KR20230044256A - Il-5의 결합 분자 및 그 제조 방법과 응용 - Google Patents
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Abstract
IL-5의 결합 분자 및 그 제조 방법과 응용을 개시한다. 결합 분자는, CDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.43~49로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되고; CDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.50~56으로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되며; CDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.57~62로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되는 상보성 결정 영역을 포함한다. 상기 결합 분자는 IL-5에 특이적으로 결합할 수 있고, IL-5에 의해 유도되는 세포 증식을 효과적으로 차단할 수 있으며, 자가면역 질환과 같은 IL-5 관련 질환의 예방, 진단 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 의약 생물 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로, IL-5의 결합 분자 및 그 제조 방법과 응용에 관한 것이다.
인간 인터루킨5, Interleukin-5, 또는 IL-5라고도 지칭되고, IL-13 및 과립구-대식구집락자극인자(GM-CSF)는 모두 조혈 및 염증에 참여하는 사이토카인이다. 모든 세 가지 사이토카인은 모두 호산구 생성, 기능 발휘 및 세포 생존을 촉진하므로, 호산구가 중요한 역할을 하는 천식, 아토피 피부염 및 알레르기성 비염과 같은 염증성 질환에 영향을 미치는 능력이 있다.
호산구 특이적 사이토카인으로서 IL-5는 대부분의 연구자들의 관심을 받았고, 여기서 IL-5 mRNA 및 단백질 수준은 증후성 천식 환자의 폐 조직 및 기관지 폐포 세척액(BAL)에서 상승하였다. 연구자들은 또한 IL-5 수준과 알레르겐 유발과 질환 활동 사이의 상관 관계를 관찰하였다. 그러나, 명백하게 알 수 있는 것은, IL-5, GM-CSF 및 IL-3이 천식에서 호산구 생성 및 활성화에 역할을 할 뿐만 아니라, GM-CSF 및 IL-3이 알레르기성 염증 발생 위치에서 합성되는 것이 입증되었다. 이러한 사이토카인의 발현은 침윤성 호산구의 총 수 및 호산구 활성화 정도를 증가하는데 기여할 수 있다. 이러한 사이토카인은 상이한 단계의 호산구 침윤 작용에 역할을 하는 것도 가능하다. 항원 공격을 받은 환자의 가장 최근 동역학 데이터에 따르면, IL-5수준은 공격 후 제2일~제7일 사이에 증가하지만, GM-CSF는 제2일에 피크에 도달하였고, 제16일에 상승을 상승상태를 유지하였다.
IL-5, GM-CSF 및 IL-3은 세포 표면 수용체에 결합하여 호산구 및 기타 정상 세포 및 암세포를 자극하고, 상기 세포 표면 수용체는 리간드 특이적 α사슬 및 세 가지 수용체에 의해 공유되는 사슬(βc)을 포함한다. 각 수용체의 α사슬에 결합하는 것은 수용체 활성화의 최초 단계이지만, α사슬 결합만으로는 활성화를 발생하기에 충분하지 않다. 다음 리간드는 βc를 모집하고, 두 개의 주요 기능적 결과를 갖는 단계가 수반된다. 먼저, IL-5, GM-CSF 및 IL-3의 결합이 본질적으로 비가역적이 되도록 허용하고; 다음 완전한 수용체 활성화를 초래한다. βc는 이러한 수용체의 주요 신호 전달 성분이기에, 이의 참여는 JAK-2, STAT-5 및 기타 신호 분자의 활성화를 초래하고, 최종적으로 일반적으로 GM-CSF 및 IL-3 자극(호산구 부착, 탈과립 및 세포 독성 유발, 및 세포 활력 연장)과 같은 IL-5와 관련된 과도한 세포 활성을 초래한다.
호산구 활성화 사이토카인의 활성을 차단하거나 길항하기 위하여, 연구자들은 세 가지 주요 방법을 시도하였다. 그 중 하나는 사이토카인에 대한 항체를 이용하는 것이다. 예를 들어, IL-5의 항체는 알레르겐에 의해 유발된 천식의 동물 모델에서 사용되고, 이 방법은 기도로의 호산구 유입과 기관지 과민 반응을 예방하는데 상대적으로 오래 지속되는 작용이 있는 것으로 나타났다. 그러나 여전히 친화도가 높고 특이적 항IL-5 항체 또는 IL-5를 표적으로 하는 약물이 부족한 점을 감안하여, 본 발명을 제안한다.
본 발명의 목적은 IL-5의 결합 분자 및 그 제조 방법과 응용을 제공하는 것이다.
본 발명은 다음과 같이 구현된다.
제1 양태에서, 실시예는 IL-5에 특이적으로 결합할 수 있고 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 IL-5의 결합 분자를 제공하며;
여기서, CDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.43~49로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되고; CDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.50~56으로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되며; CDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.57~62로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택된다.
제2 양태에서, 본 발명의 실시예는 전술한 실시예에 따른 IL-5의 결합 분자를 코딩하는 분리된 뉴클레오타이드를 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명의 실시예는 전술한 실시예에 따른 분리된 뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.
제4 양태에서, 본 발명의 실시예는 전술한 실시예에 따른 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다.
제5 양태에서, 본 발명의 실시예는 전술한 실시예에 따른 숙주 세포를 배양하여, IL-5의 결합 분자를 수득하는 단계를 포함하는 IL-5의 결합 분자의 제조 방법을 제공한다.
제6 양태에서, 본 발명의 실시예는 접합 성분, 및 전술한 실시예에 따른 IL-5의 결합 분자를 포함하는 IL-5단백질 결합용 접합체를 제공하고;
상기 접합 성분은 상기 IL-5의 결합 분자에 접합되며; 상기 접합 성분은 검출용 마커 및/또는 화합물을 포함한다.
제7 양태에서, 본 발명의 실시예는 전술한 실시예에 따른 IL-5의 결합 분자를 포함하는 IL-5 검출용 키트를 제공한다.
제8 양태에서, 본 발명의 실시예는 질환을 치료하고 IL-5를 표적으로 하는 약물의 제조에서의 전술한 실시예에 따른 IL-5의 결합 분자의 응용을 제공한다.
본 발명은 이하의 유리한 효과를 갖는다.
본 발명의 실시예는 IL-5의 결합 분자 및 그 제조 방법과 응용을 제공하고, 상기 결합 분자는 IL-5에 특이적으로 결합할 수 있으며 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고; 여기서, CDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.43~49로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되며; CDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.50~56으로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되고; CDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.57~62로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택된다. 상기 결합 분자는 IL-5에 특이적으로 결합할 수 있고, IL-5에 의해 유도되는 세포 증식을 효과적으로 차단할 수 있으며, 자가면역 질환과 같은 IL-5 관련 질환의 예방, 진단 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 실시예의 기술적 해결수단을 보다 명확하게 설명하기 위하여, 이하 실시예에서 사용하여야 하는 첨부 도면을 간단하게 소개하고, 이하 첨부 도면은 단지 본 발명의 일부 실시예를 도시할 뿐이므로, 범위에 대한 한정으로 간주되어서는 아니되며, 본 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 진보성 창출에 힘쓰지 않는 전제 하에서, 이러한 첨부 도면에 따라 다른 관련 첨부 도면을 더 획득할 수 있다.
도 1은 실시예1에서 인간재조합 IL-5의 단백질 겔 전기영동 분석 결과이고;
도 2는 실시예1에서 IL-5 재조합 단백질에 대한 나노바디 라이브러리 스크리닝된 농축 상황이며; 여기서, P/N=바이오패닝의 양성 웰에서 용출된 파지가 TG1 박테리아를 감염시킨 후 성장한 모노클로날 박테리아 수/양성 웰에서 용출된 파지가 TG1 박테리아를 감염시킨 후 성장한 모노클로날 박테리아 수, 상기 파라미터는 농축이 발생한 후 점차적으로 증가하고; I/E=바이오패닝의 각 라운드에서 양성 웰에 첨가한 파지 총량/바이오패닝의 각 라운드에서 양성 웰에서 용출된 파지 총량, 상기 파라미터는 농축이 발생한 후 점차적으로 1에 접근하며;
도 3은 실시예2에서 항체 균주1B3 및 2B3의 인간화 변이체의 각각의 정렬 결과이고;
도 4는 검증예1에서 실시예1로부터 수득한 대장균에서 발현된 12주 항체와 IL-5 결합 능력의 분석 결과이며;
도 5는 검증예2에서 Tab1 및 Tab2와 IL-5의 결합 용량 반응 곡선이고;
도 6은 검증예2에서 항체1(Tab1) 및 대조 항체2(Tab2)가 IL-5에 의해 유도된 TF-1세포 증식을 중화하는 용량 반응 곡선이며;
도 7은 검증예3에서 실시예3로부터 수득한 IL-5에 특이적인 Fc융합 단일 도메인 항체가 IL-5에 의해 유도된 TF-1증식을 중화하는 용량 반응 곡선이고;
도 8은 검증예3에서 실시예3로부터 수득한 상이한 인간화된 Fc융합 단일 도메인 항체가 IL-5에 의해 유도된 TF-1증식을 중화하는 용량 반응 곡선이다.
도 1은 실시예1에서 인간재조합 IL-5의 단백질 겔 전기영동 분석 결과이고;
도 2는 실시예1에서 IL-5 재조합 단백질에 대한 나노바디 라이브러리 스크리닝된 농축 상황이며; 여기서, P/N=바이오패닝의 양성 웰에서 용출된 파지가 TG1 박테리아를 감염시킨 후 성장한 모노클로날 박테리아 수/양성 웰에서 용출된 파지가 TG1 박테리아를 감염시킨 후 성장한 모노클로날 박테리아 수, 상기 파라미터는 농축이 발생한 후 점차적으로 증가하고; I/E=바이오패닝의 각 라운드에서 양성 웰에 첨가한 파지 총량/바이오패닝의 각 라운드에서 양성 웰에서 용출된 파지 총량, 상기 파라미터는 농축이 발생한 후 점차적으로 1에 접근하며;
도 3은 실시예2에서 항체 균주1B3 및 2B3의 인간화 변이체의 각각의 정렬 결과이고;
도 4는 검증예1에서 실시예1로부터 수득한 대장균에서 발현된 12주 항체와 IL-5 결합 능력의 분석 결과이며;
도 5는 검증예2에서 Tab1 및 Tab2와 IL-5의 결합 용량 반응 곡선이고;
도 6은 검증예2에서 항체1(Tab1) 및 대조 항체2(Tab2)가 IL-5에 의해 유도된 TF-1세포 증식을 중화하는 용량 반응 곡선이며;
도 7은 검증예3에서 실시예3로부터 수득한 IL-5에 특이적인 Fc융합 단일 도메인 항체가 IL-5에 의해 유도된 TF-1증식을 중화하는 용량 반응 곡선이고;
도 8은 검증예3에서 실시예3로부터 수득한 상이한 인간화된 Fc융합 단일 도메인 항체가 IL-5에 의해 유도된 TF-1증식을 중화하는 용량 반응 곡선이다.
본 발명의 실시예의 목적, 기술적 해결수단 및 장점을 보다 명확하게 하기 위하여, 이하 본 발명의 실시예의 기술적 해결수단을 명확하고 완전하게 설명한다. 실시예에 구체적인 조건이 명시되어 있지 않은 경우에는, 통상적인 조건 또는 제조사가 제안하는 조건에 따라 실시한다. 사용된 시약 또는 기기의 제조사가 표시되지 않으면, 모두 시중에서 구입할 수 있는 통상적인 제품이다.
명사 정의
본문의 “단일 도메인 항체”, SdAb는, 경쇄가 자연적으로 결핍된 항체이고, 상기 항체는 하나의 중쇄 가변 영역(VHH)만을 포함하며, 나노바디라고도 지칭된다.
본문의 “인간화 항체”는 표적 항체(예: 동물 항체)의 중쇄 가변 영역을 인간 항체의 불변 영역과 융합하여 얻은 항체, 또는 표적 항체의 상보성 결정 영역(CDR1~3서열)을 인간 항체의 가변 영역에 이식하여 얻은 항체, 또는 표적 항체를 인간 항체 프레임워크 영역(FR1~4)의 특징에 따라 아미노산의 돌연변이를 수행한 후 수득한 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 합성법 또는 부위 특이적 돌연변이법을 사용할 수 있다.
본문의 “이중 사슬 항체”, Diabody는 소분자의 2가 이중 특이성 항체 세그먼트로서, 2가지 항원을 동시에 인식할 수 있는 항체이다. Hollinger 등은 짧은 펩타이드 분자를 통해 A항원 항체의 경쇄 가변 영역 유전자(VLA)를 B항원 항체의 중쇄 가변 영역(VHB)에 연결하고; 마찬가지로, VHA 및 VLB를 연결하며, 두 쌍 의 키메라 유전자를 바이시스트로닉의 발현 플라스미드에 넣어, 이중 사슬 항체의 발현 플라스미드를 구성하고, 발현 후, VLA-VHB와 VHA-VLB는 교차로 연결되어, 이중 특이성 항체를 형성한다. 본 출원에서, 2가 항체가 인식할 수 있는 항원 중 하나는 IL-5단백질이고, 다른 하나의 인식할 수 있는 항원은 기존의 임의의 항원으로부터 선택될 수 있다.
본문에서 “다가 항체”는, 다중 사슬 항체라고도 지칭되고, 항체 구조를 변형시킨 후(이중 사슬 항체와 유사함), 여러 항원을 동시에 인식할 수 있는 항체(이중 사슬 항체와 동일함)를 지칭하며, 본 출원에서, 인식할 수 있는 항원 중 하나는 IL-5단백질이다.
본 명세서에 언급된 “CDR”은 항체의 상보성 결정 영역이고, 항체는 일반적으로 두 개의 가변 영역, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역은 일반적으로 3개의 CDRs를 포함한다.
실시형태
본 발명의 실시예는 IL-5에 특이적으로 결합할 수 있고 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 IL-5의 결합 분자를 제공하며;
여기서, CDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.43~49로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되고; CDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.50~56으로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되며; CDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.57~62로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택된다.
바람직하게, 상기 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은,
(1)SEQ ID No.43, 56 및 58로 표시되고;
(2)SEQ ID No.49, 51 및 60으로 표시되며;
(3)SEQ ID No.47, 56 및 57로 표시되고;
(4)SEQ ID No.45, 54 및 57로 표시되며;
(5)SEQ ID No.46, 50 및 61로 표시되고;
(6)SEQ ID No.47, 56 및 62로 표시되며;
(7)SEQ ID No.48, 56 및 57로 표시되고;
(8)SEQ ID No.45, 53 및 57로 표시되며;
(9)SEQ ID No.44, 55 및 57로 표시되고;
(10)SEQ ID No.43, 56 및 59로 표시되며;
(11)SEQ ID No.43, 52 및 59로 표시되고;
(12)SEQ ID No.47, 56 및 59로 표시되며;
(13)SEQ ID No.47, 52 및 59로 표시되는 중 임의의 하나로 표시되고;
선택적 실시형태에서, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 프레임워크 영역을 더 포함하며, 상기 프레임워크 영역은 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하고; 단일 도메인 항체의 구조는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4이다.
여기서, 상기 FR1의 아미노산 서열은 SEQ ID No.63~68로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되고; 상기 FR2의 아미노산 서열은 SEQ ID No.69~72로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되며; 상기 FR3의 아미노산 서열은 SEQ ID No.73~86으로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되고; 상기 FR4의 아미노산 서열은 SEQ ID No.87로 표시된다.
바람직하게, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인의 프레임워크 영역 FR1, FR2 및 FR3의 서열은,
(14)SEQ ID No.65, 72 및 85로 표시되며;
(15)SEQ ID No.65, 72 및 82로 표시되고;
(16)SEQ ID No.64, 71 및 86으로 표시되며;
(17)SEQ ID No.65, 72 및 73으로 표시되고;
(18)SEQ ID No.65, 72 및 84로 표시되며;
(19)SEQ ID No.66, 69 및 83으로 표시되고;
(20)SEQ ID No.68, 72 및 76으로 표시되며;
(21)SEQ ID No.66, 69 및 79로 표시되고;
(22)SEQ ID No.63, 72 및 85로 표시되며;
(23)SEQ ID No.67, 70 및 80으로 표시되고;
(24)SEQ ID No.65, 72 및 78로 표시되며;
(25)SEQ ID No.65, 72 및 77로 표시되고;
(26)SEQ ID No.67, 70 및 81로 표시되며;
(27)SEQ ID No.65, 72 및 74로 표시되고;
(28)SEQ ID No.65, 72 및 75로 표시되는 중 임의의 하나로 표시된다.
바람직하게, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VHH이다.
바람직하게, 상기 VHH의 아미노산 서열은 SEQ ID No.1~12로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택된다.
바람직하게, 상기 상기 VHH는 인간화된 VHH이다.
바람직하게, 상기 인간화된 VHH의 서열은 SEQ ID No.13~21로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택된다.
바람직하게, 상기 결합 분자는 VHH에 연결되는 면역글로불린 Fc영역을 더 포함한다.
바람직하게, 상기 면역글로불린 Fc영역은 인간 면역글로불린 Fc영역이고;
바람직하게, 상기 인간 면역글로불린 Fc영역은 인간 IgG4의 Fc영역이다.
본 발명의 실시예는 전술한 임의의 실시형태에 따른 IL-5의 결합 분자를 코딩하는 분리된 뉴클레오타이드를 제공한다.
바람직하게, 상기 뉴클레오타이드의 서열은 SEQ ID No.22~42로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택된다.
본 발명의 실시예는 전술한 임의의 실시형태에 따른 분리된 뉴클레오타이드를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 선택적 실시형태에서, 재조합 벡터는 플라스미드, 파지 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명의 실시예는 전술한 실시예에 따른 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 선택적 실시예에서, 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다.
본 발명의 실시예는 전술한 실시예에 따른 숙주 세포를 배양하여, IL-5의 결합 분자를 수득하는 단계를 포함하는 IL-5의 결합 분자의 제조 방법을 제공한다.
상기 임의의 실시형태에 따른 결합 분자는 인공 합성 방식을 통해 제조될 수 있거나, 코딩 유전자를 먼저 합성한 후, 생물학적 발현에 의해 수득될 수 있음을 유의해야 한다.
본 발명의 실시예는 접합 성분, 및 전술한 임의의 실시형태에 따른 IL-5의 결합 분자를 포함하고, 상기 접합 성분은 상기 IL-5의 결합 분자에 접합되며; 상기 접합 성분은 검출용 마커 및/또는 화합물을 포함하는 IL-5단백질 결합용 접합체를 제공한다.
바람직하게, 상기 검출용 마커는 방사성 원소이다.
본 발명의 실시예는 전술한 임의의 실시형태에 따른 IL-5의 결합 분자를 포함하는 IL-5단백질 검출용 키트를 더 제공한다.
이 외에, 본 발명의 실시예는 질환을 치료하고 IL-5를 표적으로 하는 약물의 제조에서의 상기 IL-5의 결합 분자의 응용을 더 제공한다.
바람직하게, 상기 질환은, 천식, 아토피 피부염, 습진, 관절염, 포진, 만성 원발성 두드러기, 경피증, 비후성 반흔, 만성 폐쇄성 폐질환, 아토피성 피부염, 특발성 폐섬유증, 가와사키병, 겸상적혈구병, 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, 바렛식도, 자가면역 포도막염, 결핵 및 신장질환 중 임의의 하나로부터 선택된다.
이하 실시예에 결부하여 본 발명의 특징 및 성능을 보다 상세하게 설명한다.
실시예1
항IL-5단백질의 단일 도메인 항체의 제조.
A. 인간 유래 재조합 IL-5단백질의 발현 벡터의 구축:
NCBI에서 IL-5의 코딩 서열을 검색하여 수득하고, 그 수탁 번호는 NM_000879.2이며, 상기 서열에 의해 코딩되어 생성된 아미노산 서열의 수탁 번호는 NP_000870.1이다. TMHMM과 SMART 웹사이트를 통해 NP_000870.1에 대응되는 아미노산 서열에 대해 단백질 막관통 영역 및 세포외 말단의 분석을 각각 수행한다. 분석 결과에 따르면, IL-5단백질은 막관통 영역이 없고, 분비 단백질이며; 전장은 134개의 아미노산이고, 여기서 1~19번 위치는 상기 단백질의 신호 펩타이드이다. 유전자 합성의 방식을 이용하여, IL-5단백질의 20-134번째 아미노산을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 벡터 pcDNA3.4에 클로닝한다. 구축된 벡터를 Sanger 시퀀싱하고, 원래의 서열을 정렬하여, 검출이 정확하면, 상기 재조합 플라스미드를 배치로 추출하며, 엔도톡신을 제거하고, 현탁된 293F를 형질감염시켜 표적 단백질을 발현 및 정제하며, 정제된 인간 유래 재조합 IL-5단백질의 SDS-PAGE 분석 결과는 도 1에 도시된 바와 같다(여기서 Marker: 표준 단백질 분자량 구배; hrIL -5-cHis: 카르복시 말단 히스티딘 태그를 갖는 인간 유래 재조합 IL-5단백질).
도 1로부터 알 수 있다 시피, 발현 및 정제된 인간 유래 재조합 IL-5의 단백질의 순도는 약 90%이고, 본 실시예에서 수득한 IL-5단백질은 낙타 면역 및 항체 스크리닝에 사용된다.
B. 항IL-5단백질의 단일 도메인 항체 라이브러리의 구축:
600μg의 단계A에서 정제하여 수득한 인간 유래 재조합 IL-5단백질을 동일한 부피의 프로인트 완전 보조제와 혼합하여, 내몽골 아라산 쌍봉 낙타를 면역화한다. 면역 방식은 주 1회, 총 7회 연속 면역화한다. 처음 면역화 외에, 나머지 6회는 모두 300μg의 IL-5재조합 단백질을 프로인트 불완전 보조제와 동일한 부피로 혼합하여 동물 면역화를 수행하여, 낙타가 항IL-5의 항체를 생성하도록 한다.
동물 면역화가 종료된 후, 낙타 말초 혈액 림프구 100mL를 추출하고 세포의 RNA를 추출한다. 추출된 총 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하고, nested PCR 반응을 통해 cDNA를 주형으로 VHH(중쇄 항체 가변 영역)를 증폭시킨다. 다음, 제한 엔도뉴클레아제를 이용하여 pMECS벡터 및 VHH 세그먼트(증폭에 의해 수득된)를 각각 효소 절단한 후, 효소 절단된 세그먼트 및 벡터를 연결하고; 연결된 세그먼트를 컴피턴트 세포TG1에 형질전환시켜, IL-5단백질의 파지 디스플레이 라이브러리를 구축하며, 라이브러리 용량을 측정하고, 라이브러리(재조합 TG1세포)의 라이브러리 용량은 약 1×109이다.
C. 항IL-5단백질의 단일 도메인 항체의 스크리닝:
200μL의 단계B에서 수득된 재조합 TG1세포를 2×TY배지에서 배양하고, 배양 기간 동안, 40μL의 헬퍼 파지VCSM13를 첨가하여 TG1세포를 감염시키며, 하룻밤 배양하여 파지를 증폭시키고, 다음날 PEG/NaCl로 파지를 침전시키며, 증폭된 파지를 원심분리하여 수집하여, 증폭된 파지 라이브러리를 수득한다.
NaHCO3(100mM pH 8.3)에 희석된 IL-5단백질 500μg을 효소 표지 플레이트에 결합하고, 4℃에서 하룻밤 방치하는 동시에, 음성 대조 웰을 설정하며; 제2일에 200μL의 3%의 탈지유를 첨가하고, 실온에서 2h 동안 밀폐시키며; 밀폐 종료 후, 100μL의 증폭된 파지 라이브러리(약 2×1011개의 파지 입자)를 첨가하고, 실온에서 1h 동안 작용시키며; 1시간 동안 작용시킨 후, PBS+0.05%Tween-20으로 5회 세척하여, 결합되지 않은 파지를 세척하고; 최종 농도가 2.5mg/mL인 트립신으로 IL-5단백질에 특이적으로 결합하는 파지를 해리하며, 대수 성장기의 대장균 TG1세포를 감염시키고, 37℃에서 1h 동안 배양하며, 다음 스크리닝에 사용되는 파지를 생성하여 수집하고, 동일한 스크리닝 과정을 1라운드 반복하며, 농축이 점차적으로 이루어지고, 농축 배수가 10배 이상에 도달할 경우, 농축 효과는 도 2 및 표 1에 도시된 바와 같다.
표 1 농축 효과
결과로부터 알 수 있다 시피, 3라운드 농축의 P/N은 2500이고, I/E는 4이다.
D. 파지 효소 결합 면역 흡착 분석법에 의한 항IL-5의 특이적 양성 클론 스크리닝:
농축 배수가 10배 이상에 도달할 경우, 스크리닝에 의해 수득된 양성 클론에서 400개의 단일 콜로니를 선택하고 100μg/mL의 암피실린이 함유된 TB배지의 96딥 웰 플레이트에 각각 접종하며, 블랭크 대조군을 설정하고, 37℃에서 대수기로 배양한 후, 최종 농도가 1mM인 IPTG를 첨가하며, 28℃에서 하룻밤 배양한다.
삼투압 버스트법으로 항체 조추출액을 수득하고; 인간 유래 재조합 IL-5단백질을 100mM의 pH 8.3인 NaHCO3에 각각 희석하며, 100μg의 재조합 IL-5단백질을 효소 표지 플레이트(ELISA플레이트)에서 4℃에서 하룻밤 코팅하고; 수득된 항체 조추출액 100μL를 취하여 항원(재조합 IL-5단백질)이 추가된 ELISA플레이트에 옮기며, 실온에서 1h 동안 인큐베이션하고; PBST로 결합되지 않은 항체를 세척하며, 100μL의 1:2000로 희석된 Mouse anti-HA tag antibody(마우스 항HA 항체, Thermo Fisher)를 첨가하고, 실온에서 1h 동안 인큐베이션하며; PBST로 결합되지 않은 항체를 세척하고, 100μL의 1:20000로 희석된 Anti-Rabbit HRP conjugate(horseradish peroxidase-labeled goat anti-rabbit antibody, Thermo Fisher에서 구입)를 첨가하며, 실온에서 1h 동안 인큐베이션하고; PBST로 결합되지 않은 항체를 세척하며, 양고추냉이 퍼옥시다제 발색용액을 첨가하고, 37℃에서 15min 동안 반응시킨 후, 정지 용액을 첨가하며, 마이크로플레이트 리더의 450nm의 파장에서, 흡광도 값을 판독하고; 샘플 웰OD(광 밀도)값이 대조웰보다 5배 이상 크면, 양성 클로닝 웰로 판정하며; 양성 클로닝 웰의 박테리아를 100μg/μL의 암피실린이 함유된 LB배지에서 진탕하여, 플라스미드를 추출하여 시퀀싱한다. 서열 정렬 소프트웨어 Vector NTI에 따라 각 클로닝 균주의 유전자 서열을 분석하고, CDR1, CDR2, CDR3서열이 동일한 균주를 동일한 클로닝 균주로 간주하나, 서열이 상이한 균주를 상이한 클로닝 균주로 간주하며, 최종적으로 특이적 항IL-5단백질의 단일 도메인 항체를 수득한다. 단일 도메인 항체의 아미노산 서열은 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 구조로서, 전체 VHH를 구성한다. 수득된 단일 도메인 항체 재조합 플라스미드(양성 플라스미드, 표적 서열)는 원핵 시스템에서 발현될 수 있고, 최종적으로 단일 도메인 항체 단백질을 수득한다.
E. 숙주 대장균에서의 IL-5단백질의 특이적 단일 도메인 항체의 정제 및 발현:
단계D에서 시퀀싱 분석을 통해 수득된 상이한 클로닝 균주의 양성 플라스미드(pMECS-VHH)를 대장균 HB2151로 전기변환하여, 암피실린 및 포도당이 함유된 배양 플레이트인 LB+amp+glucose에 도포하고, 37℃에서 하룻밤 배양하며; 단일 콜로니를 선택하여 5mL의 암피실린이 함유된 LB배양액에 접종하고, 37℃의 쉐이커에서 하룻밤 배양하며; 1mL의 하룻밤 배양한 균주를 330mL의 TB배양액에 접종하고, 37℃의 쉐이커에서 배양하며, 분광광도계를 사용하여 600nm 파장에서, 흡광도 값을 판독하고, OD600로 기록하며, 측정된 OD600값이 0.6-0.9에 도달할 경우, 1M의 IPTG를 첨가하고, 28℃의 쉐이커에서 하룻밤 배양하며; 원심분리하고, 대장균을 수집하며, 삼투압 버스트법을 이용하여, 항체 조추출액을 수득하고; 니켈 컬럼 친화성 크로마토그래피로 항체를 정제하며, 정제된 단일 도메인 항체는 표 2를 참조한다.
표 2 단일 도메인 항체의 정보
비고: 표 2에서, CDR1~3 및 FR1~4에 대응되는 숫자는 그 SEQ ID No.의 번호이다.
실시예2
항IL-5의 단일 도메인 항체의 인간화.
인간화 방법은 단백질 표면 아미노산 인간화의 방법 및 단일 도메인 항체 인간화의 일반적인 프레임워크 이식 방법으로 완성된다.
인간화 단계는 다음과 같다. 항체 균주1B3 및 2B3에 대해 상동성 모델링을 수행하고, 모델링 소프트웨어는 Discovery Studio이며, 참조 상동성 서열은 NbBcII10항체(PDB 번호: 3DWT)이고, 단백질 3차원 구조에 따라 아미노산의 상대적인 용매 접근성을 계산한다.
VHH인간화의 일반적인 프레임워크 이식 방법의 구체적인 단계는 다음과 같다. 먼저 서열 상동성에 따라 설계된 일반적인 인간화VHH 프레임워크 h-NbBcII10FGLA(PDB 번호: 3EAK)를 수득하고, 상기 프레임워크는 나노바디NbBcII10 항체(PDB 번호: 3DWT)를 기반으로 하며, 인간화 항체DP-47을 참조하여 단백질 표면 아미노산 인간화를 수행하고, VHH서열 프레임워크2(framework-2)의 일부 아미노산을 FGLA로 변형시켜 완성한다. h-NbBcII10FGLA를 프레임워크로 직접 사용하고, CDR을 항체 균주1B3, 2B3의 CDR 영역으로 각각 교체하여, 항체의 인간화를 완성한다.
항체 균주1B3, 2B3을 인간화하여, 5가지 항체 균주의 인간화 변이체를 수득한다. 표 3 및 표 4는 이러한 인간화 변이체의 서열 번호 및 그 아미노산 변화이고, 여기서 아미노산 잔기의 번호를 Kabat 번호와 비교한다. 표 3 및 표 4에서 “√”는 상기 나노바디가 클로닝한 상기 위치의 돌연변이(치환)가 존재함을 나타낸다. 구체적으로, 예를 들어, “S11L”은 11번 위치에서, L(류신)을 사용하여 S(세린)를 대체하고, S66T는 66번 위치에 있음을 나타내며, T(트레오닌)를 사용하여 S(세린)를 대체한다. 도 3은 인간화 서열의 정렬 결과를 나타낸다.
표 3 클론1B3, 2B3인간화 변이체의 서열 번호 및 일부 변이체의 아미노산 변화
표 4 클론1B3, 2B3인간화 변이체의 서열 번호 및 일부 변이체의 아미노산 변화
실시예3
F. IL-5단백질의 단일 도메인 항체의 Fc융합 단백질의 진핵 발현 벡터의 구축:
실시예1의 단계D에서 스크리닝된 단일 도메인 항체를 Sanger 시퀀싱을 통해 이의 뉴클레오타이드 서열을 얻고; 서열 합성 방식을 통해 코돈 최적화된 상기 뉴클레오타이드 서열을 변형된 벡터RJK-V4-hFC에 합성한다.
RJK-V4-hFC는 나노바디 범용 표적 벡터이고, invitrogen 산업화 벡터pCDNA3.4(벡터 자료 링크: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/pcdna3_4_topo_ta_cloning_kit_man.pdf)의 기초 상에서 인간 유래 IgG의 중쇄 코딩 서열(NCBI Accession No.: AB776838.1)의 Fc영역 세그먼트를 융합한 후 변형한 것이고, 즉 상기 벡터는 IgG중쇄의 힌지 영역(Hinge)CH2 및 CH3영역을 포함한다. 구체적인 변형 방안은 다음과 같다.
pcDNA3.4의 제한된 효소 절단 사이트 XbaI 및 AgeI를 선택하고; PCR을 중첩하는 방식을 통해 Fc세그먼트 코딩 서열의 5’단 및 3’단에 다중 클로닝 사이트(MCS, Multiple Cloning Site) 및 6×His 태그를 각각 도입한다. XbaI 및 AgeI효소 절단 사이트를 각각 갖는 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR의 방식을 통해 상기 세그먼트를 증폭시키고; 제한 엔도뉴클레아제XbaI 및 AgeI로 pcDNA3.4 및 XbaI 및 AgeI효소 절단 사이트 프라이머를 갖는 증폭 세그먼트를 각각 효소 절단하며; 효소 절단된 벡터 및 삽입 세그먼트를 T4연결 효소의 작용 하에서 연결한 후, 연결 생성물을 대장균으로 형질전환시킨 후, 증폭시키고, 시퀀싱 및 확인하여, 재조합 진핵 발현 벡터를 수득한다.
구축된 재조합 진핵 발현 벡터를 DH5α대장균에 형질전환시키고, 배양하여 플라스미드를 대량으로 추출하여, 엔도톡신을 제거하며; 대량으로 추출된 플라스미드를 서열 시퀀싱 감식을 수행하고; 정확한 것으로 결정된 재조합 벡터를 후속 진핵 세포 형질감염 발현을 준비한다.
G. 현탁된 Expi CHO-S세포에서의 IL-5단백질의 특이적 단일 도메인 항체의 Fc융합 단백질의 발현:
형질감염 3일 전, 2.5×105/mL의 농도의 세포로 ExpiCHO-S™세포를 계대 및 확대 배양하고, 필요한 세포 부피를 계산하며, 120mL(최종 부피)의 ExpiCHO™발현 배지가 담겨진 500mL의 진탕 플라스크로 옮겨; 세포 농도가 약 (4~6)×106생세포/mL가 되도록 하고; 형질감염 1일 전, ExpiCHO-S™세포를 농도가 3.5×106생세포/mL가 될 때까지 희석하여, 세포를 하룻밤 배양하며; 형질감염 당일, 세포 밀도 및 살아있는 세포의 백분율을 측정한다. 형질감염 전에 세포 밀도는 약 (7~10)×106생세포/mL에 도달해야 하고; 37℃로 예열된 신선한 ExpiCHO™발현 배지로 세포를 6×106개의 생세포/mL로 희석한다. 필요한 세포 부피를 계산하여 신선한 예열된 100mL(최종 부피)의 ExpiCHO™발현 배지가 담겨진 500mL의 진탕 플라스크에 옮겨; 부드럽게 거꾸로 하여 ExpiFectamine™CHO 시약을 혼합하고, 3.7mL의 OptiPRO™배지로 ExpiFectamine™CHO 시약을 희석하며, 흔들거나 혼합하며; 냉장된 4mL의 OptiPRO™배지로 플라스미드DNA(단계F에서 수득)를 희석하고, 흔들거나 혼합하며; ExpiFectamine CHO/플라스미드DNA 복합체를 실온에서 3min 동안 인큐베이션한 후, 제조된 세포 현탁액에 부드럽게 첨가하고, 첨가 과정에서 진탕 플라스크을 부드럽게 흔들며; 세포를 37℃, 8％의 CO2, 가습 공기에서 진탕 배양하고; 형질감염시킨 후 1일(18-22시간 후)에 600μL의 ExpiFectamine™CHO Enhancer(인핸서) 및 24mL의 ExpiCHO feed(피드)를 첨가한다. 형질감염 후 약 8일(세포 생존률은 70% 미만)에 상층을 수집한다.
H. 현탁된 293F세포에서의 IL-5단백질의 단일 도메인 항체의 Fc융합 단백질의 발현.
형질감염 3일 전에 2.5×105/mL의 세포로 293F세포를 계대 및 확대 배양하고, 필요한 세포 부피를 계산하여 신선한 예열된 120mL(최종 부피)의 OPM-293 CD05 Medium배지가 담겨진 500mL의 진탕 플라스크에 옮긴다. 세포 농도가 약 (2~3)×106살아있는 세포/mL에 도달하도록 한다. 형질감염 당일, 세포 밀도 및 생세포의 백분율을 측정한다. 형질감염 전에 세포 밀도는 약 (2~3)×106생세포/mL에 도달해야 한다. 예열된 OPM-293 CD05 Medium로 세포를 1×106개의 생세포/mL로 희석한다. 필요한 세포 부피를 계산하여 신선한 예열된 100mL(최종 부피)의 배지의 500mL의 진탕 플라스크에 옮긴다. 4mL의 Opti-MEM배지로 PEI(1mg/mL) 시약을 희석하고, 흔들거나 블로우 혼합하며; 4mL의 Opt-MEM배지로 플라스미드DNA(단계F에서 수득)를 희석하고, 흔들거나 혼합하며, 0.22um의 필터 헤드로 여과한다. 실온에서 5min 동안 인큐베이션한다. 희석된 PEI시약을 희석된 DNA에 첨가하고, 거꾸로 하여 혼합한다. PEI/플라스미드DNA 복합체를 실온에서 15~20분 동안 인큐베이션한 후, 제조된 세포 현탁액에 부드럽게 첨가하고, 첨가 과정에서 진탕 플라스크을 부드럽게 흔든다. 세포를 37℃, 5％의 CO2, 120rpm에서 진탕 배양한다. 형질감염시킨 후 24h, 72h에 5mL의 OPM-CHO PFF05 피드를 첨가한다. 형질감염 후 약 7일(세포 생존률은 70% 미만)에 상층을 수집한다.
I. IL-5단백질의 단일 도메인 항체의 Fc융합 단백질의 정제
단계G 또는 H에서 획득한 Fc융합 단백질의 발현 상층을 0.45μm의 일회용 필터 헤드로 불용성 불순물을 여과하여 제거하고; 여과액을 단백질 정제 기기를 사용하여친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었으며, 인간 유래 Fc융합 단백질과 Protein A(단백질A)의 결합 능력을 이용하여, Protein A를 접합한 아가로스 필러를 사용하고; 여과액을 1mL/분의 유속으로 Protein A 미리 포장된 컬럼을 통해 흘러보내며, 상기 단계에서 여과액의 표적 단백질은 필러와 결합할 수 있고; 저염 및 고염 완충액으로 컬럼에 결합된 불순물 단백질을 세척하며; 낮은 pH 완충액으로 컬럼에 결합된 표적 단백질을 용출하고; 용출액은 중성화를 위해 pH9.0의 Tris-HCl 용액에 신속하게 첨가한다.
상기 중화된 단백질 용액을 투석한 후, SDS-PAGE 분석을 수행하여, 단백질 순도가 95% 이상이고, 농도가 0.5mg/mL 이상임을 결정한 후, 저온에서 보관한다.
검증예1
실시예1에서 제공된 IL-5단백질의 특이적 단일 도메인 항체의 결합 용량 반응 곡선의 측정.
50μL의 1μg/mL IL-5단백질을 효소 표지 플레이트에 코팅하고, 4℃에서 하룻밤 경과한다. 플레이트를 세척하고; 200μL의 5% 우유를 첨가하며, 37℃에서 1h 동안 밀폐시킨다. 실시예1에서 제공된 IL-5단백질의 특이적 단일 도메인 항체(VHH)를 수득하고, VHH를 2μg/mL로 희석한 후, 5배의 구배로 항체를 희석하며, 총 8개의 농도 구배이다. 플레이트를 세척하고; 항체 50 μL를 중복 웰에 넣고 37°C에서 1시간 동안인큐베이션한다. 플레이트를 세척하고; 50μL의 마우스항HA태그HRP 이차 항체를 첨가하며, 37℃에서 30min 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 세척하고(수회 세척); 50μL의 미리 실온으로 복원된 TMB를 첨가하고, 암실에서 실온에서 15min 동안 반응시킨다. 50μL의 정지 용액(1N HCl)을 넣고, 마이크로플레이트 리더로 판독하여 보존한다. 곡선을 플롯팅하고, EC50을 계산하며, EC50, 즉 절반 최대 효과 농도(concentration for 50% of maximal effect, EC50)는 최대 효과의 50%를 일으킬 수 있는 농도를 지칭하고, 도 4 및 표 5에 도시된 바와 같다.
표 5 EC50 결과
검증예2
인간 유래 IL-5단백질을 표적으로 하는 도구 항체(Tool antibody, Tab)의 발현 및 정제.
Tab1(대조 항체1) 및 Tab2(대조 항체2)를 수득하고, 여기서, Tab1은 mepolizumab이며, 서열은 특허 US7982005B2로부터 유래되고, Tab2는 reslizumab서열이며, 특허 US6056957로부터 유래된다.
검색된 Tab1 및 Tab2서열은 통용 바이오 시스템(안후이)유한회사(General Biosystems(Anhui)Co., Ltd.)에 위탁하여 포유 동물 세포 발현 시스템 코돈 최적화를 수행하고, pcDNA3.1벡터에 각각 클로닝한다.
내성 스크리닝을 통해, 플라스미드 양성 박테리아를 선택하여 증폭시키고, 플라스미드 중간 추출 키트(Macherey Nagel, Cat#740412.50)를 사용하여 플라스미드를 추출한다. 세포 100mL당 100μg의 플라스미드(50μg중쇄 +50μg경쇄)를 첨가하고, PEI를 사용하여 293F세포(배지: FreeStyle 293 Expression medium, Thermo, Cat#12338026 + F-68, Thermo, Cat#24040032)에서 일시적 발현하며; 형질감염 6~24h 후 5%의 부피의 10% Peptone(Sigma,Cat#P0521-100G)를 첨가하고, 8%의 CO2 130rpm에서 약 7~8일 동안 배양하며; 세포 생존률이 50%로 저하될 경우 발현 상층을 수집하고, Protein A(GE, Cat#17-5438-02) 중력 컬럼을 사용하여 정제하며; PBS 투석 후, Nanodrop를 사용하여 농도를 측정하고, SEC로 순도를 감식하며, 간접 ELISA로 결합 능력을 검증하고; 본 방법을 통해 획득한 Tab항체의 농도는 2 mg/ml 미만이며, 순도는 94% 이상이고, IL-5단백질(Novoprotein, Cat#CS33)에 결합한 EC50 결과는 도 5 및 표 6에 도시된 바와 같다.
표 6 EC50 결과
인간 유래 재조합 IL-5단백질에 의해 유도된 TF1세포 증식 및 도구 항체(Tab) 중화 증식 실험.
인간 유래 재조합 IL-5단백질에 의해 유도된 TF1세포 증식 실험: 재생 후 3-4회 계대된 TF-1세포를 웰당 10000개로 96웰 플레이트에 플레이팅하고; 인간 유래 IL-5단백질을 최고 농도가 500ng/mL인 용액으로 조제하며, 5배 구배희석하고; 구배 희석된 IL-5단백질 용액을 세포 배양액의 동일한 부피로 세포 배양웰에 첨가하며; 72h 동안 인큐베이션한 후, 발광법 세포 활력 검출 키트로 세포 활력을 검출하고; 검출 결과에 따라 IL-5에 의해 유도된 TF-1세포 증식의 EC80 농도를 계산하며, EC80는 80%의 최대 효과 농도(concentration for 80% of maximal effect, EC80)는 최대 효과의 80%를 일으킬 수 있는 농도를 지칭한다.
Tab의 인간 유래 IL-5에 의해 유도된 TF1세포 증식 중화 실험: 재생 후 3-4회 계대된 TF-1세포를 웰당 10000개로 96웰 플레이트에 플레이팅하고; Tab1 및 Tab2를 10μg/mL의 용액으로 조제하며, 5배 구배 희석하고; 구배 희석된 Tab를 증식 실험에서 수득한 EC80 농도의 IL-5와 1:1로 혼합하여, 혼합액을 제조하며; 혼합액을 세포 배양액의 동일한 부피에 따라 세포 배양웰에 첨가하고; 72h 동안 인큐베이션한 후, 발광법 세포 활력 검출 키트로 세포 활력을 검출하며; 검출 결과에 따라 IL-5에 유도된 TF-1세포 증식을 중화하는 Tab1 및 Tab2의 EC50 농도를 계산하고, 결과는 도 6 및 표 7에 도시된 바와 같다.
표 7 EC50 결과
IL-5에 의해 유도된 TF1세포 증식을 중화하는 항IL-5단백질의 단일 도메인 항체의 Fc융합 단백질의 검출.
재생 후 3-4회 계대된 TF-1세포를 웰당 10000개로 96웰 플레이트에 플레이팅하고; Tab1 및 Tab2 및 실시예3-I에서 제공한 단일 도메인 항체의 Fc융합 단백질을 10μg/mL의 용액으로 조제하며, 5배 구배희석하고; 구배 희석된 Tab, 단일 도메인 항체를 증식 실험에서 수득한 EC80 농도의 IL-5단백질과 각각 1:1로 혼합하여, 혼합액을 제조하며; 혼합액을 세포 배양액의 동일한 부피에 따라 세포 배양웰에 첨가하고; 72h 동안 인큐베이션한 후, 발광법 세포 활력 검출 키트로 세포 활력을 검출하며; 검출 결과에 따라 IL-5에 의해 유도된 TF-1세포 증식을 중화하는 상이한 단일 도메인 항체의 EC50 농도를 계산하고, 결과는 도 7~도 8 및 표 8~표 9에 도시된 바와 같다.
표 8 EC50 결과
표 9 EC50 결과
IL-5결합 분자의 친화도 동역학적 검출
SD버퍼 조제: 적정량의 소혈청 알부민 및 트윈20을 취하여 1×PBS(pH7.4)로 용해시켜, 소혈청 알부민 및 트윈20의 질량(또는 부피) 분율이 각각 0.1% 및 0.02%이 되도록 하고; IL-5결합 분자를 SD버퍼로 10 μg/mL의 농도로 조제하며; 항원 작업용액 조제: 항원을 먼저 SD버퍼로 200 nM로 조제한 후, 2배 구배로 희석하여, 5개의 농도 구배를 설정하고, 추가로 하나의 SD버퍼의 블랭크 대조를 더 설정하며; 농도가 0.1M인 적정량의 글리신 저장 용액을 취하여, 탈리온수로 10배 희석하고, 혼합하여, 재생액을 수득하며; Octet 96 및 그 세트 컴퓨터의 Data Acquisiton 소프트웨어를 개시하고, 렌즈 티슈로 적정량의 75%의 에탄올을 취하여 수집 프로브의 저면과 측면을 세정하며, 기기를 15 min 이상 예열하고; Sensor 프리웨팅: Sensor를 실험 시작 전 SD버퍼에 10분 이상 침지시킨 후, 베이스라인→항체→베이스라인→결합 항원→해리 항원→재생 센서의 단계에 따라 실험 작업을 수행하도록 기계 프로그램을 설정한다.
구체적으로 측정한 IL-5결합 분자의 친화도 동역학적 파라미터는 표 10에 도시된 바와 같다.
표 10 클론1B3, 2B3 및 이의 인간화 변이체와 IL-5의 친화도 동역학적 결과
KD: 친화도 상수, 단위는 몰(M)
Ka: 결합 속도 상수, 단위는 몰 시간의 역수(1/Ms);
Kd: 해리 속도 상수, 단위는 시간의 역수.
R2: 피팅 정도, 즉 측정된 곡선과 피팅 곡선의 매칭 정도, R2는 약 1에 접근하고, 피팅값은 측정값에 더 접근하며, 상기 시스템에서, R2는 적어도 ＞0.95이어야 한다.
X2: 시스템에서 측정한 값의 통계학적 파리미터로 구현되고, ＜3이어야 하며, 작을수록 측정된 수치가 더 신뢰적이다.
다른 error값은 이에 대응되는 파라미터의 오차값으로, 이에 대응되는 파라미터의 하나의 자릿수(10배) 이상 작아야 한다.
결과에 따르면, 도구 항체와 비교하여, 클론1B3의 친화도 동역학적 상수는 약간 작고, 나머지 클론은 약간 크지만, 각 검출 샘플 사이의 친화도 동역학적 상수는 유의한 차이가 없으며, 통계학적 차이를 갖지 않는다.
이상 설명은 단지 본 발명의 실시예일 뿐, 본 발명을 제한하려는 것이 아니다. 본 분야의 통상의 기술자에게 있어서, 본 발명은 다양한 변경 및 변화가 있을 수 있다. 본 발명의 사상 및 원리 내에서 이루어진 모든 수정, 동등한 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 특허청구범위 내에 포함되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENECORE BIOTECH CO., LTD
<120> IL-5 BINDING MOLECULE, PREPARATION METHOD THEREFOR, AND USE THEREOF
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<170> PatentIn version 3.5
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ala Ser Thr Ser
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ser
35 40 45
Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ala Ser Thr Ser
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ser
35 40 45
Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
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85 90 95
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115 120
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<211> 120
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<213> artificial sequence
<400> 16
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ala Ser Thr Ser
20 25 30
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Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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<213> artificial sequence
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Thr Ala Ser Thr Ser
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Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ser
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<213> artificial sequence
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu
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Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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Cys Ala Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 122
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Phe Ser Phe Ser
20 25 30
Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu
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Gly Ser Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Gly Ser
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Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu
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Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
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Cys Ala Ala Ala Arg Tyr Cys Met Phe Trp Ser His Pro Ser Tyr Trp
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<211> 122
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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Thr Phe Ser Phe Ser
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Thr Tyr Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ser Pro Gly Lys Glu Arg Glu
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Gly Ser Leu Ala Thr Ile Tyr Asp Ala Ser Thr Ala Tyr Ala Gly Ser
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
<213> artificial sequence
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caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggcat taccgcgagc accagctgca tgggctggtt tcgtcagagc 120
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gatagcgtga aaggccgttt taccattagc gtggataacg cgaaaaacat tctgtatctg 240
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tgcatgtttt ggagccatcc gagctattgg ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 360
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<211> 360
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 23
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggcat taccgcgagc accagctgca tgggctggtt tcgtcagagc 120
ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atggcagcac cagctatgcg 180
gatagcgtga aaggccagtt taccattagc gtggataacg cgaaaaacat tctgtatctg 240
cagatgaaca acctgaaacc ggaagatacc gcgatgtatt attgcgcggc ggcgaaatat 300
tgcatgtttt ggagccatcc gagctattgg ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 360
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<211> 366
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 24
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgcgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggcaa caccctggat ctgatggcgt ggtttcgtca ggcgccgggc 120
aaagaacgtg aaggcgtggc gggcatttat agcagcggca ccacctatta tgcggatagc 180
gtgaaaggcc gttttaccgt gagccgtgat aacgcgaaaa acaccgtgta tctgcagatg 240
aacagcctga aaccggaaga tgcggcgatg tattattgcg cggcgaaagt gagctggtat 300
ggccgttggt atcagagcga aacctatgaa tattggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360
agcagc 366
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<211> 366
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 25
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggcaa cacctttagc tttagcacct attgcatggg ctggtttcgt 120
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tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc attagcgtgg ataacgcgaa aaacattctg 240
tatctgcaga tgaacaacct gaaaccggaa gataccgcga tgtattattg cgcggcggcg 300
aaatattgca tgttttggag cgatccgagc tattggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360
agcagc 366
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<211> 360
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 26
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggcat taccgcgagc accagctgca tgggctggtt tcgtcagagc 120
ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atggcagcac cagctatgcg 180
gatagcgtga aaggccgttt taccattagc gtggataacg cgaaaaacat tctgtatctg 240
cagatgaaca acctgaaacc ggcggatacc gcgatgtatt attgcgcggc ggcgaaatat 300
tgcatgtttt ggagccatcc gagctattgg ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 360
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<211> 360
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 27
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggcat taccagcagc accagctgca tgggctggtt tcgtcagagc 120
ccgggcaaag aacgtgaagg cagcctggcg accatttatg atggcaacat tagctatgcg 180
gatagcgtga aaggccgttt taccattagc gtggataacg cgaaaaacat tctgtatctg 240
cagatgaaca acctgaaacc ggaagatacc gcgatgtatt attgcgcggc ggcgaaatat 300
tgcatgtttt ggagcgatcc gagctattgg ggccagggca cccaggtgac cgtgagcagc 360
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<211> 366
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 28
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgtgg cgagcggcct gaccctgaac gatgtgagca tggcgtggtt tcgtcaggcg 120
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gatagcgtga aaggccgttt taccattagc aaagataacg cgcagaacac cctgtatctg 240
cagatgaaca gcctgaaacc ggaagatacc gcgatgtata gctgcgcggc ggtgcgtctg 300
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agcagc 366
<210> 29
<211> 366
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 29
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agctgcgcgg cgagcggcaa cacctttagc tttagcacct attgcatggg ctggtttcgt 120
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<210> 30
<211> 366
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 30
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgtgg cgagcggcct gaccctgaac gatgtgagca tggcgtggtt tcgtcaggcg 120
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gatccggtga aaggccgttt taccattagc aaagataacg cgcagaacac catgtatctg 240
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<210> 31
<211> 366
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 31
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<211> 360
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 32
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggcat taccagcagc accagctgca tgggctggtt tcgtcagagc 120
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<211> 360
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 33
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gatagcgtga aaggccgttt taccattagc gtggataacg cgaaaaacat tctgtatctg 240
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<211> 360
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 34
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 35
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> artificial sequence
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 38
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 39
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agctgcgcgg cgagcggcaa cacctttagc tttagcacct attgcatggg ctggtttcgt 120
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<212> DNA
<213> artificial sequence
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caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggcaa cacctttagc tttagcacct attgcatggg ctggtttcgt 120
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<211> 366
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 41
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggcaa cacctttagc tttagcacct attgcatggg ctggtttcgt 120
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tatctgcaga tgaacaacct gaaaccggaa gataccgcga tgtattattg cgcggcggcg 300
cgttattgca tgttttggag ccatccgagc tattggggcc agggcaccca ggtgaccgtg 360
agcagc 366
<210> 42
<211> 366
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 42
caggtgcagc tggtggaaag cggcggcggc agcgtgcagg cgggcggcag cctgcgtctg 60
agctgcgcgg cgagcggcaa cacctttagc tttagcacct attgcatggg ctggtttcgt 120
cagagcccgg gcaaagaacg tgaaggcagc ctggcgacca tttatgatgc gagcaccgcg 180
tatgcgggca gcgtgaaagg ccgttttacc attagccgtg ataacgcgaa aaacattctg 240
tatctgcaga tgaacaacct gcgtgcggaa gataccgcgg tgtattattg cgcggcggcg 300
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Gly Ile Thr Ala Ser Thr Ser Cys
1 5
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 44
Gly Ile Thr Ser Ser Thr Ala Cys
1 5
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<211> 8
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<213> artificial sequence
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Gly Ile Thr Ser Ser Thr Ser Cys
1 5
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Gly Asn Thr Phe Ser Thr Ser Thr Tyr Cys
1 5 10
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<211> 6
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<213> artificial sequence
<400> 49
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1 5
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Glu
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Gly
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35
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
Claims (12)
- IL-5에 특이적으로 결합할 수 있고 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 IL-5의 결합 분자에 있어서,
CDR1의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.43~49로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되고; CDR2의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.50~56으로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되며; CDR3의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.57~62로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 IL-5의 결합 분자. - 제1항에 있어서,
상기 상보성 결정 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열은,
(1)SEQ ID No.43, 56 및 58로 표시되고;
(2)SEQ ID No.49, 51 및 60으로 표시되며;
(3)SEQ ID No.47, 56 및 57로 표시되고;
(4)SEQ ID No.45, 54 및 57로 표시되며;
(5)SEQ ID No.46, 50 및 61로 표시되고;
(6)SEQ ID No.47, 56 및 62로 표시되며;
(7)SEQ ID No.48, 56 및 57로 표시되고;
(8)SEQ ID No.45, 53 및 57로 표시되며;
(9)SEQ ID No.44, 55 및 57로 표시되고;
(10)SEQ ID No.43, 56 및 59로 표시되며;
(11)SEQ ID No.43, 52 및 59로 표시되고;
(12)SEQ ID No.47, 56 및 59로 표시되며;
(13)SEQ ID No.47, 52 및 59로 표시되는 중 임의의 하나로 표시되고;
바람직하게, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 프레임워크 영역을 더 포함하며, 상기 프레임워크 영역은 FR1, FR2, FR3 및 FR4를 포함하고;
상기 FR1의 아미노산 서열은 SEQ ID No.63~68로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되며; 상기 FR2의 아미노산 서열은 SEQ ID No.69~72로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되고; 상기 FR3의 아미노산 서열은 SEQ ID No.73~86으로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되며; 상기 FR4의 아미노산 서열은 SEQ ID No.87로 표시되고;
바람직하게, 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인의 프레임워크 영역 FR1, FR2 및 FR3의 서열은,
(14)SEQ ID No.65, 72 및 85로 표시되며;
(15)SEQ ID No.65, 72 및 82로 표시되고;
(16)SEQ ID No.64, 71 및 86으로 표시되며;
(17)SEQ ID No.65, 72 및 73으로 표시되고;
(18)SEQ ID No.65, 72 및 84로 표시되며;
(19)SEQ ID No.66, 69 및 83으로 표시되고;
(20)SEQ ID No.68, 72 및 76으로 표시되며;
(21)SEQ ID No.66, 69 및 79로 표시되고;
(22)SEQ ID No.63, 72 및 85로 표시되며;
(23)SEQ ID No.67, 70 및 80으로 표시되고;
(24)SEQ ID No.65, 72 및 78로 표시되며;
(25)SEQ ID No.65, 72 및 77로 표시되고;
(26)SEQ ID No.67, 70 및 81로 표시되며;
(27)SEQ ID No.65, 72 및 74로 표시되고;
(28)SEQ ID No.65, 72 및 75로 표시되는 중 임의의 하나로 표시되는 것을 특징으로 하는 IL-5의 결합 분자. - 제2항에 있어서,
상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 VHH이고;
바람직하게, 상기 VHH의 아미노산 서열은 SEQ ID No.1~12로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되며;
바람직하게, 상기 VHH는 인간화된 VHH이고;
바람직하게, 상기 인간화된 VHH의 서열은 SEQ ID No.13~21로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 IL-5의 결합 분자. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 결합 분자는 VHH에 연결되는 면역글로불린 Fc영역을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-5의 결합 분자. - 제4항에 있어서,
상기 면역글로불린 Fc영역은 인간 면역글로불린 Fc영역이고;
바람직하게, 상기 인간 면역글로불린 Fc영역은 인간 IgG4의 Fc영역인 것을 특징으로 하는 IL-5의 결합 분자. - 분리된 뉴클레오타이드에 있어서,
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 IL-5의 결합 분자를 코딩하고;
바람직하게, 상기 뉴클레오타이드의 서열은 SEQ ID No.22~42로 표시되는 서열 중 임의의 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 뉴클레오타이드. - 제6항에 따른 분리된 뉴클레오타이드를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
- 제7항에 따른 재조합 벡터를 함유하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
- 제8항에 따른 숙주 세포를 배양하여, IL-5의 결합 분자를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-5의 결합 분자의 제조 방법.
- 접합 성분, 및 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 IL-5의 결합 분자를 포함하고; 상기 접합 성분은 상기 결합 분자에 접합되며; 상기 접합 성분은 검출용 마커 및/또는 화합물을 포함하고;
바람직하게, 상기 검출용 마커는 방사성 원소인 것을 특징으로 하는 IL-5단백질 결합용 접합체. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 IL-5의 결합 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 IL-5단백질 검출용 키트.
- 질환을 치료하고 IL-5를 표적으로 하는 약물의 제조에서의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 IL-5의 결합 분자의 응용에 있어서,
바람직하게, 상기 질환은, 천식, 아토피 피부염, 습진, 관절염, 포진, 만성 원발성 두드러기, 경피증, 비후성 반흔, 만성 폐쇄성 폐질환, 아토피성 피부염, 특발성 폐섬유증, 가와사키병, 겸상적혈구병, 그레이브스병, 쇼그렌 증후군, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, 바렛식도, 자가면역 포도막염, 결핵 및 신장질환 중 임의의 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 응용.
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