JP2024514306A - 混合モードクロマトグラフィーによる抗体の精製 - Google Patents

Abstract

本明細書では、フロースルーモードで動作するイオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モードクロマトグラフィー材料（ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ）を使用して抗体を製造又は精製するための方法であって、抗体が親水性抗体であり、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中で抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料に適用される、方法が報告される。

Description

本発明は、抗体精製の分野にある。特に、本発明は、イオン交換及び疎水性相互作用官能性を有する混合モード（すなわち、マルチモーダル）クロマトグラフィー材料を使用して、抗体をフロースルーモードで処理する、親水性抗体の製造又は精製のための方法に関する。特に、方法は、混合モードクロマトグラフィー材料に適用される溶液中のアンチカオトロピック塩の使用を含む。

発明の背景
モノクローナル抗体は、治療製品の非常に成功したクラスであることが証明されている。これらの組換え生物医薬タンパク質がヒト患者への投与に許容されるためには、製造及び精製プロセスから生じる不純物並びに生成物に関連する不純物が最終生物学的生成物から除去されることが重要である。プロセス成分としては、培養培地タンパク質、免疫グロブリン親和性リガンド、ウイルス、内毒素、ＤＮＡ、及び宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が挙げられる。生成物に関連するさらなる不純物としては、不完全に組み立てられた抗体又は断片のような低分子量（ＬＭＷ）不純物が挙げられる。更に、二量体、三量体、多量体又は一般的な凝集体のような高分子量（ＨＭＷ）不純物もまた、薬学的抗体の製造において生じ得る。

タンパク質凝集の現象は、抗体の品質、安全性、及び有効性を損なう共通の問題であり、製造プロセスの様々な工程で起こり得る。凝集はバイオ医薬品の生物学的活性に影響を及ぼす可能性があるため、原薬及び最終製剤中の凝集体レベルは、分子の品質属性を評価する際の重要な因子である。単量体タンパク質の活性と比較した凝集体の生物学的活性の差は、タンパク質ベースの薬物の効力を著しく損なう可能性がある。

精製中、クロマトグラフィーは、典型的には、凝集物又はＨＭＷ除去に主に寄与する工程である。特定のクロマトグラフィー材料及び動作様式の選択は、全体的なプロセス精製トレインとの適合性及び適合性、並びに生産性、収率及び製品品質の適切なバランスによって導かれるべきである。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、治療用抗体の製造における第１の精製工程として使用されることが多い。生成物凝集体は、生成物のモノマー形態と同様にクロマトグラフィーリガンドに結合する可能性があるため、この精製工程は通常、凝集体を除去できないか、又はほとんど除去できない。イオン（アニオン及びカチオン）交換クロマトグラフィーの使用は、抗体モノマーを二量体及びＬＭＷ種から分離するために生産規模で有用であることが実証されている。国際公開第９９／６２９３６号は、イオン交換クロマトグラフィーの使用による凝集体からのモノマーの分離を報告している。凝集体及びＨＣＰ等の不純物の両方の除去に主に使用されてきた疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって、疎水性の違いに基づいて抗体モノマーを凝集体から分離することが可能である（Ｌｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０（４）：４２７－４３３（非特許文献1））。抗体の疎水性は凝集と共に増加し、これは、理論的にも実際的にも有意であるという事実である（Ｓｕｄａ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １２１６（２７）：５２５６－５２６４（非特許文献2））。更に、混合モード又はマルチモーダルクロマトグラフィーは、抗体精製及び凝集体除去に広く使用されている。例えば、Ｇａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０（４）：４３４－４３９）（非特許文献3）は、電荷疎水性混合モードクロマトグラフィーによる凝集体除去を報告している。また、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１２９４ ７０－７５）（非特許文献4）は、混合モードクロマトグラフィーを使用した会合凝集体からの抗体モノマーの分離を記載している。

ＨＭＷ又は凝集物のような生成物関連不純物の低減に加えて、ＨＣＰ又はウイルス粒子のようなプロセス関連不純物も精製中に除去される必要がある。ウイルス混入は、哺乳動物細胞株に由来するバイオテクノロジー産物を使用する潜在的なリスクである。したがって、潜在的なウイルス混入に関するこれらの製品の安全性の保証を提供するために、規制当局は、内因性及び外因性ウイルスを除去する精製プロセスの能力を評価するウイルスクリアランス研究を必要とする。ウイルス混入の除去のために、ウイルスフィルタ及び低ｐＨ不活性化が使用されることが多いが、アニオン交換クロマトグラフィーのようなクロマトグラフィープロセスも有用であり得る（Ａｊａｙｉ ｅｔ ａｌ．，２０２２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１９０－２０２（非特許文献5））。

一般に、特にＨＭＷ不純物からの抗体モノマーの精製並びに様々なクロマトグラフィー材料によるウイルスの除去におけるこれらの進歩にもかかわらず、抗体の更に高い純度及び品質を達成するために精製設定を改善する必要性及び余地が依然として存在する。

Ｌｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０（４）：４２７－４３３ Ｓｕｄａ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ １２１６（２７）：５２５６－５２６４ Ｇａｇｎｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００９，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０（４）：４３４－４３９） Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１３，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１２９４ ７０－７５） Ａｊａｙｉ ｅｔ ａｌ．，２０２２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：１９０－２０２

本明細書では、アンチカオトロピック塩の存在下でイオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モード／マルチモーダルクロマトグラフィー材料を用いた親水性抗体を精製するための方法又は製造するための方法を報告する。

本発明は、少なくとも部分的には、親水性抗体及びＨＭＷを含む負荷溶液が、少なくとも１つのアンチカオトロピック塩の存在下、フロースルー（ＦＴ）モードで、イオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モードクロマトグラフィー材料（ｍｉｘｅｄ ｍｏｄｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｈａｔ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ；ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ）によって精製される場合、抗体関連高分子量不純物（ＨＭＷ）を首尾よく減少させることができるという予想外の知見に基づく。本発明の好ましい一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、クロマトグラフィー材料、負荷溶液及び任意の洗浄／すすぎ溶液を平衡化するために使用される平衡化（緩衝液）に存在する。製造及び／又は精製、すなわちＨＭＷの減少は、アンチカオトロピック塩の存在下で親水性抗体に対して実施することができるが、その効果は疎水性抗体又はカオトロピック塩の存在下では達成することができないことが見出された。

更に、本発明は、少なくとも部分的に、親水性抗体及びウイルス不純物を含む負荷溶液が、少なくとも１つのアンチカオトロピック塩の存在下、フロースルー（ＦＴ）モードでイオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モードクロマトグラフィー材料（ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ）によって精製される場合、ウイルス又はウイルス様粒子（例えば、ＲＶＬＰ）による混入、すなわちウイルス不純物含有量もまた首尾よく低減され得るという予想外の発見に基づく。本発明の好ましい一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、クロマトグラフィー材料、負荷溶液及び任意の洗浄／すすぎ溶液を平衡化するために使用される平衡化（緩衝液）において存在する。製造及び／又は精製、すなわちウイルス不純物含有量の減少は、アンチカオトロピック塩の存在下で親水性抗体に対して実施することができるが、その効果は疎水性抗体には存在しないことが分かった。

したがって、本発明の一態様は、フロースルーモードで動作する、イオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モード／マルチモーダルクロマトグラフィー材料（ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ）を使用して（／によって）、抗体を製造するための方法であって、
ａ）抗体が親水性抗体であり、
ｂ）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用される、
方法である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、方法は、以下の工程：
ｃ）任意に、すすぎ溶液が適用される工程、
ｄ）抗体が、ｂ）のフロースルーにおいて、又は任意にｂ）及びｃ）のフロースルーにおいて、回収される工程
を更に含み、
それによって、フロースルーモードで動作するＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸを使用して抗体を製造する。

本発明による別の態様は、フロースルーモードで動作する、イオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モード／マルチモーダルクロマトグラフィー材料（ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ）を使用して（によって）、抗体を精製するための方法であって、
ａ）抗体が親水性抗体であり、
ｂ）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用され、
それによって抗体を精製する、方法である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、（同じ）アンチカオトロピック塩を含む緩衝液でコンディショニング／平衡化されている。好ましい一実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸをコンディショニング／平衡化するために使用される緩衝液は、工程ｂ）の溶液の緩衝液でもある。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、
－ 方法は、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物含有量が低減された及び／又はウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物を製造するためのものであり、
－ 抗体と、少なくとも１つの抗体関連ＨＭＷ不純物及び／又は少なくとも１つのウイルス不純物と、アンチカオトロピック塩とを含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用され、
－ 抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された及び／又はウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物がフロースルーから回収され、
－ それによって、抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された及び／又はウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物が製造される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、
－ 方法は、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物含有量が低減された及びウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物を製造するためのものであり、
－ 抗体と、少なくとも１つの抗体関連ＨＭＷ不純物及び少なくとも１つのウイルス不純物と、アンチカオトロピック塩とを含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用され、
－ 抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された及びウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物がフロースルーから回収され、
－ それによって、抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された及びウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物が製造される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、
－ 方法は、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物含有量が低減された抗体組成物を製造するためのものであり、
－ 抗体と、少なくとも１つの抗体関連ＨＭＷ不純物と、アンチカオトロピック塩とを含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用され、
－ 抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された抗体組成物をフロースルーから回収し、
－ それにより、抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された抗体組成物が製造される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、抗体関連（ＨＭＷ）不純物含有量は、工程ｂ）でＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用される溶液と比較して低減される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、抗体関連（ＨＭＷ）不純物含有量は、アンチカオトロピック塩を本質的に含まない溶液と比較して、及び／又は疎水性抗体を含む溶液と比較して、低減される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、
－ 方法は、ウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物を製造するためのものであり、
－ 抗体と、少なくとも１つのウイルス不純物と、アンチカオトロピック塩とを含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用され、
－ ウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物をフロースルーから回収し、
－ それにより、ウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物が製造される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ウイルス不純物含有量は、工程ｂ）でＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用された溶液と比較して低減される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ウイルス不純物含有量は、アンチカオトロピック塩を本質的に含まない溶液と比較して、及び／又は疎水性抗体を含む溶液と比較して、低減される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、親水性抗体は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料上で、（同じＨＩＣ材料上及び同じ操作条件下で）リツキシマブと同等以下の保持時間を有する抗体である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料は、リガンドとしてポリエーテル基（エチルエーテル基）を含有する。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料は、リガンドとして以下の構造（－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨ）を有するポリエーテル基を含有する。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフ（ＨＩＣ）材料は、ポリメタクリレート基材／マトリックスを含む。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料は、リガンドとしてポリエーテル基（エチルエーテル基）を含有し、１００ｎｍの平均孔径及び１０μｍの粒径を有する。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料は、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷクロマトグラフィー材料である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＨＩＣクロマトグラフィー材料での保持時間は、（他の実施形態のいずれか１つの）ＨＩＣクロマトグラフィー材料を使用して、カラム長７５ｍｍ、内径７．５ｍｍ、溶出緩衝液勾配８．８ｍｌ／分の流速で決定され、抗体は１ｍｇ／ｍｌの濃度でクロマトグラフィー材料に適用される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、アンチカオトロピック塩は、１．２８５～４．１８３×１０Ｅ３ ｄｙｎ＊ｇ＊ｃｍ^－１＊ｍｏｌ^－１の範囲の及びこれを含むモル表面張力増分を有する。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、アンチカオトロピック塩は、塩化物、硫酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩又はフッ化物からなる群から選択される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、アンチカオトロピック塩は、カルシウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、アンチカオトロピック塩は、ナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、アンチカオトロピック塩は、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＮａＣｌ及びＫＣｌからなる群から選択される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、（工程ｂの）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、０．５～１２０ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中、アンチカオトロピック塩は、１０ｍＭ～９００ｍＭ（及びこれを含む）の濃度を有する。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸへの負荷量は、クロマトグラフィー材料１リットル当たりタンパク質１０ｇ（１０ｇ／Ｌ）以上である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸへの負荷量は、クロマトグラフィー材料１リットル当たりタンパク質１０ｇ（１０ｇ／Ｌ）～クロマトグラフィー材料１リットル当たりタンパク質６５０ｇ（６５０ｇ／Ｌ）である（及びこれを含む）。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸへの負荷量は、クロマトグラフィー材料１リットル当たりタンパク質１５ｇ（１５ｇ／Ｌ）～クロマトグラフィー材料１リットル当たりタンパク質３５０ｇ（３５０ｇ／Ｌ）である（及びこれを含む）。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、４．０～９．０（及びこれを含む）のｐＨ値を有する。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＨＭＷ不純物は、２８５ｋＤａ以上の分子量を有する不純物である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＨＭＷ不純物は、抗体の少なくとも二量体、三量体、又は任意の多量体である不純物である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、アニオン交換官能基又はカチオン交換官能基を含む。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、強いアニオン交換官能基を含む。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ 又はＮｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅ４Ａである。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、弱いカチオン交換官能基を含む。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ、又はＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓである。

発明の詳細な説明
本明細書では、イオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モード／マルチモーダルクロマトグラフィー材料を使用し、負荷溶液（本明細書では「負荷物」とも呼ばれる）においてアンチカオトロピック塩を使用して、親水性抗体を精製又は製造するための方法が報告される。

本発明は、少なくとも部分的には、親水性抗体及びＨＭＷを含む負荷物が、フロースルー（ＦＴ）モードでイオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モードクロマトグラフィー材料（ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ）によって精製され、クロマトグラフィーの開始前に負荷溶液に含まれる少なくとも１つのアンチカオトロピック塩が存在する場合、抗体関連高分子量不純物（ＨＭＷ）を首尾よく減少させることができるという予想外の知見に基づく。

より詳細には、驚くべきことに、精製される抗体が親水性抗体であり、アンチカオトロピック塩が存在する場合、ＨＭＷの含有量をより有意に減少させ得ることが見出された。対照的に、疎水性抗体が精製されている場合、ＨＭＷ減少に関するアンチカオトロピック塩の添加の有意な効果は観察され得ない。

本発明は更に、少なくとも部分的に、その効果が塩モル濃度自体の増加に起因しないという知見に基づいている。この場合も、アンチカオトロピック塩の塩モル濃度を増加させると、親水性抗体に対するプラスの効果を観察することができたが、この効果は疎水性抗体では観察することができなかった。

本発明は、少なくとも部分的には、カオトロピック塩について改善されたＨＭＷ減少を示すことができなかったという知見に更に基づく。

第１の実験セット（パートＩ）では、一定の導電率でのＨＭＷ不純物減少に対する抗体疎水性の影響が示された。

フロースルー（ＦＴ）ランは、ロボットシステム上でＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍｎｓ（商標）（ＲＣ）を用いて行った。５つのアンチカオトロピック（ａｃ）塩を使用した：Ｎａ_２ＳＯ_４、ＮａＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、及びＫ_２ＳＯ_４。これらを、異なるフォーマット及び特異性の７つのモノクローナル抗体（ｍａｂ）と組み合わせて使用した。ＦＴを収集し、純度をＳＥ－ＨＰＬＣによって分析した。負荷物にアンチカオトロピック塩を添加することによって達成されたＨＭＷ減少を、同じ緩衝液、すなわち同じ導電率であるがアンチカオトロピック塩を含有しないで達成されたＨＭＷ減少と比較した。親水性ｍａｂ、すなわち材料及び方法の項目１０（ＭＭ－１０）に従ってＨＩＣクロマトグラフィーで決定された保持時間がリツキシマブの保持時間よりも短いｍａｂ（保持時間_ｍａｂ≦保持時間_{リツキシマブ}）についてのみ、アンチカオトロピック塩の非存在下で同じ導電率を有する負荷物と比較して、負荷物へのアンチカオトロピック塩の添加によって改善されたＨＭＷ除去が達成されたことが見出された。これとは対照的に、疎水性ｍａｂ（保持時間_ｍａｂ＞保持時間_{リツキシマブ）}については、アンチカオトロピック塩の添加による有利な効果は観察されなかったことが見出された。

複数の親水性抗体について、同じ導電率でアンチカオトロピック塩を含まないトリス／酢酸塩緩衝液中の負荷溶液と比較して、アンチカオトロピック塩を負荷溶液に添加するとＨＭＷ減少が改善されることが見出された（図１～図４を参照；黒塗りの円）。負荷物中にアンチカオトロピック塩が存在すると、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ上の親水性ｍａｂのＨＭＷ減少が改善されることが分かった。

これとは対照的に、疎水性抗体の場合、アンチカオトロピック塩を含有する負荷物及びアンチカオトロピック塩を含まない負荷物では、ＨＭＷ減少は改善されなかった（図５～図７参照）。

プールのＨＭＷ除去を計算するために、傾向線を導入した。ＦＴプールのＨＭＷ除去を、例示的な親水性ｍａｂ（図８Ａ；ｍａｂ２）及び例示的な疎水性ｍａｂ（図８Ｂ；ｍａｂ７）について示す。ｍａｂ２では、総負荷量１５０ｇ／ＬでのプールＨＭＷ除去値は、硫酸アンモニウムを負荷物に添加した場合に３５％から８９％に増加した（図９Ａを参照）。５５０ｇ／Ｌの総負荷について、プールＨＭＷ除去値は、負荷物への（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の添加により１７％から４７％に増加した。これとは対照的に、アンチカオトロピック塩を含む及び含まないｍａｂ７のプールＨＭＷ値は類似していた。この疎水性ｍａｂについて、プールＨＭＷ除去値は、アンチカオトロピック塩の添加によって有意に改善されなかった（図９Ｂを参照）。

異なるｐＨ値（実施例１：ｐＨ８；実施例２：ｐＨ６）でも同じ効果が見られる。親水性ｍａｂｓについて、アンチカオトロピック塩を負荷溶液に添加すると、ＨＭＷ減少が有意に改善されることが分かった（図１０～図１３を参照）。これとは対照的に、疎水性ｍａｂｓでは、アンチカオトロピック塩を含有する負荷及びアンチカオトロピック塩を含まない負荷のＨＭＷ減少は同程度であった（図１４～図１６を参照）。

同じ効果は、異なる導電率（実施例１／２：２０ｍＳ／ｃｍ）；実施例３：１０ｍＳ／ｃｍ）に見ることができる（図１７（Ａ及びＢ）及び１８（Ａ及びＢ）を参照）。親水性ｍａｂのためのアンチカオトロピック塩の存在は、ＦＴ画分のＨＭＷ減少を改善することが見出された。疎水性ｍａｂでは、アンチカオトロピック塩を負荷物に添加した場合、ＨＭＷ減少の改善は観察されなかった。アンチカオトロピック塩を負荷物に添加することによる親水性ｍａｂの改善されたＨＭＷ減少の効果は、ｐＨが上昇するにつれてより顕著であることが見出された。

第２の実験セットでは、ＨＭＷ除去に対するアンチカオトロピック塩モル濃度の影響が示されている。

ＨＭＷ減少に対する異なるモル濃度のアンチカオトロピック塩の効果を示すために、ＲＣ実験及びＫｐ（分配係数）スクリーンを行った。最大５００ｍＭの塩のモル濃度が使用されている。種々の塩、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＮａＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ及びＫ_２ＳＯ_４をｐＨ８．０で試験した。塩モル濃度の増加は、親水性抗体調製物のＦＴ画分中のＨＭＷの除去を改善し得ることが見出されている（図１９～図２３を参照）。

更に、Ｋｐスクリーンは、広範囲のｐＨ値及び塩モル濃度について、ＨＭＷ減少に対する塩モル濃度の効果を示した（Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ樹脂／クロマトグラフィー材料を使用した実施例５及び実施例６を参照）。３つのｍａｂ、２つの親水性ｍａｂ及び１つの疎水性ｍａｂを使用した。調査したｐＨ範囲はｐＨ５．５～８．０であり、モル濃度範囲は１０～８００ｍＭであった。Ｋｐスクリーンは、ＨＭＷ減少に関してＲＣデータを確認した。親水性ｍａｂの場合、塩モル濃度の増加はＨＭＷ減少の改善をもたらしたが、疎水性ｍａｂのＨＭＷ減少は、アンチカオトロピック塩モル濃度を増加させることによって改善されないことが分かった（図２４及び図２５を参照）。予想されるように、カオトロピック塩の使用は、塩のモル濃度の増加に伴うＨＭＷ減少の改善を示さなかった（図２６及び図２７を参照）。

更に、Ｋｐスクリーンを、ｐＨ４～９のｐＨ範囲及び最大約９００ｍＭの塩モル濃度で行った（実施例６を参照）。これらのＫｐスクリーン内で、２組の緩衝液を比較した：アンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有する１つの緩衝液及びアンチカオトロピック塩を含まない１つの緩衝液（図２８を参照）。

より詳細には、塩モル濃度（及び導電率）を増加させる効果を、親水性ｍａｂ（実施例４；ｍａｂ２）を用いてｐＨ８で５つのアンチカオトロピック塩について試験した。アンチカオトロピック塩は、硫酸ナトリウム（結果については図１９を参照）、塩化ナトリウム（結果については図２０を参照）、硫酸アンモニウム（結果については図２１を参照）、塩化カリウム（結果については図２２を参照）及び硫酸カリウム（結果については図２３を参照）であった。各ＦＴ画分について達成されたＨＭＷ除去値を、増加する総負荷量に対してプロットした。一般に、総負荷量の増加に伴うＨＭＷ除去値の増加が観察された。アンチカオトロピック塩を親水性ｍａｂに添加することによって、ＦＴ画分のＨＭＷレベルの減少が達成され得ることが見出された。試験した全てのアンチカオトロピック塩について、改善されたＨＭＷ減少が見られた。

更に、塩モル濃度を増加させる効果を、５．５～８．０のｐＨ範囲及び８００ｍＭまでの塩モル濃度でＫｐスクリーンを使用して、３つのｍａｂ（親水性及び疎水性）及び４つの塩、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、Ｇｕａ／ＨＣｌ及び尿素について検証した（実施例を５参照）。カオトロピック塩（Ｇｕａ／ＨＣｌ及び尿素）は、疎水性相互作用が弱まるとＨＭＷ減少を示すように選択された。

ｍａｂの疎水性に応じて、ＨＭＷ除去の差が見られた。親水性ｍａｂ（ｍａｂ２；Ａ及びｍａｂ４；Ｂ）では、アンチカオトロピック塩（硫酸アンモニウム、図２４Ａ及び図２４Ｂ、並びにＫＣｌ、図２５Ａ及び図２５Ｂ）の添加、最大７０～８０％のＨＭＷ減少が達成されることが見出された。疎水性ｍａｂ（ｍａｂ６；Ｃ）について、硫酸アンモニウムの存在下でのＨＭＷ減少は、モル濃度によってほとんど影響されなかった。ＫＣｌでは、疎水性ｍａｂ６のＨＭＷ減少は、ＫＣｌモル濃度の増加と共に更に減少した。図２４Ｃ及び図２５Ｃは、疎水性ｍａｂ６について、アンチカオトロピック塩のモル濃度を増加させることによってＨＭＷ除去が改善されなかったことを示す。

ＨＭＷ減少に対するカオトロピック塩の効果を決定するために、Ｇｕａ／ＨＣｌ（図２６を参照）及び尿素（図２７を参照）を使用した。ＨＭＷ減少の改善は、親水性及び疎水性ｍａｂについての塩モル濃度の増加と共に観察されなかった。

要約すると、アンチカオトロピック塩を負荷溶液に添加すると、ＨＭＷ減少が親水性ｍａｂで改善されることが分かった。疎水性ｍａｂについては、アンチカオトロピック塩の添加によって改善されたＨＭＷ減少は観察できなかった。更に、カオトロピック塩の添加では、改善されたＨＭＷ減少を得ることができなかった。

実施例６の結果は、アンチカオトロピック塩の添加が、親水性ｍａｂ（ｍａｂ２）のＦＴ画分中のＨＭＷ除去を改善したことを示す。Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度の増加（図２８Ａを参照）は、最大８０％の改善されたＨＭＷ減少を示した。Ｎａ_２ＳＯ_４を含むｍａｂ２のコンタープロットは、硫酸アンモニウムを含むものと同様であった（図２４Ａを参照）。それとは対照的に、トリス／酢酸塩モル濃度の増加（図２８Ｂを参照）はＨＭＷ減少に有意な影響を及ぼさなかった。アンチカオトロピック塩を添加しないと、モル濃度の増加に伴うＨＭＷ減少の改善は観察されなかった。

第３の実験セット（パートＩＩＩ）では、異なるクロマトグラフィー樹脂を使用した。

実施例７では、５．５～８．０のｐＨ範囲及び１０～８００ｍＭの塩モル濃度において親水性ｍａｂ（ｍａｂ２）を含む負荷物のＨＭＷ減少を調査した。３つの異なる混合モードアニオン交換（ＭＭＡＥＸ）樹脂を使用した：Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ 及びＮｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅ親水性ｍａｂを含む負荷溶液にアンチカオトロピック塩を添加した場合、３つ全てのクロマトグラフィー材料が改善されたＨＭＷ減少を示したことが分かった。

実施例８は、ＭＭＡＥＸ樹脂、アニオン交換（ＡＥＸ）樹脂、ＨＩＣ樹脂、及び親水性及び疎水性ｍａｂを有する混合モードカチオン交換（ＭＭＣＥＸ）樹脂について行われたＫｐスクリーンを要約する。使用したｐＨ範囲はｐＨ４．０～９．０であり、使用した塩濃度は５～８５０ｍＭであった。親水性ｍａｂのフロースルー試料は、両方のイオン混合モード樹脂（ＭＭＡＥＸ及びＭＭＣＥＸ）について塩モル濃度の増加に伴って改善されたＨＭＷ減少を示すことが分かった。ＭＭＡＥＸ樹脂上の疎水性ｍａｂ ＨＭＷ減少とは対照的に、塩のモル濃度とは無関係であった。ＭＭＣＥＸ樹脂の場合、疎水性ｍａｂのＨＭＷ減少は、塩モル濃度を５００ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４未満に増加させることによって改善されなかった。シングルモード樹脂Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＡＥＸ）では、ＨＭＷ減少に対する有利な効果は、親水性ｍａｂについても疎水性ｍａｂについても観察されなかった。Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ（高ｓｕｂ）（ＨＩＣ）については、ＨＭＷ減少に対する塩モル濃度の増加のプラスの効果が親水性ｍａｂについて見出されたが、（混合モード樹脂とは対照的に）疎水性ｍａｂについても見出された。

より詳細には、ｍａｂ２を異なる混合モード樹脂と共に実施例７で使用した。アニオン交換及び疎水性相互作用を有する３つの混合モード樹脂を使用した。Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓフロースルーコンタープロットを図２９Ａ～図３２Ａ（Ａ系列）に示し、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅのコンタープロットを図２９Ｂ～図３２Ｂ（Ｂ系列）に示し、Ｎｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅ のコンタープロットを図２９Ｃ～図３２Ｃ（Ｃ系列）に示す。２つのアンチカオトロピック塩、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（図２９を参照）及びＫＣｌ（図３０を参照）、並びに２つのカオトロピック塩、Ｇｕａ／ＨＣｌ（図３１を参照）及び尿素（図３２を参照）を試験した。

一般に、全ての塩について、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ、Ｎｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅ及びＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓのコンタープロットが同等の結果を示すことが見出された。（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４及びＫＣｌのモル濃度が増加するにつれて、３つの混合モード樹脂は全て、改善されたＨＭＷ減少を示した。全てのコンタープロットは良好な比較性を示した。カオトロピック塩については、それぞれの塩の添加によるＨＭＷ減少の改善は観察されなかった。

要約すると、改善されたＨＭＷ減少は、様々なＭＭＡＥＸ樹脂で達成することができる。

実施例８では、１つの親水性ｍａｂ（ｍａｂ２）及び１つの疎水性ｍａｂ（ｍａｂ６）を異なる樹脂タイプ：混合モードアニオン交換樹脂（Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ）、アニオン交換樹脂（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ）、疎水性樹脂（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ）及び混合モードカチオン交換樹脂（Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ）と組み合わせて使用した。

ＡＥＸ樹脂Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦについては、ＨＭＷ減少に対するアンチカオトロピック塩の効果は観察されなかった（図３４参照）。樹脂Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＦＦ（高ｓｕｂ）については、親水性のｍａｂと疎水性のｍａｂの両方が、Ｎａ_２ＳＯ_４濃度の増加に伴って改善されたＨＭＷ減少を示した（図３５を参照）。したがって、シングルモード樹脂Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ及びＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ（高ｓｕｂ）について、親水性及び疎水性ｍａｂについて達成可能なＨＭＷ減少は同等であった。

これとは対照的に、混合モードの樹脂では、親水性及び疎水性ｍａｂのＨＭＷ減少は異なっていた。ＭＭＡＥＸ樹脂は、アンチカオトロピック塩を負荷物に添加した場合に、親水性ｍａｂ２のＨＭＷ除去の改善を示した（図３３Ａを参照）。疎水性ｍａｂ６について、ＨＭＷ除去は、試験したｐＨ及びモル濃度範囲にわたってほぼ一定であった（図３３Ｂを参照）。したがって、親水性ｍａｂについてのみ、混合モードアニオン交換樹脂上の塩モル濃度を増加させることによってＨＭＷ減少が増強されることが見出された。図３６は、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ樹脂のＨＭＷ除去値を示す。親水性ｍａｂでは、Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度を０～８００ｍＭの範囲で２０％から８０％まで増加させると、ＨＭＷ減少が増強された。これとは対照的に、疎水性ｍａｂのＨＭＷ減少は、塩モル濃度を５００ｍＭまで増加させることによって影響を受けなかった。ｍａｂ６では、ＦＴ試料の改善されたＨＭＷ減少は、５００ｍＭを超えるモル濃度でのみ観察された。５００ｍＭ未満では、ＨＭＷ減少は少なく（１０％未満）、塩モル濃度とは無関係であった。

この理論に束縛されるものではないが、実施例８は、アンチカオトロピック塩の添加による親水性ｍａｂのＨＭＷ減少の改善が、イオン性及び疎水性相互作用の組み合わせに起因し得ることを示す（疎水性相互作用単独についてはそうではない）。イオン性混合モード樹脂、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ（アニオン性部分及び疎水性部分を有する）及びＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ（カチオン性部分及び疎水性部分を有する）の両方について、塩モル濃度の増加と共にＨＭＷ減少の改善が達成されたが、親水性ｍａｂについてのみであった。

この方法はまた、自由にスケーラブルである（パートＩＶ；実施例９及び１０を参照）。

スケールアップ結果は、パートＩＩ及びＩＩＩのより小さな体積の系で達成された結果を確認した。

より詳細には、実施例９では、９ｍＳ／ｃｍの同じ導電率であるが、Ｎａ_２ＳＯ_４（４０ｍＭ及び２０ｍＭ）のモル濃度が異なる２つの負荷量のｍａｂ２を調製した。より高いＮａ_２ＳＯ_４モル濃度を有する負荷物のＦＴ画分は、より低いＮａ_２ＳＯ_４モル濃度を有する負荷物と比較してより高いメインピーク値をもたらした（図３７を参照）。これは、より高いＮａ_２ＳＯ_４モル濃度（導電率ではなく）が、負荷導電率が同じであるため、ＨＭＷ除去を促進したことを示す。

実施例１０は、ｐＨ７及びｐＨ８のＨＭＷ減少に対するＮａ_２ＳＯ_４モル濃度の効果を示した。ＦＴ画分のメインピーク値は、ｐＨ７（図３９を参照）及びｐＨ８（図３８を参照）でＮａ_２ＳＯ_４モル濃度の増加と共に増加した。ＦＴプールを、ｐＨ８での画分の平均メインピーク値を用いて計算した（図４０を参照）。ｐＨ ８の場合、メインピーク値は、６０ｍＭのＮａ_２ＳＯ_４を含有する負荷（１２ｍＳ／ｃｍの導電率）で９６．９６％（Ｎａ_２ＳＯ_４なし、５ｍＳ／ｃｍの導電率）から９９．０９％まで増加した。

第５の実験セットでは、ウイルス除去／ＲＶＬＰ除去に対するアンチカオトロピック塩モル濃度の影響が示されている。

Ｋｐ（分配係数）スクリーンを実施して、ウイルス汚染物質の減少に対する異なるモル濃度のアンチカオトロピック塩の効果を示した。ｍａｂ疎水性及びアンチカオトロピック塩の存在の効果は、ｐＨ５．０～８．０のｐＨ範囲で２つの親水性及び２つの疎水性ｍａｂを用いて示された。実施例１１では、最大４００ｍＭの塩モル濃度を有するアンチカオトロピック塩硫酸ナトリウムを調査した。実施例１２では、トリスモル濃度を増加させ、導電率を増加させるが、アンチカオトロピック塩を欠くトリス／酢酸塩緩衝液を使用した。

ｍａｂの疎水性及びアンチカオトロピック塩の存在に応じて、異なるＲＮＡ減少値（ウイルス汚染物質減少の代理測定値であるＲＶＬＰ減少の代理）を測定した。

要約すると、アンチカオトロピック塩を負荷溶液に添加すると、ウイルス汚染物質の減少が親水性ｍａｂで改善されることが分かった。疎水性ｍａｂについては、アンチカオトロピック塩の添加によってウイルス汚染物質の改善された減少は観察されなかった。

したがって、本発明は、少なくとも部分的には、親水性抗体及びＨＭＷを含む負荷溶液が、フロースルー（ＦＴ）モードでイオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モードクロマトグラフィー材料（ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ）によって精製され、クロマトグラフィーの開始前に負荷溶液に含まれる少なくとも１つのアンチカオトロピック塩が存在する場合、抗体関連高分子量不純物（ＨＭＷ）を首尾よく減少させることができるという予想外の知見に基づく。

更に、本発明は、少なくとも部分的には、親水性抗体及びウイルス汚染物質を含む負荷物が、フロースルー（ＦＴ）モードでイオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基（ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ）を含む混合モードクロマトグラフィー材料によって精製され、クロマトグラフィーの開始前に負荷溶液に含まれた少なくとも１つのアンチカオトロピック塩が存在する場合に、ウイルス汚染物質を首尾よく減少させることができるという予想外の発見に基づく。

より詳細には、驚くべきことに、精製される抗体が親水性抗体であり、アンチカオトロピック塩が存在する場合、ウイルス汚染物質の含有量をより有意に減少させ得ることが見出された。対照的に、疎水性抗体が精製されている場合、ウイルス汚染物質の減少に関するアンチカオトロピック塩の添加の有意な効果は観察され得ない。

本発明は更に、少なくとも部分的に、その効果が塩モル濃度自体の増加に起因しないという知見に基づいている。この場合も、親水性抗体に対するプラス効果は、一定の塩モル濃度のアンチカオトロピック塩で観察することができたが、この効果は疎水性抗体では観察することができなかった。

したがって、本発明による一態様は、フロースルーモードで動作する、イオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モード／マルチモーダルクロマトグラフィー材料（ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ）を使用して（／によって）、抗体を製造するための方法であって、
ａ）抗体が親水性抗体であり、
ｂ）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料に適用される、方法である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、方法は、以下の工程：
ｃ）任意に、すすぎ溶液が適用される工程、
ｄ）抗体が、ｂ）のフロースルーにおいて、又は任意にｂ）及びｃ）のフロースルーにおいて、回収される工程
を更に含み、
それによって、フロースルーモードで動作するＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸを使用して抗体を製造する。

本発明による別の態様は、フロースルーモードで動作する、イオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モード／マルチモーダルクロマトグラフィー材料（ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ）を使用して（によって）、抗体を精製するための方法であって、
ａ）抗体が親水性抗体であり、
ｂ）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料に適用され、
それによって抗体を精製する、方法である。

定義及び実施形態
本明細書で使用される「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成されたモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）を包含する。抗体断片並びに融合ポリペプチドは、それらがＦｃ領域を有する限り、この定義に包含される。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書で抗体と互換的に使用される。

抗体は、種々の構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子であり、それらの構造は全て免疫グロブリン折り畳みに基づく。例えば、ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合して機能的抗体を形成する２つの「重」鎖及び２つの「軽」鎖を有する。各重鎖及び軽鎖はそれ自体、「定常」（Ｃ）領域及び「可変」（Ｖ）領域を含む。Ｖ領域が抗体の抗原結合特異性を決定する一方で、Ｃ領域は、構造的支持を提供し、免疫エフェクタとの非抗原特異的相互作用において機能する。抗体又は抗体の抗原結合断片の抗原結合特異性は、抗体が特定の抗原に特異的に結合する能力である。

抗体の抗原結合特異性は、Ｖ領域の構造的特徴によって決定される。可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸長にわたって均等に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、各々９～１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極度に可変性の短い領域によって分離されている、１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の伸長部からなる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用する４つのＦＲを含み、これらは、３つの超可変領域により連結され、これらは、βシート構造を連結し、いくつかの場合にはその一部を形成するループを形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって共に近接近して保持されており、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への寄与等の種々のエフェクタ機能を呈する。

各Ｖ領域は、典型的には、３つの相補性決定領域（各々が「超可変ループ」を含む「ＣＤＲ」）、及び４つのフレームワーク領域を含む。したがって、特定の所望の抗原に対して実質的な親和性で結合するために必要とされる最小の構造単位である抗体結合部位は、典型的には、３つのＣＤＲと、適切な立体構造でＣＤＲを保持し、提示するためにそれらの間に散在する少なくとも３つ、好ましくは４つのフレームワーク領域とを含む。古典的な４鎖抗体は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインによって協働して決定される抗原結合部位を有する。ラクダ抗体及びサメ抗体等の特定の抗体は、軽鎖を欠き、重鎖のみによって形成される結合部位に依存する。

「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で広く異なり、且つ各特定の抗体の特定の抗原に対する結合及び特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等に分布していない。これは、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの両方において超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用する４つのＦＲを含み、これらは、３つの超可変領域により連結され、これらは、βシート構造を連結し、いくつかの場合にはその一部を形成するループを形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって共に近接近して保持されており、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）への寄与等の種々のエフェクタ機能を呈する。

「超可変領域」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、ＶＬのおよそ２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）及び８９～９７（Ｌ３）残基の周辺、並びにＶＨのおよそ３１～３５Ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、及び９５～１０２（Ｈ３）残基の周辺（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、及び／又は「超可変ループ」からのそれらの残基（例えば、ＶＬの残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）及び９１～９６（Ｌ３）、並びにＶＨの２６～３２（Ｈ１）、５２Ａ～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））を含み得る。

「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

抗体又は半抗体との関連での「ヒンジ領域」は、概して、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０までの伸長と定義される（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５））。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖内Ｓ－Ｓ結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に入れることによってＩｇＧ１配列と整列し得る。

Ｆｃ領域の「下部ヒンジ領域」は、通常、ヒンジ領域のすぐＣ末端にある残基の伸展、すなわち、Ｆｃ領域の残基２３３～２３９と定義される。本出願の前は、ＦｃγＲ結合は、概して、ＩｇＧ Ｆｃ領域の下部ヒンジ領域におけるアミノ酸残基に起因するものであった。

ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、ＩｇＧの残基約２３１から約３４０まで延びる。ＣＨ２ドメインは、他のドメインと密接に対になっていないという点で特有である。むしろ、２つのＮ結合分岐状炭水化物鎖がインタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に介在する。炭水化物がドメイン－ドメイン対合の代替を提供し、ＣＨ２ドメインを安定させるのに役立ち得ることが推測されている。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１６１－２０６（１９８５）．

「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまで（すなわち、ＩｇＧのアミノ酸残基約３４１からアミノ酸残基約４４７）の残基の伸展を含む。

抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映して表記される１つの残留「Ｆｃ」断片とが産生される。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）と共に全Ｌ鎖、及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。抗体のペプシン処理により、単一の大きいＦ（ａｂ’）２断片が産出され、これは、概して、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片に対応し、依然として抗原に架橋することができる。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらなる数個の残基を有する点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインの１つ又は複数のシステイン残基が、遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、緊密な非共有結合にある１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用してＶＨ－ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を規定するのは、この構成においてである。まとめると、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）でさえも、抗原を認識してそれに結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性が低い。

Ｆａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における少数の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が少なくとも１つの遊離チオール基を持つＦａｂ’の本明細書における表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。

任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明らかに異なる型のうちの１つに割り当て得る。

抗体は、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当て得る。インタクトな抗体には５つの主要なクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、更に、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分けられてもよい。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元配置は周知である。

本明細書で使用される「半抗体」という用語は、一価の抗原結合ポリペプチドを指す。特定の実施形態において、半抗体は、ＶＨ／ＶＬ単位及び任意に免疫グロブリン定常ドメインの少なくとも一部を含む。特定の実施形態において、半抗体は、１つの免疫グロブリン軽鎖に関連する１つの免疫グロブリン重鎖、又はその抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、半抗体は、単一特異的であり、すなわち、単一の抗原又はエピトープに結合する。当業者であれば、半抗体が、例えばラクダ科に由来する単一の可変ドメインからなる抗原結合ドメインを有し得ることを容易に理解するであろう。

「ＶＨ／ＶＬ単位」という用語は、少なくとも１つのＶＨ ＨＶＲと少なくとも１つのＶＬ ＨＶＲとを含む抗体の抗原結合領域を指す。特定の実施形態において、ＶＨ／ＶＬ単位は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＨ ＨＶＲと、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つ全てのＶＬ ＨＶＲとを含む。特定の実施形態において、ＶＨ／ＶＬ単位は、フレームワーク領域（ＦＲ）の少なくとも一部を更に含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ／ＶＬ単位は、３つのＶＨ ＨＶＲと３つのＶＬ ＨＶＲとを含む。いくつかの実施形態において、ＶＨ／ＶＬ単位は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てのＶＨ ＦＲと、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つ全てのＶＬ ＦＲとを含む。

「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、多重エピトープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つ若しくはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができるか、又は２つ若しくはそれ以上の異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる）抗原結合ドメインを含む抗体を具体的に網羅する。いくつかの実施形態において、多重特異性抗体（二重特異性抗体等）の抗原結合ドメインは、２つのＶＨ／ＶＬ単位を含み、第１のＶＨ／ＶＬ単位は、第１のエピトープに特異的に結合し、第２のＶＨ／ＶＬ単位は、第２のエピトープに特異的に結合し、各ＶＨ／ＶＬ単位は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。そのような多重特異性抗体には、完全長抗体、２つ以上のＶＬドメイン及びＶＨドメインを有する抗体が含まれるが、これらに限定されない。重鎖定常領域の少なくとも一部及び／又は軽鎖定常領域の少なくとも一部を更に含むＶＨ／ＶＬ単位は、「半抗体」とも称され得る。いくつかの実施形態において、半抗体は、単一の重鎖可変領域の少なくとも一部及び単一の軽鎖可変領域の少なくとも一部を含む。いくつかのそのような実施形態において、２つの半抗体を含み、且つ２つの抗原に結合する二重特異性抗体は、第１の抗原又は第１のエピトープに結合するが、第２の抗原又は第２のエピトープには結合しない第１の半抗体、及び第２の抗原又は第２のエピトープに結合するが、第１の抗原又は第１のエピトープには結合しない第２の半抗体を含む。いくつかの実施形態において、半抗体は、第２の半抗体との分子内ジスルフィド結合を形成するのに十分な重鎖可変領域の部分を含む。いくつかの実施形態において、半抗体は、例えば、相補的ホール変異又はノブ変異を含む第２の半抗体とのヘテロ二量体化を可能にする、ノブ変異又はホール変異を含む。ノブ変異及びホール変異は、以下で更に論じられる。

「二重特異性抗体」は、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合することができるか、又は２つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる抗原結合ドメインを含む多重特異性抗体である。二重特異性抗体はまた、本明細書において、「二重特異性」を有するもの、又は「二重特異性」であるとも称される。別途指示されない限り、二重特異性抗体によって結合される抗原が二重特異性抗体名で列記される順序は無作為である。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの半抗体を含み、各半抗体は、単一の重鎖可変領域及び単一の軽鎖可変領域を含み、第１の半抗体は、第１の抗原に結合し、第２の抗原には結合せず、第２の半抗体は、第２の抗原に結合し、第１の抗原には結合しない。

本明細書で使用される「ノブ・イントゥ・ホール」又は「ＫｉＨ」技術という用語は、２つのポリペプチドを、それらが相互作用する接触面で一方のポリペプチド中に隆起（ノブ）を導入し、他方のポリペプチド中に空洞（ホール）を導入することによって、インビトロ又はインビボでの対合を指向する技術を指す。例えば、ＫｉＨは、抗体のＦｃ：Ｆｃ結合接触面、ＣＬ：ＣＨ１接触面、又はＶＨ／ＶＬ接触面に導入されている（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２８７００９号、同第２００７／０１７８５５２号、国際公開第９６／０２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、及びＺｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ６：７８１－７８８を参照）。いくつかの実施形態において、ＫｉＨにより、多重特異性抗体の製造中に２つの異なる重鎖の対合が一緒にもたらされる。例えば、それらのＦｃ領域内にＫｉＨを有する多重特異性抗体は、各Ｆｃ領域に連結された単一可変ドメインを更に含み得るか、又は類似の若しくは異なる軽鎖可変ドメインと対合する異なる重鎖可変ドメインを更に含み得る。ＫｉＨ技術を使用して、２つの異なる受容体細胞外ドメインを一緒に、又は異なる標的認識配列（例えば、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、ペプチボディ（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、及び他のＦｃ融合物を含む）を含む任意の他のポリペプチド配列を対合することもできる。

本明細書で使用される「ノブ突然変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で隆起（ノブ）をポリペプチドに導入する突然変異を指す。いくつかの実施形態において、他方のポリペプチドは、ホール変異を有する（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１，３３３号、同第７，６９５，９３６号、同第８，２１６，８０５号を参照。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に援用される）。

本明細書で使用される「ホール突然変異」という用語は、ポリペプチドが別のポリペプチドと相互作用する界面で空洞（ホール）をポリペプチドに導入する突然変異を指す。いくつかの実施形態において、他方のポリペプチドは、ノブ変異を有する（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１，３３３号、同第７，６９５，９３６号、同第８，２１６，８０５号を参照。これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に援用される）。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じ得る想定される変異体を除いて、同一であり、及び／又は同じエピトープに結合し、かかる変異体は、一般に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の免疫グロブリンによって汚染されない点でも有利である。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本明細書で提供される方法に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）によって記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよく、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照）によって作製されてもよい。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１－５９７（１９９１）に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離され得る。

本明細書におけるモノクローナル抗体には、具体的には、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一又は相同である一方で、鎖（複数可）の残りが、別の種に由来するか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、並びにそれらが所望の生物学的活性を呈する限りはそのような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６８５１－６８５５（１９８４））。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル、又はカニクイザル等の旧世界ザル）に由来する可変ドメイン抗原結合配列と、ヒト定常領域配列とを含む、「霊長類化」抗体が含まれる（米国特許第５，６９３，７８０号）。

非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）の超可変領域の残基を、所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類の超可変領域の残基で置き換えた抗体である。いくつかの事例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基に置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は、抗体性能を更に洗練させるために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、上述のＦＲ置換（複数可）を除いて、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、且つＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、任意に、免疫グロブリンの定常領域、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分を含む。さらなる詳細については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３－５９６（１９９２）を参照されたい。

特定の実施形態において、二重特異性抗体は、以下
ドメイン交換された１＋１二重特異性抗体（ＣｒｏｓｓＭａｂ）
（第１のＦａｂ断片を含む第１の軽鎖と第１重鎖との対、並びに第２のＦａｂ断片を含む第２の軽鎖と第２重鎖との対を含む二重特異性完全長ＩｇＧ抗体であって、
第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１及びＣＬドメインのみが、互いに置き換えられているか（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含む）、
ｂ）ＶＨ及びＶＬドメインのみが、互いに置き換えられているか（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨ及びＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬ及びＣＨ１ドメインを含む）、又は
ｃ）ＣＨ１及びＣＬドメイン並びにＶＨ及びＶＬドメインが、互いに置き換えられており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む）、
第２のＦａｂ断片が、ＶＬ及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み、
第１の重鎖及び第２の重鎖が、両方ともＣＨ３ドメインを含み、両方のＣＨ３ドメインが、第１の重鎖及び第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、それぞれのアミノ酸置換によって相補的に操作されている（好ましい一実施形態において、１つのＣＨ３ドメインはノブ変異を含み、それぞれの他のＣＨ３ドメインはホール変異を含む）、二重特異性完全長ＩｇＧ抗体）；
Ｃ末端融合２＋１二重特異性抗体（２＋１Ｃフォーマット）
（二重特異性完全長ＩｇＧ抗体であって、
ａ）全長抗体軽鎖と全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの全長抗体であって、全長重鎖と全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの全長抗体と、
ｂ）１つのさらなる結合ドメイン、例えば受容体リガンドであって、さらなる結合ドメインが完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されている、１つのさらなる結合ドメインと、を含む、二重特異性完全長ＩｇＧ抗体）；
Ｎ末端Ｆａｂドメイン挿入２＋１二重特異性抗体（２＋１ Ｎフォーマット；ＴＣＢ）
（ドメイン交換を伴うさらなる重鎖Ｎ末端結合部位を有する二重特異性完全長抗体であって、
－ 第１及び第２のＦａｂ断片であって、第１及び第２のＦａｂ断片の各結合部位が第１の抗原に特異的に結合する、第１及び第２のＦａｂ断片と、
－ 第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合し、第３のＦａｂ断片が、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）及び可変重鎖ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられるようなドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片と、
－ 第１のＦｃ領域ポリペプチドと第２のＦｃ領域ポリペプチドとを含むＦｃ領域と、を含み、
第１のＦａｂ断片及び第２のＦａｂ断片は、それぞれ、重鎖断片及び全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片のＣＨ１ドメインのＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている、二重特異性完全長抗体）
からなる二重特異性抗体の群から選択される。

本明細書で使用される「ドメインクロスオーバー」という用語は、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片とその対応する同族の抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体Ｆａｂ（断片抗原結合）において、少なくとも１つの重鎖ドメインが、対応する軽鎖ドメインによって置換されている、若しくはその逆、という点について、ドメイン配列が天然型の抗体の配列から逸脱していることを意味する。ドメインクロスオーバーは、一般的に３種類あり、（ｉ）ＣＨ１及びＣＬドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列（又はＶＨ－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を有する完全長抗体重鎖）がもたらされるもの、（ｉｉ）ＶＨ及びＶＬドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされるもの、並びに（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）及び完全なＶＨ－ＣＨ１重鎖断片のドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）であって、ドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＨ１ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＬドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの（上述の全てのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向で示されている）がある。

本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメイン及び軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバー、並びに結果として生じる重鎖及び軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨ及びＶＬが「互いに置き換えられた」場合、この用語は、項目（ｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またＣＨ１及びＣＬドメインが「互いに置き換えられ」、且つＶＨ及びＶＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、該用語は、項目（ｉｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。

特定の実施形態において、Ｆｃ領域含有ポリペプチド又は抗体は、二重特異性抗体又はＦｃ融合タンパク質である。

本発明による方法では、親水性ｍａｂ（保持時間_ｍａｂ≦保持時間_{リツキシマブ}）についてのみ、アンチカオトロピック塩の非存在下で同じ導電率を有する負荷溶液と比較して、負荷溶液へのアンチカオトロピック塩の添加によって改善されたＨＭＷ除去が達成されることが示された。これとは対照的に、疎水性ｍａｂ（保持時間_ｍａｂ＞保持時間_{リツキシマブ}）では、アンチカオトロピック塩の添加によるプラスの影響は観察されなかった。

本発明による「親水性抗体」という用語は、同じＨＩＣカラム及び同じクロマトグラフィー条件下でのリツキシマブのＨＩＣ保持時間以下の疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムでの保持時間を有する抗体を示す。同様に、本発明による「疎水性抗体」は、同じＨＩＣカラム及び同じクロマトグラフィー条件下でのリツキシマブのＨＩＣ保持時間よりも長い疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムでの保持時間を有する抗体を示す。言い換えれば、保持時間≦保持時間_{リツキシマブ}を有するｍａｎ、すなわち、リツキシマブと同じ又はより短い保持時間を有するｍａｂは、親水性であると定義され、保持時間＞保持時間_{リツキシマブ}を有するｍａｂ、すなわち、リツキシマブの保持時間よりも長い保持時間を有するｍａｂは、疎水性であると定義される。

保持時間を決定するための方法は、材料及び方法のセクションのポイント１０に記載されている。この方法で決定されたｍａｂの保持時間は、１９分～４１分の範囲であった。ｍａｂの保持時間の概要を表ＭＭ－１に示す。リツキシマブの保持時間は、親水性及び疎水性ｍａｂを定義するためのカットポイントであることが分かった。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、親水性抗体は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料上で、（同じＨＩＣ材料上及び同じ操作条件下で）リツキシマブと同等以下の保持時間を有する抗体である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料は、リガンドとしてポリエーテル基（エチルエーテル基）を含有する。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料は、リガンドとして以下の構造（－（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨ）を有するポリエーテル基を含有する。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフ（ＨＩＣ）材料は、ポリメタクリレート基材／マトリックスを含む。上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料は、リガンドとしてポリエーテル基（エチルエーテル基）を含有し、１００ｎｍの平均孔径及び１０μｍの粒径を有する。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料は、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷクロマトグラフィー材料である。上記態様の好ましい一実施形態及び他の実施形態において、ＨＩＣクロマトグラフィー材料での保持時間は、（上記の他の５つの実施形態のいずれか１つの）ＨＩＣクロマトグラフィー材料を使用して、カラム長７５ｍｍ、内径７．５ｍｍ、溶出緩衝液勾配８．８ｍｌ／分の流速で決定され、抗体は１ｍｇ／ｍｌの濃度でクロマトグラフィー材料に適用される。

当業者は、所与の抗体の溶出のための緩衝液勾配を決定する方法を知っている。適切な溶出緩衝液勾配は、本明細書において、材料及び方法のセクションのポイント１０（保持時間及び疎水性の決定）、特にポイント１０．８に記載されている。

本明細書で互換的に使用される「ローディング密度」又は「ローディング容量」又は「負荷密度」又は「負荷容量」又は「負荷量」は、ある体積のクロマトグラフィー材料、例えばリットルと接触させる抗体又はタンパク質の量、例えばグラムを指す。いくつかの例では、ローディング密度は、ｇ／Ｌで表される。

上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料（すなわち、イオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モードクロマトグラフィー材料）の負荷量は、１０ｇ／Ｌ以上、すなわち、クロマトグラフィー材料１リットル当たりタンパク質１０ｇ（１０ｇ／Ｌ）以上である。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料の負荷量は、１５ｇ／Ｌ以上である。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料の負荷量は、２０ｇ／Ｌ以上である。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料の負荷量は、３０ｇ／Ｌ以上である。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料の負荷量は４０ｇ／Ｌ以上である。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料の負荷量は５０ｇ／Ｌ以上である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料（すなわち、イオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モードクロマトグラフィー材料）の負荷量は、１０ｇ／Ｌ～６５０ｇ／Ｌであり（及びこれを含み）、すなわち、クロマトグラフィー材料１リットル当たりタンパク質１０ｇ（１０ｇ／Ｌ）～クロマトグラフィー材料１リットル当たりタンパク質６５０ｇ（６５０ｇ／Ｌ）である。上記態様の特定の実施形態及び上記態様の他の実施形態並びに他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料の負荷量は、３０ｇ／Ｌ～６００ｇ／Ｌである（及びこれを含む）。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料の負荷量は、５０ｇ／Ｌ～５００ｇ／Ｌである（及びこれを含む）。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料の負荷量は、５０ｇ／Ｌ～４００ｇ／Ｌである（及びこれを含む）。上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸクロマトグラフィー材料の負荷量は、１５ｇ／Ｌ～３５０ｇ／Ｌである（及びこれを含む）。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「塩」への言及は、複数の、例えば１～３、又は１～２のそのような塩を含む。同様に、「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ以上の」及び「少なくとも１つの」という用語も、本明細書において交換可能に使用され得る。

「約」という用語は、その後の値が正確な値ではなく、値の＋／－１０％、又は値の＋／－５％、又は値の＋／－２％、又は値の＋／－１％である範囲の中心点であることを示す。値がパーセンテージで与えられる相対値である場合、「約」という用語はまた、その後の値が正確な値ではなく、値の＋／－１０％、又は値の＋／－５％、又は値の＋／－２％、又は値の＋／－１％である範囲の中心点であり、それによって範囲の上限が１００％の値を超えることができないことを示す。

「細胞」又は「宿主細胞」という用語は、例えば異種ポリペプチドをコードする核酸がトランスフェクトされ得る又はトランスフェクトされる細胞を指す。「細胞」という用語は、核酸の発現及びプラスミドの増殖を含むコードされたポリペプチドの産生に使用される原核細胞と、核酸の発現及びコードされたポリペプチドの産生に使用される真核細胞の両方を含む。一実施形態において、真核細胞は哺乳動物細胞である。一実施形態において、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞であり、任意にＣＨＯ Ｋ１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－６１又はＤＳＭ ＡＣＣ １１０）、又はＣＨＯ ＤＧ４４細胞（ＣＨＯ－ＤＨＦＲ［－］としても知られている、ＤＳＭ ＡＣＣ １２６）、又はＣＨＯ ＸＬ９９細胞、ＣＨＯ－Ｔ細胞（例えば、Ｍｏｒｇａｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６（１９８７）２９５９－２９６３を参照）、又はＣＨＯ－Ｓ細胞、又はＳｕｐｅｒ－ＣＨＯ細胞（Ｐａｋ，Ｓ．Ｃ．Ｏ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（１９９６）１３９－１４６）である。これらの細胞が無血清培地中又は懸濁液中での増殖に適合されていない場合、本方法での使用前に適合を行うべきである。本明細書で使用される場合、発現「細胞」には、対象細胞及びその子孫が含まれる。そのため、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語は、移入又は継代の回数にかかわらず初代対象細胞及びそれ由来の培養物を含む。また、全ての子孫は、意図的な、又は想定外の変異に起因して、ＤＮＡ含量において厳密に同一でない場合があることが理解される。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。

「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリンの結合パートナーへの結合に直接関与しないが、様々なエフェクタ機能を示す免疫グロブリンの部分を表す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは以下のクラスに分けられる：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ。これらのクラスのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＩｇＧ、又はＩｇＡ１及びＩｇＡ２のＩｇＡに更に分けられる。免疫グロブリンが属するクラスによれば、免疫グロブリンの重鎖定常領域は、それぞれα（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、及びμ（ＩｇＭ）と呼ばれる。

「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域断片を定義するために使用される。該用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）又はグリシン－リジンジペプチド（Ｇｌｙ４４６－Ｌｙｓ４４７）は、それぞれ存在しても存在しなくてもよい。ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う。

免疫グロブリンの「Ｆｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、完全長免疫グロブリンのパパイン切断に基づいて定義される。

本明細書に記載される抗体は常にＦｃ領域を含有するため、本明細書に報告される抗体はＦｃ領域含有ポリペプチド又は抗体である。

「（抗体の）定常領域」という用語は、本明細書では、可変ドメインを除く免疫グロブリン重鎖の部分を定義するために使用される。

「抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物」という用語は、ほぼ二量体（製造又は精製されている同じ所望の抗体／標的分子モノマー）の分子量又はより高分子量を有する不純物を指す。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物は、約２５０ｋＤａ以上の分子量を有する。上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物は、約２８５ｋＤａ以上の分子量を有する。特定の実施形態において、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物は、約３００ｋＤａ以上の分子量を有する。好ましい実施形態において、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物は、所望の抗体／標的分子の少なくとも二量体、三量体、又は任意の多量体である。したがって、特定の実施形態において、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物は、ほぼ同じ抗体の二量体の分子量又はより高分子量を有する不純物である。更に、それは、所望の抗体／標的分子の断片（半抗体のような）も含み得る。例えば、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物は、標的抗体の二量体又は三量体＋断片である。

ＨＭＷ不純物を測定する方法は当該技術分野で公知であり、例えば国際公開第２０１１／１５０１１０号に記載されている。そのような方法としては、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ－ＳＤＳ）及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）が挙げられる。

ＨＭＷ不純物は、実施例のセクションに記載されるように決定され得る。

「ウイルス不純物」又は「ウイルス不純物含有量」という用語は、ウイルス又はウイルス粒子による不純物を指す。実用上及び安全上の理由から、ウイルス不純物混入は、実際のウイルス／ウイルス不純物の代用としてレトロウイルス様粒子（ＲＶＬＰ）を用いて分析される。ＲＶＬＰは、ＲＮＡ含有量の決定によって（例えば、定量的逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲによって）決定することができる。

上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、
－ 方法は、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物含有量が低減された及び／又はウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物を製造するためのものであり、
－ 抗体と、少なくとも１つの抗体関連ＨＭＷ不純物及び／又は少なくとも１つのウイルス不純物と、アンチカオトロピック塩とを含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用され、
－ 抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された及び／又はウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物がフロースルーから回収され、
－ それによって、抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された及び／又はウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物が製造される。

上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、
－ 方法は、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物含有量が低減された及びウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物を製造するためのものであり、
－ 抗体と、少なくとも１つの抗体関連ＨＭＷ不純物及び少なくとも１つのウイルス不純物と、アンチカオトロピック塩とを含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用され、
－ 抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された及びウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物がフロースルーから回収され、
－ それによって、抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された及びウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物が製造される。

態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、
－ 方法は、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物含有量が低減された抗体組成物を製造するためのものであり、
－ 抗体と、少なくとも１つの抗体関連ＨＭＷ不純物と、アンチカオトロピック塩とを含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用され、
－ 抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された抗体組成物をフロースルーから回収し、
－ それにより、抗体関連ＨＭＷ不純物含有量が低減された抗体組成物が製造される。

態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、抗体関連（ＨＭＷ）不純物含有量は、工程ｂ）でＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用される溶液と比較して低減される。上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、抗体関連（ＨＭＷ）不純物含有量は、アンチカオトロピック塩を本質的に含まない溶液と比較して、及び／又は疎水性抗体を含む溶液と比較して、低減される。

上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、
－ 方法は、ウイルス不純物含有量／ウイルス不純物が低減された抗体組成物を製造するためのものであり、
－ 抗体と、少なくとも１つのウイルス不純物と、アンチカオトロピック塩とを含む溶液中で、抗体がＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用され、
－ ウイルス不純物含有量／ウイルス不純物が低減された抗体組成物をフロースルーから回収し、
－ それにより、ウイルス不純物含有量／ウイルス不純物が低減された抗体組成物が製造される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ウイルス不純物含有量／ウイルス不純物は、工程ｂ）でＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用された溶液と比較して低減される。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ウイルス不純物含有量／ウイルス不純物は、アンチカオトロピック塩を本質的に含まない溶液と比較して、及び／又は疎水性抗体を含む溶液と比較して、低減される。

本明細書で使用される場合、「混合モードクロマトグラフィー」又は「混合モードクロマトグラフィー材料」又は「ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ」という用語は、疎水性相互作用（ＨＩＣ）官能性／部分及びイオン交換（ＩＥＸ）官能性／部分を含む混合モード又はマルチモーダル（ＭＭ）クロマトグラフィー材料を指す（「混合モード」及び「マルチモーダル」という用語は互換的に使用することができる）。言い換えれば、混合モードクロマトグラフィー材料は、イオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む。したがって、それは、１つのクロマトグラフィー材料中に少なくとも２つの官能性を併せ持つ。ＭＭＩＥＸクロマトグラフィー材料は、他の官能性、例えば水素結合相互作用を更に含み得る。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、疎水性相互作用官能基に加えて、アニオン交換官能基又はカチオン交換官能基（イオン交換官能基として）を含む。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、アニオン交換官能基（イオン交換官能基として）を含む。次いで、この材料は、主にアニオン交換（ＡＥＸ）及び疎水性相互作用官能性（ＨＩＣ）を併せ持つ。上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、強アニオン交換官能基を含む（すなわち、マルチモーダル強アニオン交換クロマトグラフィー材料である）。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、（官能基として）帯電した窒素原子及び環構造を含む。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、（イオン交換官能基として）四級アミンを含む。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、（イオン交換官能基として）四級アミン及び（マトリックスとして）高度に架橋されたアガロースを含む。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、（官能基として）Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミン及び（マトリックスとして）高度に架橋されたアガロースを含む。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅ又はＮｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅ４Ａである。上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ、又はＣａｐｔｏ（商標）Ａｄｈｅｒｅである。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、（イオン交換官能基として）カチオン交換官能基を含む。次いで、この材料は、主にカチオン交換（ＣＥＸ）官能性及び疎水性相互作用（ＨＩＣ）官能性を組み合わせる。上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、弱カチオン交換官能基を含む（すなわち、マルチモーダル弱カチオン交換クロマトグラフィー材料である）。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、（イオン交換官能基として）弱カチオン交換官能基及び（マトリックスとして）高度に架橋されたアガロースを含む。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、（イオン交換官能基として）Ｎ－ベンゾイルホモシステイン及び（マトリックスとして）高架橋アガロースを含む。上記の態様の好ましい一実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ又はＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓである。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸは、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓである。

「アンチカオトロピック塩」（又はコモトロピック塩）という用語は、タンパク質立体配座をより水に溶けにくくすることができる化学的化合物を指す。アンチカオトロピック剤は、水－水相互作用の安定性及び構造に寄与する非共有結合力によって媒介される分子内相互作用を妨害することによって、系のエントロピーを減少させる。アンチカオトロピック塩は、典型的には、水分子を有利に相互作用させ、これはまた、高分子中の分子間相互作用を安定化させる。アンチカオトロピック塩は、イオン性及び／又は非イオン性であり得る。そのようなアンチカオトロピック剤の例としては、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌ等が挙げられるが、これらに限定されない。

上記の態様の特定の実施形態及び本明細書に報告される他の実施形態において、アンチカオトロピック塩は、塩化物、硫酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩又はフッ化物からなる群から選択される。一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、塩化物、硫酸塩、クエン酸塩、リン酸塩又は酢酸塩からなる群から選択される。一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、塩化物又は硫酸塩からなる群から選択される。一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、カルシウム（Ｃａ）、ナトリウム（Ｎａ）、アンモニウム（ＮＨ４）又はカリウム（Ｋ）を含む塩化物、硫酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩又はフッ化物からなる群から選択される。上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、アンチカオトロピック塩は、カルシウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩である。

好ましい一実施形態において、アンチカオトロピック塩はナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩である。一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、カルシウム（Ｃａ）、ナトリウム（Ｎａ）、アンモニウム（ＮＨ４）又はカリウム（Ｋ）を含む塩化物、硫酸塩、クエン酸塩、リン酸塩又は酢酸塩からなる群から選択される。一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、カルシウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩である。好ましい一実施形態において、アンチカオトロピック塩はナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩である。一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、カルシウム（Ｃａ）、ナトリウム（Ｎａ）、アンモニウム（ＮＨ４）又はカリウム（Ｋ）を含む、塩化物又は硫酸塩からなる群から選択される。一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、カルシウム塩、ナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩である。好ましい一実施形態において、アンチカオトロピック塩はナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩である。一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、ナトリウム（Ｎａ）、アンモニウム（ＮＨ４）又はカリウム（Ｋ）を含む、塩化物又は硫酸塩からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、アンチカオトロピック塩はナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩である。一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＮａＣｌ、ＫＣｌ及びＣａＣｌ_２からなる群から選択される。上記態様の好ましい実施形態及び他の実施形態において、アンチカオトロピック塩は、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＮａＣｌ及びＫＣｌからなる群から選択される。一実施形態において、アンチカオトロピック塩は、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、及びＫ_２ＳＯ_４からなる群から選択される。好ましい一実施形態において、アンチカオトロピック塩はＮａ_２ＳＯ_４である。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、アンチカオトロピック塩は、１．２８５～４．１８３×１０Ｅ３ ｄｙｎ＊ｇ＊ｃｍ^－１＊ｍｏｌ^－１の範囲の及びこれを含むモル表面張力増分を有する。好ましい実施形態において、アンチカオトロピック塩は、１．３～３．０×１０Ｅ３ｄｙｎ＊ｇ＊ｃｍ^－１＊ｍｏｌ^－１の範囲の及びこれを含むモル表面張力増分を有する。更に好ましい実施形態において、アンチカオトロピック塩は、１．４６～２．８６×１０Ｅ３ｄｙｎ＊ｇ＊ｃｍ^－１＊ｍｏｌ^－１の範囲の及びこれを含むモル表面張力増分を有する。

当業者は、モル表面張力の増分を決定する方法を知っている。この点に関する情報は、例えば、Ｌａｕｒｅｌ Ｍ．Ｐｅｇｒａｍ ａｎｄ Ｍ．Ｔｈｏｍａｓ Ｒｅｃｏｒｄ，Ｊｒ．，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ ２００７，１１１，５４１１－５４１７、及びＪａｎ－Ｃｈｒｉｓｔｅｒ Ｊａｎｓｏｎ；Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ｐ．１７０，ｔａｂｌｅ ６．２に見出すことができる。

「フロースルー」、「フロースルーモード（ｆｌｏｗｔｒｏｕｇｈ ｍｏｄｅ）」、「フロースルーモードで動作される」という用語又は同様の表現は、目的のタンパク質又は抗体がクロマトグラフィー材料に有意に結合しないようにクロマトグラフィーの条件（例えば、ｐＨ、緩衝液の含有量及び濃度、導電率等）が選択されるようにクロマトグラフィーを実施又は動作させる方法を指す。代わりに、目的のタンパク質又は抗体がクロマトグラフィー材料を通って流れる。本質的に全く結合が起こらないため、（結合溶出操作モードの場合のように）目的のタンパク質又は抗体をクロマトグラフィー材料から放出するために溶出が行われる必要もない。クロマトグラフィーカラム内に残っている残留タンパク質又は目的の抗体を回収するために、目的のタンパク質又は抗体を含む溶液をクロマトグラフィー材料に完全にローディングした（すなわち、目的のタンパク質を適用した）後に、（例えば、平衡化緩衝液又は同様の溶液を用いて）クロマトグラフィー材料をすすぐ追加の工程を行うことが有益であり得る。したがって、クロマトグラフィー材料が「フロースルーモードで動作される」場合、これは、目的の抗体／タンパク質を含む精製又は製造される溶液を適用する工程；目的の抗体／タンパク質をクロマトグラフィー材料に流す工程（及びそれにより、目的の抗体／タンパク質を不純物から分離することによって目的の抗体／タンパク質を精製する工程）；及びフロースルー（画分）中の目的の抗体／タンパク質を回収する工程を含む。任意に、すすぎ工程を実施することができる。

当業者は、フロースルーモードで動作するためにクロマトグラフィー条件をどのように選択しなければならないかを知っている。例えば、フロースルー条件を達成するために、当業者は、分子のｐＩ（等電点）に応じて、目的の分子がクロマトグラフィー材料に有意に結合しないようにｐＨを選択しなければならないことを理解している。ｐＨが分子のｐＩより低い場合、分子は正に帯電しており、アニオン交換官能基を有する混合モードクロマトグラフィー材料に有意に結合しない。一方、ｐＨが分子のｐＩよりも高い場合、分子は負に帯電しており、カチオン交換官能基を有する混合モードクロマトグラフィー材料に有意に結合しない。

当業者は、クロマトグラフィー条件がｐＨの値によって影響され得ることを知っている。上記のように、ｐＨ値の選択は、分子のｐＩ及び達成されるべき条件に大きく依存する。

全ての態様の一実施形態において、抗体及び（工程ｂの）アンチカオトロピック塩を含む溶液は、４．０以上のｐＨ値を有する。全ての態様の一実施形態において、（工程ｂの）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、４．５以上のｐＨ値を有する。全ての態様の一実施形態において、（工程ｂの）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、５．０以上のｐＨ値を有する。全ての態様の一実施形態において、（工程ｂの）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、５．５以上のｐＨ値を有する。好ましい一実施形態において、（工程ｂの）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、６．０以上のｐＨ値を有する。全ての態様の一実施形態において、（工程ｂの）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、７．０以上のｐＨ値を有する。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、（工程ｂの）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、３．５～９．５のｐＨ値を有する。好ましい一実施形態において、（工程ｂの）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、４．０～９．０のｐＨ値を有する。一実施形態において、（工程ｂの）抗体をアンチカオトロピック塩を含む溶液は、５．０～８．５のｐＨ値を有する。好ましい一実施形態において、（工程ｂの）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、５．５～８．５のｐＨ値を有する。一実施形態において、（工程ｂの）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、５．５～８．０のｐＨ値を有する。一実施形態において、（工程ｂの）抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、５．０～８．０のｐＨ値を有する。

当業者は、クロマトグラフィー条件が導電率条件によって影響され得ることを知っている。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、０．５ｍＳ／ｃｍ以上の導電率を有する。好ましい一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、０．５～１２０ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、０．５～１００ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、０．５～８０ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、０．５～６０ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、０．５～５０ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、０．５～３０ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。好ましい一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、４～２５ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、１０～２０ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。特に、一実施形態におけるウイルス不純物の除去に関して、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、５～２５ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、８～２２ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、１０～２０ｍＳ／ｃｍ（及びこれを含む）の導電率を有する。

上記態様の特定の実施形態及び他の実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中、アンチカオトロピック塩は、５ｍＭ以上のアンチカオトロピック塩のモル濃度を有する。好ましい一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中、アンチカオトロピック塩は、１０ｍＭ以上のアンチカオトロピック塩のモル濃度を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中、アンチカオトロピック塩は、２０ｍＭ以上のアンチカオトロピック塩のモル濃度を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中、アンチカオトロピック塩は、５ｍＭ～１０００ｍＭ（及びこれを含む）のアンチカオトロピック塩のモル濃度を有する。好ましい一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中、アンチカオトロピック塩は、１０ｍＭ～９００ｍＭ（及びこれを含む）のアンチカオトロピック塩のモル濃度を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中、アンチカオトロピック塩は、１５ｍＭ～８５０ｍＭのアンチカオトロピック塩のモル濃度を有する。特にウイルス不純物の除去に関して、一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、５０ｍＭ～４００ｍＭ（及びこれを含む）のアンチカオトロピック塩のモル濃度を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、５０ｍＭ～３００ｍＭ（及びこれを含む）のアンチカオトロピック塩のモル濃度を有する。一実施形態において、抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液は、５０ｍＭ～２５０ｍＭ（及びこれを含む）のアンチカオトロピック塩のモル濃度を有する。

アンチカオトロピック塩は、ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸにロードされた溶液に添加することができ、及び／又はＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸの前に実施された方法工程からＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸにロードされた溶液中に存在し得ることが理解される。例えば、アンチカオトロピック塩は、先のクロマトグラフィー工程で溶液中に存在していた可能性がある。

以下の実施例及び図は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の趣旨から逸脱することなく、示された手順に修正を加えることができると理解される。

ｐＨ８及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件の場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌを含有する７０ｍＭトリス／酢酸塩緩衝液と比較した、１．５Ｍトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ１の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ８及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件の場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌを含有する７０ｍＭトリス／酢酸塩緩衝液と比較した、１．５Ｍトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ８及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件の場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌを含有する７０ｍＭトリス／酢酸塩緩衝液と比較した、１．５Ｍトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ４の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ８及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件の場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌを含有する７０ｍＭトリス／酢酸塩緩衝液と比較した、１．５Ｍトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ５の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ８及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件の場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌを含有する７０ｍＭトリス／酢酸塩緩衝液と比較した、１．５Ｍトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ６の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ８及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件の場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌを含有する７０ｍＭトリス／酢酸塩緩衝液と比較した、１．５Ｍトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ７の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ８及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件の場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌを含有する７０ｍＭトリス／酢酸塩緩衝液と比較した、１．５Ｍトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ８の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣ上での親水性ｍａｂ２のフロースループールについてのＨＭＷ除去［％］を計算するための、負荷条件２０ｍＳ／ｃｍの導電率での１．５Ｍトリス／酢酸塩、ｐＨ８、及び２０ｍＳ／ｃｍの導電率での負荷条件７０ｍＭトリス／酢酸塩、１００ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ｐＨ８についての傾向線の図２への導入。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣ上での疎水性ｍａｂ７のフロースループールについてのＨＭＷ除去［％］を計算するための、負荷条件２０ｍＳ／ｃｍの導電率での１．５Ｍトリス／酢酸塩、ｐＨ８、及び２０ｍＳ／ｃｍの導電率での負荷条件７０ｍＭトリス／酢酸塩、１００ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ｐＨ８についての傾向線の図６への導入。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣで図８Ａに導入された傾向線を使用した、２０ｍＳ／ｃｍの導電率での１．５Ｍトリス／酢酸塩、ｐＨ８の負荷条件、及び２０ｍＳ／ｃｍの導電率での７０ｍＭトリス／酢酸塩、１００ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ｐＨ８の負荷条件についての親水性ｍａｂ２のフロースループールについての計算されたＨＭＷ除去［％］の比較。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣで図８Ｂに導入された傾向線を使用した、２０ｍＳ／ｃｍの導電率での１．５Ｍトリス／酢酸塩、ｐＨ８の負荷条件、及び２０ｍＳ／ｃｍの導電率での７０ｍＭトリス／酢酸塩、１００ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ｐＨ８の負荷条件についての疎水性ｍａｂ７のフロースループールについての計算されたＨＭＷ除去［％］の比較。 ｐＨ６及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４又はＫＣｌを含有する７０ｍＭトリス／クエン酸塩緩衝液と比較した、１．０Ｍトリス／クエン酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ１の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ６及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４又はＫＣｌを含有する７０ｍＭトリス／クエン酸塩緩衝液と比較した、１．０Ｍトリス／クエン酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ６及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４又はＫＣｌを含有する７０ｍＭトリス／クエン酸塩緩衝液と比較した、１．０Ｍトリス／クエン酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ４の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ６及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４又はＫＣｌを含有する７０ｍＭトリス／クエン酸塩緩衝液と比較した、１．０Ｍトリス／クエン酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ５の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ６及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４又はＫＣｌを含有する７０ｍＭトリス／クエン酸塩緩衝液と比較した、１．０Ｍトリス／クエン酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ６の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ６及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４又はＫＣｌを含有する７０ｍＭトリス／クエン酸塩緩衝液と比較した、１．０Ｍトリス／クエン酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ７の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ６及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４又はＫＣｌを含有する７０ｍＭトリス／クエン酸塩緩衝液と比較した、１．０Ｍトリス／クエン酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ８の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ６及び１０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌを含有する７０ｍＭトリス／クエン酸塩緩衝液と比較した、３００ｍＭトリス／クエン酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ６及び１０ｍＳ／ｃｍの負荷伝導率の負荷条件場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌを含有する７０ｍＭトリス／クエン酸塩緩衝液と比較した、３００ｍＭトリス／クエン酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ７の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ８及び１０ｍＳ／ｃｍの伝導率の負荷条件の場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌを含有する７０ｍＭトリス／酢酸塩緩衝液と比較した、４００ｍＭトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ｐＨ８及び１０ｍＳ／ｃｍの伝導率の負荷条件の場合の、ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣでの、フロースルーモードでのアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４又はＮａＣｌを含有する７０ｍＭトリス／酢酸塩緩衝液と比較した、４００ｍＭトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ７の総負荷量［ｍｇ_{タンパク質}／ｍＬ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣで、７０ｍＭのトリス／酢酸塩、ｐＨ８及び異なるモル濃度のアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有する負荷条件での親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のメインピーク値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣで、７０ｍＭのトリス／酢酸塩、ｐＨ８及び異なるモル濃度のアンチカオトロピック塩ＮａＣｌを含有する負荷条件での親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のメインピーク値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣで、７０ｍＭのトリス／酢酸塩、ｐＨ８及び異なるモル濃度のアンチカオトロピック塩（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含有する負荷条件での親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のメインピーク値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣで、７０ｍＭのトリス／酢酸塩、ｐＨ８及び異なるモル濃度のアンチカオトロピック塩ＫＣｌを含有する負荷条件での親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のメインピーク値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣで、７０ｍＭのトリス／酢酸塩、ｐＨ８及び異なるモル濃度のアンチカオトロピック塩Ｋ_２ＳＯ_４を含有する負荷条件での親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のメインピーク値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ４のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大６５０ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ６のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩ＫＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩ＫＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ４のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩ＫＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ６のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩Ｇｕａ／ＨＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩Ｇｕａ／ＨＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ４のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩Ｇｕａ／ＨＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ６のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩尿素を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩尿素を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ４のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩尿素を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ６のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ４．０～ｐＨ９．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたロボットフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ４．０～ｐＨ９．０及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量で、最大１０００ｍＭのモル濃度までトリスモル濃度を増加させるトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｎｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩ＫＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ を用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩ＫＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｎｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩ＫＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩Ｇｕａ／ＨＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩Ｇｕａ／ＨＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｎｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩Ｇｕａ／ＨＣｌを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩尿素を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩尿素を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｎｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するカオトロピック塩尿素を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．５～ｐＨ８．０で最大６５０ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ６のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＡＥＸクロマトグラフィー媒体Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ４．０～ｐＨ９．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＡＥＸクロマトグラフィー媒体Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ４．０～ｐＨ９．０で最大４５０ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ６のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＨＩＣクロマトグラフィー媒体Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ４．０～ｐＨ９．０で最大６５０ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＨＩＣクロマトグラフィー媒体Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ４．０～ｐＨ９．０で最大６５０ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ６のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＣＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ４．０～ｐＨ９．０で最大８００ｍＭのモル濃度及び７５ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 ＭＭＣＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ４．０～ｐＨ９．０で最大６５０ｍＭのモル濃度及び７５ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ６のフロースルー試料のＨＭＷ除去値［％］。 実験室規模のＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓカラムで、異なるモル濃度のＮａ_２ＳＯ_４（４０ｍＭのＮａ_２ＳＯ_４と比較して２０ｍＭ）を含有するｐＨ８及び９ｍＳ／ｃｍの導電率での２つの負荷による親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のメインピーク値［％］。 実験室規模のＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓカラムで、７０ｍＭのトリス／酢酸塩、ｐＨ８及び異なるモル濃度のアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有する負荷条件での親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のメインピーク値［％］。 実験室規模のＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓカラムで、７０ｍＭのトリス／酢酸塩、ｐＨ７及び異なるモル濃度のアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有する負荷条件での親水性ｍａｂ２の総負荷量［ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}］の増加に伴うフロースルー画分のメインピーク値［％］。 プールのメインピーク値は、実験室規模のＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓカラムで、７０ｍＭのＴトリス／酢酸塩、ｐＨ８及び異なるモル濃度のアンチカオトロピック塩ｓａｌｔ Ｎａ_２ＳＯ_４を含有する負荷条件で、１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷量での親水性ｍａｂ２の画分の平均メインピーク値を使用して計算した。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０で最大４００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩硫酸ナトリウムを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ１のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０で最大４００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩硫酸ナトリウムを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０で最大４００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩硫酸ナトリウムを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ７のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０で最大４００ｍＭのモル濃度及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩硫酸ナトリウムを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ９のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０で最大３４ｍＳ／ｃｍの導電率及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩硫酸ナトリウムを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ１のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０で最大３４ｍＳ／ｃｍの導電率及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩硫酸ナトリウムを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０で最大３４ｍＳ／ｃｍの導電率及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩硫酸ナトリウムを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ７のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０で最大３４ｍＳ／ｃｍの導電率及び１５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量を有するアンチカオトロピック塩硫酸ナトリウムを含有するトリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ９のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０及び１５０ｇ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量でトリスモル濃度を最大１１００ｍＭまで増加させた、トリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ１のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０及び１５０ｇ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量でトリスモル濃度を最大１１００ｍＭまで増加させた、トリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０及び１５０ｇ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量でトリスモル濃度を最大１１００ｍＭまで増加させた、トリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ７のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０及び１５０ｇ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量でトリスモル濃度を最大１１００ｍＭまで増加させた、トリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ９のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０及び１５０ｇ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量で導電率を最大１９ｍＳ／ｃｍまで増加させた、トリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ１のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０及び１５０ｇ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量で導電率を最大１９ｍＳ／ｃｍまで増加させた、トリス／酢酸塩緩衝液中の親水性ｍａｂ２のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０及び１５０ｇ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量で導電率を最大１９ｍＳ／ｃｍまで増加させた、トリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ７のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。 ＭＭＡＥＸ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを用いたフィルタプレート実験を使用して、ｐＨ５．０～ｐＨ８．０及び１５０ｇ_{ｐｒｏｔｅｉｎ}／Ｌ_{クロマトグラフィー媒体}の負荷容量で導電率を最大１９ｍＳ／ｃｍまで増加させた、トリス／酢酸塩緩衝液中の疎水性ｍａｂ９のフロースルー試料のＲＮＡ対数減少。

実施例部分
材料及び方法
１．タンパク質
本明細書で使用される分子は、チャイニーズハムスター卵巣細胞で産生されたヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍａｂ）であった。混合モードクロマトグラフィーカラムをロードするために使用した出発材料は、アフィニティークロマトグラフィーカラム溶出液（「アフィニティーカラムプール」と表記する）であった。分子は、標準的なＩｇＧ様ｍａｂ及び複合抗体フォーマット、例えば二重特異性ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマット、結合リガンドを含有するｍａｂ（２＋１ Ｃフォーマット）及びＴ細胞結合ｍａｂ（２＋１ Ｎフォーマット；ＴＣＢ）を包含した。分子のｐＩは８．０～９．４の範囲内であった。

ＲＶＬＰ除去試験のために、混合モードクロマトグラフィーカラムにロードするために使用した出発物質は、第２のカラムクロマトグラフィー溶出液（すなわち、アフィニティークロマトグラフィー及びその後の第２のクロマトグラフィーラン後の溶出液；「第２のカラムプール」と表記する）であった。第２のクロマトグラフィーランは、例えば、カチオン交換クロマトグラフィー材料（例えばｍａｂ９の場合のように）、アニオン交換クロマトグラフィー材料、又は混合モードアニオン交換クロマトグラフィー材料（例えばｍａｂ１、ｍａｂ２又はｍａｂ７の場合のように）等の混合モードクロマトグラフィー材料で行われ得る。

保持時間を決定するための方法は、材料及び方法の項目１０において以下に記載される。この方法で決定されたｍａｂの保持時間は、１９分～４１分の範囲であった。ｍａｂの保持時間の概要を表１に示す。リツキシマブの保持時間は、親水性及び疎水性ｍａｂを定義するためのカットポイントであることが分かった。保持時間≦保持時間_{リツキシマブ}を有する、すなわち、リツキシマブと同じ又はより短い保持時間を有するＭａｂは、親水性であると定義され、保持時間＞保持時間_{リツキシマブ}を有する、すなわち、より長い保持時間を有するＭａｂは、疎水性であると定義される。

（表ＭＭ－１）Ｍａｂ及び保持時間

２．化学物質
Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＣｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ｘ２Ｈ_２Ｏ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ｘＨ_２Ｏ、エタノール、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、酢酸、クエン酸、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、グアニジニウム／塩酸塩、尿素、ＮａＯＨは、以下に列挙する製造業者から購入し、製造業者によって提供たままで使用した。
Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ：Ｋ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＫＣｌ、Ｎａ_２ＨＰＯ_４ｘ２Ｈ_２Ｏ、ＮａＨ_２ＰＯ_４ｘＨ_２Ｏ、エタノール、酢酸、クエン酸、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化グアニジニウム、尿素、ＮａＯＨ
ＡＮＧＵＳ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ及びＭｅｒｃｋ ＫＧａＡ：硫酸アンモニウム
Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ：硫酸カリウム

３．Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍｎ（ＲＣ）
Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍｎｓ（商標）（ＲＣ）を、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ ＧｍｂＨ（レーベンスブルク、ドイツ国）から購入した：
－ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ；ＰＮ ０１１００４０８Ｒ；２００μＬ

４．クロマトグラフィー樹脂
以下のクロマトグラフィー樹脂を本明細書で使用した：
－ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ（Ｃｙｔｉｖａ（旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ウプサラ、スウェーデン国）
－ Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ（Ｃｙｔｉｖａ（旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））
－ Ｎｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅ ４Ａ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国）
－ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（Ｃｙｔｉｖａ（旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））
－ フェニルセファロース６ ＦＦ（高ｓｕｂ）（Ｃｙｔｉｖａ（旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））
－ Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ（Ｃｙｔｉｖａ（旧ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））

５．ロボット実験装置
－ フィルタプレート：ＰＡＬＬ；ＡｃｒｏＰｒｅｐ Ａｄｖａｎｃｅ ９６ウェル、１ｍＬ、０．４５μｍ、ＲＥＦ ８１８４
－ ＭＴＰ ＵＶプレート：ＵＶマイクロタイタープレート、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ

６．負荷調製のための材料
－ 遠心分離：Ｈｅｒａｅｕｓ Ｍｕｌｔｉｆｉｇ ３ Ｓ－Ｒ；ロータ：７５００６４４５
－ Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルタ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｕｌｔｒａｃｅｌ－３０Ｋ）
－ Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ透析カセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２０ ０００－３０ ０００ ＭＷＣＯ）
－ Ｍｉｎｉｓａｒｔシリンジフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｉｎｉｓａｒｔ Ｈｉｇｈ Ｆｌｏｗ、０．２２μｍ）

７．ロボットシステム
７．１．Ｔｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ １５０
ＲＣランを実行するために、Ｔｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ １５０（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、クライルスハイム、ドイツ国）液体操作システム（ＬＨＳ）を使用した。ＥＶＯ１５０は、一方の液体処理アーム（ＬｉＨａ）及び一方の偏心グリッパ、ＲＣ用のアトールブリッジ及びＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ ＮａｎｏＱｕａｎｔプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、クライルスハイム、ドイツ国）を備えていた。ＬＨＳを、ソフトウェアＦｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯｗａｒｅ（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、クライルスハイム、ドイツ国）によって制御した。プレートリーダを制御するために使用したソフトウェアは、Ｍａｇｅｌｌａｎ（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、クライルスハイム、ドイツ国）であった。プラットフォームには、更に、９６ウェル収集プレート（マイクロタイタープレート）の保管用のＴｅ－Ｓｔａｃｋ（商標）、並びにプレート搬送及び画分収集用のＴｅ－Ｓｌｉｄｅ（商標）が装備された。ＬｉＨａは、１０μＬ～１０００μＬの体積を処理することができ、１０００μＬの希釈シリンジを備えていた。ＬｉＨａは、８つの固定ステンレス鋼針を備えた８つの別々に制御可能なチャネルからなっていた。全てのＲＣランを、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ樹脂を用いて行った。カラム寸法は、長さ１ｃｍ×直径０．５ ｃｍ、ベッド体積は２００μＬであった。

７．２．Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲｌｅｔ
本明細書で使用されるフィルタプレートの調製には、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲｌｅｔロボットを使用した。ロボッター（ｒｏｂｏｔｅｒ）は、８つの１０００μＬピペットチャネル及びシェーカーを備えていた。樹脂の５０％スラリー水溶液（ｖ／ｖ）を生成し、シェーカー上のガラスバイアルに入れた。ＬｉＨａには、シェーカーからフィルタプレートに樹脂を移すための１０００μＬの先端（切断）の広い穴を装備した。ウェルあたり５０μＬの樹脂を含むフィルタプレートを製造した。保管液は水であった。

７．３．Ｔｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ ２００
Ｔｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ ２００（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、クライルスハイム、ドイツ国）液体操作システムを使用して、本明細書で使用する負荷プレート及び緩衝液プレートを調製し、ランを行った。Ｔｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ ２００は、一方の液体処理アーム（ＬｉＨａ）、一方の偏心グリッパ、Ｔｅ－Ｓｈａｋｅ（商標）、マイクロプレートの保管用Ｔｅ－Ｓｔａｃｋ（商標）、プレート搬送用Ｔｅ－Ｓｌｉｄｅ（商標）、及びＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダ（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈａｌｎｄ ＧｍｂＨ、クライルスハイム、ドイツ国）を備えていた。更に、遠心分離機（Ｒｏｔａｎｔａ ４６ＲＳＣ、ヘティヒ、ドイツ国）を作業台に組み込み、インキュベーション後に上清を除去した。ＬｉＨａは、１０μＬ～１０００μＬの体積を処理することができ、１０００μＬの希釈シリンジを備え、８つの固定ステンレス鋼ピペットチップを備えた８つの別々に制御可能なチャネルからなっていた。Ｔｅｃａｎロボットを、ソフトウェアＥｖｏｗａｒｅによって制御した。プレートリーダを制御するために使用したソフトウェアは、Ｍａｇｅｌｌａｎであった。

８．タンパク質純度の決定
モノマー含有量及び高分子量種に関するタンパク質純度を、ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用したサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）によって決定した。溶出液として０．２Ｍ Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．０を使用して、０．５～１．０ｍｌ／分の流速でＴＳＫ－Ｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬ（７．８×３００ｍｍ；５μｍ）カラム（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐ／Ｎ ０８５４１）でタンパク質分離を行った。
以下の条件を使用した：
波長２８０ｎｍ
アイソクラティック；３０分
カラム温度：２５℃
試料温度：１０℃
適用量：１５０μｇタンパク質

９．タンパク質濃度の決定
９．１．キュベットを用いた決定
タンパク質濃度を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ミュンヘン、ドイツ国）を使用してＵＶ分光法によって決定した。測定をキュベットで実行した。タンパク質試料を水で希釈した。ランベルト・ベールの法則から導かれる以下の等式１に従って濃度を決定した：
（Ａ_２８０－Ａ_３２０）＝ε・ｃ・ｄ （１）
Ａ 吸光度、ｃ タンパク質濃度［ｍｇ／ｍｌ］、ε 吸光係数［ｍｌ／（ｍｇ＊ｃｍ）］、ｄ 経路長［ｃｍ］。

９．２．マイクロプレートを用いた決定
タンパク質濃度を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅプレートリーダ（Ｔｅｃａｎ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ、クライルスハイム、ドイツ国）を使用するＵＶ分光法によって決定した。測定をマイクロプレートで実行した。タンパク質試料を水で希釈した。等式（１）に従って濃度を決定した。

経路長ｄを、以下の等式２を用いて計算した。

Ａ_水＝０．１５９ＯＤ／ｃｍ（アプリケーションノートＴＥＣＡＮに対応；文書番号Ｎ１２９０１３ ０２）。

１０．保持時間及び疎水性の決定
１０．１．機器
－ データ収集システムが統合されたＨＰＬＣ装置；Ｄｉｏｎｅｘ（現在はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
－ ０．２μｍメンブレンフィルタ；例えば、Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｕｐｏｒ（登録商標）－２００、カタログ番号６０３０１
－ Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｅｔｈｅｒ－５ＰＷ ＨＰＬＣカラム、１０μｍ、７．５ｍｍ×７５ｍｍ、カタログ番号０００８６４１、すなわち内径２ｍｍ、カラム長７５ｍｍ及び粒径１０μｍの疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム。カラムは、リガンドとしてポリエーテル基（エチルエーテル基）を有するポリメタクリレート基材（マトリックス）を有する。

１０．２．作業溶液：
－ 溶出液Ａ：ｐＨ７．０に調整した１．５Ｍ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を含む２５ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液
－溶出液Ｂ：ｐＨ７．０に調整した２５ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液

１０．３．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）標準
標準的な調製のため、リツキシマブを適切な希釈緩衝液で１ｍｇ／ｍｌに希釈する。２０μｌ（＝２０μｇ）のＨＩＣ標準を注入する。リツキシマブのピークは、３２分に近いランタイムで現れる、すなわち、３２分に近い保持時間を有する。

１０．４．試料
試料を１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。試料が既に１ｍｇ／ｍｌの濃度である場合、希釈は不要である。２０μｌ（＝２０μｇ）の１ｍｇ／ｍｌ溶液を注入する。

１０．５．ブランク
２０μｌの希釈緩衝液を注入した。

１０．６．新しいカラムのコンディショニング
カラムを超純水中に提供した。最初のランの前に、新しいカラムを以下のように調製した：
１）カラムを周囲温度で溶出液Ｂに移し、最低４０分以内にフローを０．０ｍｌ／分から０．８ｍｌ／分までゆっくりと増加させ、その後、安定なベースラインに達するまで（通常６０分後）、カラムを溶出液Ｂにより０．８ｍｌ／分で洗浄した。
２）勾配ラン：２０分以内に０％溶出液Ａから１００％溶出液Ａまで直線勾配を実行し、その後、安定なベースラインに達するまで（通常６０分後）カラムを溶出液Ａで洗浄した。
３）飽和：利用可能な標準を注入し、１０．８に従って処理し、３つの連続するクロマトグラムがピーク形態、高さ及び面積に関して同一になるまで複数回行った。その後、カラムを使用した。

１０．７．使用済みカラムのコンディショニング
マウント後、カラムを周囲温度で超純水で洗浄した。フローを、最小４０分以内で０．０ｍｌ／分から０．８ ｍｌ／分までゆっくりと増加させた。その後、安定したベースラインに達するまでカラムを溶出液Ａで０．８ｍｌ／分で洗浄した。その後、カラムを使用した。

１０．８．作業条件及び配列レイアウト
任意のシーケンスの前に、１×溶出液Ａを注入し、続いて２０μｌの０．１Ｍ ＮａＯＨを注入し、溶出液Ａをもう１回注入した。
以下の作業条件を使用した：
流量：０．８ｍｌ／分
勾配：

最大圧力：２２バール
波長：２１４ｎｍ（更に２２０ｎｍ及び２８０ｎｍを記録）
注入タンパク質：２０μｇ
カラム温度：４０℃±２℃
オートサンプラ内の温度：１０℃±４℃

ＨＩＣ標準及び試料を以下の順序で測定した：
１．溶出液Ａ
２．２０μｌ ０．１Ｍ ＮａＯＨ
３．溶出液Ａ
４．ＨＩＣ／参照
５．ブランク（希釈緩衝液）
６．試料１～ｎ
７＋ｎ ブランク（希釈緩衝液）

保持時間をピーク最大で決定した。

リツキシマブと同時又はリツキシマブの前に溶出する（保持時間が短い）Ｍａｂは親水性であることが分かっている（保持時間_ｍａｂ≦保持時間_{リツキシマブ}）が、リツキシマブの後に溶出する（保持時間が長い）Ｍａｂは疎水性であることが判明している（保持時間_ｍａｂ＞保持時間_{リツキシマブ}）。

１１．ＲＮＡ濃度の測定
ＲＶＬＰの除去を決定するために、試料中のＲＮＡ濃度を代表的な平均値として決定する。

自動ＲＮＡ分析は、ＦＬＯＷ ＰＣＲセットアップシステム（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｇｍｂｈ）を介して実施される。システムは３つのモジュールからなる。ＦＬＯＷ ＰＣＲ ＳＥＴＵＰ機器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、注文番号０７１０１９９６００１）、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６機器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、注文番号０６５４１０８９００１）及びＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０機器（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、注文番号０５０１５２７８００１）。ＲＮＡ含有量の決定は、製造業者の操作マニュアルに従って行われる。簡潔には、ＲＮＡを、ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ ９６機器を使用して単離する。ＤＮＡｓｅで処理した後、プローブをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０機器で測定して、ＰＣＲ技術（定量ＲＴ ＰＣＲ）によってＲＮＡを定量する。したがって、ＲＮＡは、逆転写（ＲＴ）によって最初にｃＤＮＡに変換される。次いで、ｃＤＮＡをＰＣＲ反応で増幅し、標準曲線との比較によって濃度を定量する。その後、結果をＲＮＡ含有量に変換する。

実施例の概要
実施例セクションは、以下の４つの部分に細分することができる。
パートＩ：一定の導電率での高分子量（ＨＭＷ）不純物低減に対するｍａｂ疎水性の影響
フロースルー（ＦＴ）ランを、ロボットシステム（Ｔｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ １５０）上でＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）を用いて行った。最大５つのアンチカオトロピック（ａｃ）塩、（Ｎａ_２ＳＯ_４、ＮａＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、Ｋ_２ＳＯ_４）を選択した。７つのｍａｂのＦＴを収集し、純度をＳＥ－ＨＰＬＣによって分析した。負荷にアンチカオトロピック塩を添加することによって達成されたＨＭＷ減少を、アンチカオトロピック塩を含有しない同じ導電率のトリス／酢酸塩緩衝液（ｐＨ８）、適宜にトリス／クエン酸緩衝液（ｐＨ６）で測定されたＨＭＷ減少と比較した。親水性ｍａｂ（保持時間_ｍａｂ≦保持時間_{リツキシマブ）}についてのみ、アンチカオトロピック塩の非存在下で同じ導電率を有する負荷材料と比較して、負荷材料へのアンチカオトロピック塩の添加によって改善されたＨＭＷ減少が達成されることが示された。これとは対照的に、疎水性ｍａｂ（保持時間_ｍａｂ＞保持時間_{リツキシマブ}）では、アンチカオトロピック塩の添加によるプラスの影響は観察されなかった。

表ＭＭ－２は、パートＩの実施例を要約する。

（表ＭＭ－２）パートＩ－実施例

パートＩＩ：ＨＭＷ除去に対するアンチカオトロピック塩モル濃度の影響
第２の実験部分では、ＨＭＷ減少に対するアンチカオトロピック塩の異なるモル濃度の影響を調査するために、ＲＣ実験及びＫｐ（分配係数）スクリーンを行った。実施例４では、親水性ｍａｂをＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣに５００ｍＭまでのモル濃度範囲で負荷した。種々の塩、Ｎａ_２ＳＯ_４、ＮａＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ及びＫ_２ＳＯ_４をｐＨ８．０で調査した。塩モル濃度の増加は、ＦＴ画分中のＨＭＷの減少を改善し得ることが示された。

これらのＲＣランに加えて、Ｋｐスクリーンを実行して、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ樹脂／クロマトグラフィー材料を使用して、より広範囲のｐＨ及びモル濃度についてＨＭＷ減少に対する塩モル濃度の影響を示した（実施例５及び実施例６）。実施例５については、３つのｍａｂ、２つの親水性ｍａｂ及び１つの疎水性ｍａｂを選択した。Ｋｐスクリーンについて、調査したｐＨ範囲はｐＨ５．５～８．０であり、モル濃度範囲１０～８００ｍＭであった。ＫｐスクリーンＨＭＷ減少は、ＲＣデータを確認した。親水性ｍａｂの場合、塩モル濃度の増加はＨＭＷ減少の改善をもたらしたが、疎水性ｍａｂのＨＭＷ減少は、アンチカオトロピック塩モル濃度を増加させることによって改善されないことが示された。アンチカオトロピック塩の必要性を強調するために、カオトロピック塩を更に調査した。カオトロピック塩を使用したコンタープロットは、塩モル濃度の増加に伴うＨＭＷ減少の改善を示さなかった。

実施例６では、ｍａｂ２及びスクリーニング範囲のｐＨ４～９及び最大約９００ｍＭのモル濃度でＫｐスクリーンを実施した。これらのＫｐスクリーン内で、２組の緩衝液を比較した：アンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４を含有する１つの緩衝液及びアンチカオトロピック塩を含まない１つの緩衝液（トリス／酢酸緩衝液のみ）。

表ＭＭ－３は、パートＩＩの実施例を要約する。

（表ＭＭ－３）パートＩＩ－実施例

パートＩＩＩ：ＨＭＷ除去と他の樹脂との比較
第３の部分は、２つの実施例からなる。実施例７では、５．５～８．０のｐＨ範囲及び１０～８００ｍＭの塩モル濃度における親水性ｍａｂのＨＭＷ除去を調査した。この実施例では、以下の混合モードアニオン交換（ＭＭＡＥＸ）樹脂を比較した：Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ 及びＮｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅ親水性ｍａｂを含む負荷溶液にアンチカオトロピック塩を添加した場合、３つ全ての樹脂が改善されたＨＭＷ減少を示した。

実施例８は、ＭＭＡＥＸ、アニオン交換（ＡＥＸ）樹脂、ＨＩＣ樹脂、及び１つの親水性ｍａｂ及び１つの疎水性ｍａｂを有する混合モードカチオン交換（ＭＭＣＥＸ）樹脂のＫｐスクリーンを要約する。調査したｐＨ範囲は、ｐＨ４．０～９．０及び５～８５０ｍＭの塩であった。親水性ｍａｂのフロースルー試料は、両方のイオン混合モード樹脂（ＭＭＡＥＸ及びＭＭＣＥＸ）について、塩モル濃度の増加に伴う改善されたＨＭＷ減少を示した。ＭＭＡＥＸ樹脂上の疎水性ｍａｂ ＨＭＷ減少とは対照的に、調査した塩モル濃度の範囲にわたって一定であった。ＭＭＣＥＸ樹脂の場合、疎水性ｍａｂのＨＭＷ減少は、塩モル濃度を５００ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４未満に増加させることによって改善されなかった。シングルモード樹脂Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＡＥＸ）では、ＨＭＷ減少に対するプラスの効果は、親水性ｍａｂについても疎水性ｍａｂについても観察されなかった。Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＦＦ（高ｓｕｂ）（ＨＩＣ）について、ＨＭＷ減少に対する塩モル濃度の増加の正の影響を、親水性ｍａｂ及び疎水性ｍａｂについて測定した。

表ＭＭ－４は、パートＩＩＩの実施例を示す。

（表ＭＭ－４）パートＩＩＩ－実施例

パートＩＶ：ＡＫＴＡカラムのランのアップスケーリング
第４の部分のスケールアップランについては、ＡＫＴＡシステムでＮａ_２ＳＯ_４及びｍａｂ２を用いて行った。ここでは、５０μＬのＫｐスクリーン樹脂体積及び２００μＬのＲＣ体積から６．８ｍＬのカラム体積へのアップスケーリングを、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ樹脂を用いて行った。実施例９は、同じ導電率であるが異なるＮａ_２ＳＯ_４モル濃度での２回のランに対するＦＴ画分のメインピーク値を示す。両方の負荷の導電率は同等であったが、Ｎａ_２ＳＯ_４のより高いモル濃度を含む負荷のＨＭＷ減少は著しく良好であった。実施例１０では、異なるＮａ_２ＳＯ_４モル濃度（及び異なる導電率）を有するｐＨ７及びｐＨ８でのランを記載した。改善されたＨＭＷ減少は、塩モル濃度の増加に伴って決定された。これらの実験室規模の結果は、パートＩＩ及びＩＩＩのロボットシステムで達成された結果を確認した。

表ＭＭ－５は、パートＩＶの実施例を示す。

（表ＭＭ－５）パートＩＶ－実施例

パートＶ：ＲＶＬＰ（レトロウイルス様粒子）の除去
生成物関連不純物（ＨＭＷ等）の除去に加えて、ＭＭクロマトグラフィー樹脂上の抗体の精製におけるアンチカオトロピック塩の使用がレトロウイルス様粒子（ＲＶＬＰ）の除去の効果も有するかどうかも調べた。

この点に関して、２つのＫｐスクリーンを実施した（実施例１１及び実施例１２）。

Ｋｐスクリーン：ＲＶＬＰ除去に対するアンチカオトロピック塩及びｍａｂ疎水性の影響
ＲＶＬＰ減少に対するアンチカオトロピック塩及び最大疎水性の影響を調べるために、Ｋｐ（分配係数）スクリーンを行った。（ＲＮＡ含有）ＲＶＬＰの濃度を、定量的ＲＴ ＰＣＲによるＲＮＡの濃度の定量によって測定した。これらのＫｐスクリーン内で、２組の緩衝液を比較した：アンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４（実施例１１）を含有する１つの緩衝液及びアンチカオトロピック塩を含まない１つの緩衝液（トリス／酢酸緩衝液のみ）（実施例１２）。更に、２つの親水性ｍａｂ（ｍａｂ１及びｍａｂ２）及び２つの疎水性ｍａｂ（ｍａｂ７及びｍａｂ９）の４つのｍａｂを選択した。クロマトグラフィー樹脂は、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓであった。

実施例１１については、調査したｐＨ範囲はｐＨ５．０～８．０であり、モル濃度範囲は２５～４００ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４（３～３４ｍＳ／ｃｍの導電率範囲に対応する）であった。親水性ｍａｂについて、疎水性ｍａｂと比較して改善されたＲＶＬＰ減少が示された（図４１及び図４２）。ｍａｂ２では、５ログステップのＲＶＬＰ除去が２００ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４（１７ｍＳ／ｃｍ）の塩モル濃度まで観察された。アンチカオトロピック塩を使用した親水性ｍａｂの改善されたＲＶＬＰ除去を強調するために、アンチカオトロピック塩を含まないトリス／酢酸塩緩衝液を更に調査した（実施例１２）。実施例１２については、調査したｐＨ範囲はｐＨ５．０～８．０であり、モル濃度範囲は２５～１１００ｍＭのトリス／酢酸塩（１～１９ｍＳ／ｃｍの導電率範囲に対応する）であった。アンチカオトロピック塩を欠くコンタープロットは、改善されたＲＶＬＰ減少を示さず、親水性ｍａｂについても疎水性ｍａｂについても示さなかった（図４３及び図４４）。

使用される用語の用語集：
参照／緩衝液のみ：いかなるアンチカオトロピック塩も含まないが、同じ導電率を有する
負荷：組成に依存せずに負荷される溶液
ＬＦ：ＲＣの負荷画分
総負荷体積：３５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_樹脂を適用するのに必要な体積
総負荷量：全ての適用されたそれぞれの負荷画分に適用された抗体の量の合計
負荷量：最良適合線によるＨＭＷ除去の計算に使用される
ＨＭＷ値：フロースルー画分中の分析的に決定されたＨＭＷ含有量
ＨＭＷ除去値：単一負荷画分について計算されたＨＭＷ除去
ＨＭＷ除去：最良適合線に基づく計算されたＨＭＷ除去
プールＨＭＷ除去値：単一画分に適用された総負荷量に対して得られた計算されたＨＭＷ除去
単一プール負荷量：それぞれの計算されたプールＨＭＷ除去値の単一画分に負荷された抗体の理論量
ＦＴ：フロースルー画分
ＲＣ：Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍ（商標）
ＲＣラン：Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍ（商標）ラン
ＣＶ：カラム容積

実施例
パートＩ：一定の導電率での高分子量（ＨＭＷ）不純物低減に対するｍａｂ疎水性の影響
実施例１
Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍｎ（商標）は、ｐＨ８及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷で実行する。
ｐＨ８及び２０ｍＳ／ｃｍの導電率で４つの親水性ｍａｂ及び３つの疎水性ｍａｂを用いてロボット操作を行った。ランからランまで、以下のアンチカオトロピック塩：塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、塩化カリウム及び硫酸カリウムを添加することによって緩衝液条件を変化させた。各ランについて、７つ全てのｍａｂを並行して調査した。

緩衝液
それぞれの平衡化緩衝液のｐＨ値及び導電率を以下の表Ｘ－１．１ａに要約する。緩衝液（酢酸）の各酸を添加してｐＨ値をそれぞれ調整した。導電率は、溶液の全ての成分を組み合わせた後に決定した。緩衝液１．５Ｍトリス／酢酸塩、ｐＨ８は、「参照」条件、すなわち、いかなるアンチカオトロピック塩も含まないが同じ導電率を有する（「緩衝液のみ」）。

（表Ｘ－１．１ａ）ＲＣランのための緩衝液条件は、ｐＨ８及び２０ｍＳ／ｃｍである。

出発物質の濃縮及び抗体溶液の緩衝液交換
抗体溶液（ｍａｂｓ）を、それぞれの緩衝液に匹敵するｐＨ及び導電率に調整した。これを達成するために、それぞれのアフィニティーカラム溶出プールをそれぞれの緩衝液（例えば７０ｍＭトリス／酢酸塩、１２５ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、ｐＨ８まで；表Ｘ－１．１ ａを参照）に緩衝液交換し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓを使用して濃縮した。遠心分離後、ｍａｂを約２０ｇ／Ｌの濃度に希釈し、ｐＨ及び導電率を決定した。負荷される溶液（「負荷」）を０．２μｍ滅菌フィルタでフィルタにかけ、タンパク質濃度を決定した。この手順を全てのＲｏｂｏｃｏｌｕｍｎ（商標）ラン（ＲＣラン）について行った。

負荷
負荷物のｐＨ値、導電率及び抗体濃度を以下の表Ｘ－１．１ｂに要約する。

（表Ｘ－１．１ｂ）負荷ｐＨ、導電率及びＲＣ－ランの濃度はｐＨ８及び２０ｍＳ／ｃｍである。範囲は、異なる抗体を含む負荷に基づく。

実施例１の全ての実験について、負荷物のｐＨ範囲はｐＨ８．０±０．２の範囲内であった。負荷の導電率は、平衡化緩衝液の導電率から±２．０ｍＳ／ｃｍ変化した。負荷物のタンパク質濃度は１４．５～２５．５ｇ／Ｌであった。

以下では、例示的なＲＣランの説明が提供される。負荷物を調製するための緩衝液が異なる（上記の表Ｘ－１．１ａ及びｂを参照）ことを除いて、全てのＲＣランを同様に行った。例えば、緩衝液（７０ｍＭトリス／酢酸塩、１２５ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、ｐＨ８）を使用する負荷の場合、ｐＨはｐＨ８．０４～８．０７の範囲であり、これは、平衡化緩衝液中の７つの異なるｍａｂの負荷が、緩衝液交換及び濃縮後にこのｐＨ範囲にあったことを意味する。

以下の表Ｘ－１．２は、７０ｍＭトリス／酢酸塩、１２５ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、ｐＨ８、フロースルーモードにおける種々の抗体についてのＲＣランのための個々の負荷の特性を示す：

（表Ｘ－１．２）実施例１－７０ ｍＭトリス／酢酸塩、１２５ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、ｐＨ ８中の負荷。

これらの負荷を、異なるＣａｐｔｏ ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＲＣに個別に適用した。

クロマトグラフィー
ＲＣランをＴｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ １５０で行った。ＲＣを最初に、抗体を含まない１０ＣＶの緩衝液（例えば、７０ｍＭトリス／酢酸塩、１２５ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、ｐＨ８）で平衡化した（ｐＨ及び伝導度の調整）。その後、各ＲＣを、２００μＬの負荷画分（ＬＦ）に３５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_樹脂まで段階的にロードし、フロースルーを２００μＬのフロースルー画分（ＦＴ画分）に収集した。３５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_樹脂を適用した後、抗体を含まない８カラム容量（ＣＶ）の緩衝液をカラムに適用して、再生前のカラムから残留未結合材料を洗浄した。負荷後の洗浄物は収集しなかった。

全てのＲＣランの流量は１８ＣＶ／時間であり、これは３．３分の滞留時間に相当する。洗浄後、ＲＣを再生及び保管した。

（表Ｘ－１．３）実施例１－例示的なクロマトグラフィー工程。

以下の表Ｘ－１．４は、負荷濃度及び体積を要約する。

（表Ｘ－１．４）実施例１－表Ｘ－１．３のスキームを使用したＲＣランで使用される負荷濃度及び体積。

Ｔｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ １５０による負荷画分のピペッティングは、一度のジョイントＲＣランの全ての荷重が同時に完了するモードで実行された。したがって、負荷を適用するための開始点は、負荷中の抗体濃度に応じて変化した。より高い濃度の負荷、例えばｍａｂ５は、必要な総負荷体積（及びそれによる負荷工程）をより低くし、負荷工程の後の開始をもたらした。各負荷工程について、それぞれのフロースルー画分（ＦＴ）を収集した。したがって、各ランについて、異なる数の２００μＬの画分をそれぞれ適用し、収集し、分析した（ｍａｂ８について最大２０の画分）。

以下の表Ｘ－１．５は、各負荷工程後の増加する総負荷量［ｇ／Ｌ］を示す。最大２０回の連続負荷ステップの後、３５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_樹脂の総負荷量を各ＲＣに適用した。

（表Ｘ－１．５ａ）実施例１－表Ｘ－１．３及びＸ－１．４のスキームを使用したランの総負荷量［ｇ／Ｌ］に応じた負荷工程。

分析

（表Ｘ－１．５ｂ）選択されたＦＴ画分のＳＥ－ＨＰＬＣ分析。

（表Ｘ－１．５ｃ）ＨＭＷ除去値。

ＨＭＷ除去値は、以下の式１を用いて計算した。
ＨＭＷ除去値（％）＝１００－ＨＭＷ_画分／ＨＭＷ_負荷×１００％（１）
ＨＭＷ_画分＝フロースルー（ＦＴ）画分で決定されたＨＭＷ値［％］、
ＨＭＷ_負荷＝それぞれの負荷［％］で決定されたＨＭＷ値［％］。

負荷工程１０におけるｍａｂ２のＨＭＷ除去値の計算の例：
負荷工程１０において、それぞれのＦＴ画分の決定されたＨＭＷ値は１．６６％であった。負荷のＨＭＷ値は９．９７％であった。これを式１に適用する
ＨＭＷ除去値＝１００－１．６６／９．９７×１００％＝８３．３５％
その結果、ｍａｂ２の負荷画分１０について８３．３５％のＨＭＷ除去値が得られた。

分析
ＨＭＷ値又はメインピーク値又はＨＭＷ除去値のいずれかを抗体の総負荷量に対してプロットした。

図１～図７は、ｐＨ８．０及び２０ｍＳ／ｃｍの導電率で異なるアンチカオトロピック塩を用いた調査したｍａｂのＦＴ画分について決定されたＨＭＷ除去値を示す。ｘ軸は総負荷量に対応し、ｙ軸はそれぞれのＦＴ画分について決定されるＨＭＷ除去値に対応する。

表Ｘ－１．５ｃのＨＭＶ除去値は、それぞれの負荷工程で得られた実際のＨＭＷ除去、すなわち対応する負荷画分を示す。しかしながら、プールＨＭＷ除去値は、実際の大規模プロセスをより厳密に反映する。このプールＨＭＷ除去値は、単一画分で適用された場合の総負荷量に対して得られたＨＭＷ除去である。プールＨＭＷ除去値を、表Ｘ－１．５ｃのデータの対数最良適合線に基づいて、１５０ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、３５０ｇ／Ｌ、４５０ｇ／Ｌ及び５５０ｇ／Ｌの単一のプール負荷量について計算した。

この手順を、ｍａｂ２について以下に例示的に説明する。

図２は、ｍａｂ２に対する各ＦＴ画分のＨＭＷ除去値を示す。表Ｘ－１．１の異なる緩衝液について得られた結果をこのグラフに表示する。ｍａｂ２の単一のプール負荷量についてのプールＨＭＷ除去値を計算するために、最初に、各緩衝液のＨＭＷ除去についての対数最良適合線を決定した。ｍａｂ２に対するこれらの最良適合傾向線の追加を図８Ａに示す。第２に、２つの最良適合傾向線の等式を用いて、ＨＭＷ除去を、２５～５５０ｇ／Ｌの範囲内の５ｇ／Ｌ及び２５ｇ／Ｌ増分の負荷量について計算した。

例えば、単一のプール負荷量、例えば１５０ｇ／ＬのプールＨＭＷ除去値を計算するために、平均は、計算された各ＨＭＷ除去値≦１５０ｇ／ＬのＨＭＷ除去に基づいて計算された。少ない負荷量（５～５０ｇ／Ｌ）では、計算の結果、非論理的ＨＭＷ除去が１００％超となったため、ＨＭＷ除去を１００％に設定した。表Ｘ－１．６は、計算されたＨＭＷ除去を示す。

（表Ｘ－１．６）実施例１－ＨＭＷ除去値及びプールＨＭＷ除去値の計算。

更に、これらの計算を１つの疎水性ｍａｂ（ｍａｂ７）について行った。図８Ｂは、ｍａｂ７のそれぞれの最良適合線及び等式を示す。

図９Ａ＋Ｂでは、単一プール負荷量のＨＭＷ除去をｍａｂ２（図９Ａ）及びｍａｂ７（図９Ｂ）について示す。

実施例１の概要：
親水性ｍａｂ（ｍａｂ１、ｍａｂ２、ｍａｂ４、ｍａｂ５）では、同じ導電率でアンチカオトロピック塩を含まない負荷物と比較して、アンチカオトロピック塩を負荷物に添加した場合、ＨＭＷ値がより良好に低下した。これを図１～図４に示す。負荷の導電率は同等であった（全て約２０ｍＳ／ｃｍ）。負荷中にアンチカオトロピック塩が存在すると、負荷伝導率は変化しなかったが、親水性ｍａｂのＨＭＷ減少が増強された。

これとは対照的に、疎水性ｍａｂ（ｍａｂ６、ｍａｂ７、ｍａｂ８）については、ＨＭＷ値の低下は、アンチカオトロピック塩を含有する負荷についても、アンチカオトロピック塩を含まない負荷についても同様であった（図５～図７を参照）。疎水性ｍａｂについては、アンチカオトロピック塩の添加は、アンチカオトロピック塩を含まない負荷と比較してＨＭＷ値の低下に関して有利な効果を示さなかった。

ＦＴプールのＨＭＷ除去を計算するために、傾向線を導入した。図８Ａ＋Ｂでは、ＦＴプールのＨＭＷ除去をｍａｂ２（図８Ａ）及びｍａｂ７（図８Ｂ）について示す。例えば、ｍａｂ２では、負荷量１５０ｇ／ＬでのＨＭＷ減少は、硫酸アンモニウムが負荷に存在する場合に３５％から８９％に増加したことが分かる（図９Ａを参照）。５５０ｇ／Ｌの負荷量では、ＨＭＷ減少は、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の存在下で１７％から４７％に増加した。これとは対照的に、驚くべきことに、アンチカオトロピック塩の存在下並びに非存在下におけるｍａｂ７のＨＭＷ減少は類似していた。したがって、疎水性ｍａｂ７について、ＨＭＷ減少は、アンチカオトロピック塩の添加によって改善されなかった（図９Ｂを参照）。

実施例２
Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍｎ（商標）は、ｐＨ６及び２０ｍＳ／ｃｍの負荷で実行する。
ＲＣランは、２つのアンチカオトロピック塩、すなわちＮａ_２ＳＯ_４及びＫＣｌの非存在下並びに存在下でトリス／クエン酸緩衝液を使用してｐＨ６及び導電率２０ｍＳ／ｃｍで７ｍａｂｓで実施した。それぞれの参照は、アンチカオトロピック塩の非存在下で同じ導電率を有する１．０Ｍトリス／クエン酸塩、ｐＨ６中の負荷であった。

図１０～図１６は、ｐＨ６．０及び２０ｍＳ／ｃｍの導電率でＮａ_２ＳＯ_４及びＫＣｌを含有する負荷に対する各ＦＴ画分のＨＭＷ除去値を示す。ｘ軸には総負荷量が表示される。

実施例２の概要：
親水性ｍａｂｓについて、同じ導電率でアンチカオトロピック塩を含まない同じ緩衝液中の負荷と比較して、アンチカオトロピック塩を負荷に添加した場合、ＨＭＷ減少は有意に改善された（図１０～図１３を参照）。これとは対照的に、驚くべきことに、疎水性ｍａｂｓでは、アンチカオトロピック塩を含有する負荷及びアンチカオトロピック塩を含まない負荷のＨＭＷ減少は同程度であった（図１４～図１６を参照）。

実施例３
Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍｎ（商標）は、ｐＨ６又は８及び１０ｍＳ／ｃｍの負荷で実行する。
ＲＣランは、緩衝液中のアンチカオトロピック塩の存在下及び非存在下（すなわち、アンチカオトロピック塩なし）で、１つの親水性ｍａｂ及び１つの疎水性ｍａｂを用いて行った。両方の場合において、負荷の導電率は同一であった（１０ｍＳ／ｃｍ）。これらの実験を、ｐＨ６及びｐＨ８で実施した。最大３５０ｇ_{タンパク質}／Ｌ_樹脂をＲＣに負荷した。５つのアンチカオトロピック塩の効果を分析した。４００ｍＭのトリス／酢酸塩（ｐＨ８）を含む負荷量及び３００ｍＭのトリス／クエン酸塩（ｐＨ６）を含むがアンチカオトロピック塩を含まない負荷量を用いたランが、それぞれ参照である。

図１７Ａ及び図１７Ｂは、親水性ｍａｂ２（図１７Ａ）及び疎水性ｍａｂ７（図１７Ｂ）について、ｐＨ６及び導電率１０ｍＳ／ｃｍでのＦＴ画分のＨＭＷ除去値を示す。図１８は、ｐＨ８及び１０ｍＳ／ｃｍの導電率でのＦＴ画分のＨＭＷ除去値を示す。図１８Ａは親水性ｍａｂ２についての結果を示し、図１８Ｂは疎水性ｍａｂ７についての結果を示す。

実施例３の概要：
図１７及び図１８は、それぞれｐＨ６及びｐＨ８で１０ｍＳ／ｃｍの導電率でのｍａｂ２及びｍａｂ７の総負荷量に応じた各ＦＴ画分のＨＭＷ除去値を示す。アンチカオトロピック塩の存在下で、親水性ｍａｂを含む負荷のＨＭＷ減少は、アンチカオトロピック塩を含まない参照ランと比較してＦＴ画分で増加することが分かる。疎水性ｍａｂについては、アンチカオトロピック塩の存在下でＨＭＷ減少の増加は観察されなかった。

パートＩＩ：ＨＭＷ減少に対するアンチカオトロピック塩モル濃度の影響
実施例４
Ｒｏｂｏｃｏｌｕｍｎ（商標）は、ｐＨ８のｍａｂ２で実行する。
０～５００ｍＭの範囲のアンチカオトロピック塩濃度を有するｐＨ８でのｍａｂ２含有負荷によるＲＣランを実施した。使用したＲＣランの手順は、実施例１で既に詳細に概説されている。以下の塩を使用した：Ｎａ_２ＳＯ_４、ＮａＣｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、Ｋ_２ＳＯ_４。フロースルー（ＦＴ）画分を収集し、分析した。

図１９～図２３は、異なるアンチカオトロピック塩についてのｐＨ８でのｍａｂ２についてのＦＴ画分のＨＭＷ値を示す。

実施例４の概要：
実施例４では、親水性ｍａｂ２を有するｐＨ８での５つのアンチカオトロピック塩について、アンチカオトロピック塩モル濃度（及び導電率）の増加の影響を調査した。以下のアンチカオトロピック塩を使用した：硫酸ナトリウム（図１９を参照）、塩化ナトリウム（図２０を参照）、硫酸アンモニウム（図２１を参照）、塩化カリウム（図２２を参照）及び硫酸カリウム（図２３を参照）。各ＦＴ画分のＨＭＷ値［％］を総負荷量に対してプロットした。親水性ｍａｂを含む負荷物にアンチカオトロピック塩を添加することによって、ＦＴ画分中のＨＭＷ値の減少が達成された。調査した全てのアンチカオトロピック塩について、ＨＭＷ減少の増加が見られた。

塩モル濃度を増加させる効果は、Ｋｐスクリーンを使用して、３つのｍａｂ（親水性及び疎水性）及び４つの塩（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ＫＣｌ、Ｇｕａ／ＨＣｌ及び尿素についても見られた（実施例５を参照）。

実施例５
Ｋｐスクリーン（ｐＨ ５．５～８．０）
Ｋｐスクリーンの方法論は、この例で詳細に説明される。

ｍａｂ溶液の調製
抗体含有溶液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓで濃縮し、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅを用いて緩衝液を１０ｍＭ トリス／酢酸塩、ｐＨ６．５に交換した。タンパク質濃度は６７ｇ／Ｌ～８９ｇ／Ｌの範囲であった。Ｋｐスクリーンの総負荷量は１５０ｇ／Ｌであった。負荷物を０．２μｍのフィルタにかけ、タンパク質含有量を決定した（ＯＤ２８０～３２０）。

フィルタプレートの作製
水中のＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ樹脂の５０％スラリーを、遠心分離機を使用して迅速な沈降のためにチューブ内で製造した。次いで、樹脂をＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲｌｅｔロボットに置いたシェーカーに移した。フィルタプレートのウェルごとに、５０μＬの樹脂Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを添加した。

緩衝液の調製
緩衝液プレート及び負荷プレートの調製のために、以下の材料を使用した：
－ 高塩緩衝液；
－ 低塩緩衝液；
－ １０ｍＭトリス／酢酸塩、ｐＨ６．５（０．６ｍＳ／ｃｍ）；
－ 適切な濃度の１０ｍＭトリス／酢酸塩、ｐＨ６．５中のタンパク質原液；
－ ストリップ緩衝液。

Ｋｐスクリーンのため、高塩緩衝液並びに低塩緩衝液を使用して、ロボットシステム（Ｔｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ ２００）によって緩衝液プレート及び負荷プレートを製造した。高塩原液及び低塩原液は、トリス及び必要量の塩を秤量することによって調製した。次いで、ｐＨを酢酸で調整した。

表Ｘ－２．１及びＸ－２．２は、平衡化プレート及び負荷プレートを調製するために使用した低塩緩衝液及び高塩緩衝液を要約する。

（表Ｘ－２．１）実施例５－Ｋｐスクリーン用低塩緩衝液

（表Ｘ－２．２）実施例５－Ｋｐスクリーン用高塩緩衝液

負荷プレート及び平衡化プレートを、表Ｘ－２．３に示すようにロボットによってピペッティングした。４つの塩のモル濃度は、１０ｍＭから約８００ｍＭまでの範囲であった。

（表Ｘ－２．３）実施例５－ＫｐＳｃｒｅｅｎのプレートレイアウト

濃縮タンパク質原液を、ロボットによって負荷プレートにピペッティングした。各ウェル条件のｐＨ及び導電率のシフトを無視するために、タンパク質原液は、１０ｍＭトリス／酢酸塩、ｐＨ６．５で、ピペッティング体積を最小化するために高タンパク質濃度で利用可能であった。

Ｋｐスクリーンの実行
Ｋｐスクリーンの総負荷量を１５０ｇ／Ｌに設定し、各７５ｇ／Ｌの２つのローディング工程に分割した。
Ｋｐスクリーン方法は以下の工程からなった：
－ 保管緩衝液の除去；
－ 平衡化１＋２：３００μＬの平衡化緩衝液の移動、シェーカー（１１００ｒｐｍ）での５分間のインキュベーション、及び平衡化緩衝液を除去するための遠心分離（２，５００ｒｐｍ、６００秒）；
－ ローディング１＋２：３００μＬの負荷物を移し、シェーカー上で６０分間インキュベートし（１１００ｒｐｍ）、遠心分離してＦＴプレート上にＦＴ（２，５００ｒｐｍ、６００秒）を収集する。
－ ストリップ１＋２：３００μＬのストリップ緩衝液を移し、シェーカー（１１００ｒｐｍ）上で５分間インキュベートし、遠心分離してストリップ緩衝液を除去する（２，５００ｒｐｍ、６００秒）。

ＦＴプレートのＳＥ－ＨＰＬＣ分析を行った。

ＨＭＷ除去を以下のように計算した：
ＨＭＷ除去（％）＝１００－ＨＭＷ_ウェル／ＨＭＷ_負荷物×１００％

ＨＭＷ_ウェルは、ＦＴプレートのウェルで測定されたＨＭＷ値［％］であり、ＨＭＷ_負荷物は、タンパク質原液のＨＭＷレベル［％］である。

負荷プレート及びＦＴプレートのタンパク質濃度を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００プレートリーダを使用して決定した。

図２４～図２７は、３つのｍａｂ及び２つのアンチカオトロピック塩、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４及びＫＣｌ、並びに２つのカオトロピック塩、Ｇｕａ／ＨＣｌ及び尿素についてのＦＴ試料のＨＭＷ除去値［％］を示す。図２４Ａ、図２５Ａ、図２６Ａ及び図２７Ａは、親水性ｍａｂ２のＨＭＷ除去値を示し、図２４Ｂ、図２５Ｂ、図２６Ｂ及び図２７Ｂは、親水性ｍａｂ４のＨＭＷ除去値を示す。疎水性ｍａｂ６のＨＭＷ除去値を図２４Ｃ、図２５Ｃ、図２６Ｃ及び図２７Ｃに示す。

ＨＭＷ減少に対する（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４の効果を図２４に示し、ＫＣｌの効果を図２５に示す。ＨＭＷ減少に対する二つのカオトロピック塩の効果を図２６（Ｇｕａ／ＨＣｌ）及び図２７（尿素）に示す。

実施例５の概要：
ｐＨ５．５～８．０のｐＨ範囲及び８００ｍＭまでの塩モル濃度において、２つの親水性ｍａｂ及び１つの疎水性ｍａｂを有する４つの塩（２つのアンチカオトロピック塩及び２つのカオトロピック塩）による効果が示された。カオトロピック塩（Ｇｕａ／ＨＣｌ及び尿素）を選択して、疎水性相互作用が弱まった場合のＨＭＷ減少を決定した。

ｍａｂの疎水性に応じて、ＨＭＷ減少の差が観察された。親水性ｍａｂ（ｍａｂ２及びｍａｂ４）の場合、アンチカオトロピック塩（硫酸アンモニウム、図２４、及びＫＣｌ、図２５）の添加は、ＨＭＷ減少を７０～８０％まで増加させた。疎水性ｍａｂ６について、硫酸アンモニウムの存在下でのＨＭＷ減少は７０～８０％の範囲であり、硫酸アンモニウムのモル濃度によってほとんど影響を受けなかった。ＫＣｌでは、疎水性ｍａｂ６のＨＭＷ減少は、ＫＣｌモル濃度の増加と共に減少した。図２４Ｃ及び図２５Ｃは、疎水性ｍａｂ６について、アンチカオトロピック塩のモル濃度を増加させることによってＨＭＷ減少が改善されなかったことを示した。

Ｇｕａ／ＨＣｌ（図２６）及び尿素（図２７）は、親水性又は疎水性の両方のｍａｂについて塩モル濃度を増加させてもＨＭＷ除去の改善が観察されないことを示した。

要約すると、アンチカオトロピック塩の存在下で親水性ｍａｂのＨＭＷ減少が改善された。疎水性ｍａｂについては、アンチカオトロピック塩の存在下で改善されたＨＭＷ減少は見られなかった。更に、カオトロピック塩の存在下では、改善されたＨＭＷ減少は得られなかった。

実施例６
ｍａｂ２（ｐＨ４～９）を用いたＫｐスクリーン
１つの親水性ｍａｂ（ｍａｂ２）及び２つの緩衝系ｉ）（１０～８５０）ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４を含む２５ｍＭトリス／酢酸塩及びｉｉ）（２５～９７５）ｍＭトリス／酢酸塩を用いたＫｐスクリーンのために、以下の原液を調製した（表Ｘ－２．４を参照）：

（表Ｘ－２．４）実施例６－Ｋｐスクリーン用の低塩緩衝液及び高塩緩衝液

総負荷量は１５０ｇ／Ｌであり、２つの負荷工程に分割した。

緩衝液条件：２つの緩衝系を表Ｘ－２．５に示すように調査した：
－ ２５ｍＭトリス／酢酸塩＋（１０～８５０）ｍＭＮａ_２ＳＯ_４（ｐＨ４．０～９．０）；Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度：１０、７５、１５０、２２５、３００、４５０、６５０、８５０ｍＭ
－ ２５～９７５ｍＭトリス／酢酸塩（ｐＨ４．０～９．０）；トリスモル濃度：２５、１００、１７５、２５０、３５０、５００、７５０、９７５ｍＭ

（表Ｘ－２．５）実施例６－プレートレイアウトＫｐスクリーン

図２８は、Ｎａ_２ＳＯ_４（図２８Ａ）及びトリス／酢酸塩（図２８Ｂ）の存在下でのｍａｂ２についてのフロースルーのコンタープロットを示す。

実施例６の概要：
実施例６は、アンチカオトロピック塩の存在下で、ｍａｂ２含有負荷のＨＭＷ減少が増加することを示す。Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度の増加（図２８Ａを参照）は、最大８０％の改善されたＨＭＷ減少をもたらした。Ｎａ_２ＳＯ_４を含むｍａｂ２のコンタープロットは、硫酸アンモニウムを含むものと同様であった（図２４Ａを参照）。それとは対照的に、トリス／酢酸塩モル濃度の増加（図２８Ｂを参照）はＨＭＷ減少に有意な影響を及ぼさなかった。トリス／酢酸塩の場合、ＨＭＷ減少はｐＨの変化に対してより応答性であった。アンチカオトロピック塩を添加しないと、モル濃度の増加に伴うＨＭＷ減少の改善は観察されなかった。

パートＩＩＩ：ＨＭＷ除去と他の樹脂／クロマトグラフィー材料との比較
実施例７
混合モードＡＥＸ樹脂を含むＫｐスクリーン
親水性ｍａｂ（ｍａｂ２）及び以下の混合モードＡＥＸ樹脂を含む負荷のＨＭＷ減少を決定した：Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ 及びＮｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅ ４Ａ。これら３つの樹脂は、アニオン性部分及び疎水性部分を示す。

実施例５に対応してＫｐスクリーンを実行した。

図２９～図３２は、３つの混合モード樹脂及び４つの塩（２つのアンチカオトロピック、２つのカオトロピック）についてのコンタープロットを示す。

実施例７の概要：
この実施例では、アニオン交換及び疎水性相互作用を有する３つの混合モード樹脂のＨＭＷ減少を比較した。Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓフロースルーコンタープロット（図２９Ａ、図３０Ａ、図３１Ａ及び図３２Ａ）、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅフロースルーコンタープロット（図２９Ｂ、図３０Ｂ、図３１Ｂ及び図３２Ｂ）及びＮｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅフロースルーコンタープロット（図２９Ｃ、３０Ｃ、３１Ｃ及び３２Ｃ）を生成した。２つのアンチカオトロピック塩、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（図２９）及びＫＣｌ（図３０）、並びに２つのカオトロピック塩、Ｇｕａ／ＨＣｌ（図３１）及び尿素（図３２）を調査した。

一般に、全ての塩について、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ、Ｎｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅ及びＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓのコンタープロットは同等の効果を示した。（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４及びＫＣｌのモル濃度が増加するにつれて、３つの混合モード樹脂は全て、改善されたＨＭＷ減少を示した。Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ、Ｎｕｖｉａ ａＰｒｉｍｅ及びＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓコンタープロットは、良好な比較可能性を示した。カオトロピック塩については、３つの樹脂で改善されたＨＭＷ減少は観察されなかった。

実施例８
ＭＭＡＥＸ、ＡＥＸ、ＨＩＣ、ＭＭＣＥＸ樹脂を用いたＫｐスクリーン
１つの親水性ｍａｂ及び１つの疎水性ｍａｂのコンタープロットは、以下の樹脂を用いて決定した：
－ 混合モードアニオン交換樹脂（Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ）（ＭＭＡＥＸ）；
－ アニオン交換樹脂（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ）（ＡＥＸ）；
－ 疎水性樹脂（フェニルセファロース６ ＦＦ（高ｓｕｂ））（ＨＩＣ）；
－ 混合モードカチオン交換樹脂（Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ）（ＭＭＣＥＸ）。

樹脂の総負荷量は、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓを除いて１５０ｇ／Ｌであり、総負荷量は７５ｇ／Ｌであった。

実施例５に対応してＫｐスクリーンを実行した。

Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ（高ｓｕｂ）及びＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓのＫｐスクリーンには、Ｎａ_２ＳＯ_４緩衝系を使用した：２５ｍＭトリス／酢酸塩＋（５～８５０）ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４。以下の原液を調製した（Ｘ－３．１を参照）：

（表Ｘ－３．１）実施例８－低塩緩衝液及び高塩緩衝液

表Ｘ－３．２に示すように、以下のＮａ_２ＳＯ_４含有緩衝液を調査した：
－２５ｍＭトリス／酢酸塩＋（５～８５０）ｍＭＮａ_２ＳＯ_４（ｐＨ４．０～９．０）；Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度：１０、７５、１５０、２２５、３００、４５０、６５０、８５０ｍＭ

（表Ｘ－３．２）実施例８－Ｋｐスクリーンのプレートレイアウト

図３３～図３６は、４つの樹脂の親水性ｍａｂ２（図「Ａ」）及び疎水性ｍａｂ６（図「Ｂ」）のコンタープロットを示す。図３３及び図３６は、混合モード樹脂Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ（図３３）及びＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ（図３６）のＨＭＷ減少を示す。図３４及び図３５は、アニオン交換樹脂であるシングルモード樹脂Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＦＦ（図３４）及び疎水性樹脂であるＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＦＦ（高ｓｕｂ）（図３５）のＨＭＷ減少を示す。

実施例８の概要：
１つの親水性ｍａｂ（ｍａｂ２）及び１つの疎水性ｍａｂ（ｍａｂ６）を用いて、以下の樹脂：混合モードアニオン交換樹脂（Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ）、アニオン交換樹脂（Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ）、疎水性樹脂（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ ＦＦ）及び混合モードカチオン交換樹脂（Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ）のフロースルーにおけるＨＭＷ減少を決定した。

ＡＥＸ樹脂Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦについては、両方のｍａｂについてＨＭＷ減少に関するアンチカオトロピック塩の効果は観察されなかった（図３４）。図３５に、樹脂フェニルセファロース６ＦＦ（高ｓｕｂ）のコンタープロットを示す。親水性ｍａｂ及び疎水性ｍａｂの両方が、Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度の増加に伴って改善されたＨＭＷ減少を示した。シングルモード樹脂Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ及びＰｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ＦＦ（高ｓｕｂ）に関して、親水性及び疎水性ｍａｂのＨＭＷ減少は同等であった。

これとは対照的に、混合モードの樹脂では、親水性及び疎水性ｍａｂのＨＭＷ減少は異なっていた。ＭＭＡＥＸ樹脂は、アンチカオトロピック塩の存在下でｍａｂ２の改善されたＨＭＷ減少を示した（図３３Ａ）。ｍａｂ６について、ＨＭＷ減少は、調査したｐＨ及びモル濃度範囲にわたって極めて一定であった（図３３Ｂ）。親水性ｍａｂについてのみ、ＨＭＷ減少は、混合モードアニオン交換樹脂上の塩モル濃度に応じて増加した。図３６は、Ｃａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ樹脂で得られたＨＭＷ減少を示す。親水性ｍａｂについて、ＨＭＷ減少は、Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度が２０％から８０％までの０～８００ｍＭの範囲で増加するにつれて増加した。これとは対照的に、疎水性ｍａｂのＨＭＷ減少は、塩モル濃度を５００ｍＭまで増加させることによってほとんど影響を受けなかった。ｍａｂ６については、ＦＴ試料の改善されたＨＭＷ減少が観察されたが、５００ｍＭ以上のモル濃度についてのみであった。５００ｍＭ未満では、ＨＭＷ減少は少なく（１０％未満）、塩モル濃度とはほとんど無関係であった。

アンチカオトロピック塩の添加による親水性ｍａｂのＨＭＷ減少の増加は、イオン性相互作用と疎水性相互作用の組み合わせに起因し得ることが示されている。イオン性混合モード樹脂、Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ（アニオン性部分及び疎水性部分を有する）及びＣａｐｔｏ（商標）ＭＭＣ ＩｍｐＲｅｓ（カチオン性部分及び疎水性部分を有する）の両方について、塩モル濃度の増加と共にＨＭＷ減少の増加が達成されたが、親水性ｍａｂについてのみであった。

パートＩＶ：ＡＫＴＡカラムのラン
実施例９
同じ導電率及び異なるＮａ_２ＳＯ_４モル濃度でのラン
２つの負荷物を、同じ導電率であるが異なるモル濃度のＮａ_２ＳＯ_４で調製した。

負荷１及び負荷２は、ｍａｂ２の同じアフィニティークロマトグラフィープール（カラム１プール）を用いて調製した。

負荷１：ｍａｂ２の１カラムプールを１．５Ｍトリス塩基でｐＨ８．０に調整し、深層濾過にかけ、次いで１Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４溶液を用いて導電率を９ｍＳ／ｃｍに調整した。次いで、負荷をＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓカラムに加えた。負荷物１の導電率は９ｍＳ／ｃｍであり、Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度は３９ｍＭであった。

負荷２：ｍａｂ２のカラム１プールを１．５Ｍトリス－塩基でｐＨ８．０に調整し、深層濾過にかけ、次いで酢酸でｐＨをｐＨ５．６に調整し、続いて１．５ＭトリスでｐＨ ８．０に再調整した。その後、１Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４溶液を用いて導電率を９ｍＳ／ｃｍに調整し、溶液をカラムに適用した。負荷２の導電率は９ｍＳ／ｃｍであり、Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度は１９ｍＭであった。

表Ｘ－４．１は、負荷調整を要約する。

（表Ｘ－４．１）実施例９－負荷調整

実施例９で使用した緩衝液を表Ｘ－４．２に列挙する。

（表Ｘ－４．２）実施例９－緩衝液

Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓカラムのカラム体積は６．８４ｍＬであり、カラム直径は０．６６ｃｍであった。７０ｍＭトリス／酢酸塩、４０ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４、ｐＨ８でカラムを平衡化した後、負荷をカラムに適用した。負荷容量は約１５０ｇ／ｌであり、流量は１５０ｃｍ／時であった。Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ ＦＴを分画した。画分のタンパク質濃度を測定し、ＳＥ－ＨＰＬＣを行った。

図３７は、９ｍＳ／ｃｍの導電率についてのＦＴ画分のメインピーク値に対するＮａ_２ＳＯ_４モル濃度の影響を示す。

実施例９の概要：
９ｍＳ／ｃｍの同じ導電率であるが、異なるモル濃度のＮａ_２ＳＯ_４（約４０ｍＭ及び約２０ｍＭ）を用いて、２つの負荷量のｍａｂ２を調製した。より高いＮａ_２ＳＯ_４モル濃度を有する負荷物のＦＴ画分は、より低いＮａ_２ＳＯ_４モル濃度を有する負荷物と比較してより高いメインピーク値を有した（図３７を参照）。これは、負荷伝導率が等しいため、Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度が高いほどＨＭＷ除去が向上したことを示している。

実施例１０
異なるＮａ_２ＳＯ_４モル濃度及び導電率でのラン

塩モル濃度（及び導電率）の増加の影響をｍａｂ２を用いて決定した。Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓカラム（カラム体積＝６．８４ｍＬ；ｄ＝０．６６ｃｍ）で、異なるＮａ_２ＳＯ_４モル濃度及び導電率で、ｐＨ７及びｐＨ８でカラムランを行った。ＦＴを分画し、負荷容量は約１５０ｇ／Ｌであった。

クロマトグラフィー条件を表Ｘ－４．３に示す。

（表Ｘ－４．３）実施例１０－クロマトグラフィー工程

（表Ｘ－４．４）実施例１０－緩衝液

１．５Ｍトリス及び１Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４（表Ｘ－４．５を参照）で調整した後、以下の負荷を得た：

（表Ｘ－４．５）実施例１０－負荷条件

図３８は、ｐＨ８で総負荷量が進行する各画分のメインピーク値を示す。Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度を０ｍＭから６０ｍＭに増加させると、ＦＴ画分のメインピーク値が改善された。

図３９は、ｐＨ７で総負荷量が進行する各画分のメインピーク値を示す。ｐＨ ７での曲線は、Ｎａ_２ＳＯ_４モル濃度の３４ｍＭ（９ｍＳ／ｃｍ）から５５ｍＭ（１２ｍＳ／ｃｍ）へのわずかな増加でさえも、ＦＴ画分のメインピーク値に対してプラスの効果を有したことを示している。Ｋｐスクリーン及びＲＣデータに対応して、ｐＨ７のＦＴ画分のメインピーク値はｐＨ８と比較して低かった。

プールを以下の方法で計算した：
プールのメインピーク値は、画分の平均メインピーク値を使用して計算した。洗浄画分（負荷工程後）はＦＴプールに含まれなかった。表Ｘ－４．６は、ラン条件及びメインピーク値を要約する。

（表Ｘ－４．６）実施例１０－ＦＴプールのラン条件及びメインピーク値

図４０は、ＦＴプールの計算されたメインピークを示す。メインピーク値は、６０ｍＭのＮａ_２ＳＯ_４を負荷物に添加することによって約９７％（Ｎａ_２ＳＯ_４を含まない）から約９９％に増加した。

実施例１０の概要：
ｐＨ７及びｐＨ８のＨＭＷ除去に対するＮａ_２ＳＯ_４モル濃度の効果が示されている。これらのデータは、ロボットシステムで得られたデータを裏付ける。ＦＴ画分のメインピーク値は、ｐＨ７（図３９を参照）及びｐＨ８（図３８を参照）でＮａ_２ＳＯ_４モル濃度の増加と共に上昇した。ＦＴプールを、ｐＨ８での画分の平均メインピーク値を用いて計算した（図４０を参照）。ｐＨ８では、６０ｍＭのＮａ_２ＳＯ_４を含有する負荷（導電率１２ｍＳ／ｃｍ）により、メインピーク値を、９６．９６％（Ｎａ_２ＳＯ_４を含まない；導電率５ｍＳ／ｃｍ）から９９．０９％まで増加させた。

実施例１１及び実施例１２
Ｋｐスクリーン：ＲＶＬＰ除去に対するアンチカオトロピック塩及びｍａｂ疎水性の影響
Ｋｐスクリーン（ｐＨ５．０～８．０）
ＲＶＬＰ除去に関連するＫｐスクリーンの方法論は、この例で詳細に説明される。

ｍａｂ溶液の調製
抗体含有溶液（列２のプール）をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓで濃縮し、緩衝液を１０ｍＭトリス／酢酸塩、ｐＨ６．５に交換し、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒｓで濃縮した。タンパク質濃度は６１ｇ／Ｌ～７２ｇ／Ｌの範囲であった。Ｋｐスクリーンの総負荷量は１５０ｇ／Ｌであった。負荷物を０．２μｍのフィルタにかけ、タンパク質含有量を決定した（ＯＤ２８０～３２０）。

フィルタプレートの作製
水中のＣａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓ樹脂の５０％スラリーを、遠心分離機を使用して迅速な沈降のためにチューブ内で製造した。次いで、樹脂をＨａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲｌｅｔロボットに置いたシェーカーに移した。フィルタプレートのウェルごとに、５０μＬの樹脂Ｃａｐｔｏ（商標）ａｄｈｅｒｅ ＩｍｐＲｅｓを添加した。

緩衝液の調製
緩衝液プレート及び負荷プレートの調製のために、以下の材料を使用した：
－ 高塩緩衝液；
－ 低塩緩衝液；
－ １０ｍＭトリス／酢酸塩、ｐＨ６．５（０．６ｍＳ／ｃｍ）；
－ 適切な濃度の１０ｍＭトリス／酢酸塩、ｐＨ６．５中のタンパク質原液；
－ ストリップ緩衝液。

Ｋｐスクリーンのため、高塩緩衝液並びに低塩緩衝液を使用して、ロボットシステム（Ｔｅｃａｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ ＥＶＯ ２００）によって緩衝液プレート及び負荷プレートを製造した。高塩原液及び低塩原液は、トリス及び必要量の塩を秤量することによって調製した。次いで、ｐＨを酢酸で調整した。

表Ｘ－５．１及びＸ－５．２に、実施例１１の平衡化プレート及び負荷プレートを調製するために使用した低塩緩衝液及び高塩緩衝液を要約する。

（表Ｘ－５．１）実施例１１－Ｋｐスクリーン用低塩緩衝液

（表Ｘ－５．２）実施例１１－Ｋｐスクリーン用高塩緩衝液

表Ｘ－５．３及びＸ－５．４に、実施例１２の平衡化プレート及び負荷プレートを調製するために使用した低塩緩衝液及び高塩緩衝液を要約する。

（表Ｘ－５．３）実施例１２－Ｋｐスクリーン用低塩緩衝液

（表Ｘ－５．４）実施例１２－Ｋｐスクリーン用高塩緩衝液

高塩緩衝液及び低塩緩衝液をピペッティングする前に、１０μｌのＲＶＬＰ原液を実施例１１及び１２のロボットによって負荷プレートの各ウェルにピペッティングした。負荷プレート及び平衡化プレートを、表Ｘ－５．５に示すようにロボットによってピペッティングした。実施例１１では、硫酸ナトリウムのモル濃度は、２５ｍＭ～４００ｍＭまでの範囲であった。

（表Ｘ－５．５）実施例１１－ＫｐＳｃｒｅｅｎのプレートレイアウト

実施例１２では、負荷プレート及び平衡化プレートを表Ｘ－５．６に示すようにロボットによってピペッティングした。例えば、実施例１２では、トリスのモル濃度は、２５ｍＭから１１００ｍＭまでの範囲であった。

（表Ｘ－５．６）実施例１２－ＫｐＳｃｒｅｅｎのプレートレイアウト

実施例１１及び１２では、濃縮タンパク質原液をロボットによって負荷プレートにピペッティングした。各ウェル条件のｐＨ及び導電率のシフトを無視するために、タンパク質原液は、１０ｍＭトリス／酢酸塩、ｐＨ６．５で、ピペッティング体積を最小化するために高タンパク質濃度で利用可能であった。

Ｋｐスクリーンの実行
Ｋｐスクリーンの総負荷量を１５０ｇ／Ｌに設定し、各７５ｇ／Ｌの２つのローディング工程に分割した。

Ｋｐスクリーン方法は以下の工程からなった：
－ 保管緩衝液の除去；
－ 平衡化１＋２：３００μＬの平衡化緩衝液の移動、シェーカー（１１００ｒｐｍ）での５分間のインキュベーション、及び平衡化緩衝液を除去するための遠心分離（２，５００ｒｐｍ、６００秒）；
－ ローディング１＋２：３００μＬの負荷物を移し、シェーカー上で６０分間インキュベートし（１１００ｒｐｍ）、遠心分離してＦＴプレート上にＦＴ（２，５００ｒｐｍ、６００秒）を収集する。
－ ストリップ１＋２：３００μＬのストリップ緩衝液を移し、シェーカー（１１００ｒｐｍ）上で５分間インキュベートし、遠心分離してストリップ緩衝液を除去する（２，５００ｒｐｍ、６００秒）。

ＲＮＡ分析をＦＴプレートに対して行った。

以下のようにＲＮＡ濃度を用いてＲＶＬＰ除去（ＲＮＡ対数減少）を計算した：
ＲＮＡ対数減少＝Ｌｏｇ（ＲＮＡ濃度_負荷／ＲＮＡ濃度_ウェル）

ＲＮＡ濃度_負荷は、負荷プレートの選択されたウェルで測定された平均ＲＮＡ濃度［コピー／μＬ］である。実施例１１では、負荷ウェルの平均ＲＮＡ濃度は１８２３５７［コピー／μＬ］であった。実施例１２では、負荷ウェルの平均ＲＮＡ濃度は８４２５０［コピー／μＬ］であった。

ＲＮＡ濃縮_ウェルは、実施例１１及び１２についてＦＴプレートの各ウェルで測定されたＲＮＡ濃度［コピー／μＬ］である。

図４１Ａ～図４１Ｄは、硫酸ナトリウムモル濃度の増加に伴う４つのｍａｂ及びアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４についてのＦＴ試料のＲＮＡ対数減少を示す。図４１Ａ及び図４１Ｂは、親水性ｍａｂ１（図４１Ａ）及びｍａｂ２（図４１Ｂ）のＲＮＡ対数減少を示す。図４１Ｃ及び図４１Ｄは、疎水性ｍａｂ７（図４１Ｃ）及びｍａｂ９（図４１Ｄ）についてのＲＮＡ対数減少を示す。

図４２Ａ～図４２Ｄは、導電率の増加に伴う４つのｍａｂ及びアンチカオトロピック塩Ｎａ_２ＳＯ_４についてのＦＴ試料のＲＮＡ対数減少を示す。図４２Ａ及び図４２Ｂは、親水性ｍａｂ１（図４２Ａ）及びｍａｂ２（図４２Ｂ）のＲＮＡ対数減少を示す。図４２Ｃ及び図４２Ｄは、疎水性ｍａｂ７（図４２Ｃ）及びｍａｂ９（図４２Ｄ）のＲＮＡ対数減少を示す。

図４３Ａ～図４３Ｄは、トリスモル濃度の増加に伴うアンチカオトロピック塩を含まないトリス／酢酸塩緩衝液中の４つのｍａｂについてのＦＴ試料のＲＮＡ対数減少を示す。図４３Ａ及び図４３Ｂは、親水性ｍａｂ１（図４３Ａ）及びｍａｂ２（図４３Ｂ）のＲＮＡ対数減少を示す。図４３Ｃ及び図４３Ｄは、疎水性ｍａｂ７（図４３Ｃ）及びｍａｂ９（図４３Ｄ）のＲＮＡ対数減少を示す。

図４４Ａ～図４４Ｄは、導電率の増加に伴うアンチカオトロピック塩を含まないトリス／酢酸塩緩衝液中の４つのｍａｂに対するＦＴ試料のＲＮＡ対数減少を示す。図４４Ａ及び図４４Ｂは、親水性ｍａｂ１（図４４Ａ）及びｍａｂ２（図４４Ｂ）のＲＮＡ対数減少を示す。図４４Ｃ及び図４４Ｄは、疎水性ｍａｂ７（図４４Ｃ）及びｍａｂ９（図４４Ｄ）についてのＲＮＡ対数減少を示す。

実施例１１及び実施例１２の概要：
ｍａｂ疎水性及びアンチカオトロピック塩の存在の効果は、ｐＨ５．０～８．０のｐＨ範囲で２つの親水性及び２つの疎水性ｍａｂを用いて示された。実施例１１（図４１及び図４２）では、４００ｍＭまでの塩モル濃度を有するアンチカオトロピック塩硫酸ナトリウムを調査した。実施例１２（図４３及び図４４）では、トリスモル濃度を増加させ、導電率を増加させるが、アンチカオトロピック塩を欠くトリス／酢酸塩緩衝液を使用した。

ｍａｂの疎水性及びアンチカオトロピック塩の存在に応じて、異なるＲＮＡ減少値を測定した。

実施例１２（アンチカオトロピック塩なし）について、調査したｍａｂは、ｍａｂ疎水性とは無関係に、低いトリス／酢酸塩モル濃度１００ｍＭ未満（３ｍＳ／ｃｍ未満の導電率に対応する）に対してのみ４～５のＲＮＡ対数減少範囲を示す（親水性ｍａｂと疎水性ｍａｂとの間に有意差はない）。親水性ｍａｂ１及びｍａｂ２については、塩モル濃度２５ｍＭ未満（導電率１．５ｍＳ／ｃｍ未満）についてのみ、４～５の対数減少値が測定された。

実施例１２とは対照的に、Ｎａ_２ＳＯ_４の存在下で親水性ｍａｂについてＲＮＡ減少の改善が観察された（実施例１１）。親水性ｍａｂ１では、４～５のＲＮＡ対数減少範囲が、ｐＨ５で１００ｍＭ Ｎａ_２ＳＯ_４の塩モル濃度まで観察され、これは９．４ｍＳ／ｃｍ未満の導電率に相当する。ｐＨ８では、４～５の対数減少値が、４０ｍＭ未満のモル濃度について測定された（４ｍＳ／ｃｍの導電率に対応する）。親水性ｍａｂ２の場合、４～５のＲＮＡ対数減少範囲が２２５ｍＭの塩モル濃度まで観察され、これは１９ｍＳ／ｃｍ未満の導電率に相当する。疎水性ｍａｂについては、アンチカオトロピック塩の存在下でＲＮＡ減少の有意な増加は観察されなかった。

Claims (15)

1. フロースルーモードで動作する、イオン交換官能基及び疎水性相互作用官能基を含む混合モードクロマトグラフィー材料（ｍｉｘｅｄ ｍｏｄｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｈａｔ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ；ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸ）を使用して（によって）、抗体を製造するための方法であって、
   ａ）前記抗体が親水性抗体であり、
   ｂ）前記抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液中で、前記抗体が前記ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用される、
   前記方法。
2. 以下の工程：
   ｃ）任意に、すすぎ溶液が適用される工程、
   ｄ）前記抗体が、ｂ）のフロースルーにおいて、又は任意にｂ）及びｃ）のフロースルーにおいて、回収される工程
   を更に含み、
   それによって、フロースルーモードで動作するＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸを使用して前記抗体を製造する、請求項１に記載の方法。
3. － 前記方法が、抗体関連高分子量（ＨＭＷ）不純物含有量が低減された及び／又はウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物を製造するためのものであり、
   － 前記抗体と、少なくとも１つのＨＭＷ不純物及び／又は少なくとも１つのウイルス不純物と、アンチカオトロピック塩とを含む溶液中で、前記抗体が前記ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用され、
   － ＨＭＷ不純物含有量が低減された及び／又はウイルス不純物含有量が低減された前記抗体組成物がフロースルーから回収され、
   － それによって、ＨＭＷ不純物含有量が低減された及び／又はウイルス不純物含有量が低減された抗体組成物が製造される、
   請求項１～２のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記ＨＭＷ不純物含有量及び／又は前記ウイルス不純物含有量が、工程ｂ）において前記ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸに適用された前記溶液と比較して低減される、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＨＭＷ不純物含有量及び／又は前記ウイルス不純物含有量が、アンチカオトロピック塩を本質的に含まない溶液と比較して、及び／又は疎水性抗体を含む溶液と比較して、低減される、請求項３又は４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記親水性抗体が、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）材料上でリツキシマブと同等以下の保持時間を有する抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ＨＩＣ材料が、リガンドとしてポリエーテル基（エチルエーテル基）を含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記アンチカオトロピック塩が、１．２８５～４．１８３×１０Ｅ３ ｄｙｎ＊ｇ＊ｃｍ^－１＊ｍｏｌ^－１の範囲の及びこれを含むモル表面張力増分を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記アンチカオトロピック塩が、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、Ｎａ_２ＳＯ_４、Ｋ_２ＳＯ_４、ＮａＣｌ及びＫＣｌからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 工程ｂの前記抗体及びアンチカオトロピック塩を含む前記溶液が、０．５～１２０ｍＳ／ｃｍの導電率を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記抗体及びアンチカオトロピック塩を含む溶液において、前記アンチカオトロピック塩が、１０ｍＭ～９００ｍＭの濃度を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸへの負荷量が、クロマトグラフィー材料１リットル当たりタンパク質１５ｇ（１５ｇ／Ｌ）～クロマトグラフィー材料１リットル当たりタンパク質３５０ｇ（３５０ｇ／Ｌ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記抗体及びアンチカオトロピック塩を含む前記溶液が、４．０～９．０のｐＨ値を有する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記ＨＭＷ不純物が、２８５ｋＤａ以上の分子量を有する不純物である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ＭＭ ＨＩＣ／ＩＥＸが、
    ｉ）アニオン交換官能基若しくはカチオン交換官能基、又は
    ｉｉ）強アニオン交換官能基、又は
    ｉｉｉ）弱カチオン交換官能基
    を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

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