CN113388035A

CN113388035A - 特异性针对人tslp的抗体及其应用

Info

Publication number: CN113388035A
Application number: CN202010173289.2A
Authority: CN
Inventors: 毕建军; 徐晓红; 王骊淳; 任红媛; 焦莎莎; 王晋; 蔺利娟; 林鉴; 陶春艳; 吴建; 朱戬; 胡蓉蓉
Original assignee: Shanghai Puming Biotechnology Co ltd; Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Puming Biotechnology Co ltd; Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-13
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2021-09-14

Abstract

本发明提供了一种结合人胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的抗体分子及其抗原结合片段，以及所述抗体分子或其抗原结合片段用于预防或治疗涉及TSLP高表达的用途。本发明的抗体分子及其抗原结合片段能够以高亲和力结合人TSLP，阻断TSLP与其受体之间的相互作用，且显著抑制树突状细胞分泌CCL17、OPG等趋化因子，可用于治疗与TSLP信号传递和/或TSLP细胞表达有关的疾病和病症，例如炎性疾病或肿瘤。

Description

特异性针对人TSLP的抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及特异性结合胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的抗体分子及其抗原结合片段，以及所述抗体分子及其抗原结合片段的应用。

背景技术

胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是上皮细胞受到促炎性刺激产生的一种细胞因子，1994年Friend首次从胸腺基质细胞的培养上清中分离获得。人TSLP(hTSLP)具有异构体Ⅰ和异构体Ⅱ2种同型异构体，异构体Ⅰ为159个氨基酸的蛋白分子，异构体Ⅱ为60个氨基酸的蛋白分子。

TSLP受体(TSLPR)是一种二聚体，由IL-7R-α链和TSLPR-γ链组成。功能性TSLPR复合物由TSLPR和IL-7Rα组成，在人树突细胞和单核细胞中，只有TSLPR和IL-7Rα同时表达时，TSLP才能诱导细胞内Stat3和Stat5磷酸化。

研究发现，TSLP作用于树突状细胞(dendritic cell，DC)和肥大细胞，驱动机体致敏性炎症反应。TSLP可以支持B淋巴细胞的生长、分化以及T细胞增殖，尤其对树突状细胞的活化、分化、成熟和迁移起着重要的调控作用。体外研究显示TSLP能够活化CD11c树突状细胞，活化的DC能表达聚集Th2的化学因子TARC和MDC。另外，被TSLP激活的DC还可以启动CD4T细胞前体向Th2转化，这些Th2细胞能够产生过敏性因子IL-4、IL-5、IL-13和肿瘤坏死因子α，同时减少IL-10和IFN-γ的生成。hTSLP诱导的DC细胞营造Th2型微环境。hTSLP诱导DC细胞产生CCL17、CCL22等趋化CD4+Th2型细胞的趋化因子，也可诱导DC细胞表达OX40L，进而诱导T细胞表达IL-4、IL-5及IL-13。上皮细胞产生的TSLP可刺激外周血CD11c+DC显著上调CD40和CD80的表达。TSLP可激活效应细胞内Stat5分子等。

TSLP在过敏性哮喘发生发展中扮演重要角色，临床研究发现，哮喘患者的支气管肺泡灌洗液中可检测到TSLP表达水平升高，并且同疾病的严重程度呈正相关，证实TSLP和人类哮喘病存在很大联系。同时，临床前数据也显示TSLP在哮喘疾病的发生发展过程中起到重要作用，靶向TSLP能抑制多个哮喘相关的生物学通路，包括IL-4、IL-5和IL-13；可以抑制下游T2细胞因子的释放和多种非T2细胞驱动的炎症反应。TSLP在炎症级联反应的早期上游活动，使其成为哮喘疾病治疗的一个明确靶点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，通过杂交瘤筛选和人源化技术，获得对人TSLP具有高亲和力和高功能活性的新抗体。

针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种抗人TSLP的抗体分子或其抗原结合片段，相比于现有抗TSLP抗体，所提供的抗体对人TSLP具有更高的亲和力和细胞活性。

本发明提供以下技术方案：

一方面，本发明提供一种抗体分子或其抗原结合片段，所述抗体分子或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的重链CDR和轻链CDR的组合：

(1)依次示于SEQ ID NO:7、8、9的H-CDR1(GYTFTNY)、H-CDR2(NPGSGG)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、12的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQFDTLPYP)；

(2)依次示于SEQ ID NO:13、14、9的H-CDR1(NYFID)、H-CDR2(VINPGSGGTNFNEKFKG)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、12的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQFDTLPYP)；

(3)依次示于SEQ ID NO:15、16、9的H-CDR1(GYTFTNYFID)、H-CDR2(VINPGSGGTN)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、12的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQFDTLPYP)；

(4)依次示于SEQ ID NO:15、14、9的H-CDR1(GYTFTNYFID)、H-CDR2(VINPGSGGTNFNEKFKG)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、12的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQFDTLPYP)；

(5)依次示于SEQ ID NO:7、17、9的H-CDR1(GYTFTNY)、H-CDR2(DAFSGG)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQGNTLPYT)；

(6)依次示于SEQ ID NO:13、19、9的H-CDR1(NYFID)、H-CDR2(VIDAFSGGSNFNEKFKG)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQGNTLPYT)；

(7)依次示于SEQ ID NO:15、20、9的H-CDR1(GYTFTNYFID)、H-CDR2(VIDAFSGGSN)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQGNTLPYT)；

(8)依次示于SEQ ID NO:15、19、9的H-CDR1(GYTFTNYFID)、H-CDR2(VIDAFSGGSNFNEKFKG)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQGNTLPYT)；

(9)依次示于SEQ ID NO:23、8、9的H-CDR1(GYAFTNY)、H-CDR2(NPGSGG)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQGNTLPYT)；

(10)依次示于SEQ ID NO:13、14、9的H-CDR1(NYFID)、H-CDR2(VINPGSGGTNFNEKFKG)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQGNTLPYT)；

(11)依次示于SEQ ID NO:24、16、9的H-CDR1(GYAFTNYFID)、H-CDR2(VINPGSGGTN)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQGNTLPYT)；

(12)依次示于SEQ ID NO:24、14、9的H-CDR1(GYAFTNYFID)、H-CDR2(VINPGSGGTNFNEKFKG)、H-CDR3(ESEVGEGFAY)；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1(RASQDISNYLN)、L-CDR2(YTSTLHS)、L-CDR3(QQGNTLPYT)。

按照本领域公知的抗体分子重链可变区、轻链可变区的结构域组成，本发明抗体分子或其抗原结合片段的轻链可变区或重链可变区以FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的顺序包含上述结构域组分，其中FR为框架区。

优选地，在本发明提供的抗体分子或其抗原结合片段中，所述重链可变区包含选自以下的序列：示于SEQ ID NO:3、5或21的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，所述轻链可变区包含选自以下的序列：示于SEQ ID NO:4、6或22的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。

根据本发明的具体实施方式，在本发明提供的抗体分子或其抗原结合片段中，重链可变区和轻链可变区可选自以下组合：

(1)示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:3的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:5的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；

(2)示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:6的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；

(3)示于SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:21的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和，示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列或与示于SEQ ID NO:22的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。

其中，所述“至少75％同一性”导致的氨基酸序列的至多25％差异可存在于重链可变区或轻链可变区中的任意框架区中，或者存在于本发明的抗体分子或其抗原结合片段中重链可变区和轻链可变区以外的任意结构域或序列中。所述差异可以由任何位置的氨基酸缺失、添加或置换产生，其中置换可以是保守置换或非保守置换。

优选地，本发明提供的抗体分子可以为鼠源抗体、嵌合抗体或者完全或部分人源化抗体；所述抗原结合片段为半抗体或者所述抗体分子的scFv、dsFv、(dsFv)₂、Fab、Fab'、F(ab')₂或Fv片段。

进一步优选地，所述抗体分子为单克隆抗体或单链抗体；

并且优选地，所述抗体分子或其抗原结合片段还包含恒定区，优选包含鼠或人的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)；进一步优选地，所述抗体分子或其抗原结合片段包含重链和轻链，例如两条重链和轻链。

更优选地，所述抗体分子或其抗原结合片段包含IgG、IgA、IgM、IgD或IgE的重链恒定区和/或κ或λ型轻链恒定区。

根据本发明的具体实施方式，所述抗体分子为单克隆抗体，优选为鼠或人源化的单克隆抗体；优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1或IgG2型，轻链恒定区为kappa型。

例如，所述单克隆抗体的重链恒定区包含示于SEQ ID NO:25的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链恒定区包含示于SEQ ID NO:26的氨基酸序列或者与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。

在本发明的上下文中，“至少75％同一性”为75％至100％之间的任何百分比数字的同一性，例如75％、80％、85％、90％，甚至91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。

本发明提供的抗体分子或其抗原结合片段为抗胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的抗体分子或其抗原结合片段；优选地，所述TSLP为哺乳动物TSLP、例如人TSLP。

实验证明，本发明的抗体分子或其抗原结合片段能够以高亲和力结合TSLP；能够阻断TSLP与TSLPR的结合；能够抑制BAF/3-TSLPR细胞报告基因表达；能够抑制树突细胞分泌CCL17和OPG。并且，本发明的抗体分子或其抗原结合片段不识别IL7。

另一方面，本发明提供一种核酸分子，其包含编码本发明抗体分子或其抗原结合片段中包含的轻链可变区、重链可变区、重链或轻链的核苷酸序列。

本发明的核酸分子可以被克隆到载体中，所述载体可以是表达载体，或者转化或转染载体。因此又一方面，本发明还提供一种载体，所述载体包含本发明的核酸分子。所述载体可以为真核表达载体、原核表达载体、人工染色体及噬菌体载体等。

本发明的载体或核酸分子可以用于转化或转染宿主细胞，用于保存或抗体表达等目的。因此，还一方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明的核酸分子和/或载体，或者所述宿主细胞被本发明的核酸分子和/或载体转化或转染。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌或昆虫、真菌、植物或动物细胞。

本发明提供的抗体分子可以利用本领域已知的任何方法获得。例如，可以先由本发明提供的核酸分子获得所述抗体分子的重链可变区和/或轻链可变区，或者获得所述抗体的重链和/或轻链，然后与所述抗体分子的任选其他结构域组装成抗体；或者，在允许本发明提供的宿主细胞表达所述抗体分子的重链可变区和/或轻链可变区或者所述抗体分子的重链和/或轻链以组装成所述抗体分的情况下，培养所述宿主细胞。任选地，所述方法还包括回收产生的抗体分子的步骤。

本发明提供的抗体分子或其抗原结合片段、核酸分子、载体和/或宿主细胞可以被包含在组合物中，更特别地被包含在药物组合物、例如药物制剂中，从而根据实际需要用于各种目的。因此，在又一方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物包含本发明所述的抗体分子或其抗原结合片段、核酸分子、载体和/或宿主细胞。所述组合物可以为药物组合物，其任选地还包含药学上可接受的载体、辅料或赋形剂。

再一方面，本发明还提供所述抗体分子或其抗原结合片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗炎性疾病或肿瘤。优选地，所述炎性疾病选自哮喘、过敏性皮炎、慢性阻塞性肺炎(COPD)和过敏性鼻炎；优选地，所述哮喘包括Th2型和非Th2型哮喘；所述肿瘤选自霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤和肺癌。

另一方面，本发明还提供一种预防或治疗炎性疾病或肿瘤的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用本发明的抗体分子或其抗原结合片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物。优选地，所述炎性疾病选自哮喘、过敏性皮炎、慢性阻塞性肺炎(COPD)和过敏性鼻炎；优选地，所述哮喘包括Th2型和非Th2型哮喘；所述肿瘤选自霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤和肺癌。

其中，所述受试者为哺乳类动物，更优选人。

再一方面，本发明还提供所述抗体分子或其抗原结合片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物在制备用于诊断炎性疾病或肿瘤的试剂中的用途。优选地，所述炎性疾病选自哮喘、过敏性皮炎、慢性阻塞性肺炎(COPD)和过敏性鼻炎；优选地，所述哮喘包括Th2型和非Th2型哮喘；所述肿瘤选自霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤和肺癌。

由此相应地，本发明还提供一种诊断炎性疾病或肿瘤的方法，所述方法包括使本发明的抗体分子或其抗原结合片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物与来自受试者的样品相接触。优选地，所述炎性疾病选自哮喘、慢性阻塞性肺炎(COPD)、过敏性皮炎和过敏性鼻炎；优选地，所述哮喘包括Th2型和非Th2型哮喘；所述肿瘤选自霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤和肺癌。

其中，所述受试者为哺乳类动物，更优选人。

由此相应地，又一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明的抗体分子或其抗原结合片段、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物。所述试剂盒可以用于治疗或诊断用途。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示了10只小鼠的血清中TSLP抗体滴度。

图2显示了杂交瘤单克隆细胞培养上清的TSLPR阻断能力，其中图2A至图2D分别为第1批至第4批单克隆细胞的结果。

图3显示了杂交瘤单克隆细胞培养上清对BAF/3-TSLPR细胞报告基因表达的抑制作用的检测结果。

图4显示了嵌合抗体对BAF/3-TSLPR细胞报告基因表达的抑制作用的检测结果。

图5显示了抗体对TSLP与TSLPR结合的阻断作用的检测结果。

图6显示了人源化抗体与TSLP的结合动力学检测结果，其中图6A：hzD01Lm12；图6B：hzD01Hm5Lm4。

图7显示了人源化抗体对BAF/3-TSLPR细胞报告基因表达的抑制作用的检测结果。

图8显示了人源化抗体对树突细胞分泌CCL17和OPG的抑制作用的检测结果，其中图8A：CCL17；图8B：OPG。

图9显示了人源化抗体对人TSLP、小鼠TSLP和猴TSLP蛋白以及人IL7蛋白的种属交叉结合检测结果，其中图9A：hzD01Hm5Lm4；图9B：hzD01m12；图9C：AMG157；BLK：空白。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为市售购买产品。其中：

人TSLP：近岸公司，catalog#CK16。

小鼠(mouse)TSLP：义翘神州，catalog#51005-M08H。

猴(rhesus)TSLP：近岸公司，catalog#CR62。

人TSLPR：义翘神州，catalog#29749-H08H。

人IL7：近岸公司，catalog#C086。

人TSLPR(CRLF2)CDS：NM_022148.3。

人IL7R CDS：NM_002185.4。

采用如下已知抗体作为对照抗体：

AMG157：重链示于SEQ ID NO:1，轻链示于SEQ ID NO:2。将全合成的AMG157抗体轻链和重链基因分别克隆至真核表达载体中，获得AMG157轻、重链表达质粒，转入大肠杆菌扩增，分离获得大量含AMG157抗体轻链和重链的质粒，将二者与聚乙烯亚胺(PEI)混合后共转染入HEK293细胞中。细胞转染5-6天，取培养上清，利用ProA亲和层析柱对表达上清进行纯化，获得AMG157抗体重组蛋白。

IgG2亚类的重链恒定区：SEQ ID NO:25；κ亚类的轻链恒定区：SEQ ID NO:26

实施例1鼠源单克隆抗体的筛选

1.1单克隆细胞的制备

使用人TSLP蛋白按照文献所述常规方法(Lonberg,N.,et al.,nature368(1994)856-859；Fishwild,D.M.,et al.,Nat.Biotechnol.14(1996)845-851和WO 98/24884)对10只Balb/c小鼠进行免疫，然后通过抗原特异性ELISA来确定免疫小鼠血清中的抗TSLP效价。

将浓度为1ug/ml的TSLP溶液(在pH 9.6，0.1M NaHCO3中)包被在96孔板中，每孔100ul，4℃过夜孵育。然后洗去包被液，使用封闭液加入每孔，室温静置孵育2小时。将小鼠血清在PBSA(含1％BSA的PBS)中预稀释400倍，并1:2连续稀释10个稀释梯度至204800倍。洗去封闭液后，将稀释的血清加入板孔中在室温孵育1个小时。用PBST(0.05％Tween20-PBS)洗涤96孔板后加入100ul/孔1/30000稀释的二抗(HRP标记的羊抗小鼠IgG(Fcγ))，室温静置孵育45分钟，PBST洗涤三遍，加入室温平衡的TMB 20ul/孔，室温孵育10分钟，在450nm测量吸光度。10只小鼠的血清TSLP抗体滴度见图1。

对抗TSLP的血清效价大于1:100000的小鼠，在融合前4天，用TSLP对小鼠进行另外的腹腔注射加强免疫一次。取小鼠脾脏分离得到的脾细胞与骨髓瘤细胞P3X63Ag8.653使用电融合方法进行融合。

将融合后的杂交瘤细胞接种于384孔板中，培养14天后，以人TSLP蛋白(1ug/ml，pH9.6，0.1M NaHCO3)包被酶标板，加入HRP-羊抗小鼠IgG(Fcγ)，酶标仪读A490值，检测杂交瘤克隆培养上清中的抗体。检测孔A450值大于阴性对照孔A490值3倍以上判断为阳性。

共进行4批免疫融合和筛选。经检测鉴定，共获得多个抗体分泌阳性杂交瘤克隆，将结合实验筛选得到的分泌抗人TSLP抗体的杂交瘤细胞克隆，通过有限稀释的方法单细胞化，两轮亚克隆之后得到的每个杂交瘤细胞克隆只分泌一个抗体。

1.2单克隆细胞上清液的检测

将4批单克隆细胞扩增培养，取上清液进行TSLPR阻断能力检测。

以1ug/ml人TSLPR蛋白用NaHCO3缓冲液(pH9.6，0.1M)包被酶标板，4℃过夜；37℃用4％脱脂奶粉-PBS封闭2小时；用PBST(0.05％Tween20-PBS)洗三遍，加入TSLP-biotin(Acro，cat#TSP-H82E0，0.5ug/ml)溶液(在PBSA(含1％BSA的PBS)中)，以阴性克隆上清为对照。等体积加入单克隆细胞培养上清，常温混合静置1小时。经PBST(0.05％Tween20-PBS)洗三遍，加入1:40000稀释的Streptavidin-HRP，37℃孵育1小时；再经PBST(0.05％Tween20-PBS)洗涤，加入TMB显色液，避光反应10min后，加入2M H2SO4终止反应，酶标仪读A450值。

阻断抑制率(％)＝((阴性对照孔-单克隆上清孔)/阴性对照孔)*100％。经检测鉴定，获得多个具有阻断能力的杂交瘤单克隆，见图2中2A至图2D。

此外，检测上清液对报告基因表达的抑制作用。

在BAF/3细胞上过表达人TSLPR和人IL7R分子，并稳定转染STAT5-荧光素酶报告基因，将稳转细胞1E6每孔50ul加入白色底透板饥饿4小时。以培养基做阴性对照(N.C.)，取阴性对照和克隆上清100ul/well，在U底板中分别和同等体积人TSLP蛋白溶液(200ng/ml，PBSA(含1％BSA的PBS))共同孵育30分钟。加入50ul TSLP-待测样品混合溶液到50ul/well的细胞中，37℃5％CO2细胞培养箱中孵育16小时，加入100ul Bio-Glo Luciferase AssayReagent震荡5分钟，读取化学发光结果。见图3。

根据阻断实验和报告基因表达抑制实验结果，选择能力强的抗体克隆。杂交瘤细胞扩大培养后，按照RNAfast200试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)说明书步骤提取细胞总RNA；利用5×PrimeScript RT Master Mix(Takara)将杂交瘤细胞总RNA反转录成cDNA；使用简并引物(Anke Krebber.1997)和Extaq PCR试剂(Takara)扩增抗体轻链可变区IgVL(κ)和重链可变区VH序列；利用PCR clean-up Gel extraction试剂盒(Macherey-Nagel公司)纯化PCR扩增产物；按照pClone007 Simple Vector Kit试剂盒(擎科生物科技有限公司)说明书将扩增PCR产物连接至T载体并转化大肠杆菌感受态细胞，菌株扩增、抽提质粒后进行DNA测序获得单克隆抗体可变区序列。

克隆A20

>A20-VH

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>A20-VL

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克隆B01

>B01-VH

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克隆C13

>C13-VH

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>C13-VL

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克隆D01

>D01-VH(SEQ ID NO:21)

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>D01-VL(SEQ ID NO:22)

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克隆D02

>D02-VH

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克隆D04

>D04-VH

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>D04-VL

QIVLTQSPVIMSASLGEEITLTCSASSSVTYMHWYQQKSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQWSTYMNTFGGGTKLEIK

实施例2抗人TSLP鼠源抗体的体外亲和力的动力学研究。

利用Fortebio(BLITZ pro1.1.0.28)仪器分析鼠源抗体与人TSLP蛋白的结合动力学参数。

测定前先将AMC生物探针浸泡于kinetic buffer(PBS，含0.01％BSA，0.002％Tween20，pH7.4)中10分钟；然后将该探针置于含100nM的鼠源抗体的kinetic buffer(PBS，含0.01％BSA，0.002％Tween20，pH7.4)中1000秒，捕获鼠源抗体；进一步将探针与含100nM的抗原溶液(PBS，含0.01％BSA，0.002％Tween20，pH7.4)进行结合反应，结合时间600秒；之后将探针转移至kinetic buffer(PBS，含0.01％BSA，0.002％Tween20，pH7.4)中，进行解离反应，时间为600秒。实验完毕，扣除空白对照响应值，用软件进行1：1Langmuir结合模式拟合，计算抗原抗体结合的动力学常数，结果见表1。

表1.鼠抗与抗原的结合动力学检测结果

	Response	KD(M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
					IgG D01	0.5081	2.83E-09	7.96E+04	2.25E-04
IgG D02	0.5132	3.28E-09	7.33E+04	2.41E-04
					IgG D03	0.4585	1.03E-08	4.50E+04	4.65E-04
IgG D04	0.5195	3.63E-09	7.35E+04	2.67E-04
					IgG D05	0.4726	1.09E-08	3.59E+04	3.93E-04

实施例3抗人TSLP嵌合抗体的制备

选择高亲和力、高阻断能力、具有细胞活性的分子D01，抗体的重轻链可变区及其CDR结构域序列见表2。

表2.鼠抗的序列

将鼠源抗人TSLP单克隆抗体的重链可变区序列和公开发表的人单克隆抗体IgG2亚类的重链恒定区序列拼接在一起，构建到哺乳动物细胞表达载体中；将鼠源抗人TSLP单克隆抗体D01的轻链可变区序列和公开发表的人单克隆抗体κ亚类的轻链恒定区序列拼接在一起，构建到哺乳动物细胞表达载体中。构建好的抗人TSLP嵌合抗体的重链载体和轻链载体配对混合，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，使用ProteinA纯化得到抗人TSLP嵌合抗体蛋白xiD01。

按照实施例2描述的检测方法，使用Fortebio仪器分析嵌合抗体与人TSLP蛋白的结合动力学参数，结果见表3。

表3.嵌合抗体与抗原的结合动力学检测结果

	Response	KD(M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
					xiD01	0.3993	9.85E-10	3.61E+05	3.56E-04

检测嵌合抗体的细胞活性，即对报告基因表达的抑制作用。

如上，使用过表达人TSLPR、人IL7R和STAT5-荧光素酶的稳转BAF/3细胞株，考察抗体抑制报告基因的活性的能力。在BAF/3细胞上过表达人TSLPR和人IL7R分子，并稳定转染STAT5-荧光素酶报告基因，将稳转细胞1E6每孔50ul加入白色底透板饥饿4小时。将1mg/ml的抗体使用PBSA(含1％BSA的PBS)1:2系列稀释至8个梯度，100ul/well在U底板中和200ng/ml人TSLP PBSA(含1％BSA的PBS)溶液，共同孵育30分钟。加入50ul TSLP-抗体混合溶液到50ul/well细胞中，37℃5％CO2细胞培养箱中孵育16小时，加入100ul Bio-Glo LuciferaseAssay Reagent震荡5分钟，检测化学发光。结果见图4。

实施例4抗人TSLP鼠源抗体的人源化和亲和力成熟改造

综合Kabat、Chothia、Abm、CCG的抗体编码方案，确定鼠源抗体的重链和轻链的6个抗原互补决定簇(CDR)的氨基酸序列区域及支撑抗体保守三维构象的框架区域(frameworkregion)。随后通过分析搜索已知人源抗体序列，选择与鼠源抗体最为相似接近的人源抗体重链可变区序列，选择其抗体框架区序列作为模板，将鼠源抗体重链CDR与人源抗体框架区结合，最终生成人源化抗体重链可变区序列。同样过程，生成人源化抗体轻链可变区序列。

鼠源抗体CDR直接移植至人框架区的抗体分子结合活性下降，接下来采用酵母展示技术对分子进行亲和力成熟改造，对模板分子的重链可变区和轻链可变区的CDR区氨基酸进行随机突变建库，从中筛选出亲和力更高的候选抗体分子。并将框架区个别氨基酸做回复突变，从人源的氨基酸改回鼠源的。确定回复突变位点，一是对照设计好的人源化抗体序列和原始的鼠源抗体序列，检查有哪些氨基酸的不同；二是检查这些氨基酸是否对支持抗体结构起重要作用或者对与抗原的结合起重要作用，同时需要检查是否有一些潜在的翻译后修饰位点，如N(天冬酰胺)糖基化位点、N脱酰胺化位点、D(天冬氨酸)异构化位点等。人源化序列见下。

重链可变区

>hzD01 H(SEQ ID NO:3)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYFIDWVRQAPGQGLEWIGVINPGSGGTNFNEKFKGRVTMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARESEVGEGFAYWGQGTLVTVSS

>hzD01 Hm5(SEQ ID NO:5)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYFIDWVRQAPGQGLEWIGVIDAFSGGSNFNEKFKGRVTMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARESEVGEGFAYWGQGTLVTVSS

>hzD01 Hm6

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYFIDWVRQAPGQGLEWIGVIDSFSGGINFNEKFKGRVTMTRDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYFCARESEVGEGFAYWGQGTLVTVSS

轻链可变区

>hzD01 L

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSTLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK

>hzD01 Lm4(SEQ ID NO:6)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSTLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGNTLPYTFGQGTKLEIK

>hzD01 Lm12(SEQ ID NO:4)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSTLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQFDTLPYPFGQGTKLEIK

将工程改造后人源化抗体可变区重链基因构建到含人单克隆抗体IgG2亚类的重链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中；轻链基因构建到含人单克隆抗体κ亚类的轻链恒定区基因的哺乳动物细胞表达载体中。构建好的抗人TSLP人源化抗体的重链载体和轻链载体配对混合，使用聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞，约7天后收集细胞上清，使用ProteinA纯化得到抗人TSLP人源化抗体蛋白。

实施例5人源化抗体的体外阻断实验

使用Dojindo公司试剂盒(Dojindo#LK21)将APC偶联于人TSLP蛋白。此外，使用人TSLPR CDS与CHO细胞构建TSLPR过表达细胞，抗生素筛选4周获得稳转细胞。

将待测抗体从100ug/mL的起始浓度开始做3倍的梯度倍比稀释(PBSA(含1％BSA的PBS))，共11个浓度点，各个浓度点的抗体取100ul加入96孔板，同100ul APC偶连的TSLP抗原(1.6ug/mL)(在PBSA(含1％BSA的PBS)中)共同孵育1个小时。加入100ul过表达TSLPR的CHO细胞(1E5/孔)孵育1个小时，用含0.5％BSA的PBS洗涤细胞一次，用流式细胞仪分析细胞群的平均荧光读值。结果见图5。

检测结果可知，就阻断TSLP与TSLPR的结合而言，两个人源化抗体分子实现了与对照抗体AMG157基本相当的阻断效果。抗体的重轻链可变区及其CDR结构域序列见表4。

表4.人源化抗体的序列

实施例6抗人TSLP人源化抗体的体外结合实验

参照实施例2的操作，进行抗人TSLP人源化抗体的体外亲和力的动力学研究。结果见表5以及图6中的图6A和图6B。

表5.人源化抗体与抗原的结合动力学检测结果

	Response	KD(M)	kon(1/Ms)	kdis(1/s)
					AMG157	0.3786	1.66E-10	6.66E+05	1.10E-04
hzD01Hm5Lm4	0.3685	6.37E-11	6.25E+05	3.98E-05
					hzD01Lm12	0.4262	9.83E-11	6.19E+05	6.08E-05

实施例7抗人TSLP人源化抗体的体外细胞学试验

7.1抑制BAF/3-TSLPR细胞报告基因表达

按照实施例3中针对嵌合抗体所描述的检测方法，梯度稀释人源化TSLP抗体，评估其抑制BAF/3-TSLPR细胞荧光素酶能力。结果见图7。

7.2抑制树突细胞分泌CCL17和OPG

用人外周血淋巴细胞，按照美天旎公司试剂说明(catalog#130-090-506)分选树突细胞，每孔100ul(5E4细胞/孔)铺96孔板，24小时后观察细胞展开。配制人TSLP蛋白在PBSA(含1％BSA的PBS)中检测浓度40ng/ml，抗体浓度4000ng/ml开始1:2梯度稀释(在PBSA(含1％BSA的PBS)中)，抗体和TSLP溶液等体积混合静置30分钟，取100ul混合液加入细胞培养孔中，继续培养48小时，用CCL17和OPG ELISA试剂盒检测上清液中两种细胞因子的浓度，见图8中的图8A和图8B。

实施例8抗人TSLP人源化抗体的种属交叉结合性以及结构近似分子IL7的交叉结合性研究

将人TSLP、小鼠TSLP和猴TSLP蛋白，以及人IL7蛋白(1ug/ml，pH9.6，0.1MNaHCO3)，分别包被96孔板，4℃，过夜；用4％脱脂奶粉-PBS封闭，37℃，2小时；用PBST(0.05％Tween20-PBS)洗三遍，加入抗人TSLP人源化抗体，37℃温育1小时。经PBST洗三遍，加入HRP-羊抗人IgG(Jackson#109-035-003)，1:10000稀释，37℃，1小时；再经PBST洗三遍，加入TMB显色液，避光显色10min，加入2M H2SO4终止反应；酶标仪读A490值。

结果可知，本发明的抗体分子hzD01Hm5Lm4和hzD01Lm12均识别人TSLP和猴TSLP分子，同IL7没有非特异性识别。见图9中的9A、9B和图9C。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110> 迈威（上海）生物科技有限公司

上海普铭生物科技有限公司

北京科诺信诚科技有限公司

<120> 特异性针对人TSLP的抗体及其应用

<130> LC20110015

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Thr Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asn

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Gln Trp Glu Leu Val His Glu Ala Phe Asp Ile Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys

210 215 220

Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Leu Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Trp Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Gly Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln

115 120 125

Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly

130 135 140

Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly

145 150 155 160

Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala

165 170 175

Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser

180 185 190

Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val

195 200 205

Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Phe Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Glu Val Gly Glu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Phe Asp Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Phe Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asp Ala Phe Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Glu Val Gly Glu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

1 5

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Asn Pro Gly Ser Gly Gly

1 5

<210> 9

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Glu Ser Glu Val Gly Glu Gly Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Gln Gln Phe Asp Thr Leu Pro Tyr Pro

1 5

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

Asn Tyr Phe Ile Asp

1 5

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Phe Ile Asp

1 5 10

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn

1 5 10

<210> 17

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

Asp Ala Phe Ser Gly Gly

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 19

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

Val Ile Asp Ala Phe Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

Val Ile Asp Ala Phe Ser Gly Gly Ser Asn

1 5 10

<210> 21

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Phe Ile Asp Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Glu Val Gly Glu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 22

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 23

Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr

1 5

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 24

Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Phe Ile Asp

1 5 10

<210> 25

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 25

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 26

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 26

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

Claims

1.一种抗体分子或其抗原结合片段，所述抗体分子或其抗原结合片段包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)包含选自以下的重链CDR和轻链CDR的组合：

(1)依次示于SEQ ID NO:7、8、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、12的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；

(2)依次示于SEQ ID NO:13、14、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、12的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；

(3)依次示于SEQ ID NO:15、16、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、12的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；

(4)依次示于SEQ ID NO:15、14、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、12的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；

(5)依次示于SEQ ID NO:7、17、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；

(6)依次示于SEQ ID NO:13、19、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；

(7)依次示于SEQ ID NO:15、20、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；

(8)依次示于SEQ ID NO:15、19、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；

(9)依次示于SEQ ID NO:23、8、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；

(10)依次示于SEQ ID NO:13、14、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；

(11)依次示于SEQ ID NO:24、16、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；

(12)依次示于SEQ ID NO:24、14、9的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；和，依次示于SEQ ID NO:10、11、18的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗体分子或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区包含选自以下的序列：

示于SEQ ID NO:3、5或21的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和

所述轻链可变区包含选自以下的序列：

示于SEQ ID NO:4、6或22的氨基酸序列或与所述氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的抗体分子或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体分子或其抗原结合片段包含的重链可变区和轻链可变区选自以下组合：

4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体分子为鼠源抗体、嵌合抗体或者完全或部分人源化抗体；所述抗原结合片段为半抗体或者所述抗体分子的scFv、dsFv、(dsFv)₂、Fab、Fab'、F(ab')₂或Fv片段；

优选地，所述抗体分子为单克隆抗体或单链抗体；

优选地，所述抗体分子或其抗原结合片段还包含恒定区，优选包含鼠或人的重链恒定区(CH)和/或轻链恒定区(CL)；优选地，所述抗体分子或其抗原结合片段包含重链和轻链；

5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体分子为单克隆抗体，优选为人源化的单克隆抗体；

优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区为IgG1或IgG2型，轻链恒定区为kappa型；

优选地，所述抗体分子或其抗原结合片段为抗胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的抗体分子或其抗原结合片段；优选地，所述TSLP为哺乳动物、例如人TSLP。

6.一种核酸分子，其包含编码权利要求1至5中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段中包含的轻链可变区、重链可变区、重链或轻链的核苷酸序列。

7.一种载体，其包含权利要求6所述的核酸分子。

8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的核酸分子和/或权利要求7所述的载体，或者所述宿主细胞被权利要求6所述的核酸分子和/或权利要求7所述的载体转化或转染。

9.一种组合物，其包含权利要求1至5中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的宿主细胞；

优选地，所述组合物为药物组合物，其可选地还包含药学上可接受的载体、辅料或赋形剂。

10.权利要求1至5中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞或权利要求9所述的组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗炎性疾病或肿瘤；

优选地，所述炎性疾病选自哮喘、过敏性皮炎、慢性阻塞性肺炎和过敏性鼻炎；

优选地，所述哮喘包括Th2型和非Th2型哮喘；优选地，所述肿瘤选自霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、胰腺癌、黑色素瘤和肺癌。

11.一种试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1至5中任一项所述的抗体分子或其抗原结合片段、权利要求6所述的核酸分子、权利要求7所述的载体、权利要求8所述的宿主细胞或者权利要求9所述的组合物。