KR20230132470A - 단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법 및 사용하는방법 - Google Patents

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KR20230132470A
KR20230132470A KR1020237024236A KR20237024236A KR20230132470A KR 20230132470 A KR20230132470 A KR 20230132470A KR 1020237024236 A KR1020237024236 A KR 1020237024236A KR 20237024236 A KR20237024236 A KR 20237024236A KR 20230132470 A KR20230132470 A KR 20230132470A
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데이브 니콜스
바오촨 황
사운 그리어
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키닉사 파마슈티컬스, 리미티드
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Abstract

본 발명은 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물, 및 이러한 조성물을 생산하기 위한 방법, 예를 들어 세포 배양 방법 및/또는 단백질 정제 방법에 관한 것이다. 장애, 예를 들어 GM-CSFR-α 연관 장애를 치료하기 위해 이러한 조성물을 사용하는 방법도 제공된다.

Description

단백질 조성물 및 이를 생산하는 방법 및 사용하는 방법
관련 출원
본 출원은 2020년 12월 18일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/127,973호에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 그 전체 내용이 참조로서 본원에 통합된다.
단클론 항체(mAb)와 같은 항체는 제약 산업에서 중요한 부류의 치료제이다. 항체 치료제는 암, 염증, 및 자가면역 장애와 같은 많은 질환을 치료하기 위해 개발되었다.
약학적 응용을 위한 단클론 항체와 같은 단백질의 생산은 일반적으로 상류 공정 기술(예: 세포 배양) 및 하류 공정 기술(예: 단백질 정제)의 사용을 포함한다. 일반적으로, 항체는 적절한 접힘 및 번역 후 변형을 보장하기 위해 포유류 세포 배양물에서 재조합 단백질로서 생산된다. 세포 배양물로부터 생산되는 단클론 항체를 효과적으로 사용하기 위해서는(예를 들어 안전성 프로파일을 개선하기 위해) 이를 숙주 세포 단백질 및 다른 불순물로부터 정제할 필요가 있다.
상류 및 하류 공정을 통해 다양한 수준의 변이체 및 불순물을 나타내는 단백질이 생산될 수 있다. 이러한 단백질 변이체 및 불순물은 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편, 또는 하전된 종(예: 산성 또는 염기성 종); 및/또는 공정 관련 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질, 핵산, 및 잔류 배지 성분을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명은 단백질 생산, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 생산을 위한 상류 및 하류 공정 기술의 식별 및 최적화에 기초하며, 이는 낮은 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어, 낮은 수준의 생성물 관련 물질, 예를 들어, 생성물 응집체, 단편 또는 하전된 종, 예를 들어, 산성 또는 염기성 종, 및/또는 낮은 수준의 공정-관련 불순불, 예를 들어 숙주 세포 단백질을 조성물의 생산을 초래한다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 감소된 수준의 절반 항체를 갖는 관심 단백질을 포함하는 제제의 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심 단백질 및 절반 항체를 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 투입하는 단계, 이에 의해, 감소된 수준의 절반 항체를 갖는 관심 단백질을 포함하는 제제를 생성하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 관심 단백질을 포함하는 제제 중 절반 항체의 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심 단백질 및 절반 항체를 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 투입하는 단계, 이에 의해 관심 단백질을 포함하는 제제 중 절반 항체의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙이다.
일부 구현예에서, 샘플은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로 정제된다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 설프하이드릴, 설포네이트, 황산염, 카르복시메틸, 설포에틸, 설포프로필, 인산염, 및 설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 POROS™ XS CEX, Capto™ S ImpAct, TOTOPEARL™ GigaGap CM 650M, 및 TOYOPEAL™ 황산염 650F로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 결합-용리 모드로 작동한다.
일부 구현예에서, 샘플은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 정제된다. 일부 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 카르복실, 하이드록실, N-벤질-N-메틸 에탄올 아민, 페닐프로필아민, 및 헥실아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capt™ MMC ImpRes 및 Capto™ Adhere ImpRes로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제제는 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2.8%, 약 2%, 약 1%, 또는 약 0.5% 미만의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 약 2.8% 미만의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 약 0.1~20%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18%, 또는 약 1~17%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 약 0.6~1.7%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제 내 절반 항체의 수준은 샘플 내 절반 항체의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 용리 완충액을 사용하여 용리물 분획을 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2.8%, 약 2%, 약 1%, 또는 약 0.5% 미만의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~20%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18%, 또는 약 1~17%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집된다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획은 약 0.6~18%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된다. 일부 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획은 약 1~17%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획 내 절반 항체의 수준은 샘플 내 절반 항체의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 40~60 mM 아세트산나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 40~60 mM 염화나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 4~7, 약 5~6, 약 5~5.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 5~5.5의 pH를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 50 mM 아세트산나트륨, 약 55 mM 염화나트륨, 및 약 5.35의 pH를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질은 약 10~100 g/L, 약 20~90 g/L, 약 30~80 g/L, 약 40~70 g/L, 또는 약 50~60 g/L의 수준으로 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지 상에 로딩된다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 약 30~60 g/L의 수준으로 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지 상에 로딩된다.
일부 구현예에서, 절반 항체의 수준은 비환원 CE-SDS(도데실황산나트륨을 이용한 모세관 전기영동)에 의해 결정된다.
일 양태에서, 본 발명은 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2.8%, 약 2%, 약 1%, 또는 약 0.5%의 절반 항체를 포함하는 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 2.8% 미만의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 0.1~20%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18%, 또는 약 1~17%의 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.6~1.7%의 절반 항체를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2.8%, 약 2%, 약 1%, 또는 약 0.5%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~20%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18%, 또는 약 1~17%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 수지로부터 수집되고 약 0.6~18%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 혼합 모드 수지로부터 수집되고 약 1~17%의 절반 항체를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집된 관류 분획 및/또는 세척액 분획을 포함하고, 상기 관류 분획 및/또는 세척액 분획은 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관류 분획 및/또는 세척액 분획은 약 6% 미만의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 절반 항체의 수준은 비환원 CE-SDS(도데실황산나트륨을 이용한 모세관 전기영동)에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙(mavrilimumab)이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 조성물 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 제제를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및 산성 종을 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 정제하여 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 제제를 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 제제에서 산성 종의 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 샘플 및 산성 종을 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 정제하여 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 제제에서 산성 종의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙이다.
일부 구현예에서, 샘플은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로 정제된다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 디에틸아미노에틸, 4차 아미노에틸, 및 4차 아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 POROS™ XQ AEX 및 Capto™ Q ImpRes로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 결합-용리 모드로 작동한다.
일부 구현예에서, 샘플은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 정제된다. 일부 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 카르복실, 하이드록실, N-벤질-N-메틸 에탄올 아민, 페닐프로필아민, 및 헥실아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capto™ Adhere ImpRes이다.
일부 구현예에서, 제제는 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5% 미만의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 약 11~22%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 약 11~38%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 약 9~18%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 약 11~38%의 산성 종 및 약 24% 미만의 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 약 11~38%의 산성 종 및 (i) 약 58~62% 주요 종 또는 (ii) 약 64% 초과 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 용리 완충액을 사용하여 용리물 분획을 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5%의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집된다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획은 약 11~22%의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된다. 일부 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획은 약 12~38%의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제 또는 용리물 분획 내 산성 종의 수준은 샘플 내 산성 종의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 50~200 mM, 약 70~150 mM, 약 90~130 mM, 또는 약 100~110 mM 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 100~110 mM 염화나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 20~150 mM, 약 30~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 40~60 mM 히스티딘을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM 아세트산염을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 40~60 mM 아세트산염을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM Bis-Tris을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 40~60 mM Bis-Tris를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 5~7 또는 5.5~6.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 5,5~6.5의 pH를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 50 mM 히스티딘, 약 105 mM NaCl을 포함하고, 6.0의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 관심 단백질은 약 10~100 g/L, 약 20~90 g/L, 약 30~80 g/L, 또는 약 40~70 g/L의 수준으로 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지 상에 로딩된다. 일부 구현예에서, 관심 단백질은 약 50~60 g/L의 수준으로 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지 상에 로딩된다.
일부 구현예에서, 산성 종의 수준은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 상기 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 처리하기 전에, 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 처리한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5%의 항체의 산성종을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 11~22%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 9~18%의 산성 종을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5% 미만의 항체의 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 24% 미만의 염기성 종을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 1~45%, 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~25%, 약 5~35%, 약 10~35%, 약 15~35%, 약 1~30%, 약 1~25%, 약 1~24%, 약 5~25%, 약 5~30%, 약 5~45%, 약 10~25%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 15~25%, 약 15~30%, 약 15~35%, 약 15~25%, 약 17~26%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16~41%의 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 16~41%의 염기성 종을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%를 초과하는 항체의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 64% 고과의 주요 종을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 40%~99%, 약 45%~99%, 약 50%~99%, 약 55%~99%, 약 50%~90%, 약 55%~90%, 약 50%~80%, 약 55%~80%, 약 50%~70%, 약 55%~70%, 약 50~65%, 약 46~67%, 약 55~65%, 약 58~62%, 약 58~63%, 약 58~67%, 약 53~61%, 또는 약 46~66%의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 46~67%의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 58~62%의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 11~38%의 산성 종 및 약 24% 미만의 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 11~38%의 산성 종 및 약 64% 초과의 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 11~38%의 산성 종 및 약 58~62%의 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 9~41%의 염기성 종 및 약 9~18%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 9~41%의 염기성 종 및 약 64% 초과의 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 16~41%의 염기성 종 및 약 58~62%의 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 46~67%의 주요 종 및 약 9~18%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 46~67%의 주요 종 및 약 24% 미만의 염기성 종을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5%의 산성 종을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 용리물 분획은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 11~38%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 11~22%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 12~38%의 산성 종을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5% 미만의 염기성 종을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 용리물 분획은 약 1~45%, 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~25%, 약 5~35%, 약 10~35%, 약 15~35%, 약 1~30%, 약 1~25%, 약 1~24%, 약 5~25%, 약 5~30%, 약 5~45%, 약 10~25%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 15~25%, 약 15~30%, 약 15~35%, 약 15~25%, 약 17~26%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16`41%의 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 9~41%의 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 9~29%의 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 16~41%의 염기성 종을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 초과의 주요 종을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 40~99%, 약 45~99%, 약 50~99%, 약 55~99%, 약 50~90%, 약 55~90%, 약 50~80%, 약 55~80%, 약 50~70%, 약 55~70%, 약 50~65%, 약 55~65%, 약 58~62%, 약 58~63%, 약 58~67%, 약 46~67%, 약 53~61%, 또는 약 46~66%의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 53~61%의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 46~66%의 주요 종을 포함한다.
전술한 양태 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙이다.
일부 구현예에서, 산성 종의 수준, 주요 종의 수준, 또는 염기성 종의 수준은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 결정된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 조성물 중 어느 하나 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 감소된 수준의 고분자량 응집체 및/또는 숙주 세포 단백질을 갖는 관심 단백질을 포함하는 제제를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심 단백질, 고분자량 응집체, 및/또는 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피 수지로 처리하여 감소된 수준의 고분자량 응집체 및/또는 숙주 세포 단백질을 갖는 관심 단백질을 포함하는 제제를 생산하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 관심 단백질을 포함하는 제제에서 고분자량 응집체 및/또는 숙주 세포 단백질의 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심 단백질 및 절반 항체를 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피 수지로 처리하여, 관심 단백질을 포함하는 제제에서 고분자량 응집체 및/또는 숙주 세포 단백질의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙이다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지이다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 설프하이드릴, 설포네이트, 황산염, 카르복시메틸, 설포에틸, 설포프로필, 인산염, 및 설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 POROS™ XS CEX, Capto™ S ImpAct, TOTOPEARL™ GigaGap CM 650M, 및 TOYOPEAL™ 황산염 650F로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 결합-용리 모드로 작동한다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 수지는 음이온 교환 크로마토그래피 수지이다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 디에틸아미노에틸, 4차 아미노에틸, 및 4차 아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 POROS™ XQ AEX 및 Capto™ Q ImpRes로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 결합-용리 모드로 작동한다.
일부 구현예에서, 크로마토그래피 수지는 혼합 모드 크로마토그래피 수지이다. 일부 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 카르복실, 하이드록실, N-벤질-N-메틸 에탄올 아민, 페닐프로필아민, 및 헥실아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capt™ MMC ImpRes 및 Capto™ Adhere ImpRes로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제제는 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 0.5% 미만의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 0.04~0.8%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제 내 고분자량 응집체의 수준은 샘플 내 고분자량 응집체의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 제제는 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 약 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8, 또는 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 약 0.1~2 ppm의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제 내 HCP의 수준은 샘플 내 HCP의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 제제는 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1% 또는 약 99.5% 초과의 관심 단백질의 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 약 99.1% 초과의 관심 단백질의 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 관심 단백질의 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 약 98~99%의 관심 단백질의 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 약 98~99.9%의 관심 단백질의 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 관심 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 약 0.4% 미만 또는 0.3% 미만의 관심 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 관심 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 약 0.6~1.5%의 관심 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 약 0.5~1.5%의 관심 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 용리 완충액을 사용해 용리물 분획을 수집하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.04~0.8%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.5~0.8%, 약 0.1~6%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 0.04~0.4%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 수지로부터 수집되고 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.04~0.2%, 약 0.04~0.8%, 약 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.5~0.7%, 약 0.1~6%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 수지로부터 수집되고 약 0.1~0.4%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.0~1%, 약 0.04~0.2%, 약 0.04~0.8%, 약 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 0.1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 수지로부터 수집되고 약 0.04~0.2%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획 내 고분자량 응집체의 수준은 샘플 내 고분자량 응집체의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8 ppm, 또는 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~2 ppm의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 2~8 ppm의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획 내 HCP의 수준은 샘플 내 HCP의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소된다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1% 또는 약 99.5% 초과의 관심 단백질의 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 94~99.9%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 관심 단백질의 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 98~99.9%의 관심 단백질의 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 98.5~99.5%의 관심 단백질의 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획는 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 관심 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.1~1.1%, 약 0.01~0.8%, 약 0.5~1.5%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 관심 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~1.1%의 관심 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~0.8%의 관심 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.4~1.1%의 관심 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피로부터 수집되고 약 0.1~0.8% 또는 약 0.4~0.8%의 관심 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~1.1% 또는 약 0.5~1.1%의 관심 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 고분자량 응집체의 수준, 관심 단백질 단편의 수준, 또는 관심 단백질의 단량체의 수준은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, HCP의 수준은 ELISA에 의해 결정된다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 0.5% 미만의 고분자량 응집체를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 0.04~0.8%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8, 또는 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.1~2 ppm의 HCP를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 또는 약 99.5% 초과의 항체 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 99.1% 초과의 항체 단량체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 항체 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 98~99%의 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 98~99.9%의 항체 단량체를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2% 또는 약 0.1% 미만의 항체의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 0.4% 미만의 항체 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 항체 단편를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 0.5~1.5%의 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.6~1.5%의 항체 단편을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%의 고분자량 응집체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 용리물 분획은 약 0.1~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.04~0.8%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.5~0.8%, 약 0.04~0.4%, 약 0.1~6%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 0.04~0.4%의 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.04~0.2%의 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~0.4%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 용리물 분획은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 용리물 분획은 약 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8 ppm, 또는 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~2 ppm의 HCP를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 2~8 ppm의 HCP를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 용리물 분획은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 또는 약 99.5% 초과의 항체 단량체를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 용리물 분획은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 94~99.9%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 항체 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 98~99.9%의 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 98.5~99.5%의 항체를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 항체 단편을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하는 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 용리물 분획은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.1~1.1%, 약 0.1~0.8%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.4~1.1%의 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~1.1% 또는 약 0.5~1.1%의 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~0.8% 또는 약 0.4~0.8%의 항체 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 고분자량 응집체의 수준, 항체 단량체의 수준, 및/또는 항체 단편의 수준은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, HCP의 수준은 ELISA에 의해 결정된다.
일부 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙이다.
일 양태에서, 본 발명은 감소된 수준의 산성 종을 갖는 관심 단백질을 세포 배양물로부터 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계; 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5의 pH로 유지하는 단계; 이에 의해 산성 종의 수준이 감소된 관심 단백질을 포함하는 제제를 제조하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 배양물에서 관심 단백질의 산성 종 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계; 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5의 pH로 유지하는 단계; 이에 의해 관심 단백질의 산성 종 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 배양물로부터 관심 단백질의 생산 수율을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계; 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5의 pH로 유지하는 단계; 이에 의해 관심 단백질의 생산 수율을 증가시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙이다.
일부 구현예에서, 세포 배양물의 pH는 약 6~7.5, 약 6.5~7.5, 약 6~7, 약 6.5~7, 또는 약 6.7~7의 pH로 유지된다. 일부 구현예에서, 세포 배양물의 pH는 약 6.5~7의 pH로 유지된다.
일부 구현예에서, 세포 배양물의 pH는 인큐베이션 기간의 2일차 내지 8일차 동안 약 0.01~0.4, 약 0.02~0.4, 약 0.05~0.3, 약 0.1~0.4, 약 0.1~0.3, 약 0.1~0.2, 또는 약 0.1~0.2만큼 감소되지만, 약 6.5~7의 pH로 유지된다.
일부 구현예에서, 세포 배양물의 pH는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계에 의해 유지된다: (a) 세포 배양물 내 CO2의 수준을 증가시키는 단계; (b) 세포 배양물 내 젖산의 수준을 약 0.1~5 g/L로 유지하는 단계; (c) 세포 배양물에서 젖산 생성을 증가시키는 단계; 및 (d) 인큐베이션 기간 동안 세포 배양 보충제의 수준을 증가시키는 단계.
일부 구현예에서, 세포 배양물 내 CO2의 수준은 적어도 약 0.1%, 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10%만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 세포 배양물 내 CO2의 수준은 약 0.1~5%, 약 0.2~6%, 약 0.3~7%, 약 0.4~8%, 또는 약 0.5~10%만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 세포 배양물 내 젖산의 수준은 약 0.1-5 g/L, 0.1-4 g/L, 0.1-3 g/L, 0.1-2 g/L, 0.2-2 g/L, 약 0.3-2 g/L, 약 0.4-2 g/L, 약 0.5-2 g/L, 약 0.6-2 g/L, 약 0.7-2 g/L, 약 0.8-2 g/L, 약 0.9-2 g/L, 약 0.1-1.9, 약 0.2-1.8, 약 0.3-1.7, 약 0.4-1.6, 약 0.5-1.5 g/L, 약 0.6-1.4, 약 0.7-1.3, 약 0.8-1.2, 또는 약 0.9-1.1에서 유지된다.
일부 구현예에서, 세포 배양 보충제는 하나 이상의 보충제를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 배양 보충제의 수준은 인큐베이션 기간 동안 약 0.1%~20%, 약 0.1%~10%, 약 0.1%~5%, 약 0.5%~20%, 약 0.5%~10%, 또는 약 1%~10%만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 인큐베이션 기간의 2일차 내지 8일차 동안 약 0.1~3% 수준의 세포 배양 보충제가 세포 배양물에 첨가되고, 세포 배양 보충제의 수준은 인큐베이션 기간의 4일차 내지 10일차 동안 초기 수준의 약 50% 이상만큼 증가된다.
일부 구현예에서, 세포 배양 보충제를 증가시키면 젖산 생성 증가, 삼투압 증가, 세포 생존력 증가, 및/또는 세포 배양 pH 감소를 초래한다.
일부 구현예에서, 세포 배양물은 약 35~37°C의 온도에서 유지된다.
일 양태에서, 본 발명은 세포 배양물로부터 감소된 수준의 산성 종을 갖는 관심 단백질을 포함하는 제조 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계; 및 (a) 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5, 약 6~7, 또는 약 6.5~7의 pH로 유지하는 단계; (b) 인큐베이션 기간 동안 세포 배양 보충제의 수준을 증가시키는 단계; (c) 세포 배양물 중 젖산의 수준을 약 0.1~5 g/L로 유지하는 단계; (d) 세포 배양물 중 젖산 생산을 증가시키는 단계; (e) 세포 배양물 중 CO2의 수준을 증가시키는 단계; 및/또는 (f) 세포 배양물의 pH를 감소시키는 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계, 이에 의해 감소된 수준의 산성 종을 갖는 관심 단백질을 포함하는 제제를 제조하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물 중 관심 단백질의 산성 종의 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계; 및 (a) 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5, 약 6~7, 또는 약 6.5~7의 pH로 유지하는 단계; (b) 인큐베이션 기간 동안 세포 배양 보충제의 수준을 증가시키는 단계; (c) 세포 배양물 중 젖산의 수준을 약 0.1~5 g/L로 유지하는 단계; (d) 세포 배양물 중 젖산 생산을 증가시키는 단계; (e) 세포 배양물 중 CO2의 수준을 증가시키는 단계; 및/또는 (f) 세포 배양물의 pH를 감소시키는 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계, 이에 의해 관심 단백질의 산성 종의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 세포 배양물로부터 관심 단백질의 생산 수율을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계; 및 (a) 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5, 약 6~7, 또는 약 6.5~7의 pH로 유지하는 단계; (b) 인큐베이션 기간 동안 세포 배양 보충제의 수준을 증가시키는 단계; (c) 세포 배양물 중 젖산의 수준을 약 0.1~5 g/L로 유지하는 단계; (d) 세포 배양물 중 젖산 생산을 증가시키는 단계; (e) 세포 배양물 중 CO2의 수준을 증가시키는 단계; 및/또는 (f) 세포 배양물의 pH를 감소시키는 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계, 이에 의해 관심 단백질의 생산 수율을 증가시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 일부 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙이다.
도 1은 예시적인 정제 공정의 개요를 도시한다.
본 발명은 단백질 생산, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 생산, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체의 생산을 위한 상류 및 하류 공정 기술의 식별 및 최적화에 기초하며, 이는 낮은 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어, 낮은 수준의 생성물 관련 물질, 예를 들어, 생성물 응집체, 단편 또는 하전된 종, 예를 들어, 산성 또는 염기성 종, 및/또는 낮은 수준의 공정-관련 불순불, 예를 들어 숙주 세포 단백질을 갖는 단백질을 포함하는 조성물의 생산을 초래한다.
상류 단백질 생산 동안의 조건, 예컨대 세포 배양의 공정 매개변수, 예를 들어, 세포 배양물의 pH, CO2 또는 젖산 수준 또는 세포 배양 공급물 및/또는 보충제의 수준을 조절하고/하거나 하류 정제, 예를 들어 크로마토그래피 단계를 최적화함으로써, 본 발명의 발명자들은, 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예컨대 감소된 수준의 산성 종 또는 염기성 종, 감소된 수준의 응집체 또는 단편, 감소된 수준의 절반 항체 및/또는 감소된 수준의 숙주 세포 단백질을 갖는 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙 또는 이의 항원 결합 부분과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하는 조성물을 성공적으로 생성하였다. 이렇게 낮은 수준의 변이체 및/또는 불순물을 갖는 조성물은 매우 바람직한데, 이는 생성된 단백질 생성물이 원하지 않는 효과 없이 더 높은 효능, 더 높은 효능, 또는 더 나은 안정성을 갖는 치료 이점을 제공하기 때문이다. 예를 들어, 더 낮은 응집체, 절반 항체 또는 단편, 및/또는 더 높은 수준의 항체 단량체를 갖는 조성물은, 해당 조성물에 존재하는 활성 항체의 수준을 최대화함으로써, 적어도 부분적으로, 더 높은 효능 및 효과를 나타낼 것이다.
다음의 설명은 당업자가 다양한 구현예를 실행하고 사용할 수 있도록 제시된다. 특정 방법, 조성물, 기술, 및 응용에 대한 설명은 단지 예로서 제공된다. 본원에 기술된 실시예에 대한 다양한 변형은 당업자에게 쉽게 명백할 것이며, 본원에 기술된 일반 원리는 다양한 구현예의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다른 실시예 및 응용에 적용될 수 있다. 따라서, 다양한 구현예는 본원에 기술되고 도시된 예에 제한되도록 의도되지 않으며, 청구범위와 일치하는 범위를 부여받아야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 출원이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 섹션에서 제시된 정의가 본원에 참고로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물에 제시된 정의와 상반되거나 그렇지 않으면 일치하지 않는 경우, 본 섹션에서 제시된 정의가 본원에 참고로 포함된 정의에 우선한다. 본원에 제공된 제목은 단지 편의를 위한 것이며 어떠한 방식으로도 본 출원을 제한하지 않는다. 본원에 언급된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물은 그 전체가 참조로서 통합된다.
정의
본 발명이 보다 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어가 먼저 정의된다. 이에 더하여, 파라미터의 값 또는 값의 범위가 인용될 때마다, 해당 인용된 값에 대한 중간 값 및 범위 또한 본 발명의 일부가 되는 것으로 의도된다는 것을 주목해야 한다.
용어 “일” 및 “하나”는 해당 용어의 문법적 대상체 중 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예로서, “일 요소”는 하나의 요소, 또는 둘 이상의 요소, 예를 들어 복수의 요소를 의미한다.
용어 “포함하는”은 본원에서 “포함하지만 이에 한정되지 않는”이라는 구절을 의미하고 이와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "또는"은 문맥상 달리 명시되지 않는 한, 용어 "및/또는"을 의미하고 이와 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, “센스 가닥 또는 안티센스 가닥”은 “센스 가닥 또는 안티센스 가닥 또는 센스 가닥 및 안티센스 가닥”으로 이해된다.
용어 “약”은 당업계에서 통상적인 공차 범위 이내를 의미하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, “약”은 평균으로부터 약 2의 표준 편차로서 이해될 수 있다. 특정 구현예에서, “약”은 평균 + ±10%이다. 특정 구현예에서, “약”은 평균 + ±5%이다. 일련의 수치 또는 범위 앞에 “약”이 존재할 경우, “약”은 해당 일련의 수치 또는 범위 내의 각각의 숫자를 수정할 수 있는 것으로 이해된다.
용어 “폴리펩티드” 및 “단백질”은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용되며, 최소 길이에 한정되지 않는다. 아미노산 잔기의 이러한 중합체는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있고, 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 삼량체 및 아미노산 잔기의 다량체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 전장 단백질 및 이의 단편 둘 모두가 해당 정의에 포함된다. 이러한 용어는 또한 폴리펩티드의 발현-후 변형, 예를 들어, 당질화, 시알화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적을 위해, “폴리펩티드”는 해당 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, (일반적으로 자연 상태에서 보존적인) 천연 서열에 대한 결실, 첨가 및 치환과 같은 변형을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위-유도 돌연변이 유발을 통하는 것과 같이 의도적이거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통하는 것과 같이 우발적일 수 있다.
용어 “항체”는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)로 이루어진 면역글로불린 분자를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 LCVR 또는 VL로서 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더 보존된 영역으로 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
항체라는 용어는 또한 키메라 항체, 인간화 항체, 및 마우스, 인간, 시노몰구스 원숭이, 라마, 낙타 등과 같은 다양한 종의 항체를 포함한다. 이러한 용어는 또한 2가 또는 4가 항체와 같은 다가 항체를 포함한다. 다가 항체는, 예를 들어, 다수의 항원 결합(CDR-함유) 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬뿐만 아니라 하나 이상의 항원 결합 도메인을 각각 함유하는 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 이러한 2개 이상의 폴리펩티드 사슬은, 예를 들어, 이황화 결합(들) 또는 임의의 다른 공유 또는 비공유 상호작용을 형성할 수 있는 힌지 영역을 통해 서로 연관된다.
항체(또는 “항체 부분”)의 “항원 결합 부분”이라는 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체, 예를 들어, 하나 이상의 항원 결합 도메인의 단편을 포함한다(예를 들어, 마브릴리무맙, 과립구/대식세포 콜로니 자극 인자 수용체 알파 서브유닛(GM-CSFRα)의 경우). 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 용어, 항체의 “항원 결합 부분” 내에 포함된 결합 단편의 예는 단일 도메인 항체(sdAb)의 적어도 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 분자를 포함하되, 분자는 항원에 결합할 수 있다. 항체 결합 부분이라는 용어는 또한 중쇄의 적어도 CDR1, CDR2, 및 CDR3 및 경쇄의 CDR1, CDR2, 및 CDR3을 포함하는 분자를 지칭하되, 분자는 항원에 결합할 수 있다. 항체 결합 부분이하는 용어는 또한, (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인을 포함하는 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab’)2 단편; (iii) F(ab’)2 단편의 환원에 의해 형성될 수 있는 Fab’ 단편; (iv) CH2 및 CH3 영역 및 하나 이상의 이황화 및 비공유 상호작용에 의해 함께 유지되는 힌지 영역의 일부를 포함하는 Fc 단편; (v) VH 및 CH1 도메인을 포함하는 Fd 단편; (vi) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 Fv 단편, (vii) 감소된 IgG 또는 절반 IgG; 및 (viii) VH 도메인을 포함하는 dAb 단편(Ward 등의 문헌[(1989) Nature 341:544-546], 이의 전체 교시는 본원에 참조로서 통합됨)과 같은 항원에 결합할 수 있는 단편을 포함한다. 또한, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, VL 및 VH 영역이 쌍을 이룬 단일 단백질 사슬로서 만들어져 1가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)로 알려짐; 예를 들어, Bird 등의 문헌(1988)[Science 242:423-426]; 및 Huston 등의 문헌(1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]을 참조하며, 이의 전체 교시는 본원에 참조로서 통합됨)를 형성할 수 있게 하는 합성 링커에 의해, 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 이러한 단쇄 항체는 또한 항체의 “항원 결합 부분”이라는 용어 내에 포함되는 것으로 의도된다. 디아바디와 같은 다른 형태의 단쇄 항체 또한 이에 포함된다. 디아바디는, VH 및 VL 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 발현되지만, 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이의 페어링을 허용하기에 너무 짧은 링커를 사용하여, 이에 의해 도메인을 강제하여 또 다른 사슬의 상보성 도메인과 쌍을 이루게 함으로써 2개의 항원 결합 부위를 생성하는, 2가 이중특이적 항체이다(예를 들어, Holliger, P. 등의 문헌(1993)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448]; Poljak, R. J. 등의 문헌(1994)[Structure 2:1121-1123]을 참조하며, 이의 전체 교시는 본원에 참조로서 통합됨). 또한, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항체 또는 항체 부분과 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비공유 연관에 의해 형성되는 더 큰 면역 부착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역 부착 분자의 예는 사량체 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov, S. M. 등의 문헌(1995)[Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101], 이의 전체 교시는 본원에 참조로서 통합됨) 및 2가 및 비오틴화된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩티드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용(Kipriyanov, S. M. 등의 문헌(1994)[Mol. Immunol. 31:1047-1058], 이의 전체 교시는 본원에 참조로서 통합됨)을 포함한다. Fab 및 F(ab’)2 단편과 같은 항체 부분은 전체 항체의 파파인 또는 펩신 소화와 같은 종래의 기술을 각각 사용하여 전체 항체로부터 제조될 수 있다. 또한, 항체, 항체 부분 및 면역부착 분자는 본원에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 일 양태에서, 항원 결합 부분은 완전한 도메인 또는 완전한 도메인의 쌍이다.
본원에서 사용되는 용어, “절반 항체” 또는 “감소된 IgG”는 75 kDa의 분자량을 갖는 하나의 면역글로불린 경쇄에 연관된 하나의 면역글로불린 중쇄를 지칭한다. 이는 항체 분자 내에서 힌지-영역 이황화 결합만을 선택적으로 환원시키는 생성물이다.
용어 "인간 항체"는 Kabat 등의 문헌[Kabat 등의 문헌(1991)[Sequences of proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]에 기술된 바와 같은 인간 생식선 면역글로불린 서열에 상응하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는, 예를 들어 CDR 및 특정 CDR3에, 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 돌연변이는 “선택적 돌연변이 유발 접근법”을 사용하여 도입될 수 있다. 인간 항체는 아미노산 잔기, 예를 들어, 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 활성을 향상시키는 아미노산 잔기로 대체된 적어도 하나의 위치를 가질 수 있다. 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열의 일부가 아닌 아미노산 잔기로 대체된 최대 20개의 위치를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 최대 10개, 최대 5개, 최대 3개 또는 최대 2개의 위치가 대체된다. 일 구현예에서, 이들 대체는 CDR 영역 내에 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 용어 “인간 항체”는 마우스와 같은 다른 포유류 종의 생식선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 접목된 항체를 포함하도록 의도되지 않는다.
"재조합 인간 항체"라는 어구는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 인간 항체, 예컨대 숙주 세포 내에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 인간 면역글로불린 유전자에 대해 형질전환된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체(예를 들어, Taylor, L. D. 등의 문헌(1992)[ Nucl. Acids Res. 20:6287-6295]을 참조하며, 이의 전체 교시는 본원에 참조로서 통합됨) 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 단계를 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다(Kabat, E. A. 등의 문헌(1991)[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조). 그러나, 특정 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발(또는, 인간 Ig 서열에 대한 동물 유전자이식이 사용될 경우, 생체 내 체세포 돌연변이 유발)을 거치며, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체 내 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 그러나, 특정 구현예에서, 이러한 재조합 항체는 선택적 돌연변이 유발 접근법 또는 역돌연변이 또는 둘 모두의 결과이다.
본원에서 사용되는, “단리된 항체”는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다(예를 들어, GM-CSFRα에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 GM-CSFRα 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 실질적으로 갖지 않음). 그러나, GM-CSFRα에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는, 다른 종으로부터의 GM-CSFRα 분자와 같은 다른 항원에 대한 교차 반응성을 가질 수 있다. 또한, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 적절한 항-GM-CSFRα 항체는 마브릴리무맙이다.
용어 “Kabat 넘버링”, “Kabat 정의” 및 “Kabat 라벨링”은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 당업계에서 인식되는 이들 용어는 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 또는 이의 항원 결합 부분 내의 다른 아미노산 잔기보다 더 가변적인(즉, 초가변적인) 아미노산 잔기에 대해 번호를 부여하는 시스템을 지칭한다(Kabat 등의 문헌(1971)[Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391] 및, Kabat, E. A. 등의 문헌(1991)[ Sequences of Proteins of Immunological Interest, 제5판, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242], 이의 전체 교시는 본원에 참조로서 통합됨). 중쇄 가변 영역의 경우, 초가변 영역은 CDR1에 대해 아미노산 위치 31 내지 35, CDR2에 대해 아미노산 위치 50 내지 65, 및 CDR3에 대해 아미노산 위치 95 내지 102의 범위이다. 경쇄 가변 영역의 경우, 초가변 영역은 CDR1에 대해 아미노산 위치 24 내지 34, CDR2에 대해 아미노산 위치 50 내지 56, 및 CDR3에 대해 아미노산 위치 89 내지 97의 범위이다.
본원에서 사용되는 용어, “생성물”은 하나 이상의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어, 생성물-관련 물질, 예를 들어, 생성물 응집체, 단편 또는 하전된 종, 예를 들어, 산성 또는 염기성 종, 및/또는 공정-관련 불순물, 예를 들어, 숙주 세포 단백질을 포함하는 샘플의 맥락에서 존재할 수 있는 관심 단백질을 지칭한다. 특정 구현예에서, 생성물, 즉 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
용어 “생성물 관련 물질” 또는 “생성물 관련 변이체”는 생성물의 임의의 변이체, 예를 들어, 하전된 종, 응집체, 절반 항체, 단편 또는 대안적인 번역 후 변형으로부터 유래된 임의의 다른 단백질 생성물 종을 지칭한다. 생성된 단백질 생성물이 바람직하지 않은 효과 없이 더 높은 효능, 더 높은 효과, 또는 더 나은 안정성을 갖는 치료적 이점을 제공하도록, 생성된 단백질 생성물, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 생성물-관련 물질, 예를 들어, 단백질 응집체, 단편 또는 하전된 종, 예를 들어, 산성 종 또는 염기성 종을 제거하는 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 용어 “단편”은 관심 단백질의 펩티드 골격을 따른 하나 이상의 결합의 파괴, 또는 효소 및/또는 화학적 변형의 해리로 인한, 관심 단백질로부터의 임의의 절단된 단백질 종을 지칭한다. 예를 들어, 항체 단편은 Fab, F(ab’)2, Fab’, Fc, Fv, scFv, Fd, dAb, 절반 항체, 또는 항체 분자의 일부를 함유하는 다른 조성물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 용어 “응집체” 또는 “고 분자량 응집체” 또는 “고 분자량 불순물”은 단백질 이량체, 삼량체, 사량체, 올리고머 및 다른 고 분자량 종을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 관심 단백질의 둘 이상의 개별 분자의 올리고머화된 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “전하 변이체” 또는 “전하된 종”은 상이한 전하를 갖는 생성물의 완전한 보체를 지칭한다. 소정의 구현예에서, 이러한 변이체는, 이러한 응집 및/또는 단편화가 그 목적을 위해 사용된 분석 기술에서 보이는 바와 같은 전하 변이를 갖는 생성물을 생성하는 정도까지, 생성물 응집체 및/또는 생성물 단편을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 변이체는 전하 비균질성을 유발하는 상이한 변형을 갖는 생성물을 지칭한다. 단클론 항체 제조에서, 하전된 변이체, 예를 들어, 산성 종, 또는 염기성 종은 등전성 포커싱(IEF) 겔 전기영동, 모세관 등전성 포커싱(cIEF) 겔 전기영동, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX) 및 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)와 같은 분리 기술 기반 하전에 의해 검출될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “산성 종”은 전반적인 산성 전하를 특징으로 하는 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 변이체를 지칭한다. 산성 종은 IEF 기반 방법을 사용하여 항체를 분석할 때 낮은 겉보기 pI를 갖는 변이체이다. 크로마토그래피 기반 방법에 의해 분석될 경우, 산성 종 및 염기성 종은 주 피크에 대한 이들의 유지 시간에 기초하여 정의된다. 산성 종은 CEX의 주 피크보다 일찍 또는 AEX의 주 피크보다 늦게 용리되는 변이체이다.
항체의 산성 종은 전하 변이체, 구조 변이체, 및/또는 단편화 변이체를 포함할 수 있다. 예시적인 전하 변이체는 탈아미드화 변이체, 탈푸코실화 변이체, 메틸글리옥살 변이체, 당화 변이체, 및 구연산 변이체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 구조 변이체는 당질화 변이체 및 아세톤화 변이체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 단편화 변이체는, Fc 및 Fab 단편, Fab가 누락된 단편, 중쇄 가변 도메인이 누락된 단편, C-말단 절단 변이체, 경쇄 내 N-말단 Asp의 절제를 갖는 변이체, 및 경쇄의 N-말단 절단을 갖는 변이체를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 펩티드 사슬의 해리, 효소적 및/또는 화학적 변형으로 인해 관심 단백질로부터 절단된 임의의 단백질 종을 포함한다. 다른 산성 종 변이체는 또한 페어링되지 않은 이황화물, 숙주 세포 단백질, 및 숙주 핵산을 함유하는 변이체, 크로마토그래피 물질, 및 배지 성분를 포함한다.
산성 종은 생성물 제조의 결과물(본원에서 “제조-유래 산성 종”으로 지칭됨), 또는 저장의 결과물(본원에서 “저장-유래 산성 종”으로 지칭됨)일 수 있다. 제조-유래 산성 종은 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 제조(상류 및/또는 하류 처리) 동안 형성되는 산성 종이다. 예를 들어, 제조-유래 산성 종은 세포 배양(“세포 배양-유래 산성 종”) 동안 형성될 수 있다. 저장-유래 산성 종은, 제조 직후 단백질 집단에 존재할 수 있고 존재하지 않을 수 있지만, 샘플이 저장되는 동안 형성되거나 생성된다. 저장-유래 산성 종의 유형 및 양은 샘플의 제형에 기초하여 달라질 수 있다. 저장-유래 산성 종의 형성은 제조물이 특정 조건 하에서 저장될 때 부분적으로 또는 완전히 억제될 수 있다. 예를 들어, 수성 제형은 산성 종 형성을 부분적으로 또는 완전히 억제하기 위해 특정 온도에서 저장될 수 있다. 예를 들어, 형성 또는 저장-유래 산성 종은 약 2°C 내지 8°C에서 보관된 수성 제형에서 부분적으로 억제될 수 있고, -80°C에서 보관된 경우 완전히 억제될 수 있다. 또한, 저 산성 종 조성물은 동결 건조되거나 냉동 건조되어 저장-유래 산성 종의 형성을 부분적으로 또는 완전히 억제할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “염기성 종”은 전반적인 염기성 전하를 특징으로 하는 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 변이체를 지칭한다. 염기성 종은 IEF 기반 방법을 사용하여 항체를 분석할 때 높은 겉보기 pI를 갖는 변이체이다. 크로마토그래피 기반 방법에 의해 분석될 경우, 염기성 종은 CEX의 주 피크보다 늦게 또는 AEX의 주 피크보다 일찍 용리되는 변이체이다.
항체의 염기성 종은 전하 변이체, 구조 변이체, 및/또는 단편화 변이체를 포함할 수 있다. 염기성 종의 생성을 초래하는 예시적인 변형은, C-말단 리신, N-말단 글루타민, 아스파르테이트의 이성질체화, 숙신이미드, 메티오닌 산화, 아미드화, 불완전한 이황화 결합, 리더 서열의 불완전 제거, 세린에서 아르기닌으로의 돌연변이, 당질화, 단편 또는 응집체를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 염기성 종은 1개 또는 2개의 C-말단 리신을 갖는 중쇄를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “주요 종”은 크로마토그램 상의 주요 피크로서 용리되는 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 형태, 즉, 단백질의 하전된 변이체의 분획 동안 검출된 대부분의 종을 지칭한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, “주요 종”은 항-GM-CSFRα 항체를 지칭한다. 특정 구현예에서, 주요 종은 마브릴리무맙을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “공정 관련 불순물”은 단백질을 포함하는 조성물에 존재하지만 단백질 자체로부터 유래되지 않는 불순물을 지칭한다. 공정 관련 불순물은 숙주 세포 단백질(HCP), 숙주 세포 핵산, 예를 들어, DNA 또는 RNA, 크로마토그래피 물질, 및 배지 성분을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 생성된 단백질 생성물이 바람직하지 않은 효과 없이 더 높은 효능, 더 높은 효과, 또는 더 나은 안정성을 갖는 치료적 이점을 제공하도록, 생성된 단백질 생성물, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분으로부터 공정-관련 불순물, 예컨대 숙주 세포 단백질을 제거하는 것이 바람직하다.
본원에서 사용되는 용어 “숙주 세포 단백질”(HCP)은 숙주 세포로부터 유래된 비-표적 단백질 관련 단백질성 불순물을 지칭하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 “과립구/대식세포 콜로니 자극 인자 알파 서브유닛(GM-CSFRα)” 또는 “GM-CSFRα” 또는 “GM-CSFR 알파”는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)에 대한 수용체의 알파 사슬을 지칭한다. GM-CSFRα는 또한 콜로니 자극 인자 2 수용체 서브유닛 알파; GMR; CD116; CSF2R; SMDP4; CDw116; CSF2RX; CSF2RY; GMCSFR; CSF2RAX; CSF2RAY; 알파GMR; GMR-알파; GMCSFR-알파; 및 GM-CSF-R-알파로도 알려져 있다.
GM-CSFR은 고도로 보존된 사이토카인 수용체 수퍼 패밀리의 구성원이다. GM-CSFR은 2개의 서브유닛을 포함하며, 이는 일부 조혈 세포에서 관찰된 GM-CSF에 대한 상이한 친화도를 초래한다. 제1 서브유닛은 일반적으로 알파 서브유닛으로 지칭되며, 낮은 친화도로 GM-CSF에 그 자체로 결합할 수 있는 85 Kd 단백질이다. 일부 막 결합 및 일부 가용성인 GM-CSFRα 사슬의 다수의 다른 이소형이 기술되었지만, 모든 이소형은 호중구 및 대식세포의 세포 표면에서 발현되는 주된 형태인 것으로 보인다(Crosier 등의 문헌[Br J Haematol. 98:540-548 (1997)]). GM-CSFRα의 세포외 부분은 고도로 당화된다. 수용체는 두 번째 서브유닛인 f3 사슬을 가지며, 이는 GM-CSF에 그 자체로 결합하지 않는다. 오히려, 이는 알파 사슬과 연관될 때 GM-CSF에 결합한다. GM-CSF는 일반적으로 성숙한 GM-CSF 수용체 알파 사슬의 세포외 도메인에 결합한다. 이러한 결합은 항-GM-CSFRα 항체, 예를 들어, 마브릴리무맙에 의해 억제될 수 있다.
용어 “GM-CSFRα”는 인간 GM-CSFRα를 포함하며, 이의 아미노산 서열은 예를 들어 GenBank 수탁 번호 NP_006131.2(서열번호 1)에서 찾을 수 있다. 용어 “GM-CSFRα”는 또한 시노몰구스 GM-CSFRα, 마우스 GM-CSFRα, 및 랫트 GM-CSFRα를 포함한다. 용어 “GM-CSFRα”는 GM-CSFRα 단백질의 야생형, 변이체 또는 이소형, 또는 이의 단편 또는 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, GM-CSFRα 단백질은 신호 펩티드 서열 및/또는 단백질 태그에 결합될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “마브릴리무맙”은 GM-CSFRα를 표적화함으로써 대식세포 활성화, 분화, 및 생존을 조절하도록 설계된 인간 IgG4 단클론 항체를 지칭한다(PCT 공개 번호 WO2007/110631을 참조하며, 이에 기술된 서열을 포함하는, 이의 전체 내용은 본원에 참조로서 포함됨). 마브릴리무맙은 서열번호 2로 제시된 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 3으로 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 마브릴리무맙의 중쇄 가변 영역은 서열번호 4로서 제시된 서열을 포함하고, 마브릴리무맙의 경쇄 가변 영역은 서열번호 5로서 제시된 서열을 포함한다. 마브릴리무맙의 중쇄 가변 영역은 서열번호 6으로 제시된 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 7로 제시된 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 8로 제시된 서열을 갖는 CDR3을 포함한다. 마브릴리무맙의 경쇄 가변 영역은 서열번호 9로 제시된 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 10으로 제시된 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 11로 제시된 서열을 갖는 CDR3을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “GM-CSFRα 연관 질환 또는 장애”는, 장애를 앓고 있는 대상체에서의 GM-CSFRα의 존재가 장애의 병태생리학 또는 장애의 악화에 기여하는 인자에 대한 책임이 있는 것으로 나타나거나 책임이 있는 것으로 의심되는 질환 및 다른 장애를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, GM-CSFRα 연관 장애는 GM-CSFRα 활성의 억제가 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시킬 것으로 예상되는 장애이다. GM-CSF는 GM-CSFRα에 특이적으로 결합하므로, GM-CSF의 병리학적 및/또는 증상적 효과는 또한 GM-CSF의 GM-CSFRα에 대한 결합을 억제함으로써 대응될 수 있고, 여기에서, 이의 GM-CSF와 연관된 임의의 질환 또는 장애는 또한 본원에서 사용되는 바와 같이 “GM-CSFRα 연관 장애”의 정의 내에 또한 포함된다. 여기에서, "GM-CSFRα 관련 장애"는 예를 들어, 장애를 앓고 있는 대상체의 체액 중 GM-CSFRα 및/또는 GM-CSF의 농도 증가(예를 들어, 대상체의 혈청, 혈장, 윤활액 등 중의 GM-CSFRα 및/또는 GM-CSF 농도 증가)에 의해 입증될 수 있으며, 이는, 예를 들어, 항-GM-CSFRα 항체 또는 항-GM-CSF 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
GM-CSFRα 연관 질환 또는 장애에는 많은 예가 있다. 일 구현예에서, GM-CSFRα 연관 질환 또는 장애는 자가면역 질환이다. 일 구현예에서, 자가면역 질환은, 류머티스 관절염, 소아 특발성 관절염, 류마티스 척추염, 강직성 척추염, 건선, 골관절염, 통풍성 관절염, 알레르기, 다발성 경화증, 건선성 관절염, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염, 신증후군, 소아 류마티스 관절염, 크론병, 궤양성 대장염, 활성 축상 척추관절염(활성 axSpA) 및 비-방사선촬영 축성 척추관절염(nr-axSpA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, GM-CSFRα 관련 질환 또는 장애는 류마티스 관절염이다. 또 다른 구현예에서, GM-CSFRα 관련 질환 또는 장애는 거대 세포 동맥염(GCA)이다. 또 다른 구현예에서, GM-CSFRα 관련 질환 또는 장애는 코로나바이러스 질환 2019(COVID-19)이다. 특정 장애의 치료를 위해 본 발명의 방법을 사용하여 수득된 GM-CSFRα 항체 및 항체 부분의 용도는 아래에서 더 상세히 논의된다.
단백질, 예를 들어 항체 제조의 맥락에서, 본원에서 사용되는 용어, “상류 공정 기술”은 (예를 들어, 세포 배양으로부터 관심 단백질을 생산하는 동안) 세포로부터 단백질(예를 들어, 항체)의 생산 및 수집을 포함하는 행위를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 “세포 배양”은 관심 단백질의 생산 및 수집을 최적화하기 위한 방법 및 기술뿐만 아니라, 관심 재조합 단백질을 생산할 수 있는 숙주 세포의 집단을 생성하고 유지하기 위한 방법을 지칭한다. 예를 들어, 일단 발현 벡터가 적절한 숙주에 혼입되면, 숙주는 관련 뉴클레오티드 코딩 서열의 발현 및 원하는 재조합 단백질의 수집 및 정제에 적합한 조건 하에서 유지될 수 있다.
본 발명의 세포 배양 기술을 사용할 경우, 관심 단백질은 주변세포질 공간에서 세포내로 생산되거나, 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 관심 단백질이 세포내에서 생산되는 구현예에서, (예를 들어, 균질화로부터 생성된) 숙주 세포 또는 용해된 세포 중 하나인 미립자 부스러기는, 원심분리 또는 한외여과를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 수단에 의해 제거될 수 있다. 관심 단백질이 배지 내로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 먼저 상업적으로 이용 가능한 단백질 농도 필터를 사용하여 농축될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “하류 공정 기술”은 상류 공정 기술 후에 관심 단백질, 예를 들어, 항체를 정제하기 위해 사용되는 하나 이상의 기술을 지칭한다. 예를 들어, 하류 공정 기술은, 예를 들어, Protein A 친화성 크로마토그래피를 포함하는 친화성 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피와 같은 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 혼합 모드 또는 다중 모드 크로마토그래피 또는 변위 크로마토그래피를 사용하여 단백질 생성물을 정제하는 단계를 포함한다.
“재조합 숙주 세포”(또는 단순히 “숙주 세포”)라는 문구는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 포함한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 지칭하는 것으로 의도된다는 것을 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은, 실제로, 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에서 사용되는 용어 “숙주 세포”의 범위 내에 여전히 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 “재조합 단백질”은 숙주 세포 내로 도입된 재조합 발현 벡터 상에 운반된 유전자의 전사 및 번역의 결과로서 생산된 단백질을 지칭한다. 특정 구현예에서, 재조합 단백질은 항체, 예를 들어, 키메라, 인간화 또는 완전한 인간 항체이다. 특정 구현예에서, 재조합 단백질은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 이소형의 항체이다: IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgD, 또는 IgE. 특정 구현예에서, 항체 분자는 전장 항체(예를 들어, IgG1 또는 IgG4 면역글로불린)이거나, 대안적으로 항체는 단편(예를 들어, Fc 단편 또는 Fab 단편)일 수 있다.
II. 본 발명의 조성물
본 발명은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어, 생성물-관련 물질, 예를 들어, 단백질 응집체, 절반 항체, 단편 또는 하전된 종, 예를 들어, 산성 종 또는 염기성 종, 및/또는 공정-관련 불순물, 예를 들어, 숙주 세포 단백질을 갖는 관심 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 감소된 수준의 절반 항체를 갖는 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하며, 여기서 조성물은 약 25%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3.9%, 약 3.8%, 약 3.7%, 약 3.6%, 약 3.5%, 약 3.4%, 약 3.3%, 약 3.2%, 약 3.1%, 약 3%, 약 2.9%, 약 2.8%, 약 2.7%, 약 2.6%, 약 2.5%, 약 2.4%, 약 2.3%, 약 2.2%, 약 2.1%, 약 2%, 약 1.9%, 약 1.8%, 약 1.7%, 약 1.6%, 약 1.5%, 약 1.4%, 약 1.3%, 약 1.2%, 약 1.1%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 20% 미만의 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 18% 미만을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 2.8% 미만의 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 1.7% 미만을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 0.1~25%, 약 0.1~20%, 약 0.1~18%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18%, 또는 약 1~17%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.6~1.7%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 2.8% 미만의 절반 항체, 및 다음 중 적어도 하나를 포함한다: a) 약 11~38%의 산성 종, b) 약 9~41%의 염기성 종, c) 약 46~67%의 주요 종, d) 약 0.04~0.8%의 관심 단백질 응집체, e) 약 98~99.9%의 관심 단백질 단량체, f) 약 0.4~1.5%의 관심 단백질 단편, 또는 g) 약 0.1~8 ppm의 숙주 세포 단백질.
일부 구현예에서, 조성물은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 산성 종을 가지며, 여기서 조성물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 40% 미만의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 20% 미만의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5-25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12-38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 12~20%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 11~22%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 18~40%의 산성 종을 포함한다. 다른 구현예에서, 조성물은 약 9~18%, 10~17%, 또는 11~16%의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 9~18%의 산성 종, 및 다음 중 적어도 하나를 포함한다: a) 약 0.6~18%의 절반 항체, b) 약 9~41%의 염기성 종, c) 약 46~67%의 주요 종, d) 약 0.04~0.8%의 관심 단백질 응집체, e) 약 98~99.9%의 관심 단백질 단량체, f) 약 0.4~1.5%의 관심 단백질 단편, 또는 g) 약 0.1~8 ppm의 숙주 세포 단백질.
특정 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 9~18%의 산성 종 및 약 9~41%의 염기성 종을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 9~18%의 산성 종 및 약 46~67%의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 45%, 약 44%, 약 43%, 약 42%, 약 41%, 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 45% 미만의 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 24% 미만의 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 23% 미만의 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 20% 미만의 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 1~45%, 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~25%, 약 5~35%, 약 10~35%, 약 15~35%, 약 1~30%, 약 1~25%, 약 1~24%, 약 5~25%, 약 5~30%, 약 5~45%, 약 10~25%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 15~25%, 약 15~30%, 약 15~35%, 약 15~25%, 약 16~31%, 약 17~26%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16~41%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 17~26%의 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 16~41%의 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 24% 미만의 염기성 종, 및 다음 중 적어도 하나를 포함한다: a) 약 0.6~18%의 절반 항체, b) 약 11~38%의 산성 종, c) 약 46~67%의 주요 종, d) 약 0.04~0.8%의 관심 단백질 응집체, e) 약 98~99.9%의 관심 단백질 단량체, f) 약 0.4~1.5%의 관심 단백질 단편, 또는 g) 약 0.1~8 ppm의 숙주 세포 단백질.
특정 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 24% 미만의 염기성 종 및 약 11~38%의 산성 종을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 24% 미만의 염기성 종 및 약 46~67%의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 초과의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 주요 종, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 64% 초과의 주요 종을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 조성물은 65% 초과의 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 40% 초과의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 40~99%, 약 45~99%, 약 50~99%, 약 55~99%, 약 50~90%, 약 55~90%, 약 50~80%, 약 55~80%, 약 50~70%, 약 55~70%, 약 50~65%, 약 55~65%, 약 58~63%, 약 58~62%, 약 59~61%, 약 58~67%, 약 53~61%, 약 46~67%, 또는 약 46~66%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 주요 종, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 58~67%의 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 46~67%의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 65% 초과의 주요 종, 및 다음 중 적어도 하나를 포함한다: a) 약 0.6~18%의 절반 항체, b) 약 11~38%의 산성 종, c) 약 9~41%의 염기성 종, d) 약 0.04~0.8%의 관심 단백질 응집체, e) 약 98~99.9%의 관심 단백질 단량체, f) 약 0.4~1.5%의 관심 단백질 단편, 또는 g) 약 0.1~8 ppm의 숙주 세포 단백질.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 58~62%의 주요 종, 및 다음 중 적어도 하나를 포함한다: a) 약 0.6~18%의 절반 항체, b) 약 11~38%의 산성 종, c) 약 9~41%의 염기성 종, d) 약 0.04~0.8%의 관심 단백질 응집체, e) 약 98~99.9%의 관심 단백질 단량체, f) 약 0.4~1.5%의 관심 단백질 단편, 또는 g) 약 0.1~8 ppm의 숙주 세포 단백질.
특정 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 64% 초과의 주요 종 및 약 11~38%의 산성 종을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 64% 초과의 주요 종 및 약 9~41%의 염기성 종을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 58~62%의 주요 종 및 약 11~38%의 산성 종을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 58~62%의 주요 종 및 약 9~41%의 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 10% 미만의 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.5% 미만의 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.4% 미만의 고분자량 응집체를 포함한다. 추가의 구현예에서, 조성물은 약 0.3% 미만의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.01~0.4%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 0.5~0.8%의 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 0.01~0.4%의 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 0.04~0.8%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 0.5% 미만의 관심 단백질 응집체, 및 다음 중 적어도 하나를 포함한다: a) 약 0.6~18%의 절반 항체, b) 약 11~38%의 산성 종, c) 약 9~41%의 염기성 종, d) 약 46~67%의 주요 종, e) 약 98~99.9%의 관심 단백질 단량체, f) 약 0.4~1.5%의 관심 단백질 단편, 및 g) 약 0.1~8 ppm의 숙주 세포 단백질.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 10% 미만의 관심 단백질의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 0.4% 미만의 관심 단백질의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 0.3% 미만의 관심 단백질의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.5~1.5%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8% 또는 약 0.4~1.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.5~1.5%의 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.6~1.5%의 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은, 약 0.4% 미만의 관심 단백질의 단편, 및 다음 중 적어도 하나를 포함한다: a) 약 0.6~18%의 절반 항체, b) 약 11~38%의 산성 종, c) 약 9~41%의 염기성 종, d) 약 46~67%의 주요 종, e) 약 0.04~0.8%의 관심 단백질 응집체, f) 약 98~99.9%의 관심 단백질 단량체, 또는 g) 약 0.1~8 ppm의 숙주 세포 단백질.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1% 또는 약 99.5% 초과의 관심 단백질 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 90%를 초과하는 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 99.1%를 초과하는 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 관심 단백질 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 98~99%의 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 98~99.9%의 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 99.1% 초과의 관심 단백질 단량체, 및 다음 중 적어도 하나를 포함한다: a) 약 0.6~18%의 절반 항체, b) 약 11~38%의 산성 종, c) 약 9~41%의 염기성 종, d) 약 46~67%의 주요 종, e) 약 0.04~0.8%의 관심 단백질 응집체, f) 약 01~1.5%의 관심 단백질 단편, 또는 g) 약 0.1~8 ppm의 숙주 세포 단백질.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 10 ppm 미만의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물은 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 1~3, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8, 또는 약 0.1~8 ppm의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) HCP를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.1~2의 HCP를 포함한다.
본 발명의 조성물 중의 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 예를 들어, 항체, 또는 이의 항원 결합 부분은 항-GM-CSFRα 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예컨대 마브릴리무맙, 또는 이의 항원 결합 부분일 수 있다. 본 구현예의 일 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 2로 제시된 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열번호 3으로 제시된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 본 구현예의 일 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 4로 제시된 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 5로 제시된 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 구현예의 일 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 6으로 제시된 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 7로 제시된 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 8로 제시된 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 본 구현예의 일 양태에서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 서열번호 9로 제시된 서열을 갖는 CDR1, 서열번호 10으로 제시된 서열을 갖는 CDR2, 및 서열번호 11로 제시된 서열을 갖는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 용리물 분획을 포함하되, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피 수지로부터 수집된다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 25%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3.9%, 약 3.8%, 약 3.7%, 약 3.6%, 약 3.5%, 약 3.4%, 약 3.3%, 약 3.2%, 약 3.1%, 약 3%, 약 2.9%, 약 2.8%, 약 2.7%, 약 2.6%, 약 2.5%, 약 2.4%, 약 2.3%, 약 2.2%, 약 2.1%, 약 2%, 약 1.9%, 약 1.8%, 약 1.7%, 약 1.6%, 약 1.5%, 약 1.4%, 약 1.3%, 약 1.2%, 약 1.1%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 20% 미만의 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 18% 미만의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 크로마토그래피 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 0.1~25%, 0.1~20%, 약 0.1~18%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18% 또는 약 1~17%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.6~18% 또는 약 1~17% 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.6~18%의 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 1~17%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환, 음이온 교환, 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 40% 미만의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환, 음이온 교환, 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5-25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12-38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 14~28%, 약 11~22%, 약 11~38%, 또는 약 12~38%의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 14~28%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 11~22%의 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 12~38%의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환, 음이온 교환, 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 45%, 약 44%, 약 43%, 약 42%, 약 41%, 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 내의 범위의) 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 45% 미만의 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환, 음이온 교환, 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 1~45%, 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~25%, 약 5~35%, 약 10~35%, 약 15~35%, 약 1~30%, 약 1~25%, 약 1~24%, 약 5~25%, 약 5~30%, 약 5~45%, 약 10~25%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 15~25%, 약 15~30%, 약 15~35%, 약 15~25%, 약 16~31%, 약 17~26%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16~41%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 15~25%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16~41% 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 15~25%의 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 16~41%의 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 9~29%의 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환, 음이온 교환, 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 용리물 분획은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 초과의 (및 전술한 것 중 하나 이상 내의 범위의) 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 40% 초과의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환, 음이온 교환, 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 용리물 분획은 약 40~99%, 약 45~99%, 약 50~99%, 약 55~99%, 약 50~90%, 약 55~90%, 약 50~80%, 약 55~80%, 약 50~70%, 약 55~70%, 약 50~65%, 약 55~65%, 약 58~62%, 약 59~61%, 약 58~63%, 약 58~67%, 약 53~61%, 약 46~67%, 또는 약 46~66%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환, 음이온 교환, 또는 혼합 모드 크로마토그래피 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 용리물 분획은 약 55~65%, 약 53~61%, 또는 약 46~66%의 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 55~65%의 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 46~66%의 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 53~61%의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 또는 음이온 교환 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 10% 미만의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 또는 음이온 교환 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.01~0.4%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%의 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~0.4%의 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.04~0.2%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 또는 음이온 교환 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편, 예를 들어, 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 10% 미만의 관심 단백질의 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 또는 음이온 교환 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.6~1.5%, 약 0.4~0.8% 또는 약 0.4~1.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8% 또는 약 0.4~1.1%의 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.4~0.8%의 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.5~1,1%의 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 또는 음이온 교환 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1% 또는 약 99.5% 초과의 관심 단백질 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 90%를 초과하는 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 또는 음이온 교환 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 관심 단백질 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 98~99.9% 또는 약 98.5~99.5%의 단량체, 예를 들어, 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 98~99.9% 또는 약 98.5~99.5%의 단량체, 예를 들어, 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 98~99.9% 또는 약 98.5~99.5%의 단량체, 예를 들어, 항체 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 또는 음이온 교환 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 10 ppm 미만의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 양이온 교환 또는 음이온 교환 단계 후에 수집된 용리물 분획으로서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 1~3, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8 또는 약 0.1~8 ppm의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) HCP를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 2~8 ppm 또는 약 0.1~2 ppm의 HCP를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 2~8 ppm의 HCP를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~2 ppm의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 세포 배양물로부터 정화된 수확물을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 “정화된 수확물” 또는 “정화된 세포 배양물 수확물”은 세포가 성장 배지로부터 분리된 수확물을 지칭한다. 정화 공정은 고형분을 제거하기 위한 원심분리, 미세여과, 심층 여과, 또는 상이한 기공 크기를 갖는 멤브레인을 통한 여과, 또는 이들의 조합에 의해 수행되거나, 수확물로부터 특정 부류의 가용성 오염물을 추출하기 위한 화학 첨가제를 사용하거나 화학적으로 상호작용하는 표면을 가진 고형분 물질을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 25%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3.9%, 약 3.8%, 약 3.7%, 약 3.6%, 약 3.5%, 약 3.4%, 약 3.3%, 약 3.2%, 약 3.1%, 약 3%, 약 2.9%, 약 2.8%, 약 2.7%, 약 2.6%, 약 2.5%, 약 2.4%, 약 2.3%, 약 2.2%, 약 2.1%, 약 2%, 약 1.9%, 약 1.8%, 약 1.7%, 약 1.6%, 약 1.5%, 약 1.4%, 약 1.3%, 약 1.2%, 약 1.1%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 25% 미만의 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 20% 미만의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 0.1~25%, 0.1~20%, 약 0.1~18%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18% 또는 약 1~17%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 0.1~25%의 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 40% 미만의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5-25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12-38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 1~40%의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 45% 미만의 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~25%, 약 5~35%, 약 10~35%, 약 15~35%, 약 1~30%, 약 1~25%, 약 1~24%, 약 5~25%, 약 5~30%, 약 5~45%, 약 10~25%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 15~25%, 약 15~30%, 약 15~35%, 약 15~25%, 약 16~31%, 약 17~26%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16~41%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 1~40%의 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 예컨대 마브릴리무맙을 포함하는 정화된 수확물은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 초과의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 50% 초과의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 예컨대 마브릴리무맙을 포함하는 정화된 수확물은 약 40~99%, 약 45~99%, 약 50~99%, 약 55~99%, 약 50~90%, 약 55~90%, 약 50~80%, 약 55~80%, 약 50~70%, 약 55~70%, 약 50~65%, 약 55~65%, 약 58~62%, 약 59~61%, 약 58~63%, 약 58~67%, 약 53~61%, 약 46~67%, 또는 약 46~66%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 40~99%의 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 10% 미만의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.01~0.4%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.04~1%, 약 0.5~0.8%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 0.01~10%의 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편, 예를 들어 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 10% 미만의 관심 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.4~1.5%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.6~1.5%, 약 0.4~0.8% 또는 약 0.4~1.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 0.1~10%의 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1% 또는 약 99.5% 초과의 관심 단백질 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 90% 초과의 관심 단백질 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 관심 단백질 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 90~99.9%의 관심 단백질 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은, 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 10 ppm 미만의 HCP를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 정화된 수확물은 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 1~3, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8 또는 약 0.1~8 ppm의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) HCP를 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 0.1~10 ppm의 HCP를 포함한다.
본 발명의 특정 양태에서, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 본 개시의 조성물에 사용될 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은, 관심 항원으로 동물을 면역화한 후 종래의 단클론 항체 방법, 예를 들어, Kohler 및 Milstein의 문헌(1975)[Nature 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기술을 포함하는 다양한 기술에 의해 생성될 수 있다. 체세포 혼성화 절차가 사용될 수 있다. 원칙적으로, B 림프구의 바이러스 또는 종양발생성 형질전환을 포함하는, 단클론 항체를 생산하기 위한 다른 기술 또한 사용될 수 있다.
하이브리도마를 제조하기 위한 하나의 예시적인 동물 시스템은 쥣과 시스템이다. 하이브리도마 생산은 매우 잘 확립된 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술이 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너(예를 들어, 쥣과 골수종 세포) 및 융합 절차도 또한 공지되어 있다.
본 발명의 조성물에 사용되는 항체는 인간, 키메라, 또는 인간화 항체일 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용된 키메라 또는 인간화 항체는 전술한 바와 같이 제조된 비인간 단클론 항체의 서열에 기초하여 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 면역글로불린을 암호화하는 DNA는 관심 비인간 하이브리도마로부터 수득될 수 있고, 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 비-쥣과(예를 들어, 인간) 면역글로불린 서열을 함유하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 키메라 항체를 생성하기 위해, 쥣과 가변 영역은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 불변 영역에 연결될 수 있다(예를 들어, Cabilly 등의 미국 특허 제4,816,567호 참조). 인간화 항체를 생성하기 위해, 쥣과 CDR 영역은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 인간 프레임워크 내에 삽입될 수 있다(예를 들어, Winter의 미국 특허 제5,225,539호, 및 Queen 등의 미국 특허 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,762호 및 제6,180,370호 참조).
비제한적인 일 구현예에서, 본 발명의 조성물에 사용되는 항체는 인간 단클론 항체이다. 이러한 인간 단클론 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역 시스템의 일부를 운반하는 유전자이식 또는 염색체전환 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 유전자이식 및 염색체전환 마우스는 본원에서 HuMAb Mouse®(Medarex, Inc.), KM Mouse®(Medarex, Inc.), 및 XenoMouse®(Amgen)로 지칭되는 마우스를 포함한다. 본 발명의 조성물에 사용된 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 또한, 그 전체 내용이 참조로서 본원에 명시적으로 통합되는 미국 특허 제6,090,382호에 기술된 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
또한, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 대안적인 염색체전환 동물 시스템이 당업계에서 이용 가능하며, 이는 본 개시의 항체를 상승시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, “TC 마우스”로 지칭되는, 인간 중쇄 염색체전환체 및 인간 경쇄 염색체전환체 둘 모두를 운반하는 마우스가 사용될 수 있으며; 이러한 마우스는 Tomizuka 등의 문헌[(2000)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727]에 기술되어 있다. 또한, 인간 중쇄 및 경쇄 염색체전환체를 운반하는 소는 당업계에 보고된 바 있으며(예를 들어, Kuroiwa 등의 문헌(2002)[Nature Biotechnology 20:889-894] 및 PCT 출원 제WO 2002/092812호), 이는 본 개시의 항체를 상승시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용되는 재조합 인간 항체는 재조합 조합 항체 라이브러리, 예를 들어, 인간 림프구로부터 유래된 mRNA로부터 제조된 인간 VL 및 VH cDNA를 사용하여 제조된 scFv 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝에 의해 단리될 수 있다. 이러한 라이브러리를 제조하고 스크리닝하기 위한 방법론은 당업계에 공지되어 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하기 위한 상업적으로 이용 가능한 키트(예를 들어, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAPTM 파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612, 이의 전체 교시는 본원에 통합됨)에 추가하여, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 데 사용하기 위한 방법 및 시약의 예는 다음 문헌에서 확인할 수 있다: 예를 들어, Laner 등의 미국 특허 제5,223,409호; Kang 등의 PCT 공개 제WO 92/18619호; Dower 등의 PCT 공개 제WO 91/17271호; Winter 등의 PCT 공개 제WO 92/20791호; Markland 등의 PCT 공개 제WO 92/15679호; Breitling 등의 PCT 공개 제WO 93/01288호; McCafferty 등의 PCT 공개 제WO 92/01047호; Garrard 등의 PCT 공개 제WO 92/09690호; Fuchs 등의 문헌[(1991) Bio/Technology 9:1370-1372]; Hay 등의 문헌[(1992) Hum Antibody Hybridomas 3:81-85]; Huse 등의 문헌[(1989) Science 246:1275-1281]; McCafferty 등의 문헌[Nature (1990) 348:552-554]; Griffiths 등의 문헌[(1993) EMBO J 12:725-734]; Hawkins 등의 문헌[(1992) J Mol Biol 226:889-896]; Clackson 등의 문헌[(1991) Nature 352:624-628]; Gram 등의 문헌[(1992) PNAS 89:3576-3580]; Garrard 등의 문헌[(1991) Bio/Technology 9:1373-1377]; Hoogenboom 등의 문헌[(1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137]; 및 Barbas 등의 문헌[(1991) PNAS 88:7978-7982] (이의 모든 교시는 본원에 통합됨).
본 발명의 조성물에 사용되는 인간 단클론 항체는 또한 면역화 시 인간 항체 반응이 생성될 수 있도록 인간 면역 세포가 그 내부로 재구성된 SCID 마우스를 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 마우스는, 예를 들어, Wilson 등의 미국 특허 제5,476,996호 및 제5,698,767호에 기술되어 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물에 사용되는 인간 항체는, 항-GM-CSFRα 항체 및 이의 항체 부분, 항-GM-CSFRα-관련 항체 및 항체 부분, 및 낮은 해리 동역학 및 높은 중화 용량을 갖는 GM-CSFRα에 대한 높은 친화도 결합과 같은 항-GM-CSFRα 항체와 동등한 특성을 갖는 인간 항체 및 항체 부분이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물에 사용되는 항-GM-CSFRα 항체는 마브릴리무맙과 같은 GM-CSFRα 상의 동일한 에피토프에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물에 사용되는 항-GM-CSFRα 항체는 생리학적 조건 하에서 GM-CSFRα에 대한 마브릴리무맙의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물은 마브릴리무맙, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다.
본 발명의 조성물에 사용되는 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 변경될 수 있으며, 여기에서 항체의 불변 영역은 비변형 항체에 비해 적어도 하나의 불변 영역 매개 생물학적 효과기 기능을 감소시키도록 변형된다. Fc 수용체에 대한 감소된 결합을 나타내도록 본 발명의 항체를 변형시키기 위해, 면역글로불린 불변 영역은 Fc 수용체(FcR) 상호작용에 필요한 특정 영역에서 돌연변이될 수 있다(예를 들어, Canfield 및 Morrison의 문헌(1991)[J. Exp. Med. 173:1483-1491]; 및 Lund 등의 문헌(1991)[J. of Immunol. 147:2657-2662]을 참조한다(이의 전체 교시는 본원에 통합됨)). 항체의 FcR 결합 능력의 감소는 또한 옵소닌화 및 식균작용 및 항원 의존성 세포 세포독성과 같은 FcR 상호작용에 의존하는 다른 효과기 기능을 감소시킬 수 있다.
III. 상류 공정 기술을 사용한 조성물의 제조
단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고, 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편, 예를 들어 절반 항체, 또는 하전된 종, 예를 들어 산성 또는 염기성 종; 및/또는 감소된 수준의 공정 관련 불순물, 예를 들어, 숙주 세포 단백질을 갖는 본 발명의 조성물은 세포 배양과 같은 상류 단백질 생산 동안 조건을 조절함으로써 생산될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편, 예를 들어 절반 항체, 또는 하전된 종, 예를 들어 산성 종 또는 염기성 종; 및/또는 감소된 수준의 공정 관련 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질을 갖는 조성물을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 변이체 및/또는 불순물이 감소된 조성물은 생성물 안정성, 생성물 안전성, 및 생성물 효능을 포함하지만 이에 한정되지 않는 개선된 생성물 특성에 대한 요구를 해결한다.
본 발명은 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고, 세포 배양물 대비 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편, 예를 들어 절반 항체, 또는 하전된 종, 예를 들어 산성 종 또는 염기성 종; 및/또는 감소된 수준의 공정 관련 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질을 갖는 제제를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양을 위한 조건을 조절하는 단계, 예를 들어 pH 수준, CO2 수준, 세포 배양 보충제의 수준, 및/또는 세포 배양물로부터 젖산염 수준 또는 젖산염 생성 수준을 조절하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 세포 배양물에서 변이체 및/또는 불순물의 수준, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편, 예를 들어 항체, 또는 하전된 종, 예를 들어 산성 종 또는 염기성 종의 수준을 감소시키고/시키거나; 관심 단백질, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 공정 관련 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질의 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양을 위한 조건을 조절하는 단계, 예를 들어 pH 수준, CO2 수준, 세포 배양 보충제의 수준, 및/또는 세포 배양물로부터 젖산염 수준 또는 젖산염 생성 수준을 조절하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 세포 배양물로부터 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체의 생산 수율을 증가시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양을 위한 조건을 조절하는 단계, 예를 들어 pH 수준, CO2 수준, 세포 배양 보충제의 수준, 및/또는 세포 배양물로부터의 젖산염 수준 또는 젖산염 생성 수준을 조절하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고, 감소된 수준의 산성 종을 갖는 제제를 세포 배양물로부터 제조하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계, 및 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5, 예를 들어 약 6~7, 약 6.1~7, 약 6.2~7, 약 6.3~7, 약 6.4~7, 약 6.5~7, 약 6.5~7.5, 약 6.5~7.4, 약 6.5~7.3, 약 6.5~7.2, 약 6.5~7.1, 약 6.6~7, 약 6.7~7, 약 6.75~6.95로 유지하여 산성 종 수준이 감소된 관심 단백질을 포함하는 제조를 제조하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 발명은 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고, 감소된 수준의 산성 종을 갖는 제제를 세포 배양물로부터 제조하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션 하는 단계; 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함한다: (a) 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5, 약 6~7, 또는 약 6.5~7의 pH로 유지하는 단계; (b) 인큐베이션 기간 동안 세포 배양 보충제의 수준을 증가시키는 단계; (c) 세포 배양물 중 젖산염의 수준을 약 1 g/L로 유지하는 단계; (d) 세포 배양물 중 젖산염 생산을 증가시키는 단계; (e) 세포 배양물 중 CO2의 수준을 증가시키는 단계; 및/또는 (f) 세포 배양물의 pH를 감소시켜, 산성 종의 수준이 감소된 관심 단백질을 포함하는 제제를 제조하는 단계.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 세포 배양물 중 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체의 산성 종의 수준을 감소시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계; 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함한다: (a) 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5, 약 6~7, 또는 약 6.5~7의 pH로 유지하는 단계; (b) 인큐베이션 기간 동안 세포 배양 보충제의 수준을 증가시키는 단계; (c) 세포 배양물 중 젖산염의 수준을 약 1 g/L로 유지하는 단계; (d) 세포 배양물 중 젖산염 생산을 증가시키는 단계; (e) 세포 배양물 중 CO2의 수준을 증가시키는 단계; 및/또는 (f) 세포 배양물의 pH를 감소시켜 관심 단백질의 산성 종의 수준을 감소시키는 단계.
추가의 구현예에서, 본 발명은 세포 배양물로부터 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체의 생산 수율을 증가시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계; 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함한다: (a) 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5, 약 6~7, 또는 약 6.5~7의 pH로 유지하는 단계; (b) 인큐베이션 기간 동안 세포 배양 보충제의 수준을 증가시키는 단계; (c) 세포 배양물 중 젖산염의 수준을 약 1 g/L로 유지하는 단계; (d) 세포 배양물 중 젖산염 생산을 증가시키는 단계; (e) 세포 배양물 중 CO2의 수준을 증가시키는 단계; 및/또는 (f) 세포 배양물의 pH를 감소시켜 관심 단백질의 생산 수율을 증가시키는 단계.
상류 공정 기술은 단독으로 사용되거나, 실시예 1에 기술된 바와 같이, 아래의 섹션 IV에 기술된 하류 공정 기술과 조합하여 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 것과 같이, 본원에 기술된 상류 공정 기술 중 하나 이상은 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 생성물 관련 물질(예를 들어 단백질 응집체, 단편, 예를 들어, 절반 항체, 또는 하전된 종, 예를 들어 산성 또는 염기성 종); 및/또는 감소된 수준의 공정 관련 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질을 갖는 본 발명의 조성물을 생산한다.
본 발명의 일부 구현예는 세포에 의해 발현되는, 생성물 관련 물질, 예를 들어, 산성 종의 양을 제한하는 조건 하에서 관심 단백질을 발현하도록 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일부 구현예는 생성물이 산성 종 변이체로 전환되는 것을 제한하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
소정의 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물은 배양물에서 숙주 세포를 배양함으로써 생산되며, 여기서 공정 파라미터, 예컨대 세포 배양물의 pH 또는 이산화탄소(CO2) 수준은, 숙주 세포에 의해 생성된 산성 종의 양을 감소시키고/시키거나 생성물이 산성 종 변이체로 전환되는 것을 감소시키도록 조절된다. 다른 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물은 배양물에서 숙주 세포를 배양함으로써 생산되며, 여기서 젖산염 및/또는 세포 보충제의 수준은, 숙주 세포에 의해 생성된 산성 종의 양을 감소시키고/시키거나 생성물이 산성 종 변이체로 전화되는 것을 감소시키도록 조절된다.
일 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물은 관심 단백질을 발현하는 세포를 바이오리액터에서 인큐베이션하고, 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5로 유지함으로써 생산된다.
또 다른 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물은 관심 단백질을 발현하는 세포를 바이오리액터에서 인큐베이션하고, 인큐베이션 기간 중 세포 배양 보충제의 수준을 증가시킴으로써 생산된다.
또 다른 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물은 관심 단백질을 발현하는 세포를 바이오리액터에서 인큐베이션하고, 세포 배양물의 젖산염 수준을 약 1 g/L로 유지함으로써 생산된다.
또 다른 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물은 관심 단백질을 발현하는 세포를 바이오리액터에서 인큐베이션하고, 세포 배양물 중 젖산염 생성을 증가시킴으로써 생산된다.
또 다른 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물은 관심 단백질을 발현하는 세포를 바이오리액터에서 인큐베이션하고, 세포 배양물 중 CO2 수준을 증가시킴으로써 생산된다.
또 다른 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체, 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물은 관심 단백질을 발현하는 세포를 바이오리액터에서 인큐베이션하고, 세포 배양물의 pH를 감소시킴으로써 생산된다.
또 다른 구현예에서, 전술한 보충제 및 변형 중 하나 이상이 조합되어 단백질, 예를 들어, 항체, 조성물의 세포 배양 중에 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용될 관심 단백질을 발현시키기 위해, 유전자가 전사 및 번역 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록, 단백질을 암호화하는 DNA, 예컨대 항체의 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA가 하나 이상의 발현 벡터 내에 삽입된다(예를 들어, 미국 특허 제6,090,382호를 참조하고, 이의 전체 교시는 참조로서 본원에 통합됨). 이러한 맥락에서, 용어 “작동가능하게 연결된”은 관심 단백질을 암호화하는 유전자가, 벡터 내의 전사 및 번역 조절 서열이 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 제공하도록, 벡터 내에 연결된다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 발현 벡터 및 발현 조절 서열은 사용된 발현 숙주 세포와 호환되도록 선택된다. 특정 구현예에서, 관심 단백질은 항체의 중쇄 및 경쇄와 같은 다수의 폴리펩티드를 포함할 것이다. 따라서, 특정 구현예에서, 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자와 같은 다수의 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 별도의 벡터 내에 삽입될 수 있거나, 보다 일반적으로는 유전자는 동일한 발현 벡터 내에 삽입된다. 유전자는 표준 방법(예를 들어, 유전자 단편 및 벡터 상의 상보적 제한 부위의 연결, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우 무딘 말단 연결)에 의해 발현 벡터 내에 삽입된다. 유전자 또는 유전자들의 삽입 전, 발현 벡터는 항체 불변 영역 서열(이에 한정되지 않음)과 같은 추가 폴리펩티드 서열을 이미 운반할 수 있다. 예를 들어, 항-GM-CSFRα 항체 또는 항-GM-CSFRα 항체 관련 VH 및 VL 서열을 전장 항체 유전자로 변환하는 하나의 접근법은, VH 분절이 벡터 내의 CH 분절(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 분절이 벡터 내의 CL 분절에 작동가능하게 연결되도록, 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 이미 암호화하는 발현 벡터 내에 이들을 각각 삽입하는 것이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터 단백질의 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 암호화할 수 있다. 유전자는, 신호 펩티드가 유전자의 아미노 말단에 프레임 내 연결되도록, 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 신호 펩티드는 면역글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드(즉, 비-면역글로불린 단백질 유래의 신호 펩티드)일 수 있다.
단백질 코딩 유전자에 더하여, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 단백질 코딩 유전자의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 서열을 운반할 수 있다. 용어 “조절 서열”은 단백질 코딩 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 서열은, 예를 들어, 그 전체 교시가 본원에 참조로서 통합되는, Goeddel의 문헌[Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기술되어 있다. 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 포유류 숙주 세포 발현에 적합한 조절 서열은 포유류 세포에서 높은 수준의 단백질 발현을 유도하는 바이러스 요소, 예컨대 거대세포바이러스(CMV)로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서(예컨대, CMV 프로모터/인핸서), 시미언 바이러스 40(SV40)으로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서(예컨대, SV40 프로모터/인핸서), 아데노바이러스로부터 유래된 프로모터 및/또는 인핸서(예를 들어, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(AdMLP)) 및 폴리오마를 포함한다. 바이러스 조절 요소 및 이의 서열에 대한 추가적인 설명은, 예를 들어, 그 전체 교시가 본원에 참조로서 통합되는, Stinski의 미국 특허 제5,168,062호, Bell 등의 미국 특허 제4,510,245호 및 Schaffner 등의 미국 특허 제4,968,615호를 참조한다.
재조합 발현 벡터는 또한 하나 이상의 추가 서열, 예컨대 숙주 세포에서 벡터의 복제를 조절하는 서열(예를 들어, 복제 기점) 및/또는 선택성 마커 유전자를 운반할 수 있다. 선택성 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다(예를 들어, 그 전체 교시가 본원에 참조로서 본원에 통합되는, Axel 등의 미국 특허 제4,399,216호, 제4,634,665호 및 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 선택성 마커 유전자는 일반적으로, 벡터가 도입된 숙주 세포 상에서 G418, 히그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 대한 내성을 부여한다. 적절한 선택성 마커 유전자는 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자(메토트렉세이트 선택/증폭과 함께 dhfr-숙주 세포에서 사용함) 및 신생 유전자(G418 선택을 위함)를 포함한다.
본 발명의 조성물에 사용되는 항체, 또는 항체 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체는 숙주 세포에서 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 유전자의 재조합 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체를 재조합적으로 발현시키기 위해, 숙주 세포는, 경쇄 및 중쇄가 숙주 세포에서 발현되고 숙주 세포가 배양되는 배지 내로 분비되도록, 항체의 면역글로불린 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 DNA 단편을 운반하는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질감염되고, 이로부터 항체가 회수될 수 있다. 표준 재조합 DNA 방법은, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자를 수득하고, 이들 유전자를 재조합 발현 벡터에 혼입하고, 숙주 세포(예컨대, 그 전체 교시가 본원에 통합되는, Sambrook, Fritsch 및 Maniatis의 문헌(편집)[Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)], Ausubel 등의 문헌(편집)[Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989)] 및 미국 특허 제4,816,397호 및 제6,914,128호에 기술된 것과 같음) 내로 벡터를 도입하는 데 사용된다.
단백질의 발현, 예를 들어 항체의 경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 단백질을 암호화하는 발현 벡터(들)는 표준 기술에 의해 숙주 세포 내로 형질감염된다. 용어 “형질감염”의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입하는 데 통상적으로 사용되는 매우 다양한 기술, 예를 들어, 전기천공, 칼슘-인산염 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 의도된다. 이론상, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 본 발명의 단백질을 발현하는 것이 가능하지만, 포유류 숙주 세포와 같은 진핵 세포에서 항체의 발현은 적합한데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유류 세포가 원핵 세포보다 적절하게 폴딩되고 면역학적으로 활성인 단백질을 조립하고 분비할 가능성이 더 높기 때문이다. 단백질 유전자의 원핵 발현은 활성 단백질의 높은 수율의 생산에 효과가 없는 것으로 보고되었다(그 전체 교시가 본원에 참조로서 포함되는, Boss 및 Wood의 문헌(1985)[Immunology Today 6:12-13] 참조).
본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현하기에 적합한 숙주 세포는 전술한 원핵 세포, 효모, 고도의 진핵 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물은, 진정세균, 예를 들어 그람 음성 또는 그람 양성 유기체, 예를 들어 엔테로박테리아과, 예컨대 에스케리키아, 예를 들어 대장균, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 예를 들어 살모넬라 티피무리움, 세라티아, 예를 들어 살모넬라균, 세라티아, 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스, 및 시겔라뿐만 아니라 B. 서브틸리스 및 B. 리케니포르미스(예를 들어, 1989년 4월 12일 공개된 DD 266,710에 개시된 B. 리케니포르미스 41P)와 같은 바실리, P. 아에루기노사와 같은 슈도노마스, 및 스트렙토미세스.를 포함한다. 대장균 B, 대장균 X1776(ATCC 31,537) 및 대장균 W3110(ATCC 27,325)과 같은 다른 균주가 적합하지만, 하나의 적절한 대장균 클로닝 숙주는 대장균 294(ATCC 31,446)이다. 이들 예는 한정적이라기 보다는 예시적인 것이다.
원핵생물 이외에, 사상균 또는 효모와 같은 진핵 미생물은 폴리펩티드 암호화 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 통상적인 베이커 효모인 사카로미세스 세레비시아는 저급 진핵 숙주 미생물에 가장 흔히 사용된다. 그러나, 스키조사카로미세스 폼베; K. 락티스, K. 프라길리스(ATCC 12,424), K. 불가리쿠스(ATCC 16,045), K. 비커라미이(ATCC 24,178), K. 발티이(ATCC 56,500), K. 드로소필라룸(ATCC 36,906)과 같은 클루이베로미세스 숙주 , K. 써모톨레란스 및 K. 마르시아누스; 야로비아(EP 402,226); 피키아 파스토리스(EP 183,070); 칸디다; 트리코데르마 레에시아(EP 244,234); 노이로스포라 크라사; 슈반니오미세스 옥시덴탈리스와 같은 슈반니오미세스; 및 예를 들어, 노이로스포라, 페니실리움, 토리포크라디움과 같은 사상균, 및 A. 니둘란스 및 A. 니게르와 같은 아스페르길루스 숙주와 같은, 다수의 다른 속, 종 및 균주가 통삭적으로 이용 가능하고 본원에서 유용하다.
당화된 단백질, 예를 들어 당화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 수많은 바큘로바이러스 균주 및 변이체, 그리고 스포돕테라 프루기페르다(카터필라), 아데스 아레깁티(모기), 아데스 알보피투스(모기), 드로소필라 메라노가스터(파리), 및 봄빅스 모리와 같은 숙주로부터의 이에 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 식별되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어, 아우토그라 칼리포르니카 NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 이용 가능하며, 이러한 바이러스는 본 발명에 따른 본원의 바이러스로서, 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다. 목화, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물 또한 숙주로서 사용될 수 있다.
포유류 세포는 본 발명의 조성물에 사용되는 재조합 단백질의 발현 및 생산에 사용될 수 있지만, 다른 진핵 세포 유형 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수도 있다. 예를 들어, Winnacker의 문헌[From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)]을 참조한다. 본 발명에 따른 재조합 단백질의 발현을 위한 적절한 포유류 숙주 세포는, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary)(CHO 세포)(예를 들어, 그 전체 교시가 본원에 참조로서 포함되는, Kaufman 및 Sharp의 문헌(1982)[Mol. Biol. 159:601-621]에 기술된 바와 같은 DHFR 선택성 마커와 함께 사용되는, Urlaub 및 Casin의 문헌(1980)[PNAS USA 77:4216-4220]에 기술된 dhfr- CHO 세포를 포함함), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포이다. 단백질 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주 세포 내로 도입될 때, 항체는 숙주 세포에서의 항체의 발현 또는 숙주 세포가 성장되는 배양 배지 내로의 항체의 분비를 허용하기에 충분한 기간 동안 숙주 세포를 배양하는 단계에 의해 생산된다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 예는, SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주주(현탁 배양물 중 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham 등의 문헌[J. Gen Virol. 36:59 (1977)]); 베이비 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10); 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub 등의 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)]); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포(CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포(MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 랫트 간 세포(BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양(MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포(Mather 등의 문헌[Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암 세포주(Hep G2)이며, 전술한 전체의 교시는 본원에 참조로서 통합된다.
숙주 세포는 단백질 생산을 위해 전술한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환되고, 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선택하거나, 원하는 서열을 암호화하는 유전자를 증폭시키기 위해 적절하게 변형된 종래의 영양 배지에서 배양된다.
단백질을 생산하는 데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 배지, 예컨대 Ham's F10™(Sigma), Minimal Essential Medium™(MEM), (Sigma), RPMI-1640(Sigma), 및 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium™(DMEM), (Sigma)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 그 전체 교시가 본원에 참조로서 포함되는, Ham 등의 문헌[Meth. Enz. 58:44 (1979)], Barnes 등의 문헌[Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 제4,657,866호; 제4,927,762호; 제4,560,655호; 또는 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 No. Re. 제30,985호에 기술된 배지 중 어느 하나가 숙주 세포를 위한 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어느 하나는 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 또는 표피 성장 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액(예를 들어, HEPES), 뉴클레오티드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들어, 겐타마이신 약물), 미량 요소(일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 및 포도당 또는 등가의 에너지원으로 필요에 따라 보충될 수 있다. 또한, 임의의 다른 필요한 보충제가 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 종래에 사용된 것들이며, 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
숙주 세포는 또한 온전한 단백질, 예를 들어, Fab 단편 또는 scFv 분자를 포함하는 항체의 일부를 생산하는 데 사용될 수 있다. 전술한 절차에 대한 변형은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 이해된다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 항체의 경쇄 또는 중쇄(둘 모두는 아님)를 암호화하는 DNA로 숙주 세포를 형질감염시키는 것이 바람직할 수 있다. 재조합 DNA 기술은 또한 항원에 결합하기 위해 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거하는 데 사용될 수 있다. 이러한 절단된 DNA 분자로부터 발현된 분자는 본 발명의 항체에 포함된다. 또한, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄는 본 발명의 항체이고, 다른 하나의 중쇄 및 경쇄는 본 발명의 항체의 특이성에 따라, 표준 화학적 가교결합 방법에 의해 본 발명의 항체를 제2 항체에 가교결합시킴으로써, 표적 항체 이외의 항원에 특이적인 이기능성 항체가 생산될 수 있다.
단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 재조합 발현에 적합한 시스템에서, 단백질, 예를 들어 항체 중쇄 및 항체 경쇄 둘 다를 암호화하는 재조합 발현 벡터는 인산칼슘 매개 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포 내로 도입된다. 재조합 발현 벡터 내에서, 단백질 유전자(들)는 각각 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소에 작동 가능하게 연결되어 유전자(들)의 높은 수준의 전사를 유도한다. 재조합 발현 벡터는 또한 DHFR 유전자를 운반하며, 이는 메토트렉세이트 선택/증폭을 사용하여 벡터로 형질감염된 CHO 세포를 선택할 수 있게 한다. 선택된 형질전환체 숙주 세포를 배양하여 단백질을 발현시키고, 예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄를 발현시키고, 온전한 단백질, 예를 들어, 항체를 배양 배지로부터 회수한다. 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체를 선별하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 단백질을 회수한다.
재조합 기술을 사용할 때, 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 세포 내에서, 세포질 주위 공간에서 생산되거나, 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 세포내에서 제조된 항체의 경우, 정제 공정의 제1 단계는 일반적으로 기계적 전단, 삼투압 쇼크, 또는 효소 처리를 포함하는 다양한 방법에 의해 수행될 수 있는 세포의 용해를 포함한다. 이러한 파괴는 세포의 전체 내용물을 균질물 내로 방출하고, 또한 세포의 작은 크기로 인해 제거하기 어려운 세포하 단편을 생성한다. 이들은 일반적으로 차동 원심분리에 의해 또는 여과에 의해 제거된다. 항체가 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액은 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 단백질 농도 필터를 사용하여 먼저 농축된다. 항체가 배지 내로 분비되는 경우, 재조합 숙주 세포는 예를 들어, 접선 유동 여과에 의해 세포 배양 배지로부터 분리될 수도 있다. 항체는 본 발명의 항체 정제 방법을 사용하여 배양 배지로부터 추가로 회수될 수 있다.
산성 종을 조절하기 위한 pH 수준의 조절
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 pH 수준은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 산성 종을 갖는, 본 발명의 조성물을 생산하도록 조절된다(예를 들어 증가 또는 감소된다). 예를 들어, pH는 원하는 pH(예를 들어 약 6~7.5의 pH)를 달성하기 위해 감소될 수 있다. 대안적으로, pH는 원하는 pH에서, 예를 들어 약 6~7.5 사이에서 유지될 수 있다.
특정 구현예에서, 세포 배양물의 pH는 감소되거나 약 6, 6.05, 6.1, 6.15, 6.2, 6.25, 6.3, 6.35, 6.4, 6.45, 6.5, 6.55, 6.6, 6.65, 6.7, 6.75, 6.8, 6.85, 6.9, 6.95, 7, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35, 7.4, 7.45, 또는 7.5로 유지된다. 일부 구현예에서, 세포 배양물의 pH는 약 6~7.5, 예를 들어, 약 6~7, 약 6.1~7, 약 6.2~7, 약 6.3~7, 약 6.4~7, 약 6.5~7, 약 6.5~7.5, 약 6.5~7.4, 약 6.5~7.3, 약 6.5~7.2, 약 6.5~7.1, 약 6.6~7, 약 6.7~7, 약 6.75~6.9 또는 약 6.75~6.95로 유지된다.
pH는 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고, 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물을 생산하는 방식으로 유지되며, 여기서 조성물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 11~19%, 약 11~16%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 13~19%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 산성 종, 및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의 산성 종, 및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 세포 배양물로부터 정화된 수확물을 포함하고, 정화된 수확물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 11~19%, 약 11~16%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 13~19%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 산성 종, 및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의 산성 종, 및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의 산성 종을 포함한다.
소정의 구현예에서, pH는 단백질 또는 항체 조성물 중 산성 종의 양을 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 만큼 (및 전술한 것 중 하나 이상의 이내의 범위만큼) 감소시키는 방식으로 유지된다.
소정의 구현예에서, pH는 산성 종의 양 및/또는 이러한 산성 종의 형성 속도를 증가시키거나 감소시키기 위해 증가되거나 감소된다. 일부 구현예에서, 초기에 약 6.5~7.0인 세포 배양물의 pH는 약 0.01~0.5, 약 0.02~0.4, 약 0.05~0.3, 또는 약 0.1~0.5, 약 0.1~0.3, 또는 약 0.1~0.2만큼 감소된다. 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 하기 실시예 1에 상술된 바와 같이, 약 6.9에서 약 6.75로의 pH 감소는, 세포를 배양하는 동안 산성 종을 감소시키고, 정화된 수확물의 맥락에서 산성 종 형성 속도를 감소시키는 데 사용될 수 있다.
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 pH는 인큐베이션 동안 상이한 시점에 조절된다. 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 세포 배양물의 pH를 증가시키거나 감소시키는 것은 인큐베이션 기간 동안 이른 시점에, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일차에 이루어지거나, 늦은 시점에, 예를 들어 인큐베이션 기간의 마지막 3일차, 마지막 2일차, 또는 마지막 날에 이루어질 수 있다. 세포 배양물의 pH는 조성물 내 산성 종의 바람직한 수준을 달성하기 위해 인큐베이션 기간 전체에 걸쳐 여러번, 예를 들어 인큐베이션 기간 동안 1회, 2회, 또는 3회 변경(예를 들어 증가 또는 감소)될 수 있다.
일부 구현예에서, 초기에 약 6.5~7.0인 세포 배양물의 pH는 인큐베이션 기간의 2일차 내지 8일차 동안 약 0.01~0.5, 약 0.02~0.4, 약 0.05~0.3, 약 0.1~0.5, 약 0.1~0.4, 약 0.1~0.3, 또는 약 0.1~0.2만큼 감소된다. 일부 구현예에서, 초기에 약 6.5~7.0인 세포 배양물의 pH는 인큐베이션 기간의 4일차 또는 5일차에 약 0.01~0.5, 약 0.02~0.4, 약 0.05~0.3, 또는 약 0.1~0.5, 약 0.1~0.4, 약 0.1~0.3, 또는 약 0.1~0.2만큼 감소된다.
일부 구현예에서, pH 변경은 인큐베이션 기간의 4일차에 발생하며, 여기에서 세포 배양물의 pH는 6.9에서 6.75로 감소된다. 다른 구현예에서, pH 변경은 인큐베이션 기간의 5일차에 발생하며, 여기에서 세포 배양물의 pH는 6.9에서 6.75로 감소된다. 또 다른 구현예에서, pH 변경은 인큐베이션 기간의 4일차에 발생하며, 여기에서 세포 배양물의 pH는 6.9에서 6.65로 떨어진다. 또 다른 구현예에서, pH 변경은 인큐베이션 기간의 5일차에 발생하며, 여기에서 세포 배양물의 pH는 6.9에서 6.65로 떨어진다. 다양한 구현예에서, pH의 감소는 세포 배양물의 CO2 수준을 증가시키거나, 세포 배양물의 젖산염 수준을 증가시킴으로써(예를 들어 3일차, 4일차, 5일차, 또는 6일차에 세포 배양물에 첨가된 세포 배양 배지 공급물의 양을 증가시킴으로써), 또는 이들의 조합에 의해 달성된다. 소정의 구현예에서, 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물(예를 들어 감소된 수준의 산성 종)을 갖는 본 발명의 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 관심 단백질을 발현하는 세포 배양물의 pH를 유지시킴과 동시에, 적절한 온도 또는 온도 변경 전략(예를 들어 작업의 공정 온도를 증가시키거나 감소시키고, 더 낮거나 더 높은 온도로 온도를 변경하거나, 조기 배양 시점에 온도를 변경하는 것, 이에 한정되지는 않음)을 선택함으로써 세포 배양물로부터 생산될 수 있다. 이들 배양 조건은 배치 배양, 유가식 배양, 화학 요법 및 관류를 포함하되 이들로 한정되지 않는 다양한 배양 방법에 사용될 수 있고, 적절한 교반 수단이 있거나 없는 진탕 플라??, 회전 플라스크, 교반식 바이오리액터, 에어리프트 바이오리액터, 막 바이오리액터, 고형 지지체 상에 머물거나 미공성 비드에서와 같이 고정/포획된 세포가 포함된 반응기, 및 원하는 세포주의 최적의 성장 및 생산성에 적절한 임의의 다른 구성을 포함하되 이들로 한정되지 않는 다양한 세포 배양 기기와 함께 사용될 수 있다.
후술하는 바와 같이, pH 및/또는 온도를 조절하는 이들 방법은 CO2 수준을 조절하는 방법, 세포 배양물 내 젖산염 수준을 조절하거나 세포 배양물로부터 젖산염 생산을 조절하는 방법, 또는 하나 이상의 세포 배양 보충제(배지 공급물)와 같은 첨가제로 배양 배지를 보충하는 방법, 또는 이들의 조합과 함께 사용되어 산성 종의 원하는 수준을 유지 또는 달성하거나, 세포를 배양하는 동안 산성 종의 형성을 감소시킬 수 있다.
산성 종을 조절하기 위한 CO 2 수준의 조정
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 CO2 수준은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 산성 종을 갖는, 본 발명의 조성물을 생산하도록 조절된다(예를 들어 증가 또는 감소된다)(아래 실시예 섹션 참조). 이러한 조절은 세포 배양물의 CO2 수준을 증가시키는 것 및/또는 세포 배양물의 CO2 수준을 약 1~20%로 유지하는 것을 포함한다. 높은 수준의 CO2는 일반적으로 세포 배양에 바람직하지 않은 조건으로서 간주된다. 그러나, 본 발명의 발명자들은 예상 외로, 본 발명의 방법에서 세포 배양물 내 CO2의 수준을 증가시킴으로써 궁극적으로 세포 배양물의 pH가 감소하고, 단백질 생성물, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체) 내 산성 종의 수준이 상당히 감소한다는 것을 발견하였다.
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 CO2 수준은 약 0.1%, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%로 유지된다. 소정의 구현예에서, 세포 배양물의 CO2 수준은 약 0.1~10%, 0.1~0.5%, 0.1~5%, 1~10%, 2~9%, 3~8%, 4~7%, 5~8%, 4~9%, 또는 1~5%로 (및 전술한 것 중 하나 이상의 이내의 범위로) 유지된다.
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 pCO2 수준은 약 200 mmHg, 약 190 mmHg, 약 180 mmHg, 약 170 mmHg, 약 160 mmHg, 약 150 mmHg, 140 mmHg, 130 mmHg, 120 mmHg, 110 mmHg, 100 mmHg, 90 mmHg, 85 mmHg, 80 mmHg, 75 mmHg, 70 mmHg, 65 mmHg, 60 mmHg, 55 mmHg, 50 mmHg, 45 mmHg, 40 mmHg, 35 mmHg, 30 mmHg, 25 mmHg, 20 mmHg, 15 mmHg, 10 mmHg, 또는 5 mmHg로 유지된다. 일부 구현예에서, 세포 배양물의 pCO2 수준은 약 5~200 mmHg, 약 10~190 mmHg, 약 15~180 mmHg, 약 20~170 mmHg, 약 25~160 mmHg, 약 30~150 mmHg, 약 35~140 mmHg, 약 40~130 mmHg, 약 45~120 mmHg, 약 50~110 mmHg, 약 5~100 mmHg, 약 10~110 mmHg, 약 20~120 mmHg, 약 30~130 mmHg, 약 40~140 mmHg, 약 50~150 mmHg, 약 60~160 mmHg, 약 70~170 mmHg, 약 80~180 mmHg, 약 90~190 mmHg, 또는 약 100~200 mmHg로 유지된다.
세포 배양물의 CO2 수준은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)를 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물을 생산하는 방식으로 유지되며, 여기서 조성물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 11~19%, 약 11~16%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 13~19%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 세포 배양물로부터 정화된 수확물을 포함하고, 정화된 수확물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 11~19%, 약 11~16%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 13~19%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다.
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 CO2 수준은 단백질 또는 항체 조성물 내 산성 종의 양을 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%만큼 (및 전술한 것 중 하나 이상의 이내의 범위만큼) 감소시키는 방식으로 유지된다.
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 CO2 수준은 산성 종의 양 및/또는 이러한 산성 종의 형성 속도를 증가시키거나 감소시키기 위해 증가되거나 감소된다. 일부 구현예에서, 세포 배양물의 CO2 수준은 산성 종의 양 및/또는 이러한 산성 종의 형성 속도를 증가시키거나 감소시키기 위해 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, , 또는 10만큼 증가되거나 감소된다. 예를 들어, 세포 배양물의 CO2 수준(%)은 산성 종의 양 또는 속도를 감소시키기 위해 3%에서 3.5%까지 0.5만큼 증가된다.
소정의 구현예에서, pH는 산성 종의 양 및/또는 이러한 산성 종의 형성 속도를 증가시키거나 감소시키기 위해 세포 배양물의 CO2 수준을 증가시키거나 감소시킴으로써 증가되거나 감소된다. 일부 구현예에서, 세포 배양물의 CO2 수준은, 초기에 약 6.5~7.0인 세포 배양물의 pH를 약 0.01~0.5, 약 0.02~0.4, 약 0.05~0.3, 또는 약 0.1~0.5, 약 0.1~0.3, 또는 약 0.1~0.2만큼 감소시키기 위해 증가된다. 또 다른 구현예에서, 세포 배양물의 CO2 수준은 pH를 약 6.9에서 약 6.75로 감소시키도록 증가되며, 여기서 정화된 수확물의 맥락에서, 세포 배양 중에 생산된 산성 종의 양 및 산성 종 형성 속도가 감소된다.
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 CO2 수준은 인큐베이션 동안 상이한 시점에 조절된다. 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 세포 배양물의 CO2 수준을 증가시키거나 감소시키는 것은 인큐베이션 또는 생산 기간 동안 이른 시점에, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일차에 이루어지거나, 늦은 시점에, 예를 들어 인큐베이션 또는 생산 기간의 마지막 3일차, 마지막 2일차, 또는 마지막 날에 이루어질 수 있다. 세포 배양물의 CO2 수준은 조성물 내 산성 종의 바람직한 수준을 달성하기 위해 인큐베이션 또는 생산 기간 전체에 걸쳐 여러번, 예를 들어 인큐베이션 기간 동안 1회, 2회, 또는 3회 변경(예를 들어 증가 또는 감소)될 수 있다.
소정의 구현예에서, 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 산성 종을 갖는 본 발명의 조성물은, 전술한 바와 같이, 본원에 기술된 것과 같은 관심 단백질을 발현하는 세포 배양물의 CO2 수준을 유지시킴과 동시에 적절한 pH 또는 pH 변경 전략, 및/또는 적절한 온도 또는 온도 변경 전략을 선택함으로써 세포 배양물로부터 생산될 수 있다. 이들 배양 조건은 배치 배양, 유가식 배양, 화학 요법 및 관류를 포함하되 이들로 한정되지 않는 다양한 배양 방법에 사용될 수 있고, 적절한 교반 수단이 있거나 없는 진탕 플라??, 회전 플라스크, 교반식 바이오리액터, 에어리프트 바이오리액터, 막 바이오리액터, 고형 지지체 상에 머물거나 미공성 비드에서와 같이 고정/포획된 세포가 포함된 반응기, 및 원하는 세포주의 최적의 성장 및 생산성에 적절한 임의의 다른 구성을 포함하되 이들로 한정되지 않는 다양한 세포 배양 기기와 함께 사용될 수 있다.
후술하는 바와 같이, CO2 수준을 조절하는 이들 방법은 pH 및/또는 온도를 조절하는 방법, 세포 배양물 내 젖산염 수준을 조절하거나 세포 배양물로부터 젖산염 생산을 조절하는 방법, 또는 하나 이상의 세포 배양 보충제와 같은 첨가제로 배양 배지를 보충하는 방법, 또는 이들의 조합과도 함께 사용되어 산성 종의 원하는 수준을 유지 또는 달성하거나, 세포를 배양하는 동안 산성 종의 형성을 감소시킬 수 있다.
산성 종을 조절하기 위한 젖산염 수준의 조절
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 젖산염 수준은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 산성 종을 갖는, 본 발명의 조성물을 생산하도록 조절된다(예를 들어 증가 또는 감소된다)(아래 실시예 섹션 참조). 이러한 조절은 세포 배양물 내 젖산염 수준을 증가시키는 것 및/또는 세포 배양물의 젖산 수준을 특정 수준, 예를 들어 약 0.1~5 g/L로 유지하는 것을 포함한다. 높은 수준의 젖산염 및/또는 낮은 pH는 일반적으로 세포 배양에 바람직하지 않은 것으로 간주된다. 그러나, 본 발명의 발명자들은 예상 외로, 본 발명의 방법에서 세포 배양물 내 젖산염의 수준을 증가시킴으로써 궁극적으로 세포 배양물의 pH가 감소하고, 단백질 생성물, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체) 내 산성 종의 수준이 상당히 감소한다는 것을 발견하였다.
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 젖산염 수준은 약 0.1 g/L, 0.2 g/L, 0.3 g/L, 0.4 g/L, 0.5 g/L, 0.6 g/L, 0.7 g/L, 0.8 g/L, 0.9 g/L, 1 g/L, 1.1 g/L, 1.2 g/L, 1.3 g/L, 1.4 g/L, 1.5 g/L, 1.6 g/L, 1.7 g/L, 1.8 g/L, 1.9 g/L, 2 g/L, 2.1 g/L, 2.2 g/L, 2.3 g/L, 2.4 g/L, 2.5 g/L, 2.6 g/L, 2.7 g/L, 2.8 g/L, 2.9 g/L, 3 g/L, 4 g/L , 또는 5 g/L로 유지된다. 소정의 구현예에서, 세포 배양물의 젖산염 수준은 약 0.1~5 g/L, 약 0.1~4 g/L, 약 0.1~3 g/L, 약 0.1~2 g/L, 약 0.2~2 g/L, 약 0.3~2 g/L, 약 0.4~2 g/L, 약 0.5~2 g/L, 약 0.6~2 g/L, 약 0.7~2 g/L, 약 0.8~2 g/L, 약 0.9~2 g/L, 약 0.1~1.9 g/L, 약 0.2~1.8, 약 0.3~1.7, 약 0.4~1.6, 약 0.5~1.5 g/L, 약 0.6~1.4, 약 0.7~1.3, 약 0.8~1.2, 또는 약 0.9~1.1로 유지된다. 소정의 구현예에서, 세포 배양물의 젖산염 수준은 약 0.1~2 g/L로 유지된다.
일부 구현예에서, 세포 배양물의 젖산염 수준은 세포 배양물을 추가 세포 배양 공급물 또는 보충제로 보충함으로써 조절되어, 배양물 내에서 세포에 의한 젖산염 생산을 증가시킨다.
젖산염 수준은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고, 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물을 생산하는 방식으로 유지되며, 여기서 조성물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 11~19%, 약 11~16%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 13~19%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 세포 배양물로부터 정화된 수확물을 포함하고, 정화된 수확물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 11~19%, 약 11~16%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 13~19%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다.
소정의 구현예에서, 젖산염 수준은 단백질 또는 항체 조성물 중 산성 종의 양을 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 만큼 (및 전술한 것 중 하나 이상의 이내의 범위만큼) 감소시키는 방식으로 유지된다.
소정의 구현예에서, pH는 산성 종의 양 및/또는 이러한 산성 종의 형성 속도를 증가시키거나 감소시키기 위해 세포 배양물의 젖산염 수준을 증가시키거나 감소시킴으로써 증가되거나 감소된다. 일부 구현예에서, 세포 배양물의 젖산염 수준은, 초기에 약 6.5~7.0인 세포 배양물의 pH를 약 0.01~0.5, 약 0.02~0.4, 약 0.05~0.3, 또는 약 0.1~0.5, 약 0.1~0.3, 또는 약 0.1~0.2만큼 감소시키기 위해 증가된다. 또 다른 구현예에서, 세포 배양물의 젖산염 수준은 pH를 약 6.9에서 약 6.75로 감소시키도록 증가되며, 여기서 정화된 수확물의 맥락에서, 세포 배양 중에 생산된 산성 종의 양 및 산성 종 형성 속도가 감소된다.
소정의 구현예에서, 세포 배양물 내 젖산염 수준은 산성 종의 양 및/또는 이러한 산성 종의 형성 속도를 증가시키거나 감소시키기 위해 증가되거나 감소된다.
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 젖산염 수준은 인큐베이션 동안 상이한 시점에 조절된다. 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 세포 배양물의 젖산염 수준을 증가시키거나 감소시키는 것은 인큐베이션 또는 생산 기간 동안 이른 시점에, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일차에 이루어지거나, 늦은 시점에, 예를 들어 인큐베이션 또는 생산 기간의 마지막 3일차, 마지막 2일차, 또는 마지막 날에 이루어질 수 있다. 세포 배양물의 젖산염 수준은 조성물 내 산성 종의 바람직한 수준을 달성하기 위해 인큐베이션 또는 생산 기간 전체에 걸쳐 여러번, 예를 들어 인큐베이션 기간 동안 1회, 2회, 또는 3회 변경(예를 들어 증가 또는 감소)될 수 있다.
소정의 구현예에서, 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 산성 종을 갖는 본 발명의 조성물은, 전술한 바와 같이, 본원에 기술된 것과 같은 관심 단백질을 발현하는 세포 배양물의 젖산염 수준을 증가시키고/시키거나 젖산염 수준을 유지시킴과 동시에 적절한 pH, CO2, 온도 또는 온도 변경 전략을 선택함으로써 세포 배양물로부터 생산될 수 있다. 이들 배양 조건은 회분 배양(batch cultivation), 유가식 배양(fed-batch cultivation), 화학 요법 및 관류를 포함하되 이들로 한정되지 않는 다양한 배양 방법에 사용될 수 있고, 적절한 교반 수단이 있거나 없는 진탕 플라??, 회전 플라스크, 교반식 바이오리액터, 에어리프트 바이오리액터, 막 바이오리액터, 고형 지지체 상에 머물거나 미공성 비드에서와 같이 고정/포획된 세포가 포함된 반응기, 및 원하는 세포주의 최적의 성장 및 생산성에 적절한 임의의 다른 구성을 포함하되 이들로 한정되지 않는 다양한 세포 배양 기기와 함께 사용될 수 있다.
세포 배양물 내 젖산염 수준을 조절하거나 세포 배양물로부터 젖산염 생산을 조절하는 이들 방법은 pH, 온도, 및/또는 CO2 수준을 조절하는 방법, 또는 하나 이상의 세포 배양 보충제와 같은 첨가제로 배양 배지를 보충하는 방법, 또는 이들의 조합과도 함께 사용되어 산성 종의 원하는 수준을 유지 또는 달성하거나, 세포를 배양하는 동안 산성 종의 형성을 감소시킬 수 있다.
산성 종을 조절하기 위한 세포 배양 보충제의 조절
소정의 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 산성 종을 갖는, 본 발명의 조성물을 생산하기 위해 하나 이상의 세포 배양 보충제(배지 공급물)이 첨가될 수 있다(아래 실시예 섹션 참조).
세포 배양 보충제는 세포 배양 성능을 향상시키고 세포 배양물로부터 재조합 단백질의 수율을 증가시키기도록 의도된다. 임의의 알려진 세포 배양 보충제가 본 발명의 방법에 적합하다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 배양 보충제는 화학적으로 정의되고 동물 유래 성분이 없으며, 유가식 공정에서 고 수율 단백질 생산에 최적화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 배양 보충제는 임의의 성장 인자(예를 들어 인슐린), 펩티드, 가수분해물, 페놀 레드, 또는 2-merCapto™ 에탄올을 함유하지 않아, 배치 간 일관성 및 증가된 세포 배양 공정 효율을 보장한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 배양 보충제는 중성에 가까운 pH를 가지며, 아미노산, 비타민, 염, 미량 원소, 및 포도당을 함유한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 세포 배양 보충제는 알칼리성 pH를 가지며, 아미노산의 농축된 용액이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 배양 보충제는 HyClone™ Cell Boost™ 7a(Cytiva Life Sciences, Amersham, UK)를 포함한다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 세포 배양 보충제는 HyClone™ Cell Boost™ 7b(Cytiva Life Sciences, Amersham, UK)를 포함한다. Cell Boost 7a 대 7b의 권장 비율은 약 10 대 1(v/v)이다.
첨가된 세포 배양 보충제의 총량 및 특정 영양 요법은 각각의 특정 세포 배양물의 영양 요건에 따라 조정된다. 소정의 구현예에서, 하나 이상의 세포 배양 보충제는 초기 배양물 부피의 약 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%, 4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 4.5%, 4.6%, 4.7%, 4.8%, 4.9%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, , 또는 10%의 부피로 세포 배양물에 첨가된다.
세포 배양 보충제는 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고, 감소된 수준의 산성 종을 갖는 조성물을 생산하는 방식으로 세포 배양물에 첨가되며, 여기서 조성물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 11~19%, 약 11~16%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 13~19%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 세포 배양물로부터 정화된 수확물을 포함하고, 정화된 수확물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정화된 수확물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 11~19%, 약 11~16%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 13~19%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다.
소정의 구현예에서, 세포 배양 보충제는 단백질 또는 항체 조성물 내 산성 종의 양을 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 만큼 (및 전술한 것 중 하나 이상의 이내의 범위만큼) 감소시키는 방식으로 세포 배양물에 첨가된다.
소정의 구현예에서, 세포 배양물 내 세포 배양 보충제의 수준은 산성 종의 양 및/또는 이러한 산성 종의 형성 속도를 증가시키거나 감소시키기 위해 증가되거나 감소된다. 일부 구현예에서, 약 0.1~3% 수준의 세포 배양 보충제가 세포 배양에 첨가되며, 이러한 산성 종의 양 및/또는 이러한 산성 종의 형성 속도를 감소시키기 위해, 세포 배양 보충제의 수준은, 예를 들어 초기 수준의 약 50% 이상만큼 추가로 증가된다. 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 하기 실시예 1에 상술된 바와 같이, 세포 배양 보충제 수준을 2%에서 약 3%로 또는 0.2%에서 약 0.3%로 증가시키는 것을 사용해 세포를 배양하는 동안 산성 종을 감소시킬 수 있고, 정화된 수확물의 맥락에서 산성 종 형성 속도를 감소시킬 수 있다.
소정의 구현예에서, 세포 배양물의 세포 배양 보충제 수준은 인큐베이션 동안 상이한 시점에 조절된다. 예를 들어, 세포 배양 보충제를 첨가하는 것은 인큐베이션 또는 생산 기간 동안 이른 시점에, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, , 또는 10일차에 이루어지거나, 늦은 시점에, 예를 들어 인큐베이션 또는 생산 기간의 마지막 3일차, 마지막 2일차, 또는 마지막 날에 이루어질 수 있다. 세포 배양물에 첨가되는 세포 배양 보충제의 양은 조성물 내 산성 종의 바람직한 수준을 달성하기 위해 인큐베이션 기간 전체에 걸쳐 여러번 변경(예를 들어 증가 또는 감소)되거나, 예를 들어 인큐베이션 또는 생산 기간 동안 1회, 2회, 또는 3회 변경(예를 들어 증가 또는 감소)될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포 배양 보충제는 약 0.1~3% 수준이고, 인큐베이션 또는 생산 기간의 2일차 내지 8일차 동안, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, , 또는 8일차에 세포 배양물에 첨가되며, 세포 배양 보충보충제의 수준은 인큐베이션 또는 생산 기간의 4일차 내지 10일차 동안, 예를 들어 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 또는 10일차에 초기 수준의 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 150%, 또는 약 200%만큼 추가로 증가된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 기간의 2일차 또는 3일차에 약 0.1~3% 수준의 세포 배양 보충제가 세포 배양물에 첨가되며, 세포 배양 보충제의 수준은 인큐베이션 또는 생산 기간의 5일차 또는 6일차에, 예를 들어 초기 수준의 약 50% 이상만큼 추가로 증가된다.
일부 구현예에서, 세포 배양 보충제는 2일차 또는 3일차에 초기 부피의 약 2%로 배양 배지에 첨가되고, 5일차 또는 6일차에 초기 부피의 약 3%로 다시 첨가된다. 다른 구현예에서, 세포 배양 보충제는 2일차 또는 3일차에 초기 부피의 약 0.2%로 배양 배지에 첨가되고, 5일차 또는 6일차에 초기 부피의 약 0.3%로 다시 첨가된다. 일부 구현예에서, 세포 배양 보충제는 2일차 또는 3일차에 초기 부피의 약 2%로 배양 배지에 첨가되고, 5일차 또는 6일차에 초기 부피의 약 3%로 및 9일차에 초기 부피의 약 2%로 다시 첨가된다. 일부 구현예에서, 세포 배양 보충제는 2일차 또는 3일차에 초기 부피의 약 0.2%로 배양 배지에 첨가되고, 5일차 또는 6일차에 초기 부피의 약 0.3%로 및 9일차에 초기 부피의 약 0.2%로 다시 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 세포 배양 보충제가 2일차 또는 3일차에 초기 부피의 약 2%로 배양 배지에 첨가되고, 5일차 또는 6일차에 초기 부피의 약 3%로 다시 첨가되며; 제2 세포 배양 보충제가 2일차 및 3일차에 초기 부피의 약 0.2%로 배양 배지에 첨가하고, 5일차 및 6일차에 초기 부피의 약 0.3%로 다시 첨가된다. 일 구현예에서, 제1 세포 배양 보충제가 3일차에 초기 부피의 약 2%로 배양 배지에 첨가되고, 5일차에 초기 부피의 약 3%로 다시 첨가되며; 제2 세포 배양 보충제가 3일차에 초기 부피의 약 0.2%로 배양 배지에 첨가하고, 5일차에 초기 부피의 약 0.3%로 다시 첨가된다. 또 다른 구현예에서, 제1 세포 배양 보충제가 3일차에 초기 부피의 약 2%로 배양 배지에 첨가되고, 6일차에 초기 부피의 약 3%로 다시 첨가되며; 제2 세포 배양 보충제가 3일차에 초기 부피의 약 0.2%로 배양 배지에 첨가하고, 6일차에 초기 부피의 약 0.3%로 다시 첨가된다. 일부 구현예에서, 제1 세포 보충제는 Cell Boost 7a와 같은 세포 배양 배지 공급물이고, 제2 보충제는 Cell Boost 7b과 같은 세포 배양 배지 공급물이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 세포 배양 보충제를 첨가하면 젖산염 생산이 증가하고, 오스몰농도가 증가하고, 세포 생존력이 증가하고/하거나, 세포 배양물의 pH가 감소한다.
하나 이상의 보충제의 첨가는 산성 종의 측정된 양을 기준으로 할 수 있다. 생성된 배지는 회분 배양, 유가식 배양, 화학 요법 및 관류를 포함하되 이들로 한정되지 않는 다양한 배양 방법에 사용될 수 있고, 적절한 교반 수단이 있거나 없는 진탕 플라??, 회전 플라스크, 교반식 바이오리액터, 에어리프트 바이오리액터, 막 바이오리액터, 고형 지지체 상에 머물거나 미공성 비드에서와 같이 고정/포획된 세포가 포함된 반응기, 및 원하는 세포주의 최적의 성장 및 생산성에 적절한 임의의 다른 구성을 포함하되 이들로 한정되지 않는 다양한 세포 배양 기기와 함께 사용될 수 있다. 또한, 수확물 생존력 또는 배양물 지속시간의 선택을 기준으로 이들 배양물에 대한 수확물 기준을 선택하여 특정 표적화된 산성 종 프로파일을 추가로 최적화할 수 있다.
세포 배양 보충물을 조정하는 이들 방법은, 본원에 기술된 것과 같은 pH, 온도, 및/또는 CO2 수준을 조절하는 방법, 세포 배양물 내 젖산염 수준을 조절하거나 세포 배양물로부터 젖산염 생산을 조절하는 방법, 또는 이들의 조합과도 함께 사용되어, 산성 종의 원하는 수준을 유지 또는 달성하거나, 세포를 배양하는 동안 산성 종의 형성을 감소시킬 수 있다.
IV. 하류 공정 기술을 사용한 조성물의 제조
본 발명은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편, 예를 들어 절반 항체, 또는 하전된 종, 예를 들어 산성 또는 염기성 종; 및/또는 감소된 수준의 공정 관련 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질을 갖는 제제를 생산하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 생성물 관련 물질, 예를 들어, 단백질 응집체, 단편, 예를 들어, 절반 항체, 또는 하전된 종, 예를 들어, 산성 종 또는 염기성 종; 및/또는 감소된 수준의 공정 관련 불순물, 예를 들어, 숙주 세포 단백질을 갖는 조성물을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 이러한 변이체 및/또는 불순물이 감소된 조성물은 생성물 안정성, 생성물 안전성, 및 생성물 효능을 포함하지만 이에 한정되지 않는 개선된 생성물 특성에 대한 요구를 해결한다.
소정의 구현예에서, 본 발명은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예를 들어 절반 항체), 또는 하전된 종(예를 들어 산성 또는 염기성 종); 및/또는 감소된 수준의 공정 관련 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질을 갖는 제제를 생산하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 관심 단백질 및 변이체 및/또는 불순물을 포함하는 샘플을 크로마토그래피 수지(예: 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피 수지, 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 수지, 및/또는 혼합 모드(MM) 크로마토그래피 수지)로 처리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 절반 항체를 갖는 제제를 생산하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심 단백질 및 절반 항체를 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 및/또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 처리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 제제에서 절반 항체의 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심 단백질 및 절반 항체를 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 및/또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 처리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 제제를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및 산성 종을 포함하는 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 처리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 제제에서 산성 종의 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및 산성 종을 포함하는 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 처리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 관심 단백질, 예컨대 마브릴리무맙과 같은 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고 감소된 수준의 고분자량 응집체 및/또는 숙주 세포 단백질을 갖는 제제를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심 단백질, 고분자량 응집체, 및/또는 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 샘플을 크로마토그래피 수지, 예컨대 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및/또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 처리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 제제에서 고분자량 응집체 및/또는 숙주 세포 단백질의 수준을 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 관심 단백질, 고분자량 응집체, 및/또는 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 샘플을 크로마토그래피 수지, 예컨대 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및/또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 처리하는 단계를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 단백질의 세포 배양 후에 본원에 기술된 것과 같은 하류 공정 기술(예: 정제)을 사용하여 제조될 수 있다. 하류 공정 기술은 단독으로 사용되거나, 실시예 2 및 3에 기술된 바와 같이 상기 섹션 III에 기술된 상류 공정 기술과 조합하여 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본원에 기술된 하류 공정 기술은 단독으로 또는 하나 이상의 상류 공정 기술과 조합하여, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)를 포함하고 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 감소된 수준의 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예를 들어 절반 항체), 또는 하전된 종(예를 들어 산성 종 또는 염기성 종); 및/또는 감소된 수준의 공정 관련 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질을 갖는 조성물을 생산한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 절반 항체를 갖는 조성물을 생성하며, 여기서 조성물은 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3.9%, 약 3.8%, 약 3.7%, 약 3.6%, 약 3.5%, 약 3.4%, 약 3.3%, 약 3.2%, 약 3.1%, 약 3%, 약 2.9%, 약 2.8%, 약 2.7%, 약 2.6%, 약 2.5%, 약 2.4%, 약 2.3%, 약 2.2%, 약 2.1%, 약 2%, 약 1.9%, 약 1.8%, 약 1.7%, 약 1.6%, 약 1.5%, 약 1.4%, 약 1.3%, 약 1.2%, 약 1.1%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.1~20%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18%, 또는 약 1~17%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 산성 종을 갖는 조성물을 생성하며, 여기서 조성물은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 염기성 종을 갖는 조성물을 생성하며, 여기서 조성물은 약 45%, 약 44%, 약 43%, 약 42%, 약 41%, 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 1~45%, 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~25%, 약 5~35%, 약 10~35%, 약 15~35%, 약 1~30%, 약 1~25%, 약 1~24%, 약 5~25%, 약 5~30%, 약 5~45%, 약 10~25%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 15~25%, 약 15~30%, 약 15~35%, 약 15~25%, 약 16~31%, 약 17~26%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16~41%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물을 생성하고, 상기 조성물은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 초과의 (및 전술한 것 중 하나 이상 내의 범위의) 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 40~99%, 약 45~99%, 약 50~99%, 약 55~99%, 약 50~90%, 약 55~90%, 약 50~80%, 약 55~80%, 약 50~70%, 약 55~70%, 약 50~65%, 약 55~65%, 약 58~62%, 약 58~63%, 약 58~67%, 약 53~61%, 약 46~67%, 또는 약 46~66%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 주요 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 고분자량 응집체를 갖는 조성물을 생성하며, 여기서 상기 조성물은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 단백질 분획을 갖는 조성물을 생성하며, 여기서 상기 조성물은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 조성물을 생성하고, 상기 조성물은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1% 또는 약 99.5% 초과의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 관심 단백질 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 90% 초과의 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 99.1% 초과의 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 관심 단백질 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 98~99%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 98~99.9%의 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하고 감소된 수준의 숙주 세포 단백질을 갖는 조성물을 생성하고, 여기서 상기 조성물은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 0.1~10 ppm, 약 1~10 ppm, 약 2~10 ppm, 약 3~10 ppm, 약 4~10 ppm, 약 1~5 ppm, 약 5~10 ppm, 약 1~3 ppm, 약 0.1~2 ppm, 약 0.1~3 ppm, 약 2~8, 또는 약 0.1~8 ppm의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) HCP를 포함한다.
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 하류 공정 기술은 단독으로 또는 하나 이상의 상류 공정 기술과 조합하여, 단백질 또는 항체 조성물에서 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 또는 하전된 종(예: 산성 종 또는 염기성 종); 및/또는 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질)의 수준을 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 만큼 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위만큼) 감소시킨다.
단백질 정제
관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)의 상류 생산 후, 하류 공정 기술을 사용해 단백질을 정제할 수 있다. 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 정화된 용액 또는 혼합물이 수득된 후, 이온 교환 분리 단계, 혼합 모드 분리 단계, 친화도 분리 단계, 및 소수성 상호작용 분리 단계를 단독으로 또는 조합으로 포함하되 이에 한정되지 않는 상이한 정제 기술의 조합을 사용해 단백질 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 또는 하전된 종(예: 산성 종 또는 염기성 종); 및/또는 공정 관련 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질로부터 관심 단백질 분리를 수행할 수 있다. 분리 단계는, 분리(크로마토그래피 분리 포함)의 특정 형태에 따라 다르지만, 단백질 혼합물의 전하, 소수성 정도, 또는 크기, 또는 이들의 임의의 조합을 기준으로 단백질 혼합물을 분리한다. 본 발명의 일 양태에서, 분리는 양이온성, 음이온성, 및 소수성 상호작용을 포함하는 크로마토그래피를 사용하여 수행된다. 이들 기술 각각에 대해 여러 가지 상이한 크로마토그래피 수지를 사용할 수 있으므로, 포함된 특정 단백질에 대한 정제 계획을 정확하게 맞춤화하는 것이 가능하다. 분리 방법 각각에 의해 단백질은 상이한 속도로 컬럼을 통과하여 물리적으로 분리되는데, 이러한 분리는 단백질이 칼럼을 추가로 통과할 때, 또는 분리 매질에 선택적으로 부착될 때 증가한다. 그런 다음, 단백질을 상이한 용리 완충액에 의해 차등적으로 용리시킨다. 일부 경우에, 관심 단백질은, 변이체 및/또는 불순물이 컬럼의 수지에 우선적으로 부착되고 관심 단백질이 부착되지 않을 때, 즉 관심 단백질이 관류 분획 내에 존재하지 않을 때 분리되며; 다른 경우에, 관심 단백질이 컬럼의 수지에 부착되고 변이체 및/또는 불순물이 세척 사이클 동안 컬럼의 수지로부터 압출될 때 분리된다.
소정의 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 본 발명의 조성물은 크로마토그래피 분리를 사용해 분리되어, 관심 단백질 및 적어도 하나의 이러한 변이체 및/또는 불순물을 포함하는 샘플의 바람직한 분획화 프로파일, 예를 들어 생성물-관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 또는 하전된 종(예: 산성 종 또는 염기성 종); 및/또는 공정 관련 불순물, 예를 들어 숙주 세포 단백질의 바람직한 분획화 프로파일을 밝혀내기에 충분한 특정 조건, 예를 들어 염 농도, pH, 완충액, 온도, 로딩량 및 조건, 세척 조건, 및 용리 조건을 식별할 수 있다. 소정의 구현예에서, 상기 방법은 원하는 조성물을 포함하는 생성된 분획을 모으는 단계를 추가로 포함한다.
일차 회수 및 바이러스 불활성화
소정의 구현예에서, 본 발명의 정제 방법의 초기 단계는 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어, 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)를 샘플 매트릭스로부터 정화하고 일차 회수하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 일차 회수 단계는 세포 및 세포 잔해로부터 관심 단백질을 분리하기 위한 하나 이상의 원심분리 단계를 포함하게 된다. 샘플의 원심분리는, 예를 들어 7,000g 내지 약 12,750g에서 수행될 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 대규모 정제의 맥락에서, 이러한 원심분리는 예를 들어, 생성된 상청액에서 150 NTU의 혼탁도 수준을 달성하도록 설정된 유속으로 온라인으로 이루어질 수 있다. 그런 다음, 이러한 상청액을 추가 정제를 위해 수집하거나, 하나 이상의 심층 필터를 통해 인라인 여과하여 샘플을 추가로 정화할 수 있다.
소정의 구현예에서, 일차 회수는 샘플 매트릭스를 정화하여 본 발명에서 관심 항체를 정제하는 데 도움을 주는, 하나 이상의 심층 여과 단계를 사용하는 것을 포함하게 된다. 다른 구현예에서, 일차 회수는 원심분리 후 샘플 매트릭스를 추가로 정화하기 위한 하나 이상의 심층 여과 단계를 사용하는 것을 포함하게 된다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 심층 필터의 비제한적인 예는 Millistak+ X0HC, F0HC, D0HC, A1HC, B1HC 심층 필터(EMD Millipore), Cuno™ 모델 30/60ZA, 60/90 ZA, VR05, VR07, 탈지질 심층 필터(3M Corp.)를 포함한다. 심층 필터 다음에는 Sartorius의 0.45/0.2μm Sartopore™ 이중층, 또는 Millipore의 Express SHR 또는 SHC 필터 카트리지와 같은 0.2 μm 필터가 일반적으로 사용된다.
소정의 구현예에서, 일차 회수 공정은 샘플 매트릭스에 존재할 수 있는 바이러스를 감소시키거나 불활성화시키는 지점일 수도 있다. 예를 들어, 다양한 바이러스 감소/불활성화 방법 중 임의의 하나 이상이 정제의 일차 회수 단계 동안 또는 그 후에 사용될 수 있으며, 이에는 열 불활성화(멸균), pH 불활성화, 완충액/세제 처리, UV 및 η-선 조사, 및 특정 화학적 불활성화제, 예컨대 β-프로피오락톤, 또는 예를 들어 미국 특허 제4,534,972호에 기술된 것과 같은 구리 페난트롤린를 첨가하는 것이 포함된다. 본 발명의 소정의 구현예에서, 샘플 매트릭스는 일차 회수 단계 동안 또는 그 후에 세제 바이러스 불활성화에 노출된다. 다른 구현예에서, 샘플 매트릭스는 일차 회수 단계 동안 또는 그 후에 저 pH 불활성화에 노출될 수 있다.
바이러스 감소/불활성화가 사용되는 구현예들에서, 추가의 정제 단계를 위해 샘플 혼합물을 필요에 따라 조절할 수 있다. 예를 들어, 저 pH 바이러스 불활성화 후에 정제 단계를 계속하기 전에, 일반적으로 샘플 혼합물의 pH가 중성에 더 가까운 pH로, 예를 들어 약 4.5에서 약 8.5로, 약 5에서 약 8로, 약 5.5에서 약 7.5로, 또는 약 6에서 약 7로 조절된다. 또한, 혼합물을 주사용수(WFI)로 희석하여 원하는 전도도를 수득할 수 있다.
친화도 크로마토그래피
본 발명의 방법에 의해 생산된 샘플을 친화도 크로마토그래피로 처리하여 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 변이체 및/또는 불순물로부터 이격되도록 정제하는 것이 유리하다. 소정의 구현예에서, 크로마토그래피 물질은 관심 단백질에 선택적으로 또는 특이적으로 결합할 수 (“포획”될 수) 있다. 이러한 크로마토그래피 물질의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 단백질 A; 단백질 G; 예를 들어 관심 항체가 결합된 항원을 포함하는 크로마토그래피 물질; 및 Fc 결합 단백질을 포함하는 크로마토그래피 물질. 특정 구현예에서, 친화도 크로마토그래피 단계는 일차 회수 샘플을 적절한 단백질 A 수지를 포함하는 컬럼으로 처리하는 단계를 포함한다. 소정의 구현예에서, 단백질 A 수지는 다양한 항체 이소형, 특히 IgG1, IgG2, 및 IgG4의 친화도 정제 및 단리에 유용하다. 단백질 A는 주로 이들의 Fc 영역을 통해 포유류 IgG에 일차적으로 결합하는 박테리아 세포벽 단백질이다. 고유 상태에서, 단백질 A는 5개의 IgG 결합 도메인뿐만 아니라 기능이 알려지지 않은 다른 도메인도 갖는다.
단백질 A 수지에 대한 여러 상업적 공급원이 있다. 적합한 수지는 MabSelect SuRe LX, MabSelect SuRe™, MabSelect, MabSelect Xtra, rProtein A Sepharose(GE Healthcare), ProSep HC, ProSep Ultra, 및 ProSep Ultra Plus(EMD Millipore), MapCapture(Life Technologies)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
단백질 A 컬럼은 샘플 로딩 전에 적절한 완충액으로 평형화될 수 있다. 컬럼을 로딩한 후, 적절한 완충액 세트를 사용하여 컬럼을 한 번 또는 여러 번 세척할 수 있다. 그런 다음, 적절한 용리 완충액을 사용하여 단백질 A 컬럼을 용리할 수 있다. 예를 들어, 글리신-HCL 또는 구연산이 용리 완충액으로서 사용될 수 있다. 용리물은 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 모니터링될 수 있다. 관심 용리물 분획을 수집한 다음 추가 가공에 맞게 준비할 수 있다.
단백질 A 용리물는 세제 또는 저 pH에 의한 바이러스 불활성화 단계를 거칠 수 있다. 단, 이 단계는 단백질 A 포획 작업 전에 수행되지 않는다. 적절한 세제 농도 또는 pH 및 시간을 선택하여 원하는 바이러스 불활성화 결과를 얻을 수 있다. 바이러스 불활성화 후, 일반적으로 단백질 A 용리물의 pH 및/또는 전도도는 후속 정제 단계에 맞게 조정된다.
단백질 A 용리물은, 추가 크로마토그래피 연마 단계 전에, 혼탁도를 제거하고/하거나 관심 항체로부터 다양한 불순물을 제거하기 위해 심층 필터를 통한 여과를 거칠 수 있다. 심층 필터의 예는 Millistak+ X0HC, F0HC, D0HC, A1HC, 및 B1HC Pod 필터(EMD Millipore), 또는 Zeta Plus 30ZA/60ZA, 60ZA/90ZA, 탈지질, VR07, 및 VR05 필터(3M)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 단백질 A 용리물 풀은 원하는대로 불순물을 제거하고 심층 여과 단계로부터 생성물을 회수하기 위해 적절한 pH 및 전도도에 맞게 컨디셔닝하는 것이 필요할 수 있다.
본 발명은 단백질 A 크로마토그래피를 사용하는 관심 단백질의 포획으로 한정되지는 않는다. 비-단백질 A 크로마토그래피 포획 단계가 수행될 수도 있다. 예를 들어, 양이온 교환 포획 및 비-크로마토그래피 방법, 예컨대 수성 2상 추출 또는 침강, 또는 당업계에 공지된 다른 방법이 사용될 수 있다.
양이온 교환 크로마토그래피
관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 본 발명의 조성물은 관심 단백질을 포함하는 샘플을 양이온 교환(CEX) 분리 단계로 처리함으로써 생산될 수 있다. 소정의 구현예에서, CEX 단계는 전술한 친화도 크로마토그래피, 예를 들어 단백질 A 친화도 단계 후에 이루어진다.
본원에서 상세히 논의된 음이온 교환 물질과 같은 음이온 교환 물질 대비 양이온 교환 물질을 사용하는 것은 주어진 용액 내 관심 단백질의 국소 전하에 기초한다. 따라서, 음이온 교환 단계를 사용하기 전에 양이온 교환 단계를 사용하는 것, 또는 양이온 교환 단계를 사용하기 전에 음이온 교환 단계를 사용하는 것은 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 양이온 교환 단계만 사용하는 것, 음이온 교환 단계만 사용하는 것, 또는 이 두가지를 임의의 연속 조합으로 사용하는 것(하나의 이온 교환 단계 또는 두가지 이온 교환 단계 모두와 본원에 기술된 다른 크로마토그래피 분리 기술과의 연속 조합으로 사용하는 것 포함)은 본 발명의 범주에 포함된다.
분리를 수행함에 있어서, 다양한 기술 중 어느 하나를 사용해, 예를 들어 단백질 A와 관련하여 전술한 것과 같은 회분 정제 기술 또는 크로마토그래피 기술을 사용해 초기 단백질 혼합물을 양이온 교환 물질과 접촉시킬 수 있다.
예를 들어, 회분 정제의 맥락에서, 양이온 교환 물질은 원하는 시작 완충액에서 제조되거나 이에 대해 평형화된다. 제조, 또는 평형화 후, 양이온 교환 물질의 슬러리가 수득된다. 일부 구현예에서, 관심 단백질(예를 들어 항체) 용액을 CEX 수지와 접촉시켜 단백질을 수지에 흡착시킨다. 변이체 및/또는 불순물을 포함하는 용액은 CEX 수지에 결합하지 않을 수 있다. 대안적으로, 다른 구현예에서, 변이체 및/또는 불순물을 포함하는 용액은 관심 단백질보다 다 밀접하게 CEX 수지에 결합할 수 있다. 수지는 하나 이상의 세척 단계 및/또는 용리 단계를 거칠 수 있다. 대안적으로, 변이체 및/또는 불순물은 수지에 결합할 수 있고, 관심 단백질은 결합하지 않는다.
충진된 양이온-교환 크로마토그래피 컬럼, 양이온-교환 막 장치, 양이온-교환 모놀리식 장치, 또는 심층 필터 매체는 결합-용리 모드, 관류 모드, 또는 하이브리드 모드로 작동될 수 있고(여기서 생성물은 크로마토그래피 물질에 대한 결합을 나타냄), 로딩 완충액과 동일하거나 실질적으로 유사한 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 세척될 수 있다. 결합-용리 모드에서, 먼저 컬럼 또는 막 장치는, 특정 단백질이 수지 기반 매트릭스 상에 고정되는 조건 하에서, 적절한 이온 강도 및 pH를 갖는 완충액으로 컨디셔닝된다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 공급물을 로딩하는 동안, 관심 단백질은 정전기 인력으로 인해 수지에 흡착되게 된다. 컬럼 또는 막 장치를 평형화 완충액 또는 상이한 pH 및/또는 전도도를 갖는 다른 완충액으로 세척한 후, 음이온 교환 매트릭스의 하전된 부위에 대한 용질과 경쟁할 용리 완충액의 이온 강도(즉, 전도도)를 증가시킴으로써 생성물 회수를 달성한다. pH를 변화시켜 용질의 전하를 변경하는 것은 용질의 용리를 달성하는 또 다른 방법이다. 전도도 또는 pH의 변화는 점진적이거나(구배 용리) 또는 단계적(단계 용리)일 수 있다. 관류 모드에서, 컬럼 또는 막 장치는, 관심 단백질이 수지 또는 막에 결합하지 않고 산성 종은 컬럼 상에 머무르거나 관심 단백질과 비교해 구별되는 용리 프로파일을 갖도록, 선택된 pH 및 전도도로 작동한다. 이러한 하이브리드 전략의 맥락에서, 산성 종은 관심 단백질과 구별되는 방식으로, 예를 들어 관심 단백질 및 관심 단백질의 특정 응집체 및/또는 단편은 크로마토그래피 물질에 결합할 수 있고, 관심 단백질을 우선적으로 제거하는 세척액이 적용될 수 있는 방식으로, 크로마토그래피 물질(또는 관류)에 결합하게 된다. 그런 다음, 컬럼을 다음 사용 전에 재생시킨다.
소정의 구현예에서, 크로마토그래피 분리의 맥락에서, 적절한 완충액에서 제조된 크로마토그래피 지지 물질(예를 들어 CEX 수지)을 담기 위해 일반적으로 원통 형상의 크로마토그래피 장치가 사용된다. 크로마토그래피 장치가 원통형인 경우, 이 장치는 약 5 mm~약 2 mm의 직경, 및 5 cm~50 cm의 높이를 가질 수 있고, 소정의 구현예에서, 특히 대규모 처리를 위해, 30 cm 이상의 높이가 사용된다. 크로마토그래피 물질이 크로마토그래피 장치에 첨가된 후, 관심 단백질(예: 항체)을 함유하는 샘플를 크로마토그래피 수지와 접촉시켜 분리를 유도한다. 사용되는 CES 수지에 따라, 크로마토그래피 수지에 결합하지 않는 용액 중 임의의 부분, 예를 들어 관심 단백질 또는 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물-관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예를 들어 절반 항체), 하전된 변이체(예를 들어 산성 또는 염기성 종), 및/또는 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질)을 포함할 수 있는 임의의 부분은, 수지를 세척하고 분획을 수집함으로써 크로마토그래피 수지로부터 분리된다. 크로마토그래피 수지는 하나 이상의 세척 단계를 거칠 수 있다. 그런 다음, 원하는 경우, 크로마토그래피 수지에 결합된 용액의 임의의 성분을 탈착하거나 용리하도록 설계된 용액과 크로마토그래피 수지를 접촉시킬 수 있다.
소정의 구현예에서, 세척 단계는 로딩 조건과 유사한 조건을 사용하여 CEX 크로마토그래피의 맥락에서 수행되거나, 대안적으로 세척 완충액의 pH 및/또는 이온 강도/전도도를 단계적으로 또는 선형 구배 방식으로 변경함으로써 수행될 수 있다. 생성된 관류 분획 및 세척물 분획을 분석하고, 적절한 분획을 풀링하여 변이체 및/불순물의 원하는감소를 달성할 수 있다.
소정의 구현예에서, 로딩 완충액 및 세척 완충액 모두로서 사용된 수성 염 용액은 관심 단백질의 등전점(pI)에서의 pH보다 더 낮다. 소정의 구현예에서, 로딩 완충액과 세척 완충액의 pH는 단백질의 pI보다 약 0~5 단위 더 낮다. 소정의 구현예에서, 로딩 완충액과 세척 완충액의 pH는 단백질의 pI보다 약 1~2 단위 더 낮다. 소정의 구현예에서, 로딩 완충액과 세척 완충액의 pH는 단백질의 pI보다 약 1~1.5 단위 더 낮다.
소정의 구현예에서, 용리 완충액으로서 사용된 수성 염 용액은 관심 단백질의 등전점(pI)에서의 pH보다 더 높다. 소정의 구현예에서, 용리 완충액의 pH는 단백질의 pI보다 약 0~5 단위 더 높다. 소정의 구현예에서, 용리 완충액의 pH는 단백질의 pI보다 약 1~2 단위 더 높다. 소정의 구현예에서, 용리 완충액의 pH는 단백질의 pI보다 약 1~1.5 단위 더 높다.
소정의 구현예에서, 로딩 완충액, 세척 완충액, 또는 용리 완충액의 pH는 3.5~10.5, 약 4~10, 약 4.5~9.5, 약 5~9, 약 5.5~8.6, 약 6~8, 약 6.5~7.5, 약 6~7, 약 5~8, 약 4~7, 약 5~7, 약 5~6, 약 5~5.5이다. 소정의 구현예에서, 로딩 완충액, 세척 완충액, 또는 용리 완충액의 pH는 약 4.9, 5, 5.1, 5.15, 5.2, 5.25, 5.3, 5.35, 5.4, 5.45, 5.5, 5.55, 5.6, 5.65, 5.7, 5.75, 5.8, 5.85, 5.9, 5.95, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.5, 9, 9.5, , 또는 10이다.
CEX 방법에 사용하기에 적합한 완충액 시스템은 트리스 포름산염, 트리스 아세트산염, 황산암모늄, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 및 황산나트륨을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 소정의 구현예에서, 완충액의 전도도 및 pH는 양이온성 제제 또는 음이온성 제제의 농도를 증가시키거나 감소시킴으로써 조절된다. 소정의 비제한적인 구현예에서, 양이온성 제제는 나트륨, 트리스, 트로메탈민, 암모늄, 아르기닌, 히스티딘, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 비제한적인 구현예에서, 음이온성 제제는 포름산염, 아세트산염, 구연산염, 염화물 음이온, 황산염, 인산염, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 500 mM, 490 mM, 480 mM, 470 mM, 460 mM, 450 mM, 440 mM, 430 mM, 420 mM, 410 mM, 400 mM, 390 mM, 380 mM, 370 mM, 360 mM, 350 mM, 340 mM, 330 mM, 320 mM, 310 mM, 300 mM, 290 mM, 280 mM, 270 mM, 260 mM, 250 mM, 240 mM, 230 mM, 220 mM, 210 mM, 200 mM, 190 mM, 180 mM, 170 mM, 160 mM, 150 mM, 140 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM 또는 5 mM 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM, 약 40~60 mM의 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 40~60 mM의 아세트산나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 500 mM, 490 mM, 480 mM, 470 mM, 460 mM, 450 mM, 440 mM, 430 mM, 420 mM, 410 mM, 400 mM, 390 mM, 380 mM, 370 mM, 360 mM, 350 mM, 340 mM, 330 mM, 320 mM, 310 mM, 300 mM, 290 mM, 280 mM, 270 mM, 260 mM, 250 mM, 240 mM, 230 mM, 220 mM, 210 mM, 200 mM, 190 mM, 180 mM, 170 mM, 160 mM, 150 mM, 140 mM, 130 mM, 125mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 또는 5 mM의 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 약 50~60 mM, 약 50~250 mM, 약 50~150 mM, 또는 약 40~60 mM의 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 40~60 mM의 염화나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 50 mM의 아세트산나트륨, 약 55 mM의 염화나트륨, 및 약 5.35의 pH를 포함한다.
당업계에 공지된 임의의 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 본 발명의 조성물의 제조에 적합하다. 예시적인 CEX 수지는 설프하이드릴(XS), 설폰산염(S), 황산염, 카르복시메틸(CM), 설포에틸(SE), 설포프로필(SP), 인산염(P), 및 설폰산염(S)을 포함하지만, 이들로 한정되지는 않는다. 소정의 구현예에서, CEX 분리에 사용되는 수지는 POROS™ XS이다. POROS™ XS는 설포프로필 관능성을 갖는 가교 결합된 폴리(스티렌-디비닐벤젠)의 지지 매트릭스의 강한 양이온 교환체이다. 소정의 구현예에서, CEX 분리에 사용되는 수지는 Capto™ S Impact이다. Capto™ S Impact는 설포네이트기 및 중성 피롤리돈을 갖는 고유동 아가로스 매트릭스의 양이온 교환체이다. 소정의 구현예에서, CEX 분리에 사용되는 수지는 Toyopearl™ 황산염 650이다. Toyopearl™ 황산염 650은 특허받은 황산염 함유 리간드를 갖는 폴리메타크릴레이트 비드의 양이온 교환 수지이다. 소정의 구현예에서, CEX 분리에 사용되는 수지는 Toyopearl™ GigaGap CM 650M이다. Toyopearl™ CM GigaGap 650M은 더 많은 수의 양이온 결합 부위를 제공하도록 화학적으로 변형되었거나 카르복시메틸기로 관능화된, 폴리메타크릴레이트 비드로 이루어진 양이온 교환 수지이다. 추가의 CEX 수지는 Capto™ SP ImpRes, CM™ 세라믹 HyperD F 등급, Eshmuno™ S, Nuvia™ C Prime, Nuvia™ S, Poros™ HS; Poros™ HQ, Toyopearl™ GigaCap S 650M, Toyopearl™ MX Trp 650M을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. CEX 크로마토그래피는 본원에 기술된 MM 수지와 함께 사용될 수 있음을 유의한다.
소정의 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)은 약 10~100 g/L, 약 20~90 g/L, 약 30~80 g/L, 약 30~60 g/L, 약 40~70 g/L, 또는 약 50~60 g/L의 수준으로 양이온 교환 크로마토그래피 수지 상에 로딩된다. 소정의 구현예에서, 관심 단백질은 약 30~60 g/L의 수준으로 양이온 교환 크로마토그래피 수지 상에 로딩된다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 방법은 관심 단백질로부터 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 하전된 변이체(예: 산성 또는 염기성 종), 및/또는 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질)의 전부를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 본질적으로 제거하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 하전된 변이체(예: 산성 또는 염기성 종), 및/또는 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질)은 관류 분획과 세척물 분획으로 수집되고, 관심 단백질은 용리물 분획으로 농축되어 변이체 및/또는 불순물의 수준이 감소된 단백질 조성물이 생산된다.
소정의 구현예에서, CEX 크로마토그래피 단계로부터 수집된 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 또는 하전된 변이체(예: 산성 또는 염기성 종); 및/또는 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질)을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 25%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3.9%, 약 3.8%, 약 3.7%, 약 3.6%, 약 3.5%, 약 3.4%, 약 3.3%, 약 3.2%, 약 3.1%, 약 3%, 약 2.9%, 약 2.8%, 약 2.7%, 약 2.6%, 약 2.5%, 약 2.4%, 약 2.3%, 약 2.2%, 약 2.1%, 약 2%, 약 1.9%, 약 1.8%, 약 1.7%, 약 1.6%, 약 1.5%, 약 1.4%, 약 1.3%, 약 1.2%, 약 1.1%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~25%, 약 0.1~20%, 약 0.1~18%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18%, 또는 약 1~17%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 45%, 약 44%, 약 43%, 약 42%, 약 41%, 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 1~45%, 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~25%, 약 5~35%, 약 10~35%, 약 15~35%, 약 1~30%, 약 1~25%, 약 1~24%, 약 5~25%, 약 5~30%, 약 5~45%, 약 10~25%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 15~25%, 약 15~30%, 약 15~35%, 약 15~25%, 약 16~31%, 약 17~26%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16~41%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 초과의 (및 전술한 것 중 하나 이상 내의 범위의) 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 40~99%, 약 45~99%, 약 50~99%, 약 55~99%, 약 50~90%, 약 55~90%, 약 50~80%, 약 55~80%, 약 50~70%, 약 55~70%, 약 50~65%, 약 55~65%, 약 58~62%, 약 59~61%, 약 58~63%, 약 58~67%, 약 53~61%, 약 46~67%, 또는 약 46~66%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 주요 종, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.01~0.4%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 0.1~6%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 또는 0.3%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편, 예를 들어 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.1~1.1%, 약 0.1~0.8%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1% 또는 약 99.5% 초과의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 관심 단백질 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 94~99.9%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 관심 단백질의 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 1~3, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8, 또는 약 0.1~8 ppm의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) HCP를 포함한다.
소정의 구현예에서, CEX 크로마토그래피 단계의 로딩, pH, 전도도뿐만 아니라 용리 pH 및/또는 전도도는, 변이체 및/또는 불순물이 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)으로부터 이격되어 바람직하게 분포하도록 변형될 수 있다.
소정의 구현예에서, CEX 크로마토그래피 분리를 수행할 수 있고, 단지 전하 변이체 농도를 조절하는 것에 더하여 또는 그 대신에, 분획의 조합을 풀링하여 원하는 공정 관련 불순물 및/또는 생성물 관련 물질 수준의 조합을 달성할 수 있다.
소정의 구현예에서, UV, NIR, FTIR, 형광, Raman과 같은 분광법을 사용해 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질(예를 들어 관심 단백질의 전하 변이체, 응집체, 단편) 및/또는 공정 관련 불순물(예를 들어 숙주 세포 단백질)의 수준을 온라인, 앳라인, 또는 인라인 모드로 모니터링한 다음, CEX 유출물로부터 수집하여 모은 물질 중 변이체 및/또는 불순물의 수준을 조절할 수 있다. 소정의 구현예에서, 온라인, 앳라인, 또는 인라인 모니터링 방법을 크로마토그래피 단계의 유출 라인 상에서 또는 수집 용기 내에서 사용해 원하는 생성물 품질을 달성하거나 회수하는 것이 가능하다. 소정의 구현예에서, UV 신호는 적절한 생성물 품질을 달성하거나 회수를 위한 대리물로서 사용될 수 있으며, 여기서 UV 신호는 정상적인 공정 변동성을 해결하고 목표 생성물 품질을 달성할 수 있도록, 통합, 분화, 이동 평균과 같은 처리 기술(이에 한정되지는 않음)로 적절히 가공될 수 있다. 소정의 구현예에서, 이러한 측정은, 로드/세척물의 이온 농도/전도성을 피드백에 의해 조절함으로써 생성물 품질 관리를 용이하게 하도록 인라인 희석 방법과 조합될 수 있다.
하나의 기술이 다른 기술과 상보적/보충적 방식으로 사용되는 소정의 구현예를 포함하는 소정의 구현예에서, CEX 및 AEX 및/또는 MM 방법의 조합이 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 본 발명의 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조합은, 상기 조합이 원하는 최종 조성물/생성물 품질을 제공하도록 특정 하위 종이 하나의 기술에 의해 주로 제거되는 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조합은 원하는 생성물 품질을 달성하기 위해 추가의 크로마토그래피, 여과, 나노여과, 한외여과/정용여과(UF/DF) 단계의 사용을 포함한다.
음이온 교환 크로마토그래피
소정의 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)은 관심 단백질을 포함하는 샘플을 음이온 교환 분리 단계로 처리함으로써 생산된다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 단계는 전술한 친화도 크로마토그래피, 예를 들어 단백질 A 친화도 단계 후에 이루어진다. 일부 구현예에서, 음이온 교환 단계는 양이온 교환 단계 후에 이루어진다. 소정의 구현예에서, 음이온 교환 단계는 양이온 교환 단계 전에 이루어진다.
위에서 상세히 논의된 양이온 교환 물질과 같은 양이온 교환 물질 대비 음이온 교환 물질을 사용하는 것은 주어진 용액 내 관심 단백질의 국소 전하에 기초한다. 따라서, 양이온 교환 단계를 사용하기 전에 음이온 교환 단계를 사용하는 것, 또는 음이온 교환 단계를 사용하기 전에 양이온 교환 단계를 사용하는 것은 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 음이온 교환 단계만 사용하는 것, 양이온 교환 단계만 사용하는 것, 또는 이 두가지를 임의의 연속 조합으로 사용하는 것(하나의 이온 교환 단계 또는 두가지 이온 교환 단계 모두와 본원에 기술된 다른 크로마토그래피 분리 기술과의 연속 조합으로 사용하는 것 포함)은 본 발명의 범주에 포함된다.
분리를 수행함에 있어서, 다양한 기술 중 어느 하나를 사용해, 예를 들어 전술한 것과 같은 회분 정제 기술 또는 크로마토그래피 기술을 사용해 초기 단백질 조성물을 음이온 교환 물질과 접촉시킬 수 있다.
소정의 구현예에서, 로딩 완충액 및 세척 완충액 모두로서 사용된 수성 염 용액은 관심 단백질의 등전점(pI)에서의 pH이거나 이에 가깝다. 소정의 구현예에서, 로딩 완충액과 세척 완충액의 pH는 관심 단백질의 pI보다 약 0~2 단위 더 높거나 낮다. 소정의 구현예에서, 로딩 완충액과 세척 완충액의 pH는 관심 단백질의 pI보다 약 0~0.5 단위 더 높거나 낮다. 소정의 구현예에서, 로딩 완충액과 세척 완충액의 pH는 관심 단백질의 pI에서의 pH이다.
소정의 구현예에서, 로딩 완충액, 세척 완충액, 또는 용리 완충액의 pH는 약 5.9~6.1, 3.5~10.5, 약 4~10, 약 4.5~9.5, 약 5~9, 약 5.5~8.6, 약 6~8, 약 6.5~7.5, 약 6~7, 약 5~8, 약 4~7, 약 5~7, 약 5~6, 약 5~5.5이다. 소정의 구현예에서, 로딩 완충액, 세척 완충액, 또는 용리 완충액의 pH는 약 5, 5.1, 5.15, 5.2, 5.25, 5.3, 5.35, 5.4, 5.45, 5.5, 5.55, 5.6, 5.65, 5.7, 5.75, 5.8, 5.85, 5.9, 5.95, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8, 8.5, 9, 9.5, 또는 10이다.
AEX 방법에 사용하기에 적합한 완충액 시스템은 피리딘, 피페라진, L-히스티딘, 비스-트리스, 비스-트리스 프로판, 이미다졸, N-에틸모르폴린, TEA(트리에탄올아민), 트리스, 모르폴린, N-메틸디에탄올아민, AMPD(2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올), 디에탄올아민, 에탄올아민, AMP(2-아미노-2-메틸-1-프로판올), 피페라진, 1,3-디아미노프로판, 피페리딘을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 소정의 구현예에서, 완충액의 전도도 및 pH는 양이온성 제제 또는 음이온성 제제의 농도를 증가시키거나 감소시킴으로써 조절된다. 소정의 비제한적인 구현예에서, 양이온성 제제는 나트륨, 트리스, 트로메탈민, 암모늄, 아르기닌, 히스티딘, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 비제한적인 구현예에서, 음이온성 제제는 포름산염, 아세트산염, 구연산염, 염화물 음이온, 황산염, 인산염, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 500 mM, 490 mM, 480 mM, 470 mM, 460 mM, 450 mM, 440 mM, 430 mM, 420 mM, 410 mM, 400 mM, 390 mM, 380 mM, 370 mM, 360 mM, 350 mM, 340 mM, 330 mM, 320 mM, 310 mM, 300 mM, 290 mM, 280 mM, 270 mM, 260 mM, 250 mM, 240 mM, 230 mM, 220 mM, 210 mM, 200 mM, 190 mM, 180 mM, 170 mM, 160 mM, 150 mM, 140 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 또는 5 mM의 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM, 약 40~60 mM의 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 40~60 mM의 아세트산나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 500 mM, 490 mM, 480 mM, 470 mM, 460 mM, 450 mM, 440 mM, 430 mM, 420 mM, 410 mM, 400 mM, 390 mM, 380 mM, 370 mM, 360 mM, 350 mM, 340 mM, 330 mM, 320 mM, 310 mM, 300 mM, 290 mM, 280 mM, 270 mM, 260 mM, 250 mM, 240 mM, 230 mM, 220 mM, 210 mM, 200 mM, 190 mM, 180 mM, 170 mM, 160 mM, 150 mM, 140 mM, 135 mM, 130 mM, 125mM, 120 mM, 115 mM, 110 mM, 105 mM, 100 mM, 95 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM , 또는 5 mM의 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 약 50~250 mM, 약 50~170 mM, 약 50~60 mM, 또는 약 40~60 mM의 염화나트륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 40~60 mM의 염화나트륨을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 500 mM, 490 mM, 480 mM, 470 mM, 460 mM, 450 mM, 440 mM, 430 mM, 420 mM, 410 mM, 400 mM, 390 mM, 380 mM, 370 mM, 360 mM, 350 mM, 340 mM, 330 mM, 320 mM, 310 mM, 300 mM, 290 mM, 280 mM, 270 mM, 260 mM, 250 mM, 240 mM, 230 mM, 220 mM, 210 mM, 200 mM, 190 mM, 180 mM, 170 mM, 160 mM, 150 mM, 140 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 또는 5 mM의 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM, 약 40~60 mM의 히스티딘을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 40~60 mM의 히스티딘을 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 500 mM, 490 mM, 480 mM, 470 mM, 460 mM, 450 mM, 440 mM, 430 mM, 420 mM, 410 mM, 400 mM, 390 mM, 380 mM, 370 mM, 360 mM, 350 mM, 340 mM, 330 mM, 320 mM, 310 mM, 300 mM, 290 mM, 280 mM, 270 mM, 260 mM, 250 mM, 240 mM, 230 mM, 220 mM, 210 mM, 200 mM, 190 mM, 180 mM, 170 mM, 160 mM, 150 mM, 140 mM, 130 mM, 120 mM, 110 mM, 100 mM, 90 mM, 85 mM, 80 mM, 75 mM, 70 mM, 65 mM, 60 mM, 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 또는 5 mM의 비스-트리스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 약 50~60 mM, 또는 약 40~60 mM의 비스-트리스를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 40~60 mM의 비스-트리스를 포함한다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 약 50 mM의 히스티딘, 약 105 mM의 염화나트륨, 및 약 6의 pH를 포함한다.
충진된 음이온-교환 크로마토그래피 컬럼, 음이온-교환 막 장치, 음이온-교환 모놀리식 장치, 또는 심층 필터 매체는 결합-용출 모드, 관류 모드, 또는 하이브리드 모드로 작동될 수 있고(여기서 생성물은 크로마토그래피 물질에 대한 결합을 나타냄), 로딩 완충액과 동일하거나 실질적으로 유사한 완충액을 사용하여 컬럼으로부터 세척될 수 있다. 결합-용리 모드에서, 먼저 컬럼 또는 막 장치는, 특정 단백질이 수지 기반 매트릭스 상에 고정되는 조건 하에서, 적절한 이온 강도 및 pH를 갖는 완충액으로 컨디셔닝된다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, 공급물을 로딩하는 동안, 관심 단백질은 정전기 인력으로 인해 수지에 흡착되게 된다. 컬럼 또는 막 장치를 평형화 완충액 또는 상이한 pH 및/또는 전도도를 갖는 다른 완충액으로 세척한 후, 음이온 교환 매트릭스의 하전된 부위에 대한 용질과 경쟁할 용리 완충액의 이온 강도(즉, 전도도)를 증가시킴으로써 생성물 회수를 달성한다. pH를 변화시켜 용질의 전하를 변경하는 것은 용질의 용리를 달성하는 또 다른 방법이다. 전도도 또는 pH의 변화는 점진적이거나(구배 용리) 또는 단계적(단계 용리)일 수 있다. 관류 모드에서, 컬럼 또는 막 장치는, 관심 단백질이 수지 또는 막에 결합하지 않고 산성 종은 컬럼 상에 머무르거나 관심 단백질과 비교해 구별되는 용리 프로파일을 갖도록, 선택된 pH 및 전도도로 작동한다. 이러한 하이브리드 전략의 맥락에서, 산성 종은 관심 단백질과 구별되는 방식으로, 예를 들어 관심 단백질 및 관심 단백질의 특정 응집체 및/또는 단편은 크로마토그래피 물질에 결합할 수 있고, 관심 단백질을 우선적으로 제거하는 세척액이 적용될 수 있는 방식으로, 크로마토그래피 물질(또는 관류)에 결합하게 된다. 그런 다음, 컬럼을 다음 사용 전에 재생시킨다.
당업계에 공지된 임의의 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 본 발명의 조성물의 제조에 적합하다. AEX 수지의 비제한적인 예는 디에틸아미노에틸(DEAE) 기, 4차 아미노에틸(QAE) 기, 및 4차 아민(Q) 기를 포함한다. 소정의 구현예에서, AEX 분리에 사용되는 수지는 POROS™ XQ이다. POROS™ XQ는 4차 아민으로 관능화된 가교 결합된 폴리(스티렌-디비닐벤젠)의 지지 매트릭스의 강한 음이온 교환체이다. 소정의 구현예에서, AEX 분리에 사용되는 수지는 Capto™ Q ImRes이다. Capto™ QTM ImRes는 4차 아민으로 관능화된 고유동 아가로오스 수지의 강력한 음이온 교환체이다. 추가의 비제한적인 예는 다음을 포함한다: POROS™ 50PI, POROS™ 50HQ, Capto™ DEAE, Toyopearl™ QAE-550, Toyopearl™ DEAE-650, Toyopearl™ GigaCap Q-650, Fractogel® EMD TMAE Hicap, Sartobind STIC® PA nano, Sartobind Q nano; CUNO™ BioCap, 및 X0HC.
소정의 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)은 약 10~100 g/L, 약 20~90 g/L, 약 30~80 g/L, 약 40~70 g/L, 또는 약 50~60 g/L의 수준으로 음이온 교환 크로마토그래피 수지 상에 로딩된다. 소정의 구현예에서, 관심 단백질은 약 50~60 g/L의 수준으로 음이온 교환 크로마토그래피 수지 상에 로딩된다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 방법은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)로부터 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 하전된 변이체(예: 산성 또는 염기성 종), 및/또는 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질)의 전부를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 본질적으로 제거하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 하전된 변이체(예: 산성 또는 염기성 종), 및/또는 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질)은 관류 분획과 세척물 분획으로 수집되고, 관심 단백질은 용리물 분획으로 농축되어 변이체 및/또는 불순물의 수준이 감소된 단백질 조성물이 생산된다.
소정의 구현예에서, AEX 크로마토그래피 단계로부터 수집된 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 또는 하전된 변이체(예: 산성 또는 염기성 종); 및/또는 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질)을 포함한다. 일부 구현예에서,
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 25%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3.9%, 약 3.8%, 약 3.7%, 약 3.6%, 약 3.5%, 약 3.4%, 약 3.3%, 약 3.2%, 약 3.1%, 약 3%, 약 2.9%, 약 2.8%, 약 2.7%, 약 2.6%, 약 2.5%, 약 2.4%, 약 2.3%, 약 2.2%, 약 2.1%, 약 2%, 약 1.9%, 약 1.8%, 약 1.7%, 약 1.6%, 약 1.5%, 약 1.4%, 약 1.3%, 약 1.2%, 약 1.1%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~25%, 약 0.1~20%, 약 0.1~18%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18%, 또는 약 1~17%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 45%, 약 44%, 약 43%, 약 42%, 약 41%, 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 1~45%, 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~25%, 약 5~35%, 약 10~35%, 약 15~35%, 약 1~30%, 약 1~25%, 약 1~24%, 약 5~25%, 약 5~30%, 약 5~45%, 약 10~25%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 15~25%, 약 15~30%, 약 15~35%, 약 15~25%, 약 16~31%, 약 17~26%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16~41%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 초과의 (및 전술한 것 중 하나 이상 내의 범위의) 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 40~99%, 약 45~99%, 약 50~99%, 약 55~99%, 약 50~90%, 약 55~90%, 약 50~80%, 약 55~80%, 약 50~70%, 약 55~70%, 약 50~65%, 약 55~65%, 약 58~62%, 약 59~61%, 약 58~63%, 약 58~67%, 약 53~61%, 약 46~67%, 또는 약 46~66%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 주요 종, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.01~0.4%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 0.1~6%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 또는 0.3%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편, 예를 들어 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.1~1.1%, 약 0.1~0.8%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1% 또는 약 99.5% 초과의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 관심 단백질 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 94~99.9%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 관심 단백질의 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 1~3, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8, 또는 약 0.1~8 ppm의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) HCP를 포함한다.
소정의 구현예에서, AEX 크로마토그래피 단계의 로딩, pH, 전도도뿐만 아니라 용리 pH 및/또는 전도도는, 변이체 및/또는 불순물이 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)으로부터 이격되어 바람직하게 분포하도록 변형될 수 있다.
소정의 구현예에서, AEX 크로마토그래피 분리를 수행할 수 있고, 단지 전하 변이체 농도를 조절하는 것에 더하여 또는 그 대신에, 분획의 조합을 풀링하여 원하는 공정 관련 불순물 및/또는 생성물 관련 물질 수준의 조합을 달성할 수 있다.
소정의 구현예에서, UV, NIR, FTIR, 형광, Raman과 같은 분광법을 사용해 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질(예를 들어 관심 단백질의 전하 변이체, 응집체, 단편) 및/또는 공정 관련 불순물(예를 들어 숙주 세포 단백질)의 수준을 온라인, 앳라인, 또는 인라인 모드로 모니터링한 다음, AEX 유출물로부터 수집하여 모은 물질 중 변이체 및/또는 불순물의 수준을 조절할 수 있다. 소정의 구현예에서, 온라인, 앳라인, 또는 인라인 모니터링 방법을 크로마토그래피 단계의 유출 라인 상에서 또는 수집 용기 내에서 사용해 원하는 생성물 품질을 달성하거나 회수하는 것이 가능하다. 소정의 구현예에서, UV 신호는 적절한 생성물 품질을 달성하거나 회수를 위한 대리물로서 사용될 수 있으며, 여기서 UV 신호는 정상적인 공정 변동성을 해결하고 목표 생성물 품질을 달성할 수 있도록, 통합, 분화, 이동 평균과 같은 처리 기술(이에 한정되지는 않음)로 적절히 가공될 수 있다. 소정의 구현예에서, 이러한 측정은, 로드/세척물의 이온 농도/전도성을 피드백에 의해 조절함으로써 생성물 품질 관리를 용이하게 하도록 인라인 희석 방법과 조합될 수 있다.
하나의 기술이 다른 기술과 상보적/보충적 방식으로 사용되는 소정의 구현예를 포함하는 소정의 구현예에서, CEX 및 AEX 및/또는 MM 방법의 조합이 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 본 발명의 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조합은, 상기 조합이 원하는 최종 조성물/생성물 품질을 제공하도록 특정 하위 종이 하나의 기술에 의해 주로 제거되는 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조합은 원하는 생성물 품질을 달성하기 위해 추가의 크로마토그래피, 여과, 나노여과, 한외여과/정용여과(UF/DF) 단계의 사용을 포함한다.
혼합 모드 크로마토그래피
혼합 모드(“MM”) 크로마토그래피 컬럼, 막 장치, 모놀리식 장치, 또는 심층 필터 매체가 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 본 발명의 조성물을 제조하는 데 사용될 수도 있다. 본원에서 “다중모드 크로마토그래피”로도 지칭되는 혼합 모드 크로마토그래피는, 결합할 물질과 상호 작용하는 적어도 2개의 상이한 (소정의 구현예에서는) 협력적인 부위를 제공할 수 있는 리간드를 포함하는 지지체를 이용하는 크로마토그래피 전략이다. 소정의 구현예에서, 이들 부위 중 하나는 리간드와 관심 물질 사이에 매력적인 유형의 전하-전하 상호작용을 제공하고, 다른 하나의 부위는 전자 수용체-공여자 상호작용 및/또는 소수성 및/또는 친수성 상호작용을 제공한다. 전자 공여자-수용자 상호작용은 수소 결합, π-π, 양이온- π, 전하 전달, 양극-양극, 유도된 양극 등과 같은 상호작용을 포함한다.
당업계에 공지된 임의의 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 본 발명의 조성물을 제조하는 데 적합하다. 소정의 구현예에서, 혼합 모드 분리에 사용되는 수지는 Capto™ MMC ImRes이다. Capto™ MMC ImpRes는 카르복시 및 하이드록실 리간드를 갖는 고유동 아가로스의 염기 매트릭스를 갖는 다중모드 기능을 갖춘 약한 양이온 교환체이다. 소정의 구현예에서, 혼합 모드 분리에 사용되는 수지는 Capto™ Adhere ImRes 및/또는 Capto™ Adhere이다. Capto™ Adhere ImpRes 및 Capto™ Adhere는 다중모드 기능을 갖춘 강력한 음이온 교환체이다. 염기 매트릭스는 리간드(N-벤질-N-메틸 에탄올 아민)와 고도로 가교 결합된 아가로스이며, 상호작용, 예컨대 이온 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용을 위한 많은 기능을 나타낸다. 소정의 구현예에서, 혼합 모드 분리에 사용되는 수지는 PPA-HyperCel 및 HEA-HyperCel로부터 선택된다. PPA-HyperCel 및 HEA-HyperCel의 염기 매트릭스는 고 다공성 가교 결합된 셀룰로오스이다. 이들의 리간드는 각각 페닐프로필아민 및 헥실아민이다. 페닐프로필아민 및 헥실아민은 단백질 분리를 위한 상이한 선택성 및 소수성 옵션을 제공한다. 추가적인 혼합 모드 크로마토그래피 지지체는 Nuvia™ C Prime, Toyo Pearl™ MX Trp 650M, 및 Eshmuno® HCX를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
소정의 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는, 가끔 염기 매트릭스로서 표시되는 유기 또는 무기 지지체에 직접 또는 스페이서를 통해 결합된 리간드로 구성된다. 지지체는 입자, 예컨대 본질적으로 구형 입자, 모놀리스, 필터, 막, 표면, 모세관 등의 형태일 수 있다. 소정의 구현예에서, 지지체는 고유 중합체, 예컨대 가교 결합된 탄수화물 물질, 예컨대 아가로스, 한천, 셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 곤약(konjac), 카라기난, 겔란, 알긴산염 등으로부터 제조된다. 높은 흡착 용량을 얻기 위해, 지지체는 다공성일 수 있는데, 그러면 리간드는 외부 표면 뿐만 아니라 기공 표면에도 결합된다. 이러한 고유 중합체 지지체는 역 현탁 겔화(S Hjerten: Biochim Biophys Acta 79(2), 393-398 (1964))와 같은 표준 방법에 따라 제조될 수 있다. 대안적으로, 지지체는 합성 중합체, 예컨대 가교 결합된 합성 중합체, 예를 들어 스티렌 또는 스티렌 유도체, 디비닐벤젠, 아크릴아미드, 아크릴레이트 에스테르, 메타크릴레이트 에스테르, 비닐 에스테르, 비닐 아미드 등으로부터 제조될 수 있다. 이러한 합성 중합체는 표준 방법에 따라 생산될 수 있다(예를 들어, “Styrene based polymer supports developed by suspension polymerization" (R Arshady: Chimica e L'Industria 70(9), 70-75 (1988) 참조). 다공성 고유 또는 합성 중합체 지지체는 Amersham Biosciences(Uppsala, Sweden)와 같은 상업적 공급원으로부터 입수도 가능하다.
소정의 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)은 약 10~100 g/L, 약 20~90 g/L, 약 30~60 g/L, 약 30~80 g/L, 약 40~70 g/L, 또는 약 50~60 g/L의 수준으로 혼합 모드 크로마토그래피 수지 상에 로딩된다. 소정의 구현예에서, 관심 단백질은 약 50~60 g/L의 수준으로 혼합 모드 크로마토그래피 수지 상에 로딩된다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 방법은 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)로부터 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 하전된 변이체(예: 산성 또는 염기성 종), 및/또는 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질)의 전부를 선택적으로 제거하거나, 유의하게 감소시키거나, 본질적으로 제거하는 데 사용될 수 있으며, 여기서 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 하전된 변이체(예: 산성 또는 염기성 종), 및/또는 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질)은 관류 분획과 세척물 분획으로 수집되고, 관심 단백질은 용리물 분획으로 농축되어 변이체 및/또는 불순물의 수준이 감소된 단백질 조성물이 생산된다.
소정의 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 단계로부터 수집된 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 감소된 수준의 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질, 예를 들어 단백질 응집체, 단편(예: 절반 항체), 또는 하전된 변이체(예: 산성 또는 염기성 종); 및/또는 공정 관련 불순물(예: 숙주 세포 단백질)을 포함한다. 일부 구현예에서,
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 25%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3.9%, 약 3.8%, 약 3.7%, 약 3.6%, 약 3.5%, 약 3.4%, 약 3.3%, 약 3.2%, 약 3.1%, 약 3%, 약 2.9%, 약 2.8%, 약 2.7%, 약 2.6%, 약 2.5%, 약 2.4%, 약 2.3%, 약 2.2%, 약 2.1%, 약 2%, 약 1.9%, 약 1.8%, 약 1.7%, 약 1.6%, 약 1.5%, 약 1.4%, 약 1.3%, 약 1.2%, 약 1.1%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~25%, 약 0.1~20%, 약 0.1~18%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18%, 또는 약 1~17%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 절반 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 산성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 45%, 약 44%, 약 43%, 약 42%, 약 41%, 약 40%, 약 39%, 약 38%, 약 37%, 약 36%, 약 35%, 약 34%, 약 33%, 약 32%, 약 31%, 약 30%, 약 29%, 약 28%, 약 27%, 약 26%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1% 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 1~45%, 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~25%, 약 5~35%, 약 10~35%, 약 15~35%, 약 1~30%, 약 1~25%, 약 1~24%, 약 5~25%, 약 5~30%, 약 5~45%, 약 10~25%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 15~25%, 약 15~30%, 약 15~35%, 약 15~25%, 약 16~31%, 약 17~26%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16~41%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 염기성 종을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99% 초과의 (및 전술한 것 중 하나 이상 내의 범위의) 주요 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 40~99%, 약 45~99%, 약 50~99%, 약 55~99%, 약 50~90%, 약 55~90%, 약 50~80%, 약 55~80%, 약 50~70%, 약 55~70%, 약 50~65%, 약 55~65%, 약 58~62%, 약 59~61%, 약 58~63%, 약 58~67%, 약 53~61%, 약 46~67%, 또는 약 46~66%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 주요 종, 예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.01~0.4%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 0.1~6%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 고분자량 응집체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 또는 0.3%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편, 예를 들어 항체 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.1~1.1%, 약 0.1~0.8%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 단백질 단편을 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1% 또는 약 99.5% 초과의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 관심 단백질 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 94~99.9%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 관심 단백질의 단량체, 예를 들어 항체 단량체를 포함한다.
일부 구현예에서, 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 용리물 분획은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) 숙주 세포 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 용리물 분획은 약 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 1~3, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8, 또는 약 0.1~8 ppm의 (및 전술한 것 중 하나 이상 이내의 범위의) HCP를 포함한다.
소정의 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 단계의 로딩, pH, 전도도뿐만 아니라 용리 pH 및/또는 전도도는, 변이체 및/또는 불순물이 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)으로부터 이격되어 바람직하게 분포하도록 변형될 수 있다.
소정의 구현예에서, 혼합 모드 크로마토그래피 분리를 수행할 수 있고, 단지 전하 변이체 농도를 조절하는 것에 더하여 또는 그 대신에, 분획의 조합을 풀링하여 원하는 공정 관련 불순물 및/또는 생성물 관련 물질 수준의 조합을 달성할 수 있다.
소정의 구현예에서, UV, NIR, FTIR, 형광, Raman과 같은 분광법을 사용해 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질(예를 들어 관심 단백질의 전하 변이체, 응집체, 단편) 및/또는 공정 관련 불순물(예를 들어 숙주 세포 단백질)의 수준을 온라인, 앳라인, 또는 인라인 모드로 모니터링한 다음, 혼합 모드 유출물로부터 수집하여 모은 물질 중 변이체 및/또는 불순물의 수준을 조절할 수 있다. 소정의 구현예에서, 온라인, 앳라인, 또는 인라인 모니터링 방법을 크로마토그래피 단계의 유출 라인 상에서 또는 수집 용기 내에서 사용해 원하는 생성물 품질을 달성하거나 회수하는 것이 가능하다. 소정의 구현예에서, UV 신호는 적절한 생성물 품질을 달성하거나 회수를 위한 대리물로서 사용될 수 있으며, 여기서 UV 신호는 정상적인 공정 변동성을 해결하고 목표 생성물 품질을 달성할 수 있도록, 통합, 분화, 이동 평균과 같은 처리 기술(이에 한정되지는 않음)로 적절히 가공될 수 있다. 소정의 구현예에서, 이러한 측정은, 로드/세척물의 이온 농도/전도성을 피드백에 의해 조절함으로써 생성물 품질 관리를 용이하게 하도록 인라인 희석 방법과 조합될 수 있다.
하나의 기술이 다른 기술과 상보적/보충적 방식으로 사용되는 소정의 구현예를 포함하는 소정의 구현예에서, CEX 및 AEX 및/또는 혼합 모드 방법의 조합이 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 본 발명의 조성물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조합은, 상기 조합이 원하는 최종 조성물/생성물 품질을 제공하도록 특정 하위 종이 하나의 기술에 의해 주로 제거되는 방식으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 조합은 원하는 생성물 품질을 달성하기 위해 추가의 크로마토그래피, 여과, 나노여과, 한외여과/정용여과(UF/DF) 단계의 사용을 포함한다.
바이러스 여과 / 나노여과
본 발명의 소정의 구현예는 바이러스 로드를 감소시키고 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어, 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 농축시키기 위한 나노여과 단계를 사용한다. 중간체/최종 연마 크로마토그래피 단계 후, 용리물 풀은 나노여과 단계를 거칠 수 있다. 일 구현예에서, 나노여과 단계는 하나 이상의 나노필터 또는 바이러스 필터를 통해 달성된다. 특정 구현예에서, 나노여과 단계는 프리필터 및 나노필터 또는 바이러스 필터로 이루어진 필터 트레인을 통해 달성될 수 있다. 필터는 이러한 목적에 유용한 것으로 당업계에 알려진 임의의 필터일 수 있으며, 예를 들어 EMD Millipore Viresolve VPro, Viresolve NFP, Viresolve NFR, Pellicon, 또는 Millipak 필터, Sartorius Vivaspin , ViroStart CPV, 또는 Sartopore 필터, Pall Ultipor DVD, DV50, DV20 필터, 또는 Planova 15N, 20N, 및 35N 바이러스 제거 필터(Asashi Kasei Pharma)를 포함할 수 있다. 소정의 구현예에서, 나노여과 필터는 약 15 nm 내지 약 200 nm의 평균 기공 크기를 갖는다. 특정 구현예에서, 나노필터는 약 15 nm 내지 약 72 nm, 또는 약 19 nm 내지 약 35 nm, 또는 약 15 nm, 19 nm, 35 nm, 또는 72 nm의 평균 기공 크기를 가질 수 있다. 당업자는, 필터의 유형 및 수의 선택이 가공되는 샘플의 부피 및 원하는 여과 성능에 따라 달라질 것임을 이해할 것이다.
한외여과/정용여과
본 발명의 소정의 구현예는 관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어, 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 추가로 농축시키고 제형화하기 위한 한외여과 및 정용여과 단계를 사용한다. 나노여과 단계 후, 목표 원료 의약품 농도 및 완충액 조건을 달성하기 위한 한외여과 및 정용여과가 제형화 전에 이어질 수 있다.
한외여과는 다음에 상세히 기술되어 있다: Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman 및 A. Zydney(Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1996); 및: Ultrafiltration Handbook, Munir Cheryan (Technomic Publishing, 1986; ISBN No. 87762-456-9). 하나의 여과 공정은 “Pharmaceutical Process Filtration Catalogue”라는 제목의 Millipore 카탈로그 pp. 177~202(Bedford, Mass., 1995/96)에 기술된 것과 같은 접선 유동 여과이다. 한외여과는 일반적으로 기공 크기가 0.1 μm 미만인 필터를 사용하는 여과를 의미하는 것으로 간주된다. 이렇게 작은 기공 크기를 갖는 필터를 사용함으로써, 필터 막 기공을 통해 샘플 완충액을 투과시키고, 단백질(예: 항체)은 막 표면 위에 머물게 하여, 샘플 부피를 감소시킬 수 있다.
정용여과는 염류, 당류, 및 비수성 용매를 제거 및 교환하고; 결합된 종으로부터 유리물을 분리시키고; 저 분자량 종을 제거하고/하거나; 이온 및/또는 pH 환경의 신속한 변화를 유발하기 위해 막 필터를 사용하는 방법이다. 미세용질은, 정용여과되는 용액에 투과물 유속과 거의 동일한 속도로 용매를 첨가함으로써 가장 효율적으로 제거된다. 이는 용액으로부터 미세 종을 일정 부피로 세척하여, 유지된 관심 단백질을 효과적으로 정제한다. 본 발명의 소정의 구현예에서, 임의로 추가의 크로마토그래피 또는 다른 정제 단계 이전에, 본 발명과 관련하여 사용되는 다양한 완충액을 교환하는 것 뿐만 아니라, 단백질 제제로부터 불순물을 제거하는 것을 위해서도 정용여과 단계가 사용된다.
당업자는 UF/DF 작업에 적합한 막 필터 장치를 선택할 수 있다. 본 발명에 적합한 막 카세트의 예는, 10 kD, 30kD, 또는 50 kD 막을 갖는 Pellicon 2 또는 Pellicon 3 카세트(EMD Millipore), Kvick 10 kD, 30 kD, 또는 50 kD 막 카세트(GE Healthcare), 및 Centramate 또는 Centrasette 10 kD, 30 kD, 또는 50 kD 카세트(Pall Corporation)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
정용여과 단계가 완료된 후, 용액의 단백질 농도는 투석 완충액을 사용해 제형에 대해 약 5% 내지 약 20%(w/v), 또는 약 10% 내지 약 20%(w/v); 또는 약 15% 내지 약 20%(w/v); 또는 약 18% 내지 약 20%(w/v)의 최종 농도로 조정되거나, 약 5%, 또는 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 또는 20%의 최종 농도로 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, 제형화된 용액은, 프리 필터가 있거나 없는 상태에서, 먼저 0.2 미크론 이하의 절대 기공 크기를 갖는 막 필터를 통해 추가로 여과함으로써, 추가로 멸균될 수 있다. 그런 다음, 용액을 적절한 밀봉을 위해 최종 용기에 무균적으로 분배하고, 시험을 위해 샘플을 채취한다.
예시적인 정제 전략
소정의 구현예에서, 일차 회수는 생산 바이오리액터 수확물로부터 세포 및 세포 잔해(HCP 포함)를 제거하기 위해 pH 감소, 원심분리, 및 여과 단계를 순차적으로 사용함으로써 진행될 수 있다. 소정의 구현예에서, 본 발명은 상기 샘플로부터의 샘플 혼합물을 하나 이상의 친화도(예: 단백질 A), AEX, CEX, 및/또는 MM 정제 단계로 처리하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 소정의 구현예는 추가의 정제 단계를 포함할 수 있는데, 이 단계는 친화도 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 단계 이전에, 도중에, 또는 이후에 수행될 수 있다. 추가 정제 절차의 예는 에탄올 침강, 등전점 전기영동, 역상 HPLC, 실리카를 이용한 크로마토그래피, 헤파린 Sepharose™을 이용한 크로마토그래피, 추가의 음이온 교환 크로마토그래피 및/또는 추가의 양이온 교환 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 황산암모늄 침강, 수산화인회석 크로마토그래피, 겔 전기영동, 및 투석을 포함한다.
소정의 구현예에서, 미결합 관류 분획 및 세척물 분획은 추가로 분획될 수 있고, 목표 생성물 순도를 제공하는 분획의 조합이 풀링될 수 있다.
소정의 구현예에서, 단백질 농도는, 순도 및/또는 수율이 추가로 개선될 수 있도록, 항체 생성물과 변이체 및/또는 불순물, 예를 들어 생성물 관련 물질 및/또는 공정 관련 불순물 사이의 차등 분할 거동을 달성하도록 조정될 수 있다. 소정의 구현예에서, 로딩은 임의의 특정 정제 단계의 생성물 품질/수율을 개선하기 위해 로딩 작업 동안 상이한 단백질 농도로 수행될 수 있다. 소정의 구현예에서, 컬럼 온도는 임의의 특정 정제 단계의 분리 효율 및/또는 수율을 개선하기 위해 독립적으로 변화될 수 있다.
소정의 구현예에서, 로딩, 세척, 및/또는 용리 완충액 매트릭스는 상이하거나 화학물질의 혼합물로 구성될 수 있지만, 유사한 “수지 상호작용”을 달성할 수 있어서, 상기 신규한 분리가 이루어질 수 있다. 예를 들어, 한정하는 것은 아니지만, 로딩 및 세척 완충액은 이온 강도 또는 pH의 관점에서 상이할 수 있지만, 세척 단계 동안 달성된 제품의 세척의 관점에서 그 기능이 실질적으로 유사하게 유지된다.
소정의 구현예에서, 로딩, 세척, 및/또는 용리 단계는 목표 생성물 품질 및/또는 수율을 달성하기 위해, 컬럼 유출물 또는 수집된 풀 또는 둘 다에서 변이체 및/또는 불순물 수준, 예를 들어 생성물 관련 물질 수준 및/또는 공정 관련 불순물 수준의 인라인, 앳라인, 또는 오프라인 측정에 의해 조절될 수 있다. 소정의 구현예에서, 로딩 농도는, 분리 효율 및/또는 수율을 개선하는 데 필요한 분할를 달성하기 위한 완충액 또는 다른 용액을 이용한 인라인 희석 또는 회분 희석 또는 연속 희석에 의해 동적으로 조절될 수 있다.
V. 샘플 순도 검정 방법
하전된 변이체의 검정
본원에 기술된 기술을 사용하여 생산된 크로마토그래피 샘플에서 하전된 변이체, 예를 들어 산성 또는 염기성 종의 수준은 당업계에 공지된 임의의 하전 기반 분리 기술에 의해 분석될 수 있다. 예를 들어, 하전된 변이체, 예를 들어 산성 종, 또는 염기성 종은 등전성 포커싱(IEF) 겔 전기영동, 모세관 등전성 포커싱(cIEF) 겔 전기영동, 양이온 교환 크로마토그래피(CEX), 및 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)와 같은 하전 기반 분리 기술에 의해 검출될 수 있다.
항체를 IEF 기반 방법을 사용해 분석할 때, 산성 종은 겉보기 pI가 낮은 변이체이고 염기성 종은 겉보기 pI가 높은 변이체이다. 크로마토그래피 기반 방법에 의해 분석될 경우, 산성 종 및 염기성 종은 주 피크에 대한 이들의 유지 시간에 기초하여 정의된다. 산성 종은 CEX에서 주 피크보다 먼저 용리되거나 AEX에서 주요 피크보다 늦게 용리되는 변이체이며, 염기성 종은 CEX에서 주요 피크보다 늦게 용리되거나 AEX에서 주요 피크보다 먼저 용리되는 변이체이다.
소정의 구현예에서, 하전된 변이체는 이온 교환 크로마토그래피 단계에 의해 검정된다. 일부 구현예에서, 정량화는 검출된 피크의 상대 면적 백분율에 기초한다.
크기 변이체의 검정
소정의 구현예에서, 본원에 기술된 기술을 사용하여 생산된 크로마토그래피 샘플 내 응집체, 단량체, 단편, 및 절반 항체의 수준이 분석된다. 소정의 구현예에서, 응집체, 단량체, 및 단편은 각 분자에 대한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 방법을 사용하여 측정된다. 소정의 구현예에서, 정량화는 검출된 피크의 상대 면적에 기초한다. 일부 구현예에서, 절반 항체의 수준은 비환원성 모세관 전기 영동 도데실황산나트륨(CE-SDS)을 사용해 측정된다.
질량 분광법과 같은 임의의 추가 기술이 크기 변이체를 검정하는 데 사용될 수도 있다.
숙주 세포 단백질의 검정
본 발명은 또한, 본 발명의 조성물에서 숙주 세포 단백질(HCP) 농축물의 잔류 수준을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 전술한 바와 같이, HCP는 바람직하게는 최종 목표 물질 생성물로부터 제외된다. 예시적인 HCP는 항체 생산물 공급원 기원의 단백질을 포함한다. 표적 항체로부터 HCP를 식별하여 충분히 제거하지 못하면 효능이 감소할 수 있고/있거나 대상체에서 이상반응이 나타날 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “HCP ELISA”는 검정에 사용되는 제2 항체가 관심 항체를 생성하는 데 사용되는 세포로부터 생산된 HCP에 특이적인 ELISA를 지칭한다. 제2 항체는 당업자에게 공지된 종래의 방법에 따라 생산될 수 있다. 예를 들어, 제2 항체는 대조군(sham) 생산 및 정제 실행에 의해 수득된 HCP를 사용하여 생산될 수 있다. 즉, 관심 항체를 생산하는 데 사용된 동일한 세포주가 사용되지만, 세포주는 항체 DNA로 형질감염되지 않는다. 예시적인 구현예에서, 제2 항체는 선택된 세포 발현 시스템, 즉 표적 항체를 생산하는 데 사용되는 세포 발현 시스템에서 발현된 것들과 유사한 HCP를 사용하여 생산된다.
일반적으로, HCP ELISA는 2개의 항체 층(제1 항체 및 제2 항체) 사이에 HCP를 포함하는 액체 샘플을 샌드위치화하는 단계를 포함한다. 샘플을 인큐베이션하고, 그 동안 샘플 내 HCP는 제1 항체(예를 들어 염소 항-CHO, 이에 한정되지 않음)에 의해 포획되고, 친화도 정제된다(Cygnus). 항체를 생성하는 데 사용된 세포로부터 생산된 HCP에 특이적인 표지된 제2 항체 또는 항체 배합물이 첨가되어, 샘플 내에서 HCP에 결합한다. 소정의 구현예에서, 제1 및 제2 항체는 다클론 항체이다. 소정의 양태에서, 제1 및 제2 항체는 HCP에 대해 생산된 다클론 항체의 배합물이다. 샘플에 함유된 HCP의 양은 제2 항체의 표지에 기초하여 적절한 시험을 사용하여 결정된다.
HCP ELISA는 전술한 공정을 사용하여 수득된 용리액 또는 관류물과 같은 항체 조성물에서 HCP의 수준을 결정하는 데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 항체를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 HCP 효소 결합 면역흡착 검정(“ELISA”)에 의해 결정했을 때 검출 가능한 수준의 HCP를 갖지 않는다.
VI. 본 발명의 조성물을 사용하는 치료 방법
관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 본 발명의 조성물은, 조성물에 포함된 치료 단백질이 치료에 적합한 대상체에서 임의의 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
“장애”는 단백질로 치료함으로써 이익을 얻을 수 있는 임의의 병태이다. 여기에는, 대상체가 해당 장애에 걸리기 쉬운 병리학적 병태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다. 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 경우, GM-CSFRα 관련 장애를 치료하기 위해 조성물의 치료적 유효량이 투여될 수 있다.
GM-CSFRα 연관 장애는 GM-CSFRα 활성의 억제가 장애의 증상 및/또는 진행을 완화시킬 것으로 예상되는 장애를 포함한다. GM-CSF는 GM-CSFRα에 특이적으로 결합하므로, GM-CSF의 병리학적 및/또는 증상적 효과도 GM-CSF가 GM-CSFRα에 결합하는 것을 억제함으로써 상쇄될 수 있다. 여기에서, GM-CSFRα 관련 장애는, 예를 들어 장애를 앓고 있는 대상체의 체액 중 GM-CSFRα 및/또는 GM-CSF의 농도 증가(예를 들어, 대상체의 혈청, 혈장, 윤활액 등에서 GM-CSFRα 및/또는 GM-CSF 농도 증가)에 의해 입증될 수 있다.
관심 단백질, 예를 들어 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예를 들어 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체)을 포함하는 본 발명의 조성물은 자가면역, 염증성 및/또는 호흡기 병태, 질환, 및 장애를 포함하지만 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 GM-CSFRα 관련 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일 구현예에서, GM-CSFRα 관련 장애는 자가면역 질환(류마티스성 관절염, 류마티스 척추염, 골관절염, 및 통풍성 관절염, 알레르기, 다발성 경화증, 자가면역 당뇨병, 자가면역 포도막염, 신증후군, 다기관 자가면역 질환, 루푸스(전신 루푸스, 루푸스 신염, 및 루푸스 뇌염), 크론병 및 자가면역성 난청), 활성 축상 척추관절염(활성 axSpA) 및 비-방사선학적 축상 척추관절염(nr-axSpA), 감염성 질환(말라리아, 수막염, 후천성 면역 결핍증(AIDS), 인플루엔자, 및 감염에 부차적인 악액질), 패혈증(패혈성 쇼크, 내독성 쇼크, 그람 음성 패혈증, 및 독성 쇼크 증후군), 동종이식 거부 반응 및 이식편 대 숙주 질환, 악성 종양, 골수성 백혈병, 폐 장애(성인 호흡곤란 증후군(ARDS) 포함), 쇼크 폐, 만성 폐 염증성 질환, 폐 사르코이드증, 폐 섬유증, 규폐증, 특발성 간질성 폐질환 및 만성 폐쇄성 기도 장애(COPD), 예: 천식), 장 장애(염증성 장 장애, 특발성 염증성 장 질환, 크론병 및 크론병 관련 장애(방광, 질, 및 피부의 루 포함; 장 폐색 농양; 영양 결핍증; 코르티코스테로이드 사용으로 인한 합병증; 관절의 염증; 결절성 홍반; 괴저성 농피증; 눈의 병변; 크론병 관련 관절통, 누공형성 크론병의 불확정 대장염 및 장염), 심장 장애(심장 허혈, 심부전, 재협착, 울혈성 심부전, 관상 동맥 질환, 협심증, 심근경색, 심장 정지에 의한 심혈관 조직 손상, 심장 우회술에 의한 심혈관 조직 손상, 심장성 쇼크, 및 고혈압, 죽상경화증, 심근증, 관상 동맥 연축, 관상 동맥 질환, 판막 질환, 부정맥, 및 심근병증 포함), 척추관절병증(강직성 척추염, 건선성 관절염/척추염, 장병증성 관절염, 반응성 관절염 또는 라이터 증후군, 및 미분화 척추관절병증 포함), 대사 장애(제1형 진성 당뇨병, 제2형 진성 당뇨병, 당뇨병성 신경병증, 말초 신경병증, 당뇨성 망막증, 당뇨병성 궤양, 망막병증 궤양, 및 당뇨병성 거대혈관병증을 포함하는 당뇨병 및 비만 포함), 빈혈, 통증(급성 및 만성 통증, 예컨대 신경병성 통증 및 수술 후 통증, 만성 허리 통증, 군발 두통, 헤르페스 신경통, 환상 사지 통증, 중추 통증, 치과 통증, 아편유사제 내성 통증, 내장 통증, 수술 통증, 뼈 손상 통증, 출산 및 분만 중 통증, 화상으로 인한 통증, 햇볕 화상, 산후 통증, 편두통, 협심증 통증, 및 방광염을 포함하는 비뇨생식관 관련 통증), 간 장애(간염, 알코올성 간염, 바이러스 간염, 알코올성 간경화증, a1 항트립신 결핍증, 자가면역 경화증, 잠복성 간경화증, 전격성 간염, B형 및 C형 간염, 지방간염, 낭성 섬유증, 원발성 담즙성 간경화증, 경화성 담관염, 및 담도 폐쇄 포함), 피부 및 손발톱 장애(건선(만성 판상 건선, 장염성 건선, 역 건선, 농포성 건선, 및 기타 건선 장애 포함), 심상성 천포창, 피부경화증, 아토피성 피부염(습진), 사르코이드증, 결절성 홍반, 화농성 한선염, 편평 태선, 스위트 증후군, 피부경화증, 및 백반증 포함), 혈관염(베체트병 포함), 및 기타 장애, 예컨대, 청소년 류마티스 관절염(JRA), 자궁내막증, 전립선염, 맥락막 신생혈관, 좌골신경통, 쇼그렌 증후군, 포도막염, 습식 황반 변성, 골다공증, 및 골관절염을 포함한다.
일 구현예에서, GM-CSFRα 관련 질환 또는 장애는 류마티스 관절염이다. 일부 구현예에서, GM-CSFRα 관련 질환 또는 장애는 거대 세포 동맥염(GCA) 또는 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS), 또는 사이토카인 방출 증후군(CRS)이다. 또 다른 구현예에서, GM-CSFRα 관련 질환 또는 장애는 코로나바이러스 질환 2019(COVID-19)이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “대상체”는 살아있는 유기체, 예를 들어 원핵생물 및 진핵생물을 포함하도록 의도된다. 대상체의 예는 포유동물, 예를 들어 인간, 개, 젖소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 랫트, 및 유전자이식 비인간 동물을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “치료(treatment 또는 treat)”는 치료적 치료 및 예방적(prophylactic 또는 preventive) 조치 둘 다를 지칭한다. 치료를 필요로 하는 이들은 장애를 이미 가진 이들뿐만 아니라 장애를 예방해야 하는 것들도 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 GM-CSFRα 활성이 억제되거나 GM-CSFRα 관련 장애가 치료되도록 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, GM-CSFRα는 인간 GM-CSFRα이고 대상체는 인간 대상체이다. 일 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체는 마브릴리무맙이다.
조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 예시적인 투여 경로/모드는 정맥내, 근육내, 비강내, 경구, 국소, 또는 피하 전달을 포함한다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 투여 경로 및/또는 모드는 원하는 결과에 따라 달라질 것이다.
최적의 원하는 반응(예: 치료적 또는 예방적 반응)을 제공하기 위해 투여 요법을 조정할 수 있다. 예를 들어, 단일 볼루스가 투여될 수 있고, 여러 개의 분할 투여량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 투여량은 치료 상황의 긴급성에 따라 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다. 소정의 구현예에서, 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해, 비경구 조성물을 투여량 단위로 제형화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 투여량 단위 형태는 치료될 포유동물 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 요구되는 약학적 담체와 연관하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 사양은 다음에 의해 좌우되거나 직접적으로 달라진다: (a) 달성하고자 하는 활성 화합물의 고유한 특성 및 특정 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체의 민감성을 치료하기 위해 이러한 활성 화합물을 화합하는 기술에 내재된 한계.
본 발명의 조성물의 치료적 또는 예방적 유효량에 대한 예시적인 비제한적 범위는 약 0.01~30 mg/kg, 0.1~20 mg/kg, 1~10 mg/kg, 2~8 mg/kg, 또는 5~15 mg/kg이다. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분(예: 마브릴리무맙)을 포함하는 조성물과 관련하여, 예시적인 투여량은 격주로 약 30, 50, 100, 또는 150 mg이다.
일부 구현예에서, 특히 류마티스 관절염의 치료를 위한 예시적인 투여량은 최대 10 mg/kg의 단일 정맥내 투여량을 포함한다. 일부 구현예에서, 예시적인 투여량은 최대 3년 동안 격주로 최대 150 mg의 반복 피하 투여량을 포함한다.
일부 구현예에서, 특히 COVID-19의 치료를 위한 예시적인 투여량은 약 6 mg/kg 또는 약 10 mg/kg의 단일 정맥내 투여량을 포함한다.
일부 구현예에서, 특히 거대 세포 동맥염의 치료를 위한 예시적인 투여량은 26주 동안 격주로 약 150 mg의 피하 투여량을 포함한다.
투여량 값은 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다는 것에 유의해야 한다. 추가로, 임의의 특정 대상체의 경우, 특정 투여량 요법은 개별적인 필요성에 따라, 및 조성물의 투여를 관리 감독하는 사람의 전문적 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정되어야 하며, 본원에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적인 것이고 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하도록 의도되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
VII. 본 발명의 조성물을 함유하는 약학적 제형
본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 제제 및 제형을 추가로 제공한다. 관심 단백질, 예를 들어 본원에 기술된 항체 및 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물은 후술하는 바와 같이 제형화되거나 제조될 수 있음을 이해해야 한다. 일 구현예에서, 항체는 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분이다. 또 다른 구현예에서, 항-GM-CSFRα 항체는 마브릴리무맙이다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 약학적 (치료) 조성물로서 제형화될 수 있고, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 투여 경로 및/또는 모드는 원하는 결과에 따라 달라질 것이다.
용어 “약학적으로 허용 가능한 담체”는 활성 성분의 생물학적 활성의 효과를 방해하지 않는 하나 이상의 비독성 물질을 의미한다. 이러한 제제는 일상적으로 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체, 및 임의로 다른 치료제를 함유할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용 가능한 제제는 인간에게 투여하기에 적합한 상용성 고형 또는 액체 필러, 희석제, 또는 캡슐화 물질을 일상적으로 함유할 수도 있다. 용어 “담체”는 활성 성분과 합쳐져 응용을 용이하게 하는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 나타낸다. 약학적 조성물의 성분은, 원하는 약학적 효능을 실질적으로 손상시키는 상호작용이 없는 방식으로 본 발명의 항체 혼합되고 서로 혼합될 수도 있다.
본 발명의 조성물은 당업계에 알려져 있고 치료적 용도에 허용 가능한 형태로 존재한다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물의 제형은 액체 제형이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물의 제형은 동결건조된 제형이다. 추가의 구현예에서, 본 발명의 조성물의 제형은 재구성된 액체 제형이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물의 제형은 안정한 액체 제형이다. 일 구현예에서, 본 발명의 조성물의 액체 제형은 수성 제형이다. 또 다른 구현예에서, 액체 제형은 비수성이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물의 액체 제형은 수성 제형이고, 여기서 수성 담체는 증류수이다.
본 발명의 조성물은 특정 투여 경로, 예컨대 경구, 비강, 폐, 국소(구강 및 설하 포함), 직장, 질, 및/또는 비경구 투여에 맞게 제형화될 수 있다. 제형은 단위 투여량 형태로 편리하게 제시될 수 있고, 제약 분야에 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 담체 물질과 합쳐져 단일 투여 형태를 생산할 수 있는 활성 성분의 양은 치료 중인 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 합쳐져 단일 투여 형태를 생산할 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성하는 조성물의 해당 양일 것이다. 예로서, 소정의 구현예에서, 항체(항체 단편 포함)는 정맥내 투여용으로 제형화된다. 소정의 다른 구현예에서, 항체(항체 단편 포함)는, 예를 들어 카테터, 스텐트, 와이어, 심근내 전달, 심막내 전달, 또는 심내막내 전달을 통해, 심혈관계로의 국소 전달을 위해 제형화된다. 특정 구현예에서, 조성물은 마브릴리무맙과 같은 항-GM-CSFRα 항체를 포함하고 피하 투여용으로 제형화된다.
국소 또는 경피 투여에 적합한 본 발명의 조성물의 제형은 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치, 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 무균 조건 하에서 약학적으로 허용 가능한 담체 혼합되고, 요구될 수 있는 임의의 보존제, 완충제, 또는 추진제와 혼합될 수 있다(미국 특허 제7,378,110호; 제7,258,873호; 제7,135,180호; 제7,923,029호; 및 미국 공개 제20040042972호).
본원에서 사용되는 바와 같이, “비경구 투여(parenteral administration 및 administered parenterally)” 라는 문구는 장관 및 국소 투여 이외에, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 및 척추 내 주사 및 주입을 포함하되 이들로 한정되지는 않는다.
본 발명의 조성물의 약학적 조성물 내 활성 성분의 실제 투여량 수준은, 환자에게 독성이 되지 않으면서, 특정 환자에 대한 원하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양, 조성물, 및 투여 방식을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약동학적 인자에 따라 달라지게 되며, 여기에는 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 이의 에스테르, 염, 또는 아미드의 활성; 투여 경로; 투여 시간; 사용되는 특정 화합물의 배설 속도; 치료 기간; 사용된 특정 조성물과 함께 사용된 다른 약물, 화합물, 및/또는 물질; 치료 중인 환자의 연령, 성별, 체중, 병태, 일반적인 건강, 및 이전 병력; 및 의학 분야에서 잘 알려진 기타 인자가 포함된다.
본 발명은 다음의 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
실시예 1: 항-GM-CSFRα 항체의 생산을 위한 상류 공정
본 실시예는 항-GM-CSFRα 항체인 마브릴리무맙의 생산을 위한 상류 공정의 세부사항을 제공한다. 개발 작업은 일련의 10L 바이오리액터 연구 및 200L 데모 실행으로 구성하였다(공정 7 200L 비-GMP 로트 1). 첫 번째 10L 실험(1번 연구)의 목표는 마브릴리무맙 상류 공정을 확립하고 공급 백분율을 평가하는 것이었다. 이러한 초기 실험 동안, 하나의 바이오리액터(R1)를 대조군 조건 하에서 가동하고, 다른 하나의 바이오리액터(R2)를 가동하되, 세포 밀도의 증가를 보상하기 위해 6일차에서 14일차까지 공급 백분율의 증가시켰다. 바이오리액터 2에서 공급 백분율의 증가는 젖산염 생산을 증가시켰는데, 이는 대조군에 비해 낮은 pH 경향과 상관되었다. 이어서, 생성물 품질 결과는 pH가 낮을수록 더 바람직한 전하 프로파일이 생성되었음을 보여주었다.
첫 번째 실험으로부터 얻은 결과를 확인하기 위해, 두 번째 연구(2번 연구)에서 바이오리액터 1 및 2에 대한 조건을 반복하되, 4일차에 두 바이오리액터 모두에서 pH를 6.90에서 6.75로 변경하는 것을 추가하였다. 바이오리액터 3 및 4의 결과는, 6일차의 공급 백분율의 증가 및 4일차의 pH 설정점의 감소 둘 다가 항체의 하전된 종에 유익함을 나타낸다.
세 번째 실험(3번 연구)은 4개의 10L 바이오리액터로 구성하였다. 대조군, 바이오리액터 5는 이전 실행에서의 바이오리액터 4의 조건과 일치하였다(6일차에서 14일차까지 공급 백분율 증가, 및 4일차에 6.75까지 pH 변경). 바이오리액터 6에 대해 대조군과 동일한 공급 방식을 유지하였고, pH는 4일차에 6.75가 아니라 6.65로 변경하였다. 바이오리액터 7에 대해 대조군과 동일한 pH 변경을 유지하였고, 2일차에 공급을 개시하고, 6일차에 증가시키고, 9일차에 감소시켰다. 마지막으로, 바이오리액터 8을 대조군과 동일한 조건 하에 실행하되, 9일차에 온도를 36℃에서 32℃로 변경하는 것을 추가하였다. 바이오리액터 6~8에서 시험한 조건은 불량한 배양 성능 및/또는 바람직하지 않은 생성물 품질을 초래하였으므로; 200L 데모 실행으로 규모를 확장하기 위해 대조군 조건(바이오리액터 4, 5)을 선택하였다.
3개의 추가 10L 바이오리액터를 4번 연구에서의 200L 데모 실행과 동시에 가동시켰다. 바이오리액터 9는 200L 바이오리액터에 대한 직접 위성이고, 바이오리액터 10은 접종 시점에 세포 세대 수를 평가하는 데 사용하였다. 바이오리액터 9 및 10은 200L의 데모 실행과 유사하게 작동하여 유사한 생성물 품질을 갖는 물질을 생산하였다.
연구 번호 1~4의 상세한 결과는 표 22~26에 나타나 있다.
모든 10L 실행 및 200L 데모 실행에 사용된 바이오리액터 파라미터는 표 1-1에 캡처되어 있다.
모든 10L 실행 및 200L 데모 실행에 사용된 포도당 공급 전략은 표 1-2에 캡쳐되어 있다.
10L 및 200L 가공에 대한 정화 파라미터는 표 1-3에 캡처되어 있다.
결과 및 논의
연구 번호 1 - 바이오리액터 1(R1) 및 바이오리액터 2(R2)
실험 조건
연구 번호 1에 대한 실험 조건은 표 1-4에 캡쳐되어 있다. 이 실험의 목표는 마브릴리무맙 상류 공정을 확립하고 공급 백분율을 평가하는 것이었다.
생산 데이터
바이오리액터 1은 바이오리액터 2보다 더 높은 생존 세포 밀도(VCD)를 달성하였고, 둘 다는 바이오리액터 4x10L R2에 비해 더 높은 피크 VCD를 가졌다. 바이오리액터 2의 생존력은 4x10L R2와 일치하는 반면, 바이오리액터 1은 15일차까지 90%를 초과하는 생존력을 유지하였다.
바이오리액터 1과 2 사이의 최종 생존력에 있어서의 불일치는 8일차 내지 15일차에 바이오리액터 2에 대해 관찰된 젖산염의 증가에 기인하는 것일 수 있다. 젖산염의 증가는 바이오리액터 1 및 4x10L R2 둘 다와 비교해 바이오리액터 2에 대한 pH 프로파일이 낮추었다. 더 높은 오스몰농도가 바이오리액터 2에 대해 관찰되었는데, 이는 공급물(%)의 증가뿐만 아니라 낮은 pH를 보상하기 위해 첨가된 염기의 증가에 기인하는 것일 수 있다. CO2 및 다른 모든 대사물은 실행 간에 비슷하였다. 1번 연구에서 생산 바이오리액터에 대한 모든 추가 데이터는 표 1-22에서 확인할 수 있다.
역가
최종 생존율이 더 낮았음에도 불구하고, 바이오리액터 2는 바이오리액터 1보다 약간 더 높은 역가를 나타냈으며, 15일차 값은 4x10L R2와 거의 동일하였다. 본 실험의 최종 역가 결과는 3상 조건에서 예상되는 것과 일치한다.
생성물 품질
TECAN 정제 및 생성물 품질 분석을 위한 샘플을 제조하였다. 13일차 및 15일차의 샘플을 NR CE-SDS, SEC, 및 글리칸을 위해 제출하였다. 13일차 및 15일차 샘플에 추가하여, 하류 규모 축소 모델(SDM)에서의 CEX 로딩 물질을 NR CE-SDS 및 IEC를 위해 제출하였다. 13일차에서 15일차까지 절반 항체의 증가가 두 조건 모두에 대해 관찰되었다(Error! Reference source not found.) 그러나, SDM의 CEX 로딩 물질 내 절반 항체 수준은 두 반응기 모두에 대한 13일차 및 15일차 값보다 낮다. 그 차이는, SDM 물질에 대한 2~8℃에서의 유지 시간이 13일차 및 15일차 샘플과 비교하여 증가하였기 때문인 것으로 여겨진다. 시간 경과에 따른 절반 항체의 감소는 이전의 보유 데이터와 일치한다. 절반 항체에 영향을 미치는 세포 배양 조건을 평가하기 위한 이전 연구는 외부적으로 CDMO에서 수행하였지만; 이들 연구는 이러한 속성을 조절하는 파라미터를 식별하는 데 실패하였다. 표 1-7에 나타낸 바와 같이, SEC 결과는 13일차에서 15일차까지 단량체가 약간 감소하였음을 나타내며, 예상대로, 전체 정제 공정을 통해 가공한 단편 및 응집체 수준은 더 높다. 글리칸 결과는 시간에 따라 안정적이다. IEC 결과는 Error! Reference source not found.에서 확인할 수 있다. 산성 피크의 증가가 두 바이오리액터 모두에서 관찰되었다. 그러나, 바이오리액터 2는 바이오리액터 1에 비해 약 8% 더 낮은 산성 종을 가졌고, 이는 실행 전반에 걸쳐 더 낮은 세포 배양 pH의 결과라는 가설을 세웠다.
연구 번호 2 - 바이오리액터 3(R3) 및 바이오리액터 4(R4)
연구 2의 결론에서, 더 낮은 배양물 pH로 인해 바이오리액터 2에 대한 산성 종의 수준을 더 낮아졌다는 가설을 세웠다. 이러한 가설을 시험하기 위해, 바이오리액터 1과 2의 조건을 바이오리액터 3과 4에서 반복하고, 4일차에 pH 변경을 구현하였다. 실험 조건은 표 1-8에서 확인할 수 있다.
실험 조건
생산 데이터
바이오리액터 3은 바이오리액터 1과 유사하게 성장하였고, 바이오리액터 4는 바이오리액터 2와 유사하게 성장하였다. 이는 pH 변화가 세포 성장에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 15일차까지, 두 바이오리액터 모두 >90%의 생존율을 유지하였고, 이는 바이오리액터 1과 일치하였다. 바이오리액터 2와 비교하여 바이오리액터 4에 대해 더 높은 생존율이 관찰된 것은 본 실행 동안 더 낮은 수준의 젖산염이 생산된 것에 기인하는 것일 수 있다. 세포 대사는 pH 변화에 의해 조절되었을 가능성이 있다. 오프라인 pH 프로파일은, 바이오리액터 3에 대한 pH를 변경함으로써, 바이오리액터 1와 비교해 더 낮은 pH가 달성되었음을 보여준다. 그러나, pH는 죽은 밴드의 상단에서 6.85로 유지되었는데, 이는 배양 이후 동안 젖산 생산에서 소모로의 대사가 전환되었기 때문이다. 바이오리액터 4에 대한 pH 수준이 더 바람직하였다. 4일차에 pH를 변경한 후, 수준은 15일차까지 6.7~6.75에서 유지되었다. 이는 나중에 배양물에서 젖산염이 증가하였기 때문에 달성할 수 있었다. 이 실험으로부터, 6일차에 공급 백분율의 증가가 오스몰농도를 상승시켰고, 이어서 이는 세포가 젖산 생산에서 소비로의 대사 플럭스를 거치는 것을 방지한 것으로 결론을 내렸다. CO2 및 다른 모든 대사물은 실행 간에 비슷하였다. 2번 연구에서 생산 바이오리액터에 대한 모든 추가 데이터는 표 1-23에서 확인할 수 있다.
역가
바이오리액터 3은 반응기 1, 2, 및 4보다 더 많이 생산하였는데, 이들의 15일차에 결과는 모두 유사하였다. 바이오리액터 3에 대해 관찰된 역가 증가는 세포 성장의 증가가 낮은 pH 조건과 결합된 것에 기인하는 것일 수 있다.
생성물 품질
시간 경과 샘플을 HiTrap Pro A 방법을 사용해 정제하고, IEC 분석을 위해 제출하였다. 하류 SDM pro A 방법을 통해 정제된 샘플을 NR CE-SDS, SEC, 및 글리칸을 위해 제출하였다. SEC 및 글리칸에 대한 15일차 결과는 예상한대로였다. 바이오리액터 3 및 4에 대한 절반 항체 수준은 더 높게 유지되었지만, 소규모 실행에 맞게 설정된 과거 데이터 세트 내에 있었다. 15일차에 바이오리액터 3 및 4의 절반 항체 수준은 바이오리액터 1 및 2와 비교하여 더 낮았다.
IEC 결과는 배양물 pH가 낮을수록 산성 종이 더 적어진다는 것을 확인시켜 준다. 바이오리액터 3 및 4로부터의 샘플을 실행하였고, 표 1-10에 나타냈다. 데이터는 (젖산염 생산을 유도하는 데 사용된) 공급 백분율 및 pH 설정점 모두가 전하 프로파일을 유지하는 데 중요하다는 것을 나타낸다.
연구 번호 3 - 바이오리액터 5 (R5), 바이오리액터 6 (R6), 바이오리액터 7 (R7) 및 바이오리액터 8 (R8)
실험 조건
본 실험의 첫 번째 목표는 pH 이동과 결합된 공급 증가가 산성 종에 긍정적인 영향을 미치기에 충분히 낮은 pH를 유지하기 위해, 바람직한 세포 대사를 재현 가능하게 유도한다는 것을 확인하는 것이었다. 따라서, 바이오리액터 5를 바이오리액터 4와 동일한 조건 하에서 작동시켰다. 바이오리액터 6에 대해 pH를 6.75가 아닌 6.65로 변경하여 전하 프로파일에 대한 추가의 개선이 일어날 수 있는지 여부를 평가하였다. 바이오리액터 7을 사용하여 공급 계획을 평가하였다. 공급은 하루 일찍 2일차에 개시하였고, 6일차에 증가시킨 다음, 9일차에 감소시켰다. 마지막으로, 9일차에 바이오리액터 8에 대해 온도를 32℃로 변경함으로써 전하 프로파일을 조절하려는 추가적인 시도를 하였다. 본 연구에서의 4개의 바이오리액터에 대한 세부 사항은 표 1-12에 캡쳐되어 있다.
생산 데이터
대조군 조건인 바이오리액터 5는 이전의 대조군인 바이오리액터 2 및 4와 유사하였다. 이러한 실행은, 공급 및 pH 설정점 변경을 통해 낮은 pH에서 조절할 수 있는 능력을 확인시켜 주었다. 바이오리액터 6 및 7은 모두 대조군보다 훨씬 더 낮은 피크 세포 밀도로 성장하였고, 더 낮은 최종 생존력을 나타냈다. 이들 2개의 바이오리액터에 대한 전체 배양 성능은 대조군에 비해 준최적이었으며, pH 설정점 및 공급에 대한 변화가 효과가 없음을 입증하였다. 온도가 변경된 바이오리액터 8의 성능은, 9~15일차에 pH가 약간 더 높았던 것을 제외하고는, 대조군과 유사하였다. 3번 연구에서 생산 바이오리액터에 대한 모든 추가 데이터는 표 1-24 및 표 1-25에서 확인할 수 있다.
역가
예상대로, 대조군 조건은 불량한 세포 성장 및 생존력을 나타낸 바이오리액터 6 및 7보다 더 많은 생산을 가능하게 하였다. 바이오리액터 8의 생산성도 낮았는데, 이는 온도를 32℃로 변경한 것에 기인하는 것일 수 있다.
생성물 품질
샘플을 HiTrap Pro A 방법을 사용해 정제하고, 생성물 품질 분석을 위해 제출하였다. 이 실험에서, 15일차의 정화된 수확물(CH)의 생성물 품질 결과는 표 1-13 내지 표 1-15에 나타나 있다. NR CE-SDS와 관련하여, SEC 및 글리칸의 바이오리액터 4개 모두는 유사하게 수행되었다. 바이오리액터 6 및 7의 G0 당형태는 다른 2개의 반응기보다 약간 더 높았는데, 이는 배양 성능이 불량하였기 때문에 비결과적이다. IEC 데이터는 온도가 산성 종에 큰 영향을 미쳤음을 나타내지만; 변환은 주요 종이 아니라 염기성 종으로의 변환이었고, 이로 인해, R8의 경우, 염기성 종 수준이 상대적으로 더 높았다. 배양 성능, 생산성, 및 생성물 품질을 기준으로, 대조군 조건을 200L 데모 실행으로 이동시키는 권고가 이루어졌다.
연구 번호 4 - 바이오리액터 9 (R9), 바이오리액터 10 (R10), 및 200L
10L 실험 조건
2개의 10L 바이오리액터를 200L 데모 실행과 동시에 작동시켰으며, 각각의 조건은 표 에서 확인할 수 있다. 바이오리액터 9는 200L 실행의 위성이었다. 접종 후, 7.0 L의 배양물을 200L 반응기로부터 배수시키고 10L XDR로 옮겼다. 위성에 대한 모든 첨가물 및 공급물은 200L 실행으로부터 분취하였다. 세포 연령이 공정 성능 및 생성물 품질에 미치는 영향을 평가하기 위해, 바이오리액터 10에 더 낮은 세대의 세포를 접종하였다.
200L 생산 바이오리액터 파라미터
200L 실행에 대한 최종 조건은 표에서 확인할 수 있는데, 파라미터들은 바이오리액터 4 및 5에 사용된 것들과 일치한다.
생산 데이터
200L 반응기용 VCD는 위성 및 다른 모든 10L 대조군보다 성능이 우수하였다. 세포 성장의 증가는 바이오리액터 기하구조 및 규모로 인한 것일 가능성이 높다. 위성 및 저 세대 바이오리액터는 이전의 대조군 조건과 유사하게 성장하였는데, 이는 규모 축소 모델이 강력하고, 세포 연령이 세포 성장에 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. 생존력은 200L 실행과 10L 바이오리액터 간에 비슷하였다. 200L 바이오리액터에 대한 젖산염 프로파일은 위성 실행 및 10L 대조군과 상이하였다. 이는 더 낮은 농도로 피크를 형성하였고, 5일차에 젖산염을 소모하기 시작하였다. 200L 바이오리액터에서 관찰된 젖산염 소모에 대응하여, 200 L 바이오리액터 및 10L 위성에 추가로 두 가지 공급 배지를 1%/0.1% 볼루스로 첨가하기로 결정하였다. 200L 바이오리액터에 대한 모든 첨가의 시기 및 부피는 표 1에서 확인할 수 있다. 추가의 볼루스는 200L 세포 대사를 젖산염 생산으로 복귀시키는 데 효과적이었다. 그러나, 젖산염의 극적인 스파이크가 9일차에서 10일차까지 관찰되었다. 젖산염 스파이크 시점에, 조절 DO 프로브와 보조 DO 프로브 사이에 불일치가 관찰되었다. 조절 프로브의 판독은 약 30%인 반면, 보조 프로브의 판독은 약 3%였다. 젖산염 스파이크를 고려하여, 보조 프로브의 판독이 정확했고, 조절 프로브가 표류하여 바이오리액터 내에 저산소 환경을 유발한 것으로 결정하였다. 프로브를 스위칭한 후, 젖산염은 감소하였다. 200L 반응기에서의 pH는, 젖산염의 스파이크에 의해 영향을 받은 9~10일차를 제외하고, 죽은 밴드의 상측을 향하는 경향을 나타냈다. pH 프로파일의 차이는 200L 반응기에서 젖산염의 생산이 낮아진 것 때문이다. 예상대로, 200L 바이오리액터 내 CO2 수준은 10L보다 약간 높았다. 오스몰농도는 규모와 상관없이 일치하였다. 200L 오스몰농도 데이터에서 보이는 발진은 공급전 샘플과 공급후 샘플이 같은 날에 채취된 것 때문이다. 4번 연구에서 추가의 생산 데이터는 표 1-26에서 확인할 수 있다.
이러한 데이터는, 배양 성능과 관련하여, 10L 규모 축소 모델이 세포 밀도에서 약간의 오프셋을 제외하고는 200L 바이오리액터를 대표한다는 것을 입증한다. 공급 백분율이 세포 대사에 영향을 미치도록 의도적으로 사용되기 때문에, 대규모로 증가된 VCD는 젖산염 생산에 영향을 미칠 가능성이 있다. 원치 않는 젖산염 소모를 완화하기 위해, 공급 백분율의 증가는 6일차가 아니라 하루 전인 5일차에 이루어져야 한다.
역가
200L 실행에 대해 관찰된 세포 밀도 증가는 10L 위성 및 이전 대조군과 비교하여 역가을 증가시켰다. 반응기 10의 역가는 위성 실행보다 약간 더 낮았지만, 15일차 값은 이전의 대조군 실행과 일치하고 공정 변이에 대한 예상치 내에 있었다.
생성물 품질
200L 실행 바이오리액터 및 10L 바이오리액터 둘 다에 대한 샘플을 HiTrap Pro A 방법을 사용해 정제하고, 생성물 품질 분석을 위해 제출하였다. 하류 파일럿 규모 실행에서의 Pro A 용리물도 200L 반응기용으로 제출하였다. 바이오리액터 9, 위성, 및 바이오리액터 10, 낮은 세대 조건에 대한 생성물 품질 결과는 유사하였는데, 이는 세포 연령이 생성물 품질에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 절반 항체는 200L 반응기 물질에서 약간 더 낮았고, 12일차에서 15일차까지 감소하였으며, 정화된 수확물에서 약간의 증가가 관찰되었다(표 1-19). 이러한 증가는 최악의 수확 조건으로 인한 것일 수 있다. 200L 반응기에 대한 전하 이질성은, pH 프로파일이 더 높음에도 불구하고 10L 위성 및 저 세대 바이오리액터와 비슷하였다(표 ). 200L 실행에 대한 산성 및 염기성 종은 10L 모델과 일치하였다. SEC에 의한 응집체 및 단편 수준은 10L 모델과 비교해 200L 실행의 경우가 약간 더 높았다 (표 1-21). 200L 실행에 대한 15일차 글리칸 결과는 10L 모델과 일치하였다.
결론
본 실시예는 마브릴리무맙 생산을 위한 상류 공정이 강력하고 확장 가능하다는 것을 입증한다. 10L 소규모 모델은 재현 가능하며, 200L 바이오리액터를 예측할 수 있게 한다. 수확 절차는 높은 처리량과 높은 수율로 확장 가능한 것으로 입증되었다. 세포 배양물의 공급량을 증가시키고 pH를 변화시킴으로써, 원하는 생성물 품질을 달성하였다.
확인 실행으로 이동하기 위해 선택된 작동 파라미터는 이 데모 실행 중에 사용된 것과 동일하며, 표 1-1: 바이오리액터 파라미터에 상세하기 나타나 있다.
실시예 2: 양이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 항체를 정제하기 위한 하류 공정
실시예 2는 항-GM-CFSRa 항체인 마브릴리무맙의 정제 공정을 위한 양이온 교환 크로마토그래피 단계의 개발을 기술한다. 고생산성 세포 배양 공정을 전술한 바와 같이 개발하였다. 하류 공정은 표 2-1에 요약되어 있다.
물질
수확물
10L 규모 바이오리액터 실행에서의 정화된 수확물을 마브릴리무맙 하류 공정 개발에 사용하였다. 200L 스케일 데모 실행 1의 수확물을 이용해, 파일럿 규모 포획 실행에 이어서 원료 의약품을 통한 하류 정제를 수행하였다.
컬럼 충진 및 적격성 평가
1 cm(ID) x 20 cm(H), 5 cm(ID) x 20 cm(H) 및 20 cm(ID) x 20 cm(H) 컬럼을 사용하여 CEX 실행을 수행하였다. 5 cm x 20 cm 컬럼을 내부에서 충진하였고, 나머지 2개는 Repligen으로부터 수득한 미리 충진된 컬럼이었다. HETP 및 비대칭(As) 규격을 충족하기 위해 컬럼의 적격성을 평가하고 검증하였다.
분석 방법
Solo VPE를 사용하여 정제된 샘플에 대한 A280 값을 측정하였고; 그런 다음 흡광 계수 1.44 mL/mg-cm를 사용하여 단백질 농도를 계산하였다. 표 2-2에 나타낸 방법을 사용하여 Hab, 응집체, 및 전하 프로파일 분석을 수행하였다.
결과 및 논의
설립 실행
표 2~3에 나타낸 바와 같이, 정제 공정 후 2 x10L 바이오리액터로부터의 정화된 수확물을 DS를 통해 정제하였다. 공정 중간체 내 Hab 함량은 8.4~10.6%였고, DS 내 Hab 함량은 7.6%였으며, DS에 대한 목표 Hab 수준은 ≤3%였다. 결과는, 이러한 하류 공정이 상류 수확물을 사용하여 원하는 Hab 수준을 달성할 수 없었음을 나타낸다.
POROS™ XS 크로마토그래피의 개발
Hab의 수준을 목표 수준인 ≤3%까지 감소시키기 위한 Fractogel COO- (M) 크로마토그래피 단계에 대한 대안으로서 POROS™ XS 수지를 평가하였다. 구배 용리 및 단계 용리 실행을 수행하여 POROS™ XS 크로마토그래피 단계를 위한 작동 조건을 정의하였다. 요약하자면, 2개의 염 구배 용리 실행의 결과는 pH 6.0과 비교했을 때 pH 5.5 용리 완충액을 사용했을 때 Hab 제거가 더 양호하다는 것을 나타냈다. 그런 다음, 표 2-4에 나타낸 바와 같이, 상이한 pH 및 염 농도의 용리 완충액을 사용해 POROS™ XS 단계 용리 실행을 수행하였다. 용리물 Hab(%) 및 단계 수율 결과에 기초하여, pH 5.4 및 55 mM NaCl을 POROS™ XS 크로마토그래피를 위한 용리 조건으로 선택하였다. 표 2-5에는 여기에서 수행된 개발 작업에 기초한 POROS™ XS 크로마토그래피에 대한 공정 파라미터가 요약되어 있다.
CEX 단계에 대해 제안된 로딩 범위는 30 및 60 g/L이다. 추정된 CEX 컬럼 용리물 부피는 약 4~5 CV이다. 추정 CEX 단계 수율은 75~85%이다.
POROS™ XS 용리물을 DS를 통해 추가로 정제하고 허용 가능한 생성물 품질을 확인하였다(표 2-6).
pH 4.5 및 pH 5.0에서의 염 구배 용리 실행
pH 5.5 및 6.0에서의 염 구배 용리로 POROS™ XS를 실행한 결과 하나의 메이저 용리 피크(낮은 Hab(%)를 함유함)에 이어서 Hab가 풍부한 하나의 마이너 용리 피크가 생성되었다. pH 4.5 및 5.0에서 추가적인 염 구배 용리를 수행하여, 낮은 pH가 POROS™ XS에 의한 Hab 제거에 미치는 영향을 평가하였다. UV 크로마토그램은, 2개의 용리 피크의 불량한 해상도로 나타난 것과 같이, pH 4.5 및 5.0에서의 용리는 Hab 제거의 측면에서 POROS™ XS의 성능을 개선시키지 않았음을 시사한다.
수지 스크리닝
추가 CEX 및 혼합 모드 수지(표 2-7)를 Hab 제거에 대해 평가하고, POROS™ XS와 비교하였다. 구배 용리 및 단계 용리 실행을 수행하고, 선택적 분획을 Hab에 대해 시험하였다. 아래에 제시된 수율 및 Hab(%) 결과는 이들 수지가 Hab 제거의 측면에서 POROS™ XS보다 성능이 양호하지 않음을 나타냈다.
Capto™ S ImpAct 구배 실행
Capto™ S ImpAct HiScreen 컬럼(0.77cm (ID) x 10cm (H))을 45 g/L로 로딩하고, 이어서 표 2-8에 나타낸 것과 같이 구배 용리하였다. 하나의 단일 용리 피크만이 관찰되었다. 용리 피크를 4개의 분획으로 분획화하였다. 분획 1 및 2는 0.2 μm 여과 전에 혼탁했다. 용리 피크 높이 부근의 분획인 분획 2는 4.3% Hab를 함유하였는데, 이는 Hab에 대해 ≤3%인 목표보다 높았다. 따라서, Capto™ S ImpActwas는 추가로 평가하지 않았다.
TOYOPEARL™ GigaCap CM-650M 구배 실행
미리 채워진 TOYOPEARL™ GigaCap CM-650M 컬럼(0.8 cm(ID) x 10 cm(H))을 44 g/L로 로딩하고, Capto™ S ImpAct와 유사하게 염 구배 실행을 수행하였다. 용리 분획 수율은 표 2-10에 나타나 있다. 하나의 단일 용리 피크만이 관찰되었다. 따라서, TOYOPEARL™ GigaCap CM-650M은 추가로 평가하지 않았다.
TOYOPEARL™ 황산염 650F 구배 실행
TOYOPEARL™ 황산염 650F 미리 채워진 컬럼(0.8 cm (ID) x 10 cm (H)) 상에서 5회의 실험 실행(실행 1, 4, 5, 6, 7)을 수행하였다.
실행 1은 Capto™ S ImpAct와 유사하게 수행된 구배 실행이며, 로드 접종은 58.4 g/L이다. 수율(표 2-11)은 70%의 마브릴리무맙이 FT/세척 분획에서 상실되었음을 나타냈다. 또한, FT/세척 분획은 5.6% Hab를 함유하였는데(표 2-11), 이는 목표인 3% 이상보다 높다.
이어지는 실행 4는, 수지에 대한 생성물의 결합을 개선하기 위해 염화나트륨이 조절된 단백질 A 용리물로 수행하였다. 5M NaCl을 단백질 A 용리물에 첨가하여 100 mM NaCl의 최종 농도를 만든 다음, TOYOPEARL™ 황산염 650F 미리 채워진 컬럼 상에 45 g/L의 로드 접종으로 로딩한 다음, Capto™ S ImpAct와 유사한 구배 용리를 수행하였다. 수율은 표 2-12에 제공되어 있다.
실행 4 결과에 기초하여, 50 mM 아세트산나트륨, 125 mM NaCl, pH 5.5를 사용해 단계 용리로 실행 5를 수행하였다(실행 4는 구배 용리를 사용해 수행함). 용리물을 2개의 분획으로 수집하고, 이어서 염 스트립 단계를 수행하였다. 수율 값은 표 2-13에 제공되어 있다.
실행 6은 단백질 A 용리물을 50 mM NaCl로 조정하여 수행하였다(실행 4 및 실행 5에서는, 황산염 650F 컬럼에 로딩하기 위해 단백질 A 용리물을 100 mM NaCl로 조정함). 미리 채워진 컬럼을 45 g/L로 로딩한 다음, 50 mM 아세트산나트륨, pH 5.0으로 세척하고, 50 mM 아세트산나트륨, pH 5.0(완충액 A) 및 50 mM 아세트산나트륨, 500 mM NaCl, pH 5.0(완충액 B)으로 구배 용리하였다. 수율 값은 표 2-14에 제공되어 있다.
실행 6 결과에 기초하여, 50 mM NaCl로 조정된 단백질 A 용리물 및 단계 용리를 사용해 실행 7을 수행하였다(실행 6은 구배 용리를 사용해 수행함). 미리 충진된 컬럼을 46 g/L로 로딩한 다음 세척하고, 50 mM 아세트산 나트륨, 150 mM NaCl, pH 5.3을 사용해 단계 용리하였다. 수율 및 Hab 값의 수준은 1차 분획의 경우 각각 43% 및 3.9%였으며(표 2-15), 이는 POROS™ XS 실행보다 더 높았다. 따라서, 황산염 650F는 추가로 평가하지 않았다.
Capto™ MMC ImpRes 구배 수행
Capto™ MMC ImpRes 미리 충진된 컬럼(0.77 cm (ID) x10 cm (H))으로 3회의 구배 실행을 수행하고, 용리물 분획을 Hab에 대해 시험하였다. 작동 조건은 표 2-16, 2-17, 및 2-18에 제공되어 있다. 분획은 낮은 Hab(1.2~1.9%)를 함유하였고, 누적 수율은 약 9.3~26.7%였다. 낮은 수율을 감안하여, Capto™ MMC ImpRes 수지를 추가로 평가하지 않았다.
Capto™ adhere ImpRes 실행
단백질 A 용리액을 0.5 M 트리스 염기를 사용해 pH 6.5로 조정한 다음, Capto™ adhere ImpRes HiScreen 컬럼(0.77 cm (ID) x 10 cm (H)) 상에 로딩하였다. 표 2-22는 크로마토그래피 조건을 열거한 것이다. 마브릴리무맙은 pH 6.5에서 Capto™ adhere ImpRes에 단단히 결합하였고, 거의 100%의 용리 완충액 B에서 컬럼으로부터 용리되었다. 또한, 단일 용리 피크는 Hab가 마브릴리무맙으로부터 분리되지 않았음을 시사한다. 따라서, Capto™ adhere ImpRes에 대해서는 추가 개발을 수행하지 않았다.
POROS™ XS 크로마토그래피 최악의 경우 시나리오 실행
높은 Hab(%) 로드 및 높은 pH 용리 완충액을 사용하여 POROS™ XS 크로마토그래피의 Hab 제거 능력을 평가하였다. 아래에 요약된 결과는 POROS™ XS 크로마토그래피가 Hab를 7~10%에서 1~2%로 감소시켰음을 나타냈다.
표 2-24(실행 번호 1~4 및 8~15)에 나타낸 바와 같이, POROS™ XS 크로마토그래피는 로드 중 4.2~10.3%인 Hab를 50 mM 아세트산나트륨, 55 mM 염화나트륨, pH 5.4 용리 완충액으로 용리한 후 용리물 중 1.9~2.1%로 감소시켰다. POROS™ XS 수지의 Hab 제거 능력을 이해하기 위해, 높은 백분율의 Hab을 함유하는 로드 물질을 사용하여 POROS™ XS 크로마토그래피에 의한 Hab 환원을 평가하였다. 염 구배 용리에 의해 Hab가 풍부한(약 45%) POROS™ XS 용리 분획을 생성하였다. 그런 다음, Hab가 풍부한 분획을 10% Hab 단백질 A 용리액에 다시 첨가하여 21% Hab를 함유하는 CEX 로드를 수득하였다. POROS™ XS 크로마토그래피는, 로딩 접종이 더 낮을 때(39 g/L 수지), Hab를 CEX 로드 중 21%에서 CEX 용리물 중 2.1%까지 제거하였다(표 2-24, 실행 번호 5).
추가의 스파이크 연구를 위한 Hab가 풍부한 물질을 추가로 생성하기 위해, 용리 후 POROS™ XS 컬럼을 250 mM NaCl을 함유하는 아세테이트 완충액으로 스트리핑하였다.
고염으로 스트리핑된 Hab 풀을 Brx5 정화된 수확물에 첨가하였다. 첨가된 정화된 수확물을 단백질 A 크로마토그래피, 저 pH 바이러스 불활성화, 및 POROS™ XS 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 최악의 공정 조건 하에서, 로드 Hab 함량뿐만 아니라 용리 완충액 pH도 변화시켜 POROS™ XS 크로마토그래피 성능을 평가하였다(표 2-24, 실행 번호 16~19). Hab 결과는, 이들 실행 중 어느 것도 Hab 수준을 목표 ≤ 3% 수준으로 제거할 수 없었고, 다량의 Hab을 함유하는 CEX 로드를 제안된 로딩 범위의 상한인 60 g/L로 CEX 컬럼에 로딩할 때, CEX 단계에 대해 제안된 pH 5.4 ± 0.1, 55 mM ± 5 mM 용리 조건이 강력하지 않을 수 있었음을 나타낸다. 이에 따라, 추가 연구를 수행하였다.
로딩 연구
200L 규모 데모 실행 1로부터 생성된 CEX 로드로 미리 충진된 POROS™ XS 컬럼(0.8 cm (ID) x 20 cm (H))을 사용하여 로딩 연구를 수행하였다. 102 g/L에서 생성물 파과가 관찰되었다. 로딩 연구 실행의 수율 및 분석 결과는 표 2-25에 나타나 있다. 더 높은 로딩은 더 높은 CEX 단계 수율과 상관된다. 그러나, 더 높은 로딩은 CEX 용리액 중 더 높은 Hab(%) 및 더 낮은 IEX 주요 피크(%)와도 상관된다. 균형 단계 수율 및 생성물 품질, 30~60 g/L를 CEX 단계를 위한 로딩 범위로서 선택하였다.
실험실 규모 CEX 실행
10L 바이오리액터 실행 및 200L 데모 실행 1로부터 수확한 물질을 원료 의약품을 통해 정제하여 생성물 품질을 평가하였다. 이들 정제에서 POROS™ XS를 제2 크로마토그래피 단계로서 사용하였고, 그 결과를 아래에 요약하였다. pH 5.4로 용리 시, POROS™ XS 크로마토그래피는 Hab의 수준을 7~10%에서 2% 미만으로 감소시켰다. POROS™ XS 크로마토그래피는 응집체 감소와 HCP 제거의 관점에서도 양호한 성능을 보인다(표 2-27 및 2-28). 용리물 부피는 약 4 내지 5 CV였다. 수율은 64 내지 87%였다. 로딩 감소는 용리물 내 Hab 감소 및 더 낮은 수율과 상관 관계가 있었다(표 2-26).
파일럿 규모 CEX 실행
200L 데모 실행 1(데모 실행 1)에서의 단백질 A 용리물을 60 g/L로 로딩한 POROS™ XS 컬럼(20 cm(ID) x 20 cm(H))을 사용하여 파일럿 규모 실행을 수행하였다. 데모 실행 1에 대한 CEX UV 크로마토그램은 실험실 규모 실행과 유사하였다. 데모 실행 1의 수율은 86%로서, 실험실 규모보다 약간 높았지만 개발 실행과 일치하였다. Hab은 데모 실행 1에서 6.9%에서 1.6%로 감소하였다. 적절한 Hab 감소를 보장하기 위해, 데모 실행 2는 5.3의 용리 pH를 목표로 하였다. pH 5.4 용리와 비교했을 때, pH 5.3 용리는 CEX 용리 풀에서 Hab을 1% 미만으로 감소시켰다(RPT-0122). 그러나, pH 5.3 용리는 단계 수율을 저하시켰고(63~65%), 용리 부피는 pH 5.4 용리(4.9 CV)보다 더 컸다(6.4~7.0 CV). 데모 실행 결과 및 pH 조절을 위한 제조 능력에 기초하여, 200L 및 2000L cGMP 배치에 대해 5.35 ± 0.1의 용리 pH가 권장된다.
최악의 경우 조건에서의 CEX 실행
최악의 경우의 로딩 조건(높은 Hab(%)) 및 용리 조건(높은 pH 및 높은 염)으로 POROS™ XS 크로마토그래피를 수행하였다. 13.5%인 로드 내 Hab는, pH 5.4, 55 mM NaCl 용리 완충액을 사용하여 60 g/L로 로드 접종 후, 생성된 CES 용리물 내 Hab(%)는 3.6%이다. 제3상 상류 공정의 CEX 로드/단백질 A 용리물 내 Hab가 높게는 10~12%일 수 있는 가능성을 감안하여, 생성된 Hab 수준이 약 3% 이하가 되도록 하기 위해, 제3상 공정에 대해 제안된 CEX 용리 조건은 pH 5.35 ± 0.1, 55 ± 5 mM NaCl이고, 로드 접종은 30~60 g/L이다. 제안된 CEX 조건은, 제3상 정화 수확물에서 Hab 수준이 12~13%만큼 높을 때에도, 최종 Hab 수준이 약 3% 이하가 되도록 할 것이다.
규모 확장 계산
제안된 제3항 2000L 규모 제조 공정에는 80 cm x 20 cm CEX 컬럼이 권장된다. 2000L 규모 바이오리액터에 대한 추정 역가는 8.5 ± 1.3 g/L이다. 시설 적합성 계산에 기초하여, 2000L 바이오리액터 규모에서 CEX 사이클의 추정 수는 3 내지 5이다.
결론
POROS™ XS 크로마토그래피의 주요 기능은 Hab 제거이다. 실시예에서 제시된 결과는 POROS™ XS 크로마토그래피 단계가 Hab의 수준을 7~10%에서 약 1~2%로 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 결과는 또한 POROS™ XS 크로마토그래피에 의해 HCP 및 응집체가 제거되었음을 나타냈다. POROS™ XS 크로마토그래피에 대해 제안된 작동 조건은 표 2-30에 열거되어 있다. CEX 컬럼에 대해 제안된 로딩 범위는 30~60 g/L이다. CEX 단계에 대한 추정 수율은 용리 부피가 4~5 CV일 때 65~85%이다. 표 2-30에 있는 POROS™ XS 크로마토그래피 공정을 포함하는 비-GMP(200L) 및 GMP(200L 및 2000L) 생산 실행으로부터의 원료 의약품 및 공정-중 불순물 제거에 대한 분석 데이터는 표 4-1 및 4-2에 요약되어 있다.
실시예 3: 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 항체를 정제하기 위한 하류 공정
실시예 3은 항-GM-CFSRa 항체인 마브릴리무맙의 정제 공정을 위한 음이온 교환 크로마토그래피 단계의 개발을 기술한다. 하류 정제 공정은 표 3-1 및 도 1에 요약되어 있다.
물질
수확물
10L 및 200L 바이오리액터 실행으로부터 수집된 수확물을 사용하여 제안된 마브릴리무맙 하류 공정을 위한 AEX 컬럼 작업을 개발하였다.
분석 방법
Solo VPE를 사용해 정제된 샘플에 대한 A280 값을 측정하였다. 그런 다음, 흡광 계수 1.44 mg-1.mL.cm-1을 사용하여 단백질 농도를 계산하였다. 크기 배제 크로마토그래피, 비환원성 CE SDS, 및 이온 교환 크로마토그래피 분석을 수행하였다.
결과 및 논의
제안된 AEX 크로마토그래피 단계
산성 종, 고분자량(HMW) 불순물, 및 숙주 세포 단백질(HCP)을 감소시키기 위해, Capto™ Q ImpRes 결합 및 용리 크로마토그래피를 세번째 크로마토그래피 단계로서 선택하였다. 컬럼은 일반적으로 16~21 cm로 충진되며, 목표 상 높이는 시설 적합성을 최적화하기 위해 변경될 수 있다. 생성물 로딩 상주 시간은 4분으로 일정하게 유지된다. 컬럼에 50~60 g/L로 수지를 로딩하고 고염 완충액으로 용리한다. 산성 전하 종은 컬럼에 더 단단히 결합하고, 용리 후 고염 스트립에서 제거된다. 제안된 AEX 단계에 대한 예상 단계 수율은 60~84%이다. 단계의 공정 파라미터는 표 3-2에 기술되어 있다.
10L 바이오리액터 1~4 정제 및 수지 평가
표 3-4에 나타낸 바와 같이, 바이오리액터 1~4에서의 샘플 하위 집합을 IEC에 의해 분석하였다. 분석 IEC가 방출 시험에 사용될 것이므로, 분석 IEC를 사용하여 산성 종을 평가하기로 결정하였다.
10L 바이오리액터 1~4에서의 수확물을 사용한 정제 실행의 IEC 결과는, 산성 종을 추가로 감소시킬 필요가 있음을 나타냈다. 따라서, 세번째 연마 컬럼 단계를 위한 추가의 수지를 평가하였다.
수지 평가
단계 수율 및 제조 가능성을 유지하면서 산성 종(%)을 감소시키는 능력에 대해 3개의 수지를 평가하였다. 이들 수지는 음으로 하전된 (산성) 종에 결합하는 이들의 경향에 기초하여 선택하였다. 평가한 수지는 표 3-5 및 표 3-6에 나타나 있다.
POROS™ XQ, Capto™ Q ImpRes, 및 Capto™ adhere ImpRes 수지를 71개의 개발 규모에 걸쳐 수율, 용리 프로파일, 및 확장성에 대해 평가하였다. 선택된 생성물 풀을 생성물 품질에 대해 분석하였다. 이들 공정 풀에 대한 분석 결과는 표 3-7에 요약되어 있다. Capto™ adhere ImpRes는 가장 강력한 산성 종의 제거를 입증하였지만, 좁은 용리 pH 범위 및 이로 인한 낮은 제조가능성에 의해 제한되었다. POROS™ XQ 및 Capto™ Q ImpRes는 유사한 제조가능성 및 수율을 나타냈다. POROS™ XQ는 선택된 조건 하에 Capto™ Q ImpRes에 비해 산성 종을 제거하는 더 큰 능력에 기초하여 추가 개발을 위한 후보로서 선택되었다.
POROS™ XQ 개발, 10L 바이오리액터 5 및 7 정제, 데모 실행 1
용리 완충액 최적화 동안, 비스-트리스 완충액을 히스티딘 완충액으로 스위칭하기로 결정하였다. 이 결정은 비스-트리스 대비 다수의 공정서 수재 히스티딘을 적절히 조달하는 능력에 기초하였다. pH 7.0에서 수행된 염 구배 실행을 기준으로서 사용하여, 표 3-9에 요약된 것과 같이 여러 단계 용리 조건을 평가하였다.
이들 실행에서의 수율 및 산성 종 제거 결과에 기초하여, 50 mM 히스티딘, 125 mM NaCl, pH 7.0(실행 63 조건)을 이 단계를 위한 목표 용리 완충액으로서 선택하였으며, 이 때의 목표 로딩 pH는 7.0이었다. 분석 IEC 결과는 산성 종이 3~4% 감소하였음을 보여준다. 이들 파라미터는 수율, 산성 종 제거, 및 제조 가능성(용리 부피) 간의 균형을 가능하게 한다.
10L 바이오리액터 5 및 7의 실험실 규모 정제 실행 및 200L 데모 실행 1
바이오리액터 5 및 7을 세 번째 연마 단계로서 POROS™ XQ를 사용하여 정제하였다. 분석 IEC 데이터는 중심점 용리 조건(50 mM 히스티딘, 125 mM 염화나트륨, pH 7.0)이 69~70%의 수율로 3~5%의 산성 종 감소를 달성함을 보여준다. 바이오리액터 5 물질의 경우, 최악의 공정 조건(바이오리액터 5의 사이클 2) 하에서 (산성 종과 관련하여) 생성물 품질을 탐색하기 위해, 표 3-13에 나타낸 바와 같이 사이클들 간에 용리 완충액을 변화시켰다. 용리 완충액 pH의 감소 및 염 농도의 증가는 (목표 조건 하에서의 용리했을 때 3~5% 감소와 비교하여) AEX 컬럼 전반에 걸쳐 산성 종을 2~3% 감소시켰다.
200L 규모의 정제 공정을 확인하기 위해 데모 실행 1을 수행하였다. POROS™ XQ 컬럼을 로딩 동안, 28 g/L 수지에서 파과가 관찰하였다. 사용한 수지 로트는 XQ-037이었다. 목표 로드는, 실험실 규모로 수행된 DBC 실행(수지 로트 XQ-042)를 기준으로 45 g/L이었다. 이는, 상이한 POROS™ XQ 수지 로트들 간에 마브릴리무맙의 결합 용량에 변동성이 있었음을 나타낸다. POROS™ XQ 수지의 결합 용량 변동성을 평가하기 위해, 표 3-15에 나타낸 것과 같은 데모 실행 1과 동일한 조건에서 5개의 상이한 POROS™ XQ 수지 로트에 대해 DBC10을 수행하였다. 바이오리액터 5 및 7의 정제를 포함하여, 대부분의 개발 작업은 고용량 수지 로트 XQ-042를 사용하여 수행하였음을 참고한다.
표 3-14의 DBC10 데이터에 기초하여, POROX XQ 부하 범위의 상한은 32 g/L(40 g/L인 최저 DBC10의 80%)로 설정되어야 할 것이다. 그 결과, POROS™ XQ 수지를 사용하는 것은 제조 과정에 상당한 어려움을 야기할 것이고, 잠재적으로, 생산에 사용하기 전에 수지 로트의 결합 능력을 평가를 필요로 할 수 있다. 이와 관련된 어려움을 감안하여, 마브릴리무맙 정제 공정의 세 번째 크로마토그래피 단계로서 Capto™ Q ImpRes를 POROS™ XQ에 대한 대안으로서 평가하기로 결정하였다. Capto™ Q ImpRes는 POROS™ XQ와 동일한 리간드(사차 아민)를 가지며, 산성 종을 제거하는 것으로 이전에 나타났다.
Capto™ Q ImpRes 개발, 데모 실행 2
Capto™ Q ImpRes 용리 조건 및 로딩 용량 스크리닝
표 3-17에 나타낸 조건을 사용하여 실험실 규모에서 4개의 Capto™ Q ImpRes 수지 로트의 로딩 용량을 평가하였다. 평형화 완충액 및 로딩을 위해 5.9의 pH를 사용하였는데, 이 pH가 5.9~6.1의 pH 범위의 하한이자 결합을 위한 최악의 조건이 될 것이기 때문이다. 스크리닝된 4개의 수지 로트 모두에 대한 DBC10은 비슷하였다. 그런 다음, 80% 안전 계수를 적용하고, 상한 로딩 용량이 60 g/L 수지인 것으로 결정하였다.
pH 5 및 pH 7에서 결합 용량 평가도 수행하였다. 예상대로, 로딩 pH가 낮아지자 로딩 용량이 낮아졌는데, 이로 인해 시설에 맞게 컬럼 크기를 조정할 수 없게 될 것이다. pH 7에서, 연장된 안정성이 영향을 받을 수 있다는 우려가 있다. 따라서, pH 6.0 +/- 0.1에서의 로딩을 선택하였다.
POROS™ XQ 개발 중에 얻은 지식을 사용하여, Capto™ Q ImpRes 컬럼을 사용해 일련의 실험실 규모의 실행을 수행하여 산성 종 감소와 수율의 균형을 맞추면서 용량을 최대화하게 될 조건을 결정하였다. 이들 실행 및 관련 분석 IEC 결과는 표 3-17에 나타나 있다.
실행 4~9는 용리 염 농도를 달리하면서 6.9의 로딩 pH 및 6.9의 용리 pH에서 수행하였다. 실행 4 및 5를 65 g/L 수지로 로딩하여, 63% 초과의 수율을 유지하면서 3% 산성 종을 제거하는 능력을 입증하였다. 실행 6을 40 g/L로 로딩한 결과, 42% 수율을 얻고 6%의 산성 종이 제거되었지만, 주요 종과 염기성 종 모두가 급격하게 변동하였다.
실행 11~22는 용리 pH와 농도를 달리하면서 6.0, 6.1, 및 6.5의 로딩 pH에서 수행하였다. pH 5.9 완충액으로 용리된 실행은 4~5%의 산성 종 감소를 달성하면서 65%를 초과하는 수율을 유지하는 능력을 보여주었다. 로드 접종이 낮은 컬럼을 로딩하자, 실행 22에서 입증된 것과 같이 수율이 유의하게 감소하였다.
이들 실행의 결과에 기초하여, 용리 pH, 용리 염 농도, 및 로드 접종에 제안된 범위의 상한 및 하한에 있는 파라미터를 사용하여, 550 mAU(경로 길이 2 mm)로 설정된 하방 UV 게이트로 단일 단계 용리 실행 23~26을 수행하였다. 이전에 관찰된 바와 같이, 실행 24에서 40 g/L(DBC10의 53%)로 로딩하자 수율이 낮아졌다(50%). 실행 23은 생성물 품질에 대한 최악의 경우를 나타냈는데(높은 로드 접종, 낮은 용리 pH, 높은 용리 염 농도), 수율은 84%였고 산성 종은 2% 감소하였다. 실행 26은 수율에 대한 최악의 경우 및 생산물 품질에 대한 최선의 경우를 나타냈는데(낮은 로드 접종, 높은 용리 pH, 및 낮은 용리 염 농도), 수율은 60%였고 산성 종은 4% 감소하였다.
3번 째 연마 단계 추가의 주요 동인은 하전된 종을 조절하는 것이었지만, 표 3-19 및 표 3-20의 SEC 및 NR-CE-SDS 데이터는, AEX 컬럼도 SEC 순도를 개선시키고, 절반 항체 수준은 시험된 조건 범위에 걸쳐 유지된다는 것을 나타낸다.
상기 실행에서의 수율 및 산성 종 제거 결과에 기초하여, 50 mM 히스티딘, 105 mM NaCl, pH 6.0을 AEX 단계를 위한 목표 용리 완충액으로서 선택하였으며, 이 때의 목표 로딩 pH는 6.0이었다. 컬럼 로드 접종은 50~60 g/L로 설정하였다. 데이터 또한, 컬럼 접종이 낮아지면 수율이 낮아지고 전하 프로파일이 변경될 것임을 나타낸다. 분석 IEC 결과는 산성 종이 2~4% 감소하였음을 보여준다. 이들 파라미터는 수율, 산성 종 제거, 및 제조 가능성(용리 부피) 간의 균형을 가능하게 한다.
Capto™ Q ImpRes를 이용한 200L 데모 실행 2
연구를 가능하게 하는 데 사용하기 위한 물질을 제공하고, 200L 규모일 때의 공정 성능을 입증하기 위해 200L 데모 실행 2를 수행하였다. Capto™ Q ImpRes 단계에 대한 작동 파라미터는 표 3-22에 요약되어 있다.
전술한 바와 같이, 로딩 범위는 50~60 g/L로 설정하였는데, 이는 컬럼 접종이 낮아지면 수율이 낮아지고 전하 프로파일이 변경될 것임을 데이터가 나타내기 때문이다. 이러한 좁은 로딩 범위는 AEX 단계에 걸쳐 정제되는 단백질의 양을 최대화하기 위해 사이클 수를 최적화하는 데 사용될 수 있는 가요성 컬럼상 높이를 필요로 한다. 또한, 4분의 상주 시간을 보장하기 위해, 로드 선형 유속은 충진된 컬럼상의 높이를 기준으로 결정되게 된다. 데모 실행 2의 경우, 15.4 cm의 상 높이를 사용하고 로드 유속을 231 cm/시간으로 설정하여 4분의 상주 시간을 보장하였다. 2 사이클을 수행하였고, 그 결과는 표 3-23에 나타나 있다.
데모 실행 2 공정 성능 및 생성물 품질은 소규모 공정 개발 데이터에 부합하였다. AEX 단계를 통해 산성 종이 3% 감소하였고, 응집체 및 HCP가 약간 감소하였으며, 단계 수율은 74~75%였다. AEX 용리물을 원료의약품을 통해 순방향으로 가공하여 허용 가능한 생성물 품질을 입증하였다.
규모 확장 및 시설 적합성 고려사항
제안된 2000L 규모 제조 공정에는 60 cm x 17 cm 컬럼이 권장된다. 이는 6.5~8.5 g/L의 추정 역가를 가정한 것이다. 표 3-24에 나타낸 시설 적합성 계산에 기초하여, 2000L 규모에서의 추정 AEX 사이클 수는 2~5이다.
결론
AEX 개발 활동은 허용 가능한 단계 수율을 유지하면서 하전된 종을 강력하게 조절하는 데 중점을 두었다. Capto™ Q ImpRes 수지는 10L 및 200L 바이오리액터 규모 모두에서 2~4% 산성 종을 제거함을 입증하였다. 이 단계는 응집체와 HCP의 제거에도 기여하였다. AEX 컬럼에 대해 제안된 로딩 범위는 50~60 g/L이다. 추정 단계 수율은 용리 부피가 4.5~5.5 CV일 때 60~84%이다. 제안된 공정은 표에 자세히 기술되어 있다. 표 3-25에 있는 Capto™ Q ImpRes 크로마토그래피 공정을 포함하는 비-GMP(200L) 및 GMP(200L 및 2000L) 생산 실행으로부터의 원료 의약품 및 공정-중 불순물 제거에 대한 분석 데이터는 표 4-1 및 4-2에 요약되어 있다.
실시예 4. 2000L 규모 확장; 배치 분석
실시예 1, 2, 및 3에서 개발된 상류 및 하류 생산 공정을 생성물 품질에 영향을 미치지 않고 2000L 바이오리액터로 10배 규모를 확장하여, 상류 및 하류가 확장 가능하고 견고함을 입증하였다. 2000L 규모 확장을 포함하여, 표 1-1의 상류 공정(5일차에 배지 공급을 증가시키는 200L 공정) 및 표 2-30 및 3-25의 하류 공정을 사용하는 여러가지 비-GMP 및 GMP 생산 실행으로부터의 원료 의약품 및 공정 중 불순물 제거의 분석 데이터가 표 4-1, 4-2, 및 4-3에 요약되어 있다.
비공식적 서열 목록
서열번호 1
>NP_006131.2 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 수용체 서브유닛 알파 이소형 a 전구체[호모 사피엔스]
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEKSDLRTVAPASSLNVRFDSRTMNLSWDCQENTTFSKCFLTDKKNRVVEPRLSNNECSCTFREICLHEGVTFEVHVNTSQRGFQQKLLYPNSGREGTAAQNFSCFIYNADLMNCTWARGPTAPRDVQYFLYIRNSKRRREIRCPYYIQDSGTHVGCHLDNLSGLTSRNYFLVNGTSREIGIQFFDSLLDTKKIERFNPPSNVTVRCNTTHCLVRWKQPRTYQKLSYLDFQYQLDVHRKNTQPGTENLLINVSGDLENRYNFPSSEPRAKHSVKIRAADVRILNWSSWSEAIEFGSDDGNLGSVYIYVLLIVGTLVCGIVLGFLFKRFLRIQRLFPPVPQIKDKLNDNHEVEDEIIWEEFTPEEGKGYREEVLTVKEIT
서열번호 2 중쇄
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKVSGYTLT ELSIHWVRQA PGKGLEWMGG FDPEENEIVY
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NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG
NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK
서열번호 3 경쇄
QSVLTQPPSV SGAPGQRVTI SCTGSGSNIG APYDVSWYQQ LPGTAPKLLI YHNNKRPSGV
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TLFPPSSEEL QANKATLVCL ISDFYPGAVT VAWKADSSPV KAGVETTTPS KQSNNKYAAS
SYLSLTPEQW KSHRSYSCQV THEGSTVEKT VAPTECS
서열번호 4 중쇄 가변 영역
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSIHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEENEIVYAQRFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIVGSFSPLTLGLWGQGTMVTVSS
서열번호 5 경쇄 가변 영역
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSGSNIGAPYDVSWYQQLPGTAPKLLIYHNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCATVEAGLSGSVFGGGTKLTVL
서열번호 6 중쇄 CDR1
ELSIH
서열번호 7 중쇄 CDR2
GFDPEENEIVYAQRFQG
서열번호 8 중쇄 CDR3
VGSFSPLTLGL
서열번호 9 경쇄 CDR1
TGSGSNIGAPYDVS
서열번호 10 경쇄 CDR2
HNNKRPS
서열번호 11 경쇄 CDR3
ATVEAGLSGSV
SEQUENCE LISTING <110> KINIKSA PHARMACEUTICALS, LTD. <120> PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS FOR PRODUCING AND USING THE SAME <130> 132261-00120 <140> PCT/US2021/063995 <141> 2021-12-17 <150> 63/127,973 <151> 2020-12-18 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 400 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Lys Ser Asp Leu Arg Thr Val Ala Pro 20 25 30 Ala Ser Ser Leu Asn Val Arg Phe Asp Ser Arg Thr Met Asn Leu Ser 35 40 45 Trp Asp Cys Gln Glu Asn Thr Thr Phe Ser Lys Cys Phe Leu Thr Asp 50 55 60 Lys Lys Asn Arg Val Val Glu Pro Arg Leu Ser Asn Asn Glu Cys Ser 65 70 75 80 Cys Thr Phe Arg Glu Ile Cys Leu His Glu Gly Val Thr Phe Glu Val 85 90 95 His Val Asn Thr Ser Gln Arg Gly Phe Gln Gln Lys Leu Leu Tyr Pro 100 105 110 Asn Ser Gly Arg Glu Gly Thr Ala Ala Gln Asn Phe Ser Cys Phe Ile 115 120 125 Tyr Asn Ala Asp Leu Met Asn Cys Thr Trp Ala Arg Gly Pro Thr Ala 130 135 140 Pro Arg Asp Val Gln Tyr 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Claims (250)

  1. 감소된 수준의 절반 항체를 갖는 관심 단백질을 포함하는 제제의 제조 방법으로서, 상기 방법은 상기 관심 단백질 및 상기 절반 항체를 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 투입하는 단계, 이에 의해, 감소된 수준의 절반 항체를 갖는 관심 단백질을 포함하는 제제를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 관심 단백질을 포함하는 제제 중 절반 항체의 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 관심 단백질 및 상기 절반 항체를 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지에 투입하는 단계, 이에 의해 관심 단백질을 포함하는 제제 중 절반 항체의 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 양이온 교환 크로마토그래피를 거치는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 설프하이드릴, 설포네이트, 황산염, 카르복시메틸, 설포에틸, 설포프로필, 인산염, 및 설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 POROS™ XS CEX, Capto™ S ImpAct, TOTOPEARL™ GigaGap CM 650M, 및 TOYOPEAL™ 황산염 650F로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 결합-용리 모드로 실행되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혼합 모드 크로마토그래피 수지를 거치는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 카르복실, 하이드록실, N-벤질-N-메틸 에탄올 아민, 페닐프로필아민, 및 헥실아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는, 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capt™ MMC ImpRes 및 Capto™ Adhere ImpRes로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2.8%, 약 2%, 약 1%, 또는 약 0.5% 미만의 절반 항체를 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 약 2.8% 미만의 절반 항체를 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 약 0.1~20%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18%, 또는 약 1~17%의 절반 항체를 포함하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 약 0.6~1.7%의 절반 항체를 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 내 절반 항체의 수준은 샘플 내 절반 항체의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액을 사용하여 용리물 분획을 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 용리물 분획은 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2.8%, 약 2%, 약 1%, 또는 약 0.5% 미만의 절반 항체를 포함하는, 방법.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 용리물 분획은 약 0.1~20%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18%, 또는 약 1~17%의 절반 항체를 포함하는, 방법.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획은 약 0.6~18%의 절반 항체를 포함하는, 방법.
  23. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획은 약 1~17%의 절반 항체를 포함하는, 방법.
  25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 용리물 분획 내 절반 항체의 수준은 샘플 내 절반 항체의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소되는, 방법.
  26. 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM의 아세트산나트륨을 포함하는, 방법.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 40~60 mM의 아세트산나트륨을 포함하는, 방법.
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM의 염화나트륨을 포함하는, 방법.
  29. 제18항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 40~60 mM의 염화나트륨을 포함하는, 방법.
  30. 제18항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 4~7, 약 5~6, 약 5~5.5의 pH를 포함하는, 방법.
  31. 제18항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 5~5.5의 pH를 포함하는, 방법.
  32. 제18항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 50 mM의 아세트산나트륨, 약 55 mM 염화나트륨, 및 약 5.35의 pH를 포함하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질은 약 10~100 g/L, 약 20~90 g/L, 약 30~80 g/L, 약 40~70 g/L, 또는 약 50~60 g/L의 수준으로 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지 상에 로딩되는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질은 약 30~60 g/L의 수준으로 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지 상에 로딩되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 절반 항체의 수준은 비환원 CE-SDS(도데실황산나트륨을 이용한 모세관 전기영동)에 의해 결정되는, 방법.
  36. 조성물로서, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2.8%, 약 2%, 약 1%, 또는 약 0.5% 미만의 절반 항체를 포함하는 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 조성물은 약 2.8% 미만의 절반 항체를 포함하는, 조성물.
  38. 제36항에 있어서, 조성물은 약 0.1~20%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18% 또는 약 1~17%의 절반 항체를 포함하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 조성물은 약 0.6~1.7%의 절반 항체를 포함하는, 조성물.
  40. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2.8%, 약 2%, 약 1%, 또는 약 0.5%의 절반 항체를 포함하는, 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 용리물 분획은 약 0.1~20%, 약 0.1~10%, 약 0.1~9%, 약 0.1~8%, 약 0.1~7%, 약 0.1~6%, 약 0.1~5%, 약 0.1~4%, 약 0.1%~3%, 약 0.1%~2.8%, 약 0.5%~2.5%, 약 0.5%~1.5%, 약 0.6~1.7%, 약 0.6~18% 또는 약 1~17%의 절반 항체를 포함하는, 조성물.
  42. 제40항에 있어서, 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.6~18%의 절반 항체를 포함하는, 조성물.
  43. 제40항에 있어서, 용리물 분획은 혼합 모드 수지로부터 수집되고 약 1~17%의 절반 항체를 포함하는, 조성물.
  44. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집된 관류 분획 및/또는 세척 분획을 포함하고, 상기 관류 분획 및/또는 세척 분획은 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 14%, 약 13%, 약 12%, 약 11%, 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 또는 약 1%의 절반 항체를 포함하는, 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 유동 통과 및/또는 세척 분획은 약 6% 미만의 절반 항체를 포함하는, 조성물.
  46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 절반 항체의 수준은 비환원 CE-SDS(도데실황산나트륨을 이용한 모세관 전기영동)에 의해 결정되는, 조성물.
  47. 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙인, 조성물.
  48. 제36항 내지 제47항 중 어느 한 항의 조성물, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
  49. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 제제를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분 및 산성 종을 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 정제하여, 상기 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고 감소된 수준의 산성 종을 갖는 제제를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  50. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 제제에서 산성 종의 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 샘플 및 산성 종을 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 정제하여 상기 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 제제에서 상기 산성 종의 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙인, 방법.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 음이온 교환 크로마토그래피를 거치는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 디에틸아미노에틸, 4차 아미노에틸, 및 4차 아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는, 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 POROS™ XQ AEX 및 Capto™ Q ImpRes로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 결합-용리 모드로 실행되는, 방법.
  56. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 혼합 모드 크로마토그래피 수지를 거치는, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 카르복실, 하이드록실, N-벤질-N-메틸 에탄올 아민, 페닐프로필아민, 및 헥실아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는, 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capto™ Adhere ImpRes인, 방법.
  59. 제49항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5% 미만의 산성 종을 포함하는, 방법.
  60. 제49항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 산성 종을 포함하는, 방법.
  61. 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 약 11~22%의 산성 종을 포함하는, 방법.
  62. 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 약 11~38%의 산성 종을 포함하는, 방법.
  63. 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 약 9~18%의 산성 종을 포함하는, 방법.
  64. 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 약 11~38%의 산성 종 및 약 24% 미만의 염기성 종을 포함하는, 방법.
  65. 제49항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 약 11~38%의 산성 종 및 다음 중 하나를 포함하는, 방법: (i) 약 58~62%의 주요 종; 또는 (ii) 약 64% 초과의 주요 종.
  66. 제49항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액을 사용하여 용리물 분획을 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 용리물 분획은 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5% 미만의 산성 종을 포함하는, 방법.
  68. 제66항 또는 제67항에 있어서, 용리물 분획은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 산성 종을 포함하는, 방법.
  69. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획은 약 11~22%의 산성 종을 포함하는, 방법.
  71. 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획은 약 12~38%의 산성 종을 포함하는, 방법.
  73. 제66항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 제제 또는 용리물 분획 내 산성 종의 수준은 샘플 내 산성 종의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소되는, 방법.
  74. 제66항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 50~200 mM, 약 70~150 mM, 약 90~130 mM, 또는 약 100~110 mM의 염화나트륨을 포함하는, 방법.
  75. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 100~110 mM의 염화나트륨을 포함하는, 방법.
  76. 제66항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 20~150 mM, 약 30~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM의 히스티딘을 포함하는, 방법.
  77. 제66항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 40~60 mM의 히스티딘을 포함하는, 방법.
  78. 제66항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM의 아세트산염을 포함하는, 방법.
  79. 제66항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 40~60 mM의 아세트산염을 포함하는, 방법.
  80. 제66항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 1~500 mM, 약 10~250 mM, 약 10~150 mM, 약 10~100 mM, 약 20~90 mM, 약 30~80 mM, 약 40~70 mM, 또는 약 50~60 mM의 비스-트리스를 포함하는, 방법.
  81. 제66항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 40~60 mM의 비스-트리스를 포함하는, 방법.
  82. 제66항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 5~7 또는 약 5.5~6.5의 pH를 포함하는, 방법.
  83. 제66항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 5.5~6.5의 pH를 포함하는, 방법.
  84. 제66항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액은 약 50 mM의 히스티딘, 약 105 mM의 NaCl을 포함하고, 약 6.0의 pH를 갖는, 방법.
  85. 제49항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질은 약 10~100 g/L, 약 20~90 g/L, 약 30~80 g/L, 또는 약 40~70 g/L의 수준으로 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지 상에 로딩되는, 방법.
  86. 제49항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 단백질은 약 50~60 g/L의 수준으로 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지 상에 로딩되는, 방법.
  87. 제49항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 종의 수준은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 결정되는, 방법.
  88. 제49항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플을 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 처리하기 전에, 상기 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 처리하는, 방법.
  89. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5%의 항체의 산성종을 포함하는, 조성물.
  90. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 산성 종을 포함하는, 조성물.
  91. 제90항에 있어서, 상기 조성물은 약 11~22%의 산성 종을 포함하는, 조성물.
  92. 제90항에 있어서, 상기 조성물은 약 9~18%의 산성 종을 포함하는, 조성물.
  93. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5%의 항체의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  94. 제93항에 있어서, 상기 조성물은 약 24% 미만의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  95. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 1~45%, 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~25%, 약 5~35%, 약 10~35%, 약 15~35%, 약 1~30%, 약 1~25%, 약 1~24%, 약 5~25%, 약 5~30%, 약 5~45%, 약 10~25%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 15~25%, 약 15~30%, 약 15~35%, 약 15~25%, 약 17~26%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16~41%의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 상기 조성물은 약 16~41%의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  97. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 또는 약 99%를 초과하는 항체의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 상기 조성물은 약 64% 초과의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  99. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 40%~99%, 약 45%~99%, 약 50%~99%, 약 55%~99%, 약 50%~90%, 약 55%~90%, 약 50%~80%, 약 55%~80%, 약 50%~70%, 약 55%~70%, 약 50~65%, 약 46~67%, 약 55~65%, 약 58~62%, 약 58~63%, 약 58~67%, 약 53~61%, 또는 약 46~66%의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  100. 제99항에 있어서, 상기 조성물은 약 46~67%의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  101. 제99항에 있어서, 상기 조성물은 약 58~62%의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  102. 제89항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 11~38%의 산성 종 및 24% 미만의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  103. 제89항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 11~38%의 산성 종 및 64% 초과의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  104. 제89항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 11~38%의 산성 종 및 58~62%의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  105. 제89항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 9~41%의 염기성 종 및 9~18%의 산성 종을 포함하는, 조성물.
  106. 제89항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 9~41%의 염기성 종 및 64% 초과의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  107. 제89항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 16~41%의 염기성 종 및 58~62%의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  108. 제89항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 46~67%의 주요 종 및 9~18%의 산성 종을 포함하는, 조성물.
  109. 제89항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 46~67%의 주요 종 및 24% 미만의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  110. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5%의 산성 종을 포함하는, 조성물.
  111. 항-GM-CSFRα 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~30%, 약 1~28%, 약 1~25%, 약 2~20%, 약 3~15%, 약 5~25%, 약 5~28%, 약 5~30%, 약 10~28%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 9~18%, 약 11~22%, 약 11~38%, 약 12~20%, 약 12~38%, 약 15~30%, 약 14~28%, 또는 약 18~40%의 산성 종을 포함하는, 조성물.
  112. 제111항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 11~38%의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  113. 제111항에 있어서, 상기 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고, 약 11~22%의 산성 종을 포함하는, 조성물.
  114. 제111항에 있어서, 상기 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되고, 약 12~38%의 산성 종을 포함하는, 조성물.
  115. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 24%, 약 23%, 약 22%, 약 21%, 약 20%, 약 19%, 약 18%, 약 17%, 약 16%, 약 15%, 약 10%, 또는 약 5%의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  116. 항-GM-CSFRα 항체, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 1~45%, 약 1~40%, 약 1~35%, 약 1~25%, 약 5~35%, 약 10~35%, 약 15~35%, 약 1~30%, 약 1~25%, 약 1~24%, 약 5~25%, 약 5~30%, 약 5~45%, 약 10~25%, 약 10~30%, 약 10~40%, 약 15~25%, 약 15~30%, 약 15~35%, 약 15~25%, 약 17~26%, 약 9~29%, 약 9~41%, 또는 약 16~41%의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  117. 제116항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 9~41%의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  118. 제116항에 있어서, 상기 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되고, 약 9~29%의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  119. 제116항에 있어서, 상기 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고, 약 16~41%의 염기성 종을 포함하는, 조성물.
  120. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99% 초과의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  121. 본 발명은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 음이온 교환 크로마토그래피 수지 또는 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 상기 용리물 분획은 약 40~99%, 약 45~99%, 약 50~99%, 약 55~99%, 약 50~90%, 약 55~90%, 약 50~80%, 약 55~80%, 약 50~70%, 약 55~70%, 약 50~65%, 약 55~65%, 약 58~62%, 약 58~63%, 약 58~67%, 약 46~67%, 약 53~61%, 또는 약 46~66%의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  122. 제121항에 있어서, 상기 용리물 분획은 혼합 모드 크로마토그래피 수지로부터 수집되고, 약 53~61%의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  123. 제121항에 있어서, 상기 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고, 약 46~66%의 주요 종을 포함하는, 조성물.
  124. 제110항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙인, 조성물.
  125. 제110항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 산성 종의 수준, 주요 종의 수준, 또는 염기성 종의 수준은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 결정되는, 조성물.
  126. 제110항 내지 제125항 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  127. 감소된 수준의 고분자량 응집체 및/또는 숙주 세포 단백질을 갖는 관심 단백질을 포함하는 제제를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 관심 단백질, 고분자량 응집체, 및/또는 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피 수지로 처리하여 감소된 수준의 고분자량 응집체 및/또는 숙주 세포 단백질을 갖는 관심 단백질을 포함하는 제제를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  128. 관심 단백질을 포함하는 제제에서 고분자량 응집체 및/또는 숙주 세포 단백질의 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 관심 단백질 및 절반 항체를 포함하는 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피 수지로 처리하여, 관심 단백질을 포함하는 제제에서 고분자량 응집체 및/또는 숙주 세포 단백질의 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  129. 제127항 또는 제128항에 있어서, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 방법.
  130. 제127항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 방법.
  131. 제127항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙인, 방법.
  132. 제127항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지인, 방법.
  133. 제132항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 설프하이드릴, 설포네이트, 황산염, 카르복시메틸, 설포에틸, 설포프로필, 인산염, 및 설포네이트로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는, 방법.
  134. 제132항 또는 제133항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 POROS™ XS CEX, Capto™ S ImpAct, TOTOPEARL™ GigaGap CM 650M, 및 TOYOPEAL™ 황산염 650F로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  135. 제132항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온 교환 크로마토그래피 수지는 결합-용리 모드로 실행되는, 방법.
  136. 제127항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 수지는 음이온 교환 크로마토그래피 수지인, 방법.
  137. 제136항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 디에틸아미노에틸, 4차 아미노에틸, 및 4차 아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는, 방법.
  138. 제136항 또는 제137항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 POROS™ XQ AEX 및 Capto™ Q ImpRes로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  139. 제136항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 결합-용리 모드로 실행되는, 방법.
  140. 제127항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 크로마토그래피 수지는 혼합 모드 크로마토그래피 수지인, 방법.
  141. 제140항에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 카르복실, 하이드록실, N-벤질-N-메틸 에탄올 아민, 페닐프로필아민, 및 헥실아민으로 이루어진 군으로부터 선택된 작용기를 포함하는, 방법.
  142. 제140항 또는 제141항에 있어서, 혼합 모드 크로마토그래피 수지는 Capt™ MMC ImpRes 및 Capto™ Adhere ImpRes로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  143. 제127항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2.8%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  144. 제143항에 있어서, 상기 제제는 0.5% 미만의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  145. 제127항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  146. 제145항에 있어서, 상기 제제는 0.04~0.8%의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  147. 제127항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제 내 고분자량 응집체의 수준은 샘플 내 고분자량 응집체의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소되는, 방법.
  148. 제127항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 HCP를 포함하는, 방법.
  149. 제127항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 약 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8, 또는 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함하는, 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 제제는 약 0.1~2 ppm의 HCP를 포함하는, 방법.
  151. 제127항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제 내 HCP의 수준은 샘플 내 HCP의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소되는, 방법.
  152. 제127항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1% 또는 약 99.5% 초과의 관심 단백질의 단량체를 포함하는, 방법.
  153. 제152항에 있어서, 상기 제제는 약 99.1% 초과의 관심 단백질의 단량체를 포함하는, 방법.
  154. 제127항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 관심 단백질의 단량체를 포함하는, 방법.
  155. 제154항에 있어서, 상기 제제는 약 98~99%의 관심 단백질의 단량체를 포함하는, 방법.
  156. 제154항에 있어서, 상기 제제는 약 98~99.9%의 관심 단백질의 단량체를 포함하는, 방법.
  157. 제127항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 관심 단백질 단편을 포함하는, 방법.
  158. 제157항에 있어서, 상기 제제는 약 0.4% 미만 또는 0.3% 미만의 관심 단백질 단편을 포함하는, 방법.
  159. 제127항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 관심 단백질 단편을 포함하는, 방법.
  160. 제159항에 있어서, 상기 제제는 약 0.6~1.5%의 관심 단백질 단편을 포함하는, 방법.
  161. 제159항에 있어서, 상기 제제는 약 0.5~1.5%의 관심 단백질 단편을 포함하는, 방법.
  162. 제127항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충액을 사용하여 용리물 분획을 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  163. 제162항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2.8%, 약 2%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  164. 제162항 또는 제163항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.04~0.8%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.5~0.8%, 약 0.1~6%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  165. 제162항 내지 제164항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리물 분획은 0.04~0.8%의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  166. 제162항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리물 분획은 양이온 교환 수지로부터 수집되고 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.04~0.2%, 약 0.04~0.8%, 약 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.5~0.7%, 약 0.1~6%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  167. 제166항에 있어서, 상기 용리물 분획은 양이온 교환 수지로부터 수집되고 약 0.1~0.4%의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  168. 제162항 내지 제165항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리물 분획은 음이온 교환 수지로부터 수집되고 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.0~1%, 약 0.04~0.2%, 약 0.04~0.8%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  169. 제168항에 있어서, 상기 용리물 분획은 음이온 교환 수지로부터 수집되고 약 0.04~0.2%의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  170. 제162항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리물 분획 내 고분자량 응집체의 수준은 샘플 내 고분자량 응집체의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소되는, 방법.
  171. 제162항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 HCP를 포함하는, 방법.
  172. 제162항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8 ppm, 또는 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함하는, 방법.
  173. 제172항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함하는, 방법.
  174. 제172항에 있어서, 상기 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~2 ppm의 HCP를 포함하는, 방법.
  175. 제172항에 있어서, 상기 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 2~8 ppm의 HCP를 포함하는, 방법.
  176. 제162항 내지 제175항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리물 분획 내 HCP의 수준은 샘플 내 HCP의 수준과 비교했을 때 적어도 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10%만큼 감소되는, 방법.
  177. 제162항 내지 제176항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1% 또는 약 99.5% 초과의 관심 단백질의 단량체를 포함하는, 방법.
  178. 제162항 내지 제177항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 94~99.9%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 관심 단백질의 단량체를 포함하는, 방법.
  179. 제178항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 98~99.9%의 관심 단백질의 단량체를 포함하는, 방법.
  180. 제178항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 98.5~99.5%의 관심 단백질의 단량체를 포함하는, 방법.
  181. 제162항 내지 제180항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 관심 단백질 단편을 포함하는, 방법.
  182. 제162항 내지 제181항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.5~1.5%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.1~1.1%, 약 0.1~0.8%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 관심 단백질 단편을 포함하는, 방법.
  183. 제182항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 0.1~1.1%, 약 0.1~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 관심 단백질 단편을 포함하는, 방법.
  184. 제182항에 있어서, 상기 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피로부터 수집되고 약 0.1~0.8% 또는 약 0.4~0.8%의 관심 단백질 단편을 포함하는, 방법.
  185. 제182항에 있어서, 상기 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피로 수지로부터 수집되고 약 0.1~1.1% 또는 약 0.5~1.1%의 관심 단백질 단편을 포함하는, 방법.
  186. 제127항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 고분자량 응집체의 수준, 관심 단백질 단편의 수준, 또는 관심 단백질의 단량체의 수준은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정되는, 방법.
  187. 제127항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, HCP의 수준은 ELISA에 의해 결정되는, 방법.
  188. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조서물은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 고분자량 응집체를 포함하는, 조성물.
  189. 제188항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.5% 미만의 고분자량 응집체를 포함하는, 조성물.
  190. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 0.01~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.04~0.4%, 약 0.04~0.8%, 약 0.5~0.8%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함하는, 조성물.
  191. 제190항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.04~0.8%의 고분자량 응집체를 포함하는, 조성물.
  192. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함하는, 방법.
  193. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8, 또는 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함하는, 조성물.
  194. 제193항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.1~2 ppm의 HCP를 포함하는, 조성물.
  195. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 또는 약 99.5% 초과의 항체 단량체를 포함하는, 조성물.
  196. 제195항에 있어서, 상기 조성물은 약 99.1% 초과의 항체 단량체를 포함하는, 조성물.
  197. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 항체 단량체를 포함하는, 조성물.
  198. 제197항에 있어서, 상기 조성물은 약 98~99%의 항체 단량체를 포함하는, 조성물.
  199. 제197항에 있어서, 상기 조성물은 약 98~99.9%의 항체 단량체를 포함하는, 조성물.
  200. 항-GM-CSFRα 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2% 또는 약 0.1% 미만의 항체 단편을 포함하는, 조성물.
  201. 제200항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.4% 미만의 항체 단편을 포함하는, 조성물.
  202. 항-GM-CSFRα 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 항체 단편를 포함하는, 조성물.
  203. 제202항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.5~1.5%의 항체 단편을 포함하는, 조성물.
  204. 제202항에 있어서, 상기 조성물은 약 0.6~1.5%의 항체 단편을 포함하는, 조성물.
  205. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 1%, 약 0.9%, 약 0.8%, 약 0.7%, 약 0.6%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1%의 고분자량 응집체를 포함하는, 조성물.
  206. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 용리물 분획은 약 0.1~10%, 약 0.01~5%, 약 0.01~1%, 약 0.04~0.8%, 약 0.04~0.2%, 약 0.1~0.4%, 약 0.5~0.8%, 약 0.1~6%, 약 0.04~0.4%, 약 1~10%, 약 2~10%, 약 3~10%, 또는 약 4~10%의 고분자량 응집체를 포함하는, 조성물.
  207. 제206항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 0.04~0.4%의 고분자량 응집체를 포함하는, 조성물.
  208. 제206항에 있어서, 상기 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.04~0.2%의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  209. 제206항에 있어서, 상기 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~0.4%의 고분자량 응집체를 포함하는, 방법.
  210. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 용리물 분획은 약 10, 약 9, 약 8, 약 7, 약 6, 약 5, 약 4, 약 3, 약 2, 약 1, 약 0.9, 약 0.8, 약 0.7, 약 0.6, 또는 약 0.5 ppm 미만의 숙주 세포 단백질을 포함하는, 조성물.
  211. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 용리물 분획은 약 0.1~10, 약 1~10, 약 2~10, 약 3~10, 약 4~10, 약 1~5, 약 5~10, 약 0.1~2, 약 0.1~3, 약 2~8 ppm, 또는 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함하는, 조성물.
  212. 제211항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 0.1~8 ppm의 HCP를 포함하는, 방법.
  213. 제211항에 있어서, 상기 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~2 ppm의 HCP를 포함하는, 조성물.
  214. 제211항에 있어서, 상기 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 2~8 ppm의 HCP를 포함하는, 조성물.
  215. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 용리물 분획은 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.1%, 또는 약 99.5% 초과의 항체 단량체를 포함하는, 조성물.
  216. 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 용리물 분획은 약 90~99.9%, 약 90~95%, 약 94~99.9%, 약 95~99.9%, 약 99~99.9%, 약 99.1~99.9%, 약 98~99%, 약 98~99.9%, 또는 약 98.5~99.5%의 항체 단량체를 포함하는, 조성물.
  217. 제216항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 98~99.9%의 항체 단량체를 포함하는, 조성물.
  218. 제216항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 98.5~99.5%의 항체를 포함하는, 조성물.
  219. 항-GM-CSFRα 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 용리물 분획은 약 10%, 약 9%, 약 8%, 약 7%, 약 6%, 약 5%, 약 4%, 약 3%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.4%, 약 0.3%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% 미만의 항체 단편을 포함하는, 조성물.
  220. 항-GM-CSFRα 항체를 포함하는 조성물로서, 상기 조성물은 크로마토그래피 수지로부터 수집된 용리물 분획을 포함하고, 크로마토그래피 수지는 양이온 교환 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 크로마토그래피 수지, 및 혼합 모드 크로마토그래피 수지로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 용리물 분획은 약 0.1~10%, 약 0.1~5%, 약 0.1~3%, 약 0.1~2%, 약 0.1~1.1%, 약 0.1~0.8%, 약 0.6~1.5%, 약 0.5~1.5%, 약 0.5~1.1%, 약 0.4~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 항체 단편을 포함하는, 조성물.
  221. 제220항에 있어서, 상기 용리물 분획은 약 0.1~1.1%, 약 0.1~0.8%, 또는 약 0.4~1.1%의 항체 단편을 포함하는, 방법.
  222. 제220항에 있어서, 상기 용리물 분획은 음이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~1.1%, 또는 약 0.5~1.1%의 항체 단편을 포함하는, 조성물.
  223. 제220항에 있어서, 상기 용리물 분획은 양이온 교환 크로마토그래피 수지로부터 수집되고 약 0.1~0.8%, 또는 약 0.4~0.8%의 항체 단편을 포함하는, 조성물.
  224. 제188항 내지 제223항 중 어느 한 항에 있어서, 고분자량 응집체의 수준, 항체 단량체의 수준, 및/또는 항체 단편의 수준은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정되는, 조성물.
  225. 제188항 내지 제223항 중 어느 한 항에 있어서, HCP의 수준은 ELISA에 의해 결정되는, 조성물.
  226. 제188항 내지 제223항 중 어느 한 항에 있어서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙인, 조성물.
  227. 세포 배양물로부터 감소된 수준의 산성 종을 갖는 관심 단백질을 포함하는 제제를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계;
    (b) 상기 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5의 pH로 유지하는 단계; 및 이에 의해 산성 종의 수준이 감소된 관심 단백질을 포함하는 제제를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  228. 세포 배양물에서 관심 단백질의 산성 종의 수준을 감소시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계;
    (b) 상기 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5의 pH로 유지하는 단계; 및 이에 의해 관심 단백질의 산성 종의 수준을 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  229. 세포 배양물로부터 관심 단백질의 생산 수율을 증가시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 상기 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계;
    (b) 상기 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5의 pH로 유지시키는 단계; 및 이에 의해 관심 단백질의 생산 수율을 증가시키는 단계를 포함하는, 방법.
  230. 제227항 또는 제229항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 방법.
  231. 제230항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 방법.
  232. 제231항에 있어서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙인, 방법.
  233. 제227항 내지 제232항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물의 pH는 약 6~7.5, 약 6.5~7.5, 약 6~7, 약 6.5~7, 또는 약 6.7~7의 pH로 유지되는, 방법.
  234. 제227항 내지 제233항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물의 pH는 약 6.5~7의 pH로 유지되는, 방법.
  235. 제227항 내지 제234항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물의 pH는 인큐베이션 기간의 2일차 내지 8일차 동안 약 0.01~0.4, 약 0.02~0.4, 약 0.05~0.3, 약 0.1~0.4, 약 0.1~0.3, 약 0.1~0.2, 또는 약 0.1~0.2만큼 감소되지만, 약 6.5~7의 pH로 유지되는, 방법.
  236. 제227항 내지 제235항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물의 pH는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계에 의해 유지되는, 방법:
    (a) 상기 세포 배양물에서 CO2의 수준을 증가시키는 단계;
    (b) 상기 세포 양물에서 젖산염의 수준을 약 0.1~5 g/L로 유지하는 단계;
    (c) 상기 세포 배양물에서 젖산염 생산을 증가시키는 단계; 및
    (d) 상기 인큐베이션 기간 동안 세포 배양 보충제의 수준을 증가시키는 단계.
  237. 제236항에 있어서, 상기 세포 배양물 내 CO2의 수준은 적어도 약 0.1%, 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9% 또는 약 10%만큼 증가되는, 방법.
  238. 제236항에 있어서, 상기 세포 배양물 내 CO2의 수준은 약 0.1~5%, 약 0.2~6%, 약 0.3~7%, 약 0.4~8%, 또는 약 0.5~10%만큼 증가되는, 방법.
  239. 제236항에 있어서, 상기 세포 배양물 내 젖산염의 수준은 약 0.1~5 g/L, 0.1~4 g/L, 0.1~3 g/L, 0.1~2 g/L, 0.2~2 g/L, 약 0.3~2 g/L, 약 0.4~2 g/L, 약 0.5~2 g/L, 약 0.6~2 g/L, 약 0.7~2 g/L, 약 0.8~2 g/L, 약 0.9~2 g/L, 약 0.1~1.9, 약 0.2~1.8, 약 0.3~1.7, 약 0.4~1.6, 약 0.5~1.5 g/L, 약 0.6~1.4, 약 0.7~1.3, 약 0.8~1.2, 또는 약 0.9~1.1로 유지되는, 방법.
  240. 제236항에 있어서, 상기 세포 배양 보충제는 하나 이상의 보충제를 포함하는, 방법.
  241. 제240항에 있어서, 상기 세포 배양 보충제의 수준은 인큐베이션 기간 동안 약 0.1%~20%, 약 0.1%~10%, 약 0.1%~5%, 약 0.5%~20%, 약 0.5%~10%, 또는 약 1%~10%만큼 증가되는, 방법.
  242. 제240항에 있어서, 인큐베이션 기간의 2일차 내지 8일차 동안 약 0.1~3% 수준의 상기 세포 배양 보충제가 상기 세포 배양물에 첨가되고, 상기 세포 배양 보충제의 수준은 인큐베이션 기간의 4일차 내지 10일차 동안 초기 수준의 약 50% 이상만큼 증가되는, 방법.
  243. 제236항에 있어서, 상기 세포 배양 보충제를 증가시키면 젖산염 생산이 증가되고, 오스몰농도가 증가되고, 세포 생존율이 증가되고/되거나, 세포 배양물의 pH가 감소하는, 방법.
  244. 제227항 내지 제243항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 약 35~37℃의 온도로 유지되는, 방법.
  245. 세포 배양물로부터 감소된 수준의 산성 종을 갖는 관심 단백질을 포함하는 제제를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계; 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 상기 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5, 약 6~7, 또는 약 6.5~7의 pH로 유지하는 단계;
    (b) 인큐베이션 기간 동안 상기 세포 배양 보충제의 수준을 증가시키는 단계;
    (c) 상기 세포 배양물에서 젖산염의 수준을 약 0.1~5 g/L로 유지하는 단계;
    (d) 상기 세포 배양물에서 젖산염 생산을 증가시키는 단계;
    (e) 상기 세포 배양물에서 CO2의 수준을 증가시키는 단계; 및/또는
    (f) 상기 세포 배양물의 pH를 감소시켜, 산성 종의 수준이 감소된 상기 관심 단백질을 포함하는 제제를 제조하는 단계.
  246. 세포 배양물에서 관심 단백질의 산성 종의 수준을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계; 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 상기 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5, 약 6~7, 또는 약 6.5~7의 pH로 유지하는 단계;
    (b) 인큐베이션 기간 동안 상기 세포 배양 보충제의 수준을 증가시키는 단계;
    (c) 상기 세포 배양물에서 젖산염의 수준을 약 0.1~5 g/L로 유지하는 단계;
    (d) 상기 세포 배양물에서 젖산염 생산을 증가시키는 단계;
    (e) 상기 세포 배양물에서 CO2의 수준을 증가시키는 단계; 및/또는
    (f) 상기 세포 배양물의 pH를 감소시켜 상기 관심 단백질의 산성 종의 수준을 감소시키는 단계.
  247. 세포 배양물에서 관심 단백질의 생산 수유을 증가시키는 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포 배양물을 바이오리액터에서 인큐베이션하는 단계; 및 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 상기 세포 배양물의 pH를 약 6~7.5, 약 6~7, 또는 약 6.5~7의 pH로 유지하는 단계;
    (b) 인큐베이션 기간 동안 상기 세포 배양 보충제의 수준을 증가시키는 단계;
    (c) 상기 세포 배양물에서 젖산염의 수준을 약 0.1~5 g/L로 유지하는 단계;
    (d) 상기 세포 배양물에서 젖산염 생산을 증가시키는 단계;
    (e) 상기 세포 배양물에서 CO2의 수준을 증가시키는 단계; 및/또는
    (f) 상기 세포 배양물의 pH를 감소시켜, 상기 관심 단백질의 생산 수율을 증가시키는 단계.
  248. 제245항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 방법.
  249. 제245항 내지 제248항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 방법.
  250. 제245항 내지 제249항 중 어느 한 항에 있어서, 항-GM-CSFRα 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 마브릴리무맙인, 방법.
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