CN111944021A

CN111944021A - Cd47亲和肽及其应用

Info

Publication number: CN111944021A
Application number: CN202010859936.5A
Authority: CN
Inventors: 高艳锋; 王鸿飞; 翟文杰; 祁元明
Original assignee: Zhengzhou University
Current assignee: Zhengzhou University
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2020-08-24
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-08-24
Also published as: CN111944021B

Abstract

本发明涉及CD47亲和肽及其应用。该亲和肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或，其1个氨基酸突变为丙氨酸、或由天冬酰胺突变为天冬氨酸的突变肽。本发明通过筛选、优化得到的肽，在亲和CD47的同时还能够阻断CD47/Sirpɑ之间的相互作用，能够显著提高巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬清除，有效抑制肿瘤的生长，从而治疗肿瘤或其它类型疾病。

Description

CD47亲和肽及其应用

技术领域：

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种亲和CD47的肽及其在肿瘤等相关疾病方面的应用。

背景技术：

肿瘤的发生发展与机体的免疫功能密切相关。机体免疫系统能够识别和杀伤恶变的细胞，从而清除或控制其生长。肿瘤细胞也可以依靠自身的高突变性等机制逃避免疫系统的清除作用，抵抗机体抗肿瘤免疫反应。肿瘤免疫治疗能够激活或者诱导肿瘤患者建立起对肿瘤抗原的特异性免疫应答，增强机体抵御肿瘤细胞的能力，进一步阻止肿瘤的复发和转移。巨噬细胞作为天然免疫的重要组成部分，在识别和清除组织中的外来、老化、损伤和死亡细胞，维持机体稳态，防止外源性病原体入侵，消除内源性病原体引起适应性免疫应答等方面发挥着关键作用，同时巨噬细胞的吞噬清除作用在抑制肿瘤生长过程中扮演着重要角色。巨噬细胞介导的吞噬作用通过暴露在目标细胞表面的促吞噬和抑吞噬信号的平衡来调节。如巨噬细胞上的低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP-1)识别死亡细胞上的促吞噬信号，包括磷脂酰丝氨酸(PS)、细胞间粘附分子3(ICAM3)和钙网蛋白(CRT) 等。相反，正常细胞表达抑吞噬信号，同时避免在细胞表面表达促吞噬信号，抑制巨噬细胞吞噬作用，以避免自身被清除。

CD47是一种免疫球蛋白超家族中广泛表达的高度糖基化细胞表面蛋白，在增殖、粘附、迁移、凋亡和吞噬等细胞功能中起重要作用，是机体内宿主细胞的 “自我”标记。CD47的表达可以作为一种抵抗巨噬细胞吞噬作用的自我保护机制，以确保健康的自体的细胞不会被吞噬，如造血干细胞、祖细胞和红细胞高表达CD47以避免清除。同时CD47在多种类型的实体瘤、血液性肿瘤以及肿瘤干细胞的表达量都显著高于正常细胞，避免自身被巨噬细胞识别和清除，以逃避免疫系统的监视和攻击，并且CD47的高表达与患者不良预后相关。CD47的受体 Sirpα(signal regulatory proteinα,CD172a)属于抑制性免疫受体，选择性地表达于髓系细胞(包括单核细胞、粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞)和神经细胞膜表面。Sirpα是一种跨膜蛋白，其胞外N末端的免疫球蛋白超家族样区介导与CD47相互作用，使其胞内免疫受体酪氨酸抑制性基序(ITIMs)磷酸化，募集并激活蛋白酪氨酸激酶SHP-1、SHP-2，抑制吞噬突触肌动蛋白聚集，传递抑吞噬信号。 CD47/Sirpα信号通路是调节巨噬细胞吞噬作用的一个重要信号。

研究表明，阻断CD47/Sirpα的相互作用能够有效促进巨噬细胞发挥吞噬功能，消除肿瘤细胞，并激活机体特异性免疫应答，细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)进而发挥肿瘤特异性杀伤作用。CD47/Sirpα通路是肿瘤免疫治疗的理想靶点。因此基于CD47/Sirpα通路，寻找合理有效的治疗策略也是科学家们正在面临和亟待解决的问题。

目前已有相关的CD47抗体，可有效阻断CD47与Sirpα之间的相互作用，促进体内巨噬细胞对于肿瘤细胞的吞噬，具有良好的临床前景。多肽药物也具有与抗体相似的特异性和亲和力，同时多肽具有较小的分子量，更高的稳定性，较低的免疫原性、更好的组织渗透以及更低的毒性和副作用。此外，人工合成和修饰多肽具有成本低、生产效率高等优点。因此，开发更安全、更有效的多肽阻断剂具有较好的开发价值及应用前景。

发明内容：

本发明提供了CD47的亲和肽，并经过实验证明了该亲和肽具有亲和CD47、阻断CD47/Sirpα相互作用的活性，可治疗肿瘤或其它类型疾病。

第一方面，本发明涉及CD47的亲和肽，其为氨基酸序列为 Ala-Trp-Ser-Ala-Thr-Trp-Ser-Asn-Tyr-Trp-Arg-His的母体肽或其突变肽，突变肽是母体肽的1个氨基酸突变为丙氨酸，或由天冬酰胺突变为天冬氨酸；所述亲和肽的各氨基酸的构型独立地选自D型或L型，如均为L型。作为示例，突变肽，其氨基酸序列为SEQ ID NOs：2、3、4、5、6、7、8、9、10或11(NOs在本领域表示序列号的并列列举，即氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3或 SEQ ID NO.4……)。

可选地，所述亲和肽N端的1、2或3个氨基酸为D型，和/或，其C端的1、2 或3个氨基酸为D型；需说明的是，本文中，当限定某氨基酸为D型而未指明其他氨基酸构型时，均默认其他氨基酸为L型，作为本发明的详细技术方案示例，序列如下：aWSATWSNYWRh、aWSATWSNYWrh、aWSATWSNYwrh、 awSATWSNYWRh、awSATWSNYWrh、awSATWSNYwrh、awsATWSNYWRh、 awsATWSNYWrh或awsATWSNYwrh，小写字母代表对应氨基酸的D型，比如Asp^D-Trp^D-Ser^D-Ala-Thr-Trp-Ser-Asn-Tyr-Trp^D-Arg^D-His^D缩写为 a-w-s-A-T-W-S-N-Y-w-r-h。

本发明的CD47是指哺乳动物Sirpα蛋白的配体CD47蛋白，如人CD47(hCD47) 或小鼠(mCD47)。CD47与Sirpα可为野生型或仍保留其活性的突变型蛋白。另需注意的是，本专利的亲和肽，可以游离形式存在，也可以其药学上可接受的盐的形式存在，基于本专利思路的简单变形，均构成对本专利的等同侵权。

第二方面，本发明提供了含前述第一方面所述亲和肽的药物组合物或试剂盒。

第三方面，本发明提供了前述第一方面所述亲和肽在制备药物或试剂盒中的应用。

第二方面或第三方面所述的试剂盒可用于检测待测物对CD47蛋白的亲合和或阻断(如阻断CD47与Sirpα的结合)能力，或，用于定性、定位或定量检测生物样品中CD47蛋白表达与否、表达位置或表达含量。

第二方面所述的药物组合物可包含药学上可接受的赋形剂，其或第三方面所述的药物，可用于下述至少一种用途：

1)阻断CD47蛋白与Sirpα配体结合；所述CD47与Sirpα可为人源或小鼠源的野生型或仍保留其活性的突变型蛋白；

2)增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬能力；

3)抗肿瘤，如结肠癌或黑色素瘤；

4)体内示踪，如确定肿瘤转移灶的位置。

所述用途的具体形式，包括所述亲和肽的治疗或其它形式的联合治疗。

本发明的多肽可通过固相合成制得，如采用Fmoc方案制备。

本发明有益效果：

本发明以CD47为靶分子，通过噬菌体展示十二肽库高通量技术筛选获得了 CD47亲和肽，并经过了后期优化修饰。经过实验证明了该亲和肽具有亲和CD47 并阻断CD47/Sirpα相互作用的活性，且针对人源和鼠源CD47蛋白均有效。实验证明了该亲和肽能够增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬并能够激活CD8⁺ T细胞免疫应答，可显著抑制小鼠结直肠癌和黑色素瘤的生长且无明显毒副作用是一种有效的杀伤体内肿瘤细胞的策略。本发明的肽在肿瘤治疗方面具有良好的应用前景，为肿瘤免疫治疗提供了新的选择。

附图说明：

图1为本发明母体肽阻断人源及鼠源CD47/Sirpα蛋白相互作用的实验结果图；

图2为pep-20肽及其丙氨酸突变肽阻断人源CD47/Sirpα蛋白相互作用的实验结果图；

图3为pep-20肽对MC38移植瘤模型C57BL/6小鼠的肿瘤体积影响图；

图4为pep-20肽对CT26移植瘤模型BABL/c小鼠的肿瘤体积影响图；

图5为pep-20肽对B16-OVA移植瘤模型C57BL/6小鼠的肿瘤体积影响图；

图6为本发明修饰肽阻断人源及鼠源CD47/Sirpα蛋白相互作用的实验结果图；

图7为pep-20-D12修饰肽对MC38移植瘤模型C57BL/6小鼠的肿瘤体积影响图；各图中涉及的显著性分析标识*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001； NS表示生理盐水对照组。

具体实施方式：

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应该为限制本发明的范围。

如无特别说明，下面所用试剂、生物材料、培养基和溶液均为本领域常用、公众可以得到或市售的物品。

为便于本领域技术人员具体实施本发明，发明人对CD47的亲和肽的制备过程简要说明如下：

噬菌体肽库液相筛选得到CD47的亲和肽pep-20等母体肽，大体筛选过程如下： 1)以真核蛋白hCD47-IgV-hIg为靶标，采用protein A/G–IgG Fc系统液相差相筛选法进行噬菌体展示十二肽库的筛选工作；

2)经过几轮的筛选后，与靶蛋白hCD47-IgV-hIg有亲和力的噬菌体单克隆逐轮得到富集；

3)从中挑选阳性克隆进行测序，共得到多个插入十二肽序列，其中多个具有重复克隆，得到的母体肽命名为pep-20，为其中阳性克隆之一，序列为 Ala-Trp-Ser-Ala-Thr-Trp-Ser-Asn-Tyr-Trp-Arg-His，氨基酸均为L构型。

基于上述筛选获得的多肽pep-20，进行标准的Fmoc固相合成，高效液相色谱纯化，质谱鉴定无误后，后续进行亲和实验、阻断实验检测多肽的亲和及阻断能力，并检测肽的稳定性、进一步确证其抗肿瘤效果。

1.微量热泳动(MST)检测本发明亲和肽pep-20与hCD47以及mCD47的亲和力，检测过程如下：

1)计算所需标记CD47蛋白摩尔浓度，并用标记缓冲液将蛋白浓度稀释至2–20 μM之间。向固体荧光染料NT-647-NHS中加入50μL DMSO，浓度即为647 μM，使染料充分溶解并混匀；

2)使用标记缓冲液将荧光染料浓度调整为标记CD47蛋白摩尔浓度的2倍，以 1:1的体积比将蛋白质和染料充分混匀，室温避光孵育30min；

3)在步骤(3)进行的同时，取下分离柱顶盖和底盖，放入15mL收集管中；向分离柱中滴加8mL PBS 7.4缓冲液(与亲和实验所使用缓冲液一致)进行平衡和清洗，之后重复进行2次，注意保持柱床湿润。

4)向分离柱中心滴加蛋白质-染料混合物，使之完全进入柱床层(当混合体积小于500μL时，用蛋白缓冲液补足500μL后再滴加入分离柱)，在穿流液不再滴出后，将分离柱放入新的15mL收集管；

5)滴加600μL PBS 7.4缓冲液至分离柱中，此时开始收集洗脱液400-500μL(前 2-3滴可以可丢弃)。为确保标记蛋白的浓度，在收集洗脱液时可以将其分别收入若干小收集管中，如果蛋白质分子量大于20kDa，则可丢弃最后50-100 ul洗脱液来提高浓度，结束后将分离柱清洗干净，并置换为贮存液4℃保存；

6)使用NanoTemper Monolith NT.115测定所标记蛋白的标记效率(在50％的 LEDpower和40％MST power下测定信号值Fnorm(normalized fluorescence) 大于400为最佳，必要时可将蛋白稀释后使用)，标记后蛋白需4℃保存，当天使用，必要时分装并-20℃以下储存。

7)开启NanoTemper Monolith NT.115预热，并启动MO.Control软件，设定反应温度为25℃，检测波长选择Red通道，设定50％LED power，40％MST power，样品名称，配体稀释浓度梯度，反应缓冲液等各个参数；

8)将多肽溶解于适当浓度MST缓冲液(PBS 7.4+0.05％Tween+1％DMSO)中，倍比稀释得到16个浓度梯度样品，各取10μL到新的微量离心管中；

9)取标记后蛋白，高速离心4℃，12000×g，5min后取上清，分别等量加入微量离心管中并充分混匀，室温反应10min；

10)使用MST专用毛细管吸取孵育后的混合液，按照一定浓度梯度放置于样品托盘上，放入仪器，检查各参数后开始检测；

11)使用NanoTemper分析软件MO.Affinity Analysis计算亲和力(K_D值)。结果显示，pep-20肽能够与hCD47以及mCD47亲和，K_D值分别为2.91±1.04μM 以及3.63±1.71μM。

2.阻断实验

1)培养CHO-K1、CHO-K1-hSirpα和CHO-K1-mSirpα细胞于RMPI 1640培养基(含10％FBS，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)中，收集对数生长期细胞，计数后分装3×10⁵/管，加入预冷PBS 7.2缓冲液，离心4℃，1500 ×g，5min洗涤后置于冰上；

2)将多肽溶解于缓冲液(PBS 7.4+1％DMSO)中，倍比稀释得到(200μM， 100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.13μM，1.56μM)8个浓度梯度样品，各取50μL到微量离心管中，对照管加入等体积缓冲液。在每个样品管及对照管中分别加入10μL的20nM重组hCD47-Fc或mCD47-Fc蛋白，充分混合后放置于冰水浴中孵育30min；

3)将孵育后的混合物等量加入细胞中，重悬细胞后加入检测流式抗体 anti-human Fc PE并混匀放置于冰水浴中孵育30min；

4)加入预冷FACS Buffer(1mL/管)离心洗涤后加入200μL FACS Buffer重悬细胞，过滤，用流式细胞仪检测细胞平均荧光强度。

阻断结果表明本发明的母体肽pep-20肽能够阻断hCD47/hSirpα以及 mCD47/mSirpα的结合，其IC₅₀分别为24.56μM和～12.03μM，阻断结果如图1 所示。

3.将pep-20肽进行丙氨酸突变，阻断实验研究其丙氨酸突变肽阻断能力，确定亲和肽pep-20与hCD47的互作氨基酸位点，具体实施方法与上述实验2所述基本相同。

将pep-20肽的任意一个氨基酸替换为丙氨酸得到一系列单突变肽，称为丙氨酸突变肽，例如丙氨酸突变肽A2序列为 Ala-Ala-Ser-Ala-Thr-Trp-Ser-Asn-Tyr-Trp-Arg-His，丙氨酸突变肽A3、A5、A6、 A7、A8、A9、A10、A11、A12序列依次如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、 SEQ ID NO.11所示，pep-20及其丙氨酸突变肽浓度在100μM时的阻断率如图2 所示。

4.为进一步展示亲和肽的抗癌等活性，在MC38，CT26结直肠癌移植瘤模型及 B16-OVA黑色素移植瘤模型中探究pep-20肽的抗肿瘤效果，具体实施方法如下：

1)培养并收集对数增长期肿瘤细胞，用预冷PBS 7.2缓冲液离心洗涤后计数并调整细胞密度，放置于冰水浴中。选取6～8周龄实验小鼠，按照以下细胞密度接种于小鼠右侧背部皮下：MC38移植瘤模型按1×10⁶/只于C57BL/6小鼠， CT26移植瘤模型2×10⁵/只于BABL/c小鼠，B16-OVA移植瘤模型2×10⁵/只于C57BL/6小鼠；

2)观察小鼠成瘤状况，待荷瘤7天左右(肿瘤生长至30-70mm³)，按照肿瘤体积将小鼠进行S形分组，隔天测量小鼠体重和肿瘤体积，并于记录当天开始给药；

肿瘤体积计算公式V＝1/2×a(长)×b(宽)×c(高)；

分组及给药：给药组小鼠背部肿瘤周围皮下注射2mg/kg pep-20肽，对照组小鼠以相同方式注射等量生理盐水，每天给药，治疗模型连续给药2周。

MC38，CT26及B16-OVA荷瘤小鼠抑瘤实验表明，pep-20肽治疗能够显著抑制小鼠肿瘤生长，实验结果如图3-5所示。

5.采用末端D构型氨基酸替换的方案对pep-20肽进行修饰，阻断实验研究其修饰肽的阻断能力，具体实施方法与上述实验2所述基本相同。

采用在多肽N-和C-末端替换至多3个D构型氨基酸的方案对天然氨基酸构象的pep-20肽进行修饰，例如修饰肽pep-20-D12的序列为Asp^D- Trp^D-Ser^D-Ala-Thr-Trp-Ser-Asn-Tyr-Trp^D-Arg^D-His^D，小写字母代表D构型氨基酸。修饰肽pep-20-D2、pep-20-D3、pep-20-D4序列依次如表1所示，将pep-20肽对 hCD47的阻断率的数值作为100％，计算浓度在100μM下，各修饰肽相对该肽的相对阻断率，结果如表1所示。

另外，检测pep-20-D12修饰肽亲和hCD47并阻断hCD47/hSirpα的相互作用，具体实施方法与上述实验2所述基本相同，阻断结果表明pep-20-D12修饰肽仍能维持对hCD47/hSirpα以及mCD47/mSirpα的阻断作用，并具有更好的剂量依赖性，其IC₅₀分别为12.14μM和18.21μM，阻断率如图6所示。

6.修饰肽酶降解稳定性实验

1)称取pep-20肽、pep-20-D12修饰肽干粉，用生理盐水溶解至200μM，加入人血清配制成含10％(V/V)血清的混合溶液，迅速混匀后放置于金属浴中，37℃ 下孵育48h，并分别在0h，0.5h，1h，2h，4h，8h，16h，24h，36h，48h取出部分样品用于后续检测；

2)将不同时间点取出的样品加入终浓度为90％(V/V)的乙腈-冰醋酸混合物，迅速震荡混匀以终止蛋白酶解，离心4℃，12000×g，15min后收集上清液，放置于冰水浴中；

3)RP-HPLC分析肽-血清混合物样品。

酶降解稳定性实验表明，pep-20-D12修饰肽相较于pep-20母体肽的血清稳定性显著提高，在36h时仍保持几乎和初始相同的浓度。

7.为验证pep-20-D12修饰肽的抗肿瘤活性，在MC38结直肠癌移植瘤模型中探究其抗肿瘤效果，具体实施方法如下：

1)培养并收集对数增长期的MC38细胞，用预冷PBS 7.2缓冲液离心洗涤后计数并调整细胞密度为5×10⁶/mL，放置于冰水浴中。选取6～8周龄C57BL/6 实验小鼠，以1×10⁶/只细胞密度接种于小鼠右侧背部皮下；

2)观察小鼠成瘤状况，待荷瘤7天左右(肿瘤生长至30-70mm³)，按照肿瘤体积将小鼠进行随机分组，隔天测量小鼠体重和肿瘤体积，并于记录当天开始给药；

3)肿瘤体积计算公式V＝1/2×a(长)×b(宽)×c(高)；

4)分组及给药：多肽药物组小鼠腹腔注射2mg/kg pep-20肽，对照组小鼠腹腔注射等量生理盐水，每天给药，共14天；抗体药物组小鼠腹腔注射400μg anti-mouse CD47抗体(MIAP301)，对照组小鼠腹腔注射等量RatIg同型抗体，每3天给药，共给药5次；

5)取治疗结束后荷瘤小鼠肿瘤，引流淋巴结，脾脏器官，做ex vivo实验，检测 CD8⁺ T细胞增殖及其IFN-γ分泌。

MC38荷瘤小鼠抑瘤实验表明，pep-20-D12修饰肽治疗能够显著抑制小鼠肿瘤生长，实验结果如图7所示。

表1基于pep-20肽的N-和C-末端D-氨基酸替代修饰肽序列及相关阻断实验

注：^a小写字符代表D-氨基酸

尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其他的更改和修改，因此，这意味着在所述权利要求中包括本发明范围的所有变化和修改均属于本发明保护范围。

序列表

<110> 郑州大学

<120> CD47亲和肽及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ala Trp Ser Ala Thr Trp Ser Asn Tyr Trp Arg His

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Ala Ser Ala Thr Trp Ser Asn Tyr Trp Arg His

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Trp Ala Ala Thr Trp Ser Asn Tyr Trp Arg His

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Trp Ser Ala Ala Trp Ser Asn Tyr Trp Arg His

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Trp Ser Ala Thr Ala Ser Asn Tyr Trp Arg His

1 5 10

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Trp Ser Ala Thr Trp Ala Asn Tyr Trp Arg His

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ala Trp Ser Ala Thr Trp Ser Ala Tyr Trp Arg His

1 5 10

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Trp Ser Ala Thr Trp Ser Asn Ala Trp Arg His

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ala Trp Ser Ala Thr Trp Ser Asn Tyr Ala Arg His

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Ala Trp Ser Ala Thr Trp Ser Asn Tyr Trp Ala His

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Ala Trp Ser Ala Thr Trp Ser Asn Tyr Trp Arg Ala

1 5 10

Claims

1.CD47亲和肽，其为母体肽或其突变肽，母体肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变肽是母体肽的1个氨基酸突变为丙氨酸，或由天冬酰胺突变为天冬氨酸；所述亲和肽的各氨基酸的构型独立地选自D型或L型。

2.如权利要求1所述的亲和肽，其特征是，所述亲和肽的氨基酸序列独立选自SEQ IDNOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11。

3.如任一在先权利要求所述的亲和肽，其特征是，所述亲和肽N端和/或C端的1、2或3个氨基酸为D型。

4.如权利要求3所述的亲和肽，其特征是，所述亲和肽的氨基酸序列为aWSATWSNYWRh、aWSATWSNYWrh、awsATWSNYwrh或aWSATWSNYwrh，字母小写代表对应氨基酸为D型。

5.如权利要求1所述的亲和肽，其特征是，所述亲和肽的各氨基酸均为L型。

6.含任一在先权利要求所述亲和肽的药物组合物或试剂盒。

7.任一在先权利要求所述亲和肽在制备药物或试剂盒中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征是，所述药物用于下述至少一种用途：

1)抗肿瘤；

2)阻断CD47与Sirpɑ蛋白的结合。

9.如权利要求8所述的应用，其特征是，所述应用中，所述肿瘤为结直肠癌或黑色素瘤。

10.如权利要求7所述的应用，其特征是，所述试剂盒用于检测待测物对CD47蛋白的亲和或阻断能力，或者用于检测样品中CD47蛋白表达与否、表达位置或表达含量。