IT202100021764A1

IT202100021764A1 - Anti-CD93 antibody / Anticorpo anti-CD93

Info

Publication number: IT202100021764A1
Application number: IT102021000021764A
Authority: IT
Inventors: Federico Galvagni; Maurizio Orlandini; Gian Marco Tosi
Original assignee: Ucme Bioscience S R L
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2021-08-11
Publication date: 2023-02-11
Also published as: CN117999287A; CA3228520A1; WO2023017066A1; WO2023017368A1

Description

ANTICORPO ANTI-CD93

CAMPO DELL?INVENZIONE

La presente invenzione si riferisce al campo dei disturbi legati all?angiongenesi, come ad esempio la degenerazione maculare legata all?et?, la retinopatia diabetica e le malattie tumorali, in particolare a composti adatti al loro trattamento. L?invenzione riguarda un anticorpo monoclonale anti-CD93, composizioni farmaceutiche comprendenti detto anticorpo, usi medicali e diagnostici dello stesso. Ulteriori aspetti dell?invenzione riguardano un polinucleotide codificante l?anticorpo anti-CD93, vettori comprendenti il polinucleotide e cellule ospiti contenenti detti vettori.

STATO DELL?ARTE

L?angiogenesi ? implicata nella patogenesi di una variet? di disordini che includono tumori solidi, sindromi oculari neovascolari, come ad esempio retinopatie proliferative o degenerazione maculare legata all?et? (AMD), artrite reumatoide e psoriasi [1,2].

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono emersi come un nuovo e importante pilastro per la terapia del cancro [3]. Negli ultimi due decenni la biologia molecolare ha fornito mezzi per creare anticorpi chimerici, umanizzati o completamente umani, mirati anche all'angiogenesi, per il trattamento delle principali malattie maligne e delle retinopatie neovascolari, e ad oggi molti anticorpi e coniugati di anticorpi sono approvati per la commercializzazione in Europa e negli Stati Uniti come terapie per cancro, AMD e la retinopatia diabetica. Essi comprendono anticorpi non modificati, coniugati anticorpofarmaco, nonch? coniugati con radionuclidi ed un anticorpo bispecifico [4].

Attualmente, l'AMD neovascolare (nAMD), che ? caratterizzata da neovascolarizzazione coroideale (CNV), viene trattata con iniezioni intraoculari di routine di anticorpi contro il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), il principale regolatore dell'angiogenesi. Tuttavia, questa terapia non induce una regressione persistente della neovascolarizzazione e sono necessarie frequenti iniezioni intravitreali per limitare la recidiva della malattia [5]. Pertanto, inibire la funzione di diversi fattori associati a nAMD rappresenta un nuovo approccio per sviluppare terapie combinatorie che possano consentire benefici clinici duraturi, evitando la necessit? di trattamenti multipli per i pazienti con nAMD.

Molti agenti terapeuticamente attivi sono efficaci solo all'interno di una cellula. Ci? solleva un problema nel caso in cui tale agente terapeuticamente attivo non possa entrare in una cellula in una forma non modificata. Pertanto, ? sempre pi? sentita la necessit? e l'importanza di agenti leganti, come anticorpi monoclonali o frammenti leganti l'antigene che siano efficacemente internalizzati nelle cellule tumorali o endoteliali e che possano quindi indirizzare agenti legati all'agente legante in una cellula maligna o cellule di retinopatie neovascolari.

Per quanto riguarda l'uso dei farmaci antiangiogenici nel trattamento dei tumori, sono in corso numerosi studi. In particolare, i farmaci antiangiogenici coinvolti nell'inibizione delle vie di trasduzione del segnale attivate dai membri della famiglia dei VEGF, si sono inizialmente dimostrati promettenti, soprattutto in combinazione con farmaci chemioterapici.

Tuttavia, questa terapia non ha prodotto risultati clinici positivi a lungo termine, evidenziando la necessit? di scoprire nuovi bersagli che consentano di aggirare i meccanismi di resistenza e attivazione di vie alternative che promuovono l?angiogenesi come si osserva dopo l'uso prolungato di farmaci antiangiogenici monospecifici.

? quindi oggetto della presente invenzione lo sviluppo di composti in grado di affrontare i problemi sopra lamentati consentendo un'efficace inibizione della neoangiogenesi e consentendo l'effetto desiderato nelle cellule da trattare.

SOMMARIO DELL?INVENZIONE

La presente invenzione riguarda un anticorpo isolato anti-CD93 (Cluster of Differentiation 93) (qui indicato come ?4E1?), che si lega al CD93 in modo specifico, in cui detto anticorpo comprende:

a. un dominio variabile della catena leggera (VJ) avente la sequenza aminoacidica della SEQ ID NO:1; e

b. un dominio variabile della catena pesante (VDJ) avente la sequenza aminoacidica della SEQ ID NO:2, in cui opzionalmente sono presenti uno o pi? sostituzioni amminoacidiche conservative.

In un secondo aspetto, l'invenzione descrive un polinucleotide che codifica l'anticorpo anti-CD93.

In un'ulteriore forma di realizzazione, qui ? descritto un vettore comprendente il polinucleotide che codifica l'anticorpo anti-CD93, in cui detto vettore ? facoltativamente un vettore di espressione.

In ancora un'ulteriore forma di realizzazione, l'invenzione descrive una cellula ospite contenente il vettore che a sua volta contiene il polinucleotide che codifica l'anticorpo anti-CD93, in cui la cellula ospite ? preferibilmente procariotica, eucariotica o di mammifero.

Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda un metodo per produrre l'anticorpo anti-CD93 come qui descritto, detto metodo comprende (a) l? esprimere il vettore contenente il polinucleotide che codifica l'anticorpo anti-CD93 in una cellula ospite adatta, e (b) recuperare l'anticorpo.

In un'ulteriore forma di realizzazione, qui descritta ? una composizione farmaceutica comprendente (i) l'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione o (ii) il polinucleotide che codifica per l'anticorpo anti-CD93, in cui la composizione facoltativamente comprende inoltre un veicolo.

In un'ulteriore forma di realizzazione, l'invenzione descrive l'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione o la composizione farmaceutica comprendente (i) l'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione o (ii) il polinucleotide che codifica l'anticorpo anti-CD93 per l'uso come medicamento.

Un'ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione descrive l'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione o la composizione farmaceutica comprendente (i) l'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione o (ii) il polinucleotide che codifica l'anticorpo anti-CD93 per l'uso nel trattamento di: retinopatie neovascolari, preferibilmente in cui le retinopatie sono AMD e retinopatia diabetica, sindromi neovascolari intraoculari, retinopatie proliferative, artrite reumatoide, psoriasi e/o una malattia tumorale, preferibilmente in cui la malattia tumorale ? una malattia tumorale epiteliale e/o ? selezionata dal gruppo costituito da astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, schwannoma, neurofibrosarcoma, medulloblastoma, melanoma, cancro del pancreas, carcinoma della prostata, cancro della testa e del collo, cancro al seno, cancro del polmone, cancro dell'ovaio, cancro dell'endometrio, cancro del rene, neuroblastoma , carcinoma squamoso, epatoma, cancro del colon, mesotelioma e carcinoma epidermoide.

Un ulteriore oggetto dell'invenzione riguarda l'anticorpo anti-CD93 come qui descritto, in cui detto anticorpo ? legato ad un composto diagnostico, preferibilmente scelto tra un radionuclide, un composto chemioluminescente, un composto fluorescente, un colorante o un enzima.

Un ulteriore oggetto dell'invenzione riguarda l'uso dell'anticorpo 4E1 come qui descritto, legato o meno ad un composto diagnostico, come agente diagnostico in vitro o come agente biotecnologico in vitro.

Il problema alla base della presente invenzione ? quello di rendere disponibili composti in grado di trattare disturbi correlati all'angiogenesi come l'AMD. Tale problema viene risolto dal presente ritrovato mediante lo sviluppo di composti in grado di contrastare la neoangiogenesi come descritti nelle rivendicazioni allegate.

BREVE DESCRIZIONE DEI DISEGNI

Le caratteristiche ed i vantaggi della presente invenzione risulteranno evidenti dalla descrizione dettagliata di seguito riportata, dagli Esempi forniti a titolo illustrativo e non limitativo, e dalle allegate Figure 1-5, in cui:

Figura 1. CD93 e Multimerin-2 (MMRN2) sono coespressi nei vasi sanguigni all'interno dei tumori umani.

A: Analisi della correlazione dei dati di RNA-seq per CD93 e MMRN2 o PECAM-1 raccolti da diversi tipi di cancro umano. I dati sono stati generati da The Cancer Genome Atlas e sono presentati in un grafico a dispersione come media di FPKM (numero di frammenti per kilobase di esone per milione di letture).

B: Colorazione immunoistochimica di CD93 e MMRN2 in tipi rappresentativi di cancro umano: renale, colorazione alta nei vasi sanguigni e cervicale, colorazione bassa nei vasi sanguigni. Viene mostrato l'ingrandimento dei vasi sanguigni. C: Analisi semiquantitativa della frazione di vasi sanguigni positivi nei microarray di tessuto tumorale umano. I valori sono riportati come media del punteggio. Il numero di campioni esaminati per ciascun tipo di cancro (rispettivamente CD93 e MMRN2) ? stato: tiroide, 7-4; polmone, 23-11; fegato, 22-12; pancreatico, 19-11; testa e collo, 8-3; stomaco, 22-11; colorettale, 24-10; renale, 23-12; prostata, 16-12; testicolo, 23-10; seno, 23-11; cervicale, 24-12; ovarico, 22-12; endometriale, 22-12; melanoma, 23-11. D: Analisi di correlazione del punteggio semiquantitativo della frazione di vasi sanguigni positivi per CD93 e MMRN2 in microarray di tessuto canceroso analizzati come in C. Il coefficiente di correlazione (r) ? stato ottenuto utilizzando l'analisi di regressione lineare (Pearson). Sono indicati i valori P (a due code).

Figura 2. Il mAb anti-CD93 4E1 viene internalizzato attraverso la via lisosomiale. Le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state incubate 18 ore con 4E1 in presenza o meno di 100 nM Bafilomycin A1. Quindi le cellule sono state fissate e colorate con IgG anti-topo marcato con Alexa Fluor 488 e ToPro-3 per identificare i nuclei. La bafilomicina A1 ? un inibitore specifico della pompa protonica di tipo vacuolare, che inibisce l'acidificazione e la degradazione proteica nei lisosomi e promuove la distribuzione perinucleare dei lisosomi. Dopo il trattamento con Bafilomicina A1 la colorazione 4E1 mostra un accumulo perinucleare.

Figura 3. Il mAb anti-CD93 4E1 viene internalizzato attraverso la via endosomialelisosomiale. Le HUVEC sono state incubate 18 ore con 4E1 in presenza o meno di 100 nM Bafilomycin A1. Quindi le cellule sono state fissate, incubate con un anticorpo anti-Rab7 di coniglio e quindi colorate con IgG anti-topo marcato con Alexa Fluor 488 e IgG anti-coniglio marcato con Alexa Fluor 568. Dopo il trattamento con Bafilomicina A1, 4E1 mostra co-localizzazzione con Rab7, un noto marcatore di endosomi tardivi che controlla l'aggregazione e la fusione delle strutture endocitiche tardive/lisosomi [6]. Figure 4. Analisi Biacore del legame e dell'affinit? di CD93-4E1. (a) Sensorgramma di CD93 che si lega a 4E1 immobilizzato alla superficie. Diverse concentrazioni di CD93 sono state iniettate sopra a 4E1, precedentemente immobilizzato su un chip sensore SA. (b) Costanti cinetiche e valori di affinit? del legame CD93 con il mAb 4E1 calcolati applicando un legame 1:1 come modello di adattamento utilizzando il software di valutazione Bia T200 2.0.1.

Figura 5. 4E1 coniugato colocalizza con MMRN2 nelle vescicole endocitiche.

Cellule HUVEC nelle fasi tardive di adesione sono state colorate utilizzando l?anticorpo 4E1 marcatio con Alexa Fluor 488 e un anticorpo policlonale anti-MMRN2, che ? stato rivelato con un anticorpo secondario marcato con Alexa Fluor 568. Vengono mostrate le immagini sovrapposte e con contrasto di interferenza differenziale (DIC).

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE

La presente invenzione riguarda un anticorpo monoclonale isolato anti-CD93 denominato 4E1, in cui detto anticorpo comprende:

a. un dominio variabile di una catena leggera (VJ) avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:1; e

b. un dominio variabile di una catena pesante (VDJ) avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:2, in cui sono eventualmente presenti uno o pi? sostituzioni amminoacidiche conservative.

CD93 ? una proteina che nell'uomo ? codificata dal gene CD93. CD93 ? un recettore transmembrana della lectina di tipo C espresso da un'ampia variet? di cellule, che svolge un ruolo non solo nei processi di adesione cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare, ma anche nell'angiogenesi, sia come fattore di crescita solubile che come molecola di adesione. La voce Genbank per la proteina CD93 umana ? NP_036204 e la sequenza del cDNA CD93 umano ? NM_012072. La voce Genbank per la proteina CD93 di topo ? NP_034870 e la sequenza del cDNA CD93 di topo ? NM_010740.

I risultati dei test Matrigel plug nei topi e del test di angiogenesi in vitro nelle cellule endoteliali primarie umane hanno suggerito che il mAb 4E1 ? uno strumento promettente per la terapia del cancro. Questo mAb (isotipo IgG1 catena leggera k) riconosce un epitopo conformazionale sulla molecola CD93 in una regione condivisa tra il dominio lectin-like di tipo C (CTLD) e il dominio sushi e potrebbe essere una buona base per la generazione di coniugati anticorpo-farmaco (ADC), perch? nelle cellule endoteliali viene internalizzato per endocitosi nella via lisosomiale, passaggio necessario che porta alla degradazione dell'ADC a causa dei numerosi enzimi proteolitici presenti nel compartimento lisosomiale acido con successivo rilascio del carico utile del farmaco (Figure 2 e 3).

In un aspetto preferito, l'anticorpo isolato anti-CD93 4E1 della presente invenzione comprende 6 regioni CDR, dette regioni CDR essendo:

a. un CDR-L1 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:5;

b. un CDR-L2 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:6;

b. un CDR-L3 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:7;

d. un CDR-H1 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:8;

e. un CDR-H2 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:9; e

f. un CDR-H3 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:10, in cui sono presenti facoltativamente uno o pi? sostituzioni amminoacidiche conservative, mentre per sostituzione o scambio conservativa/o di amminoacidi, si intende una sostituzione di un amminoacido in un altro che ha propriet? simili. Questo tipo di sostituzione dovrebbe raramente provocare disfunzioni nella proteina corrispondente. La somiglianza tra gli amminoacidi pu? essere calcolata in base a matrici di sostituzione, distanza fisico-chimica o propriet? semplici come la dimensione o la carica degli amminoacidi.

Questi anticorpi anti-CD93 che hanno sostituzioni conservative di amminoacidi nelle sei regioni CDR sono tutti in grado di legarsi allo stesso epitopo CD93 riconosciuto dal mAb 4E1.

Un epitopo ? la parte di un antigene riconosciuta da anticorpi o anticorpi anti-CD93 correlati. Ad esempio, l'epitopo ? il pezzo specifico dell'antigene a cui si lega un anticorpo. Gli epitopi possono essere epitopi conformazionali o epitopi lineari. Un epitopo conformazionale ? composto da sezioni discontinue della sequenza amminoacidica dell'antigene. Questi epitopi interagiscono con il paratopo in base alle caratteristiche della superficie 3D e alla forma o alla struttura terziaria dell'antigene. La proporzione di epitopi che sono conformazionali ? sconosciuta.

? stato dimostrato che 4E1 si lega e riconosce un epitopo sulla molecola CD93 all'interno dei domini CTLD e sushi di CD93. I metodi per determinare un epitopo legato e riconosciuto da una molecola legante sono descritti nello stato dell?arte.

Per la mappatura fine possono essere usati frammenti ricombinanti di CD93 fusi ad un Myc-tag, come ad esempio descritto in [7]. Le proteine ricombinanti possono essere utilizzate nelle analisi di immunoprecipitazione e Western blot per la mappatura degli epitopi. Il mAb 4E1 ha reagito con i domini CTLD e sushi di CD93. In generale, i metodi per determinare l'epitopo di un dato anticorpo sono noti nello stato dell?arte e comprendono la preparazione di peptidi lineari sintetici di una data regione di interesse e la successiva verifica se l'anticorpo si leghi a detti peptidi [8]. In alternativa, diverse proteine ricombinanti che coprono la regione di interesse possono essere prodotte e testate per il legame dell'anticorpo.

Come descritto in [7], l'epitopo del mAb 4E1 ? all'interno dei domini CTLD e sushi di CD93. Pertanto, anche l'epitopo delle molecole leganti, in particolare anticorpi monoclonali o loro frammenti leganti l'antigene dell'invenzione ? preferibilmente all'interno dei domini CTLD e sushi di CD93.

In una forma di realizzazione preferita, l'epitopo ? all'interno dei domini CTLD e sushi di CD93.

Il mAb 4E1 ha le seguenti sequenze CDR: KASQSVDYDGDSYMN (LCDR1; SEQ ID No: 5), AASNLES (LCDR2; SEQ ID No: 6), QQNNEDPRT (LCDR3; SEQ ID No: 7), GYTFASY (HCDR1; SEQ ID No: 8), YPGNGD (HCDR2; SEQ ID n.: 9) e LDWYFDL (HCDR3; SEQ ID n.: 10).

Le suddette sequenze mostrano le CDR dell'anticorpo monoclonale 4E1 determinate secondo il metodo di Chothia, generalmente noto allo stato dell?arte.

Ai fini della presente divulgazione, ciascuna sequenza ha un corrispondente SEQ ID NO. come segue:

SEQ ID No: 1 si riferisce al dominio VJ, ovvero la parte variabile, della catena leggera di 4E1:

DIVLTQSPTSLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYMNWYQQKPGQPPRLLIYAAS NLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQNNEDPRTFGGGTKLEIK SEQ ID No: 2 si riferisce al dominio VDJ, ovvero la parte variabile, della catena pesante di 4E1:

QEQLQQPGTELVKPGASVRLSCKTSGYTFASYTLHWVKQTPGQGLDWIGAIYPGN GDTSYNQKFKDKATLTADKSSSTAYMQLSNLTSEDSAVYYCARLDWYFDLWGAGT TVTVS SEQ ID NO:3 corrisponde alla sequenza del cDNA del gene dell?immunoglobulina codificante la catena leggera del monoclonale 4E1 (in minuscolo la sequenza del cDNA del peptide leader, in maiuscolo il cDNA della SEQ ID No: 1): atggagtttcagacccaatcctgctatgggtgctcctgctctgggttccaggctccactggtGACATTGTGCTGA CCCAATCTCCAACTTCTTTGGCTGTGTCTCTAGGGCAGAGGGCCACCATCTCCT GCAAGGCCAGCCAAAGTGTTGATTATGATGGTGATAGTTATATGAACTGGTATCA ACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATGCTGCATCCAATCTAGA ATCTGGGATCCCAGCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCC TCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCAAA ATAATGAGGATCCTCGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGTTGGAAATAAAAC SEQ ID NO:4 corrisponde alla sequenza del cDNA del gene dell?immunoglobulina codificante la catena pesante del monoclonale 4E1 (in minuscolo la sequenza del cDNA del peptide leader, in maiuscolo il cDNA della SEQ ID No: 2): atgggatggagctgtatcatcctcttcttggtagcaacagctacaggtgtccactccCAGGAGCAACTGCAGC AGCCTGGGACTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAGGCTGTCCTGCAAG ACTTCTGGCTACACATTTGCCAGTTACACTTTGCACTGGGTAAAGCAGACACCTG GACAGGGCCTGGACTGGATTGGAGCTATTTATCCAGGAAATGGTGATACTTCCT ACAATCAGAAATTCAAAGACAAGGCCACATTAACTGCAGACAAATCTTCCAGCAC AGCCTATATGCAGCTCAGTAACCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGT GCAAGGTTAGACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACTGT CTCTGCAG

Le sequenze della catena leggera (dominio VJ) della CDR identificata tramite il metodo di Chothia sono le sequenti:

SEQ ID NO:5 corrisponde alla sequenza degli aminoacidi della CDR-L1 (o LCDR1): KASQSVDYDGDSYMN

SEQ ID NO:6 corrisponde alla sequenza degli aminoacidi della CDR-L2 (o LCDR2): AASNLES SEQ ID NO:7 corrisponde alla sequenza degli aminoacidi della CDR-L3 (o LCDR3): QQNNEDPRT

Le sequenze delle regioni CDR della catena pesante (dominio VDJ) di 4E1 in accordo con il metodo di Chothia sono le seguenti:

SEQ ID NO:8 corrisponde alla sequenza degli aminoacidi della CDR-H1 (o HCDR1): GYTFASY SEQ ID NO:9 corrisponde alla sequenza degli aminoacidi della CDR-H2 (o HCDR2): YPGNGD SEQ ID NO:10 corrisponde alla sequenza degli aminoacidi della CDR-H3 (o HCDR3): LDWYFDL.

In un'ulteriore forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda un anticorpo anti-CD93 che compete con mAb 4E1 per il legame a CD93, in cui la parte variabile della catena leggera di 4E1 comprende, preferibilmente ha la sequenza in accordo a SEQ ID No: 1 o in cui la catena leggera ? codificata da SEQ ID No: 3, e in cui la catena pesante di 4E1 comprende, preferibilmente ha la sequenza in accordo a SEQ ID No: 2 o in cui la catena pesante ? codificata da SEQ ID No: 4. La competizione pu? essere determinata da saggi noti a una persona esperta, come i saggi di competizione al legame.

In un aspetto ancora preferito, l'anticorpo anti-CD93 isolato ? un anticorpo monoclonale e/o ? umanizzato o umano.

Similmente ai vasi sanguigni tumorali, le cellule endoteliali dei neovasi coroideali di pazienti affetti da nAMD esprimono alti livelli di CD93. Nelle cellule endoteliali, l'interazione tra CD93 e MMRN2 attiva vie di segnalazione essenziali per lo sviluppo vascolare e l'angiogenesi. ? stato dimostrato che, analogamente a quanto osservato nelle cellule endoteliali iperproliferative dei vasi sanguigni tumorali, come verr? mostrato negli esempi, CD93 e MMRN2 sono altamente espressi nel sistema vascolare coroideale di pazienti con nAMD [9]. Utilizzando un modello ex vivo di angiogenesi microvascolare, ? stato dimostrato che sia il tessuto coroideale isolato da topi knockout CD93 che il tessuto coroideale umano coltivato in presenza dell'anticorpo neutralizzante CD93 4E1 producevano una ridotta gemmazione vascolare rispetto ai tessuti coroideali di controllo. Inoltre, il modello sperimentale in vivo di CNV indotta da laser, che riassume le principali caratteristiche della forma essudativa dell'AMD, mostra una ridotta neovascolarizzazione nei topi knockout per CD93. Complessivamente, questi risultati evidenziano il ruolo fondamentale dell'interazione CD93-MMRN2 nella fisiologia vascolare della coroide, aprendo nuove possibilit? alla terapia della CNV.

WO2020180706A1 descrive l'anticorpo anti-CD93 F11 che si lega a un epitopo non definito all'interno di CD93. Rispetto a F11, 4E1 ha le caratteristiche peculiari di bloccare da solo l'angiogenesi, inibendo l'interazione di CD93 con il suo ligando MMRN2 [10]. In un aspetto ancora preferito, l'anticorpo anti-CD93 ? un diabody, triabody o tetrabody, e pi? preferibilmente l'anticorpo ? un anticorpo monoclonale a lunghezza intera ed ? facoltativamente un anticorpo bispecifico.

Si preferisce che l'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione mostri una forte affinit? con CD93. Come verr? mostrato negli Esempi, 4E1 presenta un'affinit? di KD (M)= 4,50*10-

<10 >per CD93 (Esempio 3).

L'affinit? a CD93 pu? essere determinata mediante metodi noti nell'arte, come per esempio mediante risonanza plasmonica di superficie. L'analisi del legame per 4E1 ? stata eseguita utilizzando un BIAcore 3000 dotato di un chip sensore CM5. In breve, un chip BIAcore CM5 ? stato attivato con EDC/NHS e il mAb 4E1 ? stato catturato sulla superficie attivata. I restanti siti attivi sono stati bloccati da etanolamina/HCI. CD93 ricombinate ? stato legato a 4E1 legato alla superficie e lasciato dissociarsi nel tempo. Le fasi di associazione e dissociazione per ciascuna iniezione su ciascuna superficie di densit? sono state sottoposte ad analisi cinetica.

Pertanto, in un'ulteriore forma di realizzazione preferita, l'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione, preferibilmente l'anticorpo monoclonale o il suo frammento legante l'antigene, si lega al CD93 con un'affinit? (KD) di almeno 10<-10>, preferibilmente di almeno 10<-11>.

In un secondo aspetto, l'invenzione descrive un polinucleotide che codifica l'anticorpo anti-CD93. Il polinucleotide codifica per un polipeptide, che mostra un legame specifico con il bersaglio CD93. Per "legame specifico" si intende significare che il legame dell'anticorpo anti-CD93 a CD93 ? almeno 50 volte, preferibilmente almeno 100 volte pi? forte del legame a una proteina di controllo come l'albumina, come determinato ad es. mediante analisi Western Blot o ELISA.

Il termine "anticorpo anti-CD93", come usato nel presente documento, indica qualsiasi polipeptide che ha somiglianza strutturale con un anticorpo naturale ed ? in grado di legarsi a CD93, in cui la specificit? di legame ? determinata dai CDR dei polipeptidi. Quindi, "anticorpo anti-CD93" intende riferirsi a una struttura derivata da immunoglobuline con legame a CD93. Il frammento legante l'antigene ? inteso come polipeptide, che comprende almeno un frammento legante l'antigene di un anticorpo a lunghezza intera. I frammenti leganti l'antigene sono costituiti almeno dal dominio variabile della catena pesante e dal dominio variabile della catena leggera, disposti in modo che entrambi i domini insieme siano in grado di legarsi all'antigene specifico. Gli anticorpi monoclonali sono anticorpi monospecifici identici perch? prodotti da uno specifico tipo di cellula immunitaria (clone) che deriva da una singola cellula madre. Gli ?anticorpi monoclonali? e la produzione di anticorpi monoclonali appartengono allo stato dell'arte. In generale, gli anticorpi monoclonali possono, ad esempio, essere preparati secondo il noto metodo di Winter & Milstein [11]. In alternativa alla preparazione di ibridomi secernenti anticorpi monoclonali, un anticorpo monoclonale diretto contro un polipeptide dell'invenzione pu? essere identificato e isolato mediante screening di una libreria di immunoglobuline combinatorie ricombinanti (ad esempio una libreria fagica di anticorpi) con il polipeptide di interesse.

In un'ulteriore forma di realizzazione, qui descritto ? un vettore comprendente il polinucleotide che codifica l'anticorpo anti-CD93, in cui detto vettore ? facoltativamente un vettore di espressione.

Tale vettore ? preferibilmente un vettore per l'espressione in batteri, come E. coli, in una cellula di lievito, in cellule di insetto o cellule di mammifero. Preferibilmente, gli acidi nucleici dell'invenzione sono sotto il controllo di sequenze regolatorie adatte come promotori o potenziatori (enhancers) nel vettore, consentendo cos? l'espressione in una cellula ospite. I vettori comprendono preferibilmente sequenze che consentono la replicazione in una cellula ospite.

In ancora un'ulteriore forma di realizzazione, l'invenzione descrive una cellula ospite contenente il vettore che comprende il polinucleotide che codifica l'anticorpo anti-CD93, in cui la cellula ospite ? preferibilmente procariotica, eucariotica o di mammifero. Un ulteriore aspetto della presente invenzione riguarda un metodo per produrre l'anticorpo anti-CD93 come qui descritto, detto metodo comprendendo (a) l?esprimere il vettore comprendente il polinucleotide che codifica l'anticorpo anti-CD93 in una cellula ospite adatta, e (b) recuperare l'anticorpo.

Preferibilmente nella composizione farmaceutica secondo l'invenzione detto anticorpo anti-CD93 ? legato ad una sostanza terapeuticamente attiva, preferibilmente ad un composto chemioterapico, preferibilmente scelto tra un agente alchilante, antibiotico antineoplastico, antimetabolita, e un derivato di origine naturale, un composto citotossico, un composto citostatico, una citochina, una nanoparticella o un radionuclide.

Si ? scoperto che il mAb 4E1 mostra un'efficiente internalizzazione in cellule di mammifero portatrici di CD93, come determinato mediante analisi microscopica di tali cellule incubate con 4E1 come mostrato negli Esempi.

Pertanto, l'anticorpo monoclonale secondo la presente invenzione e altri anticorpi anti-CD93, che si legano a CD93 nello stesso epitopo di CD93 riconosciuto da 4E1, sono sorprendentemente vantaggiosi nel campo della ricerca, diagnosi o terapia biotecnologica. In particolare, un agente attivo pu? essere legato ad un anticorpo anti-CD93 dell'invenzione, che viene captato nella cellula per internalizzazione. Tale agente attivo pu? quindi esercitare l'effetto desiderato nella cellula, come un effetto citotossico o citostatico.

In una forma di realizzazione preferita, la sostanza terapeuticamente attiva ? un composto chemioterapico o un composto citotossico o un composto citostatico selezionato tra un agente dannoso per il DNA, in particolare actinomicina-D, mitomicina C, cisplatino, doxorubicina, etoposide, verapamil, podofillotossina, 5-FU, un derivato di origine naturale e un taxano, preferibilmente paclitaxel e carboplatino, o pi? preferibilmente in cui l'anticorpo anti-CD93 ? legato covalentemente ad una sostanza terapeuticamente attiva di (a) e/o al composto diagnostico di (b), opzionalmente tramite un linker.

In un aspetto preferito, la composizione farmaceutica dell'invenzione ? per via orale, o parenterale, topica, rettale, endovenosa, sottocutanea, intramuscolare, intranasale, intravaginale, attraverso la mucosa orale, la mucosa polmonare, o per somministrazione transoculare, in cui detta composizione farmaceutica viene somministrata incorporata in liposomi, microvescicole, legata a vettori molecolari o combinata con molecole selezionate dal gruppo costituito da molecole che consentono l'apertura temporanea della barriera ematoencefalica, molecole antinfiammatorie, anticorpi monoclonali e farmaci con attivit? immunosoppressiva.

Le propriet? uniche di 4E1 consentono una somministrazione di un farmaco migliorata e accelerata alle cellule endoteliali associate ai tumorali ed alle retinopatie neovascolari.

Un'ulteriore forma di realizzazione della presente invenzione descrive l'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione o la composizione farmaceutica comprendente (i) l'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione o (ii) il polinucleotide che codifica l'anticorpo anti-CD93 per l'uso nel trattamento di: retinopatie neo-angiogeniche, preferibilmente in cui la retinopatia ? AMD e retinopatia diabetica, sindromi neovascolari intraoculari, retinopatie proliferative, artrite reumatoide, psoriasi e/o una malattia tumorale, preferibilmente in cui la malattia tumorale ? una malattia tumorale epiteliale e/o ? selezionata dal gruppo costituito da astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, Schwannoma, neurofibrosarcoma, medulloblastoma, melanoma, cancro del pancreas, carcinoma della prostata, cancro della testa e del collo, cancro della mammella, cancro del polmone, cancro dell'ovaio, cancro dell'endometrio, cancro del rene, neuroblastoma, carcinoma squamoso, epatoma, cancro del colon, mesotelioma e carcinoma epidermoide.

Preferibilmente, l'anticorpo anti-CD93 legato ad un composto diagnostico pu? essere utilizzato per scopi diagnostici in vitro e si riferisce quindi ad un importante strumento per la ricerca biotecnologica. Ad esempio, biopsie di pazienti o campioni corporei in generale possono essere analizzate utilizzando l'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione. Pertanto, un'ulteriore forma di realizzazione, la presente invenzione riguarda l'uso di un anticorpo anti-CD93 dell'invenzione come agente diagnostico in vitro o come agente biotecnologico in vitro. In una forma di realizzazione preferita, la presente invenzione riguarda l'uso di un anticorpo anti-CD93 dell'invenzione legato ad un composto diagnostico come agente diagnostico in vitro o come agente biotecnologico in vitro. ? stato scoperto che 4E1 ? internalizzato in modo efficiente nelle cellule endoteliali primarie umane, come mostrato negli esempi e nelle figure 2 e 3. L'internalizzazione pu? essere determinata utilizzando un anticorpo anti-CD93 che ? collegato a un composto diagnostico adatto come un composto fluorescente. Negli esempi, Alexa-488 ? stato utilizzato come colorante fluorescente. La quantificazione dell'internalizzazione pu? essere eseguita mediante analisi microscopica, come descritto nell'esempio, o mediante citometria a flusso per immagini. ? stato scoperto che 4E1 ? stato internalizzato negli endosomi/lisosomi tardivi, e quindi 4E1 o suoi frammenti leganti l'antigene o anticorpi anti-CD93 che riconoscono lo stesso epitopo di 4E1, sono particolarmente adatti per la somministrazione di un agente terapeuticamente attivo (somministrazione di farmaci) o per la consegna di un composto diagnostico, ad esempio ai fini di imaging.

L'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione pu? essere internalizzato da una cellula di mammifero che esprime CD93, preferibilmente detta cellula di mammifero ? una cellula endoteliale o un macrofago. In una forma di realizzazione preferita, l'internalizzazione da parte della cellula di mammifero che esprime CD93, preferibilmente in cui la cellula ? una cellula endoteliale o macrofago, ? determinata mediante analisi e quantificazione microscopiche o mediante citometria a flusso per immagini.

In una forma di realizzazione particolarmente preferita, l'anticorpo anti-CD93 dell'invenzione ? legato ad una sostanza terapeuticamente attiva, che consente l'internalizzazione della sostanza terapeuticamente attiva. Per sostanza terapeuticamente attiva secondo l'invenzione si intende un composto che ha un effetto terapeutico o preventivo in un animale, preferibilmente mammifero, ancor pi? preferibilmente umano. La sostanza terapeuticamente attiva pu? essere un composto utile in chemioterapia, cio? un composto chemioterapico. In una forma di realizzazione preferita, la sostanza terapeuticamente attiva ? un composto citotossico o citostatico. Pertanto, in una forma di realizzazione, l'invenzione riguarda un anticorpo anti-CD93 dell'invenzione legato a una sostanza terapeuticamente attiva, preferibilmente a un composto chemioterapico, preferibilmente selezionato tra un agente alchilante, un antibiotico antineoplastico, un antimetabolita e un derivato di origine naturale, un composto citotossico, un composto citostatico, una citochina, una nanoparticella o un radionuclide.

Citochine adatte sono per esempio TNFalfa, IL-2 e IL-12.

Composti chemioterapici adatti sono noti nell'arte. Questi composti rientrano in diverse categorie, tra cui, ad esempio, agenti alchilanti, antibiotici antineoplastici, antimetaboliti e derivati di origine naturale.

Esempi di agenti alchilanti che possono essere usati nell'invenzione includono busulfan, caroplatino, carmustina, clorambucile, cisplatino, ciclofosfamide (cio? Cytoxan), dacarbazina, ifosfamide, lomustina, mecolaretamina, melfalan, procarbazina, streptozotocina e tiotepa.

Esempi di antibiotici antineoplastici includono bleomicina, dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, idarubicina, mitomicina (ad esempio, mitomicina C), mitoxantrone, pentostatina e plicamicina.

Esempi di antimetaboliti includono fluorodeossiuridina, cladribina, citarabina, floxuridina, fludarabina, flurouracile (cio? 5-fluorouracile (5FU)), gemcitabina, hydroxyurea, mercaptopurina, metotrexato, e tioguanina.

Esempi di derivati di origine naturale includono docetaxel, etoposide, irinotecan, taxani (ad es. paclitaxel), teniposide, topotecan, vinblastina, vincristina, vinorelbina, prednisone e tamoxifene

Ulteriori esempi di agenti chemioterapici che possono essere usati nell'invenzione includono asparaginasi e mitotano.

Inoltre, pu? essere utilizzata anche la ceramide C2.

Inoltre, pu? essere vantaggioso collegare gli anticorpi anti-CD93 dell'invenzione a un composto diagnostico. Inoltre, pu? essere vantaggioso collegare gli anticorpi anti-CD93 dell'invenzione a un composto diagnostico. Un composto diagnostico ? un composto in grado di produrre un segnale tramite rilevamento diretto o indiretto.

Gli anticorpi "a lunghezza intera" o "completi" si riferiscono a proteine che comprendono due catene pesanti (H) e due leggere (L) interconnesse da legami disolfuro che comprendono: (1) in termini di catene pesanti, una regione variabile e una regione costante della catena pesante che comprende tre domini, CH1, CH2 e CH3; e (2) in termini di catene leggere, una regione variabile di catena leggera e una regione costante di catena leggera che comprende un dominio, CL. Per quanto riguarda il termine "anticorpo completo", si intende qualsiasi anticorpo che abbia una struttura di dominio globale tipica di un anticorpo naturale (cio? comprendente una catena pesante di tre o quattro domini costanti e una catena leggera di un dominio costante nonch? i rispettivi domini variabili), anche se ciascun dominio pu? comprendere ulteriori modifiche, come mutazioni, delezioni o inserzioni, che non modificano la struttura complessiva del dominio. Ad esempio, il mAb 4E1 ? un anticorpo a lunghezza intera. Un "frammento legante l'antigene" di un anticorpo monoclonale ? un frammento di un anticorpo monoclonale, che presenta essenzialmente la stessa funzione e specificit? dell'anticorpo monoclonale completo da cui deriva il frammento. La digestione proteolitica limitata con papaina scinde il prototipo di Ig in tre frammenti. Due frammenti amminoterminali identici, ciascuno contenente un'intera catena L e circa met? di una catena H, sono i frammenti leganti l'antigene (Fab). Il terzo frammento, di dimensioni simili ma contenente la met? terminale carbossilica di entrambe le catene pesanti con il loro legame disolfuro intercatena, ? il frammento cristallizzabile (Fc). L'Fc contiene carboidrati, siti di legame del complemento e di legame di FcR. La digestione con pepsina limitata produce un singolo frammento F(ab')2 contenente sia i pezzi Fab che la regione cerniera, incluso il legame disolfuro intercatena H-H. F(ab')2 ? bivalente per il legame con l'antigene. Il legame disolfuro di F(ab')2 pu? essere scisso per ottenere Fab'. Inoltre, le regioni variabili delle catene pesanti e leggere possono essere fuse insieme per formare un singolo frammento variabile di catena (scFv).

Poich? la prima generazione di anticorpi a grandezza naturale presentava alcuni problemi, molti degli anticorpi di seconda generazione comprendevano solo frammenti dell'anticorpo. I domini variabili (Fvs) sono i frammenti pi? piccoli con un dominio legante l'antigene intatto costituito da un VL e un VH. Tali frammenti, con solo i domini di legame, possono essere generati mediante approcci enzimatici o espressione dei frammenti genici rilevanti, ad es. nelle cellule batteriche ed eucariotiche. Possono essere utilizzati diversi approcci, ad es. o il solo frammento Fv o frammenti "Fab" comprendenti uno dei bracci superiori della "Y" che include Fv pi? i primi domini costanti. Questi frammenti vengono solitamente stabilizzati introducendo un legame polipeptidico tra le due catene, che porta alla produzione di un'unica catena Fv (scFv). In alternativa, possono essere usati frammenti Fv (dsFv) legati con disolfuro. I domini di legame dei frammenti possono essere combinati con qualsiasi dominio costante per produrre anticorpi a lunghezza intera o possono essere fusi con altre proteine e polipeptidi.

Un frammento di anticorpo ricombinante ? il frammento Fv a catena singola (scFv). In generale, ha un'elevata affinit? per il suo antigene e pu? essere espresso in una variet? di ospiti. Queste e altre propriet? rendono i frammenti scFv non solo applicabili in medicina, ma anche potenzialmente utilizzabili in applicazioni biotecnologiche. Come dettagliato sopra, nel frammento scFv i domini VH e VL sono uniti con un linker peptidico idrofilo e flessibile, che migliora l'espressione e l'efficienza del ripiegamento. Solitamente vengono utilizzati linker di circa 15 amminoacidi, di cui il linker (Gly4Ser)3 ? stato utilizzato pi? frequentemente. Le molecole scFv potrebbero essere facilmente degradate proteoliticamente, a seconda del linker utilizzato. Con lo sviluppo delle tecniche di ingegneria genetica queste limitazioni potrebbero essere praticamente superate dalla ricerca focalizzata sul miglioramento della funzione e della stabilit?. Un esempio ? la generazione di frammenti Fv stabilizzati con disolfuro (o legati a disolfuro) in cui il dimero VH-VL ? stabilizzato da un legame disolfuro intercatena. Le cisteine vengono introdotte all'interfaccia tra i domini VL e VH, formando un ponte disolfuro, che tiene insieme i due domini.

La dissociazione di scFvs si traduce in scFv monomerici, che possono essere complessati in dimeri (diabodies), trimeri (triabodies) o aggregati pi? grandi come TandAbs e Flexibodies.

Gli anticorpi con due domini di legame possono essere creati sia attraverso il legame di due scFv con un semplice legame polipeptidico (scFv)2 sia attraverso la dimerizzazione di due monomeri (diabodies). I modelli pi? semplici sono diabodies che hanno due domini funzionali leganti l'antigene che possono essere uguali, simili (diabodies bivalenti) o avere specificit? per antigeni distinti (diabodies bispecifici). Inoltre, sono stati sviluppati formati di anticorpi comprendenti quattro domini variabili di catene pesanti e quattro domini variabili di catene leggere. Esempi di questi includono anticorpi bispecifici tetravalenti (TandAbs e Flexibodies, Affimed Therapeutics AG, Heidelberg, Germania). A differenza di un diabody bispecifico, un TandAb bispecifico ? un omodimero costituito da un solo polipeptide. Poich? le due diverse catene, un diabody pu? costruire tre dimeri diversi di cui solo uno ? funzionale. Pertanto, ? pi? semplice ed economico produrre e purificare questo prodotto omogeneo. Inoltre, il TandAb di solito mostra migliori propriet? di legame (possedendo il doppio del numero di siti di legame) e una maggiore stabilit? in vivo. I corpi flessibili sono una combinazione di scFv con un motivo multimerico diabody risultante in una molecola multivalente con un alto grado di flessibilit? per unire due molecole che sono abbastanza distanti l'una dall'altra sulla superficie cellulare. Se sono presenti pi? di due domini funzionali leganti l'antigene e se hanno specificit? per antigeni distinti, l'anticorpo ? multispecifico.

In sintesi, immunoglobuline specifiche, in cui possono essere inserite particolari sequenze divulgate o, in alternativa, formare la parte essenziale di, includono ma non sono limitate ai seguenti anticorpi anti-CD93 che formano forme di realizzazione particolari della presente invenzione: un Fab (frammento monovalente con domini variabile leggero (VL), variabile pesante (VH), costante leggero e costante pesante 1 (CHI), un F(ab')2 (frammento bivalente comprendente due frammenti Fab legati da un ponte disolfuro o alternativa alla regione cerniera), un Fv (domini VL e VH), un scFv (una singola catena Fv dove VL e VH sono uniti da un linker, ad esempio un linker peptidico), una molecola anticorpale bispecifica (una molecola anticorpale comprendente un polipeptide come divulgato qui, collegato a una seconda frazione funzionale avente una diversa specificit? di legame rispetto all'anticorpo, incluso, senza limitazione, un altro peptide o proteina come un anticorpo o un ligando del recettore), un dimero Fv a catena singola bispecifico, un diabody, un triabody, un tetrabody, un minibody (un scFv unito a un CH3).

Alcuni anticorpi anti-CD93 o frammenti leganti l'antigene di anticorpi monoclonali inclusi, ma non limitati a, Fv, scFv, molecole diabody o anticorpi di dominio (Domantis) possono essere stabilizzati incorporando ponti disolfuro per rivestire i domini VH e VL. Gli anticorpi bispecifici possono essere prodotti utilizzando tecnologie convenzionali, i cui metodi specifici includono la produzione chimica, o da ibridomi e altre tecnologie tra cui, ma non solo, la tecnologia BiTE<TM >(molecole che possiedono regioni di legame all'antigene di diversa specificit? con un linker peptidico) ed approccio knobs-intoholes.

Di conseguenza, l'anticorpo anti-CD93 o il frammento legante l'antigene di un anticorpo monoclonale pu? essere un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv legato al disolfuro, un scFv, un (scFv)2 , un anticorpo bivalente, un anticorpo bispecifico, un anticorpo multispecifico, un diabody, un triabody, un tetrabody o un minibody.

In un'altra forma di realizzazione preferita, l'anticorpo anti-CD93 ? un anticorpo umano, un anticorpo chimerico o un anticorpo umanizzato. Un anticorpo chimerico ? un anticorpo in cui almeno una regione di un'immunoglobulina di una specie ? fusa con un'altra regione di un'immunoglobulina di un'altra specie mediante ingegneria genetica al fine di ridurne l'immunogenicit?. Ad esempio, le regioni murine VL e VH possono essere fuse alla parte rimanente di un'immunoglobulina umana. Un particolare tipo di anticorpi chimerici sono gli anticorpi umanizzati. Gli anticorpi umanizzati vengono prodotti fondendo il DNA che codifica i CDR di un anticorpo non umano con il DNA che produce anticorpi umani. Il costrutto di DNA risultante pu? quindi essere utilizzato per esprimere e produrre anticorpi che di solito non sono immunogenici come l'anticorpo parenterale non umano o come un anticorpo chimerico, poich? semplicemente i CDR non sono umani. Inoltre, l'anticorpo pu? essere umano.

Un ulteriore oggetto dell'invenzione riguarda l'uso dell'anticorpo anti-CD93 come qui descritto, legato o meno ad un composto diagnostico, come agente diagnostico in vitro o come agente biotecnologico in vitro.

Varie forme di realizzazione e aspetti della presente invenzione come delineato in precedenza e come rivendicato nella sezione delle rivendicazioni di seguito trovano supporto sperimentale nei seguenti esempi.

ESEMPI

Si fa ora riferimento ai seguenti esempi, che insieme alle precedenti descrizioni illustrano alcune forme di realizzazione dell'invenzione.

Esempio 1: correlazione dell?espressione di CD93 e MMRN2.

MATERIALI E METODI

Dati di RNA-seq, microarray tissutale, ed analisi di immagine

Dati di RNA-seq per CD93, MMRN2, and PECAM-1 da 15 diversi tipi di tumore sono stati ottenuti da The Cancer Genome Atlas (Tabella 1).

Tabella 1. Dati di RNA-seq per CD93, MMRN2, and PECAM-1 in 15 diversi tipi di <tumore.>

L'espressione vascolare di CD93 e MMRN2 ? stata valutata in microarray tissutali contenenti ?nuclei? di tessuto duplicati per campione (1 mm di diametro) di 455 campioni di 15 differenti tumori umani. La colorazione immunoistochimica ? stata eseguita come descritto in precedenza utilizzando i seguenti anticorpi: anti-MMRN2 (HPA020741, Atlas Antibodies) e anti-CD93 (HPA009300 e HPA012368, Atlas Antibodies). Poich? CD93 e MMRN2 erano espressi in modo eterogeneo nel vaso tumorale, ? stato utilizzato un metodo di analisi semiquantitativa basata sulla proporzione di vasi positivi in ciascun campione. La frequenza dei vasi colorati positivamente ? stata valutata in cieco su una scala da 0 a 3 (0 = nessun vaso colorato, 1 = minoranza di vasi colorati, 2 = maggioranza dei vasi colorati, 3 = forte colorazione nella maggior parte dei vasi).

Analisi statistica

In questo studio, le analisi dei dati sono state eseguite con il software Sigma-Plot GraphPad Prism 6 (Graphpad Software) e i valori rappresentano la media ? SD ottenuta da almeno tre misurazioni su campioni randomizzati. Il coefficiente di correlazione di Pearson (r) ? stato utilizzato per stimare l'associazione tra due variabili. Tutti i valori di P riportati sono a due code e P <0,05 ? stato considerato statisticamente significativo.

RISULTATI

? stato dimostrato che l'espressione vascolare di CD93 ? sovraregolata in alcuni campioni di tumore umano (15, 16, 21). Inoltre, MMRN2, il partner di legame di CD93, ? stato trovato costantemente depositato lungo i vasi sanguigni del tumore umano (17,18). Per determinare se esiste una correlazione tra l'espressione di CD93 e MMRN2 nel sistema vascolare tumorale, abbiamo prima confrontato i dati RNA-seq di CD93, MMRN2 e PECAM-1 (un marcatore di cellule endoteliali) raccolti da 15 tipi di cancro umano: tiroide, polmone, fegato, pancreas, testa e collo, stomaco, colon-retto, rene, prostata, testicolo, seno, cervicale, ovaio, endometrio e melanoma (vedere la tabella 1 per i dettagli). Queste analisi hanno mostrato una forte correlazione tra livelli di espressione simili di CD93 e MMRN2 e il grado di vascolarizzazione del tumore, stimato attraverso l'espressione di PECAM-1 (Figura 1A). Successivamente, abbiamo analizzato la frazione di vasi sanguigni positivi per CD93 e MMRN2 in microarray di tessuto tumorale (Figura 1B), contenenti un totale di 455 campioni di tessuti provenienti da 15 diversi tumori umani e calcolato la media del punteggio per ciascun tipo di cancro (Figura 1C). Quando si correla il punteggio della colorazione CD93 con il punteggio della colorazione MMRN2 negli stessi nuclei di microarray tissutali, abbiamo scoperto che alti livelli di CD93 corrispondevano ad alti livelli di MMRN2 e viceversa (Figura 1D). Complessivamente, questi dati indicano che CD93 e MMRN2 sono coespressi nei vasi tumorali e che i livelli di queste proteine sono aumentati nei tumori ipervascolarizzati, suggerendo un ruolo funzionale dell'interazione CD93-MMRN2 nello sviluppo progressivo dell'angiogenesi tumorale.

Esempio 2: purificazione dell'anticorpo monoclonale 4E1 e test di internalizzazione

MATERIALI E METODI

Cellule

Le cellule endoteliali primarie della vena ombelicale umana (HUVEC) sono state ottenute da LONZA e autenticate mediante analisi FACS con un mAb anti-CD31 e in tutta la coltura mediante valutazione da parte dei ricercatori della tipica morfologia. Le colture micoplasma-negative sono state garantite da test settimanali. Le cellule sono state coltivate in EGMTM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 (LONZA) e mantenute in un'atmosfera umidificata a 37?C e 5% di CO2.

Anticorpo monoclonale

I topi BALB/c femmina sono stati iniettati quattro volte con 8 x 10<6 >cellule HUVEC distaccate dal substrato di coltura utilizzando un tampone di dissociazione (10 mM EDTA in PBS) e risospesi come singole cellule in PBS. Le cellule immunitarie della milza sono state fuse con cellule di mieloma X63-Ag8. 1021 ibridomi sono stati sottoposti a screening per la loro capacit? di produrre anticorpi che legano gli antigeni di superficie delle cellule endoteliali mediante citometria a flusso. In breve, dopo il distacco non enzimatico, le HUVEC sono state incubate in PBS contenente il 5% di siero bovino fetale per bloccare il legame non specifico e marcate con anticorpi primari diluiti in PBS contenente l'1% di albumina di siero bovino (BSA). La colorazione ? stata rilevata utilizzando anticorpi secondari anti-topo coniugati. Successivamente, sono stati selezionati mAb positivi per la loro capacit? di non riconoscere gli antigeni espressi sulla superficie delle cellule epiteliali umane HEK-293. L'acquisizione e l'analisi dei dati sono state eseguite in un citometro a flusso Becton Dickinson FACS Calibur utilizzando il software CellQuest. 61 diversi anticorpi che hanno riconosciuto le molecole di superficie endoteliale sono stati purificati mediante cromatografia di affinit? con colonne HiTrap Protein G (GE Healthcare) e utilizzati nei saggi di inibizione.

La sequenza del cDNA dei geni dell'immunoglobulina dell'anticorpo monoclonale 4E1 ? stata determinata ed ? mostrata sopra (catena leggera: SEQ ID No: 3 e catena pesante: SEQ ID No: 4).

Inoltre, sono state determinate le sequenze proteiche della catena pesante e leggera (dominio VDJ o VJ, senza dominio costante) di 4E1 (SEQ ID No: 2 e SEQ ID No: 1) e sono state dedotte le sequenze CDR di 4E1 secondo la nomenclatura Chothia. Le sequenze CDR di 4E1 sono: KASQSVDYDGDSYMN (LCDR1; SEQ ID No: 5), AASNLES (LCDR2; SEQ ID No: 6), QQNNEDPRT (LCDR3; SEQ ID No: 7), GYTFASY (HCDR1; SEQ ID No: 8) , YPGNGD (HCDR2; SEQ ID n.: 9) e LDWYFDL (HCDR3; SEQ ID n.: 10).

mAb 4E1 ? un anticorpo dell'isotipo lgG1 a catena leggera k.

IgG di topo di controllo sono stati ottenuti da Thermo Fisher Scientific (#10400C).

Saggi di internalizzazione dell?anticorpo

20.000 HUVEC sono state seminate su vetrini coprioggetto rivestiti di gelatina, coltivate per 24 ore in mezzo EGMTM-2 e successivamente incubate 18 ore con 10 ?g/ml 4E1 in presenza o meno di 100 nM Bafilomycin A1 (Sigma-Aldrich). Successivamente, le cellule sono state fissate in paraformaldeide al 3%, permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,1% in PBS e bloccate con BSA allo 0,3% p/v in PBS, per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, le cellule sono state lavate due volte con PBS e incubate per 1 ora a 4?C con un IgG anti-topo secondario marcato con Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific), diluito a 25 ?g/mL in PBS/0.1% Tween-20, quindi incubato per 15 min con il colorante ToPro-3 (cat. #T3605; ThermoFisher Scientific) diluito 1:1.000 (1 ?M) in PBS per evidenziare i nuclei. Infine, i campioni sono stati lavati tre volte con PBS/0,1% Tween-20 , i coprioggetto sono stati montati con mezzo di montaggio Mowiol e sono state acquisite immagini della fluorescenza. Per la co-colorazione anti-Rab7, le cellule permeabilizzate sono state incubate per 1,5 ore con mAb anti-Rab7 (D95F2) di coniglio (Cat. #9367) diluito 1:100 in PBS/0.1% Tween-20. L'anticorpo secondario utilizzato per la colorazione di Rab-7 era coniugato con Alexa Fluor-568 (Thermo Fisher Scientific).

Microscopia confocale a scansione laser

Le immagini fluorescenti sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a scansione laser Leica TCS SP2 AOBS e sono state prodotte immagini sovrapposte. ? stato utilizzato un obiettivo a olio Leica HCX PL APO lbd.BL 63x/1.40. I fluorocromi e le proteine fluorescenti sono stati eccitati alla lunghezza d'onda ottimale compresa tra 458 nm e 633 nm e le immagini (risoluzione 512 ? 512) sono state acquisite a una velocit? di scansione di 400 Hz linee immagine/sec. La configurazione dello scanner confocale ? stata impostata come segue: foro stenopeico a 1,0 di diametro del disco di Airy e funzione di media della linea a 4.

RISULTATI

Il mAb 4E1 ? internalizzato attraverso la via lisosomiale.

Abbiamo effettuato saggi di internalizzazione in HUVEC utilizzando 4E1 e un anticorpo coniugato secondario Alexa Fluor-488 come descritto nella sezione Materiali e metodi sopra. La bafilomicina A1, un inibitore specifico della pompa protonica di tipo vacuolare, che inibisce l'acidificazione e la degradazione proteica nei lisosomi e promuove la distribuzione perinucleare dei lisosomi, induce l'accumulo perinucleare del segnale 4E1, suggerendo che 4E1 ? internalizzato attraverso la via lisosomiale (Figura 2). Per confermare questa ipotesi, abbiamo colorato gli HUVEC trattati e non trattati con bafilomicina per 4E1 e Rab7, un noto marcatore di endosomi tardivi, che controlla l'aggregazione e la fusione delle strutture endocitiche/lisosomi tardivi. Come mostrato nella Figura 3, nelle cellule trattate con Bafilomicina, 4E1 si ? accumulato nelle strutture marcate con Rab7, confermando che il mAb 4E1 ? internalizzato attraverso la via lisosomiale.

Esempio 3: analisi del legame dell'anticorpo monoclonale 4E1

MATERIALI E METODI

Linee cellulari

Le cellule HUVEC sono state coltivate come descritto nell'Esempio 2.

Anticorpo monoclonale

L'anticorpo monoclonale 4E1 ? stato ottenuto come descritto nell'Esempio 2. Le cellule umane Lenti-X 293T (Takara Bio Inc) sono state coltivate utilizzando condizioni standard.

Produzione della proteina ricombinante CD93

Il costrutto chimerico contenente il dominio extracellulare di CD93 fuso a un tag di 6xHis ? stato generato mediante amplificazione enzimatica di un clone di cDNA corrispondente alla sequenza completa del gene umano, utilizzando i seguenti primer: forward 5'GAGAGGATCCGACACGGAGGCGGTGG3' (SEQ ID NO:11) e reverse 5'GAGAGAATTCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCTTTTGCCCGTCAGTGC3? (SEQ ID NO:12). Il frammento generato dalla PCR ? stato clonato nel vettore pCS2 (Addgene). Il costrutto ? stato confermato dal sequenziamento. Per ottenere la proteina CD93 solubile, le cellule umane Lenti-X 293T sono state trasfettate in modo transiente utilizzando lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) seguendo le istruzioni del produttore. 24 ore dopo la trasfezione, le cellule sono state lavate con PBS e coltivate in DMEM senza siero per 16 ore. Il CD93 ricombinante ? stato purificato mediante cromatografia di affinit? di nichel in un purificatore AKTA (GE Healthcare), utilizzando un protocollo di eluizione graduale basato sull'imidazolo come agente competitivo. Le frazioni contenenti CD93, identificate mediante analisi Western Blot, sono state raggruppate e dializzate in PBS. La concentrazione proteica ? stata determinata mediante analisi spettrofotometrica.

Analisi dell'equilibrio della risonanza plasmonica di superficie (SPR) e costanti di legame

L'analisi del legame ? stata eseguita utilizzando un BIAcore 3000 dotato di un chip sensore CM5. In breve, l'anticorpo 4E1 ? stato immobilizzato tramite gruppi amminici su un chip sensore CM5 seguendo procedure standard (portata 5 ?l/min). Per l'immobilizzazione, 4E1 diluito in 10 mM Na acetato pH 4.0 alla concentrazione di 10 ?g/ml ? stato iniettato per 360 sec sulla matrice destrano su cella a flusso, precedentemente attivata con una miscela di EDC-NHS per 420 sec. Dopo l'iniezione dell'anticorpo, ? stato eseguito un impulso di Etanolamina 1M per neutralizzare i gruppi attivati. Una cella a flusso di riferimento da utilizzare come bianco, ? stata contemporaneamente sottoposta a procedure identiche, ma l'iniezione dell?anticorpo ? stata sostituita con l'iniezione del solo tampone di diluizione (HBS-EP+). La proteina CD93 ricombinante purificata ? stata diluita in HBS-EP+ a diverse concentrazioni (1 ?g/ml, 2,5 ?g/ml, 5 ?g/ml e 20 ?g/ml) e iniettata per 180 s ad una portata di 60 ?l/min sulla cella a flusso 4 e sulla cella a flusso di riferimento 3. La dissociazione ? stata seguita per 600 secondi, la rigenerazione ? stata ottenuta con un breve impulso di glicina 10 mM pH 2,0. I sensorgrammi illustrati nella figura sono ottenuti per sottrazione dai sensorgrammi su Fc4 di quelli ottenuti su Fc3. Le velocit? cinetiche sono state calcolate applicando un legame 1:1 come modello di adattamento utilizzando il software di valutazione Bia T200 2.0.1

RISULTATI

Dall'analisi dell'equilibrio SPR, ? stato scoperto che 4E1 mostra un'affinit? di KD (M) = 4,50*10<-10 >per CD93 e un'associazione cinetica (ka) e tassi di dissociazione (kd) rispettivamente di 8,41*10<4 >e 3 ,78*10<-5 >(Figura 4).

Esempio 4: marcatura dell'anticorpo monoclonale 4E1 e saggi di immunofluorescenza

MATERIALI E METODI

Linee cellulari

Le cellule HUVEC sono state coltivate come descritto nell'Esempio 2.

Marcatura degli anticorpi con fluorocromo

Anticorpo monoclonale: L'anticorpo monoclonale 4E1 ? stato ottenuto come descritto nell'Esempio 2. Come indicato nell'Esempio 2, ? stata determinata la sequenza proteica della catena pesante e leggera (dominio VDJ o VJ, senza dominio costante), rispettivamente, di 4E1 (SEQ ID No: 2 e SEQ ID No: 1). Inoltre, sono state determinate le sequenze CDR di 4E1 secondo la nomenclatura Chothia. Le sequenze CDR di 4E1 sono: KASQSVDYDGDSYMN (LCDR1; SEQ ID No: 5), AASNLES (LCDR2; SEQ ID No: 6), QQNNEDPRT (LCDR3; SEQ ID No: 7), GYTFASY (HCDR1; SEQ ID No: 8) , YPGNGD (HCDR2; SEQ ID n.: 9) e LDWYFDL (HCDR3; SEQ ID n.: 10).

mAb 4E1 ? un anticorpo dell'isotipo lgG1 a catena leggera k.

Il kit Zip Alexa Fluor Rapid Antibody Labeling (Thermo Fisher Scientific) ? stato utilizzato per marcare in modo efficiente e rapido il mAb 4E1 con Alexa Fluor 488 seguendo le istruzioni del produttore. In breve, 10 ?l di soluzione di bicarbonato di sodio 1 M sono stati aggiunti a 100 ?l di soluzione 4E1 (1 mg/ml). Successivamente, la soluzione anticorpale ? stata incubata per 15 minuti a temperatura ambiente con la soluzione di fluorocromo (Componente B) e utilizzata in esperimenti di immunofluorescenza.

Immunofluorescenza

Le cellule sono state seminate su vetrini coprioggetto rivestiti di gelatina e fissate in paraformaldeide al 3% per 15 minuti a temperatura ambiente durante la fase tardiva di adesione. I campioni sono stati permeabilizzati con Triton X-100 allo 0,1% in PBS e bloccati con BSA allo 0,3% p/v in PBS, ciascuno per 15 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, le cellule sono state lavate con PBS e incubate per 1 ora a temperatura ambiente con 4E1 marcato con Alexa Fluor 488 e anticorpi anti-MMRN2 di coniglio. Quindi, i campioni sono stati lavati tre volte con PBS/0.1% Tween-20 e incubati con anticorpi anti-coniglio secondari marcati con Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific), diluiti a 25 ?g/mL in PBS/0.1% Tween-20. Dopo il lavaggio, i coprioggetto sono stati montati con mezzo di montaggio Mowiol. Le immagini fluorescenti sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale a scansione laser Leica TCS SP2 AOBS e sono state prodotte immagini sovrapposte. ? stato utilizzato un obiettivo a olio Leica HCX PL APO lbd.BL 63x/1.40. I fluorocromi e le proteine fluorescenti sono stati eccitati alla lunghezza d'onda ottimale compresa tra 458 nm e 633 nm e le immagini (risoluzione 512 ? 512) sono state acquisite a una velocit? di scansione di 400 Hz linee immagine/sec. La configurazione dello scanner confocale ? stata impostata come segue: foro stenopeico a 1,0 di diametro del foro Airy e funzione di media della linea a 4.

RISULTATI

Per valutare se il mAb 4E1 potesse essere coniugato a un colorante fluorescente, abbiamo eseguito una reazione di coniugazione utilizzando un kit commerciale, che utilizza Alexa Fluor 488 come colorante. Poich? nelle cellule in adesione CD93 ? associato al suo ligando MMRN2 nelle vescicole internalizzate [12], abbiamo condotto esperimenti di immunofluorescenza su HUVEC in fase di adesione tardiva per verificare se la 4E1 coniugata conservasse le sue attivit? di legame colorando le vescicole endocitiche. L'uso dell?anticorpo 4E1 marcato con AlexaFluor 488 e di un anticorpo policlonale anti-MMRN2 marcato con AlexaFluor 568 ha mostrato chiaramente che CD93 colocalizzava con MMRN2 in vescicole interiorizzate, dimostrando che 4E1, dopo un evento di coniugazione, mantiene la sua peculiarit? di legame a CD93 (Figura 5).

Da quanto sopra descritto e dagli esempi sopra riportati risulta evidente il vantaggio conseguito dall'anticorpo monoclonale 4E1 descritto ed ottenuto secondo la presente invenzione.

Claims

RIVENDICAZIONI

1. Un anticorpo anti-CD93 isolato, in cui detto anticorpo comprende:

2. L?anticorpo isolato anti-CD93 della rivendicazione 1, in cui detto anticorpo comprende 6 regioni CDR, dette regioni CDR essendo:

a. un CDR-L1 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:5;

b. un CDR-L2 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:6;

c. un CDR-L3 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:7;

d. un CDR-H1 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:8;

e. un CDR-H2 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:9; e

f. un CDR-H3 avente la sequenza amminoacidica di SEQ ID NO:10, in cui opzionalmente sono presenti uno o pi? sostituzioni amminoacidiche conservative.

3. L'anticorpo isolato anti-CD93 di una qualsiasi delle rivendicazioni 1 o 2, in cui l'anticorpo ? un anticorpo monoclonale, e/o ? umanizzato o umano.

4. L'anticorpo isolato anti-CD93 di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-3, in cui l'anticorpo ? un diabody, triabody o tetrabody.

5. L'anticorpo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-4, in cui l'anticorpo ? un anticorpo monoclonale a lunghezza intera ed ? preferibilmente bispecifico.

6. Un polinucleotide che codifica l'anticorpo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5.

7. Un vettore comprendente il polinucleotide della rivendicazione 6, in cui il vettore ? facoltativamente un vettore di espressione.

8. Una cellula ospite comprendente il vettore della rivendicazione 7, in cui la cellula ospite ? preferibilmente procariotica, eucariotica o di mammifero.

9. Un metodo per produrre l'anticorpo anti-CD93 di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-6, detto metodo comprendendo (a) esprimere il vettore della rivendicazione 8 in una cellula ospite adatta e (b) recuperare l'anticorpo.

10. Una composizione farmaceutica comprendente (i) l'anticorpo anti-CD93 di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 o (ii) il polinucleotide della rivendicazione 6, in cui la composizione facoltativamente comprende inoltre un veicolo.

11. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 10, in cui detto anticorpo anti-CD93 ? legato a una sostanza terapeuticamente attiva, preferibilmente a un composto chemioterapico, preferibilmente selezionato tra un agente alchilante, antibiotico antineoplastico, antimetabolita e un derivato di origine naturale, un composto citotossico, un composto citostatico, una citochina, una nanoparticella o un radionuclide.

12. La composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 11, per somministrazione orale, o parenterale, topica, rettale, endovenosa, sottocutanea, intramuscolare, intranasale, intravaginale, attraverso la mucosa orale, la mucosa polmonare o per somministrazione transoculare, in cui detta composizione farmaceutica viene somministrata incorporata in liposomi, microvescicole, legate a trasportatori molecolari o combinate con molecole selezionate dal gruppo costituito da molecole che consentono l'apertura temporanea della barriera ematoencefalica, molecole antinfiammatorie, anticorpi monoclonali e farmaci ad attivit? immunosoppressiva.

13. L'anticorpo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 o la composizione delle rivendicazioni 10-12 per l'uso come medicamento.

14. L'anticorpo di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 o la composizione delle rivendicazioni 10-12 per l'uso nel trattamento delle retinopatie neo-angiogeniche, preferibilmente in cui la retinopatia ? degenerazione maculare legata all'et? (AMD) e retinopatia diabetica, sindromi neovascolari intraoculari, retinopatie proliferative, artrite reumatoide, psoriasi e/o una malattia tumorale, preferibilmente in cui la malattia tumorale ? una malattia tumorale epiteliale e/o ? selezionata dal gruppo costituito da astrocitoma, oligodendroglioma, meningioma, neurofibroma, glioblastoma, ependimoma, Schwannoma, neurofibrosarcoma, medulloblastoma, melanoma, cancro del pancreas, carcinoma della prostata, cancro della testa e del collo, cancro della mammella, cancro del polmone, cancro dell'ovaio, cancro dell'endometrio, cancro del rene, neuroblastoma, carcinoma squamoso, epatoma, cancro del colon, mesotelioma e carcinoma epidermoide.

15. L'anticorpo anti-CD93 di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5, in cui detto anticorpo ? legato ad un composto diagnostico, preferibilmente selezionato da un radionuclide, un composto chemioluminescente, un composto fluorescente, un colorante o un enzima.

16. Uso dell'anticorpo anti-CD93 di una qualsiasi delle rivendicazioni 1-5 o 15 come agente diagnostico in vitro o come agente biotecnologico in vitro.