T细胞表达，制备免疫原，重组人THSD7A蛋白氨基酸序列如下：
AAQGEAEAPTLYLWKTGPWGRCMGDECGPGGIQTRAVWCAHVEGWTTLHTNCKQAERPNNQQNCFKVCDWHKELYDWRLGPWNQCQPVISKSLEKPLECIKGEEGIQVREIACIQKDKDIPAEDIICEYFEPKPLLEQACLIPCQQDCIVSEFSAWSECSKTCGSGLQHRTRHVVAPPQFGGSGCPNLTEFQVCQSSPCEAEELRYSLHVGPWSTCSMPHSRQVRQARRRGKNKEREKDRSKGVKDPEARELIKKKRNRNRQNRQENKYWDIQIGYQTREVMCINKTGKAADLSFCQQEKLPMTFQSCVITKECQVSEWSEWSPCSKTCHDMVSPAGTRVRTRTIRQFPIGSEKECPEFEEKEPCLSQGDGVVPCATYGWRTTEWTECRVDPLLSQQDKRRGNQTALCGGGIQTREVYCVQANENLLSQLSTHKNKEASKPMDLKLCTGPIPNTTQLCHIPCPTECEVSPWSAWGPCTYENCNDQQGKKGFKLRKRRITNEPTGGSGVTGNCPHLLEAIPCEEPACYDWKAVRLGNCEPDNGKECGPGTQVQEVVCINSDGEEVDRQLCRDAIFPIPVACDAPCPKDCVLSTWSTWSSCSHTCSGKTTEGKQIRARSILAYAGEEGGIRCPNSSALQEVRSCNEHPCTVYHWQTGPWGQCIEDTSVSSFNTTTTWNGEASCSVGMQTRKVICVRVNVGQVGPKKCPESLRPETVRPCLLPCKKDCIVTPYSDWTSCPSSCKEGDSSIRKQSRHRVIIQLPANGGRDCTDPLYEEKACEAPQACQSYRWKTHKWRRCQLVPWSVQQDSPGAQEGCGPGRQARAITCRKQDGGQAGIHECLQYAGPVPALTQACQIPCQDDCQLTSWSKFSSCNGDCGAVRTRKRTLVGKSKKKEKCKNSHLYPLIETQYCPCDKYNAQPVGNWSDCILPEGKVEVLLGMKVQGDIKECGQGYRYQAMACYDQNGRLVETSRCNSHGYIEEACIIPCPSDCKLSEWSNWSRCSKSCGSGVKVRSKWLREKPYNGGRPCPKLDHVNQAQVYEVVPCHSDCNQYLWVTEPWSICKVTFVNMRENCGEGVQTRKVRCMQNTADGPSEHVEDYLCDPEEMPLGSRVCKLPCPEDCVISEWGPWTQCVLPCNQSSFRQRSADPIRQPADEGRSCPNAVEKEPCNLNKNCYHYDYNVTDWSTCQLSEKAVCGNGIKTRMLDCVRSDGKSVDLKYCEALGLEKNWQMNTSCMVECPVNCQLSDWSPWSECSQTCGLTGKMIRRRTVTQPFQGDGRPCPSLMDQSKPCPVKPCYRWQYGQWSPCQVQEAQCGEGTRTRNISCVVSDGSADDFSKVVDEEFCADIELIIDGNKNMVLEESCSQPCPGDCYLKDWSSWSLCQLTCVNGEDLGFGGIQVRSRPVIIQELENQHLCPEQMLETKSCYDGQCYEYKWMASAWKGSSRTVWCQRSDGINVTGGCLVMSQPDADRSCNPPCSQPHSYCSETKTCHCEEGYTEVMSSNSTLEQCTLIPVVVLPTMEDKRGDVKTSRAVHPTQPSSNPAGRGRTWFLQPFGPDGRLKT（SEQ ID No. 1）
现有技术中利用THSD7A蛋白对来自THSD7A相关pMN患者的血清样本进行检测时，THSD7A蛋白的N末端结构域能够被80%的患者识别。因此原因，目前现有技术中大多THSD7A蛋白的相关研究仅针对N端。在本实施例中，为了提供更加全面、准确的诊断，发明人选择全长THSD7A蛋白序列免疫小鼠。
2. 免疫小鼠
1）第1天：用生理盐水将重组人THSD7A蛋白稀释到2倍最终浓度，每针次5μg；
2）充分混合快速免疫佐剂（购自苏州博奥龙科技有限公司），无菌条件下取出该佐剂225μL与重组人THSD7A蛋白按体积1:1匀速混匀；
3）通过后腿小腿肌肉注射免疫Balb/c小鼠，每只小鼠注射100μL，免疫4只小鼠；
4）第21天按同样的方式加强免疫1针；
5）第35天采微量血进行ELISA测定，抗体滴度>10w，随后即可取脾。
3. 噬菌体抗体库的制备
小鼠脾脏提取RNA，反转录cDNA，通过PCR扩增获得scFv片段，使用限制性核酸内切酶Not I和Sfi I（NEB公司）对pCANTAN 5E质粒和scFv目的基因双酶切，再通过T4 DNALigase（NEB公司）连接，载体和目的基因摩尔比1：3，16℃过夜，利用酶连反应合成重组质粒。将1μg纯化产物通过电击转化到50μL TG1感受态细胞（Lucigen公司）中，37℃过夜后，甘油菌抗体库构建完成，用辅助噬菌体M13KO7（NEB公司）将甘油菌库转化为噬菌体库。
4. 单克隆抗体的筛选和测序
经过3轮固相淘筛得到抗重组人THSD7A蛋白单克隆抗体，筛选步骤如下：
重组人THSD7A蛋白（SEQ ID No. 1）2μg/mL PBS包被，4℃过夜；次日用PBST洗涤3次，每孔加入200μL含2% BSA的PBS溶液，室温孵育2h；用PBST洗涤3次，每孔加入100μL含1011pfu的噬菌体抗体库溶液，室温孵育2h；用PBST洗涤酶标板，每孔加入100μL的胰蛋白酶将结合到THSD7A蛋白的噬菌体洗脱；
用2YT培养基培养50mL TG1至OD600约0.5，将洗脱的600μL噬菌体溶液加入菌液中，37℃感染1h；在室温3000g离心30min取上清，在上清液中加入10mL的PEG/NaCl溶液，混匀冰上放置1h，期间隔10min混匀一次；之后室温3000g离心30min，弃上清；加入1mL无菌的PBS溶液重悬沉淀，得到1轮淘筛富集的噬菌体抗体库；
重复以上步骤3轮，取出100μL噬菌体抗体库溶液，感染20mL的OD600约0.5的TG1菌液，37℃感染1h；取200μL感染后菌液涂板，37℃倒置过夜；次日各挑92个单克隆接种到2YT培养基，37℃ 220rpm培养至OD600到0.5后加入辅助噬菌体M13KO7，37℃感染1h；在室温3000g离心30min取上清，即为单克隆噬菌体溶液，执行酶联免疫吸附试验（ELISA）获得9株阳性单克隆送去测序，将抗体的轻、重链可变区核苷酸序列克隆至真核表达载体中，准备细胞瞬时转染。
5. 细胞转染与筛选
提前复苏好待转染用的293T细胞，准备200mL，当细胞活率>98%准备转染，转染前一天传代将细胞密度调整为2×106个/mL。
转染当天，细胞密度调整为3×106个/mL，将表达载体与PEI按照1:3混合后加入准备好的细胞中，置于37℃、5% CO2、110rpm的摇床中培养。培养3-5天后将转染的细胞上清与对应抗原进行ELISA检测确认测出的抗体序列正确与否。
6. 细胞上清单抗的制备与纯化
将确认的阳性表达载体进行大量表达，继续培养3-5天后，收细胞悬液，10000g离心10min取上清，利用亲和层析法进行纯化。纯化后的单克隆抗体经过化学发光免疫系统检测分析灵敏度，选择LoD最小的1株阳性单克隆，命名为A3。
最终，小鼠抗THSD7A单抗A3的重链可变区核苷酸序列如下：
CAATCTGTTAAAGAATCCGGTGGCCGTTTAGTCACTCCTGGAGGGACCTTGACACTTACGTGTACTGTATCAGGTTTTTCGCTCAGTACCTATTACATGAGCTGGGTGCGCCAGGCTCCCGGCAAGGGACTAGAGTGGATTGGGTCTATCGAATCCTATGGTGATCGATACTATGCCACATGGGCAAAAGGCCGGTTCACGATATCAAAGACTTCGAGTACCACAGTTGACCTGAAAATGACGAGCTTAACTGCGTCTGATACCGCTACATACTTTTGCACGAGAAATGACTTGTCCTGGGATAACGACAATATTTGGGGACCAGGGACTCTTGTCACCGTATCATCG（SEQ ID No. 2）
其编码的氨基酸序列如下：
QSVKESGGRLVTPGGTLTLTCTVSGFSLSTYYMSWVRQAPGKGLEWIGSIESYGDRYYATWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTASDTATYFCTRNDLSWDNDNIWGPGTLVTVSS（SEQ ID No. 3）
其3个CDRs序列分别如下：
CDR-H1氨基酸序列为：TYYMS（SEQ ID No. 4）；
CDR-H2氨基酸序列为：SIESYGDRYYATWAKG（SEQ ID No. 5）；
CDR-H3氨基酸序列为：NDLSWDNDNI（SEQ ID No. 6）。
小鼠抗THSD7A单抗A3的轻链可变区核苷酸序列如下：
GATGTTCAAATGACTCAGACCCCTTCTTCCGTCTCAGTATCGGTGGGTGGCACAGTTACGATTAATTGTCAAGCTAGTCAGAGCGTCTATGGAAACAATGAATTAAACTGGTACCAACAGAAATCTGGGCAACCCCCAAAGTTGCTTATCTATAAAGCCGGTACTCTCGCATCCGGCGTACCGTCACGTTTTTCGGGAAGTGGGAGCGGTACCCAGTTCACACTAACGATATCTGACCTGGAGTGCGATGACGCGGCTATTTACTATTGTCAAGGCGGATACTGGGGGCAGCGCGCCTTTGGTGGCGGAACTAAGTTAGAAATCAAA（SEQ ID No. 7）
其编码的氨基酸序列如下：
DVQMTQTPSSVSVSVGGTVTINCQASQSVYGNNELNWYQQKSGQPPKLLIYKAGTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISDLECDDAAIYYCQGGYWGQRAFGGGTKLEIK（SEQ ID No. 8）
其3个CDRs序列分别如下：
CDR-L1氨基酸序列为：QASQSVYGNNELN（SEQ ID No. 9）；
CDR-L2氨基酸序列为：KAGTLAS（SEQ ID No. 10）；
CDR-L3氨基酸序列为：QGGYWGQRA（SEQ ID No. 11）。
实施例2 重组嵌合抗体A3单抗的制备和鉴定
1. 重组嵌合抗体A3单抗的结构
本实施例的重组嵌合抗体A3单抗（嵌合单抗rhA3）是指小鼠抗THSD7A单抗A3的重链可变区（VH）及恒定区1（CH1）与人IgG4的Fc连接，形成小鼠-人杂合重链，再与小鼠抗THSD7A单抗A3的轻链可变区（VL）及小鼠κ链恒定区（CL），形成嵌合抗体。这样形成的抗体保留了与抗原THSD7A的结合能力，同时包含人抗体IgG4的Fc部分，能与HRP标记的山羊抗人IgG相结合。
2. 嵌合单抗rhA3的制备
（1）嵌合单抗rhA3重链
小鼠抗THSD7A单抗A3的重链恒定区1（CH1）的氨基酸序列如下：
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKI（SEQ ID No. 12）
人IgG4的Fc的氨基酸序列如下：
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ ID No. 13）
由此，嵌合单抗rhA3的重链氨基酸序列如下：
QSVKESGGRLVTPGGTLTLTCTVSGFSLSTYYMSWVRQAPGKGLEWIGSIESYGDRYYATWAKGRFTISKTSSTTVDLKMTSLTASDTATYFCTRNDLSWDNDNIWGPGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（SEQ IDNo. 14）
即依次包括小鼠抗THSD7A单抗A3的重链可变区VH氨基酸序列（SEQ ID No. 3）、重链恒定区1（CH1）的氨基酸序列（SEQ ID No. 12）和人IgG4的Fc的氨基酸序列（SEQ ID No.13）。
经优化，嵌合单抗rhA3的重链核苷酸序列如下：
CAATCTGTTAAAGAATCCGGTGGCCGTTTAGTCACTCCTGGAGGGACCTTGACACTTACGTGTACTGTATCAGGTTTTTCGCTCAGTACCTATTACATGAGCTGGGTGCGCCAGGCTCCCGGCAAGGGACTAGAGTGGATTGGGTCTATCGAATCCTATGGTGATCGATACTATGCCACATGGGCAAAAGGCCGGTTCACGATATCAAAGACTTCGAGTACCACAGTTGACCTGAAAATGACGAGCTTAACTGCGTCTGATACCGCTACATACTTTTGCACGAGAAATGACTTGTCCTGGGATAACGACAATATTTGGGGACCAGGGACTCTTGTCACCGTATCATCGGCCAAGACAACGCCGCCTAGTGTGTATCCCCTCGCACCAGGTAGCGCGGCTCAAACTAACTCTATGGTTACCCTAGGCTGTCTGGTCAAAGGATACTTCCCGGAGCCTGTAACAGTGACGTGGAATTCCGGGTCATTATCGAGTGGTGTTCATACTTTTCCCGCCGTCTTGCAGAGCGATCTTTATACCCTCTCTTCCTCAGTAACAGTGCCATCGAGTACGTGGCCGAGCGAAACTGTTACCTGCAACGTCGCACACCCTGCGTCTTCCACAAAGGTAGACAAAAAGATCGAGTCAAAATACGGCCCCCCATGTCCGCCTTGCCCCGCTCCAGAATTCCTAGGAGGGCCGTCGGTGTTTCTGTTCCCTCCCAAGCCAAAAGATACGTTAATGATAAGTAGGACTCCGGAGGTTACCTGTGTCGTAGTGGACGTTAGCCAAGAAGATCCTGAGGTCCAGTTTAATTGGTATGTAGACGGTGTGGAAGTTCATAACGCCAAGACAAAACCCCGTGAGGAACAATTCAATTCTACGTACCGCGTCGTATCCGTGTTGACTGTTCTTCACCAGGATTGGCTCAACGGCAAGGAGTATAAATGCAAGGTCTCAAATAAAGGACTACCATCGAGTATTGAAAAGACCATCAGCAAAGCAAAGGGGCAACCGCGAGAGCCTCAGGTATACACACTGCCCCCATCTCAAGAAGAGATGACGAAAAACCAGGTGTCCTTAACTTGTTTGGTTAAGGGTTTTTATCCGTCAGACATAGCGGTCGAATGGGAGTCGAATGGCCAACCTGAAAACAATTACAAAACCACACCCCCAGTACTTGATAGTGACGGAAGCTTCTTTCTCTATTCTCGGCTAACGGTGGATAAGTCCAGATGGCAGGAGGGGAACGTTTTCTCATGCTCGGTCATGCATGAAGCTCTGCACAATCATTACACTCAAAAAAGTTTAAGCTTGTCTCTTGGTAAG（SEQ ID No. 15）
（2）嵌合单抗rhA3轻链
小鼠κ链的恒定区（CL）的氨基酸序列如下：
RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（SEQ ID No. 16）
由此，嵌合单抗rhA3的轻链氨基酸序列如下：
DVQMTQTPSSVSVSVGGTVTINCQASQSVYGNNELNWYQQKSGQPPKLLIYKAGTLASGVPSRFSGSGSGTQFTLTISDLECDDAAIYYCQGGYWGQRAFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC（SEQID No. 17）
即依次包括小鼠抗THSD7A单抗A3的轻链可变区VL氨基酸序列（SEQ ID No. 8）、小鼠κ链的恒定区（CL）的氨基酸序列（SEQ ID No. 16）。
经优化，嵌合单抗rhA3的轻链核苷酸序列如下：
GATGTTCAAATGACTCAGACCCCTTCTTCCGTCTCAGTATCGGTGGGTGGCACAGTTACGATTAATTGTCAAGCTAGTCAGAGCGTCTATGGAAACAATGAATTAAACTGGTACCAACAGAAATCTGGGCAACCCCCAAAGTTGCTTATCTATAAAGCCGGTACTCTCGCATCCGGCGTACCGTCACGTTTTTCGGGAAGTGGGAGCGGTACCCAGTTCACACTAACGATATCTGACCTGGAGTGCGATGACGCGGCTATTTACTATTGTCAAGGCGGATACTGGGGGCAGCGCGCCTTTGGTGGCGGAACTAAGTTAGAAATCAAACGAGCAGATGCGGCTCCTACCGTGTCCATATTCCCCCCATCATCGGAGCAATTGACAAGTGGGGGTGCCAGCGTTGTCTGCTTTCTTAATAACTTCTATCCGAAGGACATTAATGTAAAATGGAAGATCGATGGCTCTGAACGGCAGAACGGAGTGCTCAATTCCTGGACGGACCAAGATTCAAAAGACTCGACTTACAGTATGAGCTCTACCCTAACACTGACGAAGGATGAGTATGAAAGACATAACTCCTACACTTGTGAGGCAACCCACAAAACATCAACGTCGCCTATAGTTAAGAGTTTTAATAGGAACGAATGC（SEQ ID No. 18）
（3）嵌合单抗rhA3的制备
本实施例的嵌合单抗rhA3的制备方法包括如下步骤：
将上述重链核苷酸序列和轻链核苷酸序列分别构建至pcDNA3.4表达载体，转染HEK-293细胞，通过Protein A纯化获得嵌合抗体，通过SDS-PAGE电泳确认得到的rhA3抗体轻重链完整，条带清晰，抗体纯度>95%，如图1所示，将纯化后的抗体定量、分装、冻存后备用。
经鉴定，所得嵌合单抗rhA3包括重链和轻链。
3. 嵌合单抗rhA3结合人源THSD7A（hTHSD7A）效果
重组人THSD7A蛋白（SEQ ID No. 1）0.2μg/孔（2μg/mL，加100μL）包被在96孔微孔板，4℃过夜；2% BSA在37℃封闭2h；分别加入不同浓度的嵌合单抗rhA3，37℃孵育1h；PBST洗板3次后加入HRP标记的山羊抗人IgG（Thermo公司），37℃孵育0.5h；PBST洗板5次后加入TMB显色液（上海碧云天生物技术有限公司），37℃孵育10min后加入2M硫酸终止反应，测定OD450。
结果如图2所示，表明嵌合单抗rhA3与THSD7A抗原结合的同时能够被抗人IgG二抗识别。
实施例3 嵌合单抗rhA3作为标准品检测抗THSD7A人血清标准品
1. 抗THSD7A人血清标准品，检测嵌合单抗rhA3
具体检测方法如下：
重组人THSD7A蛋白（SEQ ID No. 1）PBS稀释至2μg/mL，4℃包被过夜；PBST洗板3次，2% BSA，200μL/孔在37℃封闭2h；PBST洗板3次，使用抗THSD7A人血清标准品（科翰盛生物公司），共5个浓度点（320U/mL、160U/mL、80U/mL、40U/mL、20U/mL），100μL/孔，37℃孵育1h；稀释嵌合单抗rhA3（同实施例2）至最高浓度为100ng/mL，5倍梯度稀释共3个浓度点（100ng/mL、20ng/mL、4ng/mL），100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗板3次，加入HRP标记的山羊抗人IgG，37℃孵育0.5h；PBST洗板5次，加入TMB显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入2M硫酸终止反应，测定OD450。以抗THSD7A人血清标准品测定值采用ELISA拟合计算程序绘制标准曲线并计算嵌合单抗rhA3的值。
结果如图3所示，可以看出标准品检测符合四参数回归方法，拟合曲线相关系数R2值大于0.99。
检测嵌合单抗rhA3数据如表1所示。
表1 检测嵌合单抗rhA3数据
从表1中可以看出，本实施例检测了嵌合单抗rhA3的3个浓度，即100ng/mL、20ng/mL和4ng/mL，依次代入血清标准曲线测得含有THSD7A抗体浓度分别为304.783U/mL、60.4501U/mL和12.0304 U/mL，对应比活分别为3.04783U/ng、2.9933U/ng和3.0076U/ng，结果一致。可以确定嵌合单抗rhA3每ng含有约3.0U THSD7A抗体活性。
2. 嵌合单抗rhA3作为标准品，检测抗THSD7A人血清标准品
将嵌合单抗rhA3作为标准品，检测抗THSD7A人血清标准品（同上），具体检测方法如下：
重组人THSD7A蛋白（SEQ ID No. 1）PBS稀释至2μg/mL，4℃包被过夜；PBST洗板3次，2% BSA，200μL/孔在37℃封闭2h；PBST洗板3次，稀释嵌合单抗rhA3（同实施例2）至最高浓度为100ng/mL，2倍梯度稀释共7个浓度点（100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.5625ng/mL），100μL/孔，37℃孵育1h；稀释抗THSD7A人血清标准品至300U/mL，5倍梯度稀释共3个浓度点（300U/mL、60U/mL、12U/mL），100μL/孔，37℃孵育1h；PBST洗板3次，加入HRP标记的山羊抗人IgG，37℃孵育0.5h；PBST洗板5次，加入TMB显色液100μL/孔，37℃孵育10min后加入2M硫酸终止反应，测定OD450。以嵌合单抗rhA3标准品测定值采用ELISA拟合计算程序绘制标准曲线并计算抗THSD7A人血清标准品的值。
结果如图4所示，抗THSD7A人血清标准品检测符合四参数回归方法，拟合曲线相关系数R2值大于0.99。
检测抗THSD7A人血清标准品数据如表2所示。
表2 检测人血清标准品数据
从表2中可知，本实施例检测了抗THSD7A人血清标准品高中低3个活性浓度，即高浓度300U/mL、中浓度60U/mL和低浓度12U/mL，依次代入嵌合单抗rhA3标准曲线测得含有抗THSD7A抗体浓度分别101.005ng/mL、20.169ng/mL和3.984ng/mL，对应比活分别为2.97U/ng、2.97U/ng和3.01U/ng，结果一致，与标识活性3.0U/ng误差依次为-2.97%，-2.51%，1.2%，均<±5%，表明嵌合单抗rhA3可以替代人血清作为标准品。
实施例4 嵌合单抗rhA3作为标准品联合抗THSD7A人血清标准品检测患者血清样本
重组人THSD7A蛋白（SEQ ID No. 1）PBS稀释至2μg/mL，4℃包被过夜；PBST洗板3次，2% BSA，200μL/孔在37℃封闭2h；PBST洗板3次，稀释嵌合单抗rhA3至最高浓度为100ng/mL，2倍梯度稀释共7个浓度点（100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.5625ng/mL），100μL/孔，37℃孵育1h；同时用稀释液做空白对照；用抗THSD7A人血清标准品（科翰盛生物公司），共5个浓度点（320U/mL、160U/mL、80U/mL、40U/mL、20U/mL），100μL/孔，37℃孵育1h；同时稀释患者血清样本101倍，100μL/孔，37℃孵育1h；同时用稀释液做空白对照；PBST洗板3次，加入10000倍稀释的HRP标记的山羊抗人IgG（Thermo公司），37℃孵育0.5h；PBST洗板5次，加入TMB显色液（碧云天公司）100μL/孔，37℃孵育10min后加入2M硫酸终止反应，测定OD450。
采用ELISA拟合计算程序绘制标准曲线并计算各血清样本对应的THSD7A自身抗体含量，并且和定量限比较，得出阳性例，结果如表3所示。
表3 血清样本检测结果
/>
从表3中可知，两种标准品方法检测了62例特发性膜型肾病患者血清中抗THSD7A抗体的含量，利用THSD7A（货号：FB 1254-1010-1）测试出7例阳性，由实验中标准品的稀释倍数得出，抗THSD7A人血清标准品的定量限20U/mL，而嵌合单抗rhA3标准品的定量限小于10U/mL；抗THSD7A人血清标准品的检测阳性率（与THSD7A，货号：FB 1254-1010-1比较）为85.7%，而嵌合单抗rhA3标准品的检测阳性率为100%，并且在48例其他肾病和100例健康人中，均无一例阳性。
以上结果说明：嵌合单抗rhA3作为标准品较抗THSD7A人血清标准品定量限低，阳性检出率高，其余检测结果均100%一致。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种抗THSD7A单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合部分包含：
重链可变区，其CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 4~SEQ IDNo. 6所示；
轻链可变区，其CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 9~SEQ IDNo. 11所示。
2.根据权利要求1所述的抗THSD7A单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合部分包含：
重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；
轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示。
3.根据权利要求2所述的抗THSD7A单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述单克隆抗体为嵌合抗体。
4.根据权利要求3所述的抗THSD7A单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述单克隆抗体或其抗原结合部分包含：
重链，其氨基酸序列如SEQ ID No. 14所示；
轻链，其氨基酸序列如SEQ ID No. 17所示。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗THSD7A单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述抗原结合部分选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fv和scFv中的任一种。
6.编码权利要求1~5任一所述的抗THSD7A单克隆抗体或其抗原结合部分的基因。
7.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求6所述的基因。
8.一种重组细胞，其特征在于，包括权利要求7所述的重组载体。
9.一种抗THSD7A单克隆抗体或其抗原结合部分的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求6所述的基因克隆至表达载体上，得到重组载体，再将所述重组载体转染或转化至宿主细胞中，得到重组细胞，诱导所述重组细胞表达。
10.权利要求1~5任一所述的抗THSD7A单克隆抗体或其抗原结合部分在制备用于检测生物样本中抗THSD7A抗体的标准品的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410494182.6A CN118063606A (zh) | 2024-04-24 | 2024-04-24 | 一种抗thsd7a单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410494182.6A CN118063606A (zh) | 2024-04-24 | 2024-04-24 | 一种抗thsd7a单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118063606A true CN118063606A (zh) | 2024-05-24 |
Family
ID=91095631
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410494182.6A Pending CN118063606A (zh) | 2024-04-24 | 2024-04-24 | 一种抗thsd7a单克隆抗体及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118063606A (zh) |
-
2024
- 2024-04-24 CN CN202410494182.6A patent/CN118063606A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7001474B2 (ja) | 非免疫原性単一ドメイン抗体 | |
| EP2890711B1 (en) | Method for producing antibody molecules having inter-species, intra-target cross-reactivity | |
| EP3798236B1 (en) | Antibody screening methods | |
| CN111748033B (zh) | 一种与新型冠状病毒np蛋白结合的分离抗体、包含其的检测试剂盒 | |
| Tsurushita et al. | Humanization of a chicken anti-IL-12 monoclonal antibody | |
| CN109678958B (zh) | 一种人NT-proBNP特异性重组羊单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| DK2504359T3 (da) | Monospecifikke polypeptidreagenser | |
| CN111793132A (zh) | 人源降钙素原的单克隆抗体其制备方法和用途 | |
| KR20150077891A (ko) | 항 wrs 모노클로날 항체 및 이의 용도 | |
| AU2009312731B2 (en) | Antibodies to modified human IGF-1/E peptides | |
| CN113388035A (zh) | 特异性针对人tslp的抗体及其应用 | |
| CN109336973B (zh) | 抗转铁蛋白抗体及其用途 | |
| KR20150077770A (ko) | 항 hrs 모노클로날 항체 및 이의 용도 | |
| CA2901644A1 (en) | Agents, kits and methods for complement factor h-related protein 1 detection | |
| CN118063606A (zh) | 一种抗thsd7a单克隆抗体及其制备方法和应用 | |
| CN111892657A (zh) | 用于检测米田堡血型抗原的抗体及其片段、试剂盒及方法 | |
| CN117946264B (zh) | 一种抗Tau蛋白单克隆抗体及其应用 | |
| KR20210068408A (ko) | 가용성 bcma에 대한 항체 | |
| CN113912729B (zh) | 针对sST2的单域抗体及其衍生蛋白和应用 | |
| CN117143227B (zh) | 结合冠状病毒SARS-CoV-2和SARS-CoV核衣壳蛋白的特异性抗体及其应用 | |
| CN113461822B (zh) | Scl-70抗体或其结合片段、其筛选方法及包含其的检测试剂盒 | |
| WO2023092314A1 (zh) | 结合bp特异性抗原肽的人源抗体、制备方法及用途 | |
| CN112079928B (zh) | 一种抗pd-l1的单克隆抗体 | |
| EP3665203B1 (en) | Method for determining anti-drug antibodies in a minipig sample | |
| WO2008035463A1 (fr) | Procédé de commutation de classe d'anticorps |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |