JP3447731B2 - 改良された顕示ファージ - Google Patents

改良された顕示ファージ

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 この発明は、変異させたエピトープ性ペプチド、又は
ポテンシャル結合タンパク質ドメインのライブラリー
（集合体）のファージ表面上での発現及び提示と、親和
性の高い種類を同定するためのこれら集合体のスクリー
ニングに係わるものである。
先行技術説明 アミノ酸配列はタンパク質の三次元構造を決定し、そ
の三次元構造場がタンパク質の機能を決定するものであ
る。ポリペプチド鎖上の残基のあるものは、タンパク質
の三次元構造決定において他の残基より重要である。溶
媒に露出しているアミノ酸の置換は、内部における置換
ほど三次元構造に影響を及ぼさない。
「タンパク質エンジニアリング」はタンパク質の結合
特性を変える目的でその配列を操作する技術である。タ
ンパク質の結合に影響を与える要素は知られているが、
新たな相補的な表面を作り出すことは困難とされてい
る。
DNA組換え技術の開発によって、天然のタンパク質を
コードする遺伝子を突然変異させ、それを発現させる方
法で、突然変異タンパク質を得ることが可能になった。
突然変異誘発法の幾つかは既に知られている。一つは
「タンパク質手術（surgery）」と呼ばれ、選ばれた遺
伝子内に１つないし２つの予め決められた突然変異を導
入する方法である。この方法では、予め完全に決定され
た単一のポリペプチドの配列が発現され、その結合上の
特徴が評価される。
上記と極端に異なる方法は、ランダム突然変異法で、
放射線や様々な化学物質といった比較的特異性のない突
然変異原による方法である。
核酸合成法の適切なサイクル中で、塩基混合物を使っ
て所定のヌクレオチドをランダムに変化させることがで
きる。あるコドン中のそれぞれの位置に対する混合物中
の塩基の割合により、縮重DNAの集合から発現されるポ
リペプチド中での各アミノ酸の出現頻度が決まる。オリ
ファント等（OLIP86）及びオリファント及びストルール
（OLIP87）は、非常に縮重したオリゴヌクレオチドの連
結及びクローニングを行って、これらをプロモーターの
突然変異に用いている。彼らは同じような方法がタンパ
ク質コード領域の変化に使えるだろうと示唆している。
ただし彼らは ａ）どのように変化させるタンパク質残基を選択するべ
きか、又は ｂ）どのように適切な特異性のある突然変異体を選択或
はスクリーニングするべきかは述べていない。ハイドハ
ール−オルソン及びザウアー（REID88a）は合成縮合オ
リゴヌクレオチドを用いて2,3の残基を20種のアミノ酸
全てに同時に変化させた。ヴァーション等（VERS86a、V
ERS86b）も参照のこと。レイドハール−オルソン及びザ
ウアーは、一度に何個まで残基が変化させられるかにつ
いて、或いは異なったアミノ酸をコードするDNAの量が
同じではないという問題については触れていない。
多くの研究者が、変異させてない外来抗原性エピトー
プを天然のファージ表面タンパク質に融合させて、ファ
ージ表面に導き、エピトープが抗体に認識されることを
実証してきた。
ダルベッコ（DULB86）は、外来抗原エピトープをウイ
ルス表面上のタンパク質に結合させ、外来エピトープが
抗体に接近できるようなかたちで発現されたキメラ・タ
ンパク質をウイルス表面上に提示する方法を提案してい
る。1985年スミス（SMIT85）は、EcoR Iエンドヌクレア
ーゼ遺伝子の機能しないセグメントをバクテリオ・ファ
ージf1の「遺伝子III」（gene III）に「同期させて（i
n phase）」挿入したと報告した。「遺伝子III」のタン
パク質は感染に必要なマイナーコートタンパク質であ
る。スミスは、組換えファージがEcoR Iエンドヌクレア
ーゼに対する固定抗体によって吸着させることを実証し
ている。デ・ラ・クルツ等（DELA88）は、プラスモジウ
ム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum）のサー
カムスポロツォイト・タンパク質のリピート領域のフラ
グメントを「遺伝子III」のタンパク質内の挿入体とし
てM13上に発現させた。彼らは、この組換えファージが
ウサギにおいて抗原性とともに免疫原性を示しこと、更
にこのような組換えファージがＢエピトープ・マッピン
グに使用できることを示した。研究者たちは類似した組
換えファージがＴエピトープ・マッピングやワクチンの
開発に用いられ得ると提案している。
マッカファーテイ等（MCCA90）は、抗体のFvフラグメ
ントをp IIIタンパク質のＮ末端に融合させたものを発
現させた。Fvフラグメントは突然変異させていない。
ラッドナー、グリック、及びバード（WO88/06630、公
開1988年９月７日、米国出願07/021046に基づく優先権
主張、ジーニックス・コーポレーションに譲渡）（LG
B）は、ある抗原に結合できる多様な単鎖抗体ドメイン
（SCAD）が次のような方法でスクリーニングできると考
えている。その方法とは、単鎖抗体の結合決定領域をコ
ードするDNAを変化させ、SCAD遺伝子をファージ・ラム
ダのgpV遺伝子内にサブクローニングしてSCAD/gpVキメ
ラがファージ・ラムダの外部表面に提示されるようにし
た上、親和性クロマトグラフィーで抗原に結合するファ
ージを選択するものである。
パームリー及びスミス（PARM88）は、可能なヘキサペ
プチドを全て提示するエピトープライブラリーを構築
し、抗体に結合するエピトープを分離するのに使用する
ことが可能だと提案している。エピトープライブラリー
を論じるにあたり著者たちは、異なるアミノ酸の出現
（representation）のバランスをとることが望ましいこ
とを示唆していない。また挿入体が外来タンパク質の完
全なドメインをコードすべきであるとも教えていない。
エピトープは、構造のあるタンパク質とは異なり、無構
造のペプチドであると考えられている。スコット及びス
ミス（SCIT90）及びクワーラ等（CWIR90）は、エピトー
プをコードする縮重オリゴヌクレオチドをfdファージの
「遺伝子III」と融合させ、ファージ感染細胞に融合遺
伝子を発現させることによって、目的の抗体のエピトー
プとなる可能性のあるエキサペプチドをランダムに突然
変異させた「エピトープライブラリー」を作成した。細
胞はその表面にエピトープを提示している融合ファージ
を生産した。固定化抗体に結合したファージは酸で溶出
され、研究された。デヴリン等（DEVL90）は同様に、M1
3ファージを使い、ストレプトアビジンによって認識さ
れるランダムな15残基からなるエピトープをスクリーニ
ングしている。
スコット及びスミス、クワーラ等、及びデヴリン等の
ライブラリーでは各位置ごとに可能なアミノ酸は非常に
偏ったサンプリングをされている。可変部をコードする
縮重オリゴヌクレオチドを設計するにあたって彼等が最
も重視したのは、各位置において20種のアミノ酸全てを
確実にコードできるようにすることだった。その次に考
慮したのは停止のシグナルの頻度を最低限に抑えること
である。その結果スコット及びスミス、及びクワーラ等
はNNK（Ｎ＝Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃの同量の混合、Ｋ＝ＧとＴ
の同量の混合）を用い、デヴリン等はNNS（Ｓ＝ＧとＣ
の同量の混合）を使った。最も有利なアミノ酸に対する
最も不利なアミノ酸の出現頻度比を最小にしようとする
試みも、酸性アミノ酸及び塩基性アミノ酸が生じる率を
均等にしようとする試みもなかった。
デヴリン等は、親和性によって選択された数個のスト
レプトアビジン結合ペプチドの特徴を明らかにしたが、
これらのペプチドの親和定数を測定しなかった。クワー
ラ等は彼の用いたペプチドの親和定数を測定したが、最
良のヘキサペプチドでも親和性が350−300nMであり、標
的抗体により認識される天然のMet−エンケファリンエ
ピトープ（7nM）と「けた違いに」弱いことがわかり落
胆した。クワーラ等は、恐らくファージ（p IIIのコピ
ーを約４個持つ）と二価ターゲットのIg Gとの間に多価
の相互作用が起こるために、親和性の高いペプチドを持
つファージが酸で溶出しても結合したままだったのでは
ないかと推測している。スコット及びスミスはターゲッ
ト抗体（A2）に対する親和性が参考用のミオヘメリトリ
ン（myohemerythrin）エピトープ（50nM）に匹敵するペ
プチドを発見することができた。しかし、スコットとス
ミスも、ターゲットに対する融合ファージの不可逆的結
合により、親和性の高いペプチドが幾つか失われたので
はないかという懸念を表している。
ラッドナー等（WO90/02809、ここに引用して組み込
む）は、予め決められたターゲットと親和性のある新規
結合タンパク質の生成及び確認のプロセスを説明してい
る。このプロセスによると、ポテンシャル結合ドメイン
（単なるエピトープ性ペプチドとは区別される）をコー
ドする遺伝子を遺伝子エレメントと融合させるが、この
遺伝子は限られた数の所定のコドンをランダムに変異さ
せることによって得られるものであり、遺伝子エレメン
トは結果的にキメラ発現産物をウイルス（特に繊維状フ
ァージ）又は細胞の外部表面に提示するものである。つ
いで、クロマトグラフィ選択を用いて、クロマトグラフ
ィのターゲットに結合したタンパクをコードする融合遺
伝子を含むゲノムを持っているウイルスや細胞を同定す
る。ラッドナー等はウイルス又は細胞がターゲットに非
常にしっかりと結合しているために生存状態で溶出でき
ない場合に、目的の遺伝子を回収する方法を幾つか検討
した。それらの方法とは、細胞をその場（in situ）で
クロマトグラフィのマトリックス上で生育させる、マト
リックスをばらばらにして接種剤として培養器に入れ
る、マトリックスとターゲット物質の間の連結を分解す
る、ウイルスや細胞を分解した上でそれらのDNAを回収
するといった方法である。しかしこれらの方法は、ター
ゲットに非特異的に結合しているウイルスや細胞も回収
してしまう。
WO90/02809はまた変異誘発の方法を検討しており、そ
れには20種のアミノ酸を全てほぼ同量の割合でもたらす
方法も含まれているが、タンパク質ドメインの変異誘発
の文脈で述べられており、エピトープ性ペプチドについ
てではない。
発明の要旨 本発明では、上述のような不備不足を克服することが
意図されている。発明の実施形態の１つでは、「提示フ
ァージ」のライブラリーが所定のターゲットに高い親和
性で結合するドメインを同定するために使用されてい
る。ポテンシャル結合ドメインはファージの表面に提示
されるがこれは、ポテンシャル結合ドメインとファージ
が本来有するコートタンパク質のすくなくとも機能部分
とからなるキメラ外部表面タンパク質をコードする融合
遺伝子を発現することによって達成できる。好ましい方
法は「多様化」（variegation）と呼ばれるセミランダ
ムな変異発生のパターンを用いる。これは親結合ドメイ
ンの残基の中で、結合特性に最も影響を与えそうだがそ
の基本構造を破壊する可能性が最も低そうな残基に変異
を集中させる方法である。その結果、ある１つのファー
ジは外来結合ドメインを１つだけ提示する（恐らく複数
コピーとして）が、ファージライブラリーは全体として
何千、何百万という異なる結合ドメインを提示すること
になる。ファージライブラリーは親和性分離技術によっ
てスクリーニングされ、成功（高親和性の）結合ドメイ
ンのあるファージが同定され、これらのファージは回収
され、特徴を調べられて、成功結合ドメインの配列を決
定する。その上でこれらの成功結合ドメインは再び親結
合ドメインとして、多様化及び親和性による分離に用い
られるのである。
発明の別の実施形態では、提示ファージがその表面
に、ある天然外部表面タンパク質の機能部分とポテンシ
ャル・エピトープから成るキメラ外部表面タンパク質を
提示する。これらの提示ファージから成り立っているエ
ピトープライブラリー内では、外来エピトープに相当す
る領域は超可変になる（hypervariable）。このライブ
ラリーは抗体又は他の関連結合タンパク質を用いてスク
リーニングされ、親和性の高いエピトープが同定され
る。ポテンシャル結合ドメインの提示、変異誘発、及び
スクリーニングに関する参考文献は、別途指示がない限
り、ポテンシャル・エピトープの提示、変異誘発及びス
クリーニングに、必要な変更を加えて（mutatis mutand
is）適用される。
前述の通り、キメラコート・タンパク質のコピーが数
個１つのファージ上に提示されている場合、特にターゲ
ットが多価であれば（抗体の場合がそうである）不可逆
的な結合が起こる危険がある。そのような場合、溶出勾
配により最後に溶出されたファージは、最も高い親和性
のあるエピトープ又は結合ドメインを有するものではな
く、当初の溶出条件のもとではターゲットに結合してい
られるだけの親和性はあっても、不可逆的に結合するだ
けの親和性はない。結果として、この分野で知られてい
る方法論では非常に親和性のある高いエピトープ又は結
合ドメインを回収できない可能性がある。そういうエピ
トープや結合ドメインが、多くの目的にとって最も好ま
しい種類である。
我々はキメラ・コート・タンパク質に対し、外来エピ
トープ又は結合ドメインと野性型のファージ・コート・
タンパク質のもともとの配列との間に、部位特異的プロ
テアーゼにより切断できるリンカー（linker）配列を組
み込むことによって不可逆的結合の問題に対処すること
を提案する。この場合、ファージライブラリーは固定化
ターゲットとともにインキュベートされる。親和性の低
いファージはターゲットから溶出され、固相（親和性の
高いファージを有する）のみが保持される。前述のリン
カー配列が切断され、結合したエピトープ又は結合ドメ
インを残したままファージの粒子が放出される。その後
粒子を回収し（そのDNAの配列決定して、相当するエピ
トープ又は結合ドメインの配列を決める）か、又は結合
したペプチドを回収する（及びそのアミノ酸を直接配列
決定する）こともできる。前者の回収方法の方が好まし
い、というのはコードしているDNAを試験管内でPCRを用
いるか、或いは高親和性の提示ファージを適切なホスト
細胞をインビボで感染（transfecting）させることによ
って、増幅させることができるからである。開裂可能リ
ンカーによる結合タンパク質の生成は当分野で知られて
いるが、このようなリンカーをファージのキメラ・コー
ト・タンパク質のコントロールされた開裂を行うために
使用することは、これまで報告されていない。
不可逆的結合に対処するもう一つの方法は、結合ドメ
インが「ミニ・タンパク質」である場合に適している。
つまり比較的小さいペプチドで構造の安定度が主に一つ
又はそれ以上の共有結合架橋、例えばジスルフィド結
合、の存在に起因するものが挙げられる。上記の例で示
したように、親和性の低いファージが先に除去される。
残った高親和性の結合ファージは、例えばジスルフィド
結合のドメインの場合はジチオトレイトールなどの、ク
ロスリンクを切るがペプチド結合を開裂したりクロスリ
ンクされていないアミノ酸側鎖を修飾したりしない試薬
で処理される。通常これによってファージが直ちにリリ
ースされるか、又は他の方法によってファージを溶出さ
せるのに十分な変性がおきる。
以上二つの方法が両立できることは当然である。
これまでに知られているエピトープ提示ファージライ
ブラリーでは、M13の野生型「遺伝子III」タンパク質を
コードする遺伝子が、キメラ・コート・タンパク質をコ
ードする遺伝子で置換することによってファージゲノム
が変えられた。その結果、野生型「遺伝子III」タンパ
ク質の正常なコピー５個がすべてキメラ・コート・タン
パク質に置換された。この場合各ファージはターゲット
に対し５個のポテンシャル結合個所を有しており、従っ
て非常に高い結合性がある可能性がある。親和性の高い
エピトープ（又は結合ドメイン）にあっては、これは不
可逆的結合の原因となるかもしれない。
本発明における、提示ファージ、特にエピトープ提示
ファージのターゲットに対する結合性を減らし、不可逆
的結合の問題を緩和するための方法の１つは、ファージ
が二つの遺伝子、すなわちキメラコート・タンパク質を
コードする遺伝子と、野生型タンパク質をコードする遺
伝子をもつように操作することである。従って、同一の
エピトープ又は結合ドメインを担っているファージであ
っても、野生型とキメラ・コート・タンパク質の分子比
率が異なる場合もあり、因って異なった結合性を有する
可能性がある。ライブラリーの平均比率はこれら二つの
同起源遺伝子の発現レベルによって変わるだろう。
キメラ・コート・タンパク質とそれが由来する野生型
・コート・タンパク質の比率を変えられた方が有利であ
る。例えば、進化の初期段階において、ターゲットに対
する結合ドメインの親和性はかなり低い。特にドメイン
がターゲットに対する親和性が全くない親結合ドメイン
基づいていればなおさらである。
調節はキメラ遺伝子を制御可能なプロモーターのコン
トロール下に置くことにより達成できる。同族野生型遺
伝子を、別の調節可能なプロモーターのコントロール下
に置くことは可能かもしれないが、これはM13「遺伝子I
II」の場合のように遺伝子がポリシストロン性オペロン
（polycistronic operon）の一部であれば実現不可能と
なる。その場合、野生型遺伝子の発現は、メチオニン・
イニシエーション・コドンをロイシン・イニシエーショ
ン・コドンと置換することによって削減できるだろう。
M13「遺伝子III」は前述の通り、この繊維状ファージ
のマイナーなコート・タンパク質の一つをコードする
（一つのファージにつき５個のコピー）。この遺伝子を
変えて外来エピトープがファージ・コートに提示される
ようにした人たちにより報告されている不可逆的結合の
困難性を考慮すると、M13主要コート・タンパク質の使
用を避けた方がよいことは明白である。しかし我々は、
一つのファージにつきこの主要タンパク質のコピーが10
00以上あるにもかかわらず（あるいはそうであるが故
に）、主要コート・タンパク質のキメラは、実際スクリ
ーニングの目的のためポテンシャル結合ドメインを提示
させるのに役立つことを発見した。主要（VIII）コート
・タンパク質は同様にエピトープ・ファージのライブラ
リーを構築するのに役立つであろうことは間違いない。
我々はまた、ポテンシャル結合ドメイン（又はエピト
ープ性ペプチド）をこの主要コート・タンパク質に（恐
らく他のタンパク質にも）連結するのに適したリンカー
も開発した。
最後に、エピトープライブラリーで経験した問題の幾
つかは、アミノ酸の非常に偏った配置をもたらす変異誘
発パターンを用いることから起こるということからすれ
ば、現在の発明はまた、偏りがより少なく従ってより効
率的なエピトープ・ファージライブラリーにとつなが
る、様々な改善されたパターンを志向すると言えよう。
図面の簡単な説明 図１はファージを遺伝子ファージとしていかに使うか
を示す。（ａ）は脂質二重層に位置する野生型プレコー
トタンパク質である。シグナルペプチドはペリプラスム
空間にある。（ｂ）では、シグナル・ペプチドと成熟コ
ートタンパク質配列の間に置かれたポテンシャル結合ド
メインを有するキメラプレコートタンパク質が同じよう
に捕らえられている。（ｃ）と（ｄ）では、シグナル・
ペプチドはすでに野生型及びキメラ・タンパク質からそ
れぞれ切断されているが、コートタンパク質配列の残基
のいくつかが脂質二重層と相互作用し、成熟タンパク質
が完全にペリプラスムに移行するのを防いでいる。
（ｅ）と（ｆ）では、成熟した野生型及びキメラ・タン
パク質が、ペリプラスムに出て行くにつれて、一本鎖DN
Aファージのコートに形成されていく。ファージは外膜
を通って培地の中にでていき、そこで回収されたクロマ
トグラフィーによって評価されたりする。
図２はファージf1のコート・タンパク質のＣαｓを示
す。
好ましい実施形態の詳細な説明 I.提示方法 A.一般的考察 本発明においては、ポテンシャル結合ドメイン（pb
d）又はポテンシャル・エピトープはファージ表面にお
いてファージのコート（外部表面）タンパク質（OSP）
と融合した状態で提示される。このキメラの外部表面タ
ンパク質はファージゲノムに挿入された提示遺伝子によ
って発現されたポリペプチドのプロセシング産物であ
る。従って、１）提示遺伝子が導入できるためは、ファ
ージのゲノムは、遺伝物質の追加に耐えうるか、又は置
換してもよい遺伝物質を持っていなければならない。
２）ビリオン（virion）は、遺伝物質の挿入又は置換
後、ゲノムをパッケージする能力を持たなければならな
い。更に３）ファージ表面のOSP−IPBDタンパク質の提
示は、ファージの増殖の障害となるほどのビオリン構造
破壊をもたらしてはならない。
ウイルス粒子が組み立てられるとき、そのコートタン
パク質は、ａ）細胞質から、ｂ）ペリプラスムから、ま
たはｃ）脂質二重層内から、ファージに付着していく可
能性がある。提示遺伝子からできたばかりの生成物は、
コート・タンパク質がペリプラスム又は脂質二重層内か
らファージに付着していく場合には、例えば、pho Aシ
グナル（MKQSTIALALLPLLFTPVTKA）といった機能的分泌
シグナルペプチドを、アミノ末端に持たなければならな
い。分泌シグナルがポテンシャル結合ドメインの提示に
必要であれば、特に好ましい実施形態においては、雑種
遺伝子が発現される細菌細胞は「分泌ができる」タイプ
の細菌である。
外来エピトープ又は結合ドメインをコードするDNA配
列は、修飾後のコート・タンパク質の遊離末端が通常ア
ミノ末端である場合は、コート・タンパク質をコードす
る配列の前に置くべきであり、遊離末端がカルボキシ末
端である場合は後ろに置くべきである。
ファージの形態形成経路により、IPBDの折りたたみ
（fold）が起こる環境が決まる。IPBDが必要不可欠なジ
スルフィド結合を有する場合、ペリプラスムで形成され
るファージが好ましい。IPBDは細胞内では折りたたまれ
ない可能性があるからである（これらのタンパク質はフ
ァージが細胞からリリースされた後に折りたたまれるだ
ろう）。一方IPBDが大きな又は非水溶性の補欠分子団
（Fe4S4クラスターなど）を必要とする場合は、細胞内
で形成されるファージが好ましい。IPBDが分泌された場
合、補欠分子団の欠如のために折りたたみができない可
能性があるからである。
多様化（バリエゲーション）導入時、多重感染によっ
て、ある一つのPBDの遺伝子を持つにもかかわらず、そ
の表面にすくなくとも幾つかの異なったPBDのコピーを
持つ雑種遺伝子パッケージ（GP）ができる可能性があ
る。結果的に低い多重感染度（MOI）となる条件下で細
胞をファージに感染させることによって、この可能性を
最低限に押さえることが望ましい。
あるバクテリア・ファージにとって望ましいOSPは、
通常ファージ表面に最大数のコピーを持つものである。
このことがOSP−IPBDの野生型に対する比率を変える
際、最大の柔軟性を持たせられる上、親和性による分離
を成功させる可能性が最も高いからである。更に、一つ
か二つのコピーの中にしか存在しないタンパク質は、通
常、形態形成又は感染において必要不可欠な機能を持っ
ている。このようなタンパク質を追加又は挿入によって
変異させると、GPの生存度を低減する結果となる。しか
しながら、M13g IIIタンパク質のようなOSPは、PBDを提
示させるOSPとして優れた選択であると言える。
野生型のosp遺伝子は保存されることが望ましい。ipb
d遺伝子断片は受けいれ側のosp遺伝子の二番目のコピー
に挿入するか又は新規につくられたosp遺伝子に挿入す
ることができる。osp−ipbd遺伝子は調節プロモーター
のコントロール下に置かれることが望ましい。我々のプ
ロセスは、IPBDに由来するPBDのあるものが新しい機
能、つまり選択されたターゲットに結合するという機能
を発展させるように進化を強化する。進化させる遺伝子
を重複遺伝子上に置くことは、タンパク質の進化におい
て広く認められたシナリオの模倣である。遺伝子の重複
がタンパク質の先祖からあるタンパクファミリーが進化
する上で第一の段階であったとすることは、現在一般的
に認められている考え方である。ある遺伝子のコピーを
２個持つことにより、影響を受ける生理学的過程はその
うち１個の遺伝子の突然変異を許容できる。この過程は
グロブリンファミリーについてはよく理解されており、
記録されている（DICK83、p65ff、及びCREI84、p117−1
25参照）。
ユーザーはipbd遺伝子断片を挿入するOSP遺伝子候補
の部位を選ぶ必要がある。ほとんどのバクテリオファー
ジのコートは非常に秩序整然としている。繊維状ファー
ジは、螺旋形の格子といえる。等長ファージは二十面体
の格子といえる。主要コート・タンパク質のモノマーは
格子の交点にあり、付近のモノマーと決められた相互作
用を起こす。通常の格子接触全部を形成はできないがい
くらか形成することによって、格子にはまり込むタンパ
ク質は、ａ）ビリオンの形成をだめにする。ｂ）ビリオ
ンを不安定な状態にする。ｃ）ビリオンの間にギャップ
が残るので核酸が保護されないなどで、ビリオンを不安
定にしやすい。従って、バクテリオファージにおいて
は、作られたOSP−IPBD融合タンパク質中にビリオンの
他のタンパク質と相互作用をする親OSPの残基を保持す
ることが重要なのである。M13g VIIIでは成熟タンパク
質を全て保持することが望ましいが、M13g IIIでは最後
の100残基（又はそれ以下でもよい）を保持すれば充分
である。このように短くしたg IIIタンパク質は、完全
なg IIIタンパク質と並んで発現される。g IIIタンパク
質はファージの感染性に必要だからである。
提示遺伝子は既知のプロモーター、望ましくはlacUV
5、tac、又はtrpといった調節プロモーターの下流に置
く。
B.繊維状ファージ 繊維状ファージにはM13、f1、fd、If1、Ike、Xf、Pf
1、及びPf3が含まれ、特に重要である。通常のクローニ
ングと配列決定用ベクターである繊維状ファージM13の
ライフサイクル全体はよく理解されている。M13の遺伝
子構造（SCHA78）はビリオンの物理的構造（BANN81、BO
EK80、CHAN79、ITOK79、KAPL78、KUHN85b、KUHN87、MAK
O80、MARV78、MESS78、OHKA81、RASC86、RUSS81、SHA7
8、SMIT85、WEBS78、及びZIMM82）とともに知られてい
る。コート・タンパク質の構造及び機能に関する最近の
検討は、RASC86を参照のこと。
マービン及び共同研究者（MARV78、MAKO80、BANN81）
は、近縁のファージf1のおよその三次元ビリオン構造
を、遺伝学、生化学、及びウイルスファイバーのＸ線回
折を組み合わせて調べた。図２はバナー等（BANN81）の
モデルに従って描かれたもので、タンパク質のＣαｓの
みしか示していない。円筒形のさやの中の穴のようなも
のは実際はタンパク質の側鎖によって満たされており、
その中のDNAを保護している。タンパク質の各モノマー
のアミノ末端はこの円筒の外側にあり、カルボキシ末端
はDNAの近くの、より狭い範囲にある。他の繊維状ファ
ージ（例えばPF1又はIke）はヘリックスの対称性が異な
るが、全て、多くの短いα−ヘリックスモノマーからな
るコートをもっており、各モノマーのアミノ末端はビリ
オンの表面にある。
1.M13主要コート・タンパク質（g VIII） M13の主要コート・タンパク質は「遺伝子VIII」（gen
e VIII）によってコードされる。50個のアミノ酸からな
る成熟した遺伝子VIIIコート・タンパク質は、アミノ酸
73個のプレコートとして合成される（SCHA78、ITOK7
9）。最初の23個のアミノ酸は、できたばかりのポリペ
プチドを細胞膜内に挿入する典型的なシグナル配列を構
成する。プレコートが自然に膜内に入るのか、それとも
ホストの分泌因子、例えばSecAやSecYなどの作用で入る
のかは今なお議論の対象であるが、本発明の操作には何
ら影響を及ぼさない。
E.coliシグナル・ペプチターゼ（SP−Ｉ）はアミノ酸
18、21、及び23を認識し、残基22もある程度認識して、
プレコート（KUHN85a、KUHN85b、OLIV87）の残基23及び
24の間を切断する。シグナル配列が除去された後、成熟
コートのアミノ末端は内膜のペリプラスム側に位置し、
カルボキシ末端は細胞質側に位置する。アミノ酸50個か
らなる成熟コート・タンパク質のコピー約3000個が膜内
で並んで集まっている。
我々は、以下の三部に分かれた遺伝子を構築した。
１）（２）及び（３）が内膜を通じて分泌されるよう導
くシグナル配列をコードするDNA ２）成熟BPTI配列をコードするDNA ３）成熟M13g VIIIタンパク質をコードするDNA この遺伝子は活性型のBPTIをM13ファージ表面上に出
現させる。
2.M13マイナー・コート・タンパク質一般 導入された結合ドメイン又はエピトープは繊維状ファ
ージ上にキメラマイナーコートタンパク質の一部として
提示することもできる。これらは「遺伝子III、VI、VI
I、及びIX」によってコードされ、それぞれはビリオン
あたり約５個のコピーが存在し、形態形成又は感染に係
わっている。対照的に、主要コート・タンパク質は一つ
のビリオンあたり2500個以上のコピーが存在する。「遺
伝子III、VI、VII、及びIX」タンパク質はビリオンの端
に存在する。
3.M13g IIIマイナー・コート・タンパク質 一本鎖環状ファージDNAは、「遺伝子III」タンパク質
のコピー約５個と結合して、膜結合コート・タンパク質
のパッチを通して、DNAがタンパク質の螺旋状のさやに
閉じ込められるようなかたちで押し出される（WEBS7
8）。DNAは（ウイルスのゲノムを大きく制限するよう
な）塩基対をつくらず、塩基は配列と無関係に相互に介
入し合う。
スミス（SMIT85）及びデ・ラ・クルツ等（DELA88）
は、「遺伝子III」に挿入すると、新規タンパク質ドメ
インがビリオンの外部表面に現れることを示した。ミニ
・タンパク質の遺伝子を「遺伝子III」に融合させる部
位は、スミス及びデ・ラ・クルツ等が使用した個所、別
のドメイン領域に対応するコドン、タンパク質の表面ル
ープ、或いは成熟タンパク質のアミノ末端がある。
出版された文献ではすべてfdの単一の「遺伝子III」
を変化させたものを含むベクターが用いられている。従
って、g IIIのコピー５個は全部同じ変化をしている。
「遺伝子III」はかなり大きいので（1272b.p,又はファ
ージ・ゲノムの約20％），遺伝子全体を重複させて安定
した状態でファージに挿入できるかどうかは確かでな
い。更に、g IIIタンパク質のコピー５個は全てビリオ
ンの一端に集中している。二価ターゲットの分子（抗体
など）が五価のファージと結合するとき、結果としてで
きた複合体は不可逆的となる。ファージのターゲットへ
の不可逆的結合は、ターゲットに対して最も高い親和性
を持っている新規ポリペプチドをコードする遺伝子配列
を有するGPを親和性により濃縮することの妨げとなる。
不可逆的な複合体の形成を抑制するためには、IIIの
カルボキシ末端部分のみをコードする第２の合成遺伝子
を用いることができる。例えば以下のエレメントから成
る遺伝子を作り出すこともできる。（５′から３′の方
向で） １）プロモーター（調節されているものが望ましい） ２）リボゾーム結合部位 ３）開始コドン ４）内膜を通り抜けて以下の５）と６）の部分が分泌さ
れるように指示する機能的なシグナル・ペプチドをコー
ドする配列 ５）ポテンシャル結合ドメインをコードするDNA ６）M13g IIIタンパク質の残基275から424までをコード
するDNA ７）翻訳終了コドン ８）（オプション）転写終了シグナル g IIIタンパク質では、アミノ末端側部分が繊毛結合
に関与しており（感染性）、カルボキシ末端側部分がパ
ッケージングにかかわっている。従って、上述のキメラ
g IIIタンパク質はウイルスのコートに組み上げられる
ことはできるが、感染性には関与しない。
野生型の「遺伝子III」は残しておくので、元のまま
の「遺伝子III」タンパク質が存在する。
このようにして雑種の遺伝子は、シグナル配列（例：
細菌phoA又はbla遺伝子或いはM13ファージ「遺伝子II
I」のシグナル配列）、少なくとも繊維状ファージ（例:
M13）のコート・タンパク質（例:M13「遺伝子III」又は
「遺伝子VIII」タンパク質）の機能的部分をコードする
DNA、およびこれら２つニ機能的に連結されたポテンシ
ャル結合ドメインをコードするDNA、とからなっていて
もよい。発現された物はホスト細胞の内膜（脂質二重
層）に輸送され、そこでシグナル・ペプチドが切断され
てプロセシングを受けた雑種タンパク質ができる。この
雑種タンパク質のコート・タンパク質に似た部分のＣ末
端は、脂質二重層に捕らえられて、この雑種タンパク質
はペリプラスム空間に出られない（これは野生型コート
タンパク質に特徴的に見られる）。新生ファージ粒子の
一本鎖DNAは、ペリプラスム空間に入る際、脂質二重層
から野生型・コート・タンパク質と雑種タンパク質の両
方を集める。雑種タンパク質はこのように、ポテンシャ
ル結合ドメインを繊維状ファージ表面に剥き出しにした
まま、ファージの表面外被に取り込まれる（phaged）。
4.Pf3のコート・タンパク質 他の繊維状ファージにおいても同様な構築物をつくる
ことができる。Pf3はIncP−１プラスミッド（plasmid）
を持つ緑膿菌細胞に感染するよく知られた繊維状ファー
ジである。ゲノムは全て配列が決められ（LUIT85）、複
製と形成に係わる遺伝子シグナルは知られている（LUIT
87）。Pf3の主要コート・タンパク質は、分泌を指示す
るシグナル・ペプチドを持たないという点が普通でな
い。配列には荷電残基ASP7、ARG37、LYS40、及びPHE44
−COO-1があり、これらは外に出たアミノ末端と一致す
る。従って、IPBDがPf3の表面に現れるようにするため
に、以下から成る三分割遺伝子を構築する。
１）緑膿菌に分泌を起こさせることが知られているシグ
ナル配列（IPBDの分泌を生じさせるものとして知られて
いることが望ましい） ２）IPBD配列をコードする遺伝子断片 ３）成熟したPf3コート・タンパク質をコードするDNA （ここで１）は２）に、２）は３）に読み取り枠を合わ
せて融合されている） 更に、アミノ酸１個から10個からなるフレキシブル・
リンカーをコードするDNAをipbd遺伝子断片とPf3コート
・タンパク質遺伝子との間に導入してもよい。また、特
異的プロテアーゼ、例えば組織プラスミノーゲン（plas
minogen）アクチベーター又は血液凝固因子X aなどの認
識部位をコードするDNAをipbd遺伝子断片とPf3コート・
タンパク質遺伝子との間に導入してもよい。特異的プロ
テアーゼの認識部位を形成するアミノ酸はまたフレキシ
ブル・リンカーとしても機能する。この三分割遺伝子
は、いかなるPf3遺伝子の発現も邪魔しないようにPf3に
導入される。遺伝子組換えの可能性を減少させるため、
（３）部は野生型の遺伝子からみて多くの沈黙突然変異
を持つように設計されている。シグナル配列が切り落と
されるとIPBDはペリプラスムに存在するようになり、成
熟コート・タンパク質はアンカー及びファージ形成シグ
ナルとして働く。この融合タンパク質が野生型・コート
・タンパク質がたどるルートと異なるルートによって脂
質二重層に入り、留まるようになってもかまわない。
遺伝子の構築 提示遺伝子の構造コード配列は、キメラ・コード・タ
ンパク質と必要な分泌シグナルをコードする。「キメラ
・コート・タンパク質」とは第一のアミノ酸配列（基本
的には、少なくともファージ・コート・タンパク質の機
能的部分に相当する）と第二のアミノ酸配列、例えば第
一アミノ酸のいかなるドメインとも異なり、実質的に相
同でないものとの融合体である。キメラ・タンパク質は
外来ドメインを提示する場合があるが、この外来ドメイ
ンとは、第一のタンパク質を発現している生体内に（第
１のタンパク質にではなく）見出されるドメインである
か、あるいは異なった種類の生物によって発現されるタ
ンパク質構造の「種間」、「属間」の融合体であること
ができる。外来ドメインは第一のアミノ酸配列のアミノ
又はカルボキシ末端に（スペーサーを介して又は介さず
に）来てもいいし、第一のアミノ酸配列の途中に入って
もよい。第一のアミノ酸配列はファージの表面タンパク
質の１つと完全に一致してもいいし、例えば結合ドメイ
ンを提示できるように変化させてもよい。
ipbd遺伝子をosp遺伝子に挿入するのに理想的な個所
は、ａ）IPBDが元の形に折りたたまれるところ、ｂ）OS
Pドメインが元の形に折りたたまれるところ、及びｃ）
２つのドメイン間の抵触がないところである。
OSPのアミノ又はカルボキシ末端が溶媒にさらされて
いることを示す、ファージのモデルがある場合には、成
熟OSPのその末端はipbd遺伝子を挿入するための第一候
補となる。低解像度三次元モデルで十分である。
三次元構造モデルがない場合でも、成熟OSPのアミノ
及びカルボキシ末端はipbd遺伝子の挿入用として最良の
候補である。機能的融合をするには、ドメイン間の不要
な相互作用を避けるため、IPBD及びOSPドメイン間に残
基の追加が必要な場合もある。必要であれば、ランダム
配列DNA、又はIPBD又はOSPに相同なタンパク質の特定配
列をコードするDNAをosp断片とipbd断片の間に挿入する
ことができる。
OSP内におけるドメイン境界での融合もまた機能的融
合を得るための理想的なアプローチである。スミスは、
異種DNAをf1の「遺伝子III」にサブクローニングする際
にそのような境界を利用している（SMIT85）。
IPBDを提示させるのに適したOSPドメインを決める基
準は、IPBDを同定する際に用いられる基準と多少異なっ
ている。OSPを決める際に最小サイズはそれほど重要で
ない、というのもOSPドメインは最終的な結合分子中に
は存在しないし、多様化のラウンドごとに遺伝子を繰り
返し合成する必要もないからである。設計上の重要事項
は次のとおりである。ａ）OSP::IPBD融合でIPBDが提示
されること。ｂ）最初の遺伝的構築体が適度に便利であ
ること。及びｃ）osp::ipbd遺伝子が遺伝的に安定で操
作が容易であること。ドメインを同定する方法はいくつ
かある。原子座標による方法はジャニン及びコーシア
（JANI85）によって検討されている。これらの方法はα
カーボン（Ｃα）の間の距離、分割平面（ROSE85参
照）、又は埋没表面のマトリックスを用いる。コーシア
とその共同研究者は、多くの天然タンパク質の挙動をド
メイン構造と相互連結させた（彼らの定義に基づく）。
ラッシンは、サーモライシンの残基206−316から成るド
メインの安定性について正確に予測した（VITA84、RASY
84）。
多くの研究者は、安定したドメインを単離し同定する
ため、部分的なタンパク質分解及びタンパク質配列分析
を用いている。（例えば、VITA84、PATE83、SCOT87a、
及びPABO79を参照のこと）パボ等は、コリファージから
のc Iリプレッサが二つのドメインを含むことを示すイ
ンジケーターとして熱量測定を用い、更にドメイン境界
を知るため、部分的なタンパク質分解を使った。
唯一利用できる構造上の情報が候補に上げられたOSP
のアミノ酸配列のみであるならば、我々はターンやルー
プを予測するためにその配列を使うことができる。ルー
プやターンのいくつかは正確に予測される確率が非常に
高い。（チュー及びファスマン（CHOU74）参照）これら
のロケーションはまたipbd遺伝子の一部を挿入する個所
の候補である。
１個又はそれ以上の新しいドメインをタンパク質に融
合させると、細胞から出される新しいタンパク質の機能
が、親タンパク質の機能と違ってくるかもしれない。野
生型・コート・タンパク質のシグナル・ペプチドは本来
のポリペプチドのためには機能できても、融合体を外に
出すよう指示することはできないこともある。Sec依存
性経路を使うためは、異なるシグナル・ペプチドを要す
る場合がある。従ってキメラBPTI/M13「遺伝子III」タ
ンパク質を発現し提示させるには、異種シグナル・ペプ
チド（この場合はphoA）を用いる必要性があることを我
々は見出した。
ペプチドを提示するファージは、ターゲット、殊に多
価ターゲットから溶出させることが困難である。ある特
異的プロテアーゼ、例えば血液凝固因子X aの切断部位
を融合タンパク質に導入し、結合ドメインが遺伝子パッ
ケージから分離され得るようにできる。このような分離
には、結果として得られたファージ全てが同じコートタ
ンパク質を有し、そのため同じ感染力を有するという利
点がある。たとえポリペプチドを提示しているファージ
が親和性マトリックスから切断なしに溶出できる場合で
もである。この工程は、別の方法では失われてしまうか
もしれない、価値ある遺伝子の回収を可能にする。我々
の知る限りにおいては、情報を含む遺伝子パッケージを
回収したり、あるいは感染力が異なるファージの集団を
類似した感染力を持つファージに転化させる方法とし
て、特異的プロテアーゼを用いることを発表したり提案
した者はだれもいない。
特異性の高いプロテアーゼが数多く存在する。本発明
はある特定のプロテアーゼに関するものではないが、切
断条件下ではリンカーは切断するが、ファージの生存に
欠かせないポリペプチド、又は（非常に珍しいケースを
除き）ポテンシャル・エピトープ／結合ドメインは切断
しないようにするため、プロテアーゼは十分特異的であ
ることが望ましい。例えば低温などといった特定の切断
条件を選ぶと、条件外では不適切なプロテアーゼの使用
を可能にすることもできる。
血液凝固及び補体システムには多くの非常に特異なプ
ロテアーゼが含まれている。通常、カスケードの初期段
階における酵素は、後の段階のものより特異性が高い。
例えば因子X a（FX a）はトロンビンより特異性が高
い。（COLM87表10−２参照）ウシのＦ・X aはIle−Asp
−Glu−Gly−Argの後ろを切断するが、ヒトのＦ・X aは
Ile−Asp−Gly−Argの後ろを切断する。どちらのプロテ
アーゼ−リンカーのペア組み合わせを使用してもよい。
トロンビンが使われる場合、最も望ましいトロンビン感
受性のリンカーはフィブリノーゲン、因子XIII、及びプ
ロトロンビン中に見出されるものである。リンカーの配
列を、トロンビンを得た種から取ることが望ましい。例
えば、もしウシのトロンビンを使用する場合、ウシのフ
ィブリノーゲン又はウシのF.XIIIからとられたリンカー
を使うべきである。
ヒトの因子XI aは、人の因子IXを二個所で切断する
（COLM87、p.42）： QTSKLTR145/AEAVF及び SFNDFTR180/VVGGEである。
従って、上記二つの配列（特に下線を引いた部分）の
うちどちらでもPBD及びGP表面アンカー・ドメイン（GPS
AD）のあいだのリンカーとして組み込んで、これらを切
り出すのにヒトのF.XI aを使うことができる。
ヒトのカリクレイン（kallikrein）はヒトのF.XIIをR
353において切断する。（COLM87、p.258） LFSSMTR353/VVGGLV この配列は上に示したhF.XIに非常に類似している。S
SMTRVVGの配列をPBDとGPSADの間のリンカーとして組み
入れ、ヒトのカリクレインでPBDをGPから切り出すこと
が可能である。
ヒトのF.XIIはヒトのF.XIをR369で切断する（COLM8、
7p.256）： KIKPR369/IVGGT。
KIKPRIVGをPBDとGPSADの間のリンカーとして組み込むこ
とができる。ついでPBDはGPからhF.XIIで切り出され
る。
結合タンパク質を切り出すのに用いられてきた他のプ
ロテアーゼには、エンテロキナーゼ、コラゲナーゼ、キ
モシン、ウロキナーゼ、レニン、及びある種のシグナル
・ペプチダーゼが含まれる。Rutter、US4,769,326を参
照のこと。
求めるものがプロテアーゼ阻害剤の場合は、ターゲッ
トプロテアーゼや似たような基質特異性を持つ他のプロ
テアーゼは、PBDをGPから開裂するために用いるには適
切ではない。ターゲットプロテアーゼの基質に似ている
リンカーは提示ファージのどこにも組み込んではいけな
い。なぜなら優れた結合体を集団から分離するのが不必
要に難しくなるからである。
リンカーの部位特異的開裂に立体障害がある場合、開
裂部位が剥き出しになるようにそのリンカーを修飾する
ことができる。例えば、複数のグリシン（柔軟性を増す
ため）やプロリン（最大限の伸張のため）を開裂部位と
ひとまとまりのタンパク質の間に介在させることによっ
て行う。GUAN91ではグリシンの豊富なリンカー（PGISGG
GGG）をトロンビン開裂部位（LVPRGS）の直ぐ後ろに導
入することによって、GST融合タンパク質のトロンビン
による開裂を改善した。適切なリンカーはまた多様化−
選択手法によって同定することもできる。
遺伝子の調節部の配列は、天然の調節エレメント（要
素）:a）プロモーター、ｂ）シャイン／ダルガルノ配
列、ｃ）転写ターミネーターなどの配列からとる。調節
エレメントはまた、天然の調節領域のコンセンサス配列
の知識に基づいて設計することもできる。これらの調節
エレメントの配列はコード領域に連結される。制限部位
もまた操作を容易にするために、調節領域の隣または中
に挿入される。
親和性分離の基本的機能は、ターゲットとの親和性が
高い、（IPBDから生じた）PBDを有するGPを、ターゲッ
トとの親和性が低いGPから分離することである。ファー
ジの溶出してくる液量がファージ表面にあるPBDの数に
左右されるのであれば、親和性が低いPBDを多数有する
ファージ、すなわちGP（PBDw）は、より親和性の高いPB
Dを少数有するファージ、即ちGP（PBDs）と一緒に溶出
してくる可能性がある。提示遺伝子の制御は、親和性に
応じてきちんと分離されるように、ほとんどのファージ
がPBDを十分提示するようなものであることが望まし
い。調節プロモーターを用いて提示遺伝子の発現レベル
をコントロールすると、多様化された集団のクロマトグ
ラフィ上での挙動を精密に調節できる。操作した遺伝子
の生菌細胞における合成誘導は、調節プロモーター、例
えばlacUV5、trpP、又はtacなどを用いて実施されてき
た（MANI82）。合成されるタンパク質の量を調整する要
因は、かなり十分に理解されており、現在では広範囲に
及ぶ異種タンパク質がE.coli,B.subtilis等のホスト細
胞において、少なくともある程度の量で生産できるよう
になった（SKER88,BETT88）。提示遺伝子のプロモータ
ーは、少量の化学誘導剤によって調節される。例えば、
lacプロモーターとハイブリッドtrp−lac（tac）プロモ
ーターは、イソプロピル・チオガラクトシド（IPTG）に
よって調節される。構築された遺伝子のプロモーターは
天然osp遺伝子から取る必要はない。バクテリアにおい
て機能する調節可能なプロモーターであれば何でもよ
い。漏れのないプロモーターが望ましい。
合成される遺伝子のコード部分は、タンパク質レベル
で設計され、DNAにコード化される。DNA配列を考案する
上での主要な課題は、望ましい多様なポテンシャル結合
ドメイン（又はエピトープ）の集団を得ることである
が、制限部位を供給してさらなる遺伝子操作を容易にす
ること、組換えと自然突然変異の可能性を最低限にする
こと、選択されたホスト細胞において効率的な翻訳がで
きるようにすること、なども考慮する。
本発明はDNA合成又は構築における方法に特に限定は
ない。従来のDNA合成機も、多様化DNA生産にあわせて試
薬を適当に変えれば使用できる（現在、混合プローブの
生産に用いられる方法と類似したもの）。
ファージは遺伝子操作され、例えばE.coli,B.subtili
s,P.aeruginosaといった増幅に適したホスト細胞にトラ
ンスフェクト（移入）される。本発明ではDNAによる細
胞の形質転換の方法や、ホスト細胞には限定はない。
イニシャル・ポテンシャル結合ドメイン（IPBD） 本発明のおかげで、抗体の抗原結合個所以外のターゲ
ットに結合できるタンパク質が得られるようになった。
付記する請求項の目的として、ある抗体の可変ドメイン
でないターゲットに関し、解離定数Kd（P,A）＜10-6モ
ル／リットル（＜10-7モル／リットルの方が望ましい）
であるならば、タンパク質Ｐは結合タンパク質である。
「抗体の可変ドメイン」の除外は、この目的のためタン
パク質が抗原性であるというだけでは「結合タンパク
質」と考慮されないことをはっきりさせるためである。
しかしある抗原は、酵素とその基質、又はホルモンとそ
の細胞受容体といったように、抗体以外の物質と特異的
に結合するため、結合タンパク質に値する可能性があ
る。更に、「結合タンパク質」には、スタフィロコッカ
スのプロテインＡのように抗体のFcに結合するタンパク
質が含まれることも指摘されるべきであろう。
本発明は、抗体の可変ドメインにおける超可変（hype
rvariable）領域に相応するコドンの多様化を通して新
規抗体の開発に使うことも可能であるが、主に抗体では
ない、又は抗体の可変ドメインでもない結合タンパク質
の開発に使用される。新規抗体は免疫学的技術によって
得られるが、新規酵素やホルモンなどは得られない。
ほとんどの大型タンパク質は折りたたまれて、識別可
能なドメインと呼ばれるいくつかの小球構造をとる。提
示戦略は、まずそれに対する親和性分子（抗体でもよ
い）が利用できる、安定な、構造のあるドメイン（「イ
ニシャル・ポテンシャル結合ドメイン」、IPBDとよぶ）
を提示するようにファージを遺伝的に変化させることで
ある。変更の成功度は、例えば変えられた遺伝子ファー
ジが親和性分子に結合するかどうかを知ることによって
測定できる。原子結合やタンパク質配列の相同性を完全
に無視するわけにはいかないものの、IPBDの同定という
目的のためには、「ドメイン」の安定性、即ち温度の上
昇やカオトロピック動因など混乱させる力に直面した
時、全体構造を保持すること、を強調する定義付けが好
まれる。タンパク質のあるドメインが、そのタンパク質
がターゲットに結合する能力を主に左右する場合、本書
では「結合ドメイン」（BD）と称する。
IPBDは、広範囲な突然変異に対する受容度を考慮した
上で選択される。一たびIPBDをファージ上に提示でき、
親和性による選択にかけることができることがわかれ
ば、IPBDをコードする遺伝子について多重突然変異誘発
の特別なパターン−本書で「多様化（バリエゲーショ
ン）」と呼ぶ−を行う。適切なクローニングと増幅を行
うと、それぞれ１つのポテンシャル結合ドメイン（IPBD
の変異体）を提示する多数のファージ集団ができる。こ
の集団は全体として、構造的に関連しているが、多数の
異なるポテンシャル結合ドメイン（PBD）を提示するも
のである。それぞれの遺伝子ファージは、そのファージ
上に提示されたPBDをコードするpbd遺伝子を持ってい
る。それから、親和性による選択を用いて望ましい結合
特性のあるPBDを持つ提示ファージを同定する。ついで
これらの提示ファージは増幅できる。親和性選択及び増
幅による豊富化（enrichment）を１又は２サイクル行っ
た後、成功結合ドメイン（SBD）をコードするDNAを選択
されたファージから回収することができる。必要があれ
ば、多様化の最終ラウンドにおけるSBDを次世代のPBDの
「親ポテンシャル結合ドメイン」（PPBD）として用いる
ことにより、SBDを持つファージのDNAを更に「多様化」
することができる。このプロセスは、実験者が結果に満
足するまで繰り返し行うことができる。その時点では、
SBDは化学合成を含む従来のどの方法でSBDを作ってもも
よい。
イニシャル・ポテンシャル結合ドメインは:1）天然に
おいて生じるタンパク質のドメイン、２）天然に生じた
ものではないが、配列は実質的に天然のドメインに相応
するが、配列中一つ又は二つの代替、置換、又は欠失が
あり、天然ドメインと異なるドメイン、３）実質的に２
つ又はそれ以上の天然タンパク質のハイブリッドに配列
が相当するドメイン、又は、４）アミノ酸ジオメトリー
及びアミノ酸の二次構造の優先性に関する統計的証拠の
知識に基づいた論理的基盤のみによって設計された人工
的ドメインである。（しかし、論理に基づいた（a prio
ri）タンパク質設計の限界が本発明のきっかけとなった
のである。）通常、ドメインは結合ドメイン、又は少な
くともそれの同族であるが、既知の結合活性を持たない
けれども、それに結合活性を与える裂溝や溝などの二次
またはそれ以上の高次構造を持つタンパク質に由来する
ドメインであってもよい。IPBDが由来するタンパク質は
ターゲット物質に特異的親和性を持つ必要はない。
複数の配列が「実質的に一致する」と見るべきかどう
かを決める上で考慮すべきことは、次の点である。標準
アルゴリズムにより最もよくあてはまるよう並べられた
時の親和性の程度、架橋（ジスルフィド結合など）の接
続パターンにおける類似性、タンパク質が例えばＸ線回
折分析又はNMRに示されるようにどの程度似た三次元構
造をもっているか、及び配列が決められたタンパク質が
どの程度類似した生物活性を持っているかという点であ
る。この意味で、セリンプロテアーゼの阻害剤には、相
同であると認められたタンパク質のファミリーであっ
て、メンバーの中にたった30％の配列相同性しか持たな
いペアがあるファミリーがいくつもあるということに留
意すべきである。
IPBDの候補は以下の基準を満たさなければならない。
１）意図された使用条件下で安定なドメインが存在する
こと（ドメインは挿入されるタンパク質全体からなって
いてもよい。例:BPTI、α−コノトキシン G I、又はCM
TI−III）。
２）アミノ酸配列の知識が得られること。
３）IPBD、AfM（IPBD）に特異的で高い親和性がある分
子が得られること。
多様化を推し進めるにあたり、ドメインの外部表面上
にある残基がなんであるか及びその空間における関係に
ついての情報があることが望ましい。しかし、この考察
は結合ドメインが小さい場合、例えば40以下の残基であ
ればそれ程重要でない。
IPBDは必要以上に大きくないことが望ましい。なぜな
ら小さいSBD（例えばアミノ酸40個以下）は化学的に合
成でき、小さいアミノ酸配列中には制限部位を設けるの
が容易だからである。残基40個以下のPBDにおけるさら
なる利点は、多様化された遺伝子全体が１つとして合成
されることである。その場合、osp遺伝子内に適切な制
限部位を設けるだけでよい。より小さいタンパク質は、
ファージ又はGPのホストにおける代謝疲労を最低限に抑
える。IPBDは残基200個以下であることが望ましい。IPB
Dは更に、ほどほどの結合親和性と特異性を備えられる
だけの大きさがあることが望ましい。ジスルフィド結合
のような共有クロスリンクが欠如しているIPBDにとって
は、IPBDは残基が最低40個あることが望ましい。クロス
リンクがあれば残基は６個でもよい。
IPBDの候補物質は多くある。例えばウシ膵臓トリプシ
ンインヒビター（BPTI、残基58個）、CMTI−III（残基2
9個）、クランビン（残基46個）、オボムコイドの第三
ドメイン（残基56個）、熱安定エンテロトキシン（E.co
liのST−I a）（残基18個）、α−コノトキシンG I（残
基13個）、μコノトキシンG III（残基22個）、コナス
・キングコング・ミニ・タンパク質（残基27個）、T4リ
ゾチーム（残基164個）、及びアズリン（残基128個）で
ある。表50には望ましいIPBDのリストがある。
場合によっては、他の基準が十分に満たされていなく
てもターゲットに親和性のあるタンパク質が望ましいIP
BDであることもある。例えばCD4のV1ドメインは、HIVの
gp120に結合するタンパク質のためのIPBDとして適切な
選択である。V1の42から55までの領域における変異がgp
120の結合に強い影響を与えること、その他の変異は影
響がずっと少ないか、またはV1の構造を完全に破壊して
しまうことが知られている。同様に、TNF受容体に対し
て高い親和性を持つTNF様の分子がほしい場合は、腫瘍
壊死因子（TNF）が初期の選択として適切である。
表面における変異であってもPBDの安定性を低下させ
るかも知れないので、選択されたIPBDの融解温度は高く
なければならず（50℃は許容できる最低限の温度であ
り、高ければ高いほどよい。BPTIは95℃で融解する）、
また広いpHの範囲で安定でなければならない。そうすれ
ば、選択されたIPBDから突然変異及び結合による選択に
よって生じたSBDが十分な安定性を保てるからである。
多様なPBDを作り出しているIPBD中の置換がドメインの
融解点をおよそ40℃以下には下げないことが望ましい。
IPBDにくらべSBDの安定性を高める突然変異が起こるこ
とがあるが、本発明のプロセスではこのことに依存して
いない。多数のジスルフィドのような、共有クロスリン
クを含むタンパク質は通常十分安定している。20個の残
基ごとに少なくとも二つのジスルフィドを含むタンパク
質と、少なくとも一つのジスルフィドを含むタンパク質
は十分な安定性があると考えられている。
ターゲットがタンパク質又はその他の巨大分子である
場合、IPBDの具体的物質は、Cucuebuta maximaトリプシ
ンインヒビターIII（残基29個）、Bos TaurusのBPTI
（残基58個）、菜種のクランビン（残基46個）、又はCo
turnix coturnix Japonica（日本ウズラ）のオボムコイ
ドの第三ドメインといった、小さいタンパク質であるこ
とが望ましい。このクラスのターゲットは、小さいタン
パク質を非常に特異的なやりかたで受け入れる裂溝や溝
があるからである。ターゲットがでんぷんのように巨大
分子で緊密な構造を欠くものであれば、小さい分子のよ
うに扱わなければならない。コラーゲンのような明確な
三次元構造を持つ伸張した巨大分子は、大きい分子とし
て扱うべきである。
ターゲットがステロイドのように小さい分子であれ
ば、IPBDの具体化物質は80から200個の残基からなるタ
ンパク質であることが望ましい。Bos taurusのリボヌク
レアーゼ（残基124個）、Aspergillus orizaeのリボヌ
クレアーゼ（残基104個）、Gallus gallusの鶏卵白リゾ
チーム（残基129個）、Pseudomonas aerugenosaのアズ
リン（残基128個）、又はT4リゾチーム（残基164個）な
どがその例である。なぜならこのようなタンパク質は小
さいターゲット分子が入れる裂溝や溝があるからであ
る。ブルックハーベン・タンパク質データバンクにはリ
ストにあるタンパク質全ての三次元構造が含まれてい
る。T4リゾチームほどの大きさのタンパク質をコードす
る遺伝子は、この発明の目的のため標準的技術によって
操作することができる。
ターゲットがミネラルで、水に溶けない場合、そのミ
ネラルの分子の表面の特性が考慮される。結晶シリコン
のように表面がスムーズなミネラルは、IPBDとしてリボ
ヌクレアーゼのような中型から大型タンパク質を用いる
のが最適である。十分な接触領域及び特異性を確保する
ためである。ゼオライトのように荒い、溝のある表面の
ミネラルはBPTIのような小型のタンパク質又はT4リゾチ
ームのようなより大きいタンパク質のどちらとでも結合
され得る。
BPTIは全ての基準を満たすか又はそれ以上の機能があ
り、特に望ましいIPBDである。これは小さく、大変安定
したタンパク質で、よく知られた三次元構造を持ってい
る。
小さいポリペプチドは、治療または診断用薬剤として
使われた場合、大きいポリペプチドと比べて下記のよう
な利点があると思われる（以下の利点のみに限られては
いない）。
ａ）細胞に対する浸透がより優れている。
ｂ）体循環からより速く除去される。（造影剤にとって
重要である） ｃ）抗原性がより低い。
ｄ）質量あたりの活性が高い。
従って、多様化と親和性選択の方法を組み合わせて、
選択されたターゲットに結合する小さいポリペプチドを
同定できることが望ましい。
しかし、このサイズのポリペプチドは結合分子として
は不利な点がある。オリベラ等（OLIV90a）によると、
「このサイズ範囲のポリペプチドは通常、多くのコンフ
ォーメーション（立体配座）間で均衡状態を保っている
（固定された構造を持つためには、タンパク質は一般的
にもっとずっと大型でなければならない）」ということ
である。ペプチドがターゲット分子に特異的に結合する
には、ペプチドは、結合個所に対して相補的なあるコン
フォーメーションを取ることが必要である。
実施形態の１つでは、本発明は小さいポリペプチドの
利点を保ちながら、望ましい結合特性を持つ新規ミニ・
タンパク質の生合成を促進することにより、これらの問
題を克服することができた。ミニ・タンパク質は小さい
ポリペプチド（通常残基が60個以下である。40個以下
（「マイクロ・タンパク質」）であればより望ましい）
である。これは非共有結合力だけで安定した構造を持つ
には小さすぎるが、共有結合的にクロスリンクされて
（例：ジスルフィド結合により）安定した構造になって
おり、従って、同じぐらいの大きさの拘束されていない
ポリペプチドより、むしろもっと大きいタンパク質分子
に見られる生物活性を持つ。
ミニ・タンパク質が多様化される時、親分子内に共有
結合的にクロスリンクされた残基はそのまま残されるた
め、構造を安定化する。例えば、ジスルフィド結合をも
つミニ・タンパク質の多様化において、一定のシステイ
ンは不変であるため、発現及び提示の状況下で、共有結
合クロスリンク（例:1対またはそれ以上のシステイン間
のジスルフィド結合）が形成され、超可変で、線状の中
間（ジスルフィド結合に挟まれた）アミノ酸群がとるで
あろう構造を実質的に束縛する。換言すれば拘束的骨組
みが、それ以外は徹底的にランダム化されるポリペプチ
ド中に組み込まれるということである。
望ましい結合特性を持つミニ・タンパク質の性質が一
たびわかれば、DNA組換え技術のみならず、非生物学的
合成方法によって生産することが可能となる。
本願クレームの目的として、ミニ・タンパク質はおよ
そ８個から60個の残基を有する。たとえば残基16個のポ
リペプチドのアミノ酸３と８をつないでいる鎖内ジスル
フィド架橋は、スパンが４あるという。アミノ酸４と12
がジスルフィド結合されていれば、この架橋はスパンが
７である。あわせると４つのシステインはポリペプチド
を４つのシステイン間セグメントに分割する（１−２、
５−７、９−11、及び13−16である）（Cys3とCys4との
間にはセグメントがない）。
クロスリンクされたミニ・タンパク質の接続パターン
は、クロスリンクの端点の相対位置を単純に述べるもの
である。例えば、２個のジスルフィドがあるミニ・タン
パク質では、「１−３、２−４」という接続パターン
は、（一次配列中）１番目のクロスリンクされたシステ
インは３番目のクロスリンクされたシステインにジスル
フィド結合し、２番目は４番目と結合しているというこ
とを意味する。
本発明における多様化されたジスルフィド結合ミニ・
タンパク質はいくつかの種類に分けられる。
クラスＩミニ・タンパク質は、ジスルフィド結合を形
成するよう相互作用できるシステインが１対あることを
特徴とするもので、この結合のスパンは残基９個以下で
ある。このジスルフィドブリッジは最低でも残基２個の
スパンであることが望ましい。これはジスルフィド結合
のジオメトリー的機能である。間隔が残基２個か３個で
あるとき、架橋された残基のねじれを減すため、残基の
ひとつはグリシンであることが望ましい。間隔の最大限
度はそれほど厳密ではないが、一般的には、間隔が大き
いほど、線状の中間アミノ酸残基のコンフォーメーショ
ンに対するジスルフィド結合による束縛は少ない。
スパンが４又は５のジスルフィドブリッジは特に望ま
しい。スパンが６に増えると、束縛力は減る。この場
合、囲われた、残基のうち少なくとも１個は、主鎖にジ
オメトリー的制限を与えるアミノ酸であることが望まし
とされている。プロリンは最も大きな制限を与える。バ
リン及びイソロイシンは主鎖を制限するが、その程度は
より低い。この拘束用非システイン残基の位置は不変シ
ステインの隣であることが望ましいが、他のブリッジさ
れた残基の隣であってもよい。スパンが７である場合、
主鎖のコンフォーメーションを制限するアミノ酸を２つ
含むことが望ましい。これらのアミノ酸は７つの位置の
うちどこにあってもよいが、システインの直ぐ隣にある
架橋された残基２個であることが望ましい。スパンが８
か９であれば、拘束用アミノ酸を追加することもでき
る。
追加アミノ酸は第一システインのアミノ側又はカルボ
キシ側にあることができる。「スパンされていない」直
近のアミノ酸のみがスパンの構造に影響を与えると考え
られる。
クラスIIミニ・タンパク質は、スパンがアミノ酸９個
より大きい１個のジスルフィド結合を特徴とする。ブリ
ッジされたアミノ酸は二次構造を形成するが、これはコ
ンフォーメーションの安定させるのに役立つ。これらの
中間アミノ酸がヘアピン・超二次（supersecondary）構
造を形成することが望ましい。例えば以下に示した式の
ような構造である。
適切なヘアピン構造を設計する上で、三次元構造が知
られているタンパク質から実際の構造を真似したり、個
々のアミノ酸がとりやすい二次構造のデータを用いた
り、又はこの二つの方法を組み合わせて、構造を設計す
ることもできる。一つ以上の実際の構造をモデルとして
用いることが望ましく、どの突然変異が構造を妨害する
ことなく起こせるかを決める上で、頻度データを使うと
よい。
システインとαヘリックス又はβストランドのはじめ
または終わりとの間には３個以上のアミノ酸がないほう
がよい。
更に複雑な構造（ダブルヘアピンなど）も可能であ
る。
クラスIIIミニ・タンパク質は複数のジスルフィド結
合を特徴とする。クラスIIミニ・タンパク質に関して上
に述べたような二次構造を持っていてもよい。可能なジ
スルフィド結合のトポロジーが結合数とともに急激に増
えるため（結合２個、トポロジー3;結合３個、トポロジ
ー15）、ジスルフィド結合数は４つ以上にならないほう
がよい。二つのジスルフィド結合は３個より好ましく、
４個より３個のほうがよい。２個以上のジスルフィド結
合では、ジスルフィドブリッジのスパンは30以上になら
ないほうがよく、最大のシステイン間鎖セグメントは20
を越えないことが望ましい。
耐熱性エンテロトキシンST−I aのような、天然のク
ラスIIIミニ・タンパク質は、しばしば、アミノ酸配列
中に密集したシステインの複数のペア（−Ｃ−Ｃ−又は
−Ｃ−Ｘ−Ｃ−）を有する。密集することにより、生じ
得るトロポジーの数は減り、これは利点となる可能性が
ある。
メタルフィンガー・ミニ・タンパク質。本発明におけ
るミニ・タンパク質はジスルフィド結合によってクロス
リンクされるものに限られてはいない。ミニ・タンパク
質のもう一つの重要なクラスは、フィンガー・タンパク
質の類似物である。フィンガー・タンパク質はフィンガ
ー構造を特徴とする。これは金属のイオンが残基Cys2個
とHis2個と配位結合し、その周りに四面体のアレンジメ
ントを形成するものである。金属イオンはほとんどの場
合亜鉛（II）であるが、鉄、銅、コバルトなどのことも
ある。「フィンガー」は、（Phe又はTyr）−（1AA）−C
ys−（２−4AAs）−Cys−（3AAs）−Phe−（5AAs）−Le
u−（2AAs）−His−（3AAs）−His−（5AAs）（BERG88;
GIBS88）というコンセンサス配列を有する。本発明では
一つ又は二つのフィンガーを持つミニ・タンパク質を包
含する。
タンパク質の側鎖のあるものを選択的に修飾できる酵
素及び／又は化学試薬（できれば毒性のない）を用いて
ファージを処理することによって、ポテンシャル結合ド
メインの提示ファージライブラリーに更なる多様性を導
入し、そうすることにより提示されたPBDの結合特性に
影響を及ぼすことができる。親和性分離方法を使って、
所定のターゲットに結合する修飾GPを濃縮する。活性結
合ドメインは遺伝学的に完全に特定されていないので、
我々は、各濃縮段階において、形態形成後の修飾を繰り
返さなければならない。このアプローチは、ミニ・タン
パク質IPBDにおいて特に適している。これらのSBDの化
学合成を構想しているからである。
エピトープ性ペプチド 本発明はまた、抗体、レクチン、酵素、又は他の結合
タンパク質のエピトープ性結合部位であるターゲットに
結合するエピトープ性・ペプチドの同定にも関する。抗
体の場合、エピトープ性・ペプチドは少なくとも４個の
アミノ酸でなければならず、最低６個又は８個のアミノ
酸であることが望ましい。通常、20個未満のアミノ酸で
あるが、上限はない。ただし一般的にエピトープ性・ペ
プチドは、「線状」すなわち「連続した」エピトープで
ある。通常、エピトープ性・ペプチドを提示するための
ライブラリーを構築する際ポテンシャル・エピトープの
アミノ酸部位の全部又はほとんどが変えることができ
る。しかし、タンパク質ドメインの突然変異誘発に関し
下記に述べるように、ある特定の位置に存在することを
許されたアミノ酸の間では出現頻度は比較的等しいこと
が望ましい。
多様化戦略−望ましい多様性を有するポテンシャル結合
ドメイン（又はエピトープ）を得るための突然変異誘発 検知可能量で提示できる異なるドメインの数と比べ
て、あるドメインの突然変異によって得られる異なるア
ミノ酸配列の数の方が大きい場合、強制進化の効率は、
どの残基を変化させるかを注意深く選択することによっ
て大きく高めることができる。まず、既知のタンパク質
の残基で、結合活性に影響を与えそう（例えば表面の残
基）だが、タンパク質の安定度をはなはだしく低下させ
そうもないものを同定する。次にこれらの残基をコード
する全ての、又はいくつかのコドンを同時に変化させ、
DNAの多様化集団をつくる。多様化されたDNA集団は、さ
まざまなポテンシャル結合ドメインを発現させるのに用
いられる。そしてポテンシャル結合ドメインは興味のあ
るターゲットに結合する能力に関して評価される。
本発明の方法はこのように、つくられるのが高度に多
様化された集団であり、そこから新規結合タンパク質が
選択されるという点において他の方法から更に区別され
る。我々は効率的で組織だった方法により、提示された
ポテンシャル結合ドメインが、関連アミノ酸配列の近傍
の「配列スペース」を手本とするようしむける。ここで
用いられる様々な多様化計画を導くのは次の４つの目標
である。１）非常に多数の変異体が利用できる（例えば
107）２）可能性のある変異体のうち非常に高い割合が
実際に検出可能量で出現する。３）望ましい変異体が現
れる頻度が比較的一定している。４）変異が生じるの
は、限定された数のアミノ酸残基においてのみであり、
もっとも好ましくはポテンシャル結合ドメイン表面にあ
って共通の領域に向かっている側鎖基のある残基におい
てのみである。
これは、変異が起きる場所を全くコントロールできな
い（できてもおぼろげに）、放射線やヒドロキシル・ア
ミンといった無差別変異誘発物質を単に遺伝子を変える
のに使うのと区別されるべきである。これらの無差別変
異誘発では、突然変異の多くは結合ドメイン以外にある
残基に影響を与えるであろう。更に、合理的な突然変異
誘発レベルでは、変えられたコドンは塩基が１個だけ変
化する傾向にあるため、限定された又は偏った範囲の可
能性しか調べられない。同様に本方法とかけ離れている
のは、突然変異を起こす、ランダムでない配列のオリゴ
ヌクレオチドを用いる部位特異的突然変異誘発技術であ
る。なぜならこれらの技術は多数の変異を起こしたりテ
ストするのに使うことができないからである。集中無選
別（fucused random）突然変異誘発技術は知られている
が、変異の分布を制御することの重要性は見落とされて
いる。
「多様化されたDNA（vgDNA）」とは同じか又は同様の
長さのDNA分子の混合物で、それらを並べてみると、い
くつかのコドンに違いがあり、それらのコドンは異なる
複数のアミノ酸をコードするが、それ以外のコドンは１
種のアミノ酸しかコードしないものを意味する。更に、
多様化されたDNAにおいては、可変（変えることのでき
る）コドン、及び、ある可変コドンがコードする異なっ
たアミノ酸の範囲と出現頻度は、前もってDNA合成機で
決められるということがわかる。ただし合成手法では混
合物の中にある、個々のDNA分子の配列はアプリオリに
知ることはできない。多様化されたDNAにおける、指定
された可変コドンの数は20個以下であることが望まし
く、５から10個であれば更に望ましい。各可変コドンに
おいてコードされるアミノ酸の配合比は、コドンによっ
て異なる場合がある。多様化されたDNAが導入された提
示ファージの集団は、同様に「多様化された」と言うこ
とができる。
タンパク質において知られているドメインの一部分を
コードするDNAが多様化される時、元のドメインは親ポ
テンシャル結合ドメイン（PPBD）と呼ばれる。そして多
様化の結果としてコードされた多数の突然変異ドメイン
は集合的に「ポテンシャル結合ドメイン」（PBD）と呼
ばれる。予定されたターゲットに結合する能力が知られ
ていないからである。
次に我々は、選択されたターゲットに必要な親和性を
もって結合するPBDを持つファージの選択を容易にする
ために、多様なポテンシャル結合ドメインの集合を作り
出す方法について考察する。ポテンシャル結合ドメイン
は最初アミノ酸レベルで設計される。PBDにターゲット
に対する親和性があるなら探知できる合理的な蓋然性を
確実にするため、どの残基を変異させるか、どの変異を
これらの位置で起こすかがいったん決まれば、様々なPB
Dをコードする多様化されたDNAを設計できる。当然、得
られる独立の形質転換体の数、及び親和性分離技術の感
度によって、多様化のある１ラウンドにおいて可能な多
様化の程度は制限される。
タンパク質内に多様性を持たせる方法は数多くある。
極端な例では、タンパク質の残基数個をできる限り多様
化する（集中突然変異誘発）方法であり、例えば５個か
ら７個の残基を選び、それぞれを可能な13−20通りに変
化させる。もう一つの極端な突然変異誘発法（拡散−突
然変異誘発法）は、もっとずっと多くの残基を選択肢を
より限定して多様化させるものである（VERS86a及びPAK
U86参照）。使われる多様化パターンは以上の二つの極
端な例の間にある。
同時に突然変異させ得るコドンの数に制限はない。し
かし、ある１つの可能なPBD配列が実際に少なくとも１
つのファージにより合理的な蓋然性をもって提示されう
るような突然変異方法を使うことが望ましい。vgDNAに
よってコードされ、多様化の各位置に最も条件の悪いア
ミノ酸を有するある１つのミューテン（mutein）が、少
なくとも一つの独立した形質転換体によってライブラリ
ー内に提示されている確率が最低0.50であることが望ま
しい。最低0.90の確立あればより望ましい。（より好条
件のアミノ酸から成り立っているミューテンは、当然、
同一のライブラリー内でより生じやすい。） 多様化は、典型的な形質転換体のライブラリーに106
から107個の異なるアミノ酸配列を、好ましくはその10
倍以下の（より望ましくは３倍以下の）異なったDNA配
列によって提示させるであろうことが望ましい。
αヘリックス及びβストランドを欠くミニ・タンパク
質に関しては、突然変異のどのラウンドにおいても、４
−６個の非システイン・コドンを多様化し、それぞれ
が、20個のアミノ酸のうち少なくとも８個をコードする
ようにする。各コドンにおける多様化はその位置にふさ
わしいものでよい。システインは置換基候補には含まれ
ないが、除外されるものではない。
ミニ・タンパク質がメタル・フィンガー・タンパク質
であるとき、代表的な多様化方法では、二つのCysと二
つのHisの残基と、更にオプションであるが上述のPhe/T
yr、Phe及びLeu残基は変えずに保ち、複数の他の残基
（通常５−10個）を変化させる。
ミニ・タンパク質にαヘリックスとβストランドが１
個またはそれ以上ある場合、どの位置においても、変更
アミノ酸はその位置における二次的構造をなるべく妨害
しないものを選ぶのが好ましい。各可変アミノ酸で可能
なアミノ酸数がより限定されているため、可変アミノ酸
の総数は、選択過程におけるサンプリング効率を変更す
ることなくより多くできる。
最後に説明されたミニ・タンパク質のクラスにとっ
て、ミニ・タンパク質以外のドメインの場合と同様、多
様化されるコドンは20個以下、より好ましくは５−10個
であることが望ましい。しかし、拡散突然変異誘発方法
が使われるとき、多様化されるコドンの数はもっと多く
できる。
どの残基を変えるかという決定は、どの残基がドメイ
ンの表面にあり、どれが内部にあるかということを知る
ことによって容易になる。
我々は数個の要因を検討した上でPPBDの残基を選択す
る。その要因にはａ）PPBDの三次元構造、ｂ）PPBDの相
同配列、及びｃ）PPBDとPPBDの突然変異体のモデリング
が含まれる。PPBDの正常なフォールディングを妨げるこ
となく結合に強い影響を及ぼす残基の数が、同時に変化
させられる残基の数より大きい場合、ユーザーは、一度
に変化させる残基の部分集合を選ぶべきである。ユーザ
ーは多様化の試行レベルを選び、様々な配列の豊富さを
計算する。変化させた残基と変化させた各残基における
多様化のレベルのリストは、混成多様化が、親和性分離
方法の感度及び作ることのできる独立な形質転換体の数
とつりあいがとれるまで調節される。
どの残基を変化させるか選んだ後は、各可変残基にお
いて許容できるアミノ酸の範囲を決定する。多様化の総
合レベルは、変化した各残基ごとの変異体の数の積であ
る。各変異残基は、異なる多様化計画を持つことがで
き、２から20の異なる可能性を生み出す。ある多様化さ
れたコドンによってコードされ得るアミノ酸のグループ
は、その「置換セット」と呼ぶ。
ミリゲン7500などのDNA合成機を制御するコンピュー
ターは、いくつかのヌクレオチド（nt）物質（例:ntフ
ォスフォラミド）を二つ又はそれ以上の液だめから取る
ことによって、あるオリゴヌクレオチドのどの塩基も任
意のntの分布で合成するようプログラムすることができ
る。あるいは、nt物質を任意の比率で混合して、一般に
「汚れたボトル（dirty bottle）」と呼ばれる余分な液
だめの一つに入れることができる。各コドンは別々にプ
ログラムすることができる。そのコドンのそれぞれのヌ
クレオチドの位置における塩基の「ミックス」は、その
コドンによってコードされる異なったアミノ酸が生じる
相対的頻度を決める。
単純に多様化されたコドンとは、縮重ヌクレオチドの
位置で、二つ又はそれ以上の塩基が等モル比で混合され
たものから得られるものである。これらの混合物は、こ
の明細書では標準化された「不確定（ambiguous）ヌク
レオチド」コードにより説明されている。このコードで
は、例えば、縮重コドン「SNT」においては、Ｓは塩基
ＧとＣの等モル混合物を示し、Ｎは４つの塩基全ての等
モル混合物、Ｔは単一不変塩基のチミジンを表す。
複雑に多様化されたコドンは、３つのうち少なくとも
１つの位置に、二つ以上の塩基から成る等モル混合物以
外の塩基が入るものである。
単純に多様化されたコドンも、複雑に多様化されたコ
ドンも、どちらも望まれる置換セットを達成するために
使われる。
あるアミノ酸又はアミノ酸のクラスが適切であること
を示す情報が無い場合、我々は全てのアミノ酸を同等の
確率で置き換えようと努力する。これは、ある１つのミ
ニ・タンパク質の検出レベル以上に提示することは不経
済だからである。コドン（NNN）内のそれぞれの位置に
４つ全部のヌクレオチドが同量存在すると、各アミノ酸
がそれをコードするコドンの数に比例して存在するアミ
ノ酸の分布ができる。この分布は一つの酸性残基あたり
二つの塩基性残基を与えるという不利な点がある。更
に、できるＷ又はＭの６倍ものR,S,及びＬが生じる。こ
の分布で５個のコドンが合成される場合、L,R,及びＳか
らなるある組み合わせをコードする243種の配列のそれ
ぞれは、Ｗ及びＭのある組み合わせ32種をコードする配
列に比べて、7776倍豊富であることになる。５個のＷが
検知レベルに存在するということは、（L,R,S）配列の
それぞれを7776倍余分に持たなければ成らないというこ
とである。
タンパク質又はポリペプチドにおけるアミノ酸の配列
が、分子の三次元的構造を決めるということは、定まっ
た構造がないという可能性も含めて、一般的に認められ
ている。決められた長さと配列のポリペプチドの中で、
あるものは決まった三次構造を持つが、ほとんどのもの
は持たない。
特定のアミノ酸残基は、決められたポリペプチドの三
次構造に、下記のようないくつかのやり方で影響を与え
得る。
ａ）ポリペプチドの主鎖の柔軟性に影響を与える、 ｂ）疎水性基を加える、 ｃ）荷電基を加える、 ｄ）クロスリンク、例えばジスルフィドを形成する、金
属イオンにキレートする、又は補欠分子族に結合する。
柔軟性： GLYは最小のアミノ酸であり、二つの水素がＣαに付
いている。GLYにはＣβがないため、主鎖に最大の柔軟
性を与える。従ってGLYは、逆ターンにおいて、特に、P
RO,ASP,ASN,SER,及びTHRとともに非常に頻繁に生じる。
アミノ酸ALA,SER,CYS,ASP,ASN,LEU,MET,PHE,TYR,TRP,
ARG,HIS,GLU,GLN,及びLYSは、分岐していないβ炭素を
持つ。これらのうち、SER、ASP及びASNの側鎖基はしば
しば主鎖に水素結合を行い、他にとってエネルギー的に
条件の悪い主鎖の構造を持つことができる。VAL,ILE,及
びTHRは、延びた主鎖コンフォーメーションを有利にす
る、分岐したβ炭素を持っている。従って、VAL及びILE
は最もしばしばβシート内に見られる。THRの側鎖基は
主鎖に容易に水素結合するため、βシートに存在する傾
向はより低い。
プロリンの主鎖は、環状の側鎖基によって特に制約さ
れている。φ角度は常に−60゜に近い。ほとんどのプロ
リンはタンパク質の表面に見られる。
荷電： LYS及びARGは、それぞれ10.4以下又は12.0以下のpHに
おいて単一正荷電を持つ。しかし、これらのアミノ酸
の、それぞれ４つ及び３つのメチレン基は、疎水性相互
作用を起こすことができる。ARGのグアニジニウム基は
同時に５個の水素を提供する能力があるが、LYSのアミ
ノ・グループは３個しか提供できない。更に、これらの
グループのジオメトリーはかなり違うので、これらのグ
ループは相互交換出来ないことが多い。
ASP及びGLUは、それぞれ約4.5及び4.6以上のpHにおい
て単一負荷電を持つ。ASPには一つしかメチレン基がな
いので、疎水性相互作用はほとんど不可能である。ASP
のジオメトリーは主鎖の窒素に水素結合するのに役立
ち、これはASPがしばしば逆ターンの中及びヘリックス
の初めに見られることと一致する。GLUはもっと頻繁に
αヘリックス及び殊にこれらのヘリックスのアミノ末端
部分に見られる。側鎖基の負荷電はヘリックス双極子と
安定相互作用があるからである（NICH88,SALI88）。
HISには生理学的範囲に、つまり6.2にイオン化pKがあ
る。このpKは荷電基、又は水素ドナーあるいは受容体と
の近さによって変わる。HISは亜鉛、銅、鉄などの金属
イオンに結合することができる。
水素結合： 荷電されたアミノ酸以外に、SER,THR,ASN,GLN,TYR,及
びTRPは水素結合に参加することができる。
クロスリンク： クロスリンクの最も重要な形態は、二つのチオール、
特にCYS残基のチオールの間に形成されるジスルフィド
結合である。適切な酸化環境の中では、これらの結合は
自発的に起こる。これらの結合は、タンパク質やミニ・
タンパク質のある特定のコンフォーメーションを非常に
安定させることができる。酸化されたおよび還元された
チオール試薬の混合物が存在する時、最も安定した構造
が優位になる交換反応が起こる。タンパク質及びペプチ
ドにおけるジスルフィドについては、KATZ90,MATS89,PE
RR84,PERR86,SAUE86,WELL86,JANA89,HORV89,KISH85,及
びSCHN86を参照のこと。
形成に特定の酵素を必要としない他のクロスリンクに
次のようなものがある。
１）（CYS）4:Fe Rubredoxin（in CREI84,p.376） ２）（CYS）4:Zn Aspartate Transcarbamylase（in CR
EI84,p376）及びZn−フィンガー（HARD90） ３）（HIS）２（MET）（CYS）:Cu Azurin（in CREI84,p.376）及び塩基性「ブルー」きゅ
うりタンパク質（GUSS88） ４）（HIS）4:Cu CuZn superoxide dismutase ５）（CYS）4:（Fe4SO4） Ferredoxin（in CREI84,p.3
76） ６）（CYS）２（HIS）2:Zn Zincフィンガー（GIBS88） ７）（CYS）３（HIS）2:Zn Zincフィンガー（GAUS87,G
IBS88） （HIS）２（MET）（CYS）:CuのあるクロスリンクはHIS
及びMETがCuなしには他のクロスリンクを形成できない
という点において、潜在的利点がある。
単純に多様化されたコドン 単純に多様化された以下のコドンは、比較的バランス
の取れたアミノ酸のセットをコードするので、役に立
つ。
１）［L,P,H,R,V,A,D,G］セットをコードするSNT:ここ
でａ）１つは酸性（Ｄ）で１つは塩基性（Ｒ）,b）どち
らも脂肪族（L,V）、および芳香族疎水性（Ｈ）,c）大
きい（L,R,H）及び小さい（G,A）側鎖基,d）固定された
（Ｐ）及びフレキシブルな（Ｇ）アミノ酸,e）個々のア
ミノ酸は一度しかコードされない。
２）［M,T,K,R,V,A,E,G］セットをコードするRMG:ここ
でａ）１つは酸性、２つが塩基性（最適ではないが、許
容される）,b）疎水性アミノ酸、及び親水性アミノ酸、
ｃ）個々のアミノ酸は一度だけコードされる。
３）［T,K,A,E］セットをコードするRMG:ここでａ）１
つは酸性で１つは塩基性、１つは中性で親水性,b）３個
の好条件のαヘリックス,c）個々のアミノ酸は１度だけ
コードされる。
４）［L,P,H,R,I,T,N,S,V,A,D,G］セットをコードするV
NT:a）１つは酸性、１つは塩基性,b）全てのクラス：荷
電された、中性で親水性、疎水性、固定された、及びフ
レキシブルなアミノ酸、その他,c）個々のアミノ酸は１
度だけコードされる。
５）［N,S,K,R,D,E,G2］セットをコードするRRS:a）２
つが酸性、２つが塩基性、ｂ）２個の中性親水性,c）グ
リシンのみ２回コードされる。
６）［F,S,Y,C,L,P,H,R,I,T,N,V,A,D,G］セットをコー
ドするNNT:a）15個の異なったアミノ酸を与える16個のD
NA配列。繰り返されるのはセリンのみで、他の全ては同
量で存在する。（このことにより、ライブラリーのサン
プリングが大変効率的にできるようになる）,b）酸性及
び塩基性アミノ酸の数は同じである（ＤとＲが１個ず
つ）,c）全ての主要クラスのアミノ酸が存在している：
酸性、塩基性、脂肪族性で親水性、芳香族性で疎水性、
中性で親水性。
７）［L2,R2,S,W,P,Q,M,T,K,V,A,E,G,stop］セットをコ
ードするNNG:a）αヘリックスの形成に好都合な残基が
かなり優勢である［L,M,A,Q,K,E;及び、それより劣る
が、S,R,T］,b）13個の異なったアミノ酸をコードす
る。（VHGはNNGがコードするセットのサブセットをコー
ドする。NNGは、９個の異なったDNA中に９個のアミノ酸
をコードし、酸と塩基が同量で、5/9αヘリックスを好
む。） 開始時の多様化においては、ほとんどの場合NNTが望
ましい。しかし、コドンがαヘリックスに組み入れられ
るアミノ酸をコードするときはNNGの方が望ましい。
以下においてライブラリーをサンプリングする上での
効率に関し、いくつかの単純多様化方法を分析する。
（NNK）６によってコードされる無作為ヘキサペプチ
ドのライブラリーが報告されている（SCOT90,CWIP9
0）。表130はそのようなライブラリーの予測される挙動
を示している。NNKは、PHE,TYR,CYS,TRP,HIS,GLN,ILE,M
ET,ASN,LYS,ASP,及びGLU（αセット）のためのコドンを
１つづつ形成する。VAL,ALA,PRO,THR,及びGLY（φセッ
ト）のためにコドンを２個ずつ生成する。そしてLEU,AR
G,及びSER（Ωセット）のためにコドンを３個ずつ生成
する。我々は６千４百万の可能性のある配列を28のクラ
スに分けた。これは表130Aに示されており、これらのセ
ットのそれぞれにあるアミノ酸の数に基づいている。最
大のクラスは、可能な配列の約14.6％を占めるφΩαα
ααである。いかなる選択もしなければ同じクラスの配
列は全て生成される確率が同じである。表130Bはある
（NNK）６ライブラリーから取られたDNA配列が、定めら
れたクラスの一つに属するヘキサペプチドをコードする
確率を示している。DNA配列の約6.3％のみがφΩααα
αクラスに属していることに注目せよ。
表130Cは、あらゆる数の独立した形質転換体を含むラ
イブラリーの各クラスにおいて予測される数を示す（10
6,3・106,107,3・107,108,3・108,109及び３・109）。
独立形質転換体（IT）が106の時、我々はΩΩΩΩΩΩ
クラスの56％を見られるが、ααααααの0.1％しか
見られないと予測している。配列のほとんどは、10％以
下しかサンプルが取られていないクラスにおいて見られ
るものである。例えばクラスφφΩΩααのペプチド
を、ターゲットに結合するライブラリーを分画すること
によって分離するとしよう。分離された配列に関係する
ペプチドについて我々がどれだけ知っているか考えてみ
てほしい。クラスφφΩΩααの４％しかサンプルとし
て取られていないため、Ωセットのアミノ酸群が実際に
Ωセットで最高のものであるという結論を出すことはで
きない。LEUが位置２にくることもできるが、ARG又はSE
Rの方がよい可能性もある。ΩΩΩΩΩΩクラスのペプ
チドを分離したとしても、クラス内のそれより優れたメ
ンバーがライブラリーの中に存在しないと決めることは
できない。
107ITのライブラリーでは、完全にサンプルが取られ
たクラスがいくつかあるが、ααααααクラスは1.1
％しかサンプルされていない。7.6・107ITでは、全ての
アミノ酸配列の50％が提示されることを予測している
が、αセットのアミノ酸を３つ又はそれ以上含むクラス
はやはりサンプル度が低い。（NNK）６ライブラリーの
完全サンプリングを達成するためには、３・109のITが
必要である。これは、これまでに報告されている中で最
大の（NNK）６ライブラリーの10倍も大きいものであ
る。
表131は（NNT）４（NNG）２によってコードされるラ
イブラリーの期待値を示している。存在量の期待値はコ
ドンの順序や、点在する不変コドンとは無関係である。
このライブラリーはアミノ酸配列の0.133倍をコードす
るが、DNA配列の0.0165倍しかコードしない。したがっ
て5.0・107のIT（つまり（NNK）６に必要な量より60倍
少ない）が、ほぼ完全に近いライブラリーのサンプリン
グを達成できるのである。結果は（NNT）６にとって多
少よくなり、（NNG）６にとって少しだけ悪くなる。制
御要因はDNA配列とアミノ酸配列の比である。
表132は、NNK,NNT,及びNNGのコドンに対する＃DNA配
列と＃AA配列の比を表す。NNK及びNNGについては、「停
止コドンはなくなると仮定する」と書いてあるように、
PBDが必須遺伝子、例えばFfファージの「遺伝子III」、
の一部として提示されているものと仮定した。このよう
な必須遺伝子が使われることが要求される訳ではない。
必須遺伝子でないものが使用されると、分析は多少異な
る。NNKとNNGのサンプリングは多少効率が下がる。（NN
T）６は（NNT）５の3.6倍のアミノ酸配列を与えるが、D
NA配列は1.7倍少なくて済む。また、（NNT）７は（NN
T）６の２倍のアミノ酸配列を与えるが、3.3倍少ないDN
A配列を与えるのである。
したがって、単純な混合物（NNS,NNK,又はNNN）を用
いて、ある位置における20個のアミノ酸を全て得ること
は可能ではあるが、こういった単純な混合物からは、非
常に偏ったコードされたアミノ酸のセットが得られる。
この問題は複雑に多様化されたコドンを使うことによっ
て解決される。
我々はまず、ntの分布が二つの制約を受ける場合に、
最も有利なアミノ酸と最も不利なアミノ酸の比率を最小
にするよう計算（WO90/02809を参照）された混合物につ
いて説明する。その二つの制約とは酸性と塩基性のアミ
ノ酸が同量であることと、ありうる停止コドンの数が最
小であることである。我々は、３番目の塩基をＴ又はＧ
に限定することによって（Ｃ又はＧも同等）、最適なnt
分布の探索を単純化した。しかし、本発明は３番目の塩
基がＴ又はＧ（あるいはＣ又はＧ）に限定されない複雑
に多様化されたコドンを使用することも包含している。
最適な分布（「fxS」コドン）は表10Aに示されてお
り、ここに示された量比によって各タイプのアミノ酸を
コードするDNA分子を作り出す。この化学反応により20
個のアミノ酸が全てコードされることに注目せよ。その
際酸性及び塩基性のアミノ酸がほぼ同量であり、最も有
利なアミノ酸（セリン）がコードされる頻度は最も不利
なアミノ酸（トリプトファン）のわずか2.454倍であ
る。「fxS」vgコドンは、NNK又はNNSが１個のコドンし
か与えない数個のアミノ酸［F,Y,C,W,H,Q,I,M,N,K,D,
E］を含むペプチドのサンプリングを最も改善する。サ
ンプリングの利点はライブラリーが比較的小さい時最も
顕著である。
最も有利なアミノ酸と最も不利なアミノ酸の比率を最
小にするだけでそれ以外の制約のない複雑に多様化され
たコドンを検索した結果が表10Bに示されている。変化
は小さく、酸と塩基の均衡と最小の停止コドンを要求し
ても犠牲は少ないことを示している。また、最適化を制
約しなくても酸性及び塩基性アミノ酸の頻度は非常に近
くなるということにも注目しておきたい。一方、制約を
緩めると、最も不利なアミノ酸がSERの0.412倍という分
布が得られる。
NNTコドンの利点は本出願の別の個所で説明されてい
る。最適化しないNNTは、16個のDNA配列のみによってコ
ードされた15個のアミノ酸を与える。表10Cに示した複
雑に多様化されたコドンによってNNTを改良することは
可能である。これによって５個のアミノ酸（SER,LEU,HI
S,VAL,ASP）がほぼ同量ずつになる。更に８個のアミノ
酸（PHE,TYR,ILE,ASN,PRO,ALA,ARG,GLY）はSERの78％の
量で存在する。THR及びCYSはSERの半分ある。ジスルフ
ィド結合のタンパク質用にDNAを多様化するとき、CYSの
量を減らすことが望ましいことが多い。この分布では13
個のアミノ酸が高レベルで存在することができ、停止コ
ドンがないのに、最適化されたfxS分布は優勢度が高い
アミノ酸を11個しか許容しない。
NNGコドンもまた最適化することが可能である。等モ
ルのT,C,A,GがNNGに用いられる時、LEUとARGは倍にな
る。表10Dはほぼ最適化されたNNGコドンを示す。この多
様化においては、４個のほぼ等しい最も有利なアミノ酸
がある。LEU、ARG、ALA,及びGLUである。このセットに
は酸性と塩基性のアミノ酸が１個ずつあることにも注意
してほしい。等しく最も不利なのアミノ酸が２個ある。
TRP及びMETである。lfaa（最も不利なアミノ酸）/mfaa
（最も有利なアミノ酸）の比率は0.5258である。このコ
ドンが６回繰り返された時,TRPとMETのみで成り立つペ
プチドの一般性は、最も有利なアミノ酸のみで成り立っ
ているペプチドの２％である。これを我々は「最適化さ
れたNNG6vgDNAにおける（TRP/MET）６の優勢度」と呼ん
でいる。
「汚いボトル」方法でvgDNAを合成する時、ミックス
の数を制限することが望ましいことがある。ある非常に
有用な混合物は、「最適化されたNNS混合物」と呼ばれ
ており、fxS混合物の最初の二つの位置を平均化する：
（１番目は）T1＝0.24,C1＝0.17,A1＝0.33,G1＝0.26で
あり、２番目の位置は一番目と同じであり、（３番目
は）C3＝G3＝0.5である。この分布はアミノ酸ARG,SER,L
EU,GLY,VAL,THR,ASN及びLYSを５％超、ALA,ASP,GLU,IL
E,MET及びTYRを４％超与える。
それ以外の複雑に多様化されたコドンも大事である。
このコドンは最初の２つの位置において最適化されたNN
Tコドンとよく似ており、３番目の位置ではT:G::90:10
である。このコドンは13個のアミノ酸（ALA,ILE,ARG,SE
R,ASP,LEU,VAL,PHE,ASN,GLY,PRO,TYR,及びHIE）を5.超
の比率で与える。4.3％のTHR及び3.9％のCYSはNNKのLFA
A（3.125％）より多い。残りの５個のアミノ酸は１％未
満存在する。このコドンは全てのアミノ酸が存在すると
いう特徴がある。低頻度アミノ酸が３個以上ある配列は
まれである。このコドンを用いてSBDを分離する時、我
々は最初の13個のアミノ酸は各位置でテストされている
と確信できる。最適化したNNGに基いて類似コドンを用
いてもよい。
単純又は複雑に多様化された望ましいコドンの幾つか
は、システインを含むアミノ酸をコードする。これはコ
ードされた結合ドメインの幾つかは、不変ジスルフィド
結合システインに加えてシステインを１個またはそれ以
上有する、ということを意味する。例えばNNTにコード
された各位置においては、16に１つの割でシステインを
得るチャンスがあるということである。６個のコドンが
多様化された場合、追加システインを含むドメインの割
合は0.33となる。奇数個のシステインは問題を起こす。
Perry及びWetzel（PERR84）を参照のこと。一方、ジス
ルフィドを含む多くのタンパク質、例えばトリプシン、
はジスルフィドを形成しないシステインを含む。ペア化
されないシステインの可能性は以下のような幾つかの方
法で対応できる。
まず、多様化されたファージの集合を、遊離のチオー
ルに強く結合する固定化試薬（サルフォリンク（イリノ
イ州ロックフォードのピアス・ケミカル・カンパニー、
カタログ番号44895H）など）の上を通過させる。ピアス
社のもう一つの製品はTNB−チオール・アガロース（カ
タログ番号20409H）である。同じ目的のため、BioRad社
がAffi−Gel4−１（カタログ番号153−4599）を販売し
ている。
二番目としては、以下のようにシステインを除外する
多様化方法を用いることもできる。
［F,S,Y,L,P,H,I,T,N,V,A,D］を与えるNHT ［L2,P2,H,Q,R3,I,M,T2,N,K,S,V2,A2,E,D,G2］を与える
VNS ［L2,S,W,P,Q,R2,M.T.K.R.V.A.E.G.ストップ］を与える
NNG ［L,P.H,R,V,A,D,G］を与えるSNT ［M,T,K,R,V,A,E,G］を与えるRNG ［T,K,A,E］を与えるRMG ［L,P,H,R,I,T,N,S,V,A,D,G］を与えるVNT又は ［N,S,K,R,D,E,G2］を与えるRRS しかし、これらのシステムはそれぞれにはNNTに関し
て１つ又はそれ以上の不利な点がある。ａ）許容される
アミノ酸の数がより少ない。ｂ）アミノ酸は均等に与え
られない、ｃ）酸性及び塩基性のアミノ酸が生じる確率
は同等ではない、又は、ｄ）ストップコドンが生じる。
けれどもNNG,NHT,及びVNTはNNTとほぼ等しく役立つ。NN
Gは13個の異なったアミノ酸とストップシグナル一つを
コードする。16倍ミックスに２回現れるアミノ酸は２個
のみである。
３番目に、予め選ばれたターゲットに結合するものを
集団内に増やしてから、選択された配列を余分なシステ
インについて評価することができる。コンフォーメーシ
ョンを拘束するために置かれたシステイン以外にシステ
インを含むものも申し分なく使用できるかもしれない。
予定外のジスルフィド結合が起こる可能性もあるが、こ
れは単離されたDNA配列によって定められた結合ドメイ
ンが不適当であるということにはならない。単離された
ドメインの適合性は、化学的に合成されたペプチドの化
学的及び生化学的評価によって最もよく決めることがで
きる。
最後に、遊離のチオールを、遊離チオールに特異的に
結合するがジスルフィドには反応しない試薬、例えばエ
レマン試薬、ヨードアセテート、又は沃化メチルなどで
ブロックした上、変性ファージをその集団内に残してお
くことができる。ブロック剤はミニ・タンパク質の結合
能力を変える可能性があることを理解する必要がある。
従って、異なった結合ドメインを発見できることを期待
して様々なブロック剤を用いるのである。チオールがブ
ロックされた提示ファージの多様化集団は、結合のため
に分画される。単離された結合ミニタンパク質のDNA配
列が奇数個のシステインを含んでたならば、合成手段に
より可能なあらゆる架橋を持ち奇数個のチオールは適切
にブロックされたミニタンパク質を作る。ニシウチ（NI
SH82,NISH86,及びその中に言及されている研究）は、複
数のシステインを含んでいて、各チオールが異なるタイ
プのブロック基によって保護されるペプチドの合成方法
を公開している。これらの基は選択的に除去できるの
で、ジスルフィド対をコントロールできる。我々はその
ようなシステムを、１個のチオールがブロックされたま
までいるか、又はブロックを解かれて異なる試薬で再び
ブロックされるような変更を加えて使用することを考え
ている。
NNT又はNNG多様化コドンの使用により、多様化ライブ
ラリーのサンプリングが非常に効率的になる。（異なっ
たアミノ酸配列）／（異なったDNA配列）の比率が、NN
K、あるいは最適化されたvgコドン（fxS）と比べても１
に近いためである。にもかかわらず、数個のアミノ酸は
どのケースでも落ちてしまう。NNTもNNGも重要なクラス
のアミノ酸は全て許容する。疎水性，親水性、酸性、塩
基性、中性で親水性、小さいもの、大きいものである。
結合ドメインを１つ選択した後、さらに配列の多様化及
び選択をすることが望ましい。より高い親和性又は特異
性を達成するためである。この２番目の多様化の間に前
の多様化によって見逃されるアミノ酸の可能性を調べる
とよい。
２回目の多様化において望ましい方法は、新しい残基
セットによって各位置を変えることである。このセット
は、成功結合ドメイン内のその位置に見出されるアミノ
酸を含み、更に初回の多様化で除外された残基を出来る
限り多く含む。
このように、後の多様化の回では、前に突然変異を生
じなかったアミノ酸の位置、及び前に突然変異した位置
における前の置換セットになかったアミノ酸の置換物が
ともにテストできる。初回の多様化が完全な失敗に終わ
った場合、異なるパターンの多様化方法が用いられるべ
きである。例えば、１個のドメインの中に１つ以上の相
互作用セットが特定できるならば、次の多様化の回で変
える残基は、最初の多様化で調べたものとは異なるセッ
トからのものでなければならない。失敗が続いた場合
は、異なるIPBDに切り換えることもできる。
ターゲット結合突然変異体の親和性選択 親和性分離は本発明においては、まず提示システムが
作動していることを確かめるために用いられる。つま
り、キメラ外表面タンパク質が発現され、ファージ表面
に移行して、挿入された結合ドメインがターゲット物質
に接近できるよう、正しく位置付けられているかどうか
を確認するためである。この目的で使われる場合、結合
ドメインは、あるターゲットの既知の結合ドメインであ
り、ターゲットには親和性分離過程に使われる親和性分
子である。例えば、BPTIをコードするDNAを使用するフ
ァージの外部表面タンパク質をコードする遺伝子に挿入
し、BPTIがふつうなら結合するアンヒドロトリプシンと
結合するかどうかをテストすることによって証明するこ
とができる。
ファージがターゲットに結合するならば、その結合ド
メインは実際にファージによって提示されていることが
確認できる。結合ドメインを提示する（そのことによっ
てターゲットに結合する）ファージは、そうでないもの
から分離される。
提示システムが確保されれば、様々な異なるポテンシ
ャル結合ドメインを提示する多様化ファージのライブラ
リーを用い、親和性分離手法により，それらのファージ
が一つ又はそれ以上のターゲットにどれほどよく結合す
るかを知ることができる。このターゲットは、提示され
た結合ドメインの親である既知の結合ドメインが結合す
るものである必要はない。つまり新しいターゲットに結
合するように選択していけばよいということである。
例えばBPTI結合ドメインを多様化し、トリプシンでは
なく、ヒトの好中球エラスターゼやカテプシンＧのよう
な別のセリンプロテアーゼ、あるいはウマの心臓のミオ
グロンビンのように全く無関係のターゲットに対する結
合性をテストすることもできる。
「親和性分離手段」には次のものが含まれるがそれの
みに限られてはいない。ａ）親和性カラムクロマトグラ
フィー、ｂ）親和性マトリックス物質からのバッチ溶
出、ｃ）プレートに固定された親和性マトリックス物質
からバッチ溶出、ｄ）蛍光標識式細胞分取機（FACS）、
及びｅ）ターゲット物質存在下での電気泳動法。「親和
性物質」は、精製されるべき物質（「アナライト」と呼
ばれる）に親和性がある物質という意味で使われてい
る。ほとんどの場合、不純物が洗い流された後にアナラ
イトが親和性物質から離脱できるよう、親和性物質とア
ナライトの結合は可逆的である。
親和性クロマトグラフィーが使われる場合には、 １）ターゲット物質の分子は、親和性分離に適した固相
担体に固定するのに十分な大きさと化学的反応性がある
こと。
２）マトリックスに固定した後、ターゲット物質が水に
反応しないことが望ましい。
３）マトリックスに固定した後、ターゲット物質が非特
異的にタンパク質に結合したり分解したりしないことが
望ましい。
４）ターゲット物質の分子は、同物質をマトリックスに
付けても、タンパク質を結合するための変化しない表面
が十分にある（通常少なくとも500平方オングストロー
ム、リンカーに接続される原子は除外）ように、十分大
きいこと。
親和性クロマトグラフィーは望ましい分離方法である
が、FACS、電気泳動法、又は他の方法を使用してもよ
い。
本発明では望ましい結合と性を持つタンパク質をコー
ドする遺伝子を持つファージを集団中に増やすために、
ファージの親和性分離を利用する。
本発明は、１つまたはそれ以上のターゲット物質に結
合し、及び／又は１つ又はそれ以上のターゲット物質に
結合できない結合ドメインを選択するのに使える。特異
性とは結合分子が限られたターゲット物質のセットには
強く結合するが，最初のセットとは区別される別のター
ゲット物質にはより弱くあるいは全く結合しないことを
いう。
親和性分離に適したほとんどの分子はターゲットとし
て用いることができる。ターゲットとなる可能性のある
ものには次のものが含まれるが、それに限定されない。
ペプチド、水溶性及び非水溶性タンパク質、核酸、脂
質、炭水化物その他有機分子（単量体又は重合体）、無
機化合物、有機金属化合物など。セリンプロテアーゼ類
はポテンシャル・ターゲット物質の特に興味のあるクラ
スである。
クロマトグラフィー、FACS、又は電気泳動法において
は、ターゲット物質をもう１つの化学物質とを共有結合
させる必要がある場合がある。クロマトグラフィーにお
けるもう１つの物質はマトリックス、FACSにおいては蛍
光色素、電気泳動法においては強荷電分子である。多く
の場合ターゲット物質が既に以下のような望ましい物質
を有しているので、カップリングは不要である。ａ）固
定性、ｂ）蛍光、ｃ）荷電。それ以外の場合には化学的
又は物理的カップリングが必要である。
親和性分離に使われる固定化又は標識されたアナログ
を調製するのにの実際のターゲット物質を使う必要はな
い。むしろ、ターゲット物質の適切な反応性アナログの
ほうが便利かもしれない。反応官能基のないターゲット
物質は、まずハロゲンのような強い試薬を使って反応官
能性基を作ることによって固定され得る。場合によって
は、実際のターゲット物質の反応基が、ターゲット分子
の中でそのままにしておくべき部分を占めることがあ
る。その場合には、追加の官能基を合成化学によって導
入してもよい。
２つの一般的固定化方法が広く使われている。最初の
方法は、対象化合物をビオチニル化し、さらにビオチニ
ル化された誘導体を固定されたアビジンに結合させるこ
とである。二番目の方法はターゲット物質に対する抗体
を生じさせ、数ある方法の一つを使ってその抗体を固定
して、ターゲット物質をその固定された抗体に結合させ
るものである。抗体の使用は大きいターゲット物質によ
り適している。小さいターゲット物質（例えば10個又は
それ以下の水素でない原子から成るもの）は抗体に完全
にのみこまれてしまい、ターゲット−抗体複合体の表面
に出ているターゲットの部分がほとんどなくなってしま
うかもしれないからである。
抗体を使用しない疎水性分子の非共有固定法も用いる
ことができる。2,3,3トリメチルデカンのような化合物
を、アルギン酸ナトリウムのようなマトリックス前駆体
のなかに混ぜ、混合物を固化液の中に押し出す。結果と
してできるビーズは全体に分散し表面に露出している2,
3,3トリメチルデカンを有する。
他の固定方法は特殊な化学機能物質の存在に依存す
る。ポリペプチドは−NH2（Ｎ−末端、リジン）、−COO
H（Ｃ末端、アスパラギン酸、グルタミン酸）、−OH
（セリン、スレオニン、チロシン）、及び−SH（システ
イン）を提示している。ポリサッカライドは糖の主鎖を
持つDNAと同じようにフリーなOHグループがある。
次の表は、反応官能基及びポテンシャル固定化試薬の
非包括的な検討である。
グループ：反応物質 Ｒ−NH2:2,4,6−トリニトロンベンゼンスルホネート（T
NBS），（CREI84,p.11） Ｒ−NH2:カルボン酸無水物、例：コハク酸無水物、マレ
イン酸無水物、シトラコニック無水物の誘導体（CREI8
4,p.11） Ｒ−NH2:還元性シッフ塩基を形成するアルデヒド（CREI
84,p.12）、グアニドシクロヘキサンジオン誘導体（CRE
I84,p.14） Ｒ−CO2H:ジアゾ化合物（CREI84,p.10） Ｒ−CO2−：エポキシド（CREI84,p.10） Ｒ−OH:カルボン酸無水物 アリール−OH:カルボン酸無水物 インドール環：ベンジルハロゲン化合物及びスルフェニ
ルハロゲン化物（CREI84,p.19） Ｒ−SH:N−アルキルマレイミド（CREI84,p.21） Ｒ−SH:エチレンイミン誘導体（CREI84,p.21） Ｒ−SH:アリール水銀化合物（CREI84,p.21） Ｒ−SH:ジスルフィド試薬（CREI84,p.23） チオールエーテル：沃化アルキル（CREI84,p.29）ケト
ン、シッフの塩基を作りNaBHとともに還元するREI84,p.
12−13） アルデヒド:COOHを酸化する。vide supra Ｒ−SO3H:R−SO2Clに変換し、固定化アルコール又はア
ミンと反応する。
Ｒ−PO3H:R−PO2Clに変換し、固定化アルコール又はア
ミンと反応する。
CC二重結合:HBrを加えてからアミン又はチオールを作
る。
親和性クロマトグラフィーと関連技術に関する広範な
文献は更に例を提供する。
担体物質としての使用に適したマトリックスには、ポ
リスチレン、ガラス、アガロース、その他のクロマトグ
ラフィー用担体などがあり、ビーズ、シート、カラム、
ウェル、その他必要な形態に製造できる。親和性クロマ
トグラフィー用担体物質のサプライヤーは、以下が含ま
れる。マサチューセッツ州ケンブリッジ、アプライド・
プロテイン・テクノロジーズ。ニューヨーク、ロックビ
ル・センター、バイオ・ラッド・ラボラトリーズ。イリ
ノイ州ロックフォード、ピアス、ケミカル・カンパニ
ー。ターゲット物質は、各マトリックスを作成したメー
カーの指示に従い、ターゲットがよく提示されることを
考慮して、マトリックスに結合させる。
選択過程の初期においては、結合を行いやすくするた
めターゲット物質は比較的高い濃度でマトリックスに接
触させてもよい。ターゲット濃度は、より高い親和性の
あるSBDを選ぶために次第に減らしていく。
提示ファージの集団は、結合タンパク質の意図された
使用にみあう条件下で、親和性マトリックスに接触さ
せ、その集団は、ある溶質の勾配をカラムにかけること
によって分画される。この過程はターゲットに親和性を
持つPBDと、ターゲットに対するその親和性が使われる
溶離剤の影響をほとんど受けないものが濃縮される。濃
縮画分は、高濃度の溶離剤でカラムから溶出する、生存
能力のある提示ファージを含む。
溶離剤は、提示されたPBDと固定されたターゲット物
質との間の非共有結合的相互作用を弱める能力があるこ
とが望ましい。溶離剤はファージを殺さないことが望ま
しい。成功ミニタンパク質に対応する遺伝的メッセージ
は、PCRのように試験管内で行うことによってよりも、
ファージを再生することによって最も好都合に増大でき
る。ポテンシャル溶離剤のリストには塩（Na+,HG4+,R
b+,SO4--,H2PO4 -,クエン酸塩、K+,Li+,HSO4-,CO3--,Ca
+++,Sr++,Cl-,PO4---,HCO3-,Mg++,Ba++,Br-,HPO4 --及び
酢酸塩）、酸、熱、ターゲットを結合することが知られ
ている化合物、及び水溶性のターゲット物質（又はその
アナログ）などがある。
エタノール、アセトン、エーテル、又は尿素のような
中性の溶質は、しばしばタンパク質の精製に用いられ、
タンパク質と他の分子の間で起こる非共有結合相互作用
を弱めることが知られている。これらの種類のうち多く
はバクテリア及びバクテリオファージに有害である。尿
素は8MまではM13に有害とならない。ほとんどの場合塩
は濃度勾配を作るのに望ましい溶質である。pHを低下さ
せることもまた非常に望ましい溶離剤である。場合によ
っては望ましいマトリックスが低いpHにおいて不安定な
ので、塩と尿素が最も望ましい試薬であることもある。
一般的にタンパク質とターゲット物質間の非共有結合的
相互作用を弱めるその他の溶質を使用してもよい。
溶出されない提示ファージは、溶出条件に抵抗するの
に十分なターゲット物質に対する親和性のある結合ドメ
インをコードするDNAを含む。このような成功結合ドメ
インをコードするDNAは、いろいろな方法で回収でき
る。好ましくは結合提示ファージは単に溶出条件を変え
て溶出させる。他の方法としては、ファージをその場で
培養するか、あるいはターゲットを含む物質からフェノ
ール（又は他の適切な溶剤でもよい）で抽出して、PCR
又はDNA組換え技術によってDNAを増幅する。または、特
異的プロテアーゼ用の部位が提示ベクターの中に作られ
ている場合、そのプロテアーゼを用いて結合ドメインを
GPから切り離す。
SBDを持つクローンの分析において、担体物質（ポリ
スチレン、ガラス、アガロース、セルロースその他）を
変えるのは、ターゲットではなく担体物質に結合するフ
ァージを区別するためである。
収穫されたファージは、ターゲット結合表現型に関し
て濃縮されるがその際、親和性マトリックスに固定され
たターゲット物質を使った親和性分離手法が用いられ
る。ターゲット物質に結合できないファージは洗い流さ
れる。バクテリアの増殖を防ぐため、アザイドのような
殺菌剤をバッファーに入れておくことが望ましい事があ
る。クロマトグラフィーにおいて用いられるバッファー
には次のようなものを含む。ａ）ターゲットを安定させ
るために必要なイオン又は他の溶質、及びｂ）IPBDから
派生するPBDを安定させるのに必要なイオン又は他の溶
質。
親和性カラムへの結合を示すファージを回収するに
は、上述のカオトロピック物質又は可溶形のターゲット
物質の勾配でカラムから溶出してくる画分を集める。勾
配において後から溶出する部分は高親和性ファージが濃
縮されている。溶出したファージはそれから適切な細胞
の中で増幅される。
高親和性ファージが生きた状態でターゲットから溶出
できない場合、以下のように対処することができる。
１）マトリックスを栄養培地で満たし，その場で望まし
いファージをその場で生育させる。
２）マトリックスの一部を除去し、それを生育培地に植
菌する。
３）化学的または酵素的にターゲットのマトリックスに
対する結合を弱め、ターゲットにまだ結合されているGP
が溶出するようにする。
４）ファージを分解して、フェノール又は他の適切な溶
剤でDNAを回収する。回収されたDNAを用いて細胞を形質
転換し、GPを再生させる。
以上の手段を幾つか組み合わせて使うことも可能であ
る。我々が親和性マトリックスから回収したいものはフ
ァージそれ自体ではなく、その中にある、成功エピトー
プ又は結合ドメインの配列に関する情報であるというこ
とを覚えておくべきである。
WO90/02809に説明されていたとおり、説明した親和性
分離方法を変えて物質Ａには結合するが物質Ｂには結合
しない分子、又はＡとＢの両方に拮抗的あるいは非拮抗
的部位で結合する分子、又は選択されたターゲットに結
合しない分子を選択してもよい。
その後の生産 本発明の手法を用いることにより、我々は、興味のあ
るターゲット物質に対し高親和性と特異性を持つ新規タ
ンパク質ドメインを提示する複製可能ファージを得るこ
とができる。このようなファージは、結合タンパク質ド
メインのアミノ酸体現物と新規結合ドメインをコードす
る遺伝子のDNA体現物の両方を持つ。DNAが存在すること
によって、新規結合タンパク質ドメインから成るタンパ
ク質の高レベルの発現システムでの発現が可能になる。
このシステムは開発過程において使われたのと同じシス
テムである必要はない。
新規結合タンパク質の生産方法はいくつかあり、次の
方法を含む。ａ）結合ドメインをコードする遺伝子を変
えて、結合ドメインがファージに付かず水溶性のタンパ
ク質として発現されるようにすること。（結合ドメイン
をコードするコドンの5'側のコドンを削除するか、結合
ドメインをコードするコドンの3'側に複数のストップコ
ドンを挿入することにより行う。）、ｂ）結合ドメイン
をコードするDNAを、既知の発現システムに移す、及び
ｃ）ファージを精製システムとして利用する（ドメイン
が十分小さければ、従来のペプチド合成方法によって生
産することもできるかもしれない。） 前述の通り、ミニタンパク質をIPBDとして使用するこ
との利点は、生成されるSBDもまたミニタンパク質のよ
うな挙動をし、化学合成によって得られるだろうからで
ある。（ここで使われる「化学合成」という用語の意味
には、無細胞系での酵素剤の使用を含む。） ペプチドは、水溶液の中でも担体上でも化学的に合成
することができる。段階合成や部分重合の様々な組み合
わせが使用できる。
合成が行われている間、アミノ酸の側鎖は分岐を防ぐ
ために保護されている。以下のようないくつかの異なっ
た保護グループがシステインのチオール基を保護するの
に役立つ。
１）４−メトキシベンジル（MBzl;Mob）（NISH82;BECK8
9c）、HFによって除去可能。
２）アセトアミドメチル（Acm）（NISH82;NISH86,BECK8
9c）、ヨウ素、水銀イオン（例．酢酸水銀）、硝酸銀に
よって除去可能。及び ３）Ｓ−パラーメトキシベンジル その他のチオール保護基は標準的な参考文献を参考に
してほしい。例：グリーン著、「有機合成における保護
基」（1981） ポリペプチド鎖がいったん合成されると、ジスルフィ
ド結合が形成されなければならない。酸化剤としての可
能性があるものは、空気（NISH86）、フェリシアニド
（NISHI82）、ヨウ素（NISHI82）、及び過蟻酸である。
温度、pH、溶媒、及びカオトロピック化学物質が酸化の
過程で影響を及ぼすことがある。
複数のジスルフィド結合を持つ多くのミニタンパク質
が、生物学的に活性のある形で化学的に合成されてい
る。本発明における成功結合ドメインは、それ自体で又
はより大きいタンパク質の一部として、結合タンパク質
に適したあらゆる目的、たとえばターゲット物質の分離
又は除去のために使うことができる。この目的のため、
新規結合タンパク質は直接又は間接的に、共有結合的又
は非共有結合的に標識、キャリアー、又は担体とカップ
リングすることができる。
薬品として使用される時、新規結合タンパク質は適切
なキャリアー又はアジュバントを一緒に含んでもよい。
＊ ＊ ＊ ＊ ＊ この明細書に記載された全ての出典は、関係のある範
囲においてその内容が収録されている。以下の例におい
て使われる細胞は全てE.coli細胞である。
例 Ｉ M13「遺伝子VIII」タンパク質との融合体としてのBPIT
の提示 例Ｉは、M13上にある、成熟した「遺伝子VIII」コー
トタンパク質との融合体としての、BPTIの提示に係わる
ものである。各DNAの構造は、制限分解及びDNA配列によ
って確認される。
1.viiiシグナル配列::bpti::成熟VIIIコートタンパク質
提示ベクターの構築 機能性クローニング・ベクターはM13及びM13から生成
されたファジミドである。最初の構築はf1ベースのファ
ジミドpGEM−3Z f（−）（TM）（ウイスコンシン州、マ
デイソンのプロメガ・コーポレーション）で行った。
我々は次の順でコードする遺伝子を構築した。ｉ）変
化させたlacUV5プロモーター、ii）シャイン−ダルガル
ノ配列、iii）M13「遺伝子VIII」シグナル配列、iv）成
熟BPTI、ｖ）成熟M13「遺伝子VIII」コートタンパク
質、vi）複数の停止コドン、及びvii）転写ターミネー
ター。この遺伝子は表102に図解されている。lacUV5の
オペレーターは対称形のlacOでIPTGが無い場合はより強
く抑制する。野生型「遺伝子VIII」と同じ長さの最長セ
グメントは最小にしてあるため、共存する「遺伝子VII
I」と遺伝子組換えが起こる可能性は低い。
ｉ）pGEM−3Zfに基づくOCV pGEM−3Zf（商標）（ウイスコンシン州、マデイソン
のプロメガ・コーポレーション）は、amp遺伝子、バク
テリアの複製開始点、バクテリオファージf1の複製開始
点、マルチクローニングサイトの配列１個を含むlacZオ
ペロン、及びT7とSP6のポリメラーゼ結合配列を含むベ
クターである。
BamH I及びSal Iサイトは、lacZオペロンの両境界に
導入された。（lacZオペロンを除いて合成遺伝子に置き
換えるのを容易にするためである）このベクターはpGEM
−MB3/4と名付けられている。
ii）M13mp18に基づくOCV M13mp18（YANI85）は、ファージゲノム全体と、マル
チクローニングサイトを１つ持つlacZオペロンから成る
ベクターである。（MESS77）（マサチューセッツ州ベバ
リーのニューイングランド・バイオラブス社）BamH I及
びSal Iサイトは、lacZオペロンの５′及び３′端でM13
mp18に導入された。このベクターはM13−MB1/2と命名さ
れた。
Ｂ）合成遺伝子 合成遺伝子（VIIIシグナル配列::成熟bpti::成熟VIII
コートタンパク質）は合成オリゴヌクレオチド16個から
構築されたが、この合成オリゴヌクレオチドはテキサス
州ヒューストンのジェネティック・デザインズ、Inc社
により、KIMH89及びASHM89における手法と類似した方法
によって合成された。表102にはこの配列を注釈付きで
示す。オリゴヌクレオチドは、標準的方法を用いて一番
5'側の分子を除きリン酸化されており、段階的にアニー
ルされ、連結された。突出部分はT4DNAポリメラーゼに
よって埋められ、DNAはpGEM−3Zf（−）のHinc IIサイ
トの中にクローニングされた。最初の構築体はpGEM−MB
1である。pGEM−MB1の二本鎖DNAは、Pst Iで切断され、
T4DNAポリメラーゼによって埋められ、Sal Iリンカーに
連結された（ニューイングランド・バイオラブ社）。し
たがって合成遺伝子がBamH I及びSal Iサイトによって
挟まれている（表102）。合成遺伝子はBamH I−Sal Iカ
セットの上に得られ、導入されたBamH I及びSal Iサイ
トを使ってpGEM−MB3/4及びM13−MB1/2の中にクローン
され、pGEM−MB16及びM13−MB15がそれぞれできた。合
成挿入体は配列決定された。もとのリボゾーム結合部位
（RBS）は間違っていた（設計されたAGGAGGの代わりにA
GAGGだった）ので、我々はインビトロでもインビボでも
発現されたタンパク質を探知できなかった。
Ｃ）合成遺伝子の改変 Ｉ）リボゾーム結合サイト（RBS） pGEM−MB16において、Sac I−Nhe I DNAフラグメント
（RBSを含む）を、機能することがわかっているE.coli
phoAのRBSとよく似た新規RBSをコードするオリゴヌクレ
オチドに置き換えた。
推定RBSは小文字で、開始メチオニンコドンは下線が引
かれ太字で表されている。できあがった構築体がpGEM−
MB20である。pGEM−MB20が持つ遺伝子の試験管内におけ
る発現により、約14.5Kdの予期されたサイズの新規タン
パク質種が生成された。
II）tacプロモーター 融合タンパク質の発現を高めるため、lacUV5プロモー
ターをtacプロモーターに替えた。pGEM−MB16におい
て、BamH I−Hpa IIフラグメント（lacUV5プロモーター
を含む）を、trpプロモーターの−35配列（RUSS82参
照）を含むオリゴヌクレオチドに置き換えた。ベクター
はpGEM−MB22と命名した。
融合タンパク質遺伝子のプロモーター及びRBS変異体は
以下のように構築された。
pGEM−MB20及びpGEM−MB26の合成遺伝子は、ファージ
M13−MB27とM13−MB28をそれぞれ生成するため、変えら
れたファージベクターM13−MB1/2に再度クローニングさ
れる。
III.シグナルペプチド配列 tac及び「新」RBSにより調節された合成遺伝子の試験
管内での発現により、未加工（未切断）タンパク質とし
て予期されたサイズ（約16kd）の新規タンパク質が生成
した。インビボの発現でもフルサイズの新規タンパク質
が生成されたが、プロセシングをうけたタンパク質は、
銀染色又は抗BPTI抗体を使うウエスタン分析によりファ
ージ上にも細胞抽出物中にも見出されなかった。
そこで我々は融合体のシグナル配列を分析した。表10
6はいくつかの典型的なシグナル配列を示す。荷電残基
は一般的に重要であると考えられており、太字で書かれ
下線が引かれている。各シグナル配列には無荷電残基が
長く続いており、ほとんどは疎水性である。これらは小
文字で書かれている。右側の括弧の中にあるのは無荷電
残基が続く長さである。「遺伝子VIII」のシグナルとBP
TI融合体、「遺伝子III」のシグナルとBPTIの融合体は
無荷電部分が比較的短いことに気づく。これらの短い無
荷電の部分が融合ペプチドのプロセシングを減らすか阻
止するのかもしれない。「遺伝子III」シグナル配列は
以下を指示する能力がある。ａ）（成熟BPTI）::（成熟
「遺伝子III」タンパク質）から成るペプチドを脂質二
重層に挿入する、及びｂ）BPTI及び成熟「遺伝子III」
タンパク質のほとんどを脂質二重層を横切って移動させ
る（下記参照）。「遺伝子III」タンパクが、ファージ
をできるまで脂質二重層内から動かずにいるということ
は、成熟「遺伝子III」タンパク質のカルボキシ末端付
近にある無荷電アンカー領域による指示であり（表116
参照）、分泌シグナル配列によるものではない。phoAシ
グナル配列は成熟BPTIをE.coliのペリプラズムに分泌す
るよう指示できる（MARK86）。更に、成熟した本来の
「遺伝子VIII」タンパク質がファージ形成前に脂質二重
層内に入るメカニズムについては議論がある。
従って我々は、「遺伝子III」推定シグナル配列をコ
ードするDNAを、次をコードする各DNAによって置換し
た。１）phoAシグナル配列、２）blaシグナル配列、及
び３）M13「遺伝子III」シグナル。これらの代替物はそ
れぞれ、順番に以下から成る融合タンパク質をコードす
る三分割遺伝子を生成する。（ａ）（ｂ）及び（ｃ）の
部分をペリプラズムに分泌することを指示する第一の遺
伝子に由来するシグナルペプチド、（ｂ）第二の遺伝子
（この場合、第二の遺伝子は動物の遺伝子）に由来する
開始ポテンシャル結合ドメイン（この場合はBPTI）。及
び（ｃ）第三の遺伝子に由来する構造的パッケージング
シグナル（成熟「遺伝子VIII」コートタンパク質）。
IPBD::パッケージング−シグナル融合がファージ表面
に来る過程は図１に図示されている。図1aでは、純正
「遺伝子VIII」タンパク質が脂質二重層に現れ（どのよ
うな過程を経るにせよ）、アミノ及びカルボキシ末端双
方とも細胞質内にある。シグナルペプチダーゼＩは、
「遺伝子VIII」タンパク質を開裂させ、シグナルペプチ
ド（これは細胞に吸収される）及び脂質二重層を横切る
成熟「遺伝子VIII」コートタンパク質を解放する。成熟
「遺伝子VIII」コートタンパク質の多くのコピーが脂質
二重層に蓄積しファージ構築を待つ（図1c）。幾つかの
シグナル配列はかなり大きいタンパク質を脂質二重層を
越えて移動させるよう指示できる。このような強力なシ
グナル配列のシグナルペプチダーゼＩによる切断部位を
コードするコドンの後に複数の追加のコドンが挿入され
る場合、コードされたアミノ酸は、図1bに示されたとお
り脂質二重層を越えて移動するであろう。シグナルペプ
チダーゼＩで切断された後、追加コドンによってコード
されたアミノ酸は、ペリプラズムにあるが、成熟「遺伝
子VIII」コートタンパク質によって脂質二重層内につな
ぎとめられている。図1d。環状一本鎖ファージDNAは、
高濃度の成熟「遺伝子VIII」コートタンパク質を含んで
いる脂質二重層のある場所を通って押し出される。各コ
ートタンパク質分子のカルボキシ末端はDNA付近に集ま
り、アミノ末端は外側に集まる。融合タンパク質はその
二重層貫通ドメインでは成熟「遺伝子VIII」コートタン
パク質と同一であるため、融合タンパク質は純正成熟
「遺伝子VIII」コートタンパク質と共集合する。図1eを
参照のこと。
どの場合も、成熟「遺伝子VIII」コートタンパク質部
分は純正成熟「遺伝子VIII」コートタンパク質と共集合
して、表面に提示されたBPTIドメインを持つファージ粒
子を作り出すことが意図されている。分泌シグナル配列
の由来や特徴はそれほど重要ではない。シグナル配列は
切り取られたり分解されたりするからである。しかし構
造パッケージングシグナルは、機能するウイルスシース
（鞘）を作るように純正遺伝子コートタンパク質と共集
合しなければならないため、重要である。
［0073］ ａ）細菌アルカリホスファターゼ（phoA）シグナル・ペ
プチド 構築体pGEM−MB26はSac I−Acc IIIフラグメントを有
するが、このSac I−Acc IIIフラグメントは新RBSと、
開始メチオニン及びM13「遺伝子VIII」プロタンパク質
シグナルペプチドをコードする配列とを含む。このフラ
グメントを、RBS及び開始メチオニンとPhoAのシグナル
ペプチドをコードするDNA（INOU82）を含む二重鎖（４
つのオリゴヌクレオチドをアニールさせた）と置き替え
た。このファージがpGEM−MB42である。M13MB48はGemMB
42から生じたものである。GenMB42からのBamH I−Sal I
DNAフラグメントはこの遺伝子構築体を含んでおり、同
様に切断されたベクターM13MB1/2と結合されて、M13MB4
8を生じる。
PhoA RBS及びシグナルペプチド配列 ｂ）β−ラクタマーゼ・シグナルペプチド β−ラクタマーゼ（amp）プロモーター、及びシグナ
ルペプチドをコードするDNAを、（成熟BPTI）::（成熟V
IIIコートタンパク質）遺伝子内に移すため、我々はま
ずamp遺伝子のβラクタマーゼシグナルペプチド開裂部
位のコドンの隣にAcc IIIサイトを導入した（C2504→T,
およびA2501→Ｇ）。それからBamH IリンカーをAat II
サイトのnt2260、プロモーターの5'側、に連結した。で
きたベクターはpGEM−MB45である。BamH I−Acc IIIフ
ラグメントはampプロモーター及びampRBS、開始メチオ
ニン及びβラクタマーゼ・シグナルペプチドを持つ。こ
のフラグメントを用いてpGEM−MB26の対応フラグメント
を置き換えて、構築体pGEM−MB46を作った。
amp遺伝子プロモーターとシグナルペプチドの配列 ｃ）M13「遺伝子III」シグナル::bpti::成熟VIIIコート
タンパク質 我々は更に、KmR遺伝子と、前述のBPTI::成熟VIIIコ
ートタンパク質遺伝子フラグメントに融合しているM13
「遺伝子III」シグナルペプチドを持っているM13MB51を
構築することもできる。これは。M13−MB51が「遺伝子I
II」を持っていないため、ファージはプラークを形成で
きないが、細胞をKmRにすることはことはできる。感染
性ファージ粒子はヘルパーファージを介して得られる。
「遺伝子III」シグナル配列は（BPTI）::（成熟「遺伝
子III」タンパク質）をファージの表面に向かわせるこ
とができる。（下記参照） 2.合成（シグナルペプチド::成熟−bpti::VIIIコートタ
ンパク質）遺伝子にコードされたタンパク質産物の分析 ｉ）試験管内における分析 原核細胞の共役転写／翻訳システム（イリノイ州、ア
ーリントンハイツのアマーシャム・コーポレーション）
を用い、BPTI/VIII合成遺伝子及びその誘導体によって
コードされたタンパク質産物をインビトロで分析した。
表107は列挙されたベクターによりコードされるタン
パク質を列挙するが、これらのタンパク産物は、35Sメ
チオニンの存在下で試験管内合成されついでSDSポリア
クリルアミドゲル電気泳動で生成物を分離し、標準蛍光
間接撮影によって可視化される。各サンプル中に、プレ
βラクタマーゼ産物（約31kd）が見られるが、これはベ
クターのありふれた選択遺伝子であるamp遺伝子による
ものである。更に、合成遺伝子とその変種によってコー
ドされる（pre−BPTI/VIII）生成物は、示したとおりで
ある。これらの分子種の泳動後（約14.5kd）は、コード
されるタンパク質の予想サイズと一致している。
II）試験管内における分析 （ｂ）と（ｃ）で詳細に説明したベクターは、E.coli
XL1−blue(TM)株（カリフォルニア州、ラホヤのスト
レータージーン社）及びSEF株に新たにトランスフェク
トさせた。E.coli SE6004株（LISS85）はprlA4突然変異
を持ち、野生型prlAを持つ株より分泌における許容度が
高い。SE6004はF-であり、lac Iは除去されている。し
たがって細胞には、M13が感染することができず、lacUV
5およびtacプロモーターはIPTGで制御されない。SEF'株
は、XL1−blueTMと掛け合わせてSE6004株（LISS85）か
ら派生させたものである。XL1−blueTMのF'はTCR及びla
c Iqを持つ。SE6004はストレプトマイシンＲ、TcSであ
るのにたいし、XL1−blueTMはストレプトマイシンｓ、T
cRであり、両方の親株はTcとストレプトマイシンの組み
合わせによって殺すことができる。SEF'は親株SE6004
（prlA4）の分泌許容表現型を保持している。
新たなトランスフェクタントはNZYCM培地（SAMB89）
中で１時間生育させる。1.0μＭから0.5μＭの範囲でIP
TGを加え（lacUV5とtacを抑制解除するため）、更に1.5
時間生育させる。
コードされた合成挿入タンパク質を発現している細胞
と、コントロール細胞（ベクターなし、偽ベクター、IP
TGなし）の部分標品を、SDSゲル用サンプルバッファー
に溶解し、SDS及び尿素を含む20％ポリアクリルアミド
ゲルの中で電気泳動する。二連のゲルは、銀染色（第一
製薬、東京）するか、ナイロン膜（マサチューセッツ
州、ベッドフォードのミリポア社によるイモービロン）
に電気的ブロッティングを行ってウサギの抗BPTIポリク
ローナル抗体を使ったウエスタン分析をした。
表108は、同一ゲルの銀染色及びウエスタン分析によ
って見られる興味深いタンパク質を示す。ウエスタン分
析により、BPTIエピトープを持つIPTG誘導可能なタンパ
ク質種がはっきりと見られる。これらのタンパク質は、
試験株には存在するがコントロール株には見られない。
タンパク質の一部は見たところ完全にプロセシングされ
たものと一致する大きさのところに移動するが、XL1−b
lueTMにおいてはこの種のタンパク質の易動度はは主に
プロセシングされていない形態のプロタンパク質の易動
度である。SEF′においては、プロセシングを受けた形
態の方が優勢で、プロセシングされていないものに相当
するかすかなバンドがあるだけである。
そこで我々は、SEF′株中で分泌シグナル配列の後で
開裂される三分節融合タンパク質を生産させた。我々は
成熟タンパク質はBPTIの後に「遺伝子III」コートタン
パク質が続いたものからなり、コートタンパク質部分は
細胞膜を横断していると確信している。このタンパク質
の一つ又はそれ以上のコピー、恐らく何百ものコピー
が、M13から派生したファージ又はM13様ファジミドの中
に組み込まれる。この構築体により、次のことが可能と
なる。ａ）BPTIドメインを突然変異させる。ｂ）各変異
体を一つ又はそれ以上のファージのコートに提示する
（一つのファージにつき一つのタイプ）。及びｃ）我々
が選択したターゲット物質に関して新規な結合特性を示
す変異体を提示しているファージを回収する。
ラシェッド及びオベラー（RASC86）の報告によると、
成熟コートタンパク質の最初の11個の残基に違いがある
「遺伝子VIII」の２個の対立因子を発現している細胞で
生成されたファージは、各タンパク質をいくらかずつ含
む。したがって、我々はphoA（シグナル）::bpti::成熟
VIII融合遺伝子のインビボでのプロセシングを達成でき
たことから、この遺伝子と野生型IIIとの共集合により
表面にBPTIドメインを持つファージが作られることは大
いにありそうである。これらの遺伝子のbptiドメインを
突然変異させるとファージのライブラリーができる。各
ファージは、ファージ表面に提示されたBPTIの変異体を
コードする遺伝子を持っている。
VIII 提示ファージ・生産：調製及び分析 i.ファージ生産 OCVはIPTGのない状態でXL1−blueTM中で生育できる。
典型的には、プラークプラグをプレートから取り、新た
に希釈された細胞を含む培地2mlの中で６から８時間の
間培養する。この培養物は遠心器にかけられた後、上澄
液の力価を測定する。これはファージのストック（保存
原液）として更なる感染、ファージ生成及び興味のある
遺伝子提示のために保存される。
１晩培養したSEF′細胞の培養液を500mlのNZCYM培地
で100倍に薄めた液を直ちに、37℃においてシェーカー
内で細胞密度が0.4（600nmにおける吸光度）になるまで
培養する。この培養液にMOIが10となるのに十分な量の
ファージストックを加え、同時にIPTGを最終濃度が0.5m
Mとなるように加えさらにもう２時間培養を続ける。
ii.ファージの準備及び精製 ファージを生産する細菌培養液は遠心して、上澄液に
あるファージを細菌ペレットから分離する。この上澄液
に、量にして1/4のファージ沈降液（20％PEG,3.75M酢酸
アンモニウム）を加え、PMSFを最終濃度1mMとなるよう
加える。これを２時間氷上に放置し、その後沈降したフ
ァージを遠心により回収する。ファージペレットは、0.
1％のサルコシルを含むTrisEDTAに再溶解し、４℃で１
時間放置し、その後遠心して細菌及び細菌のかけらを除
去する。上澄液のファージは４℃で一晩PEGにより再沈
降させる。ファージペレットはLB培地中に懸濁させ、あ
と２回沈降させて界面活性剤を除去する。ファージは４
℃でLB培地中に懸濁して、力価を測定し、分析及び結合
の研究のために使われる。
より厳格なファージ精製計画は、CsCl勾配（NETバッ
ファー（0.1M NaCl,1mMEDTA,0.1M Tris pH7.7）に3.86g
のCsClを溶かし10mlにする）の中で遠心分離にかける。
TEサルコシル・バッファー中の1012から1013ファージを
5mlのCsCl NETバッファーと混合し、34k rpmで一晩遠心
する。例えばSorvall OTD−65B超遠心機などを用いる。
400μｌづつの分画を注意深く取り出す。各画分から５
μｌづつを取り、0.1％のSDSを含むゲル・ローディング
・バッファーとともに15分間65℃で加熱した後、アガロ
ースゲル電気泳動法によって分析する。ファージを含む
画分はプールされる。ファージは再沈降させ、最終的に
LB培地に1mlあたり1012から1013個の濃度になるよう再
溶解させる。
III.ファージの分析 提示ファージは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、
及びゲルの銀染色又は、ナイロン膜に電気的に移してか
ら抗BPTI抗血清（ウエスタン分析）を用いて分析すると
いう標準手法を用いて分析する。異種タンパク質の提示
は、電気泳動法及びウエスタン分析において元のタンパ
ク質例えばBPTIの段階希釈と提示ファージサンプルを比
較することによって定量する。別の方法では、ファージ
の倍々希釈液を電気泳動し、主要コートタンパク質と融
合タンパク質を双方とも銀染色する。二つのタンパク質
種の比率の比較により、ファージごとの融合タンパク質
の数を予測すること可能になる。一つのファージ中にあ
るVIII遺伝子によりコードされたタンパク質の数が分か
っているからである（約3000）。
融合タンパク質のバクテリオファージへの組み込み ベクターGemMB42とM13MB48によってコードされるBPT
I:VIII融合タンパク質がプロセシングを受けたものがイ
ンビボで発現されると、プロセシングを受けた融合生成
物は恐らく細胞膜内にあるということを示される。従っ
て、この融合生成物はファージに組込まれている可能性
があり、BPTI部分はファージ表面に提示されるであろう
ことが示唆される。
SEF′細胞に、コントロールとしてM13MB48又はM13mp1
8に感染させた。できたファージを、尿素を含む20％の
ポリアクリラミドゲル中で電気泳動し（１レーンごとに
約1011個のファージ）、ナイロンマトリックスに電気移
動させて抗BPTIウサギ血清を使ってウエスタン分析を行
った。単一種のタンパク質が、M13MB48保存ファージ感
染細胞から得られたファージ中に観察されたが、これは
コントロール感染細胞から得られたファージには観察さ
れなかった。このタンパク質は約12kdのサイズへのとこ
ろへ移動したが、このサイズは完全にプロセシングされ
た融合タンパク質と一致する。
ファージ感染させた、あるいはさせていないSEF′細
菌溶菌液のウエスタン分析により、約20kdの別のタンパ
ク質種があることが示された。この種は量は少ないが、
PEG沈殿させただけでさらなる精製（例えば非イオン性
界面活性剤を用いたり、CsCl勾配遠心をするなど）を行
わないファージ標品にも存在した。界面活性剤存在下又
は非存在下で作られたM13MB48ファージ標品を比較する
と、サルコシル処理及びCsCl勾配精製は菌体混入物を除
去するが、BPTI:VIII融合タンパク質の存在には全く影
響を及ぼさないということを示した。これは融合タンパ
ク質がファージのボディに組み込まれており、構成要素
として存在することを示している。
感染後及びIPTGインダクション後のファージ生成及び
BPTI:VIIIの組み込みの時間経過を追跡した。ファージ
生成及び融合タンパク質組み込みは２時間後に最高にな
るようであった。この時間経過はその後のファージ分析
及び生成に用いられる。
ファージ標品のポリアクリルアミド電気泳動法、それ
に続く銀染色は、標品には基本的に混入タンパク質種が
ないこと、新しいタンパク質バンドが１つ、M13MB48に
由来するファージに存在するがコントロールファージに
はないことを示した。新タンパク質のサイズはウエスタ
ン分析で見られたものと一致してした。BPTI:VIIIを組
み込んだファージの段階希釈物を、同様に分析したとこ
ろ、融合タンパク質と主要コートタンパク質の比率は通
常約1:150であることが示された。ファージは「遺伝子V
III」生成物のコピーを約3000個含むので、ファージ集
合は平均、一つのファージにつき数十の融合タンパク質
のコピーを含んでいるのである。
天然の「遺伝子VIII」の開始メチオニンの変更 OCVM13MB48は、修飾M13mp18ファージベクターの遺伝
子間領域にBPTI/VIII融合タンパク質をコードする合成
遺伝子を含む。ベクターの残りはM13ゲノムである。フ
ァージへの組み込みを増やすため、我々は、この遺伝子
の最初のメチオニン・コドンをCTGに変えることによ
り、天然「遺伝子VIII」産物の生成を減らすことにし
た。このような場合、メチオニンは組み込まれるが、翻
訳開始率は下がる。この変化は部位特異的オリゴヌクレ
オチド突然変異誘発によって達成された。
この変更ベクターから派生したファージを分析したと
ころ、主要タンパク質に対する融合タンパク質の比率が
非常に増加したことを示した。量的評価はファージ集団
内で、一つのファージにつき100個のBPTI:VIII融合体の
コピーが組み込まれたことを示した。
バクテリオファージによるBPTI:VIII融合タンパク質の
提示 BPTI:VIII融合タンパク質がファージのボディ内に組
み込まれることはすでに証明された。このファージを更
に分析して、BPTI部分は特異的抗体にアクセスでき、し
たがってファージ表面に提示されていることを示した。
我々は精製ポリクローンウサギ抗BPTIIgGを、既知の
力価のファージに加えた。インキュベート後、プロテイ
ンＡアガローズビーズを加えてIgGに結合させ、一晩イ
ンキュベートする。IgGタンパク質Ａビーズ及びそれに
結合したファージを遠心分離により除き、上澄液を再度
力価測定してファージの減少分を測定する。ビーズに結
合したファージも酸によって溶出し力価測定することが
できる。このアッセイには、WTファージストック（M13m
p18）や正常ウサギの免疫前の血清から精製されたIgGな
どをコントロールとして用いる。
表140は、WTファージの力価測定が抗BPTIIgGによって
変らないのにたいし、BPTI−III MK（ポジティブ・コン
トロール、下記参照）は、プロテインＡビーズの追加が
あってもなくても、力価測定においてかなりの低下が見
られた。（BPTI部分はファージを細菌の繊毛に結合させ
るg III pの一部であるため、これは予測できた。）M13
MB48ファージ（BPTI:VIII融合タンパク質を含む）の２
つのバッチは、pfuによって判断するところ、抗BPTI抗
体及びプロテインＡが加えられた時、力価がかなりの低
下を示した。抗体のみを加えたときに見られる力価の低
下は、ファージの２バッチ間で多少異なる。免疫沈降フ
ァージの回収は、定量性はないが、WTファージ・コント
ロールと比べると著しい。
より多くのコントロールが表141と142に示されてい
る。データは、BPTI:VIIIを含むファージで観察された
力価の喪失は、これらのファージによるBPTIエピトープ
の提示と、抗BPTI抗体との特異的相互作用の結果である
ことを示している。プロテインＡアガローズビーズも、
通常のウサギの血清から精製されたIgGも、特に注目す
べき相互作用はなかった。M13MB48バッチ５の力価低下
が大きいことは、この標品では融合タンパク質の組み込
みが高いことを示している。
BPTI−VIII提示ファージにおけるBPTI部分の機能性 前述の２つのセクションでは、BPTI:VIII融合タンパ
ク質はファージボディに組み込まれたこと、及びBPTI部
分はファージ表面に提示されたことを説明した。提示さ
れた分子が機能することを示すためには、前セクション
で説明した方法とほぼ同じ方法で結合実験を行うが、抗
体の代わりにプロテアーゼを使うところのみが異なる。
提示ファージ及びコントロールは、固定されたプロテア
ーゼ又は固定され不活化されたプロテアーゼと相互作用
させる。結合は提示ファージの力価の減少又はビーズに
結合したファージを測定して評定できる。
表143は、BPTI−VIII提示ファージ、M13MB48をアンヒ
ドロトリプシン−アガローズビーズに結合させた実験の
結果を示す。WTファージ（BPTIの提示はなし）に比べて
力価がかなり大きく低下した。それぞれがBPTI:主要コ
ートタンパク質インターフェースにおいて多様化された
５個のアミノ酸伸張部を含むファージのプール（5AAプ
ール）は、同じような力価の低下を示した。コントロー
ル実験では（表143）、無関係のタンパク質（ストレプ
トアビジン）を持つアガローズビーズにおいて提示ファ
ージの非特異結合はほとんど観察されなかった。
提示ファージの実際の結合は、表144に示された二つ
の実験のデータに示されている。ネガティブコントロー
ルはM13mp18で、ポジティブコントロールはBPTI−III M
Kであり、このファージにおいては「遺伝子III」タンパ
ク質に付いたBPTI部分は提示され機能することが示され
ている。M13MB48とM13MB56はともにポジティブコントロ
ールに匹敵するかたちで、アンヒドロトリプシン・ビー
ズに結合する。これはネガティブコントロール（非提示
ファージ）の40から60倍も高い。従って、主要コートタ
ンパク質におけるBPTI部分の機能性は確立されたといえ
よう。
更に、表145は、ファージによる活性及び不活性トリ
プシンへの結合を比較する。コントロールファージであ
るM13mp18及びBPTI−III MKは、本出願の別の個所で詳
しく説明されている結合に似た結合を示した。WTファー
ジの活性プロテアーゼに対する非特異結合があきらかに
顕著に低下したために、トリプシンへの相対的結合が増
していることに留意したい。‘EGGS'リンカー伸張部を
ドメイン・インターフェースに持つM13.3X7及びM13.3X1
1は、BPTI−III MKファージと同じようにアンヒドロト
リプシン及びトリプシンに結合した。非提示ファージと
比較して、アンヒドロトリプシン結合試験においては約
100倍高く、トリプシン結合試験では少なくとも約1000
倍高かった。‘EGGGS'リンカー変異体であるM13.3Xdの
結合はM13.3X7の結合と類似していた。
結合の特異性を示すため、ヒトの好中球エラスターゼ
（HNE）ビーズを使って試験を繰り返し、表146に示した
トリプシンビーズとの結合と比較した。BPTIはトリプシ
ンに高い親和性を示し、HNEには低い親和性を示すた
め、BPTI提示ファージは、これらのビーズとの結合アッ
セイで、これらの親和性を反映するはずである。トリプ
シン結合におけるネガティブ及びポジティブコントロー
ルは既に上に説明があるとおりであるが、HNEビーズの
ためにポジティブコントロールとしてBPTI（K15L,MGN
G）−III MAを追加した。結果は、表146に示されてお
り、この予測を確証した。M13MB48,M13.3X7及びM13.3X1
1ファージは、BPTI−III MKファージに匹敵し、WTファ
ージ及びHNEコントロール（BPTI（K15L,MGNG）−III M
A）と比べてトリプシンによく結合することを示した。
逆に、HNEビーズを用いたときは、HNEポジティブコトロ
ールファージを除き、結合は少なかった。
蓄積されたデータを総合すると、BTPIがM13の主要コ
ートタンパク質との融合ンパク質の一部であるとき、分
子はファージの表面に提示され、多くがプロテアーゼと
特異的に結合する機能を持つ。
例 II BPTI/「遺伝子III」提示ベクターの構造 DNAの操作はマニアテス等（MANI82）又はサムブルッ
ク等（SAMB89）に解説されている標準的方法に基づいて
行われた。まずM13MB1/2のlacZ遺伝子が除去された。M1
3MB1/2 RFがBamH I及びSal Iによって切断され、大きい
フラグメントが分離された。回収された6619bpフラグメ
ントはKlenow酵素で補填され、Hind III 8merリンカー
に結紮されて、XL1−blueTM（カリフォルニア州、ラホ
ヤのストレータージーン社）細胞をトランスフェクトす
るのに用いられる。同細胞は次にプラーク形成のため培
地で培養される。選択されたプラークからRF DNAが調製
され、再生されたBamH I部位とSal I部位及び新たなHin
d III部位を、すべてBq1 II部位（6935）の500bp上流に
含むクローンM13MB1/2デルタが選ばれた。
M13−MB1/2デルタにおける「遺伝子III」のコドン17
と18に唯一のNar Iサイトが導入される（アミノ酸をＨ
−ＳからＧ−Ａに変える）。
ヌクレオチド1630にただ１つのNar I部位が存在するこ
とは、制限酵素分析によって確認された。新しいベクタ
ーはM13MB1/2デルタ−Nar Iである。ファージMKはプラ
スミドpUC4K（ニュージャーシー州ピスカットアウエイ
のファーマシア社）からの1.3kb BamH I KmRフラグメン
トをM13MB1/2デルタNar Iにクローニングすることによ
って作った。
合成BPTI遺伝子の挿入 BPTI−III提示ベクターは標準的方法で構築された。
合成bpit−VIII融合体はNar I部位を１つ持つが、これ
はBPTIコード領域の最後の２個のコドンから成る。二番
目のNar I部位はBPTIをコードする領域の上流にここに
示すアダプターをAcc IIIで切断したM13−MB26に結紮す
ることによって導入した。
連結標品はついでNar Iによって制限切断され、BPTI
をコードする180bpDNAのフラグメントが単離された。フ
ァージMKのRF DNAはNar Iで消化され、脱リン酸化さ
れ、更に180bpフラグメントに連結された。結紮のサン
プルはXL1−blueTMをトランスフェクトするのに使わ
れ、KmRプラークのため固体培地で培養された。プラー
クから得られたファージから分離されたDNAは、BPTI遺
伝子に相当する32Pでリン酸化された二本鎖DNAプローブ
とハイブリダイズするかについてテストされる。強いハ
イブリダイゼーションシグナルを出しているクローンに
ついて大規模RF標品が作られた。制限酵素消化分析によ
り、ファージMK−BPTIを作るのに、合成BPTI遺伝子のコ
ピーが１個MK「遺伝子III」に挿入されていることが確
認された。続くDNAの配列決定により、bpti−III融合遺
伝子の配列が正しく、正確なリーディングフレームが保
持されていることが確認された。表116は全コーディン
グ領域、タンパク質配列への翻訳、及びポリペプチド鎖
の機能部分を示す。
BPTI−III融合遺伝子の試験管内における発現 MK−BPTI RF DNAを共役原核細胞転写翻訳抽出物（Ama
rsham）に加えた。新しく合成された放射標識されたタ
ンパク質がつくられ、次に電気泳動法により15％SDSポ
リアクリルアミド・ゲル上で分離された。MK−BPTI DNA
は、プロセシングを受けていない「遺伝子III」融合タ
ンパク質の合成を指示する。このタンパク質はWT「遺伝
子III」より7kd大きく、BPTIの58個のアミノ酸を「遺伝
子III」タンパク質に挿入したことと一致する。我々は
無細胞原核細胞抽出物から得られた放射標識されたタン
パク質の免疫的沈降を行った。ウサギの抗（M13「遺伝
子VIII」タンパク質）IgGも通常のウサギの細胞のIgG
も、MK又はMK−BPTIによってコードされた「遺伝子II
I」タンパク質を免疫的沈降させることができなかっ
た。しかしウサギの抗BPTI IgGは、MK−BPTIによってコ
ードされた「遺伝子III」タンパク質を沈降でき、MKに
よるものはできなかった。これは、MK−BPTIによってコ
ードされたIIIタンパク質のサイズ増大は、BPTIタンパ
ク質の挿入によるものであることを立証する。
ウエスタン分析 ファージは培養からPEG沈殿により回収された。残っ
た細胞を取り除くため、回収されたファージは高い塩分
のバッファー内に再懸濁され、遠心分離された。これ
は、MUTA−GENE（Ｒ）M13試験管内突然変異誘発キット
（カリフォルニア州リッチモンド、バイオラッド社、カ
タログ番号170−3571）の説明に従って行われた。ファ
ージの一部（最高40μｇのタンパク質を含む）を、12.5
％のSDS尿素ポリアクリルアミド・ゲル上で電気泳動
し、タンパク質をイモビロンのシート上に電気的に移動
させる。ウエスタン・ブロットは、予めE.Coli抽出物と
インキュベートしておいたウサギの抗BPTI血清、次いで
アルカリ・ホスファターゼに結合させたヤギ抗ウサギ抗
体を用いて現像された。67Kdの免疫反応するタンパク質
がMK−BPTIの調製物中に見出されたが、MKファージには
認められなかった。免疫反応性タンパク質のサイズは、
プロセシングを受けたBPTI−III融合タンパク質（6.4KD
＋60KD）の予期されたサイズと一致している。これらの
データはBPTIに特有のエピトープが、MK−BPTIファージ
の表面に提示されているMKファージにはないこと示す。
アガロース固定アンヒドロトリプシンにより中和される
ファージ力価 アンヒドロトリプシンは、活性部位のセリンがデヒド
ロアラニンに変換されたトリプシン誘導体である。アン
ヒドロトリプシンはトリプシンの特異的結合を維持して
いるが、プロテアーゼ活性はない。ポリクローナル抗体
とは異なり、アンヒドロトリプシンは延びたBPTIにも不
完全なフラグメントにも結合しないとされている。
ファージMK−BPTI及びMKは、1.0mg/mlのBSAを含むTBS
バッファー（PARM88）で希釈して1mlあたり1.4・1012粒
子の濃度にする。希釈ファージ30μｌを、2,5,又は10μ
ｌのアガロースに固定化したアンヒドロトリプシン（イ
リノイ州ロックフォードのピアス・ケミカル社）のTBS/
BSAバッファー中50％スラリーに加えた。25℃において
インキュベートした後、一部を取り出し、氷冷LB液で希
釈し、XL1−blue(TM)細胞の菌叢（ローン）上でのプラ
ーク形成ユニットについて力価測定される。表114はMK
−BPTIファージが固定化アンヒドロトリプシンと４時間
インキュベートすると、力価は顕著に減少したが、MK
（コントロール）ファージではそのような効果はまった
く見られないことを示す。ファージ力価減少はまた、MK
−BPTIファージに加えた固定化アンヒドロトリプシンの
量に比例する。アガロースに固定化したストレプトアビ
ジン（モンタナ州セントルイスのシグマ社）のTBS/BSA
バッファー中50％スラリー５μｌとインキュベートする
と、MK−BPTIのファージでもMKファージでも、力価は低
くならない。これらのデータは、正しく折りたたまれ
た、機能的なBPTIタンパク質がMK−BPTIファージ表面上
に提示されているが、MKファージ上には提示されていな
いことと合致する。折りたたまれていない、不完全なBP
TIドメインはアンヒドロトリプシンと結合しないとされ
ている。さらに、折りたたまれていないBPTIドメインは
非特異的にくっつくと考えられている。
抗BPTI抗体によるファージ力価の中和 MK−BPTI及びMKファージは、LBブロスで1mlあたりに
４・108のプラーク形成ユニットの濃度になるよう希釈
した。希釈されたファージ15μｌを、等量のウサギの抗
BPTI血清又はノーマル血清（双方ともLBブロスで10倍希
釈）に加えた。37℃でインキュベートした後、一部を取
り出し氷冷LBブロスで希釈しXL1−blue(TM)細胞のロー
ン上でのプラーク形成ユニットについて力価を測定し
た。MK−BPTIファージと抗BPTI血清をインキュベートす
ると、２時間にわたり力価が減少してゆくが、MKファー
ジにおいてはこのような効果は見られない。予期通り、
ノーマルなウサギの血清では、MK−BPTIもMKもファージ
力価は下がらない。抗BPTI血清を前もって、等量の大腸
菌タンパク質ではなく純正BPTIタンパク質とインキュベ
ートしておくと、血清がMK−BPTIファージの力価を下げ
る機能がブロックされてしまう。これらのデータは、BP
TI特有エピトープがMK−BPTIファージ表面に提示されて
いるがMKファージでは提示されていないということと合
致する。つまりデータはこれらのBPTIエピトープは「遺
伝子III」タンパク質とが結合しており、この融合タン
パク質と抗BPTI抗体が結合すると、細胞感染する能力が
ブロックされる。
トリプシンによるファージ力価の中和 MK−BPTI及びMKファージは、LBブロスで1mlあたり４
・108のプラーク形成ユニットの濃度になるよう希釈し
た。希釈ファージを等量のさまざまな濃度のトリプシン
のLB溶液に加えた。37℃でインキュベートした後、一部
を取り出し氷冷LBブロスで希釈しXL1−blue(TM)細胞の
ローン上でのプラーク形成ユニットについて力価を測定
した。0.15μｇのトリプシンが入った溶液と２時間イン
キュベートすると、MK−BPTIファージでは力価に70％の
低下が見られ、MKファージでは15％の低下しかなかっ
た。ファージに加えられるトリプシンの量を減らすと、
力価の低下が少なくなる。しかし、調べられた全てのト
リプシン濃度で、MK−BPTIファージのほうがMKファージ
より、トリプシンとのインキュベーションにより敏感に
反応する。従って、MK−BPTIファージ表面に提示された
BPTI−III融合タンパク質にトリプシンが結合すると、
細胞感染機能をブロックしてしまう。
トリプシンによるファージMKの力価の低減はおそらく
一般的現象の一例である。プロテアーゼが十分な量存在
すれば、ファージのタンパク質を分解し、感染力を低下
させる。本出願では、この問題を解決することができる
幾つかの方法がリストされている。
親和性選択システム 固定化アンヒドロトリプシンによる親和性選択 MK−BPTI及びMKファージはTBSバッファー（PARM88）
で1mlあたり1.4・1012個の粒子濃度になるよう希釈し
た。我々は4.0・1010ファージを、TBS/BSA中のアガロー
ス固定化アンヒドロトリプシン・ビーズ（ピアス・ケミ
カル社）か又はアガロース固定化ストレプトアビジン・
ビーズ（シグマ社）の50％スラリー液５μ１に加えた。
３時間室温でインキュベートした後、ビーズは5000rpm
で30秒間、マイクロフュージで遠心分離してペレットに
し、上清画分を集めた。ビーズはTBS/Tweenバッファー
（PARM88）で５回洗浄するが、一度洗浄するたびにビー
ズは遠心分離によってペレットにし、上清液を除いた。
最後にビーズは再び溶出バッファー（1.0mg/mlのBSAを
含む、グリシンでpH2.2に調整された0.1N HCl）中に再
懸濁され、室温で５分間インキュベートした後、ビーズ
は遠心分離によりペレットにする。上澄液を取り出し、
pH8.0の1.0M Tris−HClバッファーを加えて中和した。
ファージサンプルの一部は、シュライヒャー及びシュ
エル（ニューハンプシャー州、キーン）のろ過マニホル
ドを用いてナイトラン膜に塗布された。ファージDNA
は、80℃で２時間加熱することにより、ナイトラン上に
固定された。加熱されたフィルターは、予備洗浄液（MA
NI82）と予備ハイブリダイゼーション溶液（ペンシルバ
ニア州、ウエストチェスターの５プライム−３プライム
社）で、42℃で１時間インキュベートされた。MKRFから
の1.0KbのDNAフラグメントNar I（塩基1630）/Xmn I
（塩基2646）は、オリゴラベリング・キット（ニュージ
ャージー州、ピスキャットアウエイ、ファーマシア社）
を用いて32P−dCTPで放射標識された。放射性プローブ
をハイブリダイゼーション溶液（５プライム−３プライ
ム社）中のナイトラン・フィルターに加え、一晩42℃で
インキュベートした後、フィルターを洗浄してオートラ
ジオグラフィを行った。
この親和性選択システムの効率は、ドット・ブロット
方法により半定量的に求めることができる。MK−BPTIフ
ァージ処理アンヒドロトリプシンビーズを溶出バッファ
ーにさらすと、結合したMK−BPTIファージがリリースさ
れる。ストレプトアビジン・ビーズはファージMK−BPTI
を保持しない。アンヒドロトリプシン・ビーズはファー
ジMKを保持しない。表115にある実験で、我々は全MK−B
PTIファージの20％が５μｌの固定アンヒドロトリプシ
ンに結合し、ついでビーズを溶出バッファー（pH2.2 H
Cl/グリシン）で洗浄することにより回収されたと評価
している。同じ条件のもとで、検出量のMK−BPTIファー
ジはストレプトアビジン・ビーズに結合せずまたそれか
ら回収されなかった。溶出画分において回収されたMK−
BPTIファージは、ファージに加えられた固定化アンヒド
ロトリプシンの量に比例する。固定化アンヒドロトリプ
シン又はストレプトアビジン・ビーズに結合したMKファ
ージは検出されず、溶出バッファーによって回収された
ファージもなかった。これらのデータは、上述の親和性
選択システムが、特定の折りたたまれたタンパク質（こ
の場合はBPTI）を提示するファージを選ぶのに用いられ
得ることを示している。変性又は不完全なBPTIドメイン
はアンヒドロトリプシンに結合しないとされている。
抗BPTI抗体による親和性選択 MK−BPTI及びMKファージは、1.0mg/ml BSAを含むトリ
ス・バッファー・生理食塩溶液（PARM88）で1mlあたり
１・1010粒子濃度まで希釈された。２・108個のファー
ジを、TBS/BSA中のビオチニル化ウサギ抗BPTI IgG又はT
BS/BSA中のビオチニル化ウサギ抗マウス抗体IgG（シグ
マ）の2.5μｇに加え、一晩４℃でインキュベートし
た。ストレプトアビジン・アガロース（シグマ）の50％
スラリーは、TBSバッファーで３回洗浄してから30mg/ml
のBSAを含むTBSバッファーと60分間室温でインキュベー
トし、TBS/Tweenバッファー（PARM88）で３回洗浄し
て、最終的にこのバッファー中50％の濃度になるよう再
懸濁された。ファージとビオチニル化IgGを含むサンプ
ルはTBS/Tweenバッファーで希釈してから、TBS/Tweenバ
ッファー中のストレプトアビジン・アガロースを加え
た。60分間の室温でのインキュベーションに続き、スト
レプトアビジン・アガロース・ビーズは30秒間の遠心分
離によってペレットにされ、上澄液のフラクションが集
められた。ビーズはTBS/Tweenバッファーで５回洗浄し
たすが、一度洗浄するたびにビーズは遠心分離によって
ペレットにされ、上澄液が除去された。最後にストレプ
トアビジン−アガロース・ビーズは溶出バッファー（1.
0mg/mlのBSAを含む、グリシンでpH2.2に調整された0.1N
HCl）中に再懸濁された。室温で５分間インキュベート
した後、ビーズを遠心分離によりペレットにした。上澄
液をとり、pH8.0の1.0MTris−HClバッファーを加えて中
和した。
ファージサンプルの一部を、シュライヒャー及びシュ
エル（ニューハンプシャー州のキーン社）のフィルタレ
ーション・マニホルドを用いてナイトラン膜に塗布し
た。ファージDNAは、80℃で２時間加熱することによ
り、ナイトラン上で固定された。フィルターは、42℃の
予備洗浄液（MANI82）で60分間洗浄し、42℃で60分間、
サザン・プレハイブリダイゼーション溶液（５プライム
−３プライム社）の中でインキュベートした。MK RFか
らのDNAフラグメント、1.0Kb Nar I（1630bp）/Xmn I
（2646bp）は、オリゴラベリング・キット（ニュージャ
ージー州、ピスキャットアウエイ、ファーマシア社）を
用いて32P−dCTPで放射標識した。ナイトラン膜は、42
℃でプレ・ハイブリダイゼーション溶液からサザン・ハ
イブリダイゼーション溶液（５プライム−３プライム
社）に移した。放射性プローブをハイブリダイゼーショ
ン溶液に加え、一晩42℃でインキュベートしたあと、フ
ィルターを、室温で２×SSC（0.1％SDS）中で３回洗浄
し、65℃で２×SSC（0.1％SDS）中で１回洗浄した。ナ
イトラン膜はオートラジオグラフィにかけた。親和性選
択システムの効率は、ドット・ブロット法により半定量
的に求めることができる。ドットA1及びB1又はC1及びD1
の比較は、ファージの大半がストレプトアビジン−アガ
ロース・ビーズに付着しなかったことを示している。TB
S/Tweenバッファーによる洗浄により、非特異的にスト
レプトアビジン・ビーズに結合していたファージの大半
が取り除かれる。ストレプトアビジン・ビーズを溶出バ
ッファーにさらすと、前もってビオチニル化ウサギ抗BP
TI IgGとインキュベートしておいたMK−BPTIファージの
場合のみ結合ファージをリリースする。このデータは、
上述の親和性選択システムが、特定の抗原を提示するフ
ァージ（この場合はBPTI）の選択に用いられ得ることを
示している。我々は以下の計算に基づいて、少なくとも
富化定数が40倍高くなると評価している。
MK−BPTIファージが回収されたパーセンテージ 富化定数＝回収されたMK−BPTIファージパーセント／回
収されたMKファージパーセント 例III BPTI:VIII境界伸張 BPTIと成熟gV III pの間の柔軟性を増すため、我々
は、これらのドメインの間にペプチドを伸ばすためのコ
ドンを導入した。
融合タンパク質接点にブロック伸張を加える バクテリオファージの電子顕微鏡観察で示されたよう
にM13「遺伝子III」産物は「ストーク様」領域を含む
（LOPE85）。このタンパク質の予測されたアミノ酸配列
は、次のような繰り返しのモチーフを含む。
glu.gly.gly.gly.ser（EGGGS）が７回 gly.gly.gly.ser（GGGS）が３回 glu.gly.gly.gly.thr（EGGGT）が１回 本節の目的は、ドメインの接点において、III遺伝子
産物に見られる繰り返しモチーフを反映するマルチユニ
ット伸張部を挿入することである。
二つの合成オリゴヌクレオチドが合成された。我々は
これらのコドンの３番目の塩基を選び、オリゴヌクレオ
チドが反対方向に翻訳されるとSERを生じるようにし
た。合成オリゴヌクレオチドをアニールさせると次のユ
ニット二本鎖配列となる（EGGSリンカー）。
この二本鎖分子では、共通する二つの塩基ペア（GC）
がリンカーの両5'端に突出しており、マルチユニットの
連結と、M13MB48及びGemMB42のOCV中に存在する単一のN
ar I認識配列中にクローン化する機能を持つ。この部位
は接点をコードするDNAの１個のコドン内に位置する。E
GGSリンカー（またはマルチリンカー）をベクターのNar
I部位にクローニングすると、この認識配列が壊れる。
EGGSリンカーを逆向きに挿入すると、GSSSLを融合タン
パク質に挿入することになる。
表113に示す遺伝子のNar I部位へEGGSリンカーを１個
加えると以下の遺伝子になる。
OCVに挿入されるリンカーの方向は前もって選べず、
どちらの向きの（予期されたEGGGS又はGSSSLアミノ酸配
列の）マルチリンカーも、あるいは方向の混在（逆方向
反復DNA）も起こる可能性がある。
異なる比率で5'末端がリン酸化されている及びリン酸
化されていない２つの出発オリゴヌクレオチドをアニー
ルし、連結することにより順々に大きくなるマルチリン
カーのラダーが作られた。この背後にある論理は次のよ
うなものである。あるオリゴヌクレオチドの3'非リン酸
化末端が別のオリゴヌクレオチドの5'リン酸化末端に連
結される。リン酸化及び非リン酸化オリゴヌクレオチド
の混合物を用いると、マルチリンカー形成の程度を制御
できる。15塩基対（１ユニットの二本鎖−５アミノ酸）
から600塩基対以上（40個の連結されたリンカー−200ア
ミノ酸）にわたる、挿入体の大きさの範囲を示すラダー
がアガロースゲル電気泳動で容易に検出できた。
逆方向反復が大きいと、遺伝子的不安定性につなが
る。従って我々は、OCVへの連結前に、マルチリンカー
を制限酵素Acc III又はXho Iにより消化することによっ
てそれらを除去することにした。リンカーが「頭同志」
又は「尻尾同志」連結されるとこれらの認識配列を生じ
るからである。このような消化はマルチリンカーのサイ
ズの範囲を、１〜８リンカー・ユニット（５工程で５個
から40個のアミノ酸）の間へと顕著に減少させる。これ
はアガロース・ゲル電気泳動で査定された。
リンカーは、標準手法により、Nar Iで切断されたOCV
又はGemMB42に連結される（異なるサイズの挿入体のプ
ール又はゲルで精製した別々のフラグメントとして）。
連結に続いて、制限酵素Nar Iを加えて、自動連結する
出発OCVを除去する（リンカー挿入はNar I認識配列を壊
すからである）。この混合物を用いてXL−１−blue細胞
を形質転換し、プラーク（OCV M13MB48）又は抗アンピ
シリン・コロニー（OCV GemMB42）を作るように適切に
平板培養した。
形質転換細胞は、二つの32P標識オリゴヌクレオチド
プローブのうちの一つを用いたドット・ブロットDNA分
析により、スクリーニングされる。プローブの１つはBP
TIのP1ループをコードするDNAの相補配列から成り、も
う一つのプローブはドメイン接点領域をコードするDNA
に相補的な配列から成る。適切なリンカー候補は最初の
プローブには正に反応し、２番目のプローブには反応し
ないか、または反応が悪い。プラークから精製されたク
ローンは、結合分析及びBPTI提示のためファージストッ
クをつくるのに使われ、ファージ感染細胞から得られた
Rf DNAは制限酵素分析及び配列決定のために使われる。
分析された選択クローンの代表的挿入配列は次のとおり
である。
これらの非常にフレキシブルなオリゴマーリンカー
は、結合ドメインを繊維状ファージの主要コート・タン
パク質（遺伝子VIII）につないで結合ドメインをファー
ジ表面に提示させるのに役立つに違いない。これらはさ
らに他の遺伝子パッケージ用のキメラOSPの構築にも役
立つだろう。
ドメイン間伸張融合タンパク質のファージへの組み込み BPTI:コートタンパク質接点において多様化されたペ
ンタペプチド伸張部を含むファージプールをSEF細胞に
感染させた。前節で述べた基準を用いて我々は、伸張融
合タンパク質がファージに組み込まれと決めた。生成さ
れたファージのゲル電気泳動とそれに続く銀染色又は抗
BPTIウサギ血清を用いたウエスタン分析により、融合タ
ンパク質が開始時の融合タンパク質に似ているが、多少
遅い速度で移動することがわかった。
ドメイン接点のEGGGSリンカー伸張部に関しては、５
個のアミノ酸からなるユニット伸張部を含むと予測され
る個々のファージストックを同様の方法で分析した。伸
張融合タンパク質の移動は、ウエスタン分析と銀染色に
よって見ると、親融合タンパク質とは容易に区別でき
る。
より詳しく分析されたクローンには次が含まれる。M1
3.3X4（予測されたアミノ酸配列GSSSLのある単一逆方向
EGGSリンカーを含む）、M13.3X7（予測されたアミノ酸
配列EGGSのある正しい向きのリンカーを含む）、M13.3X
11（逆方向を１つ含む４つのリンカーを含み、その伸張
のための推定アミノ酸配列はEGGGSGSSSLGSSLである）、
及びM13.3Xd（少なくとも５個のリンカーすなわち25個
のアミノ酸から成る伸張部を含む）である。
伸張された融合タンパク質はすべて、高いレベルでフ
ァージに組み込まれ（ファージＩつにつき平均何十もの
コピーが存在した）、ゲル電気泳動により分析すると、
易動度は予測される伸張サイズと一致した。クローンM1
3.3X4とM13.3X7は、親融合タンパク質と類似しているが
明らかに異なる位置に移動した。一方M13.3X11及びM13.
3Xdは顕著に大きかった。
例IV ペプチド・ファージ 以下の物質及び手法が以下の例で使われる。
1.ペプチド・ファージ 推定上のジスルフィド結合ミニタンパク質であるHPQ6
はM13ファージ上に「遺伝子III」タンパク質（g III
p）の挿入物質として提示された。M13はビリオン１個に
つきg III pのコピーを５個持つ。ファージは標準方法
で構築された。HPQ6にはデブリンのストレプトアビジン
結合Ｅペプチド特有の配列CHPQFPRC（DEVL90）及びF.X
a認識部位が含まれる（表820参照）。HPQ6ファージはス
トレプトアビジンに結合することが示されている。
ストレプトアビジンと全く親和性のない無関係の提示
ファージをコントロールとして用いた。
2.ストレプトアビジン アガロースビーズに固定されたものが市販されている
（ピアス社）。６％アガロースのビーズに、1mlのゲル
あたり１から2mgの濃度でストレプトアビジン（StrAv）
が固定されたものが、50％スラリーとして入手できる。
遊離のタンパク質として市販されているもの（ピアス
社）は1mgあたり14.6ユニットの比活性がある（１ユニ
ットは１μｇのビオチンを結合する）。0.01％アザイド
を含むPBS中1mlあたり1mgのストック溶液を作る。
3.D−ビオチン クリスタル状のものが市販されている（ベーリンガー
・マンハイム社）。4mMのストック溶液を作る。
4.マイクロタイター・ウェルプレートのストレプトアビ
ジン・コーテイング イミュロン（Immulon）（＃２又は＃４）ストリップ
又はプレートが使われる。StrAv原液100μＬを250μＬ
容のウェルに加え、一晩４℃でインキュベートする。原
液を除き、ml/mgのBSAを含む250μＬのPBSと置換し、４
℃で更に１時間インキュベートする。ファージ結合実験
に用いる前に、0.1％Tweenを含むPBS250μＬでウェルを
急激に５回洗浄する。
5.結合実験 ビーズアッセイ 結合実験の直前に10から20μＬのStrAvビーズスラリ
ー（ビーズ体積５から10μＬ）を結合バッファー（1ml
あたり1mgのBSAを含むTBS）によって３回洗浄する。コ
ントロールエレメント又はペプチド提示ファージを含む
50から100μＬの結合バッファー（合計108から1011のプ
ラーク形成ユニット（pfu））を各マイクロチューブに
加える。結合は倒立回転器（エンドオーバー・エンドロ
ーテーター）を使って室温で１時間結合を行わせる。ビ
ーズは短時間遠心分離して、上澄液を除く。ビーズは、
0.1％Tweenを含むTBS 1mLで５回洗浄する。各洗浄は５
分間のインキュベーションと短い遠心分離から成る。最
後に結合したファージはStrAvビーズから、mg/mlのBSA
を含むpH2のクエン酸バッファーと10分間インキュベー
トすることにより溶出される。その後pH8の1Mトリス260
μＬによって中和する。各段階に存在するファージの数
は、適当に希釈したものをＦ′を持つE.Coli′のローン
にプレーティングすることにより求められたプラーク形
成ユニットとしてもとめられる。
プレートアッセイ StrAvでコートされた各ウエルに対し既知量のファー
ジ（108から1011のpfu）を含む100μＬの結合バッファ
ー（1mlにつき1mgのBSAを含むPBS）を加える。室温で１
時間インキュベートし、その後非結合ファージの除去と
0.1％Tween−PBSによる10回の急激な洗浄が続く。結合
ファージは、pH2の250μＬのクエン酸バッファー（1mL
あたり1mgのBSAを含む）により溶出され、60μＬの1Mト
リスpH8により中和される。各段階に存在するファージ
の数は、適当な希釈したものをＦ′を持つE.Coli′のロ
ーンにプレーティングすることにより求められたプラー
ク形成ユニットとしてもとめられる。
例 Ｖ ストレプトアビジン・アガロースに結合する提示ファー
ジに対するジチオトレイトール（DTT）の効果 予備的対照実験 a.HRP結合ビオチン及びストレプトアビジン・ビーズの
使用 HRP結合ビオチンに対するStrAvアガロース・ビーズの
結合能力は、５μＬのビーズにつき約１μｇ（約150pmo
lビオチンに相当）とされている。（これらの実験に使
われた分量である） b.StrAvビーズに結合しているHRP結合ビオチンに対する
DDTの効果 ５μＬのStrAvビーズを変化量のDTTの存在下（少なく
とも99％は還元）10ngのHRPビオチンと結合バッファー
（TBS−BSA）中でインキュベートした。室温で15分間イ
ンキュベートした後、ビーズは結合バッファーで２回洗
浄した後、HRP基質を加えた。発色させた後、半定量的
に検討された。表827は、ビオチニル化されたホースラ
ディッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）が20mM未満の濃
度のDDTではそれほど影響を受けないことを示してい
る。20から50mMのDTT溶液はStrAvビーズがない時のHRP
と基質との相互作用も阻害したので、全般的にこのシス
テムにおいてマイナスの効果を有することに注意。
HPQ6提示ファージの感染力に対するDTTの効果 HPQ6の108pfusがDTTの異なった濃度の溶液がある中で
結合バッファー（TBS−BSA）に加えられた。室温で１時
間インキュベートされた後、薄められプレートされてpf
usとしての力価が求められた。表828はHPQ6提示ファー
ジの感染力に対するDTTの効果を示す。従ってDTTは、こ
の範囲の濃度においてはファージの感染力に効果を及ぼ
さないか、又はファージを薄める時に効果が逆になって
しまったかのどちらかである。これらのコントロール要
因の実験から、DTTはStrAvに結合するペプチド提示ファ
ージにおける媒体を減らす効果に関する研究において10
mM以下の濃度で用いることができることは明らかであ
る。
表829は、ファージHPQ6とMKTNのStrAvビーズに対する
結合へのDTTへのもっとも顕著な効果は、DTTが0.1及び
1.0mMの間に生じた。この濃度では、前段階コントロー
ル実験においてはマイナスの効果が観察されなかった。
これらの結果は、HPQ6提示ファージの場合、DTTはStrAv
に対する結合に大きな効果を持ち、提示ペプチド内のジ
スルフィドブリッジが優れた結合にとって必要になる、
ということを強く示している。
例 VI ファクターX a切断によるストレプトアビジン結合提示
ファージの放出 ファージHPQ6はウシF.X a認識部位を持つ（YIEGR/E
V）。多くの場合、IEGRはF.X aにとって十分な認識部位
だが、我々はこの部位を両方向に伸張し、効率的な切断
を実現するようにした。HPQ6ファージをF.X aとともに
予めインキュベートした場合のStrAvビーズ上への結合
に及ぼす効果が表832に示されている。従って、F.X a
（2.5ユニット）のこの濃度が、処理された提示ファー
ジの力価には測定できるほどの影響はなかったが、StrA
vに結合する処理提示ファージの能力には非常に大きな
影響があった。これはStrAv認識配列がF.X aのYUEGR/IV
を認識し切断する働きにより除去されることと合致す
る。
表833はStrAvに結合したあとのHPQ6のF.X a処理の効
果を示す。ターゲットに結合した提示ファージをpHまた
はカオトロビック剤による溶出に代わり、F.X aを用い
て取り出せるか?HPA6提示ファージをStrAvに結合させて
から、FX aバッファー中で又は同じバッファーと2.5ユ
ニットのF.X aとともに３時間インキュベートした。pH2
溶出によって判断される結合ファージの総数と、溶出量
を比較した。従って、提示ファージはバッファーのみで
はゆっくりと除去されるのにたいし、F.X aの存在はこ
の速度を顕著に増大させる。
F.X aによる、StrAvからのHPQ6提示ファージの除去
は、インキュベート時に加えられた酵素の関数としても
研究された。これは表834に示されている。高濃度の酵
素（1.2Uで１時間又は2.5Uで２時間）では、pfusにより
測定される処理ファージの感染力喪失が認められたこと
に注意。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバーツ、ブルース、リンゼイ アメリカ合衆国、01757 マサチューセ ッツ州、ミルフォード、ウインザー ロ ード 26 (72)発明者 ラドナー、ロバート、チャールズ アメリカ合衆国、21754 メリーランド 州、イジャムスビル、グリーン バレー ロード 3827 (72)発明者 レイ、アーサー、チャールズ アメリカ合衆国、02165 マサチューセ ッツ州、ニュートン、アデナ ロード 122 (56)参考文献 特表 平５−508076（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／002809（ＷＯ，Ａ１) Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．249，Ｎｏ. 4967（1990）ｐ．386−390 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．309，Ｎｏ. 5971（1984）ｐ．810−812 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．249，Ｎｏ. 4966（1990）ｐ．257−263 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 261，Ｎｏ．16（1986）ｐ．7115−7118 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 7/00 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】特定のターゲット物質に対して所望の結合
    活性を有する新規なエピトープ性ペプチドまたは結合タ
    ンパク質を同定する方法であって、以下の工程： （１）ファージライブラリーを準備する（ここで該ファ
    ージライブラリーは第１のファージ遺伝子の発現の結果
    各ファージの表面に特定のキメラコートタンパクのコピ
    ーを１つ又はそれ以上提示しているファージからなり、
    該キメラコートタンパクはそれぞれが（ａ）エピトープ
    候補、あるいはそのファージにとって外来である既知の
    タンパクドメインの変異体である結合ドメイン候補、及
    び（ｂ）該ファージ上に該キメラコートタンパクを提示
    することができるように機能する該ファージ本来の１種
    のコートタンパクの少なくとも一部分とからなり、該ラ
    イブラリーは集合的にエピトープ候補又は結合ドメイン
    候補を複数提示する）； （２）該ファージライブラリーをターゲット物質と接触
    させる； （３）ターゲット物質に対するファージの親和性に基づ
    いてファージを分離する；および （４）部位特異的プロテアーゼで処理して高親和性を有
    するファージを回収する工程からなり、 ここで該キメラコートタンパクは該部位特異的プロテア
    ーゼによって切断できるリンカーペプチドを含み、該リ
    ンカーペプチドは（ａ）該エピトープ候補あるいは結合
    ドメイン候補の配列と、（ｂ）該本来のコートタンパク
    の配列との間に配置され、リンカーの切断により（ａ）
    が（ｂ）から遊離できることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】部位特異的プロテアーゼがXI a因子、カリ
    クレイン、XII a因子、コラゲナーゼ、あるいはエンテ
    ロキナーゼである、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】該ファージライブラリーを該ターゲット物
    質に接触させた後、（１）低親和性ファージを除く、
    （２）まだ該ターゲット物質に結合している高親和性フ
    ァージを、部位特異的プロテアーゼにより該リンカーに
    おいてキメラコートタンパクを開裂することにより遊離
    させ、遊離した高親和性ファージを回収するものであ
    る、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】特定のターゲット物質に対して所望の結合
    活性を有する新規なエピトープ性ペプチドまたは結合タ
    ンパク質を同定する方法であって、以下の工程： （１）ファージライブラリーを準備する（ここで該ファ
    ージライブラリーは第１のファージ遺伝子の発現の結果
    各ファージの表面に特定のキメラコートタンパクのコピ
    ーを１つ又はそれ以上提示しているファージからなり、
    該キメラコートタンパクはそれぞれが（ａ）そのファー
    ジにとって外来である既知のタンパクドメインの変異体
    である結合ドメイン候補、及び（ｂ）該ファージ上に該
    キメラコートタンパクを提示することができるように機
    能する該ファージ本来の一種のコートタンパクの少なく
    とも一部分とからなり、該ライブラリーは集合的にエピ
    トープ性ペプチドまたは結合ドメイン候補を複数提示す
    る）； （２）該ファージライブラリーをターゲット物質と接触
    させる； （３）ターゲット物質に対するファージの親和性に基づ
    いてファージを分離して低親和性ファージをまずターゲ
    ット物質から除去する；および （４）高親和性を有するファージを架橋開裂剤によって
    処理して回収する工程からなり、 該結合ドメイン候補はその第１のアミノ酸部位と第２の
    アミノ酸部位の間に少なくとも１個の配列内共有結合架
    橋を有し、第１の部位におけるアミノ酸と第２の部位に
    おけるアミノ酸は、該ライブラリーにより提示されるす
    べてのキメラコートタンパクにおいて不変であり、上記
    架橋開裂剤は該配列内共有結合架橋を開裂するが好まし
    くはファージを殺さないことを特徴とする方法。
  5. 【請求項５】ドメインが60アミノ酸より小さいミニタン
    パク質、好ましくは40アミノ酸より小さいミクロタンパ
    ク質である、請求項１−４のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】架橋がジスルフィド結合であり、該第１の
    部位と第２の部位のアミノ酸がシステインである、請求
    項４記載の方法。
  7. 【請求項７】試薬がジチオスレイトールである、請求項
    ６記載の方法。
  8. 【請求項８】ファージがさらに、該ファージコートタン
    パクの野生型をコードする第２のファージ遺伝子を有す
    るものである、請求項１−７のいずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】特定のターゲット物質に対して所望の結合
    活性を有する新規なエピトープ性ペプチドを同定する方
    法であって、以下の工程： （１）ファージライブラリーを準備する（ここで該ファ
    ージライブラリーは第１のファージ遺伝子の発現の結果
    各ファージの表面に特定のキメラコートタンパクのコピ
    ーを１つ又はそれ以上提示しているファージからなり、
    該キメラコートタンパクはそれぞれが（ａ）エピトープ
    候補、及び（ｂ）該ファージ上に該キメラコートタンパ
    クを提示することができるように機能する該ファージ本
    来の１種のコートタンパクの少なくとも一部分とからな
    り、該ライブラリーは集合的にエピトープ候補を複数提
    示するものである）； （２）該ファージライブラリーをターゲット物質と接触
    させる；および （３）ターゲット物質に対するファージの親和性に基づ
    いてファージを分離する工程からなり、 該ファージがさらに、上記ファージ本来のコートタンパ
    ク質の野生型をコードする第２のファージ遺伝子を有す
    ることを特徴とする方法。
  10. 【請求項１０】特定のターゲット物質に対して所望の結
    合活性を有する新規なエピトープ性ペプチドまたは結合
    タンパク質を同定する方法であって、以下の工程： （１）ファージライブラリーを準備する（ここで該ファ
    ージライブラリーは第１のファージ遺伝子の発現の結果
    各ファージの表面に特定のキメラコートタンパクのコピ
    ーを１つ又はそれ以上提示しているファージからなり、
    該キメラコートタンパクはそれぞれが（ａ）エピトープ
    候補、あるいはそのファージにとって外来である既知の
    タンパクドメインの変異体である結合ドメイン候補、及
    び（ｂ）該ファージ上に該キメラコートタンパクを提示
    することができるように機能する該ファージ本来の１種
    のコートタンパクの少なくとも一部分とからなり、該ラ
    イブラリーは集合的にエピトープ候補又は結合ドメイン
    候補を複数提示する）； （２）該ファージライブラリーをターゲット物質と接触
    させる；および （３）ターゲット物質に対するファージの親和性に基づ
    いてファージを分離する工程からなり、 上記コートタンパクの一部分は、該ファージの１つのコ
    ートタンパクの集合可能な断片のみを含み、コートタン
    パクの繊毛結合に係わる部分は有さず、かつ該ファージ
    がさらに、ファージの上記コートタンパクの野生型をコ
    ードする第２のファージ遺伝子を有することを特徴とす
    る方法。
  11. 【請求項１１】該ファージのコートタンパクの野生型が
    ファージの主要コートタンパクであることを、特徴とす
    る、請求項８−10のいずれかに記載の方法。
  12. 【請求項１２】第２のファージ遺伝子の開始コドンがロ
    イシンをコードするものである、請求項８−11のいずれ
    かに記載の方法。
  13. 【請求項１３】第１のファージ遺伝子がさらに、シグナ
    ルペプチドをコードする細胞質分泌シグナル配列を有
    し、ここで該シグナルペプチドはすぐ後ろの発現産物を
    該ファージに感染した細菌宿主細胞の内膜に向かわせ、
    そこで発現産物はプロセシングにより該シグナルペプチ
    ドが除去されて、結合ドメイン候補と少なくとも該ファ
    ージのgene VIII様タンパク質の１部分とを有する成熟
    キメラコートタンパクになり、該キメラタンパクは野生
    型コートタンパクとともに組み立てられてファージコー
    トを作り、該分泌シグナルがphoA,pla及びgene III遺伝
    子のシグナル配列からなる群から選択されるシグナル配
    列によってコードされることを特徴とする、請求項１−
    12のいずれかに記載の方法。
  14. 【請求項１４】特定のターゲット物質に対して所望の結
    合活性を有する新規なエピトープ性ペプチドまたは結合
    タンパク質を同定する方法であって、以下の工程： （１）ファージライブラリーを準備する（ここで該ファ
    ージライブラリーは第１のファージ遺伝子の発現の結果
    各ファージの表面に特定のキメラコートタンパクのコピ
    ーを１つ又はそれ以上提示しているファージからなり、
    該キメラコートタンパクはそれぞれが（ａ）エピトープ
    候補、あるいはそのファージにとって外来である既知の
    タンパクドメインの変異体である結合ドメイン候補、及
    び（ｂ）該ファージ上に該キメラコートタンパクを提示
    することができるように機能する該ファージ本来の１種
    のコートタンパクの少なくとも一部分とからなり、該ラ
    イブラリーは集合的にエピトープ候補又は結合ドメイン
    候補を複数提示する）； （２）該ファージライブラリーをターゲット物質と接触
    させる；および （３）ターゲット物質に対するファージの親和性に基づ
    いてファージを分離する工程からなり、 該ファージがさらに、該ファージコートタンパクの野生
    型をコードする第２のファージ遺伝子を有し、第２のフ
    ァージ遺伝子の開始コドンがロイシンコドンであること
    を特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】該集団が少なくとも105の異なる結合ド
    メイン候補を提示することを特徴とする、請求項１−14
    のいずれかに記載の方法。
  16. 【請求項１６】開始時に選ばれた親結合ドメイン候補
    が； （ａ）ウシ膵臓トリプシンインヒビター、クラムビン、
    Cucurbita maximaのトリプシンインヒビターIII、大腸
    菌の熱安定性エンテロトキシン、α−、μ−、ω−コノ
    トキシン、アパミン（apamin）、キャリブドトキシン
    （charybdotoxin）、分泌性白血球プロテアーゼインヒ
    ビター、シスタチン、エグリン（eglin）、オオムギプ
    ロテアーゼインヒビター、オボムコイド、T4リゾチー
    ム、ニワトリ卵白リゾチーム、リボヌクレアーゼ、アズ
    リン、腫瘍壊死因子、およびCD4、の結合ドメイン、
    （ｂ）少なくとも50℃の融点を有する上記のドメインの
    どれかと少なくとも実質的に相同であるドメイン、から
    なる群から選択されものである、請求項１−14のいずれ
    かに記載の方法。
  17. 【請求項１７】該キメラコートタンパクが該ファージの
    主要コートタンパクである、請求項１−10、12、14のい
    ずれかに記載の方法。
  18. 【請求項１８】該ファージが繊維状ファージである，請
    求項１−17のいずれかに記載の方法。
  19. 【請求項１９】該繊維状ファージがM13,fi,fd,If1,Ike,
    Xf,Pf1またはPf3である、請求項１から17のいずれかに
    記載の方法。
  20. 【請求項２０】該繊維状ファージがM13である、請求項
    １から17のいずれかに記載の方法。
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