ES2217350T3 - Variante de aprotinina con propiedades mejoradas. - Google Patents
Variante de aprotinina con propiedades mejoradas.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A VARIANTES DE LA APROTININA CON PROPIEDADES DE INHIBICION ENZIMATICA, INMUNOLOGICAS Y FARMACOCINETICAS MEJORADAS Y SU PREPARACION.
Description
Variante de aprotinina con propiedades
mejoradas.
La presente invención se refiere a variantes de
aprotinina con propiedades inhibidoras de enzimas, inmunológicas y
farmacológicas mejoradas y a su producción.
La aprotinina, que también se denomina como
inhibidor de tripsina pancreático bovino (BPTI), pertenece a la
familia de los inhibidores de proteasas de serina del tipo Kunitz.
El espectro de las proteasas de serina que pueden inhibirse
comprende, por ejemplo, tripsina, quimotripsina, plasmina y
calicreína plasmática (W. Gebhard, H. Tschesche y H. Fritz,
Proteinase Inhibitors, Barrett and Salvesen (editores), Elsevier
Science Publ. BV 375-387, 1986).
La aprotinina está compuesta por 58 aminoácidos.
La estructura tridimensional de la proteína se esclareció con ayuda
del análisis de la estructura cristalina por rayos X y la
espectroscopía RMN (Wlodawer et al., J. Mol. Bio. 198 (3),
469-480, 1987; Wagner et al., J. Mol. Biol.
196 (1), 227-231, 1987; Berndt et al.,
Biochemistry 32 (17), 4564-4570, 1993).
Con el nombre comercial Trasylol® se utiliza
aprotinina natural, originalmente para el tratamiento de la
pancreatitis. Trasylol® se utiliza hoy en la cirugía cardiaca,
después de que estudios clínicos mostraron que un tratamiento con
aprotinina disminuye significativamente la necesidad de
transfusiones en este tipo de operaciones y conduce a una reducción
de las hemorragias posteriores (D. Royston, J. Cardiothorac. Vasc.
Anesth. 6; 76-100, 1992).
Se pudo mostrar que el intercambio del aminoácido
en posición 15, que determina la especificidad de la inhibición,
conduce a valiosas variantes de aprotinina con propiedades
inhibidoras mejoradas (DE-PS 3 339 693). En función
del aminoácido introducido pueden producirse de esta manera
inhibidores potentes, que inhiben, por ejemplo, la elastasa del
páncreas o de los leucocitos.
Además se pudo mostrar que las propiedades
inhibidoras de la aprotinina y de las variantes producidas por
medio del intercambio en la posición 15, también están determinadas
por otros restos de aminoácidos en la región de contacto entre la
proteasa objeto que debe inhibirse y la molécula inhibidora. A ellos
pertenecen principalmente los restos de aminoácidos adicionales en
las posiciones 14, 16, 17, 18, 19, 34, 38 y 39. Variantes de
aprotinina con propiedades mejoradas por medio del intercambio de
uno o varios de estos restos de aminoácidos en la zona de la región
de contacto se describieron a modo de ejemplo, entre otros, en las
siguientes solicitudes de patente: WO 89/01968, WO 89/10374, EP 0
307 592, EP 683 229.
De manera interesante pudieron mejorarse las
propiedades farmacocinéticas de aprotinina y sus variantes por
medio de intercambios de aminoácidos, que determinaron las
propiedades fisicoquímicas de la sustancia. De esta manera, por
medio del descenso de la carga neta positiva de la molécula, se
consiguió disminuir significativamente la fijación al riñón. Este
tipo de variantes se describieron en la solicitud de patente WO
92/06111.
Por motivos de una producibilidad técnica
mejorada conviene, en determinados casos, realizar una modificación
en el extremo N-terminal de la molécula inhibidora.
Este tipo de modificaciones pueden ser acortamientos o
prolongaciones en el extremo N-terminal o deleciones
de uno o varios aminoácidos. En el documento EP 419 878 se
describen variantes de aprotinina modificadas en el extremo
N-terminal.
Las variantes de aprotinina descritas en la
presente solicitud de patente se caracterizan por las siguientes
características:
- 1.
- Intercambio de uno o varios aminoácidos en el centro activo de la molécula para mejorar las propiedades de actividad.
- 2.
- Intercambio de aminoácidos para disminuir la carga neta positiva, con el fin de mejorar las propiedades inmunológicas y farmacocinéticas.
- 3.
- Modificación de la secuencia N-terminal de aminoácidos por motivos de producibilidad técnica.
Las variantes de aprotinina que contienen
respectivamente sólo una de las características mencionadas se
describen en las solicitudes de patente citadas anteriormente.
Ahora, las variantes de aprotinina según la invención reúnen en su
estructura molecular dos o tres de las características mencionadas
anteriormente. La secuencia de aminoácidos está representada en la
figura, a modo de ejemplo para algunas variantes.
Sin embargo, las variantes de aprotinina según la
invención no se limitan a los ejemplos mencionados en la figura 1.
A las variantes de aprotinina según la invención pertenecen también
las variantes con la prolongación N-terminal
Ala(-2)-Gln(-1), con el resto natural de aminoácido
prolina en posición 2, con el intercambio de otros aminoácidos que
llevan una carga positiva por restos de aminoácidos neutros o
cargados negativamente, o con el intercambio de otros aminoácidos
neutros por restos de aminoácidos cargados negativamente. A este
respecto, la selección de los intercambios de restos de aminoácidos
sigue el principio de producir una sustancia que a un valor de pH
fisiológico tiene una carga neta positiva reducida, preferiblemente
en el intervalo de +2 a -2. Las modificaciones mencionadas en la
secuencia de aminoácidos, inclusive las prolongaciones o los
acortamientos en el extremo N-terminal o las
deleciones, pueden aprovecharse entre sí en cualquier combinación.
De esta manera, a las variantes de aprotinina según la invención
pertenecen todos los compuestos que presentan una combinación de
las características mencionadas anteriormente y tienen una carga
neta positiva reducida a un valor de pH fisiológico.
Sorprendentemente, se mostró que la combinación
de dos o tres de las características mencionadas no sólo lleva a la
conservación, sino en parte incluso a una manifestación más
marcada de las características individuales. Además pudieron
producirse propiedades nuevas y significativas de las sustancias,
que se refieren, por ejemplo, a las propiedades inmunológicas, a las
farmacocinéticas y a las de la unión a la superficie. Las nuevas
variantes muestran una reacción reducida con antisueros de conejo y
humanos policlonales, que se produjeron utilizando aprotinina.
Además se encontró que, en comparación con la aprotinina, las
nuevas variantes tienen un comportamiento inmunogénico marcadamente
reducido, es decir, éstas causan una respuesta inmunológica
reducida. Además pudo mostrarse que las variantes según la
invención, en comparación con la aprotinina, inducen una menor
liberación de histamina a partir de las células sanguíneas. Además,
las nuevas variantes muestran una acumulación renal marcadamente
menor en comparación con la aprotinina. Sorprendentemente, las
constantes de inhibición de cinética enzimática (valores de Ki) han
sido mejoradas a pesar del gran número de modificaciones en el
cuerpo molecular frente a variantes anteriores de la molécula.
La presente invención se refiere entonces a
variantes de aprotinina con una carga neta de +3 a -3 a pH 7 y con
los aminoácidos Arg 15 o Arg 15-Ala 17. Se
prefieren aquellos con una carga neta de +2 a -2, prefiriéndose
especialmente aquellos con de +1 a -1.
Estas variantes de aprotinina son adecuadas para
la inhibición de la calicreína plasmática, calicreína tisular y
plasmina.
Además, estas variantes de aprotinina pueden
tener una secuencia N-terminal modificada.
Con ellos se aluden las variantes de aprotinina
con una prolongación o un acortamiento N-terminal o
con aminoácidos delecionados en posición
N-terminal.
Se prefiere la variante de aprotinina
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina.
La invención se refiere también a fármacos que
contienen estas variantes de aprotinina.
El nuevo inhibidor de proteinasa descrito es
adecuado para el tratamiento de situaciones patológicas en las
cuales, también a causa de procedimientos quirúrgicos complejos,
como por ejemplo en la cirugía cardiaca o en el caso de la
sustitución aloartroplástica de articulaciones en la medicina de
trasplante, se produce la activación de los sistemas enzimáticos
plasmáticos por el contacto intenso o extenso de la sangre con
superficies extrañas.
El inhibidor redujo la pérdida de sangre en
operaciones que están ligadas a un riesgo elevado de hemorragias
(por ejemplo, operaciones cardiacas, cirugía ósea y de
articulaciones). Son adecuadas para la terapia en caso de shock,
politraumatismo, y traumatismo craneoencefálico, sepsis,
coagulopatía intravascular diseminada (CID), fallo multiorgánico,
enfermedades infecciosas con participación del sistema de la
calicreína, tales como enfermedades articulares reumáticas, y asma.
El inhibidor impide el crecimiento tumoral invasivo y la
metastatización, por medio de la inhibición de plasmina. También es
adecuado para el tratamiento del dolor y de los edemas por medio de
la inhibición de la síntesis de bradicinina, así como para el
tratamiento de los accidentes cerebrovasculares.
También es útil en el caso de la terapia de
diálisis y de órganos artificiales, para evitar las infecciones y
la coagulación y para disminuir el riesgo de hemorragias.
Para la producción de las variantes de aprotinina
según la invención conviene utilizar procedimientos de ingeniería
genética. Para ello, con métodos habituales de biología molecular
se introduce en un organismo microbiológico adecuado de expresión,
la información de ingeniería genética para la síntesis de la
variante de aprotinina considerada respectivamente. El
microorganismo recombinante se fermenta; por medio de la selección
adecuada de las condiciones se provoca la expresión de la
información genética heteróloga. La variante de aprotinina
expresada se obtiene a continuación a partir del caldo de
cultivo.
Los organismos huésped adecuados para la
producción de las variantes de aprotinina según la invención pueden
ser bacterias, levaduras u hongos. La expresión puede tener lugar
intracelularmente o extracelularmente utilizando sistemas de
secreción adecuados. La variante de aprotinina puede expresarse
correctamente procesada o fusionada a péptidos o proteínas.
Los sistemas adecuados para la expresión de las
variantes de aprotinina se describieron en las solicitudes de
patente EP 683 229, WO 89/02463, WO 90/10075 y en otras diferentes
solicitudes de patente de las ya mencionadas anteriormente.
Las enzimas utilizadas (endonucleasas de
restricción, fosfatasa alcalina de intestino de ternero, T4
polinucleótido cinasa y T4 ADN ligasa) se adquirieron de las
empresas Boehringer Mannheim y GIBCO/BRL y se utilizaron según las
especificaciones del productor.
Se llevaron a cabo trabajos de clonación
rutinarios, como, por ejemplo, el aislamiento de ADN plasmídico de
E. coli (denominado "miniprep") y la transformación de
E. coli con ADN plasmídico, según Sambrook et al.
(Molecular Cloning Cold Spring Harbor, 1989). Como organismo huésped
para las transformaciones se utilizó la cepa DH5\alpha de E.
coli (GIBCO/BRL). Se emplearon puntas de Qiagen (Qiagen) para
el aislamiento de grandes cantidades de ADN plasmídico. La
extracción de fragmentos de ADN de los geles de agarosa se realizó
con ayuda de Jetsorb siguiendo las instrucciones del productor
(Genomed).
Se produjeron oligonucleótidos para experimentos
de mutagénesis dirigida al sitio ("site directed mutagenesis")
y cebadores para reacciones de PCR y secuenciación, mediante el
"380 A DNA synthesizer" (sintetizador de ADN 380 A) de la
empresa Applied Biosystems. Las pruebas de mutagénesis se realizaron
siguiendo un procedimiento de Deng y Nickoloff (Deng et al.,
Anal. Biochem. 200, 81-88, 1992) y utilizando un
kit de la empresa Pharmacia Biotech ("Unique Site Elimination
Mutagenesis" - mutagénesis por eliminación de un sitio único).
Todas las construcciones de vectores y todos los experimentos de
mutagénesis se confirmaron mediante secuenciación cíclica del ADN
con Taq, con terminadores marcados con fluorescencia en un "ABI
373 A Sequencer" (secuenciador ABI 373 A) (Applied
Biosystems).
Se pusieron células de levadura, por ejemplo de
la cepa JC34. 4D (MAT\alpha, ura3-52, suc2) en 10
ml de YEPD (2% de glucosa; 2% de peptona; 1% de extracto de
levadura Difco) y se recolectaron a una D.O._{600 nm} de 0,16 a
0,8. Se lavaron las células con 5 ml de disolución A (sorbitol 1 M;
Bicin 10 mM pH 8,35; 3% de etilenglicol), se suspendieron de nuevo
en 0,2 ml de disolución A y se almacenaron a -70ºC.
El ADN plasmídico (5 \mug) y el ADN carrier (50
\mug de ADN de esperma de arenque) se añadieron a las células
congeladas. A continuación, se descongelaron las células mediante
agitación durante 5 min a 37ºC. Tras añadir 1,5 ml de disolución B
(40% de PEG 1000; Bicin 200 mM pH 8,35) se incubaron las células
durante 60 min a 30ºC, se lavaron con 1,5 ml de disolución C (NaCl
0,15 M; Bicin 10 mM pH 8,35) y se suspendieron de nuevo en 100
\mul de disolución C. La siembra se llevó a cabo en placas con un
medio selectivo con 2% de Agar. Los transformantes se obtuvieron
tras una incubación de 3 días de duración a 30ºC.
| Bacto Yeast Nitrogen Base | 6,7 g/l |
| Glucosa* | 20 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 6,7 g/l |
| pH 6,0 | |
| *= esterilizar en autoclave por separado |
| Glucosa* | 20 g/l |
| Extracto de levadura Difco | 20 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 6,7 g/l |
| (NH_{4})SO_{4} | 2,0 g/l |
| MgSO_{4} x 7 H_{2}O | 1,0 g/l |
| Disolución de elementos traza SL4 | 1,0 ml/l |
| pH 6,0 | |
| *= esterilizar en autoclave por separado |
| Titriple x III | 5 g/l |
| FeSO_{4} x 7 H_{2}O | 2 g/l |
| ZnSO_{4} x 7 H_{2}O | 0,1 g/l |
| MnCl_{2} x 4 H_{2}O | 0,03 g/l |
| H_{3}BO_{3} | 0,3 g/l |
| CoCl_{2} x 6 H_{2}O | 0,2 g/l |
| CuCl_{2} x 2 H_{2}O | 0,01 g/l |
| NiCl_{2} x 6 H_{2}O | 0,02 g/l |
| Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O | 0,03 g/l |
| Glucosa* | 2,0 g/l |
| Peptona de soja | 25,0 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 1,4 g/l |
| MgSO_{4} x 7 H_{2}O | 1,0 g/l |
| Cloruro de tiamina | 5,1 mg/l |
| Inositol | 20 mg/l |
| Disolución de elementos traza | 3 ml/l |
| Disolución vitamínica | 3 ml/l |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 3,8 g/l |
| pH 5,5 | |
| *= esterilizar en autoclave por separado |
| Glucosa* | 530 g/l |
| (NH_{4})_{2}SO_{4} | 5,0 g/l |
| KH_{2}PO_{4} | 2,9 g/l |
| MgSO_{4} x 7 H_{2}O | 3,8 g/l |
| Cloruro de tiamina | 13 mg/l |
| Inositol | 70 mg/l |
| Disolución de elementos traza | 6,8 ml/l |
| Disolución vitamínica | 6,8 ml/l |
| *= esterilizar en autoclave por separado |
| FeCl_{3} x 6 H_{2}O | 13,5 g/l |
| ZnCl_{2} x 4 H_{2}O | 2,0 g/l |
| H_{3}BO_{3} | 0,5 g/l |
| CoCl_{2} x 6 H_{2}O | 2,0 g/l |
| CuSO_{4} x 5 H_{2}O | 1,9 g/l |
(Continuación)
| Na_{2}MoO_{4} x 2 H_{2}O | 2,0 g/l |
| CaCl_{2} x 2 H_{2}O | 1,0 g/l |
| HCl concentrado | 100 ml/l |
| Riboflavina | 0,42 g/L |
| Pantotenato cálcico | 5,9 g/l |
| Ácido nicotínico | 6,1 g/l |
| Hidrocloruro de piridoxina | 1,7 g/l |
| Biotina | 0,06 g/l |
| Ácido fólico | 0,04 g/l |
Con una conserva de cepas se inocularon 200 ml de
medio SD2 en un matraz de Erlenmeyer de 1 l al 1%. Los cultivos se
incubaron 72 horas a 28ºC sobre el agitador (260 rpm). Después se
envasaron de 2 ml en 2 ml en recipientes de conserva y se
congelaron en nitrógeno líquido.
Como cultivo previo se inocularon 200 ml de medio
SD2 en un matraz de 1 l al 1% con una conserva de trabajo y se
fermentaron durante 72 horas a 28ºC sobre el agitador (260 rpm). Con
el cultivo previo se inocularon cultivos principales (200 ml de
medio SC5 en un matraz de 1 l) al 1% y se incubaron durante
72-96 horas sobre el agitador a 28ºC.
Como cultivo previo se inocularon 200 ml de medio
SD2 en un matraz de 1 l al 1% con una conserva de trabajo y se
fermentaron durante 72 horas a 28ºC sobre el agitador (260 rpm). El
cultivo principal en un fermentador de 10 l se realizó como
fermentación de alimentación (fed-batch) en un
período de 96 horas. Se utilizó como medio nutritivo el medio de
fermentación, con un volumen inicial de 7 l. Se inocularon 200 ml
de cultivo previo en el fermen-
tador.
tador.
Temperatura 28ºC
Número de revoluciones del agitador: 500 rpm
Ventilación: 10 l/min
pH: 5,5
Presión en la cabeza: 200 mbar
Después de 7 horas de tiempo de fermentación se
inició la alimentación. La tasa de alimentación se reguló por medio
de los cocientes respiratorios (RQ) (RQ= CO_{2} formado / oxígeno
consumido). Si el RQ alcanzaba un valor > 1,15, se disminuía la
tasa de alimentación, si descendía a valores < 1,05, se
aumentaba la tasa de alimentación.
Se tomaron muestras del fermentador a intervalos
regulares y se determinó el crecimiento celular mediante la
medición de la densidad óptica a 700 nm. Además, se determinó la
concentración de Bay 19-8757 en el sobrenadante
mediante la medición de la actividad.
Hacia el final de la fermentación, se disminuyó
el valor del pH a 3,0 añadiendo 50% (p/v) de ácido cítrico y se
calentó el fermentador durante 10 min a 70ºC. A continuación, se
separaron las células mediante centrifugación a 7500 x g y el
sobrenadante se dejó para purificación de proteínas.
Los análisis secuenciales se llevaron a cabo con
un secuenciador de proteínas modelo 473A de la empresa Applied
Biosystems (Forster City, EE.UU.). Se utilizó el programa de
secuenciación estándar. El secuenciador, los diversos programas de
secuenciación, así como el sistema de detección de PTH se describen
detalladamente en el manual de instrucciones (User's manual protein
sequencing system model 473 A) (1989) Applied Biosystems Forster
City, CA 94404, EE.UU.).
Los agentes reactivos para el funcionamiento del
secuenciador y la columna de PLC para la detección de PTH se
adquirieron de Applied Biosystems.
Los análisis de HPLC se realizaron con un sistema
de HPLC HP 1090 de Hewlett Packard (D-Waldbronn).
Se utilizó una columna de HPLC-RP-18
(250 mm x 4,6 mm, material de 5 \mu, diámetro de poros de 300
Angström) de Backerbond (D-Gro\beta Gerau) para
la separación.
La electroforesis capilar, modelo 270
A-HT, era de Applied Biosystems (Forster City, CA
94404, EE.UU.). Las muestras se inyectaron por lo general de manera
hidrodinámica con diferentes intervalos de tiempo. La columna de
capilares utilizada (50 \mum x 72 cm) era de Applied
Biosystems.
Los análisis de aminoácidos se realizaron con un
analizador de aminoácidos LC 3000 de Eppendorf Biotronik
(D-Maintal). Se utilizó un programa estándar de
separación de Biotronik con una ligera modificación. Los programas
de separación y la función del analizador se describen
detalladamente en el manual de instrucciones del aparato.
Se determinaron los pesos moleculares con un
sistema MALDI I de Kratos/Shimadzu (D-Duisburg). Las
electroforesis en SDS se llevaron a cabo con un sistema de
electroforesis de Pharmacia (D-Freiburg).
La determinación de la información cinética se
realizó con un lector de placas de microtitulación de SLT
(D-Crailsheim). El lavado de las placas de
microtitulación se llevó a cabo mediante un dispositivo de lavado de
Dynatec (D-Denkendorf).
Las enzimas y los sustratos eran de Calbiochem
(D-Bad Soden). Todos los demás productos químicos y
agentes reactivos eran de Merck (D-Darmstadt) o
Sigma (D-Deisenhofen). Las placas con 96 pocillos
se adquirieron de Greiner.
Los anticuerpos policlonales de conejo
anti-aprotinina se produjeron en conejos mediante
inmunización con aprotinina. Los anticuerpos policlonales humanos
anti-aprotinina procedían de pacientes que se
trataron con aprotinina.
En una hoja de secuenciador, que se había
incubado previamente con polibreno, se cargaron 1-3
nmol de inhibidor de proteasa diluido en agua. La proteína se
secuenció con el ciclo casi normal del secuenciador. Los aminoácidos
de PTH se identificaron mediante Online-HPLC con
ayuda de un estándar de PTH de 50 pmol.
Se diluyeron 200 \mug de proteína en 200 \mul
de HCl 6N y se hidrolizaron durante 1 h a 166ºC. Se añadió
aproximadamente 1 nmol de la muestra en el analizador de
aminoácidos. La cantidad de aminoácidos se determinó sobre un
estándar de 5 nmol.
La electroforesis en gel de SDS se llevó a cabo
según las condiciones de Laemmli. Se analizaron 10 \mug del
inhibidor de proteasa con un gel de SDS al 10-20% y
se hizo visible mediante tinción de plata (Merril et
al.).
U.K. Laemmli, Nature 227, 680-685
(1970).
C.R. Merril, M.L. Dunau, D. Goldmann, Anal.
Biochem. 100, 201-207 (1981).
Se analizaron 8 ng del inhibidor de proteasa
mediante una electroforesis capilar en una columna de vidrio
(longitud de 72 cm, diámetro interior 50 \mum). Condiciones:
intensidad de la corriente 90 \muA, temperatura de la columna
25ºC, tampón fosfatado 100 nM pH 3,0, detección a 210 nm,
alimentación bajo presión durante 3 seg.
Se cromatografiaron 5 nmol del inhibidor de
proteasa en una columna HPLC RP-18 de Bakerbond
(material de 5 \mu, 4,6 nm x 250 mm, tamaño de poros de 300
Angström). Se utilizó como eluyente un gradiente de
acetonitrilo/TFA. Condiciones: flujo de 0,7 ml/min, temperatura de
la columna de 40ºC, detección a 40ºC, disolvente A, 0,1% de TFA,
disolvente B 0,1% de TFA / 60% de acetonitrilo; gradiente: 0 min,
0% de B, 10 min, 0% de B, 70 min, 100% de B, 80 min, 0% de B
Se analizó 1 \mug del inhibidor de proteasa con
la técnica de MALDI. Se utilizó como matriz ácido sinápico. Las
proteínas estándar para la calibración de masas fueron insulina
bovina, citocromo C y melitina.
El contenido proteico se determinó según el
método BCA. En este método, por medio de las proteínas presentes se
transforman los iones Cu^{2+} en iones Cu^{1+}, que forman un
complejo con el ácido bicinconínico, que absorbe a 560 nm.
La proteína liofilizada se lleva a equilibrio de
humedad y se disuelve con una concentración de 1 mg/ml en una
disolución de 0,9% de NaCl. Se prepara una serie de diluciones. Se
añaden 1000 \mul de reactivo de la prueba BCA (Pierce) a 50 \mul
de disolución de muestra, el tubo de reacción se cierra bien con un
tapón y se incuba exactamente durante 30 minutos a 60ºC. Después de
enfriar las muestras en un baño helado durante 5 minutos se realiza
la medición a una temperatura de 25ºC y una longitud de onda de 560
nm.
La actividad se determina según una prueba
modificada de inhibición de la tripsina-F.I.P.. Bay
y 19-8757 inhibe la hidrólisis catalizada por la
tripsina del éster etílico de
N\alpha-benzoil-L-arginina
(BAEE). Los grupos carboxilo liberados por la reacción se determinan
mediante valoración alcalina. La actividad residual de la tripsina
es una medida para la actividad de inhibición del principio
activo.
La proteína liofilizada se lleva a equilibrio de
humedad, se disuelve con una concentración de 1 mg/ml en una
disolución de 0,9% de NaCl y se prepara una serie de diluciones. Se
añaden 2 ml de tampón (tampón borato 15 mM, pH 8,0 con CaCl_{2}
200 mM) y 0,8 ml de disolución de tripsina (2 mg/ml) a 1 ml de
disolución de muestra y se incuba durante 5 minutos a 25ºC. A
continuación se añaden 0,2 ml de disolución BAEE (6,8 mg/ml) y se
mide el consumo de KOH en un período de 5 minutos.
Se fijan durante la noche a 4ºC,
0,5-10 ng de inhibidor de proteasa o aprotinina
diluidos en tampón de acoplamiento a una placa de microtitulación.
Los pocillos se lavaron 4 veces con 200 \mul de tampón de lavado
cada vez y después se añadieron 100 \mul de disolución de bloqueo.
Se tapó la placa y se incubó durante una hora a 37ºC. Después del
lavado, tal como se describe anteriormente, se incorporaron los
anticuerpos policlonales anti-aprotinina de conejo
(0,2 \mug/ml en 1% de BSA en tampón PBS) o los anticuerpos humanos
policlonales (20 \mug/ml en 1% de HSA en tampón PBS). La placa se
tapó y se incubó durante una hora a 37ºC y después de lavó tal como
se describe anteriormente. En ese momento se incorporaron 100 \mul
de anticuerpos anti-conejo o
anti-humano biotinilado (25 \mul + 10 ml de 1% de
BSA o 1% de HSA en tampón PBS) y se incubó durante una hora a 37ºC.
La placa se lavó tal como se describe anteriormente y luego se
pusieron 100 \mul de complejo
estreptavidina-peroxidasa (50 \mul + 10 ml de 1%
de BSA o 1% de HSA en tampón PBS) en cada uno de los pocillos. La
placa se tapó y se incubó durante una hora a 37ºC y después se lavó
tal como se describe anteriormente.
La reacción de sustrato se llevó a cabo con
sustrato TMB + disolución de peroxidasa (1+1; 100 \mul por cada
pocillo). La reacción se paró después de 10 min con 100
\mul/pocillo de ácido fosfórico 2 M y se midió la absorción a 450
nm (referencia a 570 nm).
Disoluciones
| 1. Tampón de incubación | Na_{2}CO_{3}15 nM, NaHCO_{3} 35 mM, pH 9,6 |
| 2. Tampón de muestra | Las muestras se diluyeron en una concentración adecuada en tampón de incubación. |
| 3. Disolución de lavado | 0,1% (v/v) de Tween 20 en PBS |
| 4. Tampón de bloqueo | 3% (p/v) de BSA o HSA en PBS |
Como material de partida para la producción del
gen de
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
sirvió un gen de
DesPro2-Arg15-Ala17, que se clonó a
través de las enzimas de restricción HindIII y BamHI en el vector
pUC18. El vector resultante (pEM6.6L) se sometió a una reacción de
mutagénesis de doble hélice con el cebador A de mutagénesis y el
cebador de selección Scal/Mlul U.S.E., según el procedimiento U.S.E.
(Pharmacia Biotech). El cebador A de mutagénesis tenía la siguiente
secuencia:
5'GGCTGCAGAGCTAACCGTAACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCATGGAAACTTGCGGTGGTGCT
TAG3'. Este cebador causa las mutaciones Asn41 y Glu53 en el gen DesPro2-Arg15-Ala17-aprotinina. El análisis de los clones se realizó mediante una digestión de restricción con las enzimas Scal y Sphl. La secuencia deseada se confirmó, además, mediante la secuenciación del ADN del clon pEM31.8.L. Los demás intercambios en la región 5' del gen (Ser10-Asp24-Thr26-Glu31) se produjeron con ayuda de la técnica de PCR utilizando el cebador B y el cebador "24-mer M13 inverso" partiendo de ADN plasmídico de pEM31.8.L. El cebador B tenía la siguiente secuencia:
TAG3'. Este cebador causa las mutaciones Asn41 y Glu53 en el gen DesPro2-Arg15-Ala17-aprotinina. El análisis de los clones se realizó mediante una digestión de restricción con las enzimas Scal y Sphl. La secuencia deseada se confirmó, además, mediante la secuenciación del ADN del clon pEM31.8.L. Los demás intercambios en la región 5' del gen (Ser10-Asp24-Thr26-Glu31) se produjeron con ayuda de la técnica de PCR utilizando el cebador B y el cebador "24-mer M13 inverso" partiendo de ADN plasmídico de pEM31.8.L. El cebador B tenía la siguiente secuencia:
5'TGCCTCGAGCCGCCGTCTACTGGGCCCTGCAGAGCTATCATCCGTTACTTCTACGATGCAACTGCAG
GCCTGTGTGAAACCTTCGTATACGGC3'. La secuencia de reconocimiento de XhoI está subrayada.
GCCTGTGTGAAACCTTCGTATACGGC3'. La secuencia de reconocimiento de XhoI está subrayada.
La mezcla básica de PCR contenía 20 ng de ADN
plasmídico de pEM31.8.L, 20 pmol de cebador
"24-mer M13 inverso", 60 pmol de cebador B,
dNTP 200 \muM, 1 x tampón II de reacción de PCR (Perkin Elmer),
MgCl_{2} 4 mM y 2,5 U de Taq polimerasa de ADN (Perkin Elmer) en
un volumen total de 100 \mul. Las condiciones del "ciclo"
fueron de 3 min a 94ºC, 30 ciclos de 1 min a 94ºC respectivamente,
1 min a 55ºC y 1 min a 72ºC y una incubación subsiguiente durante 5
min a 72ºC. La mezcla básica de PCR se diluyó 1:5 y se ligó con el
vector pCRII (Invitrogen). Con la mezcla básica de ligado se
transformaron células DH5\alpha de E. coli. Los clones
positivos se identificaron después de una digestión de restricción
con las enzimas XhoI y BamHI y se secuenciaron varios clones. El
clon pES9.10.L contenía la secuencia deseada y se utilizó para los
siguientes trabajos.
Un vector de amplio espectro de E.
coli/levadura (por ejemplo, pA202) se utilizó para la
construcción de un vector de secreción de levadura, en el que la
secuencia de
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
está enlazada con la
pre-pro-secuencia del factor alfa de
la levadura.
El vector pA202 lleva un gen (bla) de resistencia
a la ampicilina y un gen URA3 como genes de marcadores que pueden
seleccionarse para E. coli y la levadura. Otros elementos
esenciales del vector son el Co1 E1 y el punto de origen de 2 \mu
de replicación (ori). El locus REP3 se encuentra también en
esta región. Un fragmento EcoRI-HindIII con un
tamaño de 1200 pb lleva el promotor MF\alpha1 y la
pre-pro-secuencia
N-terminal de la proteína precursora del factor alfa
de la levadura (Kurjan y Herskowitz, Cell 30,
933-943, 1982). Por medio de la introducción de un
ADNc de
DesPro2-Arg-15-aprotinina
modificado como fragmento HindIII-BamHI se produjo
nuevamente el punto de reconocimiento para la proteasa KexII
("Lys-Arg") dentro de la
pre-pro-secuencia del factor
alfa
(EP 0 419 878).
(EP 0 419 878).
En el extremo 3' de la secuencia de
DesPro2-Arg-15-aprotinina,
el vector lleva un fragmento BamHI-SaII del gen
URA3 de la levadura, que en esta posición actúa como señal de
terminación para la transcripción (Yarger et al., Mol. Cell.
Biol.6, 1095-1101, 1986).
Un fragmento de ADN con un tamaño de 180 pb se
recortó con XhoI y BamHI del vector pES9.10.L, se purificó a través
de electroforesis en gel de agarosa y se clonó en el vector pA202,
desfosforilado y cortado también con XhoI y BamHI. Por medio de esta
clonación, la
DesPro2-Arg15-aprotinina se
sustituye en el vector pA202 por la
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina.
Se transformaron células de levadura (JC34.4D) con el vector
pES13.10.L que se obtuvo como resultado a partir de esta
clonación.
Otros vectores de amplio espectro de E.
coli/levadura con diferentes promotores, como por ejemplo, el
promotor GAPDH constitutivo o el GAL10 que puede inducirse, pueden
producirse de manera similar y llevan también a la secreción de la
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina.
Además, naturalmente también es posible utilizar
vectores de amplio espectro con otros orígenes de replicación de la
levadura, tales como por ejemplo el segmento (ars) que puede
replicarse de forma autónoma respecto al cromosoma.
Los genes marcadores adecuados que pueden
seleccionarse son, además del gen URA3, aquellos genes que ayudan a
un mutante auxotrofo de la levadura a alcanzar la prototropía, como
por ejemplo, los genes LEU2, HIS3 o TRP1. Además, naturalmente
pueden utilizarse también genes cuyos productos proporcionen
resistencia frente a diferentes antibióticos, como por ejemplo el
aminoglucósido G418.
Otras levaduras, como por ejemplo, las levaduras
metilotrofas Pichia pastoris o Hansenula polymorpha
también pueden producir
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
después de la transformación con vectores adecuados.
Para la producción de un vector de expresión de
levadura que permita la secreción de
Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
con la secuencia N-terminal natural
"Arg-Pro-Asp", el promotor
MF\alpha1 se amplifica primero mediante PCR con la
pre-secuencia del factor \alpha y el extremo 5'
del gen de aprotinina (hasta la secuencia de reconocimiento de la
enzima de restricción XhoI) y se clona. Los cebadores utilizados
tenían la siguiente secuencia:
5'GGGATATCTATTGATAAGATTTAAAGGTATTTGACAAG3'.
La secuencia de reconocimiento de EcoRV está subrayada.
5'GGGCTCGAGGCAGAAATCTGGTCTAGCCAAAGCAGAAGAAGCAGCGAACAAGACAGCAGTGAAAA
TAGATGGAA TCTCATTCTTTTAATCGTTTATATT3'. La secuencia de reconocimiento de XhoI está subrayada.
TAGATGGAA TCTCATTCTTTTAATCGTTTATATT3'. La secuencia de reconocimiento de XhoI está subrayada.
La mezcla básica de PCR contenía 200 ng de ADN
plasmídico de pA202, cebador C 0,2 \muM, cebador D 0,2 \muM,
dNTP 200 \muM, 1 x tampón 11 de reacción de PCR (Stratagene,
Opti-Prime^{TM}) y 2,5 U de Taq polimerasa de ADN
(Perkin Elmer) en un volumen total de 50 \mul. Las condiciones del
"ciclo" fueron: 1 min a 94ºC, 30 ciclos de 1 min a 94ºC
respectivamente, 1 min a 50ºC y 2 min a 72ºC y una incubación
subsiguiente durante 5 min a 72ºC. La mezcla básica de PCR se diluyó
1:5 y se ligó con el vector pCRII (Invitrogen). Con la mezcla básica
de ligado se transformaron células DH5\alpha de E. coli.
Los clones positivos se identificaron después de una digestión de
restricción con la enzima EcoRI y se secuenciaron varios clones. El
clon pIU20.11.L se utilizó para los trabajos siguientes.
El vector basculante pYES2 de E.
coli/levadura (Invitrogen) se utilizó para la construcción de un
vector de secreción de levadura en el que la secuencia
Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Ans41-Glu53-aprotinina
está enlazada directamente con la pre-secuencia del
factor alfa de la levadura. En primer lugar, el vector pYES2 se
cortó con las enzimas de restricción SspI y BamHI, se desfosforiló y
purificó en gel. En lo anterior, el promotor GAL 1 presente en el
vector pYES2 y el ori fl se eliminan. Un fragmento de ADN con un
tamaño aproximado de 1030 pb se recortó con EcoRV y XhoI del vector
PIU20.11.L, se purificó a través de electroforesis en gel de agarosa
y se clonó junto con un fragmento de XhoI y BamHI, con un tamaño de
aproximadamente 180 pb, del vector pES9.10.L en el vector pYES2
cortado con SspI y BamHI. Con la mezcla base de ligado se
transformaron células DH5\alpha de E. coli. Los clones
positivos se identificaron después de una digestión de restricción
con la enzima XhoI y se secuenciaron. Las células de levadura
(JC34.4D) se transformaron con el vector pIU28.11.L que se obtuvo
como resultado a partir de esta clonación. El vector de expresión
pIU28.11.L ya no contiene ninguna pro-secuencia del
factor \alpha, de manera que el procesamiento de la
Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
se realiza exclusivamente por medio de la peptidasa señal y con
independencia de la disociación mediante la proteasa KexII.
Una cepa de expresión de Saccharomyces
cerevisiae se fermentó como se ha descrito anteriormente.
Después de la fermentación, las células se
separan por centrifugación y se filtra el sobrenadante que queda
para retirar las células que quedaron.
El sobrenadante libre de células se ajusta a un
pH de 3 mediante la adición de ácido cítrico concentrado. La
disolución debe diluirse con agua purificada de manera adecuada para
ajustar una conductividad inferior a 8 mS/cm. A continuación, la
disolución se aplica sobre una columna de intercambio de cationes,
que fue equilibrada antes con un tampón ácido. El material no ligado
se elimina lavando abundantemente con tampón de inicio. El producto
se eluye con la ayuda de un gradiente de sal. Las fracciones
obtenidas se analizan con ayuda de la cromatografía líquida de alta
resolución en fase inversa (RP-HPLC) y un ensayo
biológico de actividad, que determina la inhibición de la proteasa,
en cuanto a su contenido de producto. Las fracciones que contienen
el producto se purifican y se aplican directamente sobre una columna
de RP-HPLC preparativa. La columna se equilibró
antes con un tampón ácido. La proteína no ligada se retira lavando
la columna con tampón de inicio. El producto se eluye con ayuda de
un gradiente de disolvente orgánico. Las fracciones se analizan
nuevamente, como se ha descrito anteriormente, en cuanto al
contenido de producto y aquellas fracciones que contienen producto
se unen. Posiblemente, en función de la pureza del producto
conseguida es necesario purificar las fracciones unidas a través de
una segunda columna de RP-HPLC. Las condiciones son
esencialmente las mismas que las ya descritas. La disolución de
producto obtenida se diluye con agua para fines de inyección y se
envasa y liofiliza en porciones adecuadas.
Otros métodos para la purificación de los
derivados de aprotinina sin carga neta a un valor de pH neutro, que
se pueden combinar con los procesos descritos anteriormente, son la
cromatografía de afinidad en tripsina inmovilizada en sefarosa y
cromatografía de permeación en gel.
El material de fermentaciones de 10 l se purificó
según el siguiente procedimiento. Una vez finalizada la
fermentación, el contenido del fermentador se ajustó a un pH de 3
con ácido cítrico concentrado y se calentó durante 10 minutos a
70ºC. A continuación, las células se eliminaron por centrifugación
(15 minutos, 7500 x g, centrífuga Heraeus) y el sobrenadante
obtenido se filtró (de 8 \mum a 0,2 \mum, Millipore, Alemania).
A partir de esta etapa puede conservarse el sobrenadante mediante
congelación a -18ºC hasta el uso siguiente. La disolución se diluyó
a continuación mediante la adición de agua purificada hasta una
conductividad inferior a 8 mS/cm y se cargó en una columna
SP-sefarosa FF (Pharmacia, Suecia). La columna se
había equilibrado antes con 50 nM de tampón de
citrato-NaOH, pH 3. La proteína no ligada se eliminó
lavando intensamente con el mismo tampón. A continuación, el
producto se eluyó con ayuda de un gradiente de sal (NaCl 1M). Las
fracciones obtenidas se analizaron con la ayuda de la cromatografía
líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC,
C4) y mediante ensayos de la actividad inhibidora de proteasas, en
cuanto al contenido de producto. Se unieron aquellas fracciones que
contienen el producto deseado.
A continuación, la disolución del producto se
cargó directamente en la primera columna de RP-HPLC
(Source 15 RPC, Pharmacia, Suecia), que se había equilibrado antes
con 1% de ácido trifluoroacético/agua. La proteína no ligada se
retiró lavando intensamente con el mismo tampón. El producto se
eluyó con la ayuda de un gradiente lineal de acetonitrilo
(0-70%). Las fracciones obtenidas se analizaron
nuevamente, en cuanto al contenido de producto, con los métodos
descritos anteriormente y aquellas que contenían producto se
unieron.
Para la purificación final, la disolución que
contiene el producto, se diluyó con agua para fines de inyección y
se cargó en la segunda columna RP-HPLC (Vydac C8,
Vydac, EE.UU.), que se había equilibrado antes con 0,1% de ácido
trifluoroacético/agua. La proteína no ligada se retiró lavando
intensamente con el mismo tampón. El producto se eluyó con la ayuda
de un gradiente lineal de acetonitrilo (0-70%). Las
fracciones obtenidas se analizaron nuevamente, en cuanto al
contenido de producto, con los métodos descritos anteriormente y
aquellas que contenían producto se unieron.
La disolución de producto obtenida se diluyó con
agua para fines de inyección, se envasó en porciones adecuadas (20,
10, 1 y 0,2 mg), se liofilizó y se analizó.
1 unidad de calicreína plasmática humana se
diluyó hasta 16 ml con tampón (Tris 0,05 M/NaCl 0,1 M, 0,05% de
Tween-20, pH 8,2). A 200 \mul de esta disolución
enzimática se añadieron volúmenes decrecientes de tampón de prueba
(250, 240, 230, 220, 200, 180, 170, 150, 100, 50 \mul) y después
se mezclaron cantidades crecientes de inhibidor en tampón de ensayo
(10, 20, 30, 50, 70, 80, 100, 150, 200 y 250 \mul; concentración
0,7 \mug/ \mul).
La disolución enzima/inhibidor se incubó
previamente durante 4 horas a temperatura ambiente. Después se
dispusieron 180 \mul de cada disolución en los pocillos de una
placa de microtitulación y se añadieron 20 \mul de disolución de
sustrato. Se midió la variación de la absorción a 405 nm durante 10
min. Se determinó la velocidad de la reacción enzimática y a partir
de ella se calculó el valor de Ki según el método de Bieth
(Biochemical Medicine 32: 387-97 (1984)).
\newpage
| Disolución de reserva de sustrato | 0,1 M en DMSO |
| Disolución de sustrato: | S-2302 1 x 10^{-3} M en tampón de ensayo |
| Tampón de ensayo: | Tris-(hidroximetil)-aminometano 0,05 M, NaCl 0,1 M, 0,05% de Tween-20; |
| pH 8,2; 1 ml de alcohol bencílico / l. |
Las constantes cinéticas de la complejación con
las enzimas factor XIa, plasmina, tripsina bovina y quimotripsina,
se determinaron según el mismo método. Los sustratos fueron
cromozima PL para plasmina,
HD-Pro-Phe-Arg-pNA
para el factor XI, S-2444 para tripsina y
Suc-Phe-Leu-Phe-pNA
para quimotripsina.
El inhibidor de proteasa
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
se produjo por secreción mediante un organismo de levadura
modificado mediante ingeniería genética. A partir del sobrenadante
de la levadura se purificó por medio de diferentes procedimientos
cromatográficos hasta la homogeneidad. Los siguientes análisis
analíticos de las proteínas muestran la identidad del inhibidor con
la secuencia clonada.
El inhibidor de proteasa se secuenció
completamente a través de 57 etapas. La siguiente lista muestra la
secuencia de proteínas determinada, que es idéntica a la secuencia
clonada.
1
Arg-Asp-Phe-Cys-Leu-Glu-Pro-Pro-Ser-Thr-Gly-Pro-Cys-Arg-Ala-Ala-Ile-Ile-Arg-Tyr-
21
Phe-Tyr-Asp-Ala-Thr-Ala-Gly-Leu-Cys-Glu-Thr-Phe-Val-Tyr-Gly-Gly-Cys-Arg-Ala-
40
Asn-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Ser-Ala-Glu-Asp-Cys-Met-Glu-Thr-Cys-Gly-Gly-Ala
Análisis de secuencia de
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
a través de 57 etapas.
El análisis de aminoácidos representa un
parámetro cuantitativo importante para la caracterización de una
proteína. Además del contenido proteico, en el caso de conocer la
estructura primaria se determina la cantidad de aminoácidos
individuales. El análisis de aminoácidos de
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
concuerda bastante bien con los valores teóricos a partir de la
estructura primaria (tabla 1).
| Análisis de aminoácidos de DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53- | ||
| aprotinina. Todos los números se refieren a Ala=7. | ||
| Aminoácido | Números enteros | Números teóricos |
| CysSO_{3}H | 5,28 | 6 |
| Asp | 6,27 | 6 |
| Thr | 3,49 | 4 |
| Ser | 1,58 | 2 |
| Glu | 4,25 | 4 |
| Gly | 6,16 | 6 |
| Aminoácido | Números enteros | Números teóricos |
| Ala | 7,00 | 7 |
| Val | 0,98 | 1 |
| Met | 1,10 | 1 |
| Ile | 1,66 | 2 |
| Leu | 1,89 | 2 |
| Tyr | 2,49 | 3 |
| Phe | 4,11 | 4 |
| Lys | 1,05 | 1 |
| Arg | 4,73 | 5 |
| Pro | 3,23 | 3 |
| *)la cisteína y la metionina se determinaron según la oxidación de ácido perfórmico (Met como | ||
| metioninsulfona) |
En el caso de la cromatografía HPLC de proteínas
en fases inversas ligadas químicamente se produce, a través de una
interacción hidrófoba de las proteínas, una unión a la fase
utilizada. Las proteínas se ven desplazadas según la fuerza de su
unión a la fase estacionaria por disolventes orgánicos (fase móvil).
Por este motivo, este método es un buen criterio para la evaluación
de la pureza de una proteína. La
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
eluye como único pico de la fase RP-18. Se ha
mostrado que el inhibidor de proteasa aislado es muy puro.
La electroforesis capilar permite la separación
de péptidos y proteínas en función de su carga en un campo
eléctrico. En lo anterior, la calidad de la separación depende del
tampón, del valor del pH, de la temperatura y de los aditivos
utilizados. Como capilares se utilizan las denominadas columnas de
"fused silica" con un diámetro interior de
50-100 \mum. La
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
se separó en una columna de "fused silica" en un campo
eléctrico. El electroferograma muestra un pico estrecho.
Se determinó un peso molecular de 6223 Dalton
para la
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
con la técnica MALDI. A este respecto, el peso molecular determinado
concuerda bastante bien con el valor teórico de 6215 Dalton, en el
marco de la exactitud del método de medición. Se utilizó ácido
sinápico como matriz.
Se analizó la
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
mediante electroforesis con SDS en condiciones reductoras y no
reductoras. Muestra una banda en la zona de aproximadamente 6,5
kD.
Se determinaron las constantes de inhibición de
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina
para distintas enzimas. En la tabla 2 se reproducen los valores de
las Ki.
| Constantes de inhibición de complejación de DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41- | |
| Glu53- aprotinina con las enzimas y calicreína sérica, factor XIa, quimotripsina bovina y tripsina bovina. | |
| Enzima | Valor de Ki [M] |
| Calicreína sérica | 2x10^{-11} |
| Plasmina | 5x10^{-10} |
| Factor XIa | 5x10^{-10} |
| Tripsina | 2x10^{-11} |
| Quimotripsina | 9x10^{-9} |
Se investigó la actividad cruzada de los
inhibidores de proteasa obtenidos por recombinación con los
anticuerpos policlonales anti-aprotinina de conejo o
humanos. Se comprobó que las diversas variantes de inhibidores de
proteasa muestran sólo una muy débil interacción con los antisueros
de aprotinina.
Claims (3)
1. Variante de la aprotinina
DesPro2-Ser10-Arg15-Ala17-Asp24-Thr26-Glu31-Asn41-Glu53-aprotinina.
2. Composición farmacéutica que contiene la
variante de aprotinina según la reivindicación 1.
3. Utilización de la variante de aprotinina según
la reivindicación 1 para la producción de composiciones
farmacéuticas para el uso en la cirugía para disminuir la pérdida de
sangre, en casos de politraumatismo, shock e inflamación.
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