CN117043181A - 蛋白质组合物以及其产生和使用方法 - Google Patents

蛋白质组合物以及其产生和使用方法 Download PDF

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B·黄
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Abstract

本发明涉及包括蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM‑CSFRα抗体或其抗原结合部分的组合物以及用于产生此类组合物的方法，例如细胞培养和/或蛋白质纯化方法。还提供了用于使用此类组合物治疗病症，例如GM‑CSFRα相关病症的方法。

Description

蛋白质组合物以及其产生和使用方法
相关申请交叉引用
本申请要求于2020年12月18日提交的美国临时申请第63/127,973号的优先权的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用特此并入。
背景技术
抗体，如单克隆抗体(mAb)，是制药行业中的重要一类治疗性药物。抗体治疗剂已被开发用于治疗许多疾病，如癌症、炎症和自身免疫障碍。
用于药物应用的蛋白质(如单克隆抗体)的产生通常涉及上游过程技术(例如细胞培养)和下游过程技术(例如蛋白质纯化)的使用。通常，抗体在哺乳动物细胞培养物中作为重组蛋白产生，以确保适当的折叠和翻译后修饰。由细胞培养物产生的单克隆抗体需要从宿主细胞蛋白和其它杂质中纯化，以便被有效利用，例如，以改善安全性配置。
表现出不同水平的变体和杂质的蛋白质可以通过上游和下游过程产生。此类蛋白质变体和杂质包含但不限于：产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段或带电物种，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白、核酸和残余介质组分。
发明内容
本发明基于用于蛋白质产生，例如，抗体或其抗原结合部分的产生的上游和下游过程技术的鉴定和优化，由此导致具有低水平的变体和/或杂质的组合物，所述低水平的变体和/或杂质例如低水平的产物相关物质，例如产物聚集体、片段或带电物种，例如酸性或碱性物种；和/或低水平的过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白。
因此，一方面，本发明提供了一种产生具有水平降低的半抗体的包含所关注的蛋白质的制剂的方法，所述方法包含使包含所述所关注的蛋白质以及半抗体的样品经受阳离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂，由此产生具有水平降低的半抗体的包含所述所关注的蛋白质的所述制剂。
另一方面，本发明提供了一种降低包含所关注的蛋白质的制剂中的半抗体的水平的方法，所述方法包含使包含所关注的蛋白质以及半抗体的样品经受阳离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂，由此降低包含所述所关注的蛋白质的所述制剂中的半抗体的水平。
在一些实施例中，所述所关注的蛋白质是抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合部分是抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗(mavrilimumab)。
在一些实施例中，所述样品经受阳离子交换色谱树脂。在一些实施例中，所述阳离子交换色谱树脂包含选自由以下组成的组的官能团：巯基、磺酸酯、硫酸酯、羧甲基、磺乙基、磺丙基、磷酸酯和磺酸酯。在一些实施例中，所述阳离子交换色谱树脂选自由以下组成的组：POROSTMXS CEX、CaptoTMSImpAct、TOTOPEARLTMGigaGap CM 650M和TOYOPEALTM硫酸酯650F。在一些实施例中，所述阳离子交换色谱树脂以结合洗脱模式运行。
在一些实施例中，所述样品经受混合模式色谱树脂。在一些实施例中，所述混合模式色谱树脂包含选自由以下组成的组的官能团：羧基、羟基、N-苄基-N-甲基乙醇胺、苯基丙胺和己胺。在一些实施例中，所述混合模式色谱树脂选自由CaptTMMMC ImpRes和CaptoTMAdhere ImpRes组成的组。
在一些实施例中，所述制剂包含小于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2.8％、约2％、约1％或约0.5％的半抗体。
在一些实施例中，所述制剂包含小于约2.8％的半抗体。
在一些实施例中，所述制剂包含约0.1-20％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体。
在一些实施例中，所述制剂包含约0.6-1.7％的半抗体。
在一些实施例中，与所述样品中的半抗体的水平相比，所述制剂中的半抗体的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
在一些实施例中，所述方法进一步包含使用洗脱缓冲液收集洗脱液级分。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含小于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2.8％、约2％、约1％或约0.5％的半抗体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约0.1-20％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集。在一些实施例中，从阳离子交换色谱树脂收集的所述洗脱液级分包含约0.6-18％的半抗体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集。在一些实施例中，所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包含约1-17％的半抗体。
在一些实施例中，与所述样品中的半抗体的水平相比，所述洗脱液级分中的半抗体的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM的乙酸钠。在一些实施例中，其中所述洗脱缓冲液包含约40-60mM的乙酸钠。
在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM的氯化钠。在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约40-60mM的氯化钠。
在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约4-7、约5-6、约5-5.5的pH。在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约5-5.5的pH。
在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约50mM的乙酸钠、约55mM的氯化钠以及约5.35的pH。
在一些实施例中，所述所关注的蛋白质以约10-100g/L、约20-90g/L、约30-80g/L、约40-70g/L或约50-60g/L的水平上样到所述阳离子交换色谱树脂或所述混合模式色谱树脂上。在一些实施例中，所述所关注的蛋白质以约30-60g/L的水平上样到所述阳离子交换色谱树脂或所述混合模式色谱树脂上。
在一些实施例中，半抗体的水平是通过非还原CE-SDS(用十二烷基硫酸钠进行的毛细管电泳)确定的。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，所述组合物包含小于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2.8％、约2％、约1％或约0.5％的半抗体。
在一些实施例中，所述组合物包含小于约2.8％的半抗体。
在一些实施例中，所述组合物包含约0.1-20％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体。在一些实施例中，所述组合物包含约0.6-1.7％的半抗体。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从阳离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包含小于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2.8％、约2％、约1％或约0.5％的半抗体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约0.1-20％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换树脂收集并且包含约0.6-18％的半抗体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从混合模式树脂收集并且包含约1-17％的半抗体。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从阳离子交换色谱树脂收集的流通和/或洗涤级分，并且其中所述流通和/或洗涤级分包含小于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的半抗体。
在一些实施例中，所述流通和/或洗涤级分包含小于约6％的半抗体。
在一些实施例中，半抗体的水平是通过非还原CE-SDS(用十二烷基硫酸钠进行的毛细管电泳)确定的。
在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文所述的组合物中的任一种以及药学上可接受的载体。
一方面，本发明提供了一种产生具有水平降低的酸性物种的包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分的制剂的方法，所述方法包含使包含所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分以及酸性物种的样品经受阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂，由此产生具有水平降低的酸性物种的包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分的所述制剂。
另一方面，本发明提供了一种降低包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分的制剂中的酸性物种的水平的方法，所述方法包含使包含所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分以及酸性物种的样品经受阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂，由此降低包含所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分的所述制剂中的酸性物种的水平。
在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
在一些实施例中，所述样品经受阴离子交换色谱树脂。在一些实施例中，所述阴离子交换色谱树脂包含选自由以下组成的组的官能团：二乙基氨基乙基、四氨基乙基和季铵。在一些实施例中，所述阴离子交换色谱树脂选自由POROSTMXQ AEX和CaptoTMQ ImpRes组成的组。在一些实施例中，所述阴离子交换色谱树脂以结合洗脱模式运行。
在一些实施例中，所述样品经受混合模式色谱树脂。在一些实施例中，所述混合模式色谱树脂包含选自由以下组成的组的官能团：羧基、羟基、N-苄基-N-甲基乙醇胺、苯基丙胺和己胺。在一些实施例中，所述混合模式色谱树脂是CaptoTMAdhere ImpRes。
在一些实施例中，所述制剂包含小于约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的酸性物种。
在一些实施例中，所述制剂包含约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种。
在一些实施例中，所述制剂包含约11-22％的酸性物种。在一些实施例中，所述制剂包含约11-38％的酸性物种。在一些实施例中，所述制剂包含约9-18％的酸性物种。在一些实施例中，所述制剂包含约11-38％的酸性物种以及小于约24％的碱性物种。在一些实施例中，所述制剂包含约11-38％的酸性物种以及(i)约58-62％的主要物种或(ii)大于约64％的主要物种。
在一些实施例中，所述方法进一步包含使用洗脱缓冲液收集洗脱液级分。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含小于约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的酸性物种。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集。在一些实施例中，从阴离子交换色谱树脂收集的所述洗脱液级分包含约11-22％的酸性物种。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集。在一些实施例中，从混合模式色谱树脂收集的所述洗脱液级分包含约12-38％的酸性物种。
在一些实施例中，与所述样品中的酸性物种的水平相比，所述制剂或所述洗脱液级分中的酸性物种的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约1-500mM、约10-250mM、约50-200mM、约70-150mM、约90-130mM或约100-110mM的氯化钠。在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约100-110mM的氯化钠。
在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约1-500mM、约10-250mM、约20-150mM、约30-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM的组氨酸。在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约40-60mM的组氨酸。
在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM的乙酸盐。在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约40-60mM的乙酸盐。
在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM的Bis-Tris。在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约40-60mM的Bis-Tris。
在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约5-7或约5.5-6.5的pH。在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约5.5-6.5的pH。
在一些实施例中，所述洗脱缓冲液包含约50mM的组氨酸、约105mM的NaCl，并且具有约6.0的pH。
在一些实施例中，所述所关注的蛋白质以约10-100g/L、约20-90g/L、约30-80g/L或约40-70g/L的水平上样到所述阴离子交换色谱树脂或所述混合模式色谱树脂上。在一些实施例中，所述所关注的蛋白质以约50-60g/L的水平上样到所述阴离子交换色谱树脂或所述混合模式色谱树脂上。
在一些实施例中，酸性物种的水平是通过离子交换色谱确定的。
在一些实施例中，在使所述样品经受阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂之前，使样品经受阳离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含所述抗体的小于约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的酸性物种。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种。
在一些实施例中，所述组合物包含约11-22％的酸性物种。在一些实施例中，所述组合物包含约9-18％的酸性物种。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含所述抗体的小于约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的碱性物种。在一些实施例中，所述组合物包含小于约24％的碱性物种。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含约1-45％、约1-40％、约1-35％、约1-25％、约5-35％、约10-35％、约15-35％、约1-30％、约1-25％、约1-24％、约5-25％、约5-30％、约5-45％、约10-25％、约10-30％、约10-40％、约15-25％、约15-30％、约15-35％、约15-25％、约17-26％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种。
在一些实施例中，所述组合物包含约16-41％的碱性物种。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含所述抗体的大于约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的主要物种。
在一些实施例中，所述组合物包含大于约64％的主要物种。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含约40-99％、约45-99％、约50-99％、约55-99％、约50-90％、约55-90％、约50-80％、约55-80％、约50-70％、约55-70％、约50-65％、约46-67％、约55-65％、约58-62％、约58-63％、约58-67％、约53-61％或约46-66％的主要物种。
在一些实施例中，所述组合物包含约46-67％的主要物种。
在一些实施例中，所述组合物包含约58-62％的主要物种。
在一些实施例中，所述组合物包含约11-38％的酸性物种以及小于约24％的碱性物种。在一些实施例中，所述组合物包含约11-38％的酸性物种以及大于约64％的主要物种。在一些实施例中，所述组合物包含约11-38％的酸性物种以及约58-62％的主要物种。在一些实施例中，所述组合物包含约9-41％的碱性物种以及约9-18％的酸性物种。在一些实施例中，所述组合物包含约9-41％的碱性物种和大于约64％的主要物种。在一些实施例中，所述组合物包含约16-41％的碱性物种以及约58-62％的主要物种。在一些实施例中，所述组合物包含约46-67％的主要物种以及约9-18％的酸性物种。在一些实施例中，所述组合物包含约46-67％的主要物种以及小于24％的碱性物种。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包含小于约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的酸性物种。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包含约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约11-38％的酸性物种。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包含约11-22％的酸性物种。在一些实施例中，所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包含约12-38％的酸性物种。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包含小于约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的碱性物种。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包含约1-45％、约1-40％、约1-35％、约1-25％、约5-35％、约10-35％、约15-35％、约1-30％、约1-25％、约1-24％、约5-25％、约5-30％、约5-45％、约10-25％、约10-30％、约10-40％、约15-25％、约15-30％、约15-35％、约15-25％、约17-26％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约9-41％的碱性物种。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包含约9-29％的碱性物种。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包含约16-41％的碱性物种。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包含大于约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约63％、约64％、约65％、约66％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的主要物种。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包含约40-99％、约45-99％、约50-99％、约55-99％、约50-90％、约55-90％、约50-80％、约55-80％、约50-70％、约55-70％、约50-65％、约55-65％、约58-62％、约58-63％、约58-67％、约46-67％、约53-61％或约46-66％的主要物种。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包含约53-61％的主要物种。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包含约46-66％的主要物种。
在前述方面中任一项的一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
在一些实施例中，酸性物种的水平、主要物种的水平或碱性物种的水平是通过离子交换色谱确定的。
一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本文所述的组合物中的任一种以及药学上可接受的载体。
一方面，本发明提供了一种产生具有水平降低的高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白的包含所关注的蛋白质的制剂的方法，所述方法包含使包含所述所关注的蛋白质、高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白(HCP)的样品经受色谱树脂，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，由此产生具有水平降低的高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白的包含所述所关注的蛋白质的所述制剂。
另一方面，本发明提供了一种降低包含所关注的蛋白质的制剂中的高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白(HCP)的水平的方法，所述方法包含使包含所述所关注的蛋白质以及半抗体的样品经受色谱树脂，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，由此降低包含所述所关注的蛋白质的所述制剂中的高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白的水平。
在一些实施例中，所述所关注的蛋白质是抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合部分是抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
在一些实施例中，所述色谱树脂是阳离子交换色谱树脂。在一些实施例中，所述阳离子交换色谱树脂包含选自由以下组成的组的官能团：巯基、磺酸酯、硫酸酯、羧甲基、磺乙基、磺丙基、磷酸酯和磺酸酯。在一些实施例中，所述阳离子交换色谱树脂选自由以下组成的组：POROSTMXS CEX、CaptoTMS ImpAct、TOTOPEARLTMGigaGap CM 650M和TOYOPEALTM硫酸酯650F。在一些实施例中，所述阳离子交换色谱树脂以结合洗脱模式运行。
在一些实施例中，所述色谱树脂是阴离子交换色谱树脂。在一些实施例中，所述阴离子交换色谱树脂包含选自由以下组成的组的官能团：二乙基氨基乙基、四氨基乙基和季铵。在一些实施例中，所述阴离子交换色谱树脂选自由POROSTMXQ AEX和CaptoTMQ ImpRes组成的组。在一些实施例中，所述阴离子交换色谱树脂以结合洗脱模式运行。
在一些实施例中，所述色谱树脂是混合模式色谱树脂。在一些实施例中，所述混合模式色谱树脂包含选自由以下组成的组的官能团：羧基、羟基、N-苄基-N-甲基乙醇胺、苯基丙胺和己胺。在一些实施例中，所述混合模式色谱树脂选自由CaptTMMMC ImpRes和CaptoTMAdhere ImpRes组成的组。
在一些实施例中，所述制剂包含小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体。在一些实施例中，所述制剂包含小于0.5％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，所述制剂包含约0.01-10％、约0.01-5％、约0.01-1％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。在一些实施例中，所述制剂包含约0.04-0.8％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，与所述样品中的高分子量聚集体的水平相比，所述制剂中的高分子量聚集体的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
在一些实施例中，所述制剂包含小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的HCP。
在一些实施例中，所述制剂包含约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约0.1-2、约0.1-3、约2-8或约0.1-8ppm的HCP。在一些实施例中，所述制剂包含约0.1-2ppm的HCP。
在一些实施例中，与所述样品中的HCP的水平相比，所述制剂中的HCP的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
在一些实施例中，所述制剂包含大于所关注的蛋白质的约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的单体。
在一些实施例中，所述制剂包含所关注的蛋白质的大于约99.1％的单体。
在一些实施例中，所述制剂包含所关注的蛋白质的约90-99.9％、约90-95％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体。
在一些实施例中，所述制剂包含所关注的蛋白质的约98-99％的单体。在一些实施例中，所述制剂包含所关注的蛋白质的约98-99.9％的单体。
在一些实施例中，所述制剂包含所关注的蛋白质的小于10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的片段。在一些实施例中，所述制剂包含所关注的蛋白质的小于约0.4％或小于0.3％的片段。
在一些实施例中，所述制剂包含所关注的蛋白质的约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.6-1.5％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的片段。在一些实施例中，所述制剂包含所关注的蛋白质的约0.6-1.5％的片段。在一些实施例中，所述制剂包含所关注的蛋白质的约0.5-1.5％的片段。
在一些实施例中，所述方法进一步包含使用洗脱缓冲液收集洗脱液级分。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约0.01-10％、约0.01-5％、约0.01-1％、约0.04-0.8％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.5-0.8％、约0.1-6％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约0.04-0.4％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换树脂收集，并且包含约0.01-10％、约0.01至5％、约0.01至1％、约0.04-0.2％、约0.04-0.8％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.5-0.7％、约0.1-6％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换树脂收集，并且包含约0.1-0.4％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包含约0.01-10％、约0.01-5％、约0.0-1％、约0.04-0.2％、约0.04-0.8％、约0.1-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换树脂收集，并且包含约0.04-0.2％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，与所述样品中的高分子量聚集体的水平相比，所述洗脱液级分中的高分子量聚集体的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的HCP。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约0.1-2、约0.1-3、约2-8ppm或约0.1-8ppm的HCP。在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约0.1-8ppm的HCP。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包含约0.1-2ppm的HCP。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包含约2-8ppm的HCP。
在一些实施例中，与所述样品中的HCP的水平相比，所述洗脱液级分中的HCP的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含所关注的蛋白质的大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的单体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含所关注的蛋白质的约90-99.9％、约90-95％、约94-99.9％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含所关注的蛋白质的约98-99.9％的单体。在一些实施例中，所述洗脱液级分包含所关注的蛋白质的约98.5-99.5％的单体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含所关注的蛋白质的小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的片段。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含所关注的蛋白质的约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.1-1.1％、约0.1-0.8％、约0.5-1.5％、约0.6-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的片段。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含所关注的蛋白质的约0.1-1.1％的片段。在一些实施例中，所述洗脱液级分包含所关注的蛋白质的约0.1-0.8％的片段。在一些实施例中，所述洗脱液级分包含所关注的蛋白质的约0.4-1.1％的片段。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱收集，并且包含所关注的蛋白质的约0.1-0.8％或约0.4-0.8％的片段。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包含所关注的蛋白质的约0.1-1.1％或约0.5-1.1％的片段。
在一些实施例中，高分子量聚集体的水平、所关注的蛋白质的片段的水平或所关注的蛋白质的单体的水平是通过尺寸排阻色谱确定的。
在一些实施例中，HCP的水平是通过ELISA确定的。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，所述组合物包含小于约0.5％的高分子量聚集体。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含约0.01-10％、约0.01-5％、约0.01-1％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，所述组合物包含约0.04-0.8％的高分子量聚集体。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的宿主细胞蛋白。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约0.1-2、约0.1-3、约2-8ppm或约0.1-8ppm的HCP。在一些实施例中，所述组合物包含约0.1-2ppm的HCP。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包含大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的抗体单体。
在一些实施例中，所述组合物包含大于99.1％的抗体单体。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包含约90-99.9％、约90-95％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的抗体单体。
在一些实施例中，所述组合物包含约98-99％的抗体单体。在一些实施例中，所述组合物包含约98-99.9％的抗体单体。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包含小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的抗体片段。
在一些实施例中，所述组合物包含小于约0.4％的抗体片段。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包含约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.6-1.5％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的抗体片段。
在一些实施例中，所述组合物包含约0.5-1.5％的抗体片段。在一些实施例中，所述组合物包含约0.6-1.5％的抗体片段。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包含小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包含约0.1-10％、约0.01-5％、约0.01-1％、约0.04-0.8％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.5-0.8％、约0.04-0.4％、约0.1-6％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约0.04-0.4％的高分子量聚集体。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包含约0.04-0.2％的高分子量聚集体。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包含约0.1-0.4％的高分子量聚集体。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包含小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的宿主细胞蛋白。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包含约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约0.1-2、约0.1-3、约2-8ppm或约0.1-8ppm的HCP。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约0.1-8ppm的HCP。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包含约0.1-2ppm的HCP。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包含约2-8ppm的HCP。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包含大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的抗体单体。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包含从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包含约90-99.9％、约90-95％、约94-99.9％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的抗体单体。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约98-99.9％的抗体单体。在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约98.5-99.5％的抗体。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包含从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包含小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的抗体片段。
另一方面，本发明提供了一种组合物，其包含抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包含从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包含约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.1-1.1％、约0.1-0.8％、约0.6-1.5％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的抗体片段。
在一些实施例中，所述洗脱液级分包含约0.4-1.1％的抗体片段。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包含约0.1-1.1％或约0.5-1.1％的抗体片段。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包含约0.1-0.8％或约0.4-0.8％的抗体片段。
在一些实施例中，高分子量聚集体的水平、抗体单体的水平和/或抗体片段的水平是通过尺寸排阻色谱确定的。
在一些实施例中，HCP的水平是通过ELISA确定的。
在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
一方面，本发明提供了一种用于由细胞培养物制备具有水平降低的酸性物种的包含所关注的蛋白质的制剂的方法，所述方法包含：在生物反应器中温育所述细胞培养物；将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5的pH下；由此制备具有水平降低的酸性物种的包含所关注的蛋白质的制剂。
另一方面，本发明提供了一种用于降低细胞培养物中的所关注的蛋白质的酸性物种的水平的方法，所述方法包含：在生物反应器中温育所述细胞培养物；将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5的pH下；由此降低所述所关注的蛋白质的酸性物种的水平。
一方面，本发明提供了一种用于增加来自细胞培养物的所关注的蛋白质的产生产率的方法，所述方法包含：在生物反应器中温育所述细胞培养物；将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5的pH下；由此增加所述所关注的蛋白质的所述产生产率。
在一些实施例中，所述所关注的蛋白质是抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合部分是抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
在一些实施例中，所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5、约6.5-7.5、约6-7、约6.5-7或约6.7-7的pH下。在一些实施例中，所述细胞培养物的pH维持在约6.5-7的pH下。
在一些实施例中，在温育时段的第2天-第8天期间，所述细胞培养物的pH降低了约0.01-0.4、约0.02-0.4、约0.05-0.3、约0.1-0.4、约0.1-0.3、约0.1-0.2或约0.1-0.2，但维持在约6.5-7的pH下。
在一些实施例中，所述细胞培养物的pH通过一个或多个选自由以下组成的组的步骤维持：(a)增加所述细胞培养物中的CO2的水平；(b)将所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约0.1-5g/L下；(c)增加所述细胞培养物中的乳酸盐产生；以及(d)在所述温育时段间增加细胞培养补充剂的水平。
在一些实施例中，所述细胞培养物中的CO2的水平增加了至少约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在一些实施例中，所述细胞培养物中的CO2的水平增加了约0.1-5％、约0.2-6％、约0.3-7％、约0.4-8％或约0.5-10％。
在一些实施例中，所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约0.1-5g/L、0.1-4g/L、0.1-3g/L、0.1-2g/L、0.2-2g/L、约0.3-2g/L、约0.4-2g/L、约0.5-2g/L、约0.6-2g/L、约0.7-2g/L、约0.8-2g/L、约0.9-2g/L、约0.1-1.9、约0.2-1.8、约0.3-1.7、约0.4-1.6、约0.5-1.5g/L、约0.6-1.4、约0.7-1.3、约0.8-1.2或约0.9-1.1下。
在一些实施例中，所述细胞培养补充剂包含一种或多种补充剂。
在一些实施例中，所述细胞培养补充剂的水平在温育时段间增加了约0.1％-20％、约0.1％-10％、约0.1％-5％、约0.5％-20％、约0.5％-10％或约1％-10％。
在一些实施例中，在温育时段的第2天-第8天期间，将在约0.1-3％的水平下的所述细胞培养补充剂添加到所述细胞培养物中，并且在温育时段的第4天-第10天期间，所述细胞培养补充剂的水平增加了初始水平的约50％或更多。
在一些实施例中，增加所述细胞培养补充剂使乳酸盐产生增加、渗透压增加、细胞活力增加和/或细胞培养物的pH降低。
在一些实施例中，将所述细胞培养物维持在约35-37℃的温度下。
一方面，本发明提供了一种用于由细胞培养物制备具有水平降低的酸性物种的包含所关注的蛋白质的制剂的方法，所述方法包含：在生物反应器中温育所述细胞培养物；以及一个或多个选自由以下组成的组的步骤：(a)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5、约6-7或约6.5-7的pH下；(b)在所述温育时段期间增加细胞培养补充剂的水平；(c)将所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约0.1-5g/L下；(d)增加所述细胞培养物中的乳酸盐产生；(e)增加所述细胞培养物中的CO2的水平；和/或(f)降低所述细胞培养物的pH，由此制备具有水平降低的酸性物种的包含所关注的蛋白质的制剂。
另一方面，本发明提供了一种用于降低细胞培养物中的所关注的蛋白质的酸性物种的水平的方法，所述方法包含：在生物反应器中温育所述细胞培养物；以及一个或多个选自由以下组成的组的步骤：(a)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5、约6-7或约6.5-7的pH下；(b)在所述温育时段期间增加细胞培养补充剂的水平；(c)将所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约0.1-5g/L下；(d)增加所述细胞培养物中的乳酸盐产生；(e)增加所述细胞培养物中的CO2的水平；和/或(f)降低所述细胞培养物的pH，由此降低所述所关注的蛋白质的酸性物种的水平。
另一方面，本发明提供了一种用于增加来自细胞培养物的所关注的蛋白质的产生产率的方法，所述方法包含：在生物反应器中温育所述细胞培养物；以及一个或多个选自由以下组成的组的步骤：(a)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5、约6-7或约6.5-7的pH下；(b)在所述温育时段期间增加细胞培养补充剂的水平；(c)将所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约0.1-5g/L下；(d)增加所述细胞培养物中的乳酸盐产生；(e)增加所述细胞培养物中的CO2的水平；和/或(f)降低所述细胞培养物的pH，由此增加所述所关注的蛋白质的所述产生产率。
在一些实施例中，所述所关注的蛋白质是抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合部分是抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分。在一些实施例中，所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
附图说明
图1描绘了示例性纯化过程的概述。
具体实施方式
本发明基于用于蛋白质产生，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的产生的上游和下游过程技术的鉴定和优化，由此导致产生具有低水平的变体和/或杂质的包括蛋白质的组合物，所述低水平的变体和/或杂质例如低水平的产物相关物质，例如产物聚集体、片段或带电物种，例如酸性或碱性物种；和/或低水平的过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白。
通过在上游蛋白质产生期间调节条件，如细胞培养物的过程参数，例如细胞培养物的pH、CO2或乳酸盐的水平或细胞培养进料和/或补充剂的水平；和/或通过优化所述下游纯化过程，例如色谱步骤，本发明的发明人已成功地生成具有水平降低的变体和/或杂质，如水平降低的酸性物种或碱性物种，水平降低的聚集体或片段、水平降低的半抗体和/或水平降低的宿主细胞蛋白的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)或其抗原结合部分的组合物。具有如此低水平的变体和/或杂质的组合物是高度期望的，因为所得蛋白质产物将提供具有较高效力、较高功效或更佳稳定性的治疗益处，而没有不期望的作用。例如，具有较低聚集体、半抗体或片段和/或更高水平的抗体单体的组合物将至少部分通过使存在于组合物中的活性抗体的水平最大化而表现出更高的效力和功效。
呈现以下描述以使本领域的普通技术人员能够制造和使用各种实施例。仅作为实例提供具体方法、组合物、技术和应用的描述。对本文所述的实例的各种修改对于本领域的普通技术人员将是显而易见的，并且在不脱离各种实施例的精神和范围的情况下，本文所述的一般原理可以应用于其它实例和应用。因此，各种实施例并不旨在限于本文所述和所示的实例，而是赋予与权利要求一致的范围。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如果本章节中陈述的定义与在通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其它出版物中陈述的定义相反或在其它方面不一致，则在本章节中陈述的定义优先于通过引用并入本文的定义。本文提供的标题仅为方便而设，不以任何方式限制应用。本文提及的所有专利、申请、公开申请和其它出版物通过引用以其整体并入。
I.定义
为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。另外，应该注意的是，每当引用参数的值或值的范围时，意图是所引用的值中间的值和范围也旨在是本发明的一部分。
冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中用于指代所述冠词的语法宾语中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“要素”是指一个要素或多于一个要素，例如，多个要素。
术语“包含”在本文中用于意指短语“包含但不限于”，并且可与之互换使用。
除非上下文另外清楚地指出，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与之互换使用。例如，“正义链或反义链”被理解为“正义链或反义链或正义链和反义链”。
术语“约”在本文中用于意指在本领域的典型公差范围内。例如，“约”可以被理解为平均值的约2个标准偏差。在某些实施例中、约意指+±10％。在某些实施例中、约意指±5％。当“约”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解“约”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可以含有天然或非天然的氨基酸残基，并且包含但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖了全长蛋白以及其片段两者。所述术语还包含多肽的表达后修饰，例如，糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，出于本发明的目的，“多肽”是指包含对天然序列进行修饰，如缺失、添加和取代(通常本质上是保守的)的蛋白质，只要所述蛋白质维持所需活性。这些修饰可以是故意的，如通过定点诱变；或可以是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增导致的误差。
术语“抗体”包含由通过二硫键相互连接的四条多肽链，即两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白分子。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包含三个结构域，即CH1、CH2以及CH3。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH区和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称为框架区(FR)的区。每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
术语抗体还包含嵌合抗体、人源化抗体以及各种物种，如小鼠、人、食蟹猴、驼、骆驼等的抗体。所述术语还包含多价抗体，如二价或四价抗体。多价抗体包含，例如，包括多个抗原结合(含CDR)结构域的单个多肽链，以及两个或更多个多肽链，每个多肽链含有一个或多个抗原结合结构域，如彼此缔合，例如，通过能够形成二硫键或任何其它共价或非共价相互作用的铰链区彼此缔合的两个或更多个多肽链。
术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体部分”)包含保留与抗原特异性结合的能力的抗体的片段，例如，一个或多个抗原结合结构域(例如，在玛弗利木单抗、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子受体α亚基(GM-CSFRα)的情况下)。已经表明抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合部分”内涵盖的结合片段的实例包含包括单结构域抗体(sdAb)的至少CDR1、CDR2和CDR3的分子，其中所述分子能够与抗原结合。术语抗体结合部分还指包括重链的至少CDR1、CDR2和CDR3以及轻链的CDR1、CDR2和CDR3的分子，其中所述分子能够与抗原结合。术语抗体结合部分还包含能够结合抗原的片段，如：(i)Fab片段，即包括VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包括由铰链区处的二硫桥连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fab'片段，所述片段可以通过F(ab')2片段的减少而形成；(iv)Fc片段，所述片段包括CH2和CH3区以及通过一个或多个二硫醚和非共价相互作用保持在一起的所述铰链区的一部分；(v)包括VH和CH1结构域的Fd片段；(vi)包括抗体的单臂的VL和VH结构域的Fv片段；(vii)还原的IgG或半IgG；以及(viii)dAb片段(Ward等人,(1989)《自然(Nature)》341:544-546，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)，所述片段包括VH结构域。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是这两个结构域可以使用重组方法通过使这两个结构域能够制成单个蛋白链的合成接头进行接合，在所述单个蛋白链中，所述VL区和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv))；参见例如，Bird等人(1988)《科学(Science)》242:423-426；以及Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879-5883，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)。此类单链抗体还旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。还涵盖了其它形式的单链抗体，如双抗体。双抗体是双价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单个多肽链上表达，但使用的接头太短以至于无法在同一条链上的两个结构域之间进行配对，由此迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如，Holliger,P.,等人(1993)《美国国家科学院院刊》90:6444-6448；Poljak,R.J.,等人(1994)《结构(Structure)》2:1121-1123，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)。另外，抗体或其抗原结合部分可以是较大免疫粘附分子的一部分，其通过抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成。此类免疫粘附分子的实例包含使用链霉亲和素核心区来制备四聚体scFv分子(Kipriyanov,S.M.,等人(1995)《人抗体和杂交瘤(HumanAntibodies and Hybridomas)》6:93-101，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)，以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.,等人(1994)《分子免疫学(Mol.Immunol)》31:1047-1058，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)。抗体部分，如Fab和F(ab')2片段，可以使用常规技术，如全抗体的分别木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化，由全抗体制备。此外，可以使用如本文所述的标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。一方面，抗原结合部分是完整结构域或完整结构域对。
如本文所使用的，术语“半抗体”或“还原IgG”是指与分子量为75kDa的一条免疫球蛋白轻链相关的一条免疫球蛋白重链。其为选择性地仅减少抗体分子内的铰链区二硫键的产物。
术语“人抗体”包含具有对应于如Kabat等人所述的人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体(参见Kabat,等人(1991)《有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences ofproteins of Immunological Interest)》,第五版,美国卫生与公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公开号91-3242)。本发明的人抗体可以包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中，并且具体地说，在CDR3中。可以使用“选择性诱变方法”引入突变。人抗体可以具有被氨基酸残基，例如，未被人种系免疫球蛋白序列编码的活性增强的氨基酸残基替换的至少一个位置。人抗体可以具有被并非人种系免疫球蛋白序列的一部分的氨基酸残基替换的至多二十个位置。在其它实施例中，至多十个、至多五个、至多三个或至多两个位置被替换。在一个实施例中，这些置换在CDR区内。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”并非旨在包含其中衍生自另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上的抗体。
短语“重组人抗体”包含通过重组方式制备、表达、产生或分离的人抗体，如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体、从重组的组合人抗体库中分离的抗体、从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如，小鼠)中分离的抗体(参见例如，Taylor,L.D.,等人(1992)《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》20:6287-6295，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)，或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列上的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见，Kabat,E.A.,等人(1991)《有免疫学意义的蛋白质序列》,第五版,美国卫生与公共服务部,NIH公开号91-3242)。然而，在某些实施例中，此类重组人抗体经受体外诱变(或者，当使用对于人Ig序列是转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是尽管衍生自人种系VH和VL序列并与之相关，但可能并非天然存在于体内人抗体种系库内的序列。然而，在某些实施例中，此类重组抗体是选择性诱变方法或回复突变或两者的结果。
如本文所使用的，“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如，特异性结合GM-CSFRα的分离的抗体基本上不含特异性结合除GM-CSFRα以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合GM-CSFRα的分离的抗体可以与其它抗原，如来自其它物种的GM-CSFRα分子具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学品。合适的抗GM-CSFRα抗体是玛弗利木单抗。
术语“Kabat编号”“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域中公认的这些术语是指对比抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其它氨基酸残基更可变(即，高变)的氨基酸残基进行编号的系统(Kabat等人(1971)《纽约科学院年鉴(Ann.NY Acad,Sci.)》190:382-391和Kabat,E.A.,等人(1991)《有免疫学意义的蛋白质序列》,第五版,美国卫生与公共服务部,NIH公开号91-3242，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)。对于重链可变区，对于CDR1的高变区在氨基酸位置31至35的范围内，对于CDR2的高变区在氨基酸位置50至65的范围内，对于CDR3的高变区在氨基酸位置95至102的范围内。对于轻链可变区，对于CDR1的高变区在氨基酸位置24至34的范围内，对于CDR2的高变区在氨基酸位置50至56的范围内，对于CDR3的高变区在氨基酸位置89至97的范围内。
如本文所使用的，术语“产物”是指所关注的蛋白质，所述所关注的蛋白质可以存在于包括一种或多种变体和/或杂质的样品的情况下，所述一种或多种变体和/或杂质例如，产物相关物质，例如，产物聚集体、片段或带电物种，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白。在某些实施例中，产物，即，所关注的蛋白质是抗体或其抗原结合片段。
术语“产物相关物质”或“产物相关变体”是指产物的任何变体，例如，带电物种、聚集体、半抗体、片段或源自替代翻译后修饰的任何其它蛋白质产物物种。期望将产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段或带电物种，例如酸性物种或碱性物种从所得蛋白质产物，例如抗体或其抗原结合部分中去除，使得所得蛋白质产物将提供具有较高效力、较高功效或更佳稳定性的治疗益处，而没有不期望的作用。
如本文所使用的，术语“片段”是指来自所关注的蛋白质的由于沿着所关注的蛋白质的肽主链的一个或多个键的断裂或酶促和/或化学修饰的解离的任何截短蛋白物质。例如，抗体片段包含但不限于Fab、F(ab')2、Fab'、Fc、Fv、scFv、Fd、dAb、半抗体或含有抗体分子的一部分的其它组合物。
如本文所使用的，术语“聚集体”或“高分子量聚集体”或“高分子量杂质”是指所关注的蛋白质的两种或更多种单独分子的寡聚化，包含但不限于蛋白质二聚体、三聚体、四聚体、寡聚物以及其它高分子量物种。
如本文所使用的，术语“电荷变体”或“带电物种”是指具有不同电荷的产物的完全补体。在某些实施例中，此类变体可以包含产物聚集体和/或产物片段，从某种程度上说，此类聚集和/或片段化导致具有如用于所述目的的分析技术中可见的电荷变化的产物。在某些实施例中，此类变体是指具有产生电荷异质性的不同修饰的产物。在单克隆抗体制剂中，带电变体，例如酸性物种或碱性物种可以通过基于带电的分离技术，如等电聚焦(IEF)凝胶电泳、毛细管等电聚焦(cIEF)凝胶电泳、阳离子交换色谱(CEX)和阴离子交换色谱(AEX)来检测。
如本文所使用的，术语“酸性物种”是指蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分的变体，所述变体的特征在于总体酸性电荷。当使用基于IEF的方法分析抗体时，酸性物种是具有较低表观pI的变体。当通过基于色谱的方法分析时，酸性物种和碱性物种基于其相对于主峰的保留时间来定义。酸性物种是早于来自CEX的主峰或晚于来自AEX的主峰洗脱的变体。
抗体的酸性物种可以包含电荷变体、结构变体和/或片段化变体。示例性电荷变体包含但不限于脱酰胺基变体、去岩藻糖基化变体、甲基乙二醛变体、糖基化变体和柠檬酸变体。示例性结构变体包含但不限于糖基化变体和丙酮化变体。示例性片段化变体包含由于肽链解离、酶促和/或化学修饰的来自所关注的蛋白质的任何截短的蛋白质物种，所述截短的蛋白质物种包含但不限于Fc和Fab片段、缺失Fab的片段、缺失重链可变结构域的片段、C末端截短变体、轻链中切除N末端Asp的变体以及具有轻链的N末端截短的变体。其它酸性物种变体还包含含有未配对的二硫醚、宿主细胞蛋白和宿主核酸、色谱材料和培养基组分的变体。
酸性物种可以是产物制备的结果(在本文中被称为“制剂衍生的酸性物种”)或储存的结果(在本文中被称为“储存衍生的酸性物种”)。制剂衍生的酸性物种是在蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分的制备(上游和/或下游处理)期间形成的酸性物种。例如，制剂衍生的酸性物种可以在细胞培养期间形成(“细胞培养物衍生的酸性物种”)。储存衍生的酸性物种是可以或可以不在制备后直接存在于蛋白质群体中，但在样品被储存期间形成或产生的酸性物种。储存衍生的酸性物种的类型和量可以基于样品的调配物而变化。当将制剂储存在特定条件下时，可以部分或完全抑制储存衍生的酸性物种的形成。例如，水性调配物可以在特定温度下储存以部分或完全抑制酸性物种的形成。例如，形成或储存衍生的酸性物种在约2℃与8℃之间储存的水性调配物中可以被部分抑制，并且当在-80℃下储存时被完全抑制。另外，低酸性物种组合物可以被冻干或冷冻干燥，以部分或完全抑制存储衍生的酸性物种的形成。
如本文所使用的，术语“碱性物种”是指蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分的变体，所述变体的特征在于总体碱性电荷。当使用基于IEF的方法分析抗体时，碱性物种是具有更高表观pI的变体。当通过基于色谱的方法分析时，碱性物种是晚于来自CEX的主峰或早于来自AEX的主峰洗脱的变体。
抗体的碱性物种可以包含电荷变体、结构变体和/或片段化变体。导致碱性物种的生成的示例性修饰包含但不限于C末端赖氨酸、N末端谷氨酰胺、天冬氨酸的异构化、琥珀酰亚胺、蛋氨酸氧化、酰胺化、不完全二硫键、前导序列的不完全去除、从丝氨酸到精氨酸的突变、糖基化、片段或聚集体。在一些实施例中，碱性物种是指包括具有一个或两个C末端赖氨酸的重链的抗体或其抗原结合部分。
如本文所使用的，术语“主要物种”是指蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分的形式，所述形式洗脱为色谱图上的主峰，即，在蛋白质的带电变体的分馏期间检测到的大多数物种。例如，在具体实施例中，“主要物种”是指抗GM-CSFRα抗体。在具体实施例中，主要物种是指玛弗利木单抗。
如本文所使用的，术语“过程相关杂质”是指存在于包括蛋白质的组合物中但并非来源于蛋白质自身的杂质。过程相关杂质包含但不限于宿主细胞蛋白(HCP)、宿主细胞核酸，例如，DNA或RNA、色谱材料和培养基组分。期望将过程相关杂质，如宿主细胞蛋白从所得蛋白质产物，例如抗体或其抗原结合部分中去除，使得所得蛋白质产物将提供具有较高效力、较高功效或更佳稳定性的治疗益处，而没有不期望的作用。
如本文所使用的，术语“宿主细胞蛋白”(HCP)旨在指来源于宿主细胞的非靶蛋白相关性蛋白质杂质。
如本文所使用的，术语“粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子受体α亚基(GM-CSFRα)”或“GM-CSFRα”或“GM-CSFRα”是指用于粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的受体的α链。GM-CSFRα也被称为集落刺激因子2受体亚基α；GMR；CD116；CSF2R；SMDP4；CDw116；CSF2RX；CSF2RY；GMCSFR；CSF2RAX；CSF2RAY；αGMR；GMR-α；GMCSFR-α和GM-CSF-R-α。
GM-CSFR是高度保守的细胞因子受体超家族的成员。GM-CSFR包括两个亚基，这导致在一些造血细胞上观察到的GM-CSF的不同亲和力。第一亚基通常被称为α亚基，并且是可以低亲和力自身结合GM-CSF的85Kd蛋白。已描述了GM-CSFRα链的多个其它同种型，一些膜结合以及一些可溶性，然而，所有同种型似乎是在嗜中性粒细胞和巨噬细胞的细胞表面上表达的主要形式(Crosier等人,《英国血液学杂志(Br J Haematol.)》98:540-548(1997))。GM-CSFRα的胞外部分是高度糖基化的。受体具有第二亚基，即f3链，其自身不与GM-CSF结合。相反，当与α链相关时，其结合GM-CSF。GM-CSF通常与成熟GM-CSF受体α链的胞外结构域结合。这种结合可以由抗GM-CSFRα抗体，例如，玛弗利木单抗抑制。
术语“GM-CSFRα”包含人GM-CSFRα，其氨基酸序列可见于例如GenBank登记号NP_006131.2(SEQ ID NO:1)。术语“GM-CSFRα”还包含食蟹猴GM-CSFRα、小鼠GM-CSFRα和大鼠GM-CSFRα。术语“GM-CSFRα”包含GM-CSFRα蛋白或其片段或结构域的野生型、变体或同种型。在某些实施例中，GM-CSFRα蛋白可以与信号肽序列和/或蛋白质标签偶联。
如本文所使用的，术语“玛弗利木单抗”是指被设计以通过靶向GM-CSFRα来调节巨噬细胞活化、分化和存活的人IgG4单克隆抗体(参见PCT公开号WO2007/110631，所述文献的全部内容，包含其中描述的序列通过引用并入本文)。玛弗利木单抗包括包含如SEQ ID NO:2所示的序列的重链以及包含如SEQ ID NO:3所示的序列的轻链。玛弗利木单抗的重链可变区包括如SEQ ID NO:4所示的序列，并且玛弗利木单抗的轻链可变区包括如SEQ ID NO:5所示的序列。玛弗利木单抗的重链可变区包括具有如SEQ ID NO:6所示的序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:7所示的序列的CDR2以及具有如SEQ ID NO:8所示的序列的CDR3。玛弗利木单抗的轻链可变区包括具有如SEQ ID NO:9所示的序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:10所示的序列的CDR2以及具有如SEQ ID NO:11所示的序列的CDR3。
如本文所使用的，术语“GM-CSFRα相关疾病或病症”旨在包含其中患有所述病症的受试者中的GM-CSFRα的存在已示出或怀疑对所述病症的病理生理或导致所述病症恶化的因素负责的疾病和其它病症。因此，GM-CSFRα相关病症是其中GM-CSFRα活性的抑制预期缓解病症的症状和/或进展的病症。由于GM-CSF与GM-CSFRα特异性结合，因此GM-CSF的病理和/或症状效果也可以通过抑制GM-CSF与GM-CSFRα的结合来抵消，并且因此，如本文所使用的，与GM-CSF有关的任何疾病或病症也涵盖在“GM-CSFRα相关病症”的定义内。因此，“GM-CSFRα相关病症”可以例如通过在患有所述病症的受试者的生物流体中GM-CSFRα和/或GM-CSF的浓度增加(例如，受试者的血清、血浆、滑液等中的GM-CSFRα和/或GM-CSF的浓度增加)来证明，这可以例如使用抗GM-CSFRα抗体或抗GM-CSF抗体进行检测。
存在GM-CSFRα相关疾病或病症的许多实例。在一个实施例中，GM-CSFRα相关疾病或病症是自身免疫性病症。在一个实施例中，所述自身免疫性病症选自由以下组成的组：类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、青少年先天性关节炎(juvenile idiopathicarthritis)、类风湿性脊柱炎(rheumatoid spondylitis)、强直性脊柱炎(ankylosingspondylitis)、银屑病(psoriasis)、骨关节炎(osteoarthritis)、痛风性关节炎(goutyarthritis)、过敏、多发性硬化(multiple sclerosis)、银屑病关节炎(psoriaticarthritis)、自身免疫性糖尿病(autoimmune diabetes)、自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis)、肾病综合征(nephrotic syndrome)、青少年类风湿性关节炎(juvenile rheumatoid arthritis)、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、活动性轴向脊柱炎(active axial spondyloarthritis，活性axSpA)以及非放射学中轴型脊柱炎(non-radiographic axial spondyloarthritis，nr-axSpA)。在具体实施例中，GM-CSFRα相关疾病或病症是类风湿性关节炎。在另一个实施例中，GM-CSFRα相关疾病或病症是巨细胞动脉炎(GCA)。在另一个实施例中，GM-CSFRα相关疾病或病症是2019冠状病毒病(COVID-19)。下文进一步详细论述使用本发明的方法获得的GM-CSFRα抗体和抗体部分用于治疗特定病症的用途。
如本文所使用的，术语“上游过程技术”在蛋白质，例如抗体、制剂的情况下是指涉及从细胞产生和收集蛋白质(例如抗体)的活动(例如，在从细胞培养产生所关注的蛋白质期间)。如本文所使用的，术语“细胞培养”是指用于产生和维持能够产生所关注的重组蛋白的宿主细胞的群体的方法，以及用于优化所关注的蛋白质的产生和收集的方法和技术。例如，一旦表达载体已掺入适当的宿主内，宿主就可以在适合于表达相关核苷酸编码序列以及所期望的重组蛋白的收集和纯化的条件下维持。
当使用本发明的细胞培养技术时，所关注的蛋白质可以在细胞内、在周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。在其中所关注的蛋白质在细胞内产生的实施例中，颗粒碎片、宿主细胞或裂解细胞(例如，由均质化产生)可以通过多种手段，包含但不限于离心或超滤进行去除。当所关注的蛋白质分泌到培养基中时，首先可以使用商购可得的蛋白质浓缩过滤器来浓缩来自此类表达系统的上清液。
如本文所使用的，术语“下游过程技术”是指在上游过程技术之后用于纯化所关注的蛋白质，例如抗体的一种或多种技术。例如，下游过程技术包含使用例如亲和色谱纯化蛋白质产物，所述亲和色谱包含蛋白A亲和色谱、离子交换色谱，如阴离子或阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱、混合模式或多模式色谱或置换色谱。
短语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)包含其中已引入重组表达载体的细胞。应当理解，此类术语旨在不仅指特定的受试者细胞，而且还指此类细胞的后代。因为可能由于突变或环境影响而在后续代中发生某些修饰，所以此类后代实际上可能会与亲本细胞不相同，但仍包含在如本文所使用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所使用的，术语“重组蛋白”是指由于在已引入到宿主细胞中的重组表达载体上携带的基因的转录和翻译而产生的蛋白质。在某些实施例中，重组蛋白是抗体，例如，嵌合、人源化或完全人抗体。在某些实施例中，重组蛋白是选自由以下组成的组的同种型的抗体：IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。在某些实施例中，抗体分子是全长抗体(例如，IgG1或IgG4免疫球蛋白)，或者可替代地抗体可以是片段(例如，Fc片段或Fab片段)。
II.本发明的组合物
本发明提供了包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物。所述组合物包括所关注的蛋白质，具有水平降低的变体和/或杂质，例如产物相关物质，例如蛋白质聚集体、半抗体、片段或带电物种，例如酸性物种或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白。
在一些实施例中，所述组合物包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)，具有水平降低的半抗体，其中所述组合物包括小于约25％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3.9％、约3.8％、约3.7％、约3.6％、约3.5％、约3.4％、约3.3％、约3.2％、约3.1％、约3％、约2.9％、约2.8％、约2.7％、约2.6％、约2.5％、约2.4％、约2.3％、约2.2％、约2.1％、约2％、约1.9％、约1.8％、约1.7％、约1.6％、约1.5％、约1.4％、约1.3％、约1.2％、约1.1％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括小于约20％的半抗体。在一些实施例中，所述组合物包括小于约18％。在一些实施例中，所述组合物包括小于约2.8％的半抗体。在一些实施例中，所述组合物包括小于约1.7％。
在一些实施例中，所述组合物包括约0.1-25％、0.1-20％、约0.1-18％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约0.6-1.7％的半抗体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括小于约2.8％的半抗体以及以下中的至少一种：a)约11-38％的酸性物种；b)约9-41％的碱性物种；c)约46-67％的主要物种；d)所关注的蛋白质的约0.04-0.8％的聚集体；e)所关注的蛋白质的约98-99.9％的单体；f)所关注的蛋白质的约0.4-1.5％的片段或g)约0.1-8ppm的宿主细胞蛋白。
在一些实施例中，所述组合物包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)，具有水平降低的酸性物种，其中所述组合物包括小于约40％、约39％、约38％、大约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括小于约40％的酸性物种。在一些实施例中，所述组合物包括小于约20％的酸性物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约12-20％的酸性物种。在一些实施例中，所述组合物包括约11-22％的酸性物种。在一些实施例中，所述组合物包括约18-40％的酸性物种。在其它实施例中，组合物约9-18％、10-17％或11-16％的酸性物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括约9-18％的酸性物种，以及以下中的至少一种：a)约0.6-18％的半抗体；b)约9-41％的碱性物种；c)约46-67％的主要物种；d)所关注的蛋白质的约0.04-0.8％的聚集体；e)所关注的蛋白质的约98-99.9％的单体；f)所关注的蛋白质的约0.4-1.5％的片段或g)约0.1-8ppm的宿主细胞蛋白。
在具体实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括约9-18％的酸性物种以及约9-41％的碱性物种。在另一个具体实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括约9-18％的酸性物种以及约46-67％的主要物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括小于约45％、约44％、约43％、约42％、约41％、约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括小于45％的碱性物种。在一些实施例中，所述组合物包括小于24％的碱性物种。在一些实施例中，所述组合物包括小于23％的碱性物种。在一些实施例中，所述组合物包括小于20％的碱性物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括约1-45％、约1-40％、约1-35％、约1-25％、约5-35％、约10-35％、约15-35％、约1-30％、约1-25％、约1-24％、约5-25％、约5-30％、约5-45％、约10-25％、约10-30％、约10-40％、约15-25％、约15-30％、约15-35％、约15-25％、约16-31％、约17-26％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约17-26％的碱性物种。在一些实施例中，所述组合物包括约16-41％的碱性物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括小于约24％的碱性物种，以及以下中的至少一种：a)约0.6-18％的半抗体；b)约11-38％的酸性物种；c)约46-67％的主要物种；d)所关注的蛋白质的约0.04-0.8％的聚集体；e)所关注的蛋白质的约98-99.9％的单体；f)所关注的蛋白质的约0.4-1.5％的片段或g)约0.1-8ppm的宿主细胞蛋白。
在具体实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括小于约24％的碱性物种以及约11-38％的酸性物种。在另一个具体实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括小于约24％的碱性物种以及约46-67％的主要物种。
在一些实施例中，所述组合物包括大于约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的主要物种，例如，抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)，并且范围在前述中的一种或多种内。在具体实施例中，所述组合物包括大于64％的主要物种。在另一个实施例中，所述组合物包括大于65％的主要物种。在一些实施例中，所述组合物包括大于40％的主要物种。
在一些实施例中，所述组合物包括约40-99％、约45-99％、约50-99％、约55-99％、约50-90％、约55-90％、约50-80％、约55-80％、约50-70％、约55-70％、约50-65％、约55-65％、约58-63％、约58-62％、约59-61％、约58-67％、约53-61％、约46-67％或约46-66％的主要物种，例如，抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约58-67％的主要物种。在一些实施例中，所述组合物包括约46-67％的主要物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括大于约64％的主要物种，以及以下中的至少一种：a)约0.6-18％的半抗体；b)约11-38％的酸性物种；c)约9-41％的碱性物种；d)所关注的蛋白质的约0.04-0.8％的聚集体；e)所关注的蛋白质的约98-99.9％的单体；f)所关注的蛋白质的约0.4-1.5％的片段或g)约0.1-8ppm的宿主细胞蛋白。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括约58-62％的主要物种，以及以下中的至少一种：a)约0.6-18％的半抗体；b)约11-38％的酸性物种；c)约9-41％的碱性物种；d)所关注的蛋白质的约0.04-0.8％的聚集体；e)所关注的蛋白质的约98-99.9％的单体；f)所关注的蛋白质的约0.4-1.5％的片段或g)约0.1-8ppm的宿主细胞蛋白。
在具体实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括大于约64％的主要物种以及约11-38％的酸性物种。在另一个具体实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括大于约64％的主要物种以及约9-41％的碱性物种。
在又一个实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括约58-62％的主要物种以及约11％-38％的酸性物种。在又一个另外的实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括约58-62％的主要物种以及约9-41％的碱性物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括小于约10％的高分子量聚集体。在一些实施例中，所述组合物包括小于约0.5％的高分子量聚集体。在一些实施例中，所述组合物包括小于约0.4％的高分子量聚集体。在另外的实施例中，所述组合物包括小于约0.3％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括约0.01-10％、约0.01-5％、约0.01-1％、约0.01-0.4％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约0.5-0.8％的高分子量聚集体。在一些实施例中，所述组合物包括约0.01-0.4％的高分子量聚集体。在一些实施例中，所述组合物包括约0.04-0.8％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括所关注的蛋白质的小于约0.5的聚集体，以及以下中的至少一种：a)约0.6-18％的半抗体；b)约11-38％的酸性物种；c)约9-41％的碱性物种；d)约46-67％的主要物种；e)所关注的蛋白质的约98-99.9％的单体；f)所关注的蛋白质的约0.4-1.5％的片段；以及g)约0.1-8ppm的宿主细胞蛋白。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％的蛋白质片段，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括所关注的蛋白质的小于约10％的片段。在一些实施例中，所述组合物包括所关注的蛋白质的小于0.4％的片段。在一些实施例中，所述组合物包括所关注的蛋白质的小于0.3％的片段。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.5-1.5％、约0.6-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的蛋白质片段，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约0.5-1.5％的蛋白质片段。在一些实施例中，所述组合物包括约0.6-1.5％的蛋白质片段。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括所关注的蛋白质的小于约0.4％的片段，以及以下中的至少一种：a)约0.6-18％的半抗体；b)约11-38％的酸性物种；c)约9-41％的碱性物种；d)约46-67％的主要物种；e)所关注的蛋白质的约0.04-0.8％的聚集体；f)所关注的蛋白质的约98-99.9％的单体或g)约0.1-8ppm的宿主细胞蛋白。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括所述所关注的蛋白质的大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的单体，例如，抗体单体。在一些实施例中，所述组合物包括大于约90％的单体，例如，抗体单体。在一些实施例中，所述组合物包括大于约99.1％的单体，例如，抗体单体。
在一些实施例中，所述组合物包括所述所关注的蛋白质的约90-99.9％、约90-95％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体。在一些实施例中，所述组合物包括约98-99％的单体。在一些实施例中，所述组合物包括约98-99.9％的单体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括所述所关注的蛋白质的大于约99.1％的单体，以及以下中的至少一种：a)约0.6-18％的半抗体；b)约11-38％的酸性物种；c)约9-41％的碱性物种；d)约46-67％的主要物种；e)所关注的蛋白质的约0.04-0.8％的聚集体；f)所关注的蛋白质的约0.4-1.5％的片段或g)约0.1-8ppm的宿主细胞蛋白。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的宿主细胞蛋白，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括小于约10ppm的HCP。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物包括小于约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约1-3、约0.1-2、约0.1-3、约2-8或约0.1-8ppm的HCP，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约0.1-2个HCP。
本发明的组合物中的蛋白质包括抗体或其抗原结合部分。例如，抗体或其抗原结合部分可以是抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，如玛弗利木单抗，或其抗原结合部分。在本实施例的一方面，抗体或其抗原结合部分包括包含如SEQ ID NO:2所示的序列的重链以及包含如SEQ ID NO:3所示的序列的轻链。在本实施例的一方面，抗体或其抗原结合部分包括包含如SEQ ID NO:4所示的序列的重链可变区以及包含如SEQ ID NO:5所示的序列的轻链可变区。在本实施例的另一方面，抗体或其抗原结合部分包括包含具有如SEQ ID NO:6所示的序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:7所示的序列的CDR2以及具有如SEQ ID NO:8所示的序列的CDR3的重链可变区。在本实施例的另一方面，抗体或其抗原结合部分包括包含具有如SEQ ID NO:9所示的序列的CDR1、具有如SEQ ID NO:10所示的序列的CDR2以及具有如SEQID NO:11所示的序列的CDR3的轻链可变区。
在一些实施例中，本发明的组合物包括包含抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分的洗脱液级分，其中所述洗脱液级分从色谱树脂收集，所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换或混合模式色谱步骤之后收集的洗脱液级分包括小于约25％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3.9％、约3.8％、约3.7％、约3.6％、约3.5％、约3.4％、约3.3％、约3.2％、约3.1％、约3％、约2.9％、约2.8％、约2.7％、约2.6％、约2.5％、约2.4％、约2.3％、约2.2％、约2.1％、约2％、约1.9％、约1.8％、约1.7％、约1.6％、约1.5％、约1.4％、约1.3％、约1.2％、约1.1％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括小于20％的半抗体。在一些实施例中，洗脱液级分包括小于18％的半抗体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换或混合模式色谱步骤之后收集的洗脱液级分包括约0.1-25％、0.1-20％、约0.1-18％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.6-18％或约1-17％的半抗体。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.6-18％的半抗体。在一些实施例中，所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包括约1-17％的半抗体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换、阴离子交换或混合模式色谱步骤之后收集的洗脱液级分包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括小于约40％的酸性物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换、阴离子交换或混合模式色谱步骤之后收集的洗脱液级分包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约14-28％、约11-22％、约11-38％或约12-38％的酸性物种。
在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约14-28％的酸性物种。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约11-22％的酸性物种。在一些实施例中，所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包括约12-38％的酸性物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换、阴离子交换或混合模式色谱步骤之后收集的洗脱液级分包括小于约45％、约44％、约43％、约42％、约41％、约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括小于约45％的碱性物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换、阴离子交换或混合模式色谱步骤之后收集的洗脱液级分包括约1-45％、约1-40％、约1-35％、约1-25％、约5-35％、约10-35％、约15-35％、约1-30％、约1-25％、约1-24％、约5-25％、约5-30％、约5-45％、约10-25％、约10-30％、约10-40％、约15-25％、约15-30％、约15-35％、约15-25％、约16-31％、约17-26％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约15-25％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约15-25％的碱性物种。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约16-41％的碱性物种。在一些实施例中，所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包括约9-29％的碱性物种。
在一些实施例中，包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分(如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换、阴离子交换或混合模式色谱步骤之后收集的洗脱液级分包括大于约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的主要物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括大于40％的主要物种。
在一些实施例中，包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分(如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换、阴离子交换或混合模式色谱步骤之后收集的洗脱液级分包括约40-99％、约45-99％、约50-99％、约55-99％、约50-90％、约55-90％、约50-80％、约55-80％、约50-70％、约55-70％、约50-65％、约55-65％、约58-62％、约59-61％、约58-63％、约58-67％、约53-61％、约46-67％或约46-66％的主要物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分(如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换、阴离子交换或混合模式色谱步骤之后收集的洗脱液级分包括约55-65％、约53-61％或约46-66％的主要物种。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约55-65％的主要物种。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约46-66％的主要物种。在一些实施例中，所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包括约53-61％的主要物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换或阴离子交换步骤之后收集的洗脱液级分包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括小于约10％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换或阴离子交换步骤之后收集的洗脱液级分包括约0.01-10％、约0.01至5％、约0.01至1％、约0.01-0.4％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％的高分子量聚集体。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.1-0.4％的高分子量聚集体。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.04-0.2％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换或阴离子交换步骤之后收集的洗脱液级分包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％或约0.3％的蛋白质片段，例如，抗体片段，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括所关注的蛋白质的小于约10％的片段。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换或阴离子交换步骤之后收集的洗脱液级分包括约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.6-1.5％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的蛋白质片段，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的蛋白质片段。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.4-0.8％的蛋白质片段。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.5-1.1％的蛋白质片段。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换或阴离子交换步骤之后收集的洗脱液级分包括所述所关注的蛋白质的大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的单体，例如，抗体单体。在一些实施例中，洗脱液级分包括大于约90％的单体，例如，抗体单体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换或阴离子交换步骤之后收集的洗脱液级分包括所述所关注的蛋白质的约90-99.9％、约90-95％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体，例如，抗体单体。在一些实施例中，洗脱液级分包括约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体，例如抗体单体。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体，例如抗体单体。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体，例如抗体单体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换或阴离子交换步骤之后收集的洗脱液级分包括小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的宿主细胞蛋白，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括小于10ppm的HCP。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)，例如，在阳离子交换或阴离子交换步骤之后收集的洗脱液级分包括约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约1-3、约0.1-2、约0.1-3、约2-8或约0.1-8ppm的HCP，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约2-8ppm或约0.1-2ppm的HCP。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约2-8ppm的HCP。在一些实施例中，所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.1-2ppm的HCP。
在一些实施例中，本发明的组合物包括来自细胞培养物的澄清收获物，所述细胞培养物包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗。如本文所使用的，术语“澄清收获物”或“澄清细胞培养收获物”是指细胞已从生长培养基中分离出的收获物。澄清过程可以通过离心、微过滤、深度过滤或通过具有不同孔径的膜过滤或其组合来执行，以去除固体，或者其可以包含使用化学添加剂或具有化学相互作用表面的固体材料，以从收获物中提取特定类别的可溶性污染物。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括小于约25％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3.9％、约3.8％、约3.7％、约3.6％、约3.5％、约3.4％、约3.3％、约3.2％、约3.1％、约3％、约2.9％、约2.8％、约2.7％、约2.6％、约2.5％、约2.4％、约2.3％、约2.2％、约2.1％、约2％、约1.9％、约1.8％、约1.7％、约1.6％、约1.5％、约1.4％、约1.3％、约1.2％、约1.1％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括小于25％的半抗体。在一些实施例中，所述澄清收获物包括小于20％的半抗体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括约0.1-25％、0.1-20％、约0.1-18％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括约0.1-25％的半抗体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括小于约40％的酸性物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括约1-40％的酸性物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括小于约45％的碱性物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括约1-40％、约1-35％、约1-25％、约5-35％、约10-35％、约15-35％、约1-30％、约1-25％、约1-24％、约5-25％、约5-30％、约5-45％、约10-25％、约10-30％、约10-40％、约15-25％、约15-30％、约15-35％、约15-25％、约16-31％、约17-26％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括约1-40％的碱性物种。
在一些实施例中，包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分(如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括大于约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的主要物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括大于50％的主要物种。
在一些实施例中，包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分(如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括约40-99％、约45-99％、约50-99％、约55-99％、约50-90％、约55-90％、约50-80％、约55-80％、约50-70％、约55-70％、约50-65％、约55-65％、约58-62％、约59-61％、约58-63％、约58-67％、约53-61％、约46-67％或约46-66％的主要物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括约40-99％的主要物种。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括小于约10％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括约0.01-10％、约0.01至5％、约0.01至1％、约0.01-0.4％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.8％、约0.04-1％、约0.5-0.8％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括约0.01-10％的高分子量聚集体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％或约0.3％的蛋白质片段，例如，抗体片段，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括所关注的蛋白质的小于约10％的片段。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.4-1.5％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.6-1.5％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的蛋白质片段，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括约0.1-10％的蛋白质片段。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括所述所关注的蛋白质的大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的单体，例如，抗体单体。在一些实施例中，所述澄清收获物包括所述所关注的蛋白质的大于约90％的单体，例如，抗体单体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括所述所关注的蛋白质的约90-99.9％、约90-95％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体，例如，抗体单体。在一些实施例中，所述澄清收获物包括所述所关注的蛋白质的约90-99.9％的单体，例如抗体单体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的宿主细胞蛋白，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括小于10ppm的HCP。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分(例如，抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗)的澄清收获物包括约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约1-3、约0.1-2、约0.1-3、约2-8或约0.1-8ppm的HCP，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括约0.1-10ppm的HCP。
在本发明的某些方面，所关注的蛋白质是抗体或其抗原结合部分。可用于本公开的组合物中的抗体或其抗原结合部分可以通过多种技术产生，所述多种技术包含用所关注的抗原对动物进行免疫接种，随后进行常规单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein(1975)《自然》256:495的标准体细胞杂交技术。可以使用体细胞杂交程序。原则上，也可以采用用于产生单克隆抗体的其它技术，包含B淋巴细胞的病毒或致癌转化。
用于制备杂交瘤的一个示例性动物系统是鼠类系统。杂交瘤产生是非常成熟的程序。用于分离用于融合的免疫脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。
本发明的组合物中使用的抗体可以是人、嵌合或人源化抗体。本发明的组合物中使用的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述制备的非人单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从所关注的非人杂交瘤获得，并且经工程化以含有使用标准分子生物学技术的非鼠(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，鼠类可变区可以使用本领域已知的方法与人恒定区连接(参见例如，Cabilly等人的美国专利第4,816,567号)。为了产生人源化抗体，鼠类CDR区可以使用本领域已知的方法插入人框架中(参见例如，Winter的美国专利第5,225,539号以及Queen等人的美国专利第5,530,101号；第5,585,089号；第5,693,762号和第6,180,370号)。
在一个非限制性实施例中，用于本发明的组合物中的抗体是人单克隆抗体。此类人单克隆抗体可以使用携带人免疫系统的部分而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠生成。这些转基因和转染色体小鼠包含在本文中被称为HuMAb(梅达瑞克斯公司(Medarex、Inc.))、KM(梅达瑞克斯公司)和Xeno(安进公司(Amgen))的小鼠。本发明的组合物中使用的抗体或其抗原结合部分也可以使用美国专利第6,090,382号中描述的方法产生，所述美国专利的全部内容特此通过引用并入本文。
此外，表达人免疫球蛋白基因的替代的转染色体动物系统在本领域中是可用的，并且可用于培养本公开的抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体两者的被称为“TC小鼠”的小鼠；此类小鼠描述于Tomizuka等人(2000)《美国国家科学院院刊》97:722-727。此外，本领域中已描述了携带人重链和轻链转染色体的奶牛(例如，Kuroiwa等人(2002)《自然生物技术(Nature Biotechnology)》20:889-894和PCT申请第WO 2002/092812号)，并且可以用于培养本公开的抗体。
待用于本发明的组合物中的重组人抗体可以通过筛选重组组合抗体文库，例如，使用由源自人淋巴细胞的mRNA制备的人VL和VH cDNA制备的scFv噬菌体展示文库来分离。用于制备和筛选此类文库的方法在本领域中是已知的。除了用于生成噬菌体展示文库(例如，法玛西亚(Pharmacia)重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01；以及StratageneSurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)的可商购获得的试剂盒之外，尤其可用于生成和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可见于例如，Ladner等人。美国专利第5,223,409号；Kang等人PCT公开号WO 92/18619；Dower等人PCT公开号WO 91/17271；Winter等人PCT公开号WO 92/20791；Markland等人PCT公开号WO 92/15679；Breitling等人PCT公开号WO 93/01288；McCafferty等人PCT公开号WO 92/01047；Garrard等人PCT公开号WO 92/09690；Fuchs等人(1991)《生物/技术(Bio/Technology)》9:1370-1372；Hay等人(1992)《Hum抗体杂交瘤(Hum Antibody Hybridomas)3:81-85；Huse等人(1989)《科学》246:1275-1281；McCafferty等人,《自然》(1990)348:552-554；Griffiths等人(1993)《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)》12:725-734；Hawkins等人(1992)《分子生物杂志(J Mol Biol)》226:889-896；Clackson等人(1991)《自然》352:624-628；Gram等人(1992)《美国国家科学院院刊(PNAS)》89:3576-3580；Garrard等人(1991)《生物/技术》9:1373-1377；Hoogenboom等人(1991)《核酸研究(Nuc Acid Res)》19:4133-4137；以及Barbas等人(1991)《美国国家科学院院刊》88:7978-7982；所述文献的全部教导内容并入本文。
用于本发明的组合物中的人单克隆抗体也可以使用SCID小鼠制备成其中所述人免疫细胞已重构，使得在免疫后可以生成人抗体应答。此类小鼠描述于例如Wilson等人的美国专利第5,476,996号和第5,698,767号。
在某些实施例中，待用于本发明的组合物中的人抗体是抗GM-CSFRα抗体及其抗体部分、抗GM-CSFRα相关抗体和抗体部分以及与抗GM-CSFRα抗体具有等效特性，如以低解离动力学和高中和能力与GM-CSFRα高亲和力结合的人抗体和抗体部分。在一个实施例中，待用于本发明的组合物中的抗GM-CSFRα抗体与和玛弗利木单抗相同的GM-CSFRα上的表位结合。在另一个实施例中，待用于本发明的组合物中的抗GM-CSFRα抗体在生理条件下竞争性地抑制玛弗利木单抗与GM-CSFRα的结合。在一个实施例中，本发明的组合物包括玛弗利木单抗或其抗原结合部分。
待用于本发明的组合物中的抗体或其抗原结合部分可以被改变，其中所述抗体的恒定区被修饰以减少至少一种相对于未修饰的抗体的恒定区介导的生物效应子功能。为了修饰本发明的抗体，使其表现出与Fc受体的结合减少，免疫球蛋白恒定区可以在Fc受体(FcR)相互作用所必需的特定区域发生突变(参见例如，Canfield和Morrison(1991)《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》173:1483-1491；以及Lund等人(1991)《免疫学杂志(J.ofImmunol.)》147:2657-2662，所述文献的全部教导内容并入本文)。抗体的FcR结合能力的降低还可以减少依赖于FcR相互作用的其它效应子功能，如调理作用和吞噬作用以及抗原依赖性细胞毒性。
III.使用上游过程技术制备组合物
具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如，半抗体、或带电物种，例如酸性或碱性物种；和/或水平降低的过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的包括蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物可以通过在上游蛋白质产生，如细胞培养期间调节条件来产生。在某些实施例中，本发明的组合物包含但不限于具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、或带电物种，例如酸性物种或碱性物种；和/或水平降低的过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，如玛弗利木单抗的组合物。此类变体和/或杂质减少的组合物满足对改进的产物特性，包含但不限于产物稳定性、产物安全性和产物功效的需要。
本发明提供了用于通过以下由细胞培养物产生具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、或带电物种，例如酸性物种或碱性物种；和/或水平降低的过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的制剂的方法：调节细胞培养的条件，例如，通过调节pH水平、CO2水平、细胞培养补充剂的水平和/或来自细胞培养物的乳酸盐或乳酸盐产生水平。
本发明还提供了用于通过以下降低细胞培养物中的所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的变体和/或杂质的水平，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、或带电物种，例如酸性物种或碱性物种的水平；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的水平的方法：调节细胞培养的条件，例如，通过调节pH水平、CO2水平、细胞培养补充剂的水平和/或来自细胞培养物的乳酸盐或乳酸盐产生水平。
此外，本发明提供了用于通过以下增加来自细胞培养物的所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的产率的方法：调节细胞培养物的条件，例如，通过调节pH水平、CO2水平、细胞培养补充剂的水平和/或来自细胞培养物的乳酸盐或乳酸盐产生水平。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于通过以下由细胞培养物制备具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的制剂的方法：在生物反应器中温育所述细胞培养物，并且将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5，例如，约6-7、约6.1-7、约6.2-7、约6.3-7、约6.4-7、约6.5-7、约6.5-7.5、约6.5-7.4、约6.5-7.3、约6.5-7.2、约6.5-7.1、约6.6-7、约6.7-7、约6.75-6.95的pH下，由此制备具有水平降低的酸性物种的包括所述所关注的蛋白质的制剂。
在其它实施例中，本发明提供了一种用于通过以下由细胞培养物制备具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的制剂的方法：在生物反应器中温育所述细胞培养物；以及一个或多个选自由以下组成的组的步骤：(a)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5、约6-7或约6.5-7的pH下；(b)在所述温育时段期间增加细胞培养补充剂的水平；(c)将所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约1g/L下；(d)增加所述细胞培养物中的乳酸盐产生；(e)增加所述细胞培养物中的CO2的水平；和/或(f)降低所述细胞培养物的pH，由此制备具有水平降低的酸性物种的包括所述所关注的蛋白质的制剂。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于通过以下降低细胞培养物中的所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的酸性物种的水平的方法：在生物反应器中温育所述细胞培养物；以及一个或多个选自由以下组成的组的步骤：(a)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5、约6-7或约6.5-7的pH下；(b)在所述温育时段期间增加细胞培养补充剂的水平；(c)将所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约1g/L下；(d)增加所述细胞培养物中的乳酸盐产生；(e)增加所述细胞培养物中的CO2的水平；和/或(f)降低所述细胞培养物的pH，由此降低所述所关注的蛋白质的酸性物种的水平。
在另外的实施例中，本发明提供了一种用于通过以下增加来自细胞培养物的所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的产生产率的方法：在生物反应器中温育所述细胞培养物；以及一个或多个选自由以下组成的组的步骤：(a)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5、约6-7或约6.5-7的pH下；(b)在所述温育时段期间增加细胞培养补充剂的水平；(c)将所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约1g/L下；(d)增加所述细胞培养物中的乳酸盐产生；(e)增加所述细胞培养物中的CO2的水平；和/或(f)降低所述细胞培养物的pH，由此增加所述所关注的蛋白质的所述产生产率。
上游过程技术可以单独使用或与下文第IV节中所描述的以及如实例1中所描述的下游过程技术组合使用。
在一个实施例中，如本文所述，本文描述的一种或多种上游过程技术产生具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、或带电物种，例如酸性或碱性物种；和/或水平降低的过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的包括蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物。
本发明的一些实施例包括培养宿主细胞以在限制由细胞表达的产物相关物质，例如，酸性物种的量的条件下表达所关注的蛋白质。本发明的一些实施例包括在限制产物转化为酸性物种变体的条件下培养宿主细胞。
在某些实施例中，具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物通过在培养物中培养宿主细胞来产生，其中过程参数，如细胞培养物的pH或二氧化碳(CO2)水平被调节以减少由宿主细胞产生的酸性物种的量和/或减少产物转化为酸性物种变体。在其它实施例中，具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物通过在培养物中培养宿主细胞来产生，其中乳酸盐和/或细胞培养补充剂的水平被调节以降低由宿主细胞产生的酸性物种的量和/或产物转化为酸性物种变体。
在一个实施例中，具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物通过在生物反应器中温育表达所关注的蛋白质的细胞，并将细胞培养物的pH维持在约6-7.5的pH下来产生。
在另一个实施例中，具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物通过在生物反应器中温育表达所关注的蛋白质的细胞，并在所述温育时段期间增加细胞培养补充剂的水平来产生。
在仍又一个实施例中，具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物通过在生物反应器中温育表达所关注的蛋白质的细胞，并将细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约1g/L下来产生。
在又一个实施例中，具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物通过在生物反应器中温育表达所关注的蛋白质的细胞，并增加细胞培养物中的乳酸盐产生来产生。
在仍又一个实施例中，具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物通过在生物反应器中温育表达所关注的蛋白质的细胞，并增加细胞培养物中的CO2的水平来产生。
在另一个实施例中，具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物通过在生物反应器中温育表达所关注的蛋白质的细胞，并降低所述细胞培养物的pH来产生。
在另一个实施例中，上述补充剂和修饰中的一种或多种可以组合，并在蛋白质(例如抗体)、组合物的细胞培养期间使用。
为了表达待用于本发明的组合物中的所关注的蛋白质，将编码所述蛋白质的DNA，如编码抗体的部分或全长轻链和重链的DNA插入到一个或多个表达载体中，使得基因可操作地连接至转录和翻译控制序列。(参见例如，美国专利第6,090,382号，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文。)在这种情况下，术语“可操作地连接”旨在意指编码所关注的蛋白质的基因连接在载体内，使得载体内的转录和翻译控制序列服务于其调节基因的转录和翻译的预期功能。选择要与所使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达控制序列。在某些实施例中，所关注的蛋白质将包括多个多肽，例如抗体的重链和轻链。因此，在某些实施例中，编码多个多肽的基因(如抗体轻链基因和抗体重链基因)可以插入到单独的载体中，或者更通常地，所述基因插入到相同的表达载体中。将基因通过标准方法(例如，基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或者如果不存在限制位点，则平末端连接)插入到表达载体中。在插入一个或多个基因之前，表达载体可能已经携带另外的多肽序列，如但不限于抗体恒定区序列。例如，将抗GM-CSFRα抗体或抗GM-CSFRα抗体相关VH和VL序列转换为全长抗体基因的一种方法是将其分别插入已编码重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段可操作地连接到载体内的CH区段，并且VL区段可操作地连接到载体内的CL区段。另外地或可替代地，重组表达载体可以编码促进从宿主细胞分泌蛋白质的信号肽。基因可以被克隆到载体中，使得信号肽被框内连接到基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白蛋白质的信号肽)。
除了蛋白质编码基因之外，重组表达载体还可以携带一个或多个控制宿主细胞中的蛋白质编码基因的表达的调控序列。术语“调控序列”旨在包含控制蛋白质编码基因的转录或翻译的启动子、增强子以及其它表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。此类调控序列描述于，例如，Goeddel；《基因表达技术：酶学方法(Gene Expression Technology:Methodsin Enzymology)》185,加利福尼亚州圣地亚哥的学术出版社(Academic Press,San Diego,CA)(1990)，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文。本领域的技术人员将理解，表达载体的设计，包含调控序列的选择，可能取决于如待转化的宿主细胞的选择、所期望的蛋白质的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的合适的调控序列包含指导哺乳动物细胞中的高水平的蛋白质表达的病毒元件，如来源于巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、Simian病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))以及多瘤的启动子和/或增强子。关于病毒调控元件及其序列的进一步描述，参见例如，Stinski的美国专利第5,168,062号、Bell等人的美国专利第4,510,245号以及Schaffner等人的美国专利第4,968,615号，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文。
重组表达载体还可以携带一个或多个另外的序列，如调节宿主细胞中的载体的复制(例如，复制起源)和/或选择性标记基因的序列。选择性标记基因促进选择其中已引入载体的宿主细胞(参见例如美国专利第4,399,216号、第4,634,665号和第5,179,017号，均由Axel等人撰写，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)。例如，选择性标记基因典型地在其中已引入载体的宿主细胞上赋予对药物，如G418、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤(methotrexate)的抗性。合适的选择性标记基因包含二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于具有甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr宿主细胞)以及新基因(用于G418选择)。
待用于本发明的组合物中的抗体或抗体部分，例如，抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)可以通过宿主细胞中的免疫球蛋白轻链和重链基因的重组表达来制备。为了重组表达抗体，用一个或多个携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得轻链和重链在宿主细胞中表达，并且分泌到在其中培养宿主细胞的培养基中，抗体可以从所述培养基中回收。标准重组DNA方法被用于获得抗体重链和轻链基因，将这些基因掺入到重组表达载体中，并将载体引入宿主细胞中，如Sambrook,Fritsch和Maniatis(编辑),《分子克隆；实验室手册(Molecular Cloning；A Laboratory Manual)》,第二版,纽约的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor,N.Y.),(1989),Ausubel等人(编辑)《分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)》,格林出版协会(Greene Publishing Associates),(1989)和美国专利第4,816,397号和第6,914,128号中描述的那些，所述文献的全部教导内容并入本文。
对于蛋白质，例如，抗体的轻链和重链的表达，编码蛋白质的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-右旋糖酐转染等。尽管理论上有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的蛋白质，但抗体在真核细胞，如哺乳动物宿主细胞中的表达是合适的，因为此类真核细胞，并且具体地哺乳动物细胞，比原核细胞更有可能组装和分泌正确折叠和免疫活性的蛋白质。据报道，蛋白质基因的原核表达对于产生高产率的活性蛋白是无效的(Boss和Wood(1985)《今日免疫学(Immunology Today)》6:12-13，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)。
用于克隆或表达本文中的载体中的DNA的合适的宿主细胞是上述原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。用于此目的的合适的原核生物包含真细菌类，如革兰氏阴性或革兰阳性生物，例如，肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如，大肠杆菌(E.coli)；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如，粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescans)；和志贺氏杆菌属(Shigella)；以及芽孢杆菌纲(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，1989年4月12日出版的DD 266,710中公开的地衣芽孢杆菌41P)；假单胞杆菌属，如绿假单胞杆菌(P.aeruginosa)；以及链霉菌属(Streptomyces)。一种合适的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC 31,446)，但是其它菌株，如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)是合适的。这些实例是说明性而非限制性的。
除了原核生物之外，真核微生物，如丝状真菌(filamentous fungi)或酵母是用于多肽编码载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而许多其它基因、物种和菌株在本文中是通常可用且有用的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pockbe)；克鲁维酵母菌属宿主(Kluyveromyce)，例如，乳酸克鲁维酵母(K.Lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、沃特克克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；念珠菌属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌，例如，脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉菌属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉菌(A.niger)。
用于表达糖基化蛋白，例如糖基化抗体的合适的宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎细胞的实例包含植物和昆虫细胞。已鉴定多种杆状病毒株和变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞，所述许可性昆虫宿主细胞来自于如以下等宿主：草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。多种用于转染的病毒菌株是可公开获得的，例如，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5菌株，并且此类病毒可以根据本发明用作本文中的病毒，具体地用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
哺乳动物细胞可用于表达和产生本发明的组合物中使用的重组蛋白，然而其它真核细胞类型也可以用于本发明的上下文中。参见例如，Winnacker,《从基因到克隆(FromGenes to Clones),纽约的纽约VCH出版社(VCH Publishers,N.Y.,N.Y.)(1987)。用于表达根据本发明的重组蛋白的合适的哺乳动物宿主细胞包含中国仓鼠卵巢(Chinese HamsterOvary，CHO细胞)(包含dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和Chasin,(1980)《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》77:4216-4220，与DHFR选择性标记一起使用，例如，如Kaufman和Sharp(1982)《分子生物学(Mol.Biol.)》159:601-621中所述，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当将编码蛋白质基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养持续足以允许抗体在宿主细胞中表达或将抗体分泌到其中生长宿主细胞的培养基中的时间段来产生抗体。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是由SV40(COS-7、ATCC CRL 1651)转化的猴肾CV1系；人胚肾系(针对悬浮培养物中的生长亚克隆的293或293细胞，Graham等人,《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》36:59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》77:4216(1980))；小鼠塞尔托利氏细胞(mouse sertoli cell)(TM4,Mather,《生殖生物学(Biol.Reprod.)》23:243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76、ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA、ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK、ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A、ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138、ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2、HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562、ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,《纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)》383:44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；以及人肝瘤细胞系(Hep G2)，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文。
将宿主细胞用上述表达或克隆载体转化以用于蛋白质产生，并且在常规营养培养基中进行培养，所述常规营养培养基适当地修饰以诱导启动子、选择转化体或扩增编码所需序列的基因。
用于产生蛋白质的宿主细胞可以在多种培养基中培养。可商购获得的培养基，如Ham's F10TM(西格玛(Sigma))、Minimal Essential MediumTM(MEM)，(西格玛)、RPMI-1640(西格玛)和Dulbecco's Modified Eagle's MediumTM(DMEM)，(西格玛)合适用于培养宿主细胞。另外，在以下文献中描述的培养基中的任何培养基都可以用作用于宿主细胞的培养基：Ham等人,《酶学方法(Meth.Enz.)》58:44(1979)，Barnes等人,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》102:255(1980)，美国专利第4,767,704号；第4,657,866号；第4,927,762号；第4,560,655号；或第5,122,469号；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利第Re.30,985号，所述文献的全部教导内容通过引用并入本文。这些培养基中的任何培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸酯)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素(gentamycin)药物)、微量元素(定义为通常以在微摩尔范围内的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。还可以包含以本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必要补充剂。培养条件(如温度、pH等)是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，并且对于普通技术人员来说将是显而易见的。
宿主细胞还可以用于产生完整蛋白质，例如抗体的部分，包含Fab片段或scFv分子。应理解，上述程序的变化在本发明的范围内。例如，在某些实施例中，可能期望用编码抗体的轻链或重链(但不是两者)的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术还可以用于去除编码轻链和重链中的一者或两者的对于与抗原结合不是必需的一些或全部DNA。由此类截短的DNA分子表达的分子也涵盖于本发明的抗体。另外，双官能抗体可以通过标准化学交联方法将本发明的抗体与第二抗体交联来产生，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，并且另一条重链和轻链对于除了靶抗体以外的抗原具有特异性，这取决于本发明的抗体的特异性。
在用于蛋白质，例如，抗体或其抗原结合部分的重组表达的合适系统中，通过磷酸钙介导的转染将编码蛋白质，例如，抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体引入到dhfr-CHO细胞中。在重组表达载体内，蛋白质基因各自可操作地连接到CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，这允许选择已使用甲氨蝶呤选择/扩增用载体转染的CHO细胞。培养所选的转化体宿主细胞以允许表达蛋白质，例如，抗体重链和轻链，并且从培养基中回收完整的蛋白质，例如，抗体。标准分子生物学技术用于制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收蛋白质。
当使用重组技术时，蛋白质，例如，抗体或其抗原结合片段，可以在细胞内产生、在周质空间中产生或直接分泌到培养基中。对于在细胞内制备的抗体，纯化过程的第一步通常涉及：细胞的裂解，这可以通过多种方法，包含机械剪切、渗透休克或酶促治疗来完成。这种断裂将细胞的全部内容物释放到匀浆中，并且另外产生由于其小尺寸而难以去除的亚细胞片段。这些通常通过差速离心或通过过滤去除。在分泌抗体的情况下，将来自此类表达系统的上清液通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器进行浓缩。在抗体分泌到培养基中的情况下，重组宿主细胞也可以从细胞培养基分离，例如，通过切向流过滤。抗体可以使用本发明的抗体纯化方法从培养基进一步回收。
控制pH水平以调节酸性物种
在某些实施例中，细胞培养物的pH水平被控制(例如增加或降低)，以便产生具有所需水平的变体和/或杂质，例如水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物。例如，pH可以被降低，以便实现所期望的pH，例如，介于约6-7.5之间。可替代地，pH可以维持在所期望的pH，例如，介于约6-7.5之间。
在某些实施例中，细胞培养物的pH降低到或维持在约6、6.05、6.1、6.15、6.2、6.25、6.3、6.35、6.4、6.45、6.5、6.55、6.6、6.65、6.7、6.75、6.8、6.85、6.9、6.95、7、7.05、7.1、7.15、7.2、7.25、7.3、7.35、7.4、7.45或7.5下。在一些实施例中，细胞培养物的pH维持在约6-7.5，例如约6-7、约6.1-7、约6.2-7、约6.3-7、约6.4-7、约6.5-7、约6.5-7.5、约6.5-7.4、约6.5-7.3、约6.5-7.2、约6.5-7.1、约6.6-7、约6.7-7、约6.75-6.9或约6.75-6.95下。
pH以这种方式维持以产生具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，其中所述组合物包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约11-19％、约11-16％、约12-20％、约12-38％、约13-19％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且在前述酸性物种中的一种或多种内变化，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，所述组合物包括来自细胞培养物的澄清收获物，其中所述澄清收获物包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约11-19％、约11-16％、约12-20％、约12-38％、约13-19％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且在前述酸性物种中的一种或多种内变化，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，pH以这种方式维持以将蛋白质或抗体组合物中的酸性物种的量减少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，pH增加或降低以便增加或降低酸性物种的量和/或此类酸性物种形成的速率。在一些实施例中，细胞培养物的pH，最初在介于约6.5-7.0之间，降低介于约0.01-0.5、约0.02-0.4、约0.05-0.3或约0.1-0.5、约0.1-0.4、约0.1-0.3或约0.1-0.2之间。例如，但并非限制于，如以下实例1中所详述的，pH从约6.9至约6.75的降低可以用于在细胞培养期间降低酸性物种以及在澄清收获物的背景下降低酸性物种形成的速率。
在某些实施例中，在温育时段间的不同时间点调节细胞培养物的pH。例如，但不限于，细胞培养物的pH的增加或降低可以在较早的时间点，例如在温育时段期间的第1、2、3、4、5、6、7、8、9天或第10天，或在较晚的时间点，例如在温育时段的最后三天、最后两天或最后一天发生。细胞培养pH可以在整个温育时段被改变，例如增加或减少多次，例如在温育时段期间一次、两次或三次，以便实现组合物中的酸性物种的所期望的水平。
在一些实施例中，在温育时段的第2天-第8天期间，例如第2、3、4、5、6、7、8天，细胞培养物的pH，最初在约6.5-7.0下，降低了约0.01-0.5、约0.02-0.4、约0.05-0.3、约0.1-0.5、约0.1-0.4、约0.1-0.3或约0.1-0.2。在一些实施例中，在温育时段期间的第4天或第5天，细胞培养物的pH，最初在约6.5-7.0下，降低了介于约0.01-0.5、约0.02-0.4、约0.05-0.3或约0.1-0.5、约0.1-0.4、约0.1-0.3或约0.1-0.2之间。
在一些实施例中，pH转变在温育时段期间的第4天发生，其中细胞培养物的pH从6.9降至6.75。在其它实施例中，pH转变在温育时段期间的第5天发生，其中细胞培养物的pH从6.9降至6.75。在另一个实施例中，pH转变在温育时段期间的第4天发生，其中细胞培养物的pH从6.9降至6.65。在又一个实施例中，pH转变在温育时段期间的第5天发生，其中细胞培养物的pH从6.9降至6.65。在多个实施例中，pH的降低通过增加细胞培养物的CO2水平，或通过增加细胞培养物的乳酸盐水平(例如，通过增加在第3天、第4天、第5天或第6天添加到细胞培养物的细胞培养基进料的量)或其组合来实现。在某些实施例中，具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的酸性物种的本发明的组合物可以通过维持表达如本文所述的所关注的蛋白质的细胞培养物的pH以及选择合适的温度或温度转变策略，例如，但不限于，增加或降低操作的过程温度、温度转变到较低温度或较高温度或在较早培养时间点的温度转变，由细胞培养物产生。这些培养条件可用于各种培养方法中，所述各种培养方法包含但不限于分批、分批进料、恒化器和灌注，并且与各种细胞培养设备一起使用，所述各种细胞培养设备包含但不限于适当搅动或未适当搅动的摇瓶、旋转瓶、搅拌生物反应器、空气输送生物反应器、膜生物反应器、具有保留在固相载体上或固定/包埋在如微孔珠中的细胞的反应器，以及适用于所期望的细胞系的最佳生长和产生率的任何其它配置。
调节pH和/或温度的这些方法还可以与调节CO2水平的方法、调节细胞培养物中的乳酸盐水平或来自细胞培养物的乳酸盐产生或用添加剂，如一种或多种细胞培养补充剂(培养基进料)补充培养基的方法或其组合进行组合使用，如下文所述，以维持或实现所期望水平的酸性物种或减少细胞培养期间的酸性物种的形成。
调整CO2水平以调节酸性物种
在某些实施例中，细胞培养物的CO2水平被调节(例如增加或降低)，以便产生具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物(参见以下实例节)。此类调整包含增加细胞培养物的CO2水平和/或将细胞培养物的CO2水平维持在约1-20％下。高水平的CO2通常被认为是细胞培养的不合需要的条件。然而，本发明的发明人已经出人意料地发现，通过增加本发明的方法中的细胞培养物中的CO2的水平，这反过来导致细胞培养物pH降低，实现了蛋白质产物，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)中的酸性物种的水平的显著降低。
在某些实施例中，细胞培养物的CO2水平维持在约0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％下。在某些实施例中，细胞培养物的CO2水平维持在约0.1-10％、0.1-0.5％、0.1-5％、1-10％、2-9％、3-8％、4-7％、5-8％、4-9％或1-5％下，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，细胞培养物的pCO2水平维持在约200mmHg、约190mmHg、约180mmHg、约170mmHg、约160mmHg、约150mmHg、140mmHg、130mmHg、120mmHg、110mmHg、100mmHg、90mmHg、85mmHg、80mmHg、75mmHg、70mmHg、65mmHg、60mmHg、55mmHg、50mmHg、45mmHg、40mmHg、35mmHg、30mmHg、25mmHg、20mmHg、15mmHg、10mmHg或5mmHg下。在一些实施例中，细胞培养物的pCO2水平维持在约5-200mmHg、约10-190mmHg、约15-180mmHg、约20-170mmHg、约25-160mmHg、约30-150mmHg、约35-140mmHg、约40-130mmHg、约45-120mmHg、约50-110mmHg、约5-100mmHg、约10-110mmHg、约20-120mmHg、约30-130mmHg、约40-140mmHg、约50-150mmHg、约60-160mmHg、约70-170mmHg、约80-180mmHg、约90-190mmHg或约100-200mmHg下。
细胞培养物的CO2水平以这种方式维持以产生具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，其中所述组合物包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约11-19％、约11-16％、约12-20％、约12-38％、约13-19％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，所述组合物包括来自细胞培养物的澄清收获物，其中所述澄清收获物包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约11-19％、约11-16％、约12-20％、约12-38％、约13-19％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且在前述酸性物种中的一种或多种内变化，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，细胞培养物的CO2水平以这种方式维持以将蛋白质或抗体组合物中的酸性物种的量减少约1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,100％，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，细胞培养物的CO2水平增加或减少，以便增加或减少酸性物种的量和/或此类酸性物种形成的速率。在一些实施例中，细胞培养物的百分比CO2水平增加了约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9或10，以便减少酸性物种的量和/或此类酸性物种形成的速率。例如，细胞培养物的百分比CO2水平从3％增加了0.5到3.5％，以便减少酸性物种的量或速率。
在某些实施例中，pH通过增加或降低细胞培养物的CO2水平来增加或降低，以便增加或降低酸性物种的量和/或此类酸性物种形成的速率。在一些实施例中，细胞培养物的CO2水平增加，以便将细胞培养物的pH，最初在介于约6.5-7.0之间，降低介于约0.01-0.5、约0.02-0.4、约0.05-0.3或约0.1-0.5、约0.1-0.4、约0.1-0.3或约0.1-0.2之间。在另一个实施例中，细胞培养物的CO2水平增加，以将pH从约6.9降低至约6.75，其中在澄清收获物的背景下，在细胞培养期间产生的酸性物种的量和酸性物种形成的速率降低。
在某些实施例中，细胞培养物的CO2水平在温育时段间的不同时间点进行调节。例如，但不限于，细胞培养物的CO2水平的增加或降低可以在较早的时间点，例如在温育或生产时段期间的第1、2、3、4、5、6、7、8、9天或第10天，或在较晚的时间点，例如在温育或生产时段的最后三天、最后两天或最后一天发生。细胞培养物CO2水平可以在整个温育或生产时段被改变，例如增加或减少多次，例如在温育时段期间一次、两次或三次，以便实现组合物中的酸性物种的所期望的水平。
在某些实施例中，如上所述，具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的酸性物种的本发明的组合物可以通过维持表达如本文所述的所关注的蛋白质的细胞培养物的CO2水平以及选择合适的pH或pH转变策略和/或合适的温度或温度转变策略，由细胞培养物产生。这些培养条件可用于各种培养方法中，所述各种培养方法包含但不限于分批、分批进料、恒化器和灌注，并且与各种细胞培养设备一起使用，所述各种细胞培养设备包含但不限于适当搅动或未适当搅动的摇瓶、旋转瓶、搅拌生物反应器、空气输送生物反应器、膜生物反应器、具有保留在固相载体上或固定/包埋在如微孔珠中的细胞的反应器，以及适用于所期望的细胞系的最佳生长和产生率的任何其它配置。
调节CO2水平的这些方法还可以与调节pH和/或温度的方法、调节细胞培养物中的乳酸盐水平或来自细胞培养物的乳酸盐产生或用添加剂，如一种或多种细胞培养补充剂补充培养基的方法或其组合进行组合使用，如本文所述，以维持或实现所期望水平的酸性物种或减少细胞培养期间的酸性物种的形成。
调整乳酸盐水平以调节酸性物种
在某些实施例中，细胞培养物的乳酸盐水平被调节(例如增加或降低)，以便产生具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物(参见以下实例节)。这种调整包含增加细胞培养物中的乳酸盐水平和/或将细胞培养物的乳酸盐水平维持在某一水平，例如约0.1-5g/L下。高水平的乳酸盐和/或较低的pH通常被认为是细胞培养不期望的。然而，本发明的发明人已经出人意料地发现，通过增加本发明的方法中的细胞培养物中的乳酸盐的水平，这反过来导致细胞培养物pH降低，实现了蛋白质产物，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)中的酸性物种的水平的显著降低。
在某些实施例中，细胞培养物的乳酸盐水平维持在约0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L、0.7g/L、0.8g/L、0.9g/L、1g/L、1.1g/L、1.2g/L、1.3g/L、1.4g/L、1.5g/L、1.6g/L、1.7g/L、1.8g/L、1.9g/L、2g/L、2.1g/L、2.2g/L、2.3g/L、2.4g/L、2.5g/L、2.6g/L、2.7g/L、2.8g/L、2.9g/L、3g/L、4g/L或5g/L下。在某些实施例中，细胞培养物的乳酸盐水平维持在约0.1-5g/L、约0.1-4g/L、约0.1-3g/L、约0.1-2g/L、约0.2-2g/L、约0.3-2g/L、约0.4-2g/L、约0.5-2g/L、约0.6-2g/L、约0.7-2g/L、约0.8-2g/L、约0.9-2g/L、约0.1-1.9、约0.2-1.8、约0.3-1.7、约0.4-1.6、约0.5-1.5g/L、约0.6-1.4、约0.7-1.3、约0.8-1.2或约0.9-1.1下。在某些实施例中，细胞培养物的乳酸盐水平维持在约0.1-2g/L下。
在一些实施例中，细胞培养物的乳酸盐水平通过用另外的细胞培养进料或补充剂补充细胞培养物来调节，由此增加通过培养物内的细胞的乳酸盐产生。
乳酸盐水平以这种方式维持以产生具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，其中所述组合物包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约11-19％、约11-16％、约12-20％、约12-38％、约13-19％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，所述组合物包括来自细胞培养物的澄清收获物，其中所述澄清收获物包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约11-19％、约11-16％、约12-20％、约12-38％、约13-19％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且在前述酸性物种中的一种或多种内变化，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，乳酸盐水平以这种方式维持以将蛋白质或抗体组合物中的酸性物种的量减少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，pH通过增加或降低细胞培养物的乳酸盐水平来增加或降低，以便增加或降低酸性物种的量和/或此类酸性物种形成的速率。在一些实施例中，细胞培养物的乳酸盐水平增加，以便将细胞培养物的pH，最初在介于约6.5-7.0之间，降低介于约0.01-0.5、约0.02-0.4、约0.05-0.3或约0.1-0.5、约0.1-0.4、约0.1-0.3或约0.1-0.2之间。在另一个实施例中，细胞培养物的乳酸盐水平增加以将pH从约6.9降低至约6.75，其中在澄清收获物的背景下，在细胞培养期间产生的酸性物种的量和酸性物种形成的速率降低。
在某些实施例中，细胞培养物中的乳酸盐水平增加或降低，以便增加或降低酸性物种的量和/或此类酸性物种形成的速率。
在某些实施例中，细胞培养物的乳酸盐水平在温育时段间的不同时间点进行调节。例如，但不限于，细胞培养物的乳酸盐水平的增加或降低可以在较早的时间点，例如在温育或生产时段期间的第1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天，或在较晚的时间点，例如在温育或生产时段的最后三天、最后两天或最后一天发生。细胞培养物乳酸盐水平可以在整个温育或生产时段被改变，例如增加或减少多次，例如在温育时段期间一次、两次或三次，以便实现组合物中的酸性物种的所期望的水平。
在某些实施例中，如上所述，具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的酸性物种的本发明的组合物可以通过增加乳酸盐水平和/或维持表达如本文所述的所关注的蛋白质的细胞培养物的乳酸盐水平以及合适的pH、CO2、温度或温度转变策略的选择，由细胞培养物产生。这些培养条件可用于各种培养方法中，所述各种培养方法包含但不限于分批、分批进料、恒化器和灌注，并且与各种细胞培养设备一起使用，所述各种细胞培养设备包含但不限于适当搅动或未适当搅动的摇瓶、旋转瓶、搅拌生物反应器、空气输送生物反应器、膜生物反应器、具有保留在固相载体上或固定/包埋在如微孔珠中的细胞的反应器，以及适用于所期望的细胞系的最佳生长和产生率的任何其它配置。
调节细胞培养物中的乳酸盐水平或来自细胞培养物的乳酸盐产生的这些方法还可以与调节pH、温度和/或CO2水平，或用添加剂，如一种或多种细胞培养补充剂补充培养基的方法或其组合进行组合使用，如本文所述，以维持或实现所期望水平的酸性物种或减少细胞培养期间的酸性物种的形成。
调整细胞培养补充剂以调节酸性物种
在某些实施例中，可以添加一种或多种细胞培养补充剂(培养基进料)，以便产生具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物(参见以下实例节)。
细胞培养补充剂旨在增强细胞培养性能并增加来自细胞培养物的重组蛋白的产率。任何已知的细胞培养补充剂都适合于本发明的方法。在一些实施例中，一种或多种细胞培养补充剂是化学上限定的并且不含源自动物的组分，并且针对分批进料过程中的高产率蛋白质产生进行优化。在一些实施例中，一种或多种细胞培养补充剂不含有任何生长因子(如胰岛素)、肽、水解物、酚红或2-merCaptoTM乙醇，由此确保批与批的一致性以及增加的细胞培养过程效率。在一些实施例中，一种或多种细胞培养补充剂具有接近中性的pH，并且含有氨基酸、维生素、盐、微量元素和葡萄糖。在其它实施例中，一种或多种细胞培养补充剂具有碱性pH，并且是氨基酸的浓缩溶液。
在一些实施例中，一种或多种培养补充剂包括HyCloneTM Cell BoostTM 7a(英国阿默舍姆的思拓凡生命科学公司(Cytiva Life Sciences,Amersham,UK))。在其它实施例中，一种或多种细胞培养补充剂包括HyCloneTM Cell BoostTM 7b(英国阿默舍姆的思拓凡生命科学公司)。Cell Boost 7a与7b的建议比率为约10至1(v/v)。
所添加的细胞培养补充剂的总量和特定进料方案根据每种特定细胞培养物的营养需求进行调整。在某些实施例中，将一种或多种细胞培养补充剂以初始培养容积的约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的容积添加到细胞培养物中。
将细胞培养补充剂以这种方式添加到细胞培养物中，以产生具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，其中所述组合物包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约11-19％、约11-16％、约12-20％、约12-38％、约13-19％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，所述组合物包括来自细胞培养物的澄清收获物，其中所述澄清收获物包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述澄清收获物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约11-19％、约11-16％、约12-20％、约12-38％、约13-19％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且在前述酸性物种中的一种或多种内变化，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，将细胞培养补充剂以这种方式添加到细胞培养物中，以将蛋白质或抗体组合物中的酸性物种的量减少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，细胞培养物中的细胞培养补充剂的水平增加或降低，以便增加或降低酸性物种的量和/或此类酸性物种形成的速率。在一些实施例中，将在约0.1-3％的水平下的所述细胞培养补充剂添加到细胞培养物中，并且细胞培养补充剂的水平进一步增加，例如增加了初始水平的约50％或更大，以便减少酸性物种的量和/或此类酸性物种形成的速率。例如，但并非限制于，如下文实例1中详述的，细胞培养补充剂水平从2％到约3％或从0.2％到约0.3％的增加可以被用于降低细胞培养期间的酸性物种，以及在澄清收获物的背景下的酸性物种形成的速率。
在某些实施例中，细胞培养物的细胞培养补充剂水平在温育时段间的不同时间点进行调节。例如，细胞培养补充剂的添加可以在较早的时间点，例如在温育或生产时段期间的第1、2、3、4、5、6、7、8、9天或第10天，或在较晚的时间点，例如在温育或生产时段的倒数三天、倒数两天或最后一天发生。添加到细胞培养物中的细胞培养补充剂的量可以在整个温育时段被改变，例如增加或减少多次，例如在温育或生产时段期间一次、两次或三次，以便实现组合物中的酸性物种的所期望的水平。
在一些实施例中，在所述温育或生产时段的第2天-第8天，例如第2、3、4、5、6、7天或第8天，将在约0.1-3％的水平下的所述细胞培养补充剂添加到细胞培养物中，并且在所述温育或生产时段的第4天-第10天，例如第4、5、6、7、8、9天或第10天，细胞培养补充剂的水平进一步增加，例如增加了初始水平的大于约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约150％或约200％。在一些实施例中，在所述温育或生产时段的第2天或第3天，将在约0.1-3％的水平下的所述细胞培养补充剂添加到细胞培养物中，并且在所述温育或生产时段的第5天或第6天，细胞培养补充剂的水平进一步增加，例如增加了初始水平的约50％或更大。
在一些实施例中，将细胞培养补充剂在第2天或第3天以初始容积的约2％添加到培养基中，并且在第5天或第6天以初始容积的约3％再次添加。在其它实施例中，将细胞培养补充剂在第2天或第3天以初始容积的约0.2％添加到培养基中，并且在第5天或第6天以初始容积的约0.3％再次添加。在一些实施例中，将细胞培养补充剂在第2天或第3天以初始容积的约2％添加到培养基中，在第5天或第6天以初始容积的约3％再次添加，并且在第9天以初始容积的约2％添加。在一些实施例中，将细胞培养补充剂在第2天或第3天以初始容积的约0.2％添加到培养基中，在第5天或第6天以初始容积的约0.3％再次添加，并且在第9天以初始容积的约0.2％添加。在一些实施例中，将第一细胞培养补充剂在第2天或第3天以初始容积的约2％添加到培养基中，并且在第5天或第6天以初始容积的约3％再次添加，并且将第二细胞培养补充剂在第2天或第3天以初始容积的约0.2％添加到培养基中，并且在第5天或第6天以初始容积的约0.3％再次添加。在一个实施例中，将第一细胞培养补充剂在第3天以初始容积的约2％添加到培养基中，并且在第5天以初始容积的约3％再次添加，并且将第二细胞培养补充剂在第3天以初始容积的约0.2％添加到培养基中，并且在第5天以初始容积的约0.3％再次添加。在另一个实施例中，将第一细胞培养补充剂在第3天以初始容积的约2％添加到培养基中，并且在第6天以初始容积的约3％再次添加，并且将第二细胞培养补充剂在第3天以初始容积的约0.2％添加到培养基中，并且在第6天以初始容积的约0.3％再次添加。在一些实施例中，第一细胞补充剂是细胞培养基进料，如Cell Boost 7a，并且第二补充剂是细胞培养基进料，如Cell Boost 7b。
在一些实施例中，增加或一种或多种细胞培养补充剂使乳酸盐产生增加、渗透压增加、细胞活力增加和/或细胞培养物的pH降低。
一种或多种补充剂的添加可以基于测量的酸性物种的量。所得培养基可用于各种培养方法中，所述各种培养方法包含但不限于分批、分批进料、恒化器和灌注，并且与各种细胞培养设备一起使用，所述各种细胞培养设备包含但不限于适当搅动或未适当搅动的摇瓶、旋转瓶、搅拌生物反应器、空气输送生物反应器、膜生物反应器、具有保留在固相载体上或固定/包埋在如微孔珠中的细胞的反应器，以及适用于所期望的细胞系的最佳生长和产生率的任何其它配置。另外，可以例如基于收获物活力或培养持续时间的选择来选择这些培养物的收获标准，以进一步优化某种靶向酸性物种配置。
调整细胞培养补充剂的这些方法还可以与调节pH、温度和/或CO2水平的方法、调节细胞培养物中的乳酸盐水平或来自细胞培养物的乳酸盐产生的方法或其组合进行组合使用，如本文所述，以维持或实现所期望水平的酸性物种或减少细胞培养期间的酸性物种的形成。
IV.使用下游过程技术制备组合物
本发明提供了用于产生具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、或带电物种，例如酸性物种或碱性物种；和/或水平降低的过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的制剂的方法和组合物。在某些实施例中，本发明的组合物包含但不限于具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、或带电物种，例如酸性物种或碱性物种；和/或水平降低的过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，如玛弗利木单抗的组合物。此类变体和/或杂质减少的组合物满足对改进的产物特性，包含但不限于产物稳定性、产物安全性和产物功效的需要。
在某些实施例中，本发明涉及一种用于通过以下产生具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段(例如半抗体)或带电物种(例如酸性物种或碱性物种)；和/或水平降低的过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的制剂的方法：使包括所述所关注的蛋白质以及变体和/或杂质的样品经受色谱树脂，如阳离子交换(CEX)色谱树脂、阴离子交换(AEX)色谱树脂和/或混合模式(MM)色谱树脂。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于通过以下产生具有水平降低的半抗体的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的制剂的方法：使包括所述所关注的蛋白质以及半抗体的样品经受阳离子交换色谱树脂和/或混合模式色谱树脂。
在一些实施例中，本发明提供了一种通过以下降低包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的制剂中的半抗体的水平的方法：使包括所述所关注的蛋白质以及半抗体的样品经受阳离子交换色谱树脂和/或混合模式色谱树脂。
在一些实施例中，本发明提供了一种通过以下产生具有水平降低的酸性物种的包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分(如玛弗利木单抗)的制剂的方法：使包括所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分以及酸性物种的样品经受阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂。
在一些实施例中，本发明提供了一种通过以下降低包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分(如玛弗利木单抗)的制剂中的酸性物种的水平的方法：使包括所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分以及酸性物种的样品经受阴离子交换色谱树脂和/或混合模式色谱树脂。
在一些实施例中，本发明提供了一种通过以下产生具有水平降低的高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白的包括所关注的蛋白质，如抗体或其抗原结合部分(如玛弗利木单抗)的制剂的方法：使包括所述所关注的蛋白质、高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白(HCP)的样品经受色谱树脂，如阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和/或混合模式色谱树脂。
在一些实施例中，本发明提供了一种降低包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的制剂中的高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白的水平的方法：使包括所述所关注的蛋白质、高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白(HCP)的样品经受色谱树脂，如阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和/或混合模式色谱树脂。
在某些实施例中，在蛋白质的细胞培养之后，本发明的组合物可以使用如本文所述的下游过程技术(例如，纯化)产生。下游过程技术可以单独或与上文第III节中描述的上游过程技术组合使用，并且如实例2和3中所述。
在一个实施例中，本文所述的下游过程技术，单独或与一种或多种上游过程技术组合，产生具有水平降低的变体和/或杂质，例如水平降低的产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段(例如半抗体)或带电物种(例如，酸性物种或碱性物种)；和/或水平降低的过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物。
在一些实施例中，所述方法产生具有水平降低的半抗体的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，其中所述组合物包括小于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3.9％、约3.8％、约3.7％、约3.6％、约3.5％、约3.4％、约3.3％、约3.2％、约3.1％、约3％、约2.9％、约2.8％、约2.7％、约2.6％、约2.5％、约2.4％、约2.3％、约2.2％、约2.1％、约2％、约1.9％、约1.8％、约1.7％、约1.6％、约1.5％、约1.4％、约1.3％、约1.2％、约1.1％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约0.1-20％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，所述方法产生具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，其中所述组合物包括小于约40％、约39％、约38％、大约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，所述方法产生具有水平降低的碱性物种的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，其中所述组合物包括小于约45％、约44％、约43％、约42％、约41％、约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约1-45％、约1-40％、约1-35％、约1-25％、约5-35％、约10-35％、约15-35％、约1-30％、约1-25％、约1-24％、约5-25％、约5-30％、约5-45％、约10-25％、约10-30％、约10-40％、约15-25％、约15-30％、约15-35％、约15-25％、约16-31％、约17-26％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，所述方法产生包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，包括大于约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的主要物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约40-99％、约45-99％、约50-99％、约55-99％、约50-90％、约55-90％、约50-80％、约55-80％、约50-70％、约55-70％、约50-65％、约55-65％、约58-62％、约58-63％、约58-67％、约53-61％、约46-67％或约46-66％的主要物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，方法产生具有水平降低的高分子量聚集体的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，其中所述组合物包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约0.01-10％、约0.01至5％、约0.01至1％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，所述方法产生具有水平降低的蛋白质片段的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，其中所述组合物包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的蛋白质片段，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的蛋白质片段，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，所述方法产生包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，所述组合物包括所述所关注的蛋白质的大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的单体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括大于约90％的单体。在一些实施例中，所述组合物包括大于约99.1％的单体。在一些实施例中，所述组合物包括所述所关注的蛋白质的约90-99.9％、约90-95％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体。在一些实施例中，所述组合物包括约98-99％的单体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约98-99.9％的单体。
在一些实施例中，所述方法产生具有水平降低的宿主细胞蛋白的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物，所述组合物包括小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的宿主细胞蛋白，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述组合物包括约0.1-10ppm、约1-10ppm、约2-10ppm、约3-10ppm、约4-10ppm、约1-5ppm、约5-10ppm、约1-3ppm、约0.1-2ppm、约0.1-3ppm、约2-8或约0.1-8ppm的HCP，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，本文所述的下游过程技术，单独或与一种或多种上游过程技术组合，将蛋白质或抗体组合物中的变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、或带电物种，例如酸性物种或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的水平降低了约1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,100％，并且范围在前述中的一种或多种内。
蛋白质纯化
在所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的上游产生之后，下游过程技术可用于纯化蛋白质。例如，但并非限制于，一旦已获得包括所述所关注的蛋白质，例如，抗体或其抗原结合片段的澄清溶液或混合物，那么从蛋白质变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、或带电物种，例如酸性物种或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白分离所述所关注的蛋白质就可以使用不同纯化技术的组合来实现，所述不同纯化技术包含但不限于，单独或组合的离子交换分离步骤、混合模式分离步骤、亲和分离步骤以及疏水相互作用分离步骤。分离步骤基于蛋白质的电荷、疏水性程度或大小或其任何组合来分离蛋白质的混合物，这取决于特定分离形式，包含色谱分离。在本发明的一方面，使用色谱，包含阳离子、阴离子和疏水相互作用进行分离。若干不同的色谱树脂是这些技术中的每一种都可获得的，由此允许将纯化方案精确地定制到所涉及的特定蛋白质。每种分离方法导致蛋白质以不同速率穿过柱，以实现随着其进一步通过柱而增加的物理分离，或选择性地粘附到分离培养基。然后通过不同的洗脱缓冲液对蛋白质进行差异洗脱。在一些情况下，当变体和/或杂质优先粘附到柱的树脂并且所关注的蛋白质没有粘附，即，所关注的蛋白质存在于通过级分的流中时，将所关注的蛋白质与变体和/或杂质分离开，而在其它情况下，所关注的蛋白质将粘附到柱的树脂上，而变体和/或杂质在洗涤循环期间从柱的树脂挤出。
在某些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物使用色谱分离法产生，以确定足以获得所需分馏配置，例如，包括所关注的蛋白质以及至少一种此类变体和/或杂质的样品的产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、或带电物种，例如酸性物种或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的分馏的特定条件，例如，盐浓度、pH、缓冲液、温度、上样量和条件、洗涤条件和洗脱条件。在某些实施例中，所述方法进一步包括汇集所得的包括所期望的组合物的级分。
初级回收和病毒灭活
在某些实施例中，本发明的纯化方法的初始步骤涉及来自样品基质的所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的澄清和初级回收。在某些实施例中，初级回收将包含一个或多个离心步骤以将所关注的蛋白质与细胞和细胞碎片分离开。样品的离心可以在例如但并非限制于7,000g至大约12,750g下进行。在大规模纯化的背景下，此类离心可以线上(on-line)进行，其流速设定成例如但并非限制于在所得上清液中实现150NTU的浊度水平。然后，可以收集此类上清液用于进一步纯化，或通过一个或多个深度过滤器线内(in-line)过滤以用于样品的进一步澄清。
在某些实施例中，初级回收将包含使用一个或多个深度过滤步骤来澄清样品基质，并且由此有助于纯化本发明中的所关注的抗体。在其它实施例中，初级回收将包含离心后使用一个或多个深度过滤步骤以进一步澄清样品基质。可用于本发明的上下文中的深度过滤器的非限制性实例包含Millistak+X0HC、F0HC、D0HC、A1HC、B1HC深度过滤器(EMD密理博公司(EMD Millipore))、CunoTM模型30/60ZA、60/90ZA、VR05、VR07、脱脂深度过滤器(3M公司(3M Corp.))。0.2μm的过滤器，如赛多利斯公司(Sartorius)的0.45/0.2μm SartoporeTM双层过滤器或密理博的Express SHR或SHC过滤器滤芯通常遵循深度过滤器。
在某些实施例中，初级回收过程也可以是减少或灭活样品基质中可能存在的病毒的点。例如，可以在纯化的初级回收阶段期间或之后使用病毒减少/灭活的多种方法中的任何一种或多种，包含热灭活(巴氏杀菌)、pH灭活、缓冲液/洗涤剂处理、UV和γ射线照射以及添加某些化学灭活剂，如β丙内酯或例如，如美国专利第4,534,972号中所述的铜菲咯啉。在本发明的某些实施例中，样品基质在初级回收阶段期间或之后暴露于洗涤剂病毒灭活。在其它实施例中，样品基质可以在初级回收阶段期间或之后暴露于低pH灭活。
在采用病毒减少/灭活的那些实施例中，样品混合物可以根据需要进行调整以用于另外的纯化步骤。例如，在低pH病毒灭活之后，在继续纯化过程之前，通常将样品混合物的pH调节到更中性的pH，例如，约4.5至约8.5、约5至约8、约5.5至约7.5或约6至约7。另外，混合物可以用注射用水(WFI)进行稀释以获得所需电导率。
亲和色谱
使通过本发明的技术产生的样品经受亲和色谱，以将所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)进一步纯化远离变体和/或杂质是有利的。在某些实施例中，色谱材料能够与所关注的蛋白质选择性地或特异性结合(“捕获”)。此类色谱材料的非限制性实例包含：蛋白A、蛋白G、包括例如由所关注的抗体结合的抗原的色谱材料以及包括Fc结合蛋白的色谱材料。在具体实施例中，亲和色谱步骤涉及使初级回收样品经受包括合适的蛋白A树脂的柱。在某些实施例中，蛋白A树脂可用于多种抗体同种型，具体地IgG1、IgG2和IgG4的亲和纯化和分离。蛋白A是主要通过其Fc区与哺乳动物IgG结合的细菌细胞壁蛋白。在其天然状态下，蛋白A具有五个IgG结合结构域以及未知功能的其它结构域。
存在蛋白A树脂的若干商业来源。合适的树脂包含但不限于MabSelect SuRe LX、MabSelect SuReTM、MabSelect、MabSelect Xtra、来自通用电气医疗公司(GE Healthcare)的rProtein A Sepharose、ProSep HC、ProSep Ultra和来自EMD密理博公司的ProSepUltra Plus、来自生命技术公司(Life Technologies)的MapCapture。
在样品上样之前，蛋白A柱可以用合适的缓冲液平衡。在上样柱后，柱可以使用一组合适的缓冲液洗涤一次或多次。然后蛋白A柱可以使用适当的洗脱缓冲液洗脱。例如，甘氨酸-HCL或柠檬酸可以用作洗脱缓冲液。洗脱液可以使用本领域的技术人员熟知的技术进行监测。所关注的洗脱液级分可以被收集，并且然后被制备用于进一步处理。
蛋白A洗脱液可以通过洗涤剂或低pH经受病毒灭活步骤，前提是在蛋白A捕获操作之前不执行此步骤。可以选择适当的洗涤剂浓度或pH和时间，以获得所期望的病毒灭活结果。在病毒灭活后，蛋白A洗脱液通常为针对后续纯化步骤调整的pH和/或电导率。
在另外的色谱精制步骤之前，蛋白A洗脱液可以通过深度过滤器经受过滤，以从所关注的抗体去除浊度和/或各种杂质。深度过滤器的实例包含但不限于Millistak+X0HC、F0HC、D0HC、A1HC和B1HC Pod过滤器(EMD密理博公司)或ζPlus 30ZA/60ZA、60ZA/90ZA、脱脂、VR07和VR05过滤器(3M)。蛋白A洗脱液池可能需要被调节到适当pH和电导率，以获得来自深度过滤步骤的所期望的杂质去除和产物回收。
本发明不限于使用蛋白A色谱捕获所关注的蛋白质。也可以执行非蛋白A色谱捕获步骤。例如，可以使用阳离子交换捕获和非色谱方法，如水性两相提取或沉淀，或本领域已知的其它方法。
阳离子交换色谱
包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物可以通过使包括所关注的蛋白质的样品经受阳离子交换(CEX)分离步骤来产生。在某些实施例中，CEX步骤在上述亲和色谱，例如，蛋白A亲和步骤之后发生。
阳离子交换材料与阴离子交换材料，如本文详细论述的那些阴离子交换材料的使用基于所关注的蛋白质在给定溶液中的局部电荷。因此，在使用阴离子交换步骤之前采用阳离子交换步骤，或在使用阳离子交换步骤之前采用阴离子交换步骤在本发明的范围内。此外，采用仅阳离子交换步骤、仅阴离子交换步骤或两者的任何连续组合(包含一个或两个离子交换步骤与本文所述的其它色谱分离技术的连续组合)在本发明的范围内。
在执行分离时，初始蛋白质混合物可以通过使用多种技术中的任一种，例如，使用如上文关于蛋白A所述的分批纯化技术或色谱技术来与阳离子交换材料接触。
例如，在分批纯化的情况下，阳离子交换材料在所需起始缓冲液中制备或平衡至所需起始缓冲液。在制备或平衡后，获得阳离子交换材料的浆液。在一些实施例中，将所关注的蛋白质，例如抗体、溶液与CEX树脂接触，以允许蛋白质吸附到树脂。包括变体和/或杂质的溶液可以不与CEX树脂结合。可替代地，在其它实施例中，包括变体和/或杂质的溶液可以与CEX树脂比所关注的蛋白质更紧密地结合。树脂可以经受一个或多个洗涤步骤和/或洗脱步骤。可替代地，变体和/或杂质可以与树脂结合，而所关注的蛋白质不与树脂结合。
填充的阳离子交换色谱柱、阳离子交换膜装置、阳离子交换单片装置或深度过滤器培养基可以在结合洗脱模式、流通模式或混合模式下进行操作，其中产物表现出与色谱材料的结合，但可以使用与上样缓冲液相同或基本上类似的缓冲液从柱洗涤。在结合洗脱模式下，在其中某些蛋白质将固定在基于树脂的基质上的情况下，柱或膜装置首先用具有适当离子强度和pH的缓冲液进行调节。例如，在某些实施例中，在进料上样期间，由于静电吸引，所关注的蛋白质将吸附到树脂上。在用平衡缓冲液或具有不同pH和/或电导率的另一缓冲液洗涤柱或膜装置之后，通过增加洗脱缓冲液的离子强度(即，电导率)以与溶质竞争阴离子交换基质的带电位点来实现产物回收。改变pH并且由此改变溶质的电荷是实现溶质的洗脱的另一种方式。电导率或pH的变化可以是渐进的(梯度洗脱)或逐步的(逐步洗脱)。在流通模式下，柱或膜装置在选定的pH和电导率下操作，使得所关注的蛋白质不与树脂或膜结合，而酸性物种将保留在柱上或与所关注的蛋白质相比将具有不同的洗脱曲线。在此混合策略的背景下，酸性物种将以不同于所关注的蛋白质的方式与色谱材料结合(或流通)，例如，虽然所关注的蛋白质和所关注的蛋白质的某些聚集体和/或片段可以结合色谱材料，但可以应用优先去除所关注的蛋白质的洗涤物。然后在下一次使用之前重新生成柱。
在某些实施例中，在色谱分离的情况下，通常形状呈圆柱形的色谱设备被用于含有在适当的缓冲溶液中制备的色谱载体材料(例如，CEX树脂)。色谱设备如果呈圆柱形，则可以具有约5mm至约2米的直径，以及5cm至50cm的高度，并且在某些实施例中，具体地对于大规模处理，采用≤30cm的高度。一旦将色谱材料添加到色谱设备中，就将含有所关注的蛋白质，例如抗体的样品与色谱树脂接触，以诱导分离。不与色谱树脂结合的溶液的任何部分，例如，所述任何部分可以包括所关注的蛋白质或变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、带电变体，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白，取决于所使用的CEX树脂，通过洗涤树脂并且收集级分与色谱树脂分离。色谱树脂可以经受一个或多个洗涤步骤。如果需要，然后可以将色谱树脂与被设计成脱附或洗脱已与色谱树脂结合的溶液的任何组分的溶液接触。
在某些实施例中，洗涤步骤可以使用类似于上样条件的条件在CEX色谱的背景下，或者可替代地通过以逐步或线性梯度方式改变洗涤缓冲液的pH和/或离子强度/电导率来执行。所得的流通和洗涤级分可以被分析，并汇集适当的部分，以实现变体和/杂质的所期望的减少。
在某些实施例中，用作上样和洗涤缓冲液两者的水性盐溶液具有低于所关注的蛋白质的等电点(pI)的pH。在某些实施例中，上样和洗涤缓冲液的pH比蛋白质的pI低约0至5个单位。在某些实施例中，上样和洗涤缓冲液的pH比蛋白质的pI低约1至2个单位。在某些实施例中，上样和洗涤缓冲液的pH比蛋白质的pI低约1至1.5个单位。
在某些实施例中，用作洗脱缓冲液的水性盐溶液具有高于所关注的蛋白质的等电点(pI)的pH。在某些实施例中，洗脱缓冲液的pH比蛋白质的pI高约0至5个单元。在某些实施例中，洗脱缓冲液的pH比蛋白质的pI高约1至2个单元。在某些实施例中，洗脱缓冲液的pH比蛋白质的pI高约1至1.5个单元。
在某些实施例中，上样、洗涤或洗脱缓冲液的pH为约3.5-10.5、约4-10、约4.5-9.5、约5-9、约5.5-8.6、约6-8、约6.5-7.5、约6-7、约5-8、约4-7、约5-7、约5-6、约5-5.5。在某些实施例中，上样、洗涤或洗脱缓冲液的pH为约4.9,5,5.1,5.15,5.2,5.25,5.3,5.35,5.4,5.45,5.5,5.55,5.6,5.65,5.7,5.75,5.8,5.85,5.9,5.95,6,6.1,6.2,6.3,6.4,6.5,6.6,6.7,6.8,6.9,7,7.1,7.2,7.3,7.4,7.5,7.6,7.7,7.8,7.9,8,8.5,9,9.5或10。
合适用于CEX方法中的缓冲液系统包含但不限于甲酸三酯、乙酸三酯、硫酸铵、乙酸钠、氯化钠和硫酸钠。在某些实施例中，缓冲液的电导率和pH通过增加或降低阳离子或阴离子剂的浓度进行调节。在某些非限制性实施例中，阳离子剂选自由以下组成的组：钠、Tris、三甲基氨基、氨、精氨酸、组氨酸或其组合。在某些非限制性实施例中，阴离子剂选自由以下组成的组：甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、氯阴离子、硫酸酯、磷酸酯或其组合。
在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约500mM,490mM,480mM,470mM,460mM,450mM,440mM,430mM,420mM,410mM,400mM,390mM,380mM,370mM,360mM,350mM,340mM,330mM,320mM,310mM,300mM,290mM,280mM,270mM,260mM,250mM,240mM,230mM,220mM,210mM,200mM,190mM,180mM,170mM,160mM,150mM,140mM,130mM,120mM,110mM,100mM,90mM,85mM,80mM,75mM,70mM,65mM,60mM,55mM,50mM,45mM,40mM,35mM,30mM,25mM,20mM,15mM,10mM或5mM的乙酸钠。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM、约40-60mM的乙酸钠。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约40-60mM的乙酸钠。
在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约500mM,490mM,480mM,470mM,460mM,450mM,440mM,430mM,420mM,410mM,400mM,390mM,380mM,370mM,360mM,350mM,340mM,330mM,320mM,310mM,300mM,290mM,280mM,270mM,260mM,250mM,240mM,230mM,220mM,210mM,200mM,190mM,180mM,170mM,160mM,150mM,140mM,130mM,125mM,120mM,110mM,100mM,90mM,85mM,80mM,75mM,70mM,65mM,60mM,55mM,50mM,45mM,40mM,35mM,30mM,25mM,20mM,15mM,10mM或5mM的氯化钠。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM、约50-60mM、约50-250mM、约50-150mM或约40-60mM的氯化钠。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约40-60mM的氯化钠。
在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约50mM的乙酸钠、约55mM的氯化钠以及约5.35的pH。
本领域已知的任何阳离子交换色谱树脂都适合用于制备本发明的组合物。示例性CEX树脂包含但不限于巯基(XS)、磺酸酯(S)、硫酸酯、羧甲基(CM)、磺乙基(SE)、磺丙基(SP)、磷酸酯(P)和磺酸酯(S)。在某些实施例中，用于CEX分离的树脂是POROSTMXS。POROSTMXS是具有磺丙基官能度的交联聚(苯乙烯-二乙烯基苯)的载体基质的强阳离子交换器。在某些实施例中，用于CEX分离的树脂是CaptoTMS Impact。CaptoTMTMSImpact是具有磺酸酯基团和中性吡咯烷酮的高流动琼脂糖基质的阳离子交换器。在某些实施例中，用于CEX分离的树脂是ToyopearlTM硫酸酯650。ToyopearlTM硫酸酯650是具有专有的含有配体的硫酸酯的聚甲基丙烯酸盐珠的阳离子交换树脂。在某些实施例中，用于CEX分离的树脂是ToyopearlTMGigaGap CM 650M。ToyopearlTMCM GigaGap 650M是由聚甲基丙烯酸盐珠构成的阳离子交换树脂，所述聚甲基丙烯酸盐珠已被化学修饰以提供更多数量的阳离子结合位点并用羧甲基官能化。另外的CEX树脂包含但不限于CaptoTMSPImpRes、CMTMCeramic HyperDgrade F、EshmunoTMS、NuviaTMC Prime、NuviaTMS、PorosTMHS；PorosTMHQ、ToyopearlTMGigaCapS 650M、ToyopearlTMMX Trp 650M。应注意，CEX色谱可与本文所述的MM树脂一起使用。
在某些实施例中，将所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)以约10-100g/L、约20-90g/L、约30-80g/L、约30-60g/L、约40-70g/L或约50-60g/L的水平上样到阳离子交换色谱树脂上。在某些实施例中，所述所关注的蛋白质以约30-60g/L的水平上样到所述阳离子交换色谱树脂上。
在某些实施例中，本发明的方法可以用于从所关注的蛋白质选择性地去除、显著减少或基本上去除所有变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、带电变体，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白，其中所述变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、带电变体，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白在流通和洗脱级分中被收集，并且所述所关注的蛋白质在洗脱液级分中被富集，由此产生具有水平降低的变体和/或杂质的蛋白质组合物。
在某些实施例中，从CEX色谱步骤收集的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括水平降低的变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、带电变体，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约25％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3.9％、约3.8％、约3.7％、约3.6％、约3.5％、约3.4％、约3.3％、约3.2％、约3.1％、约3％、约2.9％、约2.8％、约2.7％、约2.6％、约2.5％、约2.4％、约2.3％、约2.2％、约2.1％、约2％、约1.9％、约1.8％、约1.7％、约1.6％、约1.5％、约1.4％、约1.3％、约1.2％、约1.1％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.1-25％、约0.1-20％、约1-18％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％或约0.6-18％或约1-17％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约45％、约44％、约43％、约42％、约41％、约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约1-45％、约1-40％、约1-35％、约1-25％、约5-35％、约10-35％、约15-35％、约1-30％、约1-25％、约1-24％、约5-25％、约5-30％、约5-45％、约10-25％、约10-30％、约10-40％、约15-25％、约15-30％、约15-35％、约15-25％、约16-31％、约17-26％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括大于约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的主要物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述洗脱液级分包括约40-99％、约45-99％、约50-99％、约55-99％、约50-90％、约55-90％、约50-80％、约55-80％、约50-70％、约55-70％、约50-65％、约55-65％、约58-62％、约59-61％、约58-63％、约58-67％、约53-61％、约46-67％或约46-66％的主要物种，例如，抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.01-10％、约0.01至5％、约0.01至1％、约0.01-0.4％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约0.1-6％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％或约0.3％的蛋白质片段，例如抗体片段，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.1-1.1％、约0.1-0.8％、约0.6-1.5％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的蛋白质片段，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括所述所关注的蛋白质的大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的单体，例如，抗体单体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括所述所关注的蛋白质的约90-99.9％、约90-95％、约94-99.9％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体，例如，抗体单体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的宿主细胞蛋白，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约1-3、约0.1-2、约0.1-3、约2-8或约0.1-8ppm的HCP，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，CEX色谱步骤的上样、pH、电导率以及洗脱pH和/或电导率可以被修改，以实现变体和/或杂质远离所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的期望分布。
在某些实施例中，可以执行CEX色谱分离，并且可以汇集级分的组合，以在仅调节电荷变体浓度之外或代替仅调节电荷变体浓度，实现所期望的过程相关杂质和/或产物相关物质水平的组合。
在某些实施例中，光谱方法，如UV、NIR、FTIR、荧光、拉曼(Raman)可以用于以线上、近线(at-line)或线内模式监测变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如，所关注的蛋白质的电荷变体、聚集体、片段；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的水平，然后这可以用于控制从CEX废水中收集的汇集材料中的变体和/或杂质的水平。在某些实施例中，线上、近线或线内监测方法可以用于色谱步骤的废水管上或收集容器中，以能够实现所期望的产物质量/回收。在某些实施例中，UV信号可以用作实现适当产物质量/回收的替代物，其中可以适当地处理UV信号，包含但不限于，如整合、分化、移动平均值等处理技术，使得可以解决正常过程可变性并且可以实现目标产物质量。在某些实施例中，此类测量可以与线内稀释方法组合，使得上样/洗涤的离子浓度/电导率可以通过反馈控制，并且因此促进产物质量控制。
在某些实施例中，CEX和AEX和/或MM方法的组合可以用于制备包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物，所述实施例包含其中一种技术与另一种技术以互补/补充方式使用的某些实施例。在一些实施例中，可以执行这样的组合，使得某些子物种主要通过一种技术去除，使得组合提供所期望的最终组成/产物质量。在一些实施例中，此类组合包含使用另外的色谱、过滤、纳米过滤、超滤/渗滤(UF/DF)步骤，以便实现所期望的产物质量。
阴离子交换色谱
在某些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的组合物通过使包括所关注的蛋白质的样品经受阴离子交换分离步骤来产生。在一些实施例中，阴离子交换步骤在上述亲和色谱，例如，蛋白A亲和步骤之后发生。在一些实施例中，阴离子交换步骤在阳离子交换步骤之后发生。在某些实施例中，阴离子交换步骤在阳离子交换步骤之前发生。
阴离子交换材料与阳离子交换材料，如上文详细论述的那些阳离子交换材料的使用基于所关注的蛋白质在给定溶液中的局部电荷。因此，在使用阳离子交换步骤之前采用阴离子交换步骤，或在使用阴离子交换步骤之前采用阳离子交换步骤在本发明的范围内。此外，采用仅阴离子交换步骤、仅阳离子交换步骤或两者的任何连续组合(包含一个或两个离子交换步骤与本文所述的其它色谱分离技术的连续组合)在本发明的范围内。
在执行分离时，初始蛋白质组合物可以通过使用多种技术中的任一种，例如，使用如上所述的分批纯化技术或色谱技术来与阴离子交换材料接触。
在某些实施例中，用作上样和洗涤缓冲液两者的水性盐溶液具有在所关注的蛋白质的等电点(pI)处或附近的pH。在某些实施例中，上样和洗涤缓冲液的pH比所关注的蛋白质的pI高或低约0至2个单位。在某些实施例中，上样和洗涤缓冲液的pH比所关注的蛋白质的pI高或低约0至0.5个单位。在某些实施例中，上样和洗涤缓冲液的pH在所关注的蛋白质的pI处。
在某些实施例中，上样、洗涤或洗脱缓冲液的pH为约5.9-6.1、3.5-10.5、约4-10、约4.5-9.5、约5-9、约5.5-8.6、约6-8、约6.5-7.5、约6-7、约5-8、约4-7、约5-7、约5-6、约5-5.5。在某些实施例中，上样、洗涤或洗脱缓冲液的pH为约5、5.1、5.15、5.2、5.25、5.3、5.35、5.4、5.45、5.5、5.55、5.6、5.65、5.7、5.75、5.8、5.85、5.9、5.95、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.5、9、9.5或10。
适合用于AEX方法中的缓冲液系统包含但不限于吡啶、哌嗪、L-组氨酸、Bis-tris、Bis-三丙烷、咪唑、N-乙基吗啉、TEA(三乙醇胺)、Tris、吗啉、N-甲基二乙醇胺、AMPD(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、二乙醇胺、乙醇胺、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、哌嗪、1,3-二氨基丙烷、哌啶。在某些实施例中，缓冲液的电导率和pH通过增加或降低阳离子或阴离子剂的浓度进行调节。在某些非限制性实施例中，阳离子剂选自由以下组成的组：钠、Tris、三甲基氨基、氨、精氨酸、组氨酸或其组合。在某些非限制性实施例中，阴离子剂选自由以下组成的组：甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、氯阴离子、硫酸酯、磷酸酯或其组合。
在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约500mM、490mM、480mM、470mM、460mM、450mM、440mM、430mM、420mM、410mM、400mM、390mM、380mM、370mM、360mM、350mM、340mM、330mM、320mM、310mM、300mM、290mM、280mM、270mM、260mM、250mM、240mM、230mM、220mM、210mM、200mM、190mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM的乙酸钠。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM、约40-60mM的乙酸钠。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约40-60mM的乙酸钠。
在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约500mM、490mM、480mM、470mM、460mM、450mM、440mM、430mM、420mM、410mM、400mM、390mM、380mM、370mM、360mM、350mM、340mM、330mM、320mM、310mM、300mM、290mM、280mM、270mM、260mM、250mM、240mM、230mM、220mM、210mM、200mM、190mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、135mM、130mM、125mM、120mM、115mM、110mM、105mM、100mM、95mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM的氯化钠。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM、约50-250mM、约50-170mM、约50-60mM或约40-60mM的氯化钠。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约40-60mM的氯化钠。
在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约500mM、490mM、480mM、470mM、460mM、450mM、440mM、430mM、420mM、410mM、400mM、390mM、380mM、370mM、360mM、350mM、340mM、330mM、320mM、310mM、300mM、290mM、280mM、270mM、260mM、250mM、240mM、230mM、220mM、210mM、200mM、190mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM的组氨酸。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM、约40-60mM的组氨酸。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约40-60mM的组氨酸。
在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约500mM、490mM、480mM、470mM、460mM、450mM、440mM、430mM、420mM、410mM、400mM、390mM、380mM、370mM、360mM、350mM、340mM、330mM、320mM、310mM、300mM、290mM、280mM、270mM、260mM、250mM、240mM、230mM、220mM、210mM、200mM、190mM、180mM、170mM、160mM、150mM、140mM、130mM、120mM、110mM、100mM、90mM、85mM、80mM、75mM、70mM、65mM、60mM、55mM、50mM、45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM或5mM的Bis-Tris。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM、约50-60mM或约40-60mM的Bis-Tris。在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约40-60mM Bis-Tris。
在一些实施例中，洗脱缓冲液包括约50mM的组氨酸、约105mM的氯化钠以及约6的pH。
填充的阴离子交换色谱柱、阴离子交换膜装置、阴离子交换单片装置或深度过滤器培养基可以在结合洗脱模式、流通模式或混合模式下进行操作，其中产物表现出与色谱材料的结合，但可以使用与上样缓冲液相同或基本上类似的缓冲液从柱洗涤。在结合洗脱模式下，在其中某些蛋白质将固定在基于树脂的基质上的情况下，柱或膜装置首先用具有适当离子强度和pH的缓冲液进行调节。例如，在某些实施例中，在进料上样期间，由于静电吸引，所关注的蛋白质将吸附到树脂上。在用平衡缓冲液或具有不同pH和/或电导率的另一缓冲液洗涤柱或膜装置之后，通过增加洗脱缓冲液的离子强度(即，电导率)以与溶质竞争阴离子交换基质的带电位点来实现产物回收。改变pH并且由此改变溶质的电荷是实现溶质的洗脱的另一种方式。电导率或pH的变化可以是渐进的(梯度洗脱)或逐步的(逐步洗脱)。在流通模式下，柱或膜装置在选定的pH和电导率下操作，使得所关注的蛋白质不与树脂或膜结合，而酸性物种将保留在柱上或与所关注的蛋白质相比将具有不同的洗脱曲线。在此混合策略的背景下，酸性物种将以不同于所关注的蛋白质的方式与色谱材料结合(或流通)，例如，虽然所关注的蛋白质和所关注的蛋白质的某些聚集体和/或片段可以结合色谱材料，但可以应用优先去除所关注的蛋白质的洗涤物。然后在下一次使用之前重新生成柱。
本领域已知的任何阴离子交换色谱树脂都合适用于制备本发明的组合物。AEX树脂的非限制性实例包含二乙基氨基乙基(DEAE)、四氨基乙基(QAE)和季铵(Q)基团。在某些实施例中，用于AEX分离的树脂是POROSTMXQ。POROSTMXQ是用季铵官能化的交联聚(苯乙烯-二乙烯基苯)的载体基质的强阴离子交换器。在某些实施例中，用于AEX分离的树脂是CaptoTMQImRes。CaptoTMQTMImRes是用季铵官能化的高流动琼脂糖树脂的强阴离子交换器。另外的非限制性实例包含：POROSTM50PI、POROSTM50HQ、CaptoTMDEAE、ToyopearlTMQAE-550、ToyopearlTMDEAE-650、ToyopearlTMGigaCap Q-650、EMD TMAE Hicap、SartobindPA nano、Sartobind Q nano；CUNOTMBioCap和X0HC。
在某些实施例中，将所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)以约10-100g/L、约20-90g/L、约30-80g/L、约40-70g/L或约50-60g/L的水平上样到阴离子交换色谱树脂上。在某些实施例中，所述所关注的蛋白质以约50-60g/L的水平上样到所述阴离子交换色谱树脂上。
在某些实施例中，本发明的方法可以用于从所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)选择性地去除、显著减少或基本上去除所有变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、带电变体，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白，其中所述变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、带电变体，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白在流通和洗脱级分中被收集，并且所述所关注的蛋白质在洗脱液级分中被富集，由此产生具有水平降低的变体和/或杂质的蛋白质组合物。
在某些实施例中，从AEX色谱步骤收集的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括水平降低的变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、带电变体，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白。在一些实施例中，
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约25％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3.9％、约3.8％、约3.7％、约3.6％、约3.5％、约3.4％、约3.3％、约3.2％、约3.1％、约3％、约2.9％、约2.8％、约2.7％、约2.6％、约2.5％、约2.4％、约2.3％、约2.2％、约2.1％、约2％、约1.9％、约1.8％、约1.7％、约1.6％、约1.5％、约1.4％、约1.3％、约1.2％、约1.1％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.1-25％、约0.1-20％、约1-18％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％或约0.6-18％或约1-17％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约45％、约44％、约43％、约42％、约41％、约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约1-45％、约1-40％、约1-35％、约1-25％、约5-35％、约10-35％、约15-35％、约1-30％、约1-25％、约1-24％、约5-25％、约5-30％、约5-45％、约10-25％、约10-30％、约10-40％、约15-25％、约15-30％、约15-35％、约15-25％、约16-31％、约17-26％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括大于约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的主要物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述洗脱液级分包括约40-99％、约45-99％、约50-99％、约55-99％、约50-90％、约55-90％、约50-80％、约55-80％、约50-70％、约55-70％、约50-65％、约55-65％、约58-62％、约59-61％、约58-63％、约58-67％、约53-61％、约46-67％或约46-66％的主要物种，例如，抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.01-10％、约0.01至5％、约0.01至1％、约0.01-0.4％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约0.1-6％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％或约0.3％的蛋白质片段，例如抗体片段，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.1-1.1％、约0.1-0.8％、约0.6-1.5％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的蛋白质片段，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括所述所关注的蛋白质的大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的单体，例如，抗体单体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括所述所关注的蛋白质的约90-99.9％、约90-95％、约94-99.9％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体，例如，抗体单体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的宿主细胞蛋白，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约1-3、约0.1-2、约0.1-3、约2-8或约0.1-8ppm的HCP，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，AEX色谱步骤的上样、pH、电导率以及洗脱pH和/或电导率可以被修改，以实现变体和/或杂质远离所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的期望分布。
在某些实施例中，可以执行AEX色谱分离，并且可以汇集级分的组合，以在仅调节电荷变体浓度之外或代替仅调节电荷变体浓度，实现所期望的过程相关杂质和/或产物相关物质水平的组合。
在某些实施例中，光谱方法，如UV、NIR、FTIR、荧光、拉曼可以用于以线上、近线或线内模式监测变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如，所关注的蛋白质的电荷变体、聚集体、片段；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的水平，然后这可以用于控制从AEX废水中收集的汇集材料中的变体和/或杂质的水平。在某些实施例中，线上、近线或线内监测方法可以用于色谱步骤的废水管上或收集容器中，以能够实现所期望的产物质量/回收。在某些实施例中，UV信号可以用作实现适当产物质量/回收的替代物，其中可以适当地处理UV信号，包含但不限于，如整合、分化、移动平均值等处理技术，使得可以解决正常过程可变性并且可以实现目标产物质量。在某些实施例中，此类测量可以与线内稀释方法组合，使得上样/洗涤的离子浓度/电导率可以通过反馈控制，并且因此促进产物质量控制。
在某些实施例中，CEX和AEX和/或MM方法的组合可以用于制备包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物，所述实施例包含其中一种技术与另一种技术以互补/补充方式使用的某些实施例。在一些实施例中，可以执行这样的组合，使得某些子物种主要通过一种技术去除，使得组合提供所期望的最终组成/产物质量。在一些实施例中，此类组合包含使用另外的色谱、过滤、纳米过滤、超滤/渗滤(UF/DF)步骤，以便实现所期望的产物质量。
混合模式色谱
混合模式(“MM”)色谱柱、膜装置、单片装置或深度过滤器培养基也可以被用于制备包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物。混合模式色谱，在本文中也称为“多峰色谱”，是利用包括配体的载体的色谱策略，所述配体能够提供与待结合的物质相互作用的至少两个不同并且在某些实施例中合作的位点。在某些实施例中，这些位点中的一个在配体与所关注的物质之间提供了有吸引力的电荷相互作用类型，并且另一个位点提供了电子受体-供体相互作用和/或疏水性和/或亲水性相互作用。电子供体-受体相互作用包含相互作用，如氢键合、π-π、阳离子-π、电荷转移、偶极-偶极、诱导偶极等。
本领域已知的任何混合模式色谱树脂都适合用于制备包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物。在某些实施例中，用于混合模式分离的树脂是CaptoTMMMC ImpRes。CaptoTMMMC ImpRes是具有含有羧酸和羟基配体的高流动琼脂糖的碱性基质的具有多峰官能度的弱阳离子交换器。在某些实施例中，用于混合模式分离的树脂是CaptoTMAdhere ImpRes和/或CaptoTMAdhere。CaptoTMAdhere ImpRes和CaptoTMAdhere是具有多峰官能度的强阴离子交换器。碱性基质是具有配体(N-苄基-N-甲基乙醇胺)的高度交联的琼脂糖，其表现出许多用于相互作用的官能度，如离子相互作用、氢键合和疏水相互作用。在某些实施例中，用于混合模式分离的树脂选自PPA-HyperCel和HEA-HyperCel。PPA-HyperCel和HEA-HyperCel的碱性基质是高孔隙度交联纤维素。其配体分别是苯基丙胺和己胺。苯基丙胺和己胺为蛋白质分离提供了不同的选择性和疏水性选择。另外的混合模式色谱载体包含但不限于NuviaTMC Prime、ToyoPearlTMMX Trp 650M和HCX。
在某些实施例中，混合模式色谱树脂包含直接地或经由间隔子与有机或无机载体偶联的配体，所述配体有时表示为碱性基质。载体可以呈颗粒的形式，如基本上球形的颗粒、单片、过滤器、膜、表面、毛细管等。在某些实施例中，载体由天然聚合物，如交联的碳水化合物材料，如琼脂糖、琼脂、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、魔芋、卡拉胶、结冷胶、海藻酸盐等制备。为了获得高吸附能力，载体可以是多孔的，并且然后将配体与外表面以及与孔表面偶联。此类天然聚合物载体可以根据标准方法制备，如反向悬浮凝胶(SHjerten:《生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)》79(2),393-398(1964))。可替代地，载体可以由合成聚合物，如交联的合成聚合物，例如，苯乙烯或苯乙烯衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等进行制备。这种合成聚合物可以根据标准方法产生，参见例如，“通过悬浮聚合开发的基于苯乙烯的聚合物载体”(R Arshady：《化学和工业(Chimica e L'Industria)70(9),70-75(1988))。多孔的天然或合成聚合物载体也可从商业来源，如瑞典乌普萨拉的安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)获得。
在某些实施例中，将所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)以约10-100g/L、约20-90g/L、约30-60g/L、约30-80g/L、约40-70g/L或约50-60g/L的水平上样到混合模式色谱树脂上。在某些实施例中，所述所关注的蛋白质以约50-60g/L的水平上样到所述混合模式色谱树脂上。
在某些实施例中，本发明的方法可以用于从所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)选择性地去除、显著减少或基本上去除所有变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、带电变体，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白，其中所述变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、带电变体，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白在流通和洗脱级分中被收集，并且所述所关注的蛋白质在洗脱液级分中被富集，由此产生具有水平降低的变体和/或杂质的蛋白质组合物。
在某些实施例中，从混合模式色谱步骤收集的包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括水平降低的变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如蛋白质聚集体、片段，例如半抗体、带电变体，例如酸性或碱性物种；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白。在一些实施例中，
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约25％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3.9％、约3.8％、约3.7％、约3.6％、约3.5％、约3.4％、约3.3％、约3.2％、约3.1％、约3％、约2.9％、约2.8％、约2.7％、约2.6％、约2.5％、约2.4％、约2.3％、约2.2％、约2.1％、约2％、约1.9％、约1.8％、约1.7％、约1.6％、约1.5％、约1.4％、约1.3％、约1.2％、约1.1％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.1-25％、约0.1-20％、约1-18％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％或约0.6-18％或约1-17％的半抗体，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约45％、约44％、约43％、约42％、约41％、约40％、约39％、约38％、约37％、约36％、约35％、约34％、约33％、约32％、约31％、约30％、约29％、约28％、约27％、约26％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约3％、约2％或约1％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约1-45％、约1-40％、约1-35％、约1-25％、约5-35％、约10-35％、约15-35％、约1-30％、约1-25％、约1-24％、约5-25％、约5-30％、约5-45％、约10-25％、约10-30％、约10-40％、约15-25％、约15-30％、约15-35％、约15-25％、约16-31％、约17-26％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括大于约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的主要物种，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，所述洗脱液级分包括约40-99％、约45-99％、约50-99％、约55-99％、约50-90％、约55-90％、约50-80％、约55-80％、约50-70％、约55-70％、约50-65％、约55-65％、约58-62％、约59-61％、约58-63％、约58-67％、约53-61％、约46-67％或约46-66％的主要物种，例如，抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.01-10％、约0.01至5％、约0.01至1％、约0.01-0.4％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约0.1-6％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％或约0.3％的蛋白质片段，例如抗体片段，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.1-1.1％、约0.1-0.8％、约0.6-1.5％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的蛋白质片段，并且范围在前述中的一种或多种内。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括所述所关注的蛋白质的大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的单体，例如，抗体单体，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括所述所关注的蛋白质的约90-99.9％、约90-95％、约94-99.9％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体，例如，抗体单体。
在一些实施例中，包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的洗脱液级分包括小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的宿主细胞蛋白，并且范围在前述中的一种或多种内。在一些实施例中，洗脱液级分包括约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约1-3、约0.1-2、约0.1-3、约2-8或约0.1-8ppm的HCP，并且范围在前述中的一种或多种内。
在某些实施例中，混合模式色谱步骤的上样、pH、电导率以及洗脱pH和/或电导率可以被修改，以实现变体和/或杂质远离所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的期望分布。
在某些实施例中，可以执行混合模式色谱分离，并且可以汇集级分的组合，以在仅调节电荷变体浓度之外或代替仅调节电荷变体浓度，实现所期望的过程相关杂质和/或产物相关物质水平的组合。
在某些实施例中，光谱方法，如UV、NIR、FTIR、荧光、拉曼可以用于以线上、近线或线内模式监测变体和/或杂质，例如，产物相关物质，例如，所关注的蛋白质的电荷变体、聚集体、片段；和/或过程相关杂质，例如宿主细胞蛋白的水平，然后这可以用于控制从混合模式废水中收集的汇集材料中的变体和/或杂质的水平。在某些实施例中，线上、近线或线内监测方法可以用于色谱步骤的废水管上或收集容器中，以能够实现所期望的产物质量/回收。在某些实施例中，UV信号可以用作实现适当产物质量/回收的替代物，其中可以适当地处理UV信号，包含但不限于，如整合、分化、移动平均值等处理技术，使得可以解决正常过程可变性并且可以实现目标产物质量。在某些实施例中，此类测量可以与线内稀释方法组合，使得上样/洗涤的离子浓度/电导率可以通过反馈控制，并且因此促进产物质量控制。
在某些实施例中，CEX和AEX和/或混合模式方法的组合可以用于制备包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物，所述实施例包含其中一种技术与另一种技术以互补/补充方式使用的某些实施例。在一些实施例中，可以执行这样的组合，使得某些子物种主要通过一种技术去除，使得组合提供所期望的最终组成/产物质量。在一些实施例中，此类组合包含使用另外的色谱、过滤、纳米过滤、超滤/渗滤(UF/DF)步骤，以便实现所期望的产物质量。
病毒过滤/纳米过滤
本发明的某些实施例采用纳米过滤步骤，以减少病毒上样并浓缩所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)。在中间/最终精制色谱步骤之后，洗脱液池可以经受纳米过滤步骤。在实施例中，纳米过滤步骤经由一个或多个纳米过滤器或病毒过滤器完成。在具体实施例中，纳米过滤步骤可以经由包含预过滤器和纳米过滤器或病毒过滤器的过滤器系来完成。过滤器可以是本领域中可用于此目的的任何已知过滤器，并且可以包含例如，EMD密理博Viresolve VPro、Viresolve NFP、Viresolve NFR、Pellicon或Millipak过滤器、赛多利斯Vivaspin、ViroStart CPV或Sartopore过滤器、颇尔(Pall)Ultipor DVD、DV50、DV20过滤器或来自日本旭化成株式会社(Asashi Kasei Pharma)的Planova 15N、20N和35N病毒去除过滤器。在某些实施例中，纳米过滤过滤器具有介于约15nm与约200nm之间的平均孔径。在具体实施例中，纳米过滤器可以具有介于约15nm与约72nm之间、或介于约19nm与约35nm之间、或在或在约15nm、19nm、35nm或72nm的平均孔径。本领域技术人员将理解，过滤器的类型和数量的选择将取决于正在处理的样品的容积和所期望的过滤性能。
超滤/渗滤
本发明的某些实施例采用超滤和渗滤步骤，以进一步浓缩和调配所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)。纳米过滤步骤之后可以进行超滤和渗滤，以实现目标原料药浓度和在配制前的缓冲液条件。
超滤详细描述于：《微过滤和超滤：原理与应用(Microfiltration andUltrafiltration:Principles and Applications)》,L.Zeman和A.Zydney(纽约的纽约马赛尔德克有限公司(Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.),1996)；以及《超滤手册(Ultrafiltration Handbook)》,Munir Cheryan(技术经济出版社(TechnomicPublishing),1986；ISBN第87762-456-9号)。一种过滤过程是如名称为“药物过程过滤目录”的密理博目录第177-202页(马萨诸塞州贝德福德(Bedford,Mass.),1995/96)中所描述的切向流过滤。超滤通常被认为意指使用孔径小于0.1μm的过滤器的过滤。通过采用具有这种小孔径的过滤器，样品的容积可以通过使样品缓冲液渗透通过过滤器膜孔，同时将蛋白质，如抗体保留在膜表面上方来减小。
渗滤是使用膜过滤器去除和交换盐、糖和非水性溶剂，以分离没有结合物种，以去除低分子量物种和/或以引起离子和/或pH环境的快速变化的方法。微溶质通过将溶剂添加到以大约等于渗透液流速的速率进行渗滤的溶液中而最有效地去除。这以恒定的容积从溶液中洗涤出微量物种，由此有效地纯化保留的所关注的蛋白质。在本发明的某些实施例中，渗滤步骤用于交换与本发明结合使用的各种缓冲液，任选地在另外的色谱或其它纯化步骤之前，以及用于从蛋白质制剂中去除杂质。
本领域的普通技术人员可以为UF/DF操作选择适当的膜过滤装置。合适用于本发明的膜盒的实例包含但不限于来自EMD密理博公司的具有10kD、30kD或50kD膜的Pellicon2或Pellicon 3盒、来自通用电气医疗公司的Kvick 10kD、30kD或50kD膜盒以及来自颇尔公司(Pall Corporation)的Centramate或Centrasette 10kD、30kD或50kD盒。
一旦完成渗滤步骤，溶液的蛋白质浓度就可以用渗滤缓冲液调整到介于约5％与约20％(w/v)之间、或介于约10％与约20％(w/v)之间、或介于约15％与约20％(w/v)之间、或介于约18％与约20％(w/v)之间的最终浓度，或调整到约5％或6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％或20％的最终浓度进行调配。
在一些实施例中，调配的溶液可以通过首先过滤通过有或没有预过滤器的绝对孔径为0.2微米或更小的膜过滤器进一步灭菌。然后，将溶液无菌分配到最终容器中以进行适当密封，采集样品进行检测。
示例性纯化策略
在某些实施例中，初级回收可以通过依序采用pH降低、离心和过滤步骤进行，以从产生生物反应器收获物中去除细胞和细胞碎片(包含HCP)。在某些实施例中，本发明涉及使来自所述样品的样品混合物经受一个或多个亲和(例如，蛋白A)、AEX、CEX和/或MM纯化步骤。本发明的某些实施例可以包含另外的纯化步骤，所述另外的纯化步骤可以在亲和和/或离子交换色谱步骤之前、期间或之后执行。另外的纯化程序的实例包含乙醇沉淀、等电聚焦、反相HPLC、二氧化硅上的色谱、肝素SepharoseTM上的色谱、另外的阴离子交换色谱和/或另外的阳离子交换色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳和透析。
在某些实施例中，未结合的流通和洗涤级分可以被进一步分馏，并且可以汇集提供目标产物纯度的部分的组合。
在某些实施例中，蛋白质浓度可以被调整以实现抗体产物与变体和/或杂质，例如，产物相关物质和/或过程相关杂质之间的差异分配行为，使得纯度和/或产率可以被进一步改善。在某些实施例中，上样可以在上样操作期间以不同的蛋白质浓度执行，以改善任何特定纯化步骤的产物质量/产率。在某些实施例中，柱温可以被单独改变以改善任何特定纯化步骤的分离效率和/或产率。
在某些实施例中，上样、洗涤和/或洗脱缓冲液基质可以不同或由化学品的混合物构成，同时实现相似的“树脂相互作用”行为，使得可以实现上述新型分离。例如，但并非限制于，上样和洗涤缓冲液在离子强度或pH方面可以不同，而在洗涤步骤期间实现的产物的洗脱方面的功能保持基本上类似。
在某些实施例中，上样、洗涤和/或洗脱步骤可以通过在柱废水中或收集池上或两者中的变体和/或杂质水平，例如，产物相关物质水平和/或过程相关杂质水平的线内、近线或离线测量进行控制，以便实现目标产物质量和/或产率。在某些实施例中，上样浓度可以通过线内或分批或连续稀释用缓冲液或其它溶液进行动态控制，以实现提高分离效率和/或产率所必需的分配。
V.测定样品纯度的方法
测定带电变体
使用本文所述的技术产生的色谱样品中的带电变体，例如酸性或碱性物种的水平可以通过本领域已知的任何基于带电的分离技术进行分析。例如，带电变体，例如酸性物种或碱性物种可以通过基于带电的分离技术，如等电聚焦(IEF)凝胶电泳、毛细管等电聚焦(cIEF)凝胶电泳、阳离子交换色谱(CEX)和阴离子交换色谱(AEX)来检测。
当使用基于IEF的方法分析抗体时，酸性物种是具有较低表观pI的变体，并且碱性物种是具有较高表观pI的变体。当通过基于色谱的方法分析时，酸性物种和碱性物种基于其相对于主峰的保留时间来定义。酸性物种是早于来自CEX的主峰或晚于来自AEX的主峰洗脱的变体，碱性物种是晚于来自CEX的主峰或早于来自AEX的主峰洗脱的变体。
在某些实施例中，带电变体是通过离子交换色谱步骤测定的。在一些实施例中，定量基于检测到的峰的相对面积百分比。
测定尺寸变体
在某些实施例中，分析使用本文所述的技术产生的色谱样品中的聚集体、单体、片段和半抗体的水平。在某些实施例中，聚集体、单体和片段使用每种分子的尺寸排阻色谱(SEC)方法进行测量。在某些实施例中，定量基于检测到的峰的相对面积。在一些实施例中，半抗体的水平使用非还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠(CE-SDS)测量。
任何另外的技术，如质谱法，也可以被用于测定尺寸变体。
测定宿主细胞蛋白
本发明还提供了用于确定本发明的组合物中的宿主细胞蛋白(HCP)浓度的残余水平的方法。如上所述，HCP期望被排除在最终目标物质产物之外。示例性HCP包含源自抗体产生源的蛋白质。未能从靶抗体中鉴定并且充分去除HCP可能导致受试者中的功效降低和/或不良反应。
如本文所使用的，术语“HCP ELISA”是指其中测定中使用的第二抗体对由用于生成所关注的抗体的细胞产生的HCP具有特异性的ELISA。第二抗体可以根据本领域技术人员已知的常规方法产生。例如，第二抗体可以使用通过假产生和纯化运行，即，使用用于产生所关注的抗体的相同细胞系，但所述细胞系没有用抗体DNA转染获得的HCP产生。在示例性实施例中，第二抗体使用与在所选择的细胞表达系统，即，用于产生靶抗体的细胞表达系统中表达的那些HCP类似的HCP产生。
通常，HCP ELISA夹层包括包含介于两层抗体，即，第一抗体和第二抗体之间的液体样品。样品被温育，在此期间，样品中的HCP被第一抗体，例如但不限于，山羊抗CHO捕获，被亲和纯化(赛纳斯公司(Cygnus))。添加对于由用于产生抗体的细胞产生的HCP具有特异性的标记第二抗体或抗体的共混物，并在样品内与HCP结合。在某些实施例中，第一抗体和第二抗体是多克隆抗体。在某些方面，第一抗体和第二抗体是针对HCP升高的多克隆抗体的共混物。样品中含有的HCP的量基于第二抗体的标签使用适当的测试进行确定。
HCP ELISA可以用于确定抗体组合物，如使用上述过程获得的洗脱液或流通液中的HCP的水平。本发明还提供了包括抗体的组合物，其中所述组合物不具有如通过HCP酶联免疫吸附测定(“ELISA”)确定的可检测水平的HCP。
VI.使用本发明的组合物的处理方法
包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物可以用于治疗受试者的任何病症，其中所述组合物中包括的治疗性蛋白质适合用于治疗。
“病症”是将由用蛋白质治疗而受益的任何病状。这包含慢性和急性病症或疾病，包含使受试者易患所谈论的病症的那些病理状况。在抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分(如玛弗利木单抗)的情况下，可以施用治疗有效量的组合物以治疗GM-CSFRα相关病症。
GM-CSFRα相关病症包含其中GM-CSFRα活性的抑制预期缓解病症的症状和/或进展的病症。由于GM-CSF与GM-CSFRα特异性结合，因此GM-CSF的病理和/或症状效果也可以通过抑制GM-CSF与GM-CSFRα的结合来抵消。因此，GM-CSFRα相关病症可以例如通过患有所述病症的受试者的生物流体中的GM-CSFRα和/或GM-CSF的浓度的增加(例如，受试者的血清、血浆、滑膜液等中的GM-CSFRα和/或GM-CSF的浓度的增加)来证明。
包括所关注的蛋白质，例如抗体或其抗原结合部分，例如抗GM-CSFRα抗体(如玛弗利木单抗)的本发明的组合物可以用于治疗本领域已知的任何GM-CSFRα相关疾病或病症，包含但不限于自身免疫性、炎性和/或呼吸病状、疾病和病症。在一个实施例中，GM-CSFRα相关病症包含自身免疫性疾病(包含类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、类风湿性脊柱炎(rheumatoid spondylitis)、骨关节炎(osteoarthritis)和痛风性关节炎(goutyarthritis)、过敏(allergy)、多发性硬化(multiple sclerosis)、自身免疫性糖尿病(autoimmune diabetes)、自身免疫性葡萄膜炎(autoimmune uveitis)、肾病综合征(nephrotic syndrome)、多系统自身免疫性疾病(multisystem autoimmune disease)、狼疮(lupus)(包含全身性狼疮(systemic lupus)、狼疮肾炎(lupus nephritis)和狼疮脑炎(lupus cerebritis))、克罗恩氏病(Crohn's disease)和自身免疫性听力丧失(autoimmune hearing loss))、活动性轴向脊柱关节炎(active axialspondyloarthritis，活性axSpA)和非放射学轴向脊柱关节炎(non-radiographic axialspondyloarthritis，nr-axSpA)、传染病(包含疟疾(malaria)、脑膜炎(meningitis)、获得性免疫缺陷综合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)、继发于感染的流感和恶病质)、败血症(sepsis)(包含败血性休克(septic shock)、内毒性休克(endotoxicshock)、革兰氏阴性败血症(gram negative sepsis)和毒性休克综合征(toxic shocksyndrome))、同种异体移植物排斥(allograft rejection)和移植物抗宿主病(graftversus host disease)、恶性肿瘤(malignancy)、骨髓性白血病(myeloid leukemia)、肺病(包含成人呼吸窘迫综合征(adult respiratory distress syndrome，ARDS)、冲击肺(shock lung)、慢性肺部炎性疾病(chronic pulmonary inflammatory disease)、肺结节病(pulmonary sarcoidosis)、肺纤维化(pulmonary fibrosis)、硅肺(silicosis)、先天性间质性肺疾病(idiopathic interstitial lung disease)和慢性阻塞性气道疾病(chronic obstructive airway disorder，COPD)、如哮喘(asthma))、肠病(包含炎性肠病(inflammatory bowel disorder)、先天性炎性肠病(idiopathic inflammatory boweldisease)、克罗恩氏病和克罗恩氏病相关病症(包含膀胱、阴道和皮肤中的瘘管；肠阻塞(bowel obstruction)；脓肿(abscesse)；营养缺陷；皮质类固醇使用引起的并发症；关节炎症；结节性红斑(erythem nodosum)；坏疽性脓皮症(pyoderma gangrenosum)；眼病变、克罗恩氏相关关节痛(Crohn's related arthralgias)、瘘管性克罗恩氏不确定性结肠炎和结肠袋炎(fistulizing Crohn's indeterminant colitis and pouchitis))、心脏病症(包含心脏缺血(ischemia of the heart)、心功能不全(heart insufficiency)、再狭窄(restenosis)、充血性心力衰竭(congestive heart failure)、冠状动脉疾病(coronaryartery disease)、心绞痛(angina pectoris)、心肌梗塞(myocardial infarction)、心脏停搏导致的心血管组织损伤(cardiovascular tissue damage caused by cardiacarrest)、心脏转流导致的心血管组织损伤(cardiovascular tissue damage caused bycardiac bypass)、心源性休克(cardiogenic shock)以及高血压(hypertension)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、心肌病(cardiomyopathy)、冠状动脉痉挛(coronary arteryspasm)、冠状动脉疾病(coronary artery disease)、瓣膜病(valvular disease)、心律失常(arrhythmias)以及心肌病(cardiomyopathy)、脊柱关节病(spondyloarthropathy)(包含强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis)、银屑病关节炎/脊柱炎(psoriaticarthritis/spondylitis)、肠病性关节炎(enteropathic arthritis)、反应性关节炎(reactive arthritis)或赖特综合征(Reiter's syndrome)以及未分化脊柱关节病(undifferentiated spondyloarthropathy)、代谢障碍(包含肥胖症(obesity)和糖尿病(diabetes)，包含1型糖尿病、2型糖尿病、糖尿病神经病变(diabetic neuropathy)、周围神经病变(peripheral neuropathy)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)、糖尿病溃疡(diabetic ulceration)、视网膜病溃疡(retinopathy ulceration)和糖尿病大血管病(diabetic macrovasculopathy)、贫血、疼痛(包含急性和慢性疼痛、如神经性疼痛(neuropathic pain)和术后疼痛(post-operative pain)、慢性下背部疼痛(chroniclower back pain)、丛集性头痛(cluster headache)、疱疹神经痛(herpes neuralgia)、幻肢疼痛(phantom limb pain)、中央疼痛(central pain)、牙痛(dental pain)、阿片类抗性疼痛(opioid-resistant pain)、内脏疼痛(visceral pain)、手术疼痛(surgical pain)、骨损伤疼痛(bone injury pain)、分娩过程中的疼痛(pain during labor anddelivery)、烧伤导致的疼痛，包含晒伤(sunburn)、产后疼痛(post partum pain)、偏头痛(migraine)、心绞痛疼痛(angina pain)以及包含膀胱炎(cystitis)的泌尿生殖道相关疼痛)、肝病症(包含肝炎(hepatitis)、酒精性肝炎(alcoholic hepatitis)、病毒性肝炎(viral hepatitis)、酒精性肝硬化(alcoholic cirrhosis)、a1抗酪蛋白缺乏症(a1antitypsin deficiency)、自身免疫性肝硬化(autoimmune cirrhosis)、隐源性肝硬化(cryptogenic cirrhosis)、暴发性肝炎(fulminant hepatitis)、乙型肝炎和丙型肝炎(hepatitis B and C)以及脂肪性肝炎(steatohepatitis,cystic fibrosis)、囊性纤维化(cystic fibrosis)、原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis)、硬化性胆管炎(sclerosing cholangitis)和胆道阻塞(biliary obstruction)、皮肤和指甲病(包含银屑病(psoriasis)(包含慢性斑块型银屑病(chronic plaque psoriasis)、点滴状银屑病(guttate psoriasis)、反转型银屑病(inverse psoriasis)、脓疱型银屑病(pustularpsoriasis)以及其它银屑病病症)、寻常性天疱疮(pemphigus vulgaris)、硬皮病(scleroderma)、特应性皮炎(atopic dermatitis)(湿疹(eczema))、结节病(sarcoidosis)、结节性红斑(erythema nodosum)、化脓性汗腺炎(hidradenitissuppurative)、扁平苔藓(lichen planus)、斯威特综合征(Sweet's syndrome)、硬皮病(scleroderma)和白癜风(vitiligo))、血管炎(vasculitides)(包含贝赛特氏症(Behcet'sdisease))以及其它病症、如幼年型类风湿性关节炎(juvenile rheumatoid arthritis，JRA)、子宫内膜异位(endometriosis)、前列腺炎(prostatitis)、脉络膜新生血管(choroidal neovascularization)、坐骨神经痛(sciatica)、干燥综合征(Sjogren'ssyndrome)、葡萄膜炎(uveitis)、湿性黄斑变性(wet macular degeneration)、骨质疏松症(osteoporosis)和骨关节炎(osteoarthritis)。
在一个实施例中，GM-CSFRα相关疾病或病症是类风湿性关节炎。在一些实施例中，GM-CSFRα相关疾病或病症是巨细胞动脉炎(giant cell arteritis，GCA)或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)或细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)。在另一个实施例中，GM-CSFRα相关疾病或病症是2019冠状病毒病(COVID-19)。
如本文所使用的，术语“受试者”旨在包含活生物体，例如，原核生物和真核生物。受试者的实例包含哺乳动物，例如，人、犬、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在本发明的具体实施例中，受试者是人。
如本文所使用的，术语“治疗”或“治疗”是指治疗性治疗和预防性或预防措施两者。需要治疗的那些包含已经患有所述病症的那些，以及待预防所述病症的那些。
在一个实施例中，本发明提供了一种向受试者施用包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分的组合物的方法，使得GM-CSFRα活性被抑制或GM-CSFRα相关病症被治疗。在一个实施例中，GM-CSFRα是人GM-CSFRα，并且受试者是人受试者。在一个实施例中，抗GM-CSFRα抗体是玛弗利木单抗。
所述组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。示例性施用途径/模式包含静脉内、肌内、鼻内、口服、局部或皮下递送。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或模式将根据所期望的结果而变化。
剂量方案可以被调整以提供最佳的期望应答(例如，治疗性或预防性应答)。例如，可以施用单次团注，可以随时间推移施用若干次分剂量，或可以按治疗状况的紧急情况所表明的成比例地减少或增加剂量。在某些实施例中，以剂量单位形式调配肠胃外组合物以易于施用以及剂量的均一性是特别有利的。如本文所使用的，剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位包括被计算以产生与所需的药物载体相关的所期望的治疗效果的预定量的活性化合物。本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)活性化合物的独特特性以及待实现的特定治疗性或预防性效果；以及(b)复合此类活性化合物用于治疗个体敏感性的领域中的固有限制。
治疗或预防有效量的本发明的组合物的示例性非限制性范围为约0.01-30mg/kg、0.1-20mg/kg、1-10mg/kg、2-8mg/kg或5-15mg/kg。关于包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分(如玛弗利木单抗)的组合物，示例性剂量为每隔一周约30、50、100或150mg。
在一些实施例中，具体地用于治疗类风湿性关节炎，示例性剂量包含至多10mg/kg的单次静脉内剂量。在一些实施例中，示例性剂量包含每两周一次至多150mg的重复皮下剂量持续至多3年。
在一些实施例中，具体地用于治疗COVID-19，示例性剂量包含约6mg/kg或约10mg/kg的单次静脉内剂量。
在一些实施例中，具体地用于治疗巨细胞动脉炎，示例性剂量包含每两周一次约150mg的皮下剂量持续26周。
应注意的是，剂量值可以随要缓解的病状的类型和严重程度变化。应当进一步理解，对于任何具体受试者，应当根据个体需要和施用或监督组合物的施用的人士的专业判断，随时间调整具体剂量方案，并且本文所示的所述剂量范围仅是示例性的，并且不旨在限制要求保护的组合物的范围或实践。
VII.含有本发明的组合物的药物调配物
本发明进一步提供了包括本发明的组合物的制剂和调配物。应理解，包括本文所述的所关注的蛋白质，例如抗体及其抗原结合部分的组合物可以如下文所述进行调配或制备。在一个实施例中，抗体是抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分。在另一个实施例中，抗GM-CSFRα抗体是玛弗利木单抗。
在某些实施例中，本发明的组合物可以与药学上可接受的载体一起调配成药物(治疗性)组合物，并且可以通过本领域已知的多种方法施用。如本领域技术人员将理解的，施用途径和/或模式将根据所期望的结果而变化。
术语“药学上可接受的载体”意指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种无毒材料。此类制剂可以常规地含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容载体以及任选地其它治疗剂。此类药学上可接受的制剂还可以常规地含有适合用于向人施用的相容固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。术语“载体”表示天然或合成的有机或无机成分，其与活性成分相组合以促进应用。药物组合物的组分还能够以这样的方式与本发明的抗体以及彼此共混合，使得不存在将显著损害所期望的药物功效的相互作用。
本发明的组合物以本领域已知并且可接受用于治疗用途的形式存在。在一个实施例中，本发明的组合物的调配物是液体调配物。在另一个实施例中，本发明的组合物的调配物是冻干调配物。在另外的实施例中，本发明的组合物的调配物是重构液体调配物。在一个实施例中，本发明的组合物的调配物是稳定液体调配物。在一个实施例中，本发明的组合物的液体调配物是水性调配物。在另一个实施例中，液体调配物是非水性的。在具体实施例中，本发明的组合物的液体调配物是水性调配物，其中水性载体是蒸馏水。
本发明的组合物可以被调配用于特定施用途径，如口服、鼻腔、肺、局部(包含颊和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外施用。调配物可以方便地以单位剂型呈递，并且可以通过药学领域中已知的任何方法制备。可以与载体材料组合以产生单个剂型的活性成分的量将根据正在被治疗的受试者和特定施用模式而变化。可以与载体材料组合以产生单个剂型的活性成分的量通常将是产生治疗效果的组合物的所述量。举例来说，在某些实施例中，抗体(包含抗体片段)被调配用于静脉内施用。在某些其它实施例中，抗体(包含抗体片段)被调配用于局部递送到心血管系统，例如，经由导管、支架、线、心肌内递送、心包内递送或心内递送。在具体实施例中，所述组合物包括抗GM-CSFRα抗体，如玛弗利木单抗，并且被调配用于皮下施用。
适合用于局部或经皮施用的本发明的组合物的调配物包含粉末、喷雾剂、软膏剂、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶、溶液、贴片和吸入剂。活性化合物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体，以及与可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合(美国专利第7,378,110号；第7,258,873号；第7,135,180号；第7,923,029号；以及美国公开第20040042972号)。
如本文所使用的，短语“肠胃外施用”和“在肠胃外施用”意指除肠内和局部施用之外的施用模式，通常通过注射，并且包含但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
本发明的组合物的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得有效实现具体患者、组合物以及施用模式所期望的治疗反应的活性成分的量，而对患者无毒。选定的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包含所采用的本发明的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所采用的具体化合物的排泄速率；治疗持续时间；与所采用的具体组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料；所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况以及既往病史；以及医学领域中熟知的类似因素。
通过以下实例进一步说明本发明，所述实例不应以任何方式解释为限制性的。
实例
实例1：用于产生抗GM-CSFRα抗体的上游过程
本实施例提供了用于产生抗GM-CSFRα抗体，即玛弗利木单抗的上游过程的详细信息。开发工作由一系列10L生物反应器研究和200L演示运行(过程7 200L非GMP批次1)组成。首次10L实验(1号研究)的目标是建立玛弗利木单抗上游过程并评价进料百分比。在此初始实验期间，一个生物反应器(R1)在对照条件下运行，并且另一个生物反应器(R2)在第6天至第14天的进料百分比增加的情况下运行以补偿细胞密度的增加。生物反应器2中的进料百分比的增加导致乳酸盐产生增加，这和与对照相比较低的pH趋势相关。随后，产物质量结果显示，较低的pH导致更期望的电荷曲线。
为了确认从首次实验获得的结果，在第二次研究(2号研究)中重复生物反应器1和2的条件，在第4天两个生物反应器中添加pH从6.90转变到6.75。来自生物反应器3和4的结果表明，在第6天进料百分比的增加和在第4天pH设定点的降低两者都对抗体的带电物种有益。
第三次实验，3号研究，由四个10L生物反应器组成。对照，即生物反应器5匹配了来自先前运行的生物反应器4的条件(从第6天到第14天的进料百分比增加，并且在第4天pH转变到6.75)。生物反应器6维持与对照相同的进料方案，并且在第4天将pH转变到6.65而不是6.75。生物反应器7维持与对照相同的pH转变，并且在第2天开始进料，在第6天增加，并且在第9天减少。最后，生物反应器8在与对照相同的条件下运行，并在第9天时添加温度从36转变到32℃。在生物反应器6-8中测试的条件导致不良的培养性能和/或不期望的产物质量；因此，选择对照条件(生物反应器4、5)用于规模放大到200L演示运行。
在4号研究中有另外三个10L生物反应器与200L演示运行同时运行。生物反应器9是200L生物反应器的直接附属，并且生物反应器10用于评价接种时的细胞生成数量。生物反应器9和10与200L演示运行相当，并且产生出具有类似产物质量的材料。
表22-26中示出了来自1号研究-4的详细结果。
缩写词和定义
术语 定义
CDMO 合同开发和制造组织
kDa 千道尔顿
VCD 活细胞密度
DO 溶解氧
MS 微喷射器
NR CE-SDS 非还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠
IEC 离子交换色谱
SEC 尺寸排阻色谱
表1-1中捕获了用于所有10L运行和200L演示运行的生物反应器参数。
表1-1：生物反应器参数
*在细胞培养过程的优化期间，确定了培养基进料百分比的增加可以提前一天，在第5天而不是第6天发生，以减少不需要的乳酸盐消耗，并实现所期望的产物质量。
表1-2中捕获了用于所有10L运行和200L演示运行的葡萄糖进料策略。
表1-2：葡萄糖和消泡剂进料方案
表1-3中捕获了用于10L和200L处理的澄清参数。
表1-3：澄清参数
结果和讨论
1号研究-生物反应器1(R1)和生物反应器2(R2)
实验条件
表1-4中捕获了1号研究的实验条件。此实验的目标是建立玛弗利木单抗上游过程并评价进料百分比。
表1-4：1号研究的实验条件
产生数据
生物反应器1实现了比生物反应器2更高的活细胞密度(VCD)，并且两者都具有比生物反应器4x 10L R2更高的峰VCD。生物反应器2的活力与4x 10L R2一致，而生物反应器1维持>90％的活力直到第15天。
生物反应器1与2之间的最终活力差异可归因于第8-15天在生物反应器2中观察到乳酸盐的增加。乳酸盐的增加导致与生物反应器1和4x 10LR2两者相比，生物反应器2的pH曲线较低。对于生物反应器2，也观察到较高的渗透压，这可归因于进料％增加以及碱添加增加以补偿较低的pH。CO2和所有其它代谢物在运行之间都相当。1号研究中产生生物反应器的所有另外的数据可见于表1-22中。
滴度
尽管最终活力较低，但生物反应器2产生的滴度略高于生物反应器1，并且第15天的值与4x 10L R2几乎相同。来自此实验的最终滴度结果符合对3阶段条件的期望。
产物质量
制备样品用于TECAN纯化和产物质量分析。提交了来自第13天和第15天的样品用于NR CE-SDS、SEC和聚糖。除了第13天和第15天样品之外，还提交了来自下游缩小模型(SDM)的CEX上样材料用于NR CE-SDS和IEC。在两种条件下均观察到第13天到第15天的半抗体的增加(错误！找不到参考源。)。然而，SDM的CEX上样材料中的半抗体水平均低于两个反应器的第13天和第15天值。差异被认为是由于与第13天和15天样品相比，SDM材料在2-8℃下的保持时间增加。随时间推移，半抗体的减少与先前保持数据一致。先前的研究在CDMO外部进行，以评价影响半抗体的细胞培养条件；然而，这些研究没有成功鉴定调节此属性的参数。如表1-7中所示，SEC结果显示第13天到第15天单体略微减少，并且如预期，片段和聚集体水平较高，这已经通过整个纯化过程进行处理。聚糖结果随时间推移是稳定的。IEC结果可见于错误！找不到参考源。。在两个生物反应器中观察到酸性峰的增加。然而，与生物反应器1相比，生物反应器2的酸性物种低大约8％，并且假设这是在整个运行中较低的细胞培养pH的结果。
表1-5：1号研究NR CE-SDS
生物反应器ID 天 半抗体(％) IgG(％)
R1 13.0 8.7 90.3
R1 15.0 9.3 86.7
R1 SDM CEX上样 7.39 89.2
R2 13.0 11.8 87.6
R2 15.0 14.3 85.7
R2 SDM CEX上样 6.2 90.8
表1-6：1号研究IEC
表1-7：1号研究SEC
生物反应器ID 天 单体(％) 聚集体(％) 片段(％)
R1 13 96.7 1.6 1.7
R1 15 95.3 2 1.7
R2 13 96.9 1.9 1.2
R2 15 96.2 2 1.8
2号研究-生物反应器3(R3)和生物反应器4(R4)
在研究2的结论中，假设较低的培养pH导致生物反应器2的较低水平的酸性物种。为了测试这一假设，在第4天执行pH转变时，在生物反应器3和4中重复生物反应器1和2的条件。实验条件可见于表1-8中。
实验条件
表1-8：2号研究实验条件
产生数据
生物反应器3与生物反应器1相当生长，并且生物反应器4与生物反应器2相当生长。这表明pH转变对细胞生长没有负面影响。两个生物反应器维持>90％的活力直到第15天，与生物反应器1一致。生物反应器4观察到的与生物反应器2相比较高活力可归因于在此运行期间产生的较低水平的乳酸盐。细胞代谢可能通过pH转变进行调节。离线pH曲线显示，通过执行生物反应器3的pH转变，实现了与生物反应器1相比较低的pH。然而，由于在培养的后几天期间从乳酸盐产生到消耗的代谢转化，pH维持在静区的顶部，即6.85。生物反应器4的pH水平更合乎需要。在第4天pH转变后，水平保持在6.7-6.75直到第15天。这由于在培养的后几天中乳酸盐的增加而是可实现的。由此实验得出结论，第6天的进料百分比的增加导致渗透压的升高，这随后阻止细胞经历从乳酸盐产生到消耗的代谢通量。CO2和所有其它代谢物在运行之间都相当。2号研究产生生物反应器的所有另外的数据可见于表1-23中。
滴度
生物反应器3比都具有相当的第15天结果的反应器1、2和4要产生得多。生物反应器3观察到的滴度的增加可归因于细胞生长的增加加上低pH条件。
产物质量
时程样品使用HiTrap Pro A方法进行纯化，并提交用于IEC分析。将通过下游SDMpro A方法进行纯化的样品提交用于NR CE-SDS、SEC和聚糖。SEC和聚糖的第15天结果与预期一致。生物反应器3和4的半抗体水平仍然较高，但在小规模运行的历史数据集内。在第15天，生物反应器3和4具有与生物反应器1和2相比较低的半抗体水平。
IEC结果证实，较低的培养pH导致较低的酸性物种。来自生物反应器3和4的样品运行且示出于表1-10中。数据表明，进料百分比(用于诱导乳酸盐产生)和pH设定点两者对于维持电荷曲线都很重要。
表1-9：2号研究NR CE-SDS
表1-10：2号研究IEC
表1-11：2号研究SEC
生物反应器ID 天 单体(％) 聚集体(％) 片段(％)
R3 SDM ProA洗脱液 98.1 0.74 1.14
R4 SDM ProA洗脱液 97.8 0.76 1.42
3号研究-生物反应器5(R5)、生物反应器6(R6)、生物反应器7(R7)和生物反应器8 (R8)
实验条件
此实验的第一目标是确认增加的进料加上pH转变将可重复地导致所需的细胞代谢，以将pH保持在足够低的水平以积极影响酸性物种。因此，生物反应器5在与生物反应器4相同的条件下运行。对于生物反应器6执行pH转变到6.65，而不是6.75，以评价是否可以对电荷曲线进行进一步改进。使用生物反应器7以评价进料方案。进料提前一天，在第2天开始，在第6天增加，并且随后在第9天减少。最后，通过在第9天对生物反应器8执行温度转变到32℃来调节电荷曲线的另外的尝试。表1-12中已捕获了此研究中四个生物反应器的详细信息。
表1-12：3号研究实验条件
产生数据
对照条件，生物反应器5与先前对照，生物反应器2和4相当。此运行确认了通过进料和pH设定点转变在低pH下进行控制的能力。生物反应器6和7都生长到比对照低得多的峰值细胞密度，并且显示出较低的最终活力。这两个生物反应器的总体培养性能相对于对照是次优的，并且证实对pH设定点和进料方案所做的改变是无效的。生物反应器8在温度转变的情况下，与对照相当地执行，除了pH从第9-15天略微升高之外。3号研究中产生生物反应器的所有另外的数据可见于表1-24和表1-25中。
滴度
如预期，对照条件比均表现出不良细胞生长和活力的生物反应器6和7要产生得多。生物反应器8的产生率也较低，这可归因于温度转变到32℃。
产物质量
样品使用HiTrap Pro A方法进行纯化，并提交用于产物质量分析。表1-13至表1-15中示出了来自此实验的第15天澄清收获物(CH)产物质量结果。对于NR CE-SDS、SEC和聚糖，所有四种生物反应器类似地执行。生物反应器6和7的G0糖型比其它两个反应器略高，这无关紧要，因为培养性能较差。IEC数据表明温度对酸性物种具有较大影响；然而，所述转换并非转换成主要，而是转换成碱性，这导致R8的相对较高的碱性物种水平。基于培养性能、产生率和产物质量，建议将对照条件推进到200L演示运行。
表1-13：3号研究NR CE-SDS
生物反应器ID 天 半抗体(％) IgG(％)
R5 15CH 9.56 88.86
R6 15CH 10.36 87.45
R7 15CH 10.48 87.21
R8 15CH 9.11 88.86
表1-14：3号研究IEC
表1-15：3号研究SEC
生物反应器ID 天 单体(％) 聚集体(％) 片段(％)
R5 15CH 98.4 0.57 1.02
R6 15CH 98.4 0.42 1.15
R7 15CH 97.7 1.09 1.2
R8 15CH 98.4 0.56 1.09
4号研究-生物反应器9(R9)、生物反应器10(R10)和200L
10L实验条件
两个10L生物反应器与200L演示运行同时运行，每个生物反应器的条件可见于表中。生物反应器9是200L运行的直接附属。接种后，将7.0L的培养物从200L反应器中排出，并转移到10L XDR。附属的所有添加物和进料由200L运行进行等分。将生物反应器10用低代细胞进行接种，以评价细胞年龄对过程性能和产物质量的影响。
表1-16：4号研究实验条件
Brx-9 Brx-10
200L生物反应器的附属 用低代细胞接种的产生生物反应器
200L生产生物反应器参数
200L运行的最终条件可见于与生物反应器4和5中使用的参数相匹配的表中。
表1-17：200L生产生物反应器参数
产生数据
200L反应器的VCD优于附属和所有其它10L对照。细胞生长的增加可能是由于生物反应器几何形状和规模。附属和低代生物反应器的生长与先前的对照条件相当，由此表明规模缩小的模型是稳健的，并且细胞年龄对细胞生长没有影响。200L运行与10L生物反应器之间的活力相当。200L生物反应器的乳酸盐曲线不同于附属运行和10L对照。其在较低浓度下达到峰值，并在第5天开始消耗乳酸盐。响应于在200L生物反应器中观察到的乳酸盐消耗，决定向200L生物反应器和10L附属添加另外1％/0.1％的两种进料培养基的团注。向200L生物反应器的所有添加的定时和容积可见于表1-。另外的团注有效地将200L细胞代谢恢复到乳酸盐产生。然而，第9天到第10天观察到乳酸盐的急剧尖峰。在乳酸盐尖峰时，观察到对照与辅助DO探针之间的差异。对照探针读数大约30％，而辅助探针读数大约3％。考虑到乳酸盐尖峰，确定辅助探针读数正确，并且对照探针已漂移，由此导致生物反应器中的低氧环境。在切换探针时，乳酸盐降低。200L反应器中的pH趋势在静区的较高侧，除其中其受乳酸盐中的尖峰影响的第9-10天外。pH曲线的差异是由于200L反应器中的较低的乳酸盐产生。如预期，200L生物反应器中的CO2水平略微高于10L的水平。渗透压在各规模之间是一致的。在200L渗透压数据中观测到的振荡是由于在同一天采集的进料前和进料后样品。4号研究中的所有另外的产生数据可见于表1-26。
此数据证实，关于培养性能，10L缩小模型代表了200L生物反应器，除了细胞密度略微偏移。由于进料百分比有意用于影响细胞代谢，因此大规模增加的VCD可能影响乳酸盐产生。为了减少不必要的乳酸盐消耗，进料百分比的增加应提前一天，在第5天而不是第6天发生。
表1-18：200L生物反应器添加
滴度
在200L运行观察到的增加的细胞密度导致与10L附属和先前对照相比滴度的增加。反应器10的滴度略低于附属运行，但第15天值与先前对照运行一致，并且在过程变化预期内。
产物质量
用于200L运行和10L生物反应器的样品使用HiTrap Pro A方法进行纯化，并提交用于产物质量分析。对于200L反应器，还提交了来自下游中试规模运行的Pro A洗脱液。生物反应器9、附属和生物反应器10，即低代条件的产物质量结果相当，这表明细胞年龄不影响产物质量。半抗体在200L反应器材料中略低，并且第12天到第15天减少，在澄清收获物中观察到略微增加，表1-19。这种增加可归因于最坏情况的收获条件。200L反应器的电荷异质性与10L附属和低代生物反应器相当，尽管pH曲线较高，表。200L运行的酸性和碱性物种与10L模型一致。200L运行的通过SEC的聚集体和片段水平与10L模型相比略微更高，表1-21。200L运行的第15天聚糖结果与10L模型一致。
表1-19：4号研究NR CE-SDS
生物反应器ID 天 半抗体(％) IgG(％)
R9 12 10.19 88.02
R9 13 10.29 87.54
R9 14 10.17 87.55
R9 15 10.49 87.13
R9 15CH 9.78 87.87
R10 12 10.25 87.71
R10 13 10.2 87.67
R10 14 10.49 86.98
R10 15 10.74 86.62
200L R1 12 8.64 89.69
200L R1 13 8.62 89.47
200L R1 14 8.21 89.99
200L R1 15 7.71 90.15
200L R1 15CH 8.37 90.04
200L R1 Pro A洗脱液 6.86 90.97
表1-20：4号研究IEC
表1-21：4号研究SEC
结论
此实例证实，用于玛弗利木单抗产生的上游过程是稳健且可扩展的。10L小规模模型是可重复的，并对200L生物反应器具有预测性。收获程序被证明是可扩展的，具有高吞吐量和高产率。通过增加进料和改变细胞培养物的pH，实现了期望的产物质量。
被选择以前进至确认运行的操作参数与在此演示运行期间使用的那些参数相同，并且详细描述于表1-1：生物反应器参数中。
表1-22a：产生数据
表1-22b：产生数据
表1-23a.产生数据
表1-23b：产生数据
表1-24a.产生数据
表1-24b：产生数据
表1-25a.产生数据
表1-25b：产生数据
表1-26a.产生数据
表1-26b：产生数据
实例2：使用阳离子交换色谱进行抗体纯化的下游过程
实例2描述了用于抗GM-CFSRa抗体，玛弗利木单抗的纯化过程的阳离子交换色谱步骤的开发。高产生率细胞培养过程如上所述进行开发。表2-1中汇总了下游过程。
表2-1：纯化过程概述
缩写词和定义
术语 定义
AEX 阴离子交换色谱
Brx 生物反应器
CEX 阳离子交换色谱
cGMP 当前良好制造规范
CHO 中国仓鼠卵巢细胞
CV 柱容积
DS 原料药
FT 流通
g 克
Hab 半抗体
HCP 宿主细胞蛋白
H 柱床高度
hr 小时
ID 柱内径
IEC 分析离子交换色谱
kDa 千道尔顿
L 升
不适用 不适用
NR-CE-SDS 非还原毛细管电泳十二烷基硫酸钠
mM 毫摩尔
min 分钟
mS 毫-西门子
UF/DF 超滤/渗滤
VI 病毒灭活
VIN 病毒灭活和中和
材料
收获物
来自10L规模生物反应器运行的澄清收获物被用于玛弗利木单抗下游过程开发。用来自200L规模演示运行1的收获物进行中试规模捕获运行，随后通过原料药进行下游纯化。
柱包装和资格
CEX运行使用1cm(ID)x 20cm(H)、5cm(ID)x 20cm(H)和20cm(ID)x 20cm(H)柱进行。将5cm x 20cm柱进行内部包装，并且剩余两个是获得自瑞普利金公司(Repligen)的预包装柱。对柱进行了资格认证和验证，以满足HETP和不对称性(As)规范。
分析方法
使用Solo VPE测量A280值用于纯化的样品；然后使用消光系数1.44mL/mg-cm计算蛋白浓度。使用表2-2中所示的方法进行Hab、聚集和电荷曲线分析。
表2-2：分析方法列表
测定 方法
半抗体 非还原CE-SDS
聚集 SEC-HPLC
电荷物种 IEC
结果和讨论
建立运行
在如表2-3所示的纯化过程之后，来自2x 10L生物反应器的澄清收获物通过DS进行纯化。过程中间体中的Hab含量为8.4-10.6％，并且DS中的Hab含量为7.6％，以及DS的目标Hab水平(≤3％)。结果表明，此下游过程无法达到使用上游收获物所需的Hab水平。
表2-3：建立运行1过程中间体和DS的Hab结果
POROSTMXS色谱的开发
POROSTMXS树脂被评价作为Fractogel COO-(M)色谱步骤的替代物，以将Hab水平降低至≤3％的目标水平。执行梯度洗脱和逐步洗脱运行，以定义POROSTMXS色谱步骤的操作条件。简而言之，来自两次盐梯度洗脱运行的结果表明与pH 6.0相比，用pH 5.5洗脱缓冲液的Hab清除更好。如表2-4中所示，然后用以不同pH和盐浓度的洗脱缓冲液进行POROSTMXS逐步洗脱运行。基于洗脱液Hab％和步骤产率结果，选择具有55mM NaCl的pH5.4作为用于POROSTMXS色谱的洗脱条件。表2-5汇总了用于基于那里执行的开发工作的POROSTMXS色谱的过程参数。
CEX步骤的提议上样范围为30和60g/L。估计的CEX柱洗脱液容积为约4-5CV。估计的CEX步骤产率为75到85％。
POROSTMXS洗脱液通过DS进一步纯化，并确认可接受的产物质量(表2-6)。
表2-4：CEX开发运行-产率和Hab％
表2-5：POROSTMXS色谱的提议过程参数
表2-6：证明运行过程中间体和DS的非还原CE-SDS结果
过程步骤 Hab(％) IgG(％)
蛋白A洗脱液 7.2 92.0
VIN产物 7.1 92.2
POROSTMXS洗脱液 1.9 97.1
Q膜FT/追踪 1.8 97.5
TFF池 1.9 97.0
DS 1.7 97.2
参考(RSN300111L) 2.7 97.3
pH 4.5和pH 5.0处的盐梯度洗脱运行
POROSTMXS以在pH 5.5和6.0下的盐梯度洗脱运行，由此产生大洗脱峰(其含有低Hab％)，随后是在Hab中富集的次要洗脱峰。在pH 4.5和5.0下进行另外的盐梯度运行，以评价较低的洗脱pH对POROSTMXS Hab清除率的影响。UV色谱图表明，洗脱pH 4.5和5.0并未改善POROSTMXS在Hab清除率方面的性能，如两个洗脱峰的不良分辨率所表明的。
树脂筛选
评价另外的CEX和混合模式树脂(表2-7)用于Hab清除，并与POROSTMXS进行比较。执行梯度和逐步洗脱运行，并且测试用于Hab的选择性级分。下文呈现的产率和Hab％结果表明，这些树脂就Hab清除而言的性能并不优于POROSTMXS。
表2-7：评价的CEX和混合模式树脂列表
树脂 注释
CaptoTMS ImpAct CEX树脂
TOYOPEARLTMGigaCap CM-650M CEX树脂
TOYOPEARLTM硫酸酯650F CEX树脂
CaptoTMadhere ImpRes 混合模式树脂
CaptoTMMMC ImpRes 混合模式树脂
CaptoTMS ImpAct梯度运行
CaptoTMS ImpAct HiScreen柱(0.77cm(ID)x 10cm(H))以45g/L进行上样，随后进行梯度洗脱，如表2-8所示。仅观察到一个单洗脱峰。将洗脱峰分馏成4级分。级分1和2在0.2μm过滤之前是浑浊的。级分2，即在洗脱峰高附近的级分含有4.3％的Hab，这较高于Hab的目标≤3％。因此，未进一步评价CaptoTMS ImpAct。
表2-8：CaptoTMS ImpAct梯度洗脱运行的过程参数
表2-9：CaptoTMS ImpActTM运行-产率和非还原CE SDS结果
TOYOPEARLTMGigaCap CM-650M梯度运行
将预包装的TOYOPEARLTMGigaCap CM-650M柱(0.8cm(ID)x 10cm(H))以44g/L上样，并且盐梯度运行类似于CaptoTMS ImpAct执行。表2-10中示出了洗脱级分产率。仅观察到一个单洗脱峰。因此，没有进一步评价TOYOPEARLTMGigaCap CM-650M。
表2-10：TOYOPEARLTMGigaCap CM-650M运行-产率结果
TOYOPEARLTM硫酸酯650F梯度运行
在TOYOPEARLTM硫酸酯650F预包装柱(0.8cm(ID)x 10cm(H))上执行五次实验运行(运行1、4、5、6、7)。
运行1是与CaptoTMS ImpAct类似执行的梯度运行，上样挑战为58.4g/L。产率(表2-11)表明70％的玛弗利木单抗在FT/洗涤级分中丢失。此外，FT/洗涤级分含有比≤3％目标更高的5.6％Hab(表2-11)。
表2-11：TOYOPEARLTM硫酸酯650F运行1-产率和非还原CE SDS结果
用经氯化钠调整的蛋白A洗脱液进行后续运行4，以改善与树脂的产物结合。将5MNaCl添加到蛋白A洗脱液到最终浓度为100mM NaCl，并且然后以45g/L的上样挑战上样到TOYOPEARLTM硫酸酯650F预包装柱上，随后进行类似于CaptoTMS ImpAct的梯度洗脱。表2-12中提供了产率。
表2-12：TOYOPEARLTM硫酸酯650F运行4-产率结果
基于运行4结果，运行5使用50mM乙酸钠、125mM NaCl、pH 5.5用逐步洗脱执行(使用梯度洗脱执行运行4)。将洗脱液收集到两个级分中，随后是盐剥离步骤。表2-13中提供了产率值。
表2-13：TOYOPEARLTM硫酸酯650F运行5-产率结果
运行6用调整到50mM NaCl的蛋白A洗脱液执行(在运行4和运行5中，将蛋白A洗脱液调整到100mM NaCl，用于上样到硫酸酯650F柱上)。将预包装柱以45g/L上样，随后用50mM乙酸钠，pH 5.0进行洗涤，并用50mM乙酸钠，pH 5.0(缓冲液A)和50mM乙酸钠，500mM NaCl，pH5.0(缓冲液B)进行梯度洗脱。表2-14中提供了产率值。
表2-14：TOYOPEARLTM硫酸酯650F运行6-产率结果
基于运行6结果，运行7用调整到50mM NaCl的蛋白A洗脱液以及逐步洗脱执行(运行6使用梯度洗脱执行)。将预包装柱以46g/L上样，随后使用50mM乙酸钠、150mM NaCl、pH5.3进行洗涤和逐步洗脱。对于第1级分的Hab值的产率和水平分别为43％和3.9％(表2-15)，这较高于POROSTMXS运行。因此未进一步评价硫酸酯650F。
表2-15：TOYOPEARLTM硫酸酯650F运行7-产率和非还原CE SDS结果
CaptoTMMMC ImpRes梯度运行
用CaptoTMMMC ImpRes预包装柱(0.77cm(ID)x 10cm(H))进行三次梯度运行，并且测试洗脱液级分用于Hab。操作条件提供于表2-16、2-17和2-18中。含有低Hab(1.2-1.9％)的级分的累积产率为约9.3-26.7％。考虑到低产率，未进一步评价CaptoTMMMC ImpRes树脂。
表2-16：CaptoTMMMC ImpRes运行8的过程参数
表2-17：CaptoTMMMC ImpRes运行9的过程参数
表2-18：CaptoTMMMC ImpRes运行13的过程参数
表2-19：CaptoTMMMC ImpRes运行8-产率和非还原CE SDS结果
表2-20：CaptoTMMMC ImpRes运行9-产率和非还原CE SDS结果
表2-21：CaptoTMMMC ImpRes运行13-产率和非还原CE SDS结果
CaptTMo adhere ImpRes运行
将蛋白A洗脱液用0.5M Tris碱调节到pH 6.5，并且然后上样到CaptoTMAdhereImpRes HiScreen柱(0.77cm(ID)x 10cm(H))。表2-22列出了色谱条件。玛弗利木单抗在pH6.5下与CaptoTMadhere ImpRes紧密结合，并且在接近100％洗脱缓冲液B下从柱中洗脱。另外，单个洗脱峰表明Hab未与玛弗利木单抗分离。因此，未针对CaptoTMAdhere ImpRes进行进一步开发。
表2-22：CaptoTMadhere ImpRes色谱操作的过程参数
表2-23：CaptoTMadhere ImpRes运行-产率
POROSTMXS色谱最坏情况的方案运行
POROSTMXS色谱的Hab清除能力使用高Hab％上样和高pH洗脱缓冲液进行评价。下文总结的结果表明，POROSTMXS色谱将Hab从7-10％降低到1-2％。
如表2-24(1-4和8-15号运行)所示，在具有50mM乙酸钠、55mM氯化钠、pH 5.4洗脱缓冲液的洗脱液中，POROSTMXS色谱将Hab从上样中的4.2-10.3％减少到1.9-2.1％。为了理解POROSTMXS树脂的Hab去除能力，使用含有高百分比Hab的上样材料评价通过POROSTMXS色谱进行的Hab减少。通过盐梯度洗脱生成富集有Hab(约45％)的POROSTMXS洗脱级分。然后将富含Hab的级分掺加回到10％Hab蛋白A洗脱液中，以得到含有21％Hab的CEX上样。POROSTMXS色谱以较低上样挑战(39g/L树脂)使Hab从CEX上样中的21％清除到CEX洗脱液中的2.1％(表2-24，5号运行)。
为了产生用于另外的掺加研究的另外的富含Hab的材料，将POROSTMXS柱在洗脱后用含有250mM NaCl的乙酸盐缓冲液剥离。
将高盐剥离的Hab池掺加到Brx5澄清收获物中。将掺加的澄清收获物通过蛋白A色谱、低pH病毒灭活和POROSTMXS色谱进行纯化。改变上样Hab含量以及洗脱缓冲液pH，以评价在最差过程条件下的POROSTMXS色谱性能(表2-24，16-19号运行)。Hab结果表明，这些运行均无法将Hab水平清除到目标≤3％水平，并且当CEX柱在具有含有高量的Hab的CEX上样的以60g/L为建议上样范围的上端处进行上样时，用于CEX步骤的提议的pH 5.4±0.1、55mM±5mM的洗脱条件可能不稳健。因此，进行另外的研究。
表2-24：通过POROSTMXS色谱获得的Hab清除率的汇总
上样研究
使用预包装的POROSTMXS柱(0.8cm(ID)x 20cm(H))进行上样研究，其中CEX上样由200L规模演示运行1产生。在102g/L处观察到产物突破。表2-25中示出了上样研究运行的产率和分析结果。较高的上样与较高的CEX步骤产率相关。然而，较高的上样也与CEX洗脱液中的较高的Hab％和较低的IEX主峰％相关。选择平衡步骤产率和产物质量，30-60g/L作为CEX步骤的上样范围。
表2-25：CEX上样研究-IEC和SEC结果
实验室规模CEX运行
来自10L生物反应器运行和200L演示运行1的收获材料通过原料药进行纯化，以评估产物质量。POROSTMXS在这些纯化中用作第二色谱步骤，并且结果如下汇总。在pH 5.4洗脱的情况下，POROSTMXS色谱将Hab的水平从7-10％降低至<2％。POROSTMXS色谱在聚集体减少和HCP清除方面也表现良好(表2-27和表2-28)。洗脱液容积为约4至5CV。产率为64至87％。降低的负载与洗脱液中的降低的Hab和较低的产率相关(表2-26)。
表2-26：开发CEX运行-产率和Hab结果
表2-27：CEX上样和洗脱液中的SEC单体含量
生物反应器运行 上样(％) 洗脱液(％)
验证运行 96.8 98.5
10L运行#5 96.5 99.0
200L演示运行1 96.9 98.3
表2-28：CEX上样和洗脱液中的残留HCP
生物反应器运行 上样(ppm) 洗脱液(ppm)
验证运行 147.9 6.7
10L运行#5 146.4 4.2/2.8
200L演示运行1 359.6 7.7
中试规模CEX运行
中试规模运行用来自200L规模演示运行1(演示运行1)的蛋白A洗脱液以60g/L上样使用20cm(ID)x 20cm(H)POROSTMXS柱进行。演示运行1的CEX UV色谱与实验室规模运行类似。演示运行1的产率为86％，略高于实验室规模，但与开发运行一致。演示运行1的Hab从6.9％降低到1.6％。为了确保充分减少Hab，演示运行2的目标为5.3的洗脱pH。与pH 5.4洗脱相比，pH 5.3洗脱将CEX洗脱池中的Hab减少到<1％(RPT-0122)。然而，pH 5.3洗脱导致比pH 5.4洗脱(4.9CV)更低的步骤产率(63-65％)和更大的洗脱容积(6.4-7.0CV)。基于演示运行结果和pH控制的制造能力，对于200L和2000L cGMP批次所建议的洗脱pH为5.35±0.1。
用最坏情况的条件的CEX运行
POROSTMXS色谱用最坏情况的上样(高Hab％)和洗脱条件(高pH和高盐)条件执行。在上样中13.5％的Hab，以60g/L的上样挑战，使用pH5.4、55mM NaCl洗脱缓冲液的情况下，CEX洗脱液中的所得Hab％为3.6％。鉴于来自3阶段上游过程的CEX上样/蛋白A洗脱液中的Hab可能高达10-12％，以确保所得的Hab水平为大约3％或更低，对于3阶段过程的提议CEX洗脱条件为pH 5.35±0.1，55±5mM NaCl以及30-60g/L的上样挑战。所提议的CEX条件将确保最终Hab水平为大约3％或更低，即使3阶段澄清收获物中的Hab水平高达12-13％。
表2-29：POROSTMXS色谱最坏情况的运行-产率和Hab％
规模化计算
对于提议的3阶段2000L规模制造过程，建议80x 20cm CEX柱。2000L规模生物反应器的估计滴度为8.5±1.3g/L。基于设施适配计算，在2000L生物反应器规模下的CEX周期的估计数为3到5。
结论
POROSTMXS色谱的主要功能是Hab清除。所述实例中呈现的结果证实POROSTMXS色谱步骤能够将Hab的水平从7-10％降低到约1-2％。结果还表明通过POROSTMXS色谱清除HCP和聚集体。表2-30中列出了POROSTMXS色谱的提议操作条件。CEX柱的提议上样范围为30-60g/L。CEX步骤的估计产率为65-85％，洗脱体积为4到5CV。表4-1和4-2中汇总了非GMP(200L)和GMP(200L和2000L)产生批次的原料药和过程中杂质清除率的分析数据，其包含表2-30中的POROSTMXS色谱过程。
表2-30：POROSTMXS色谱条件
实例3：使用阴离子交换色谱进行抗体纯化的下游过程
实例3描述了用于抗GM-CFSRa抗体，即玛弗利木单抗的纯化过程的阴离子交换色谱步骤的开发。表3-1和图1中汇总了下游纯化过程。
表3-1：纯化过程概述
步骤
1 蛋白A色谱
2 低pH病毒灭活
3 阳离子交换色谱–结合洗脱模式
4 阴离子交换色谱–结合洗脱模式
5 病毒过滤
6 超滤/渗滤
7 调配、过滤和散装填充
缩写词和定义
材料
收获物
从10L和200L生物反应器运行中收集的收获物用于开发用于提议玛弗利木单抗下游过程的AEX柱运行。
分析方法
使用Solo VPE测量纯化样品的A280值。然后使用消光系数1.44mg-1.mL.cm-1计算蛋白质浓度。执行了尺寸排阻色谱、非还原CE SDS和离子交换色谱分析。
结果和讨论
提议AEX色谱步骤
选择CaptoTMQ ImpRes结合和洗脱色谱作为第三色谱步骤，以便减少酸性物种、高分子量(HMW)杂质和宿主细胞蛋白(HCP)。柱通常介于16-21cm之间填充，并且可以改变目标床高度以优化设施适配。产生上样停留时间在4分钟时保持一致。将柱以50-60g/L树脂上样，并用高盐缓冲液洗脱。酸性电荷物种与柱更紧密地结合，并且在洗脱后高盐剥离中被去除。提议AEX步骤的预期步骤产率为60-84％。表3-2中描述了步骤的过程参数。
表3-2：AEX色谱步骤描述
10L生物反应器1-4纯化和树脂评价
表3-3：10L生物反应器1-4纯化概述
如表3-4中所示，将来自生物反应器1-4的样品的子集通过IEC进行分析。由于分析性IEC将用于释放检测，因此决定使用分析性IEC来评价酸性物种。
表3-4：来自生物反应器1-4的CEX洗脱液和DS的IEC结果
样品描述 酸性总计(％) 主要总计(％) 碱性总计(％)
生物反应器1CEX洗脱液 19.4 63.9 16.7
生物反应器2CEX洗脱液 27.4 55.4 17.2
生物反应器3CEX洗脱液 19.3 60.2 20.5
生物反应器4CEX洗脱液 17.4 60.2 22.4
生物反应器3DS 19.4 60.3 20.3
生物反应器4DS 18.5 58.4 23.2
使用来自10L生物反应器1-4的收获物进行的纯化运行的IEC结果表明需要进一步减少酸性物种。因此，针对第3精制柱步骤评价另外的树脂。
树脂评价
评价了三种树脂降低酸性物种％同时维持步骤产率和可制造性的能力。这些树脂基于其与带负电(酸性)物种结合的倾向来选择。表3-5和表3-6中示出了所评价的树脂。
表3-5：树脂评价概述
表3-6：树脂候选物
在71个开发规模运行中评价了POROSTMXQ、CaptoTMQ ImpRes和CaptoTMadhereImpRes树脂的产率、洗脱曲线和可扩展性。分析选定的产物池的产物质量。表3-7中汇总了这些过程池的分析结果。CaptoTMAdhere ImpRes展现处最强的酸性物种清除率，但受到窄洗脱pH范围及其较差的可制造性的限制。POROSTMXQ和CaptoTMQ ImpRes示出类似的可制造性和产率。POROSTMXQ基于其在选定的条件下相对于CaptoTMQ ImpRes的清除酸性物种的较大能力而被选择作为进一步开发的候选物。
表3-7：筛选运行的分析性IEC结果
POROSTMXQ开发，10L生物反应器5和7纯化，演示运行1
在洗脱缓冲液优化期间，决定从Bis-Tris缓冲液转变为组氨酸缓冲液。此决定基于足够获得多谱系组氨酸相对于Bis-Tris的能力。使用在pH 7.0下执行的盐梯度运行作为参考，评价了若干逐步洗脱条件，如表3-9中汇总的。
表3-8：POROSTMXQ洗脱条件筛选概述
表3-9：POROSTMXQ运行60-64条件
表3-10：POROSTMXQ运行60-64产率表
级分(CV) 运行60 运行61 运行62 运行63 运行64
1 22％ 27％ 33％ 24％ 35％
2 45％ 54％ 63％ 52％ 63％
3 58％ 67％ 76％ 65％* 76％*
4 65％ 74％ 83％ 73％* 83％*
5 69％ 79％ 86％ 77％ 87％
6 72％ 82％ 88％ 79％ 89％
7 75％ 84％ 89％ 81％ 90％
*提交用于分析性IEC
表3-11：分析性IEC结果用于POROSTMXQ洗脱条件筛选
基于来自这些运行的产率和酸性物种清除结果，选择50mM组氨酸，125mM NaCl，pH7.0(运行63条件)作为此步骤的目标洗脱缓冲液，目标上样pH为7.0。分析性IEC结果示出酸性物种减少3-4％。这些参数允许产率、酸性物种清除率和可制造性(洗脱容积)之间的平衡。
10L生物反应器5和7实验室规模纯化运行和200L演示运行1
生物反应器5和7使用POROSTMXQ作为第3个精制步骤进行纯化。分析性IEC数据显示，中心点洗脱条件(50mM组氨酸，125mM氯化钠，pH 7.0)实现了酸性物种的3-5％降低，以及69-70％的产率。对于生物反应器5材料，洗脱缓冲液在周期之间变化，如表3-13所示，以便探索在最坏情况的过程条件下(周期2以及生物反应器5)的产物质量(关于酸性物种)。洗脱缓冲液pH的降低和盐浓度的增加导致AEX柱上的酸性物种的2-3％降低(与在目标条件下洗脱时的3-5％降低相比)。
表3-12：10L生物反应器5和7，200L演示运行1纯化概述
表3-13：生物反应器5和7，演示运行1条件和过程性能
a在28g/L树脂下的上样期间首次看到的突破。步骤产率基于上样总量。由于低负荷挑战的较低的洗脱CV。
表3-14：分析性IEC结果用于Brx 5、Brx 7和演示运行1
样品描述 酸性总计(％) 主要总计(％) 碱性总计(％)
Brx 5CEX洗脱液周期1 15.6 60.9 23.5
Brx 5AEX洗脱液周期1 11.4 61.8 26.8
Brx 5AEX洗脱液周期2 13.4 61.3 25.3
BRX5 DS 11.6 61.3 27.1
Brx 7AEX上样 15.8 57.9 26.4
Brx 7AEX洗脱液 12.8 56.8 30.5
Brx 7DS 12.1 57.4 30.5
演示运行1AEX上样 18.4 60.4 21.2
演示运行1AEX洗脱液 16.1 60.3 23.6
演示运行1DS 15.5 62.8 21.7
执行演示运行1，以确认在200L规模下的纯化过程。在上样POROSTMXQ柱期间，在28g/L树脂下观察到突破。使用的树脂批次为XQ-037。基于在实验室规模下执行的DBC运行，目标上样为45g/L(树脂批次XQ-042)。这表明不同POROSTMXQ树脂批次之间的玛弗利木单抗结合能力的可变性。为了评价POROSTMXQ树脂的结合能力差异，在与表3-15中所示的演示运行1相同的条件下，对5个不同的POROSTMXQ树脂批次执行DBC10。应注意，大部分开发工作使用高容量树脂批次XQ-042进行，包含生物反应器5和7的纯化。
基于表3-14中的DBC10数据，POROX XQ负荷范围的上端将必须设置为32g/L(最低DBC10的80％，其为40g/L)。因此，使用POROSTMXQ树脂将显著挑战制造节奏，并且可能需要在用于产生之前评价树脂批次的结合能力。鉴于这些相关挑战，决定评价CaptoTMQ ImpRes作为POROSTMXQ的替代物，作为玛弗利木单抗纯化过程中的第3个色谱步骤。CaptoTMQImpRes具有与POROSTMXQ(季铵)相同的配体，并且先前已显示清除酸性物种。
表3-15：实验室规模下的树脂容量筛选的概述
a上样材料受限；未实现突破
CaptoTMQ ImpRes开发，演示运行2
CaptoTMQ ImpRes洗脱条件和上样能力筛选
对四个CaptoTMQ ImpRes树脂批次使用表3-17中所示的条件评价实验室规模下的上样能力。将5.9的pH用于平衡缓冲液和上样，因为这将是pH范围5.9-6.1的低端和最坏情况的结合条件。所筛选的所有4个树脂批次的DBC10相当。然后施加80％的安全因子，并且高端上样能力确定为60g/L树脂。
结合能力评价也在pH 5和pH 7下执行。如预期，较低的上样pH导致较低的上样能力，这将不允许色谱柱定形以适合于设施。在pH 7下，存在可能影响延伸稳定性的担忧。因此，选择在pH 6.0+/-0.1下的上样。
表3-16：CaptoTMQ ImpRes上样能力和洗脱条件筛选总结
表3-17：CaptoTMQ ImpRes上样能力评价
表3-18：CaptoTMQ ImpRes开发运行和分析性IEC数据
使用在POROSTMXQ开发期间获得的知识，用CaptoTMQ ImpRes柱执行一系列实验室规模运行，以确定将使容量最大化，同时平衡产率和酸性物种减少的条件。表3-17中示出了这些运行和相关的分析性IEC结果。
运行4-9在6.9的上样pH和6.9的洗脱pH以及变化的洗脱盐浓度下进行。将运行4和5以65g/L树脂上样，并且证实了清除3％酸性物种，同时保持大于63％的产率的能力。运行6以40g/L上样，这导致42％的产率，6％的酸性物种的清除，但主要和碱性物种两者均剧烈转变。
运行11-22在6.0、6.1和6.5的上样pH，同时改变洗脱pH和盐浓度下执行。用pH 5.9缓冲液洗脱的运行显示出将产率维持在65％以上，同时实现4-5％之间的酸性物种减少的能力。如运行22所展示的，在较低上样挑战下上样色谱柱显著降低了产率。
基于来自这些运行的结果，使用在洗脱pH、洗脱盐浓度和上样挑战的提议范围的高端和低端处的参数，用设置为550mAU(路径长度2mm)的降低UV门执行单步洗脱运行23-26。如先前观察到的，在运行24中以40g/L(53％的DBC10)的上样导致低产率(50％)。运行23代表了产物质量的最坏情况(高上样挑战、低洗脱pH、高洗脱盐浓度)，并产生了84％的产率，酸性物种减少了2％。运行26代表产率的最坏情况和产物质量的最佳情况(低上样挑战、高洗脱pH和低洗脱盐浓度)，并产生60％的产率，酸性物种减少了4％。
虽然添加第3个精制步骤的主要动力是调节带电物种，但表3-19和表3-20中的SEC和NR-CE-SDS数据指示AEX柱也改善SEC纯度，同时半抗体水平在测试的条件的范围内被维持。
表3-19：运行23-26SEC数据
表3-20：运行23-26NR-CE-SDS数据
样品描述 ％其它 Hab(％) igG(％)
运行23CaptoTMQ ImpRes洗脱液 1.1 1.4 96.8
运行24CaptoTMQ ImpRes洗脱液 0.9 1.3 95.3
运行25CaptoTMQ ImpRes洗脱液 1.4 1.4 96.4
运行26CaptoTMQ ImpRes洗脱液 1.2 1.3 95.0
演示运行1AEX上样 1.7 1.5 95.1
*上样材料源自用于此开发工作的演示运行1。
基于来自上述运行的产率和酸性物种清除结果，选择50mM组氨酸、105mM NaCl、pH6.0作为AEX步骤的目标洗脱缓冲液，目标上样pH为6.0。将柱上样挑战设置为50-60g/L。数据还表明，柱的挑战不足将导致低产率和电荷曲线的转变。分析性IEC结果示出酸性物种减少2-4％。这些参数允许产率、酸性物种清除率和可制造性(洗脱容积)之间的平衡。
用CaptoTMQ ImpRes进行的200L演示运行2
执行200L演示运行2，以提供用于使能研究的材料，并证实200L规模下的过程性能。表3-22中汇总了CaptoTMQ ImpRes步骤的操作参数。
表3-21：用CaptoTMQ ImpRes概述进行的200L演示运行2
表3-22：CaptoTMQ ImpRes操作参数用于演示运行2
如前所提及的，上样范围被设定为50-60g/L，因为数据表明，柱的挑战不足将导致低产率和电荷曲线的转变。这种窄上样范围需要柔性柱床高度，这可以用于优化周期数，以便使在AEX步骤中纯化的蛋白质的量最大化。另外，上样线性流速基于包装柱床高度确定，以确保4分钟停留时间。对于演示运行2，使用15.4cm床高度，并将上样流速设定为231厘米/小时，以确保4分钟停留时间。执行两个周期，并且表3-23中示出了结果。
表3-23：演示运行2AEX过程性能和分析结果
与小规模过程开发数据一致的演示运行2过程性能和产生质量。AEX步骤提供了3％的酸性物种减少，聚集体和HCP的轻微减少，并且步骤产率为74-75％。AEX洗脱液通过原料药进行正向处理，并证实了可接受的产物质量。
规模化和设施适配考虑因素
对于提议的2000L规模制造过程，建议60cm x 17cm柱。这假设了估计滴度为6.5-8.5g/L。基于表3-24中所示的设施适配计算，在2000L规模下的AEX周期的估计数为2-5。
表3-24：用于3阶段2000L规模色谱的设施适配计算
结论
AEX开发活动集中于提供带电物种的稳健调节，同时维持可接受的步骤产率。CaptoTMQ ImpRes树脂在10L和200L生物反应器规模两者中均展示了2-4％的酸性物种的去除。所述步骤还有助于清除聚集体和HCP。AEX柱的提议上样范围为50-60g/L。估计步骤产率为60-84％，洗脱体积为4.5-5.5CV。表中详述了所提议的过程。表4-1和4-2中汇总了来自非GMP(200L)和GMP(200L和2000L)产生运行的原料药和过程中杂质清除率的分析数据，其包含表3-25中的CaptoTMQ ImpRes色谱过程。
表3-25：AEX色谱过程
实例4.2000L规模化；批次分析
在实例1、2和3中开发的上游和下游产生过程被放大10倍到2000L生物反应器，但对产物质量没有影响，由此证实上游和下游是可扩展且稳健的。表4-1、4-2和4-3中汇总了使用表1-1(200L过程，第5天培养基进料增加)的上游过程以及表2-30和3-25的下游过程，来自包含2000L规模的若干非GMP和GMP产生运行的原料药和过程中杂质清除率的分析数据。
表4-1：原料药批次分析
表4-2：CEX和AEX杂质清除
表4-3：过程7a 2000L GMP批次1的SEC结果
非正式序列表
SEQ ID NO:1
>NP_006131.2粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体亚基α同种型a前体[智人]
SEQ ID NO:2重链
SEQ ID NO:3轻链
SEQ ID NO:4重链可变区
SEQ ID NO:5轻链可变区
SEQ ID NO:6重链CDR1
ELSIH
SEQ ID NO:7重链CDR2
GFDPEENEIVYAQRFQG
SEQ ID NO:8重链CDR3
VGSFSPLTLGL
SEQ ID NO:9轻链CDR1
TGSGSNIGAPYDVS
SEQ ID NO:10轻链CDR2
HNNKRPS
SEQ ID NO:11轻链CDR3
ATVEAGLSGSV。

Claims (250)

1.一种产生具有水平降低的半抗体的包括所关注的蛋白质的制剂的方法，所述方法包括使包括所述所关注的蛋白质以及半抗体的样品经受阳离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂，由此产生具有水平降低的半抗体的包括所述所关注的蛋白质的所述制剂。
2.一种降低包括所关注的蛋白质的制剂中的半抗体的水平的方法，所述方法包括使包括所述所关注的蛋白质以及半抗体的样品经受阳离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂，由此降低包括所述所关注的蛋白质的所述制剂中的半抗体的水平。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述所关注的蛋白质是抗体或其抗原结合部分。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分是抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述样品经受阳离子交换色谱树脂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述阳离子交换色谱树脂包括选自由以下组成的组的官能团：巯基、磺酸酯、硫酸酯、羧甲基、磺乙基、磺丙基、磷酸酯和磺酸酯。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述阳离子交换色谱树脂选自由以下组成的组：POROSTMXS CEX、CaptoTMS ImpAct、TOTOPEARLTMGigaGap CM 650M和TOYOPEALTM硫酸酯650F。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换色谱树脂以结合洗脱模式运行。
10.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述样品经受混合模式色谱树脂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述混合模式色谱树脂包括选自由以下组成的组的官能团：羧基、羟基、N-苄基-N-甲基乙醇胺、苯基丙胺和己胺。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述混合模式色谱树脂选自由CaptTMMMCImpRes和CaptoTMAdhere ImpRes组成的组。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述制剂包括小于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2.8％、约2％、约1％或约0.5％的半抗体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述制剂包括小于约2.8％的半抗体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述制剂包括约0.1-20％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述制剂包括约0.6-1.7％的半抗体。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中与所述样品中的半抗体的水平相比，所述制剂中的半抗体的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其进一步包括使用洗脱缓冲液收集洗脱液级分。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述洗脱液级分包括小于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2.8％、约2％、约1％或约0.5％的半抗体。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述洗脱液级分包括约0.1-20％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集。
22.根据权利要求21所述的方法，其中从阳离子交换色谱树脂收集的所述洗脱液级分包括约0.6-18％的半抗体。
23.根据权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包括约1-17％的半抗体。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的方法，其中与所述样品中的半抗体的水平相比，所述洗脱液级分中的半抗体的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM的乙酸钠。
27.根据权利要求18至26中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约40-60mM的乙酸钠。
28.根据权利要求18至27中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM的氯化钠。
29.根据权利要求18至28中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约40-60mM的氯化钠。
30.根据权利要求18至29中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约4-7、约5-6、约5-5.5的pH。
31.根据权利要求18至30中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约5-5.5的pH。
32.根据权利要求18至31中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约50mM的乙酸钠、约55mM的氯化钠以及约5.35的pH。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述所关注的蛋白质以约10-100g/L、约20-90g/L、约30-80g/L、约40-70g/L或约50-60g/L的水平上样到所述阳离子交换色谱树脂或所述混合模式色谱树脂上。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述所关注的蛋白质以约30-60g/L的水平上样到所述阳离子交换色谱树脂或所述混合模式色谱树脂上。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中半抗体的水平是通过非还原CE-SDS(用十二烷基硫酸钠进行的毛细管电泳)确定的。
36.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，所述组合物包括小于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2.8％、约2％、约1％或约0.5％的半抗体。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述组合物包括小于约2.8％的半抗体。
38.根据权利要求36所述的组合物，其中所述组合物包括约0.1-20％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1％-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述组合物包括约0.6-1.7％的半抗体。
40.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从阳离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包括小于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2.8％、约2％、约1％或约0.5％的半抗体。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述洗脱液级分包括约0.1-20％、约0.1-10％、约0.1-9％、约0.1-8％、约0.1-7％、约0.1-6％、约0.1-5％、约0.1-4％、约0.1％-3％、约0.1-2.8％、约0.5％-2.5％、约0.5％-1.5％、约0.6-1.7％、约0.6-18％或约1-17％的半抗体。
42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述洗脱液级分从阳离子交换树脂收集，并且包括约0.6-18％的半抗体。
43.根据权利要求40所述的组合物，其中所述洗脱液级分从混合模式树脂收集，并且包括约1-17％的半抗体。
44.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从阳离子交换色谱树脂收集的流通和/或洗涤级分，并且其中所述流通和/或洗涤级分包括小于约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约14％、约13％、约12％、约11％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％的半抗体。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述流通和/或洗涤级分包括小于约6％的半抗体。
46.根据权利要求36至45中任一项所述的组合物，其中半抗体的水平是通过非还原CE-SDS(用十二烷基硫酸钠进行的毛细管电泳)确定的。
47.根据权利要求36至46中任一项所述的组合物，其中所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
48.一种药物组合物，其包括根据权利要求36至47中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载体。
49.一种产生具有水平降低的酸性物种的包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分的制剂的方法，所述方法包括使包括所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分以及酸性物种的样品经受阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂，由此产生具有水平降低的酸性物种的包括所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分的所述制剂。
50.一种降低包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分的制剂中的酸性物种的水平的方法，所述方法包括使包括所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分以及酸性物种的样品经受阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂，由此降低包括所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分的所述制剂中的酸性物种的水平。
51.根据权利要求49或50所述的方法，其中所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述样品经受阴离子交换色谱树脂。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述阴离子交换色谱树脂包括选自由以下组成的组的官能团：二乙基氨基乙基、四氨基乙基和季铵。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述阴离子交换色谱树脂选自由POROSTMXQAEX和CaptoTMQ ImpRes组成的组。
55.根据权利要求52至54中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换色谱树脂以结合洗脱模式运行。
56.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述样品经受混合模式色谱树脂。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述混合模式色谱树脂包括选自由以下组成的组的官能团：羧基、羟基、N-苄基-N-甲基乙醇胺、苯基丙胺和己胺。
58.根据权利要求56或57所述的方法，其中所述混合模式色谱树脂是CaptoTMAdhereImpRes。
59.根据权利要求49至58中任一项所述的方法，其中所述制剂包括小于约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的酸性物种。
60.根据权利要求49至59中任一项所述的方法，其中所述制剂包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种。
61.根据权利要求49至60中任一项所述的方法，其中所述制剂包括约11-22％的酸性物种。
62.根据权利要求49至60中任一项所述的方法，其中所述制剂包括约11-38％的酸性物种。
63.根据权利要求49至60中任一项所述的方法，其中所述制剂包括约9-18％的酸性物种。
64.根据权利要求49至60中任一项所述的方法，其中所述制剂包括约11-38％的酸性物种以及小于约24％的碱性物种。
65.根据权利要求49至60中任一项所述的方法，其中所述制剂包括约11-38％的酸性物种以及(i)约58-62％的主要物种或(ii)大于约64％的主要物种。
66.根据权利要求49至65中任一项所述的方法，其进一步包括使用洗脱缓冲液收集洗脱液级分。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述洗脱液级分包括小于约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的酸性物种。
68.根据权利要求66或67所述的方法，其中所述洗脱液级分包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种。
69.根据权利要求66至68中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集。
70.根据权利要求69所述的方法，其中从阴离子交换色谱树脂收集的所述洗脱液级分包括约11-22％的酸性物种。
71.根据权利要求66至68中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集。
72.根据权利要求71所述的方法，其中从混合模式色谱树脂收集的所述洗脱液级分包括约12-38％的酸性物种。
73.根据权利要求66至72中任一项所述的方法，其中与所述样品中的酸性物种的水平相比，所述制剂或所述洗脱液级分中的酸性物种的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
74.根据权利要求66至73中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约50-200mM、约70-150mM、约90-130mM或约100-110mM的氯化钠。
75.根据权利要求66至74中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约100-110mM的氯化钠。
76.根据权利要求66至75中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约20-150mM、约30-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM的组氨酸。
77.根据权利要求66至76中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约40-60mM的组氨酸。
78.根据权利要求66至77中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM的乙酸盐。
79.根据权利要求66至78中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约40-60mM的乙酸盐。
80.根据权利要求66至79中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约1-500mM、约10-250mM、约10-150mM、约10-100mM、约20-90mM、约30-80mM、约40-70mM或约50-60mM的Bis-Tris。
81.根据权利要求66至80中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约40-60mM的Bis-Tris。
82.根据权利要求66至81中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约5-7或约5.5-6.5的pH。
83.根据权利要求66至82中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约5.5-6.5的pH。
84.根据权利要求66至83中任一项所述的方法，其中所述洗脱缓冲液包括约50mM的组氨酸、约105mM的NaCl，并且具有约6.0的pH。
85.根据权利要求49至84中任一项所述的方法，其中所述所关注的蛋白质以约10-100g/L、约20-90g/L、约30-80g/L或约40-70g/L的水平上样到所述阴离子交换色谱树脂或所述混合模式色谱树脂上。
86.根据权利要求49至85中任一项所述的方法，其中所述所关注的蛋白质以约50-60g/L的水平上样到所述阴离子交换色谱树脂或所述混合模式色谱树脂上。
87.根据权利要求49至86中任一项所述的方法，其中酸性物种的水平是通过离子交换色谱确定的。
88.根据权利要求49至87中任一项所述的方法，其中在使所述样品经受阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂之前，使所述样品经受阳离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂。
89.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括所述抗体的小于约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的酸性物种。
90.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种。
91.根据权利要求90所述的组合物，其中所述组合物包括约11-22％的酸性物种。
92.根据权利要求90所述的组合物，其中所述组合物包括约9-18％的酸性物种。
93.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括所述抗体的小于约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的碱性物种。
94.根据权利要求93所述的组合物，其中所述组合物包括小于约24％的碱性物种。
95.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括约1-45％、约1-40％、约1-35％、约1-25％、约5-35％、约10-35％、约15-35％、约1-30％、约1-25％、约1-24％、约5-25％、约5-30％、约5-45％、约10-25％、约10-30％、约10-40％、约15-25％、约15-30％、约15-35％、约15-25％、约17-26％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种。
96.根据权利要求95所述的组合物，其中所述组合物包括约16-41％的碱性物种。
97.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括所述抗体的大于约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的主要物种。
98.根据权利要求97所述的组合物，其中所述组合物包括大于约64％的主要物种。
99.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括约40-99％、约45-99％、约50-99％、约55-99％、约50-90％、约55-90％、约50-80％、约55-80％、约50-70％、约55-70％、约50-65％、约46-67％、约55-65％、约58-62％、约58-63％、约58-67％、约53-61％或约46-66％的主要物种。
100.根据权利要求99所述的组合物，其中所述组合物包括约46-67％的主要物种。
101.根据权利要求99所述的组合物，其中所述组合物包括约58-62％的主要物种。
102.根据权利要求89-101中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约11-38％的酸性物种以及小于约24％的碱性物种。
103.根据权利要求89-101中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约11-38％的酸性物种以及大于约64％的主要物种。
104.根据权利要求89-101中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约11-38％的酸性物种以及约58-62％的主要物种。
105.根据权利要求89-101中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约9-41％的碱性物种以及约9-18％的酸性物种。
106.根据权利要求89-101中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约9-41％的碱性物种以及大于约64％的主要物种。
107.根据权利要求89-101中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约16-41％的碱性物种以及约58-62％的主要物种。
108.根据权利要求89-101中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约46-67％的主要物种以及约9-18％的酸性物种。
109.根据权利要求89-101中任一项所述的组合物，其中所述组合物包括约46-67％的主要物种以及小于24％的碱性物种。
110.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包括小于约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的酸性物种。
111.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包括约1-40％、约1-35％、约1-30％、约1-28％、约1-25％、约2-20％、约3-15％、约5-25％、约5-28％、约5-30％、约10-28％、约10-30％、约10-40％、约9-18％、约11-22％、约11-38％、约12-20％、约12-38％、约15-30％、约14-28％或约18-40％的酸性物种。
112.根据权利要求111所述的组合物，其中所述洗脱液级分包括约11-38％的酸性物种。
113.根据权利要求111所述的组合物，其中所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约11-22％的酸性物种。
114.根据权利要求111所述的组合物，其中所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包括约12-38％的酸性物种。
115.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包括小于约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约24％、约23％、约22％、约21％、约20％、约19％、约18％、约17％、约16％、约15％、约10％或约5％的碱性物种。
116.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包括约1-45％、约1-40％、约1-35％、约1-25％、约5-35％、约10-35％、约15-35％、约1-30％、约1-25％、约1-24％、约5-25％、约5-30％、约5-45％、约10-25％、约10-30％、约10-40％、约15-25％、约15-30％、约15-35％、约15-25％、约17-26％、约9-29％、约9-41％或约16-41％的碱性物种。
117.根据权利要求116所述的组合物，其中所述洗脱液级分包括约9-41％的碱性物种。
118.根据权利要求116所述的组合物，其中所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包括约9-29％的碱性物种。
119.根据权利要求116所述的组合物，其中所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约16-41％的碱性物种。
120.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包括大于约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约63％、约64％、约65％、约66％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％的主要物种。
121.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从阴离子交换色谱树脂或混合模式色谱树脂收集的洗脱液级分，并且其中所述洗脱液级分包括约40-99％、约45-99％、约50-99％、约55-99％、约50-90％、约55-90％、约50-80％、约55-80％、约50-70％、约55-70％、约50-65％、约55-65％、约58-62％、约58-63％、约58-67％、约46-67％、约53-61％或约46-66％的主要物种。
122.根据权利要求121所述的组合物，其中所述洗脱液级分从混合模式色谱树脂收集，并且包括约53-61％的主要物种。
123.根据权利要求121所述的组合物，其中所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约46-66％的主要物种。
124.根据权利要求110至123中任一项所述的组合物，其中所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
125.根据权利要求110至124中任一项所述的组合物，其中酸性物种的水平、主要物种的水平或碱性物种的水平是通过离子交换色谱确定的。
126.一种药物组合物，其包括根据权利要求110至125中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载体。
127.一种产生具有水平降低的高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白的包括所关注的蛋白质的制剂的方法，所述方法包括使包括所述所关注的蛋白质、高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白(HCP)的样品经受色谱树脂，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，由此产生具有水平降低的高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白的包括所述所关注的蛋白质的所述制剂。
128.一种降低包括所关注的蛋白质的制剂中的高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白(HCP)的水平的方法，所述方法包括使包括所述所关注的蛋白质以及半抗体的样品经受色谱树脂，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，由此降低包括所述所关注的蛋白质的所述制剂中的高分子量聚集体和/或宿主细胞蛋白的水平。
129.根据权利要求127或128所述的方法，其中所述所关注的蛋白质是抗体或其抗原结合部分。
130.根据权利要求127至129中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分是抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分。
131.根据权利要求127至130中任一项所述的方法，其中所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
132.根据权利要求127至131中任一项所述的方法，其中所述色谱树脂是阳离子交换色谱树脂。
133.根据权利要求132所述的方法，其中所述阳离子交换色谱树脂包括选自由以下组成的组的官能团：巯基、磺酸酯、硫酸酯、羧甲基、磺乙基、磺丙基、磷酸酯和磺酸酯。
134.根据权利要求132或133所述的方法，其中所述阳离子交换色谱树脂选自由以下组成的组：POROSTMXS CEX、CaptoTMS ImpAct、TOTOPEARLTMGigaGap CM 650M和TOYOPEALTM硫酸酯650F。
135.根据权利要求132至134中任一项所述的方法，其中所述阳离子交换色谱树脂以结合洗脱模式运行。
136.根据权利要求127至131中任一项所述的方法，其中所述色谱树脂是阴离子交换色谱树脂。
137.根据权利要求136所述的方法，其中所述阴离子交换色谱树脂包括选自由以下组成的组的官能团：二乙基氨基乙基、四氨基乙基和季铵。
138.根据权利要求136或137所述的方法，其中所述阴离子交换色谱树脂选自由POROSTMXQ AEX和CaptoTMQ ImpRes组成的组。
139.根据权利要求136至138中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换色谱树脂以结合洗脱模式运行。
140.根据权利要求127至131中任一项所述的方法，其中所述色谱树脂是混合模式色谱树脂。
141.根据权利要求140所述的方法，其中所述混合模式色谱树脂包括选自由以下组成的组的官能团：羧基、羟基、N-苄基-N-甲基乙醇胺、苯基丙胺和己胺。
142.根据权利要求140或141所述的方法，其中所述混合模式色谱树脂选自由CaptTMMMCImpRes和CaptoTMAdhere ImpRes组成的组。
143.根据权利要求127至142中任一项所述的方法，其中所述制剂包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述制剂包括小于0.5％的高分子量聚集体。
145.根据权利要求127至144中任一项所述的方法，其中所述制剂包括约0.01-10％、约0.01-5％、约0.01-1％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述制剂包括约0.04-0.8％的高分子量聚集体。
147.根据权利要求127至146中任一项所述的方法，其中与所述样品中的高分子量聚集体的水平相比，所述制剂中的高分子量聚集体的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
148.根据权利要求127至147中任一项所述的方法，其中所述制剂包括小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的HCP。
149.根据权利要求127至148中任一项所述的方法，其中所述制剂包括约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约0.1-2、约0.1-3、约2-8或约0.1-8ppm的HCP。
150.根据权利要求149所述的方法，其中所述制剂包括约0.1-2ppm的HCP。
151.根据权利要求127至150中任一项所述的方法，其中与所述样品中的HCP的水平相比，所述制剂中的HCP的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
152.根据权利要求127至151中任一项所述的方法，其中所述制剂包括所述所关注的蛋白质的大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的单体。
153.根据权利要求152所述的方法，其中所述制剂包括所述所关注的蛋白质的大于约99.1％的单体。
154.根据权利要求127至153中任一项所述的方法，其中所述制剂包括所述所关注的蛋白质的约90-99.9％、约90-95％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体。
155.根据权利要求154所述的方法，其中所述制剂包括所述所关注的蛋白质的约98-99％的单体。
156.根据权利要求154所述的方法，其中所述制剂包括所述所关注的蛋白质的约98-99.9％的单体。
157.根据权利要求127至156中任一项所述的方法，其中所述制剂包括所述所关注的蛋白质的小于10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的片段。
158.根据权利要求157所述的方法，其中所述制剂包括所述所关注的蛋白质的小于约0.4％或小于0.3％的片段。
159.根据权利要求127至158中任一项所述的方法，其中所述制剂包括所述所关注的蛋白质的约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.6-1.5％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的片段。
160.根据权利要求159所述的方法，其中所述制剂包括所述所关注的蛋白质的约0.6-1.5％的片段。
161.根据权利要求159所述的方法，其中所述制剂包括所述所关注的蛋白质的约0.5-1.5％的片段。
162.根据权利要求127至161中任一项所述的方法，其进一步包括使用洗脱缓冲液收集洗脱液级分。
163.根据权利要求162所述的方法，其中所述洗脱液级分包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体。
164.根据权利要求162或163所述的方法，其中所述洗脱液级分包括约0.01-10％、约0.01-5％、约0.01-1％、约0.04-0.8％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.5-0.8％、约0.1-6％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。
165.根据权利要求162至164中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分包括约0.04-0.4％的高分子量聚集体。
166.根据权利要求162至165中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分从阳离子交换树脂收集，并且包括约0.01-10％、约0.01至5％、约0.01至1％、约0.04-0.2％、约0.04-0.8％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.5-0.7％、约0.1-6％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。
167.根据权利要求166所述的方法，其中所述洗脱液级分从阳离子交换树脂收集，并且包括约0.1-0.4％的高分子量聚集体。
168.根据权利要求162至165中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.01-10％、约0.01-5％、约0.0-1％、约0.04-0.2％、约0.04-0.8％、约0.1-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。
169.根据权利要求168所述的方法，其中所述洗脱液级分从阴离子交换树脂收集，并且包括约0.04-0.2％的高分子量聚集体。
170.根据权利要求162至169中任一项所述的方法，其中与所述样品中的高分子量聚集体的水平相比，所述洗脱液级分中的高分子量聚集体的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
171.根据权利要求162至170中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分包括小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的HCP。
172.根据权利要求162至171中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分包括约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约0.1-2、约0.1-3、约2-8ppm或约0.1-8ppm的HCP。
173.根据权利要求172所述的方法，其中所述洗脱液级分包括约0.1-8ppm的HCP。
174.根据权利要求172所述的方法，其中所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.1-2ppm的HCP。
175.根据权利要求172所述的方法，其中所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约2-8ppm的HCP。
176.根据权利要求162至175中任一项所述的方法，其中与所述样品中的HCP的水平相比，所述洗脱液级分中的HCP的水平降低了至少约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％。
177.根据权利要求162至176中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分包括所关注的蛋白质的大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的单体。
178.根据权利要求162至177中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分包括所关注的蛋白质的约90-99.9％、约90-95％、约94-99.9％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的单体。
179.根据权利要求178所述的方法，其中所述洗脱液级分包括所关注的蛋白质的约98-99.9％的单体。
180.根据权利要求178所述的方法，其中所述洗脱液级分包括所关注的蛋白质的约98.5-99.5％的单体。
181.根据权利要求162至180中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分包括所关注的蛋白质的小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的片段。
182.根据权利要求162至181中任一项所述的方法，其中所述洗脱液级分包括所关注的蛋白质的约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.5-1.5％、约0.6-1.5％、约0.5-1.1％、约0.1-1.1％、约0.1-0.8％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的片段。
183.根据权利要求182所述的方法，其中所述洗脱液级分包括所关注的蛋白质的约0.1-1.1％、约0.1-0.8％或约0.4-1.1％的片段。
184.根据权利要求182所述的方法，其中所述洗脱液级分从阳离子交换色谱收集，并且包括所关注的蛋白质的约0.1-0.8％或约0.4-0.8％的片段。
185.根据权利要求182所述的方法，其中所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括所关注的蛋白质的约0.1-1.1％或约0.5-1.1％的片段。
186.根据权利要求127至185中任一项所述的方法，其中高分子量聚集体的水平、所关注的蛋白质的片段的水平或所关注的蛋白质的单体的水平是通过尺寸排阻色谱确定的。
187.根据权利要求127至185中任一项所述的方法，其中HCP的水平是通过ELISA确定的。
188.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体。
189.根据权利要求188所述的组合物，其中所述组合物包括小于约0.5％的高分子量聚集体。
190.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括约0.01-10％、约0.01-5％、约0.01-1％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.04-0.4％、约0.04-0.8％、约0.5-0.8％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。
191.根据权利要求190所述的组合物，其中所述组合物包括约0.04-0.8％的高分子量聚集体。
192.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的宿主细胞蛋白。
193.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约0.1-2、约0.1-3、约2-8ppm或约0.1-8ppm的HCP。
194.根据权利要求193所述的组合物，其中所述组合物包括约0.1-2ppm的HCP。
195.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包括大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的抗体单体。
196.根据权利要求195所述的组合物，其中所述组合物包括大于99.1％的抗体单体。
197.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包括约90-99.9％、约90-95％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的抗体单体。
198.根据权利要求197所述的组合物，其中所述组合物包括约98-99％的抗体单体。
199.根据权利要求197所述的组合物，其中所述组合物包括约98-99.9％的抗体单体。
200.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的抗体片段。
201.根据权利要求200所述的组合物，其中所述组合物包括小于约0.4％的抗体片段。
202.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包括约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.6-1.5％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的抗体片段。
203.根据权利要求202所述的组合物，其中所述组合物包括约0.5-1.5％的抗体片段。
204.根据权利要求202所述的组合物，其中所述组合物包括约0.6-1.5％的抗体片段。
205.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约1％、约0.9％、约0.8％、约0.7％、约0.6％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的高分子量聚集体。
206.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包括约0.1-10％、约0.01-5％、约0.01-1％、约0.04-0.8％、约0.04-0.2％、约0.1-0.4％、约0.5-0.8％、约0.1-6％、约0.04-0.4％、约1-10％、约2-10％、约3-10％或约4-10％的高分子量聚集体。
207.根据权利要求206所述的组合物，其中所述洗脱液级分包括约0.04-0.4％的高分子量聚集体。
208.根据权利要求206所述的组合物，其中所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.04-0.2％的高分子量聚集体。
209.根据权利要求206所述的组合物，其中所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.1-0.4％的高分子量聚集体。
210.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包括小于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、约1、约0.9、约0.8、约0.7、约0.6或约0.5ppm的宿主细胞蛋白。
211.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包括约0.1-10、约1-10、约2-10、约3-10、约4-10、约1-5、约5-10、约0.1-2、约0.1-3、约2-8ppm或约0.1-8ppm的HCP。
212.根据权利要求211所述的组合物，其中所述洗脱液级分包括约0.1-8ppm的HCP。
213.根据权利要求211所述的组合物，其中所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.1-2ppm的HCP。
214.根据权利要求211所述的组合物，其中所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约2-8ppm的HCP。
215.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包括大于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.1％或约99.5％的抗体单体。
216.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分，其中所述组合物包括从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包括约90-99.9％、约90-95％、约94-99.9％、约95-99.9％、约99-99.9％、约99.1-99.9％、约98-99％、约98-99.9％或约98.5-99.5％的抗体单体。
217.根据权利要求216所述的组合物，其中所述洗脱液级分包括约98-99.9％的抗体单体。
218.根据权利要求216所述的组合物，其中所述洗脱液级分包括约98.5-99.5％的抗体。
219.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包括从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包括小于约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％、约0.5％、约0.4％、约0.3％、约0.2％或约0.1％的抗体片段。
220.一种组合物，其包括抗GM-CSFRα抗体，其中所述组合物包括从色谱树脂收集的洗脱液级分，其中所述色谱树脂选自由阳离子交换色谱树脂、阴离子交换色谱树脂和混合模式色谱树脂组成的组，并且其中所述洗脱液级分包括约0.1-10％、约0.1-5％、约0.1-3％、约0.1-2％、约0.1-1.1％、约0.1-0.8％、约0.6-1.5％、约0.5-1.5％、约0.5-1.1％、约0.4-0.8％或约0.4-1.1％的抗体片段。
221.根据权利要求220所述的组合物，其中所述洗脱液级分包括约0.1-1.1％、约0.1-0.8％或约0.4-1.1％的抗体片段。
222.根据权利要求220所述的组合物，其中所述洗脱液级分从阴离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.1-1.1％或约0.5-1.1％的抗体片段。
223.根据权利要求220所述的组合物，其中所述洗脱液级分从阳离子交换色谱树脂收集，并且包括约0.1-0.8％或约0.4-0.8％的抗体片段。
224.根据权利要求188至223中任一项所述的组合物，其中高分子量聚集体的水平、抗体单体的水平和/或抗体片段的水平是通过尺寸排阻色谱确定的。
225.根据权利要求188至223中任一项所述的组合物，其中HCP的水平是通过ELISA确定的。
226.根据权利要求188至223中任一项所述的组合物，其中所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
227.一种用于由细胞培养物制备具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质的制剂的方法，所述方法包括：
(a)在生物反应器中温育所述细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5的pH下；由此制备具有水平降低的酸性物种的包括所述所关注的蛋白质的制剂。
228.一种用于降低细胞培养物中的所关注的蛋白质的酸性物种的水平的方法，所述方法包括：
(a)在生物反应器中温育所述细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5的pH下；由此降低所述所关注的蛋白质的酸性物种的水平。
229.一种用于增加来自细胞培养物的所关注的蛋白质的产生产率的方法，所述方法包括
(a)在生物反应器中温育所述细胞培养物；
(b)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5的pH下；由此增加所述所关注的蛋白质的所述产生产率。
230.根据权利要求227至229中任一项所述的方法，其中所述所关注的蛋白质是抗体或其抗原结合部分。
231.根据任何权利要求230所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分是抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分。
232.根据权利要求231所述的方法，其中所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
233.根据权利要求227至232中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5、约6.5-7.5、约6-7、约6.5-7或约6.7-7的pH下。
234.根据权利要求227至233中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的pH维持在约6.5-7的pH下。
235.根据权利要求227至234中任一项所述的方法，其中在温育时段的第2天-第8天期间，所述细胞培养物的pH降低了约0.01-0.4、约0.02-0.4、约0.05-0.3、约0.1-0.4、约0.1-0.3、约0.1-0.2或约0.1-0.2，但维持在约6.5-7的pH下。
236.根据权利要求227至235中任一项所述的方法，其中所述细胞培养物的pH通过一个或多个选自由以下组成的组的步骤维持：
(a)增加所述细胞培养物中的CO2的水平；
(b)将所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约0.1-5g/L下；
(c)增加所述细胞培养物中的乳酸盐产生；以及
(d)在所述温育时段期间增加细胞培养补充剂的水平。
237.根据权利要求236所述的方法，其中所述细胞培养物中的CO2的水平增加了至少约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。
238.根据权利要求236所述的方法，其中所述细胞培养物中的CO2的水平增加了约0.1-5％、约0.2-6％、约0.3-7％、约0.4-8％或约0.5-10％。
239.根据权利要求236所述的方法，其中所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约0.1-5g/L、0.1-4g/L、0.1-3g/L、0.1-2g/L、0.2-2g/L、约0.3-2g/L、约0.4-2g/L、约0.5-2g/L、约0.6-2g/L、约0.7-2g/L、约0.8-2g/L、约0.9-2g/L、约0.1-1.9、约0.2-1.8、约0.3-1.7、约0.4-1.6、约0.5-1.5g/L、约0.6-1.4、约0.7-1.3、约0.8-1.2或约0.9-1.1。
240.根据权利要求236所述的方法，其中所述细胞培养补充剂包括一种或多种补充剂。
241.根据权利要求240所述的方法，其中细胞培养补充剂的水平在温育时段期间增加了约0.1％-20％、约0.1％-10％、约0.1％-5％、约0.5％-20％、约0.5％-10％或约1％-10％。
242.根据权利要求240所述的方法，其中在所述温育时段的第2天-第8天期间，将在约0.1-3％的水平下的所述细胞培养补充剂添加到所述细胞培养物中，并且在温育时段的第4天-第10天期间，所述细胞培养补充剂的水平增加了初始水平的约50％或更多。
243.根据权利要求236所述的方法，其中增加所述细胞培养补充剂使乳酸盐产生增加、渗透压增加、细胞活力增加和/或细胞培养物的pH降低。
244.根据权利要求227至243中任一项所述的方法，其中将所述细胞培养物维持在约35-37℃的温度下。
245.一种用于由细胞培养物制备具有水平降低的酸性物种的包括所关注的蛋白质的制剂的方法，所述方法包括：在生物反应器中温育所述细胞培养物；以及一个或多个选自由以下组成的组的步骤：
(a)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5、约6-7或约6.5-7的pH下；
(b)在所述温育时段期间增加细胞培养补充剂的水平；
(c)将所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约0.1-5g/L下；
(d)增加所述细胞培养物中的乳酸盐产生；
(e)增加所述细胞培养物中的CO2的水平；和/或
(f)降低所述细胞培养物的pH，由此制备具有水平降低的酸性物种的包括所述所关注的蛋白质的制剂。
246.一种用于降低细胞培养物中的所关注的蛋白质的酸性物种的水平的方法，所述方法包括：在生物反应器中温育所述细胞培养物；以及一个或多个选自由以下组成的组的步骤：
(a)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5、约6-7或约6.5-7的pH下；
(b)在所述温育时段期间增加细胞培养补充剂的水平；
(c)将所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约0.1-5g/L下；
(d)增加所述细胞培养物中的乳酸盐产生；
(e)增加所述细胞培养物中的CO2的水平；和/或
(f)降低所述细胞培养物的pH，由此降低所述所关注的蛋白质的酸性物种的水平。
247.一种用于增加来自细胞培养物的所关注的蛋白质的产生产率的方法，所述方法包括：在生物反应器中温育所述细胞培养物；以及一个或多个选自由以下组成的组的步骤：
(a)将所述细胞培养物的pH维持在约6-7.5、约6-7或约6.5-7的pH下；
(b)在所述温育时段期间增加细胞培养补充剂的水平；
(c)将所述细胞培养物中的乳酸盐的水平维持在约0.1-5g/L下；
(d)增加所述细胞培养物中的乳酸盐产生；
(e)增加所述细胞培养物中的CO2的水平；和/或
(f)降低所述细胞培养物的pH，由此增加所述所关注的蛋白质的所述产生产率。
248.根据权利要求245至247中任一项所述的方法，其中所述所关注的蛋白质是抗体或其抗原结合部分。
249.根据权利要求245至248中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分是抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分。
250.根据权利要求245至249中任一项所述的方法，其中所述抗GM-CSFRα抗体或其抗原结合部分是玛弗利木单抗。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4510245A (en) 1982-11-18 1985-04-09 Chiron Corporation Adenovirus promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4534972A (en) 1983-03-29 1985-08-13 Miles Laboratories, Inc. Protein compositions substantially free from infectious agents
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4968615A (en) 1985-12-18 1990-11-06 Ciba-Geigy Corporation Deoxyribonucleic acid segment from a virus
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
WO1990003430A1 (en) 1988-09-23 1990-04-05 Cetus Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
JPH06508511A (ja) 1990-07-10 1994-09-29 ケンブリッジ　アンティボディー　テクノロジー　リミティド 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
EP0575485A1 (en) 1991-03-01 1993-12-29 Dyax Corp. Process for the development of binding mini-proteins
JP3672306B2 (ja) 1991-04-10 2005-07-20 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート ファージミドを使用するヘテロ二量体受容体ライブラリー
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
JP4115281B2 (ja) 2001-05-11 2008-07-09 キリンファーマ株式会社 ヒト抗体λ軽鎖遺伝子を含むヒト人工染色体、および子孫伝達可能な該ヒト人工染色体を含む非ヒト動物
KR20050011741A (ko) 2002-04-11 2005-01-29 메드이뮨 백신즈 인코포레이티드 분무 건조에 의한 생물학적 활성 물질의 보존
CA2482448C (en) 2002-04-11 2014-07-08 Medimmune Vaccines, Inc. Preservation of bioactive materials by freeze dried foam
US7923029B2 (en) 2002-04-11 2011-04-12 Medimmune Llc Spray freeze dry of compositions for pulmonary administration
US20040042972A1 (en) 2002-04-11 2004-03-04 Medimmune Vaccines, Inc. Spray freeze dry of compositions for intranasal administration
KR20100107083A (ko) 2002-12-17 2010-10-04 메디뮨 엘엘씨 생물활성 물질의 고압 분무 건조
ES2424467T3 (es) 2006-03-27 2013-10-02 Medimmune Limited Miembro de unión para el receptor GM-CSF
WO2013158275A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
EA202191470A1 (ru) * 2018-11-27 2021-09-07 Стейдсон (Бейджин) Биофармасьютикалз Ко., Лтд. Антитела, специфично распознающие рецептор-альфа гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, и их применения
US20220127375A1 (en) * 2019-02-14 2022-04-28 Merus N.V. Producing compositions comprising two or more antibodies

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